CN104177476B - 一种靶向人癌细胞的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向人癌细胞的多肽及其应用。所述多肽如以下通式所示：YX1X2X3X4X5C；所述多肽的氨基酸残基为L型和/或D型；本发明还涉及由所述多肽与载体偶联得到的偶联物以及该多肽、其形成的二价体或多价体用于制备治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的应用。本发明的多肽能与癌细胞标记物人氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)特异性结合，弥补了抗体等生物制剂制备繁琐、稳定性差、费用昂贵、穿透力弱等缺点，可用于制备癌症的诊断试剂和靶向探针。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种多肽及其应用，尤其涉及一种靶向人癌细胞的多肽和由该肽所衍生的且能与人氨肽酶蛋白结合的产品及上述多肽或其衍生的产品在制备抗癌药物或显像制剂中的应用。
背景技术
癌症是全球一个主要死亡原因，数据显示：2012年全球新增约1410万例癌症病例，癌症死亡人数达820万，与之相比，2008年的数据分别为1270万和760万。世界范围内诊断的最常见癌症依次为肺癌(180万，13％)、乳腺癌(170万，11.9％)和结直肠癌(140万，9.7％)，最主要致死癌症为肺癌(160万，19.4％)、肝癌(80万，9.1％)和胃癌(70万，8.8％)。
癌细胞的浸润和转移是恶性肿瘤的基本特征之一，也是临床治疗失败并导致病人死亡的主要原因。癌症转移的先决条件是新生血管的形成。因此目前，针对新生血管生成的肿瘤靶向治疗是目前癌症研究领域的热点。
人氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)是由967个氨基酸残基组成的糖蛋白，APN在多种肿瘤细胞如黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌等细胞表面高水平表达，对肿瘤细胞的侵袭、转移以及肿瘤新血管的形成起重要的作用，直接导致及参与肿瘤细胞浸润与穿透基底膜发生转移的过程。
目前，针对APN的靶向的诊断和治疗药物主要是抗体药物。抗体虽然以其特异靶向性在临床诊断中广泛应用，但存在着制备繁琐、稳定性较差、费用昂贵、穿透力弱等缺点。因此，为了提高对肿瘤转移诊断和治疗的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要寻求针对APN设计小分子探针，以作为检测和治疗癌症的有效方法。
多肽类药物及诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面彰显出很强的优越性，甚至显示了替代抗体类诊疗试剂的趋势。在癌症研究中，寻找针对癌细胞的高特异多肽药物和高亲和多肽探针已成为关键问题。多肽由氨基酸作为基本单元，氨基酸排列组合的多样性决定了多肽在序列、构象、功能上千差万别。因此针对肿瘤转移标记物APN，从高通量的多肽文库中筛选出具有特异靶向性的多肽，继而发展成为癌症的诊断试剂及治疗药物，是解决上述难题的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽及其应用，特别是一种靶向人癌细胞的多肽和由该肽所衍生的且能与人氨肽酶蛋白结合的产品及上述多肽或其衍生的产品在制备抗癌药物或显像制剂中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种靶向人癌细胞的多肽，所述多肽的氨基酸序列通式为：
YX1X2X3X4X5C
其中，Y为酪氨酸；X1是亲水性氨基酸，优选为缬氨酸或谷氨酸；X2是亲水性氨基酸，优选为缬氨酸或谷氨酸；X3是芳香族氨基酸，优选为酪氨酸；X4是碱性氨基酸，优选为组氨酸；X5是中性或亲水性氨基酸，优选为亮氨酸或丝氨酸；C为半胱氨酸。
本发明所述的多肽是由序列表中的序列1-4之一自氨基末端至少7个氨基酸残基组成；优选地，所述多肽由序列表中的序列1-4之一所示的氨基酸残基组成。
本发明的四条多肽的氨基酸序列分别为：AP-1：YVEYHLC；AP-2：YEKYHSC；AP-3：YVENGYC；AP-4：YEVGHRC。
本发明的多肽还含有取代基，所述取代基为烷氧基、烷酰基或酰胺基。
优选地，在本发明中，组成所述多肽的氨基酸残基为L型和/或D型。
第二方面，本发明还提供了一种多肽偶联物，由本发明第一方面所述的多肽与载体偶联而获得；所述载体为药物、毒素、细胞因子、放射性元素、载体蛋白、酶、凝集素、荧光基团、量子点或高吸光系数发色团。
所述载体可以根据具体的目的进行选择，例如载体可以为药物或细胞因子等，可将药物或细胞因子靶向癌细胞，也可用放射性元素、载体蛋白、酶、凝集素、荧光基团、量子点活高吸光系数发色团作为载体。
优选地，所述载体为酶或荧光基团；所述酶优选为辣根过氧化物酶；所述荧光基团优选为异硫氰酸荧光素。
本发明的多肽与癌细胞标记物APN结合力强，并具有良好的特异性。
第三方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包含如本发明第一方面所述的多肽或第二方面所述的多肽偶联物。
本发明所述试剂盒可用于检测人癌细胞或人氨肽酶N蛋白。
第四方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的多肽形成的二价体或多价体，其具有靶向人氨肽酶N蛋白的特性。
优选地，所述的二价体或多价体通过与多聚体共价或非共价连接形成。
所述多聚体可以根据具体目的进行选择，例如可以是聚乙二醇(PEG)或环糊精等。
