CN104195134A - 一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物学领域中以尿液为样本提取核酸的方法及其应用。本发明提供了一种能快速从大容量尿液中提取核酸的专用试剂盒及提取方法，采用抽滤过柱的方式将尿液中的核酸富集到核酸吸附柱上，再经过洗涤、洗脱等步骤，提取出尿液中含有的微量核酸。使用本发明提供的试剂盒提取得到的核酸包含了尿液中的游离核酸和尿液中脱落细胞内的核酸，操作简单快捷，核酸得率高、纯度高，可直接用于分子生物学检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物学领域中核酸(DNA和RNA)的提取方法，具体涉及一种从人类尿液中提取核酸的方法及其应用。
技术背景
尿液是血液流经肾脏后，经肾小球滤过、肾小管重吸收与分泌作用而形成，通过膀胱、尿道排出体外。尿液是保持机体内环境稳定的最终代谢产物，除了含有水、葡萄糖、无机盐、蛋白质、尿素、尿酸外，还含有血红细胞、白细胞、器官脱落的表皮细胞、游离DNA及RNA(mRNA,miRNA等)。尿液中的游离核酸包括经肾脏过滤的来自体循环的游离核酸以及来自尿道细胞裂解后释放出来的核酸。尿液中蕴藏着丰富的生物学信息,并具有无创收集、处理相对简单等优点。尿液成分及含量的改变不仅受泌尿系统、生殖系统的影响，而且与血液循环、内分泌、消化、代谢、呼吸等系统的生理或病理变化有关。从尿液中分离出核酸，并对这些核酸片段进行测试，可以帮助对癌症、肺结核、艾滋病、疟疾和潜在的一些其它的疾病的早期、有效的分子检测。
由于尿液中的游离核酸和体细胞的含量很低，采用常规的核酸提取方法难以从尿液细胞中获取足量且高质量的核酸。尿液pH值、密度、温度等理化性质及样本自收集到处理的时间间隔都可能影响尿液中细胞的完整性,进而影响提取核酸时的回收率。为了从尿液中以高回收率获取高质量的核酸，除了采用降低存储温度、缩短样本收集及处理时间和减少实验对样品的处理(离心或浓缩)等保持细胞完整性的方法外，核酸提取时采用的方法尤为重要。
在采用离心柱法提取核酸时，通常将样品离心通过吸附柱，使样品中的核酸结合到吸附柱的硅胶膜上。然而这样的上样方法对于核酸含量低、样品量较大的尿液而言，所需上样时间过长，不利于核酸的提取。也有方法先将尿液离心后，取沉淀细胞作为样品，可有效减小样品的体积，但这类提取方法会损失尿液上清中的游离核酸，而尿液中的游离核酸包含着很大的生物学信息。因此，针对尿液中核酸含量低、提取核酸时所需样本量较大的实际情况，发明一种从尿液中快速富集并提取核酸的方法，将对临床应用尿液进行分子检测具有重要的应用价值。本发明提供了富集尿液核酸专用的抽滤装置，可将大量尿液样本中的核酸快速富集至核酸吸附柱上，再经过洗涤、洗脱步骤，提取出高质量的核酸，可用于分子检测。
发明内容
本发明的目的是为了克服实验室现有技术的不足，提供一种能快速从大容量尿液中提取核酸的专用试剂盒及提取方法。
本发明提供的提取尿液核酸试剂盒所含试剂及耗材装置见表1，提取流程为：在尿液中加入0.5～3倍量的裂解液ULB，37～55℃保温10～60min后，将样品全部通过核酸吸附柱，样品中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上。用洗涤液UWB1和UWB2分别洗涤吸附柱后，再用洗脱液将核酸从吸附柱上洗脱下来。
表1：尿液核酸快速提取试剂盒所含试剂及装置
本发明的发明人根据目标样品的不同，例如健康男性尿样、健康女性尿样、糖尿病患者尿样及胰腺癌患者尿样等，经过反复实验，对各因素进行优化，摸索出提取尿液核酸的最适操作步骤及相应溶液的最佳配方。
裂解液ULB的成分包括但不限于SDS、EDTA、曲拉通X-100、盐酸胍，在配方中的浓度见表2。
表2：裂解液ULB配方
在裂解液ULB中，SDS的浓度为0.1g/uL～1g/uL，最适浓度为0.2ng/uL～0.6ng/uL；
