CN104174029A

CN104174029A - 呼肠孤病毒dsRNA在医用内源性干扰素诱导剂制备中的应用

Info

Publication number: CN104174029A
Application number: CN201410346988.7A
Authority: CN
Inventors: 董长垣; 陈冬娥; 聂志平; 邓庚粮; 刘军
Original assignee: WUHAN XINGYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUHAN XINGYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2014-07-21
Publication date: 2014-12-03

Abstract

本发明公开了呼肠孤病毒dsRNA在内源性干扰素诱导剂制备中的应用。以纯化的ReovirusdsRNA为材料制备Reov-dsRNAEnII，直接用于机体，诱导产生各种内源性干扰素，赋予人体抗病毒、抗肿瘤、增强体质的功能。主要优点：A）Reovirus本身不引起人体明显疾病、无肿瘤源性，显著安全；B）诱导人体产生干扰素的种类齐全、体内浓度高，人源病毒、真核分子高度符合种属特异性，无免疫排斥和依赖，在人体内生物活性和药理作用极强，高度药效；C）天然绿色dsRNA生物材料，生态友好；D）资源能无限再生、用之不竭；E）特殊的病毒dsRNA材料可高通量增殖和提取、现代化制备、造价低廉。

Description

呼肠孤病毒dsRNA在医用内源性干扰素诱导剂制备中的应用

技术领域

本发明属于核酸制药技术领域。呼肠孤病毒(Reovirus)双链RNA核酸(dsRNA)在医用内源性干扰素诱导剂(Endo-Interferon Inducer，EnII)制备中的应用是指利用现代生物技术体外增殖天然的、可无限再生的、显著安全的Reovirus绿色资源，高纯度提取其dsRNA分子，并最终制备成体内用核酸制剂，即医用Reovirus dsRNA内源性干扰素诱导剂(Reov-dsRNA EnII)。该EnII直接用于人体内，诱导人体大量的各种相关细胞，如白细胞、成纤维细胞、免疫淋巴细胞以及其他相关细胞，高浓度地产生种类齐全的、高度符合种属特异性的、无免疫排斥和依赖的、在人体内生物活性和药理作用极强的、高度药效的内源性干扰素(Endo-Interferon，ENIs)，从而安全有效地赋予人体抗病毒、抗肿瘤以及广泛的防病、治病和增强体质等功能，亦能用于应对突发性公共卫生事件。

背景技术

由于具有广泛的疾病防治功能的干扰素(Interferon，IFN)(董长垣主编，《现代分子病毒学》，武汉大学出版社，1996年10月)是人类至今所发现的最好的一类细胞因子；也由于内源性干扰素(Endo-Interferon，ENI)较外源性干扰素(Exo-Interferon，EXI)有无可比拟的优点，以及人类至今尚未获得理想的内源性干扰素诱导剂(Endo-Interferon Inducer，EnII) 等原因，人类一直在追求安全的、有效的医用EnII。

1.干扰素及其分类和特性

IFN是由干扰素诱导剂(Interferon Inducer)刺激诱导多种细胞产生的一组多功能的可溶性糖蛋白。通过与细胞受体结合，IFN可活化300多种干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)，发挥多种生物学活性，包括抗病毒作用、抗肿瘤作用以及增强体质的调理作用。

国际干扰素命名委员会(International Commission on Interferon Nomenclature)规定，先根据IFN的动物来源进行初步分类；再根据IFN的抗原特性和分子结构的差异分成不同的型。在特定的型内，按氨基酸序列或组成差异又可分为若干亚型。于是，根据氨基酸序列和受体的不同，IFN被分为I、Ⅱ和Ⅲ三种类型(Richard E.Randall,Stephen G.Interferons and viruses:an interplay between induction,signalling,antiviral responses and virus countermeasures.Jof General Virology,2008,89:4-6)。IFN-α、IFN-β、IFN-г和IFN-ω亚型归于Ⅰ型干扰素，其中IFN-α就有20余个亚型，IFN-β仅有一个亚型；IFN-γ是唯一的Ⅱ型干扰素，且只有1个亚型；IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28a)和IFN-λ(IL-28b)归于Ⅲ型干扰素；IFN-ω是IFN-α家族成员，但是其结构和大小与其它IFN-α略有差异，而其抗原性却有较大差异。以上分类仅适用于人和小鼠干扰素，其他动物干扰素科学积累尚少。

根据产生途径，干扰素又分为天然IFN和非天然IFN。前者是细胞接受干扰素诱导剂刺激而直接产生的干扰素；后者是指借助生物工程技术生产的干扰素。

天然干扰素种类繁多，各自的分子量不同，抗原性也不同。至今，对人原细胞产生的不同干扰素已获得三种不同的抗原成分，包括白细胞干扰素抗原(Le)，人成纤维细胞干扰素抗原(F)和T淋巴细胞干扰素抗原(T)。简言之，Le抗原干扰素即IFN-α，F抗原干扰素即IFN－β，T-干扰素即IFN-γ。