第五方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的多肽或第四方面所述的二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的应用。
所述癌症包括但不限于：乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌或子宫颈癌等。
本发明的多肽具有靶向APN蛋白的作用，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在APN阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明的多肽能对APN阳性细胞起靶向作用，选择性强，且本发明涉及的多肽可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠。
附图说明
图1为筛选APN靶向多肽的肽库构建化学式示意图。
图2为表面等离子共振成像(SPRi)方法检测AP-1，AP-2，AP-3和AP-4分别对APN蛋白的结合作用。
图3为AP-1，AP-2，AP-3和AP-4分别与APN阳性细胞SKOV-3和APN阴性细胞293A的特异性结合；
其中，图3-(a)～(d)是AP-1，AP-2，AP-3和AP-4分别与APN阳性细胞SKOV-3的特异性结合，图3-(e)是对照多肽SP与APN阳性细胞SKOV-3无结合；
图3-(f)～(i)是AP-1，AP-2，AP-3和AP-4分别与APN阴性细胞293A的特异性结合，图3-(j)是对照多肽SP与APN阴性细胞293A无结合。
图4为AP-1，AP-2特异性识别SKOV-3细胞表面的APN蛋白位点。
图5为AP-1，AP-2，AP-3和AP-4分别与人肝癌细胞系HepG2的特异性结合。
其中：AP-1，AP-2，AP-3和AP-4分别对应序列表中的序列1-4。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1多肽文库的构建与APN靶向多肽的筛选
1.实验仪器与材料
N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，上述试剂和材料均从商业途径获得。
2.“一珠一物”多肽文库的合成
采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽文库，筛选APN靶向多肽的肽库所构建的化学式如图1所示。具体方法为通过混合裂分的方式将氨基酸随机地逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将侧链保护基团去除，进而进行筛选。
(1)称取200mg的Tentagel-S-NH2树脂，按照固相多肽合成程序循环，加入200mg的Met等量的HBTU，Cys等量的HBTU依次进行反应两个循环。待反应完成后，把树脂均分为8份，向每管分别加入40mg的Asn、Arg、Leu、Asp、Gly、Ser、His、Tyr与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把8管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为8份，向每管分别加入40mg的Asn、Arg、Leu、Asp、Gly、Ser、His、Tyr与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把8管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为8份，向每管分别加入40mg的Asn、Arg、Leu、Asp、Gly、Ser、His、Tyr与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把8管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为4份，向每管分别加入50mg的Val，Glu，Ile，Lys与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把4管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为4份，向每管分别加入50mg的Val，Glu，Ile，Lys与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把4管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为4份，向每管分别加入50mg的Phe、Tyr、Ala、Leu与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把4管树脂混合，脱保护。
向上述树脂中依次加入二氯甲烷，三氟乙酸，脱出侧链保护基团，得到加载有肽库的干燥树脂备用。
(2)与APN特异性结合的多肽的筛选
用PBS把多肽文库中的肽珠清洗3次；用5％的脱脂牛奶在混旋仪上对肽珠混合封闭(37℃，2h)；用PBS清洗肽珠3次；用溶于PBS的5％脱脂牛奶按1：1000稀释Biotin标记的APND蛋白，然后与肽珠在混旋仪上混合孵育(37℃，2h)；用PBS清洗肽珠；用过量的链酶亲和素标记的磁珠与阳性肽珠在混旋仪上混合孵育(37℃，1h)。用移液枪把管底部的肽珠转移到另一个管中。孵育后的多肽库置于1.5mL离心管中，把离心管置于磁力架上。阳性肽珠受磁力影响吸附于离心管侧壁，而阴性多肽由于重力沉降在EP管底。