EDTA的浓度为0.5mmol/L～2mmol/L，最适浓度为1mmol/L～1.5mmol/L；曲拉通X-100的浓度为0.5％～6％，最适浓度为2％～3％；盐酸胍的浓度为2mol/L～8mol/L，最适浓度为5mol/L～8mol/L。
洗涤液UWB1的配方见表3。其中盐酸胍的浓度为2mol/L～8mol/L，最适浓度为3mol/L～6mol/L；氯化钠浓度为75mmol/L～1.5mol/L，最适浓度为120mmol/L～200mmol/L；EDTA的浓度为0.5mmol/L～2mmol/L，最适浓度为1 mmol/L～1.5mmol/L；乙醇浓度为40％～80％，最适浓度为55％～75％。洗涤液UWB2的成分及配方见表4。
洗脱液可以为纯水或pH值大于7.0的低盐溶液。
为了不破坏尿液平衡体系，保证尿液中各组分的完整性，本发明将全部尿液通过吸附柱，而不是将尿液离心取沉淀细胞来提取核酸。发明人利用抽滤过柱的方法将尿液样本全部通过吸附柱，处理30mL样品仅需5～10分钟的上柱时间，大大简化了操作步骤。抽滤过柱的装置见图1，其原理为：通过抽气泵将废液收集瓶中空气抽净，使外界大气压大于废液收集瓶中的气压，利用气压差，加快盛样管中的尿液通过吸附柱，达到快速将核酸富集到吸附柱上的目的。
表3：洗涤液UWB1配方
表4：洗涤液UWB2配方
本发明具有以下优势和应用价值：
1.方便、快捷：本发明用抽滤过柱的方法对尿液中的核酸进行富集，尿液样本即取即用，无需浓缩，与离心过柱的方法相比，可节省5～10倍的操作时间。
2.操作简便、安全：操作简单，整个提取过程约20分钟，适合大规模样品处理，步骤简单，操作方便。
3.样品用样量少、得率高：本试剂盒仅需10mL尿液样本，即可得到高质量的DNA和RNA样品(DNA提取得率女性一般为50～200ng/mL尿液，男性一般为3～50ng/mL尿液)。
4.提取所得核酸完整：本试剂盒对尿液样品不加任何处理，无需离心、浓缩，提取得到的核酸包含了尿液中的游离核酸和尿液中脱落细胞内的核酸，最大限度地保证了样品中核酸的完整性。
5.所提取的核酸纯度高：本试剂盒所提取的核酸可直接用于PCR、DNA甲基化鉴定、癌症检测等下游实验。
6.安全无毒：本试剂盒中所用试剂及装置对人体无毒，无腐蚀性和刺激性气味。
附图说明：
图1：尿液核酸提取抽滤装置。
图2：以健康人尿液DNA为模板，GAPDH为目的基因进行PCR扩增。
图3：以胰腺癌患者尿液DNA为模板，突变型KRAS(34G>T)为目的基因进行PCR扩增。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
取10mL健康人的新鲜尿液，加入15mL裂解液ULB，颠倒混匀，37℃水浴10分钟。将抽滤装置组装到抽滤瓶上，配置成一套完整的抽滤系统(见图1)。将样品倒入盛样管中，启动抽气泵，待样品完全通过吸附柱后，关闭抽气泵，取出吸附柱。在吸附柱中加入500μL UWB1，12000rpm离心1min后，再加入500μL UWB2，12000rpm离心1min，最后用35μL洗脱液进行洗脱。
PCR扩增实验：以人的GAPDH为目的基因，取2μL洗脱下来的核酸溶液作为PCR模板，加入11μL去离子水和7μL的预混液，反应体系为20μL。预混液配制方法见表5，PCR反应程序见表6。
引物序列:GAPDH-F gcgacacccactcctccaccttt；GAPDH-R tgctgtagccaaattcgttgtcata
表5：PCR预混液的配制方法：
表6：PCR反应程序
PCR反应结束后，取5μL扩增产物与6×DNA Loading Buffer混合均匀后，加入4％琼脂糖凝胶的加样孔中，以5V/cm电泳45分钟后，在凝胶成像仪下观察电泳结果，见图2。在电泳图中能看到清晰的、以人的GAPDH为目的基因扩增得到的120bp的条带。
实施例2：
取已被确诊为胰腺癌患者的尿液20mL，做两管平行实验，每管尿样为10mL。各加入15mL裂解液ULB，颠倒混匀，37℃水浴10分钟。将抽滤装置组装到抽滤瓶上，配置成一套完整的抽滤系统(见图1)。将样品倒入盛样管中，启动抽气泵，待样品完全通过吸附柱后，关闭抽气泵，取出吸附柱。在吸附柱中加入500μL UWB1，12000rpm离心1min后，再加入500μL UWB2，12000rpm离心1min，最后用35μL洗脱液进行洗脱。
