CN104173386A

CN104173386A - 美洲大蠊提取在制备抗aqp3下降的药物、护肤品或日化用品中的用途

Info

Publication number: CN104173386A
Application number: CN201410457833.0A
Authority: CN
Inventors: 陈光健
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2014-09-10
Publication date: 2014-12-03

Abstract

本发明公开了美洲大蠊提取物在制备抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品中的用途。本发明还公开了美洲大蠊提取物在制备治疗皮肤损伤或抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品中的用途。本发明美洲大蠊提取物可以用于修复皮肤的辐射损伤，具有抗老化的作用，质量安全，具有较好的应用前景。

Description

美洲大蠊提取在制备抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品中的用途

技术领域

本发明涉及美洲大蠊提取物在制备抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品中的用途。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta americana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀证坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。近些年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者其进一步研究并取得了可喜的成就，以美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新液”，在烧伤、烫伤等外伤创面的治疗上取得的良好疗效。

发明内容

本发明提供了美洲大蠊提取物的新用途。

本发明提供了美洲大蠊提取物在制备抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品中的用途。

AQP3，即Aquaporin 3，表达于正常皮肤的基底细胞的细胞膜，是水和甘油的转运通道。

其中，所述抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品为抗皮肤AQP3下降的药物、护肤品或日化用品。其中，所述抗皮肤AQP3下降的药物、护肤品或日化用品为抗UVB照射后引起的皮肤AQP3下降的药物、护肤品或日化用品中的用途。

其中，所述药物、护肤品、或日化用品为治疗皮肤损伤或抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品。其中，所述治疗皮肤损伤的药物、护肤品或日化用品为治疗辐射引起的皮肤损伤的药物、护肤品或日化用品中的用途。其中，所述抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品为抗皮肤光老化的药物、护肤品或日化用品中的用途。

本发明还提供了美洲大蠊提取物在制备治疗皮肤损伤或抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品中的用途。

其中，所述治疗皮肤损伤的药物、护肤品或日化用品为治疗辐射引起的皮肤损伤的药物、护肤品或日化用品中的用途。其中，所述抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品为抗皮肤光老化的药物、护肤品或日化用品中的用途。

本发明还提供了一种抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品，它是以美洲大蠊提取物为活性成分，加上药物、护肤品或日化用品中可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

本发明还提供了一种治疗皮肤损伤或抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品，它是以美洲大蠊提取物为活性成分，加上药物、护肤品或日化用品中可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

本发明美洲大蠊提取物可以上调UVB照射后引起的皮肤的AQP3下降，修复皮肤损伤，起到抗光老化的作用，应用前景良好。

本发明美洲大蠊提取物可以通过购买市售产品获得(如康复新)，也可通过现有方法制备得到，如专利申请号201310030233.1、201010182489.0、03117804.9、200610021993.6等，但不限于上述提取方法，此处不再赘述。该提取物均符合WS3－B－3674－98(卫生部药品标准中药成方制剂第十九册)中关于“康复新”的要求。

本发明采用醇提水沉法制备美洲大蠊提取物,具体操作如下:

A、粉碎：将干燥的美洲大蠊虫体粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；

B、浸泡：将步骤A所得美洲大蠊粗粉用浓度50％～95％的乙醇浸泡，使乙醇液面高出粗粉液面5～10cm密闭保存，制得粗粉混合液；

C、提取：将步骤B所得粗粉混合液在70～85℃的温度下进行3～5次回流提取，对粗粉混合液进行第一次提取时，加粗粉重量5～8倍量浓度90％～95％的乙醇，提取时间为4～6小时；第二次以后每次提取加粗粉重量3～6倍量浓度90％～95％的乙醇，提取时间为3～5小时；合并提取液，过滤得乙醇提取液；

D、一级浓缩：将步骤C所得乙醇提取液在真空度-0.05～-0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，至比重为1.05～1.15时，得乙醇浓缩液；

E、脱脂：将步骤D所得乙醇浓缩液加入乙醇浓缩液重量5～7倍量的水，搅拌，然后保温静置1～9小时使油水分层；

F、二级浓缩：将步骤E所得下层水液放出，经滤纸过滤后，滤液减压浓缩，最后干燥的成品。经检测，本品按干燥品计算，总氨基酸含量在7.0％以上，且性状鉴别均符合标准要求。

本发明采用水提醇沉法制备美洲大蠊提取物，具体操作如下：

取美洲大蠊药材，加水煮沸提取三次，减压浓缩至相对密度为1.1，冷藏，去除上层油脂；下层液加乙醇至含醇量达80％v/v，静置，过滤、滤液浓缩至无醇味，即得。经检测，本品按干燥品计算，总氨基酸含量在7.0％以上，且性状鉴别均符合标准要求。