用移液枪把EP管底部的肽珠转移到另一个EP管中。将经磁场分选出的肽珠逐个挑出，单个肽珠采用溴化氢裂解，经MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)鉴定获得相应序列信息，获得序列包括AP-1：YVEYHLC；AP-2：YEKYHSC；AP-3：YVENGYC；AP-4：YEVGHRC。按上述序列重新合成，MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续实验。
实验例1通过表面等离子共振成像(SPRi)方法检测多肽与人氨肽酶N(APN)蛋白的亲和作用
将1mg/mL的AP-1，AP-2，AP-3，AP-4及1×PBS(磷酸缓冲液)点到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，再用1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×PBS中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(PlexeraHT表面等离子共振成像系统)。
流动相依次通过1×PBS、2×PBS、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的APN纯化蛋白，记录分析SPRi信号。
结合作用如图2所示，AP-1，AP-2，AP-3，AP-4随着APN蛋白浓度的增加，其与APN蛋白的结合力逐渐增强，而1×PBS则不随之增加。说明本实施例所述的四条多肽对APN是有强结合的，可以作为靶向APN的多肽用于相关的研究应用。
实验例2AP-1，AP-2，AP-3，AP-4与APN阳性细胞SKOV-3、APN阴性细胞293A的相互作用
AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的异硫氰酸荧光素(FITC)偶联物采用固相合成方法获得，在实施例1中获得的AP-1，AP-2，AP-3，AP-4多肽微珠上继续偶联ε-氨基己酸。在吡啶/N,N二甲基甲酰胺/二氯甲烷比例为1:5:7的溶液中，将FITC与肽珠混合反应过夜。
经三氟乙酸裂解后得到AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的FITC偶联物。多肽SP按照上述方法与FITC偶联，获得SP-FITC偶联物作为对照。采用MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续实验。
将人卵巢癌细胞系SKOV-3培养于含100mL/L胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中，以1×105/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，加入用McCoy’s 5A培养基溶解的FITC-AP-1，FITC-AP-2，FITC-AP-3，FITC-AP-4(1mg/mL，冰浴预冷)；对照组加入相同摩尔浓度的用McCoy’s 5A培养基溶解的SP-FITC(冰浴预冷)；冰浴避光孵育40min后，分别弃去多肽溶液，并用预冷PBS洗涤3次。
将人胚肾细胞系293A细胞培养于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中，以1×105/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，加入用DMEM培养基溶解的FITC-AP-1，FITC-AP-2，FITC-AP-3，FITC-AP-4(1mg/mL，冰浴预冷)；对照组加入相同摩尔浓度的用DMEM培养基溶解的SP-FITC(冰浴预冷)；冰浴避光孵育40min后，分别弃去多肽溶液，并用预冷PBS洗涤3次。
用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000-IX81，日本)检测细胞中的荧光分布。结果如图3所示，加入AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的SKOV-3细胞观测到绿色荧光，而对照多肽SP的SKOV-3细胞和263细胞以及AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的263细胞都没有观测到绿色荧光信号。
上述结果说明，AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的FITC偶联物与SKOV-3的识别是序列专一性的，AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的FITC偶联物与高表达APN的SKOV-3细胞是特异性结合。而以上四种多肽与APN阴性的293A细胞则没有特异性结合。
2.AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的细胞定位
为了观察AP-1，AP-2，AP-3，AP-4在SKOV-3细胞的定位，用FITC-AP-1，FITC-AP-2，FITC-AP-3，FITC-AP-4与Hoechst33342对SKOV-3细胞进行了双染实验。Hoechst 33342是一种显示细胞核的蓝色荧光染料。
结果如图3所示，表明AP-1，AP-2，AP-3，AP-4结合在SKOV-3细胞的细胞膜上，这与APN表达部位相同。
实验例3AP-1，AP-2，AP-3，AP-4与APN的特异性相互作用