根据来源，IFNs可分为内源性干扰素(ENI)和外源性干扰素(EXI)。EXI就是在体外应用外源性干扰素诱导剂(Exo-Interferon Inducer，ExII)刺激离体培养细胞所生产的或生物工程技术合成的，而后用于机体的IFNs；ENI则是用内源性干扰素诱导剂(Endo-InterferonInducer，EnII)于机体内，直接诱导机体产生的IFNs。

2.干扰素功能

Ⅰ型干扰素主要参与抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫等作用。

Ⅱ型干扰素抗病毒作用比I型IFN弱，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物学活性为免疫调节作用，主要参与诱导MHC类抗原的表达和免疫调节效应。

Ⅲ型干扰素具有抗病毒、抗增殖及体外抗肿瘤等方面作用。

可见，IFN-α、IFN-β、IFN-γ均有抗病毒作用，且其抗病毒作用具有广谱性。其对细胞的抗病毒作用是间接的，广谱的(即非特异性的)(Richard E.Randall,Stephen G.Interferons andviruses:an interplay between induction,signalling,antiviral responses and viruscountermeasures.J of General Virology,2008,89:4-6)。

近年来，有关诱导IFN产生机理的研究，IFN抗病毒、抗肿瘤和调理机体功能的药理和生理作用的研究取得了令人满意的结果，显示了其符合机体自然防御功能的特性。IFN不仅具有抗病毒和抗肿瘤作用，而且具有增强体质的调理作用；既能治疗疾病，又能预防疾病；既能抗已知病毒，也能抗未知病毒(包括烈性病毒，如SARS-CoV、禽流感病毒)。

3.干扰素的产生与干扰素诱导剂

细胞基因组密码着各种IFN基因。由于IFN基因抑制物(IFN suppressor)与IFN基因结合，所以，在一般情况下，IFN基因处于抑制状态。能诱导IFN产生的物质统称为干扰素诱导剂(Interferon inducer)。当干扰素诱导剂作用于细胞膜，便会解脱IFN基因抑制物与IFN基因的结合，IFN操纵子开始转录，合成mRNA，mRNA迅速转移至胞浆，在核糖体上转译出IFN前体，切除信号肽后，成熟的IFN分泌到细胞外。

研究表明，病毒感染细胞后，经相同机制可同时诱生Ⅲ型和I型干扰素，但两者表达量不同(Osterlund P,Veckman V,Siren J,et a1.Gene expression and antiviral activity of alpha/bela intederons and interleukin-29 in virus-infected human myeloid dendritic cells.J Virol,2005,79[15]：9608-9617；Contoli M,Message SD,Laza-Stanca V,et a1.Role of deficienttypeⅢ interferon-lambda production in asthma exacerbations.Nat Med,2006,12[9]:1023-1026；Khaitov MR，Laza-Stanca V，Edwards MR，et a1.Respiratory virus inductionof alpha-,beta-and lambda-interferons in bronchial epithelial cells and peripheral bloodmononuclear cells.Allergy，2009，64[3]：375-386)，表达的组织也不同，例如，IFN-λ应答主要产生于上皮细胞，尤其是在肺、皮肤和肠道，而几乎所有类型的细胞均能产生I型干扰素(Sommereyns C,Paul S,Staeheli P,et a1.IFN-lambda(IFN-lambda)is expressed in atissue-dependent fashion and primarily acts on epithelial cells in vivo.PLoS Pathog,2008,4[3]:e1000017)。在某些条件下，IFN-λ和I型干扰素并不同时表达(Doyle SE，SchreckhiseH,Khuu-Duong K，et a1.Interleukin-29uses a type I interferon-like program to promoteantiviral responses in human hepatocytes.Hepatology,2006,44[4]:896-906)。几乎所有的脊椎动物(包括人)细胞都可产生IFN，但无论在体内还是体外，必须由IFN诱导剂诱导产生。

按照干扰素诱导剂的本质，可将其分为：病毒IFN诱导剂、双链RNA IFN诱导剂、代谢物IFN诱导剂和一些病原菌IFN诱导剂等。衣原体、立克次体、细胞内毒素、真菌提取物等也能诱导IFN产生。目前主要是灭活的新城疫病毒(NDV)用作外源性干扰素诱导剂(ExII)。但是，活的病原体是不能用作干扰素诱导剂的，特别不能作为内源性干扰素诱导剂(Endo-Interferon Inducer，EnII)，更谈不上用于人体。

4.内源性干扰素的优点和内源性干扰素诱导剂

目前所用的外源性干扰素(EXI)在临床使用时会产生系列的毒副作用，如造成白细胞减少、头痛、发热、肝功能异常、感冒样综合征、骨髓抑制、神经系统症状(如失眠、焦虑、抑郁、兴奋、易怒、精神病)等。此外，还有少见的副反应，如癫痫、肾病综合征、间质性肺炎和心律失常等；还可能诱发自身免疫性疾病，如甲状腺炎、血小板减少性紫癜、溶血性贫血、风湿性关节炎、红斑狼疮样综合征、血管炎综合征和Ⅰ型糖尿病等。也由于干扰素的本质是一类蛋白多肽，所以EXI应用于人体必然会引起机体异源反应和依赖性。此外，由于EXI应用于人体时种类单一，药物和生理功能差；而且其制备复杂、价格昂贵，保存和运输麻烦，所以，限制了EXI的大量生产和普及应用。

内源性干扰素(ENI)是应用内源性干扰素诱导剂(EnII)于人体内，直接诱导机体产生的IFNs。在这种情况下，机体变成了生产干扰素的复合工厂，以生产各型干扰素，发挥抗肿瘤、抗感染和调理作用。ENI是由机体自身产生的天然的复合型干扰素，即白细胞干扰素、纤维母细胞型干扰素和免疫型干扰素等，由多种不同类型的细胞诱导生成(Sang-Myeong L,Susan KS,Steven B.Kleiboeker Porcine reproductive and respiratory syndrome virus fieldisolates differ in in vitro interferon phenotypes Veterinary Veterinary.Immunology andImmunopathology,2004,102：217-231)。所以，用EnII在人体内直接诱导产生的ENI能克服EXI的诸多不足，如：诱生的IFN种类齐全、体内浓度高、没有异源蛋白质的免疫原性(即过敏反应和排斥反应)、没有依赖性、无需提纯、造价低廉、……等。也由于IFNs具有相对种属特异性，所以，内源性干扰素的抗病毒、抗肿瘤以及调理功能活性最强。

可见，具有广泛的疾病防治功能的IFNs是人类至今所发现的最好的一类细胞因子；内源性干扰素(ENI)较外源性干扰素(EXI)有无可比拟的优点。然而，欲想得到ENIs，关键是要获得能安全应用于人体的、能有效诱导人体产生ENIs的、造价低廉的、便于工业化生产的、不污染环境的、资源丰富的内源性干扰素诱导剂(EnII)。

一旦获得了理想的EnII便会极大地造福人类，直接用于人体，诱导人体大量的各种类型的相关细胞高浓度地产生种类齐全的、高度符合种属特异性的、无免疫排斥和依赖的、在人体内生物活性和药理作用最强的、高度药效的内源性干扰素(ENIs)，从而安全有效地赋予人体广泛抗病毒、抗肿瘤以及防病、治病和增强体质等功能，亦能用于应对突发性公共卫生事件。

目前用于人体的商业化EnII主要是多聚肌苷酸(Polyinosinic Polycytidylic Acid， Poly[I:C]，PIC)，为人工合成的小分子双链RNA(Chadha KC,Dembinski WE,Dunn CB,et al.Effect of increasing thiolation of the polycytidylic acid strand of poly I：poly C on the alpha,beta and gamma interferon-inducing properties，antiviral and antipmliferative activities.Antiviral Res,2004,64[3]:171-7)，国内于1983年已用于临床，作为广谱抗病毒药物使用。

然而，近年发现：Poly[I:C]具有很多问题，以致在临床应用上受到极大限制，无法推广应用。Poly[I:C]在人体和其他灵长类体内易被血清核酸酶破坏、诱生IFN产生的效能低(Taniguchi,T,Takaoka,A,A weak signal for strong responses:interferon-alpha/betarevisited.Nat.Rev.Mol.Cell.Biol,2001.2:378–386.)。更有文献报道：Poly[I:C]会引起自身免疫性疾病，会导致机体发热、造血机能下降、促红细胞生成素减少、白细胞减少、肝脾细胞破坏、血压及凝血功能失常、转氨酶升高、肾功能损伤等一系列毒副作用，从而大大限制了Poly[I:C]的市场和临床应用(聂实践、胡冬琴，错位双链核糖核酸的热原反应，中国生物工程，2003，23[2]:97-98)。寻找和开发新的第二代医用EnII是全世界生物医学家们角逐的领域，人类一直在追求安全而有效的医用EnII。

5.Reovirus dsRNA具备发展成理想的医用EnII的潜能

人类已认识到：病毒具有诱导IFN的作用、人工合成的dsRNA具有诱导IFN的作用；那么，在理论上讲，来自病毒基因组的dsRNA分子应该具有发展成EnII的潜能。同理，来自人Reovirus的dsRNA分子更应该具有发展成EnII的潜能。

Reovirus基因组由10分子dsRNAs所组成，其分子量为0.5×10⁶-2.7×10⁶，总分子量14×10⁶-15×10⁶，占病毒重量的15％—20％。聚丙烯凝胶电泳(PAGE)技术可将10分子dsRNAs分析成清晰的电泳图谱，该图谱将Reovirus dsRNAs分成大(L)、中(M)、小(S)三个片段组。(董长垣主编，《现代分子病毒学》，武汉大学出版社，1996年10月)。

Reovirus含10分子分段dsRNA，带依赖RNA的RNA聚合酶，故提取和纯化的dsRNAs没有感染性；其基因组为双链RNA分子，耐RNA酶(RNAase)；该病毒不引起人类重大疾病，为dsRNA病毒，没有肿瘤源性；系天然病毒，其核酸是天然核酸，毫无影响生态平衡的后顾之忧(董长垣主编，《现代分子病毒学》，武汉大学出版社，1996年10月)。reovirus因其特殊的分子结构，便于离体增殖和纯化制备，有利于产业化。这些特点赋予了Reovirus极其显著的医用和生物工程价值。

国际上，近年已有力地证明了“dsRNA分子的安全性”。我们已证实了Reovirus对人正常细胞如人胚肺细胞、人气管平滑肌细胞等无感染性；用实验动物小鼠(非敏感动物)作半数致死量测定尚未寻找到LD₅₀，显示了该病毒对实验小鼠的安全性。近十年，申请人和国际同行又反复证明了：人呼肠孤病毒(Reovirus，RV)及其同科成员BTV对人体十分安全；具有靶向抗人癌作用；该科病毒已被用于发展靶向溶癌病毒(Oncolytic Virus)(Hu J,Dong CY,Li JK-K,Chen DE and Liang K.Selective in vitro degradation of human cancer cells by Bluetonguevirus.Acta Oncologica,2008,47:124-134；Strong JE,Coffey MC,Tang D,Sabinin P,LeePWK.The molecular basis of viral oncolysis:usurpation of the Ras signaling pathway byreovirus.EMBO.J,1998,17(12):3351-3362；J.K.-K.Li,Oncolytic Bluetongue viruses:Promise,progress and perspectives,Frontiers in Microbiol.,2011，2:1-13.)。

近年，申请人又在离体培养的人源细胞(正常/肿瘤细胞)上，以目前最好的商业化的能用于人体的干扰素诱导剂Poly[I:C]为对照，比较研究了Reovirus-3和Reovirus裸露dsRNA(Reovirus NdsRNA)的安全性和作为外源性干扰素(Exo-Interferon，EXI)的潜力，结果表明：①Reovirus-3对人源正常细胞安全；②Reovirus dsRNA对离体培养的人正常细胞安全；③Reovirus dsRNA能有效地诱导离体培养的人源细胞(包括正常细胞和肿瘤细胞)产生IFN-β；④Reovirus dsRNA体外诱导IFN-β的产量显著高于Poly[I:C](P<0.01)；⑤Reovirus dsRNA能通过诱导产生IFN而杀死离体培养的人癌细胞。

进而，我们成功地建立起了单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus tipe1，HSV-1)感染昆明鼠实验动物模型；借助该实验动物模型，以目前最好的商业化干扰素诱导剂Poly[I:C] 为阳性药物对照，系统地开展了Reovirus dsRNA(Reov-dsRNA)体内安全性研究、诱导动物产生IFN的有效性及其体内诱导内源性IFNs的种类研究、Reov-dsRNA体内预防HSV-1感染效果的研究、体内抗HSV-1感染治疗效果的研究，获得了一系列极其有价值的研究结果。

(1)HE染色病理切片显示，与既未接种HSV-1也未应用Reov-dsRNA的空白对照组相比，HSV-1感染模型组的脑组织病变明显，验明了HSV-1感染模型建立成功。

(2)Reov-dsRNA处理的小鼠，无明显不良反应，提示该病毒dsRNA在机体内是安全的。

(3)借助双位点夹心酶联免疫吸附技术(ELISA)检测实验动物血清中干扰素水平结果显示：

(A)单纯应用Reov-dsRNA能有效地高水平诱导实验动物产生各种干扰素，其中，IFN-α(234.45±4.328pg/ml)、IFN-β(13.684±0.533ng/ml)、IFN-γ(236.846±11.003pg/ml)；

(B)以空白动物为对照，Reov-dsRNA和poly[I:C]都能有效地诱导实验动物产生内源性干扰素，如IFN-α、IFN-β、IFN-γ(P<0.05)；

(C)Reov-dsRNA体内诱导IFN-α、IFN-β、IFN-γ水平显著地高于poly[I:C](P<0.05)；

(D)与未用Reov-dsRNA的病毒模型组比较，预防组动物产生IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平显著地高于病毒模型组，差异有显著性(P1<0.05)。

(E)与未用Reov-dsRNA的病毒模型组比较，治疗组动物产生IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平显著地高于病毒模型组，差异有显著性(P2<0.05)。

(4)统计分析Reov-dsRNA预防HSV-1感染组与poly[I:C]预防HSV-1感染组小鼠死亡率，结果显示：Reov-dsRNA预防HSV-1感染组死亡率显著低于poly[I:C]预防HSV-1感染组(P<0.05)，提示Reov-dsRNA具有良好的预防HSV-1感染的效果。

(5)统计分析Reov-dsRNA治疗HSV-1感染组与poly[I:C]治疗HSV-1感染组小鼠死亡率，结果显示：Reov-dsRNA治疗HSV-1感染组死亡率显著低于poly[I:C]治疗HSV-1感染组(P<0.05)，提示Reov-dsRNA具有良好的治疗HSV-1感染的效果。

(6)统计分析Reov-dsRNA预防HSV-1感染组与Reov-dsRNA治疗HSV-1感染组小鼠死亡率，结果显示：Reov-dsRNA治疗HSV-1感染组死亡率高于Reov-dsRNA预防HSV-1感染组(P<0.05)，提示Reov-dsRNA预防HSV-1感染的效果优于Reov-dsRNA治疗HSV-1感染的效果。

由上，可以得出以下结论：

(1)Reov-dsRNA在实验动物体内是安全的；

(2)Reov-dsRNA能够在实验动物体内高效诱生IFN-α、IFN-β、IFN-γ，增强机体免疫功能，发挥良好的预防单纯疱疹病毒感染的作用；

(3)Reov-dsRNA能够在实验动物体内高效诱生IFN-α、IFN-β、IFN-γ，增强机体免疫功能，发挥良好的治疗单纯疱疹病毒感染的作用；

(4)Reov-dsRNA对HSV-1感染的预防效果优于poly[I:C]；

(5)Reov-dsRNA对HSV-1感染的治疗效果优于poly[I:C]；

(6)似乎是，Reov-dsRNA预防HSV-1感染的效果优于Reov-dsRNA治疗HSV-1感染的效果。

以上研究结果清楚地提示申请人：Reov-dsRNA具备发展成理想的医用内源性干扰素诱导剂(EnII)的潜能，即具有显著的发展成新型抗病毒药物的潜能。

申请人研究Reov-dsRNA作为EnII，无论体内还是体外，均以Poly[I:C]为对照；无论在理论上，还是在体内、体外研究结果上，Reov-dsRNA EnII均优于Poly[I:C]。申请人考虑，其原因可能是(A)Poly[I:C]为人工合成的dsRNA，而Reovirus dsRNA则是天然的dsRNA；(B)Poly[I:C]为较小分子dsRNA，而Reovirus dsRNA则是大分子dsRNA；(C)Reov-dsRNA EnII来自Reovirus，如前所述，其分子大小和结构特征(10分子dsRNAs，L、M和S三个片段组，G+C含量)等特殊条件密切相关。

6.dsRNA分子诱导细胞产生IFNs的细胞分子机理已很成熟

前面，我们已就干扰素、干扰素诱导剂、IFNs的产生、以及IFNs的各种重要生理功能、……等作了介绍。有关其细胞分子机理也研究得很清楚：首先是，干扰素诱导剂作为配体，作用于特定的细胞受体，通过细胞信号通路将信息传递到细胞核，以激活人类基因组编码的各种IFN基因，表达各种不同的干扰素，并释放到细胞外。其次是，释放到细胞外的干扰素作为配体，与靶细胞特异性受体结合，通过信号传导系统诱导靶细胞产生抗病毒等生物功能作用。

Reov-dsRNA和Poly[I:C]的本质都是dsRNA分子，均能诱导IFN产生。近年已证实，TLR3(Toll like receptor3)和RIG-I/MDA5细胞信号转导通路是识别dsRNA、诱导Ⅰ型IFN表达的重要分子。TLR3主要表达于免疫细胞，定位于细胞内涵体(endosome)膜上的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，识别经内吞作用进入细胞囊泡的dsRNA分子，诱导Ⅰ型IFN表达。RIG-Ⅰ/MDA5定位于细胞质内的PRR，识别胞质内dsRNA，通过不依赖TLR3的方式诱导IFN合成。(Alexopoulou L,Holt AC，Medzhitov R，et al.，Recognition ofdouble-stranded RNA and activation of NF-kappa B by toll-like receptor3.Nature，2001,413[6857]:732-738)。目前已发现有二条途径介导TLRs(Toll like receptors)信号转导，一为髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88MyD88)依赖性途径(Akashi S,ShimazuR,Ogata H,et al.，Cutting edge:cell surface expression and lipopolysaccharide signaling viathe toll-like receptor 4-MD-2 complex on mouse peritoneal macrophages.J.Immunol.2000,164[7]:3471-3475)；另一条为MyD88非依赖性途径(Kawai T,Adachi O,Ogawa T,et al.，Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin.Immunity,1999,11[1]:115-122)。MyD88分子是大多数TLRs信号转导中的接头分子，但是，MyD88功能缺失并不能完全终止所有的TLRs信号。所以,TLRs信号转导必然还存在MyD88非依赖信号途径。TLRs是单次跨膜受体，胞外区有LRRs(leucine-rich repeats)结构域，识别特定的病原相关分子模式(PAMP)配体，如病原体组份、病原体产物、dsRNA等；胞内区是TLR向下游传递信号的核心元件。TLRs家族成员的胞外区结构的差异性较大，是结合不同配体的结构学基础。在已知的11个TLRs中，只有TLR3识别外源dsRNA、诱导Ⅰ型IFN合成(Alexopoulou L,Holt AC,MedzhitovR,et al.，Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by toll-likereceptor3.Nature,2001,413[6857]:732-738)。

视黄酸诱导基因蛋白I(RIG-I)也是细胞内识别病毒dsRNA的一种受体，属含DexD/H box的dsRNA解旋酶家族成员。RIG-I的C端是解旋域，可以借助解旋酶结构域结合人工合成的或病毒的dsRNA，并以ATP酶依赖的方式解开dsRNA。N端是2个串联的半胱天冬酶募集结构域(CARD)，诱导IFN-β表达需要RIG-I。但是，RIG-I并不参与IFN-β下游的信号通路(Kato H,Sato S,Yoneyama M,et al.，Cell type-specific involvement of RIG-Ⅰin antiviral response.Immunity,2005,23[1]:19～28)。MDA5又是一个能结合dsRNA、激活IRF-3(IFN regulatoryfactor3)、诱导IFN表达的信号分子(Kata H,Takeuchi O,Sato S,et al.，Differential roles ofMDA5and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.Nature,2006,441[7089]:101～105)。

Ⅰ型干扰素是连接天然免疫和获得性免疫的关键枢纽分子。不同的TLRs诱导产生Ⅰ型干扰素能力并不相同，不同的DC细胞亚群产生Ⅰ型干扰素的能力也不一样。

7.干扰素受体及其信号通道

产物IFN释出胞外，作为配体，与靶细胞特异性受体结合，激活与受体胞浆端相连的“两面神”激酶(Janus kinases，JAKs)，JAKs再磷酸化激活信号转导子和转录激动子(signaltransducers and activators of transcription，STATs)中的酪氨酸残基，使信号放大。磷酸化激活的STATs酪氨酸残基与磷酸化酪氨酸的Src同源区2(SH2)形成同二聚体和异二聚体。异二聚体和同二聚体都可与IRF结合，组成不同的三聚体。不同的三聚体与IFN激活的调节序列(IFNstimulated regulatory elements，ISREs)结合以分别驱动IFN-α/β调控的基因表达或IFN-γ调控的基因表达。近年的研究工作已经搞清，是dsRNA依赖蛋白激酶(double-strandedRNA-dependent Protein Kinase,PKR)和2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(OAS)参与IFN介导的抗病毒反应(Smith E J,Marie I,Prakash A,et al.IRF3and IRF7phosphorylation in virus-infectedcells does not require double-stranded RNA-dependent protein kinase R or Ikappa B kinasebut is blocked by Vaccinia virus E3L protein.J Biol Chem,2001,276[12]:8951～8957)。

dsRNA分子及其诱导干扰素产生的细胞信号转导通路的研究成绩也为安全而有效地应用Reov-dsRNA EnII诱导人体内源性IFNs，赋予人体自身安全有效地抗病毒、抗肿瘤，广泛地防病、治病，增强体质等功能以及用于应对突发性公共卫生事件提供了可靠的理论依据。

8.小结

申请人的前期应用基础理论研究成绩结合上述系列的基础理论研究成绩为申请人提出的本发明专利申请奠定了坚实的理论基础和技术条件。本发明提供的正是这样一种全新的优于Poly[I:C]的Reov-dsRNA EnII。

发明内容

本发明正是基于：IFNs是人类至今所发现的最好的一类细胞因子，具有广泛的疾病防治功能；内源性干扰素(ENI)较外源性干扰素(EXI)有无可比拟的优点；欲想得到ENI，关键是要获得能安全应用于人体的、能有效诱导人体产生ENIs的、造价低廉的、便于工业化生产的、不污染环境的、资源丰富的EnII；目前用于人体的商业化EnII，Poly[I:C]，有很多问题，以致在临床应用上受到极大限制；寻找和开发新的第二代医用EnII是全世界生物医学家们角逐的领域，人类一直在追求安全而有效的新的医用EnII。

本发明将呼肠孤病毒双链RNA(Reovirus dsRNA)应用于制备内源性干扰素诱导剂(Endo-Interferon Inducer，EnII)，即形成Reov-dsRNA EnII。本Reov-dsRNA EnII极具临床应用前景，直接注射人体，在人体内遵循自身防御反应方式的条件下，诱导人体产生各种内源性干扰素(Endo-Interferon，ENIs)，赋予人体抗病毒病治疗、抗病毒病预防、抗肿瘤的治疗和联合治疗、以及广泛的防病、治病和增强体质的功能，以及用于应对突发性公共卫生事件等重要作用。本专利提供的这种全新的优于Poly[I:C]的Reov-dsRNA EnII不仅具有高度的安全性和高效性、适合人类之急需，而且造价低廉、便于工业化生产、不污染环境、资源丰富。

该EnII具有如此重要医用功能，主要在于它的天然分子结构。只要我们能有效地高效地增殖Reovirus、高效高纯度地提取其dsRNA核酸、并最终制备成体内用核酸制剂等，即可成为全新的、更安全的、更有效的、天然的、可无限产业化的、人类急需的EnII，造福人类。

本发明的技术要点：

(1)借助体外细胞培养系统增殖Reovirus；

(2)提取高纯度的Reovirus dsRNA分子；

(3)制备成能直接用于人体的Reov-dsRNA EnII。

凡能满足获得高纯度Reovirus dsRNA并制备成Reov-dsRNA EnII的技术方法均能达此目的。例如，本专利申请人前期采取了如下技术措施实现了本发明的目标，其基本步骤是：

1.所用细胞及其培养：以世界卫生组织推荐为生产人用疫苗的理想细胞，----非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary，CHO)、幼仓鼠肾传代细胞(BHK-21)为病毒扩增培养细胞。细胞在37℃、5％CO₂、10％小牛血清、DMEM培养基常规培养。

2.Reovirus培养增殖：待细胞长至80％-90％汇合时，弃培养液，用pH7.4的1×PBS洗涤贴壁细胞1-2次，接种Reovirus悬液1.0ml于培养瓶，37℃吸附1-2小时后，弃病毒液，以含2％小牛血清的添加DMEM培养基在37℃，5％ CO₂条件下维持培养。随后每12小时光镜下观察一次，至细胞出现明显细胞病变效应(CPE)，即当CPE达90％时收获增殖的Reovirus的培养细胞，弃去培养液。

3.Reovirus的初提取和Reovirus dsRNA的纯化制备：

橡皮垫帚刮下已弃去培养液的带毒细胞，收集在无菌试管中；加入10倍体积DEPC水，充分溶解带毒细胞；-20℃反复冻融3次，12000-15000rpm，离心10-15min，收集上清；饱和硫酸铵沉淀上清后4000rpm离心30min，含病毒沉淀备作dsRNA纯化用。

采用TRIzol法提取制备Reovirus dsRNA。等体积PBS(pH7.4)溶解含病毒沉淀，装透析袋；DEPC水透析，彻底除去硫酸氨后转入EP管；加9.5倍体积Trizol，裂解病毒；加0.2倍体积氯仿到裂解病毒液；12000g，离心12-15min，取上层水相收集Reovirus RNA；等体积异丙醇沉淀Reovirus RNA；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀，风干；DEPC水溶解ReovirusRNA，-20℃储存备用。

4.提取Reovirus基因组dsRNA的鉴定：

(1)采用琼脂糖凝胶电泳技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析电泳图谱鉴定Reovirus基因组dsRNA。

(2)提取Reovirus dsRNA纯度鉴定：结合(A)采用紫外分光光度法(根据OD260/OD280比值)和(B)聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合电泳凝胶背景蛋白染色技术判断所提取ReovirusdsRNA的纯度。

(3)采用紫外分光光度法测定dsRNA含量，根据dsRNA浓度＝OD₂₆₀×稀释倍数×50(μg/ml)公式计算Reovirus dsRNA浓度。

5.生理盐水制备成Reov-dsRNA EnII注射剂型，经肌内注射使用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)Reov-dsRNA EnII显著地优于目前所用的最好的商业化的Poly[I:C]，能非常安全地运用于人体。Reovirus为dsRNA病毒，对人类安全，不引起人类任何重大疾病；该病毒含分段dsRNA，带依赖RNA的RNA聚合酶，故提取和纯化的Reovirus dsRNAs没有感染性；Reovirus为dsRNA病毒，没有肿瘤源性；近年人类研究的伟大成果更是结论，dsRNA分子对人类安全，大分子dsRNA可诱导干扰素，小分子dsRNA诱导RNA干涉(RNAi)。所以，本发明的全新的Reov-dsRNA EnII能非常安全地应用于人体。

(2)本发明Reov-dsRNA EnII的临床效果显著地优于目前所用的最好的商业化的Poly[I:C]。Poly[I:C]为人工合成的小片段dsRNA分子，诱生IFN的能力低，伴有许多副作用，且价格昂贵，市场受到极大的限制。本发明在研究Reov-dsRNA EnII过程中，无论体内还是体外，均以Poly[I:C]为对照；无论在理论上，还是在体内、外实验结果上，Reov-dsRNA EnII 均优于Poly[I:C]。

(3)Reov-dsRNA EnII为新的理想的天然核酸药物，具有广泛的治疗药物作用和生理调节功能。IFNs是人类至今所发现的最好的一类细胞因子，不仅具有抗病毒和抗肿瘤作用，而且具有增强体质的调理作用。本发明制备的Reov-dsRNA EnII是医用内源性干扰素诱导剂，直接应用于人体，诱导机体产生种类齐全的内源性干扰素(ENIs)。在这种情况下，机体变成了生产干扰素的复合工厂，以生产复合型干扰素，发挥抗肿瘤、抗感染和调理作用。这种ENIs是天然干扰素，所以，用EnII在人体内直接诱导产生的ENIs能克服外源性干扰素的诸多不足。Reov-dsRNA EnII在人体内诱生的IFN种类齐全、体内浓度高、没有异源蛋白质的免疫原性(即过敏反应和排斥反应)、没有依赖性；可用作治疗用药，也可以作为预防用药；既可用于抗病毒病治疗，也可用于抗病毒病预防；既能抗已知病毒，也能抗未知病毒(包括烈性病毒，如SARS-CoV、禽流感病毒)；既能抗病毒治疗，也能抗肿瘤治疗(包括联合抗肿瘤治疗)，具有广泛的防病、治病和增强体质的功能，以及用于应对突发性公共卫生事件的重要作用。也由于IFNs具有相对种属特异性，所以，由Reov-dsRNA EnII在体内诱导的ENIs抗病毒、抗肿瘤以及调理功能活性最强。本发明制备的EnII用于人体完全遵循机体产生干扰素的防御反应法则，能更有效诱导ENIs的产生。

(4)Reov-dsRNA EnII理所当然地也能用作Reov-dsRNA外源性干扰素诱导剂(ExII)。

(5)全新的理论基础。由于近年关于dsRNA分子作为配体与靶细胞特异性受体，如TLR3，相互作用及其细胞信号通路研究的成绩积累，使dsRNA与靶细胞相互作用的后果及其细胞分子机理的成熟，为直接应用Reov-dsRNA EnII于人体，诱导各种在体细胞产生IFNs(即ENIs)奠定了理论基础。Reov-dsRNA EnII体内诱导ENIs的作用机理是应用Reov-dsRNA分子通过上述机理直接调控人源细胞干扰素基因的表达。这是一个全新的理论体系，揭示了裸露的病毒基因组dsRNA无须用转基因技术而直接通过注射的方式应用于人体，并安全而有效地诱导机体产生各种ENIs，发挥其药理和生理作用。

(6)具有显著的资源优势。Reovirus dsRNA是一种全新的对人安全的天然的可无限再生的绿色生物材料，取之不尽，用之不竭。Reov-dsRNA EnII正是以之为资源而提取制备的天然内源性干扰素诱导剂。

(7)以Reovirus资源制备天然dsRNA EnII，便于离体增殖和纯化制备，无需提纯、造价低廉，有利于产业化，生产成本低，有利于市场供给。

(8)由于Reov-dsRNA EnII体内诱导ENIs产生的速度快、安全、高效、造价低廉，所以，既能用于临床疾病的常规预防和治疗，也可用于应对突发性公共卫生事件。

(9)本发明制备的EnII市场很大。申请人的前期工作已经展示了理想的EnII的医学价值和市场前景。Reov-dsRNA EnII具有诱导IFN产生的生理功能，具有广泛抗病毒和抗癌的作用，而病毒性疾病和肿瘤性疾病这两类疾病都是目前对人类健康和生命威胁最大的疾病。从近年新的病毒病等(如：AIDS、SARS、禽流感、结核等)的出现和流行来看，新的传染病的预防显得特别重要，由此可见Reov-dsRNA EnII的用武之地。所以，Reov-dsRNA EnII既在新、老传染病预防和治疗上有广阔的市场，又具有应对突发性公共卫生事件的重大价值，比如说，它是抗乙型肝炎的首先药物，可见一斑。由于ENI较EXI有无可比拟的优点，所以，理想的Reov-dsRNA EnII将会占据IFN生产相关的极大市场，并会极大地扩大现有IFN市场。

附图说明

图1.呼肠孤病毒(Reovirus)结构示意图。病毒呈球形，双层衣壳，基因组分段排列在单层内衣壳内。

图2.增殖感染vero细胞的呼肠孤病毒3型(Reovirus-3)超微切片电镜图。

图3.体外培养Reovirus dsRNA基因组10％PAGE图谱。A为未感染病毒的vero细胞提取物；B&C均为感染Reovirus的vero细胞提取物，显示10分子dsRNA条带；D为1.0kbDNA marker(购自加拿大Fermentas公司)。

图4.未感染HSV-1的Vero细胞。在荧光显微镜下，未感染HSV-1的Vero细胞未见绿色荧光，在紫外光下可见细胞呈梭形，排列规则，生长茂盛，未见细胞病变效应(CPE)。

图5.绿色荧光蛋白标记的单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染vero细胞。实验用绿色荧光蛋白标记的HSV-1增殖感染培养的Vero细胞，发出强烈的绿色荧光。此图像也明显呈现：感染HSV-1的vero细胞收缩、变圆、脱落等细胞病变效应(CPE)。

图6.HSV-1感染小鼠模型脑组织匀浆接种Vero细胞的病毒增殖图像。取HSV-1感染小鼠模型脑组织匀浆接种Vero细胞，实验细胞发出清晰的绿色荧光，说明：HSV-1感染小鼠模型建立成功，并从模型动物大脑组织成功分离到HSV-1。此图像也明显呈现：感染HSV-1的vero细胞收缩、变圆、脱落等细胞病变效应(CPE)。

图7.HSV-1增殖感染vero细胞显微观察结果。被感染的vero细胞发出绿色荧光；绿色荧光的密度和强度直接反应了HSV-1