说明书附图

图1UVB照射后用美洲大蠊提取物处理6h、12h后的HaCaT细胞样品RT-PCR反应的溶解曲线；

图2UVB照射后用康复新液处理24h后的HaCaT细胞样品RT-PCR反应的溶解曲线；

图3UVB照射后6h，不同组别HaCaT细胞的AQP3mRNA表达水平变化。

实施例1康复新液对UVB照射的人角质形成细胞株(HaCaT)的损伤修复作用

一、材料

1、细胞株

人角质形成细胞株(HaCaT)由德国柏林自由大学本杰明.富兰克林医学中心惠赠。

2、主要试剂

康复新为美洲大蠊乙醇提取物

细胞培养液和胎牛血清购自Hyclone公司。二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司。总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、RealMasterMix新型荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。引物由北京赛百盛公司合成。

3、引物序列

GAPDH,扩增产物313bp。

上游引物,5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'；

下游引物,5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'。

AQP3，扩增产物133bp。

上游引物,5'-GCTGTCACTCTGGGCATCCTC-3'；

下游引物,5'-GCGTCTGTGCCAGGGTGTAG-3'。

4、主要仪器设备

细胞培养超净台(蚌埠净化设备厂)、CO₂培养箱(Queue SystemsTM 2711美国)、倒置相差显微镜(OLYMPUS,I×70日本)、全能型高性能台式冷冻离心机(Heaeus,Biofuge Stratos德国)、深低温冰箱(SANYO,Altra Low日本)、蒸汽高压消毒箱(Tuttnauer,2540MK美国)、550型酶标仪(Bio-Rad Laboratories Inc,Hercules加拿大)、实时定量荧光PCR仪(Rotor-gene 3000,澳大利亚)、Waldmann UVB治疗仪(Waldmann，UV801KL德国)。

二、实验方法

1、细胞培养

HaCaT细胞生长于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养液中，置于5％CO₂、37℃孵箱中传代培养。

2、MTT法检测康复新对HaCaT细胞的增殖抑制作用

将浓度为4×10³/cm³HaCaT细胞接种在96孔板上，于对数生长期向细胞中加入不同浓度康复新(1×10^-6、1×10^-5、5×10^-4、1×10^-3、1×10^-2L/L)的DMEM 180μl，每组各设6个对照复孔。细胞培养24h后，加入MTT 20μl，37℃孵育4h，弃上清液，每孔加入100μl DMSO，震荡10min，酶标仪测490nm吸光度A值。细胞存活率＝(加药组A值/对照组A值)×100％。

3、UVB照射

光源：Waldmann(UV 801KL,Germany)UVB波长285-350nm,峰值310-315nm.

光源至细胞的照射距离：15cm。

照射过程：待HaCaT细胞生长至约80％融合，弃培养基，PBS冲洗，加入300μl PBS，形成细胞层上方保护液面，后UVB照射。

4、实验分组

(1)阴性对照组

不照射、不加康复新。

(2)阳性组

UVB 20mJ/cm²，光源距离细胞表面15cm，照射后加入不含血清的DMEM培养基培养6、12、24h，收集培养细胞。

(3)实验组：

如上阳性组，每组加入康复新浓度为10^-2L/L，同上培养6、12、24h后收集细胞。

收集的细胞保存于-80℃深低温冰箱或直接进行下一步实验。

5、实时荧光定量RT-PCR检测AQP3mRNA表达

5.1总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA

(1)收集HaCaT细胞，向每管约5×10⁶个细胞中加入0.5ml Trizol总RNA提取试剂，轻轻吹打，将均浆样本放于室温5min，使核酸蛋白复合物完全分解。

(2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置10min。

(3)4℃，12,000rpm离心15min。

(4)小心将上层无色水相移至新的Eppendorf管中。

(5)缓慢加入1倍体积70％乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入试剂盒提供的吸附柱中。

(6)4℃下以12,000×g的速度离心10min，离心后在管的底部及管壁可以看到凝胶状RNA小滴。弃去收集管中的废液，加入1ml75％乙醇洗RNA小滴一次，涡旋混合样本。

(7)4℃下以7500×g的速度离心5min，室温下空气干燥5-10min。

(8)用0.1ml DEPC水溶解RNA，55-60℃孵育10min。

(9)取10μl RNA溶液，加990μl DEPC水稀释，在紫外分光光度计内测定RNA溶液在260nm及280nm处的光密度(OD)值。OD 260/OD 280>1.7时标本可用，否则重新提取。根据OD260值计算RNA浓度。