PCR扩增实验：以人的突变后的KRAS为目的基因，取2μL洗脱下来的核酸溶液作为PCR模板，加入11μL去离子水和7μL的预混液，反应体系为20μL，作2管平行对照和一组阴性对照。预混液配制方法见表7，PCR反应程序见实施例1中的表6。
引物序列为：KRAS-F aaacttgtggtagttggagtta；KRAS-R tatctgtatcaaagaatggtcc
表7：PCR预混液的配制方法
PCR反应结束后，取5μL扩增产物与6×DNA Loading Buffer混合均匀后，加入4％琼脂糖凝胶的加样孔中，以5V/cm电泳45分钟后，在凝胶成像仪下观察电泳结果，见图3。在电泳图中能看到清晰的、以人的突变型KRAS为目的基因扩增得到的条带，长度为280bp，阴性对照无条带，因此能确认该患者的尿液DNA中含有突变型的KRAS基因。
Claims (8)
1.一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法，可快速从大容量尿液中提取微量核酸，其特征在于：在尿液中加入裂解液ULB，保温一段时间后，将样品全部通过核酸吸附柱，样品中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上，用洗涤液UWB1和UWB2分别洗涤吸附柱后，再用洗脱液将核酸从吸附柱上洗脱下来。
2.如权利要求1所述的一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：提取出的核酸包含了尿液中的游离核酸和尿液中脱落细胞内的核酸。
3.如权利要求1所述的一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：裂解液ULB的用量为尿液样本的0.5～3倍量。
4.如权利要求1所述的一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：在裂解液ULB中，SDS的浓度为0.1g/uL～1g/uL，最适浓度为0.2ng/uL～0.6ng/uL；EDTA的浓度为0.5mmol/L～2mmol/L，最适浓度为1mmol/L～1.5mmol/L；曲拉通X-100的浓度为0.5％～6％，最适浓度为2％～3％；盐酸胍的浓度为2mol/L～8mol/L，最适浓度为5mol/L～8mol/L。
5.如权利要求1所述的一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：在尿液样本中加入裂解液ULB后，于37～55℃保温10～60min。
6.如权利要求1所述的一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：采用抽滤的方法将尿液样本全部通过吸附柱，通过抽气泵将废液收集瓶中空气抽净，使外界大气压大于废液收集瓶中的气压，利用气压差，加快盛样管中的尿液通过吸附柱，达到快速将核酸富集到吸附柱上的目的。
7.如权利要求1所述的一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：盐酸胍的浓度为2mol/L～8mol/L，最适浓度为3mol/L～6mol/L；氯化钠浓度为75mmol/L～1.5mol/L，最适浓度为120mmol/L～200mmol/L；EDTA的浓度为0.5mmol/L～2mmol/L，最适浓度为1mmol/L～1.5mmol/L；乙醇浓度为40％～80％，最适浓度为55％～75％。
8.如权利要求1所述的一种从尿液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：洗脱液UWB2可以为纯水或pH值大于7.0的低盐溶液。
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