1.人卵巢癌细胞系SKOV-3培养于含100mL/L胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中，以1×105/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
2.转染前2h，将细胞培养基换成无血清的McCoy’s 5A培养基。
3.将0.5μL lipofectamine 2000加入到100μL无血清的McCoy’s 5A培养基中，再将1μg的APNsiRNA加入到无血清的McCoy’s 5A培养基中。静置5min，将siRNA溶液缓慢加入到lipofectamine 2000溶液中，轻轻混匀，室温静置15min。
4.将混合后的转染溶液逐滴加入玻底培养皿(Φ＝35mm)，4h后换成含100mL/L胎牛血清的McCoy’s 5A培养基。
5.培养24h后，弃去培养液，加入用McCoy’s 5A培养基溶解的FITC-AP-1，FITC-AP-2(1mg/mL)，冰浴避光孵育40min后，分别弃去多肽溶液，并用预冷PBS洗涤3次。
用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000-IX81，日本)检测细胞中的荧光分布，结果如图4所示。AP-1和AP-2分别与APN阳性的SKOV-3细胞都有特异性的结合。而采用RNA干扰(RNAi)处理后的细胞RNAi SKOV-3则不与AP-1或AP-2特异性结合。经验证，AP-3和AP-4也都与APN阳性的SKOV-3细胞有特异性结合。
实验例4AP-1，AP-2，AP-3，AP-4与APN阳性细胞HepG2的相互作用
人肝癌细胞系HepG2细胞培养于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中，以1×105/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，加入用DMEM培养基溶解的FITC-AP-1，FITC-AP-2，FITC-AP-3，FITC-AP-4(1mg/mL，冰浴预冷)；对照组加入相同摩尔浓度的用DMEM培养基溶解的SP-FITC(冰浴预冷)；冰浴避光孵育40min后，分别弃去多肽溶液，并用预冷PBS洗涤3次。
用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000-IX81，日本)检测细胞中的荧光分布。
结果如图5所示，加入AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的HepG2细胞观测到绿色荧光，而对照组的HepG2细胞则没有观测到绿色荧光信号，说明AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的FITC偶联物与HepG2的识别是序列专一性的。加入AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的293A细胞没有观测到绿色荧光，说明AP-1，AP-2，AP-3，AP-4的FITC偶联物与高表达APN的HepG2细胞是特异性结合。
从实验例1-4可以得出，本发明的多肽具有靶向人氨肽酶N蛋白阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (12)
1.一种靶向人癌细胞的多肽，其特征在于，所述多肽由序列表中的序列1-4之一所示的氨基酸残基组成。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，组成所述多肽的氨基酸残基为L型和/或D型。
3.一种多肽偶联物，其特征在于，所述多肽偶联物是由权利要求1或2所述的多肽与载体偶联获得的偶联物；所述载体为药物、毒素、细胞因子、放射性元素、载体蛋白、酶、凝集素、荧光基团、量子点或高吸光系数发色团。
4.根据权利要求3所述的多肽偶联物，其特征在于，所述载体为酶或荧光基团。
5.根据权利要求4所述的多肽偶联物，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶；所述荧光基团为异硫氰酸荧光素。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的多肽或权利要求3-5之一所述的多肽偶联物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测人癌细胞或人氨肽酶N蛋白。
8.根据权利要求1或2所述的多肽形成的二价体或多价体，其特征在于，所述的二价体或多价体具有靶向人氨肽酶N蛋白的特性。
9.根据权利要求8所述的二价体或多价体，其特征在于，所述的二价体或多价体通过与多聚体共价或非共价连接形成。
10.根据权利要求9所述的二价体或多价体，其特征在于，所述多聚体为聚乙二醇或环糊精。
11.根据权利要求1或2所述的多肽或者权利要求8-10之一所述的二价体或多价体在制备用于诊断癌症的药物或显像制剂中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述癌症为乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌或子宫颈癌中的任意一种。
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| CN104177476A (zh) | 2014-12-03 |
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Granted publication date: 20161005 |