5.2逆转录

(1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入2μg总RNA，2μl Random，2μldNTP，补RNase-free水定容至13.5μl。

(2)70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min，瞬时离心收集反应液后加入4μl 5×First-Strand Buffer,1μl 0.1MDTT，0.5μl RNasin。

(3)加1μl TIANScript M-MLV混匀。25℃温浴10min，42℃温浴50min，95℃加热5min终止反应，RNase-free ddH2O将体系稀释至30μl，-20℃冻存备用。

5.3PCR反应

(1)20×SYBR solution室温平衡并彻底混匀。

(2)将125μl 20×SYBR solution加入至1ml 2.5×RealMasterMix中。

(3)在平头PCR管中分别加入2.5×RealMasterMix/20×SYRB solution 9μl，正向引物及负向引物各2μl，逆转录产物2μl，超纯水5μl。反应体系为20μl。

(4)在RG3000定量PCR仪上按照RealMasterMix新型荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应：95℃起始变性2min，94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s。用双标准曲线法对AQP3基因进行相对定量测定。

6、统计学处理

相应数据用SPSS 12.0统计包进行分析，两样本均数比较用t检验，多样本均数比较用方差分析，以p＜0.05有统计学意义。

三、结果

1、康复新对HaCaT细胞增殖的影响

MTT比较结果如下表所示：

Source	DF	Type III SS	Mean Square	F Value	Pr>F
						A	6	4.13889800	0.68981633	242.78	<.0001

[0087]

两两比较可见，各组与对照组有差别，但各剂量组无差别，提示康复新在1×10-2L/L浓度无细胞毒性。

2、RT-PCR溶解曲线实验结果

辐照处理后用康复新液处理6h、12h、24h后的HaCaT细胞的AQP3和GAPDH mRNA扩增溶解曲线均只有单一的峰，说明扩增产物特异性好。

3、RT-PCR分析结果

析实时定量PCR结果，以阴性组为基准，预设其AQP3mRNA表达水平为1.0。

(1)经UVB 20mJ/cm2照射后6h、12h的HaCaT细胞AQP3mRNA表达水平均降，至24h又有回升,但与阴性组相比未见统计学显著性差异。

(2)经UVB 20mJ/cm2照射后，康复新处理后6h AQP3mRNA变化不明显；处理后12h，AQP3mRNA较照射后升高约8倍左右；处理后24h亦有上升但不明显。与阴性组比较均未见统计学显著性差异。

康复新处理6h后组间无统计学差别：

Source	DF	Type III SS	Mean Square	F Value	Pr>F
						A	2	0.73762222	0.36881111	5.04	0.0519

康复新处理12h后组间无统计学差别：

Source	DF	Type III SS	Mean Square	F Value	Pr>F
						A	2	2.40648889	1.20324444	3.10	0.1188

[0103]

康复新处理24h后，组间无统计学差别：

Source	DF	Type III SS	Mean Square	F Value	Pr>F
						A	2	0.76335556	0.38167778	1.42	0.3126

康复新可以在mRNA水平上调UVB诱导HaCaT细胞AQP3表达的抑制，尤以作用后12h最为明显。

综上，美洲大蠊提取物能够上调细胞AQP3的表达，具有优良的抗辐射损伤作用和抗老化作用，临床应用前景良好。

Claims

1.美洲大蠊提取物在制备抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品为抗皮肤AQP3下降的药物、护肤品或日化用品。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述抗皮肤AQP3下降的药物、护肤品或日化用品为抗UVB照射后引起的皮肤AQP3下降的药物、护肤品或日化用品中的用途。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的用途，其特征在于：所述药物、护肤品、或日化用品为治疗皮肤损伤或抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述治疗皮肤损伤的药物、护肤品或日化用品为治疗辐射引起的皮肤损伤的药物、护肤品或日化用品中的用途。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品为抗皮肤光老化的药物、护肤品或日化用品中的用途。

7.美洲大蠊提取物在制备治疗皮肤损伤或抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品为抗皮肤光老化的药物、护肤品或日化用品中的用途。

9.一种抗AQP3下降的药物、护肤品或日化用品，其特征在于：它是以美洲大蠊提取物为活性成分，加上药物、护肤品或日化用品中可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

10.一种治疗皮肤损伤或抗皮肤老化的药物、护肤品或日化用品，其特征在于：它是以美洲大蠊提取物为活性成分，加上药物、护肤品或日化用品中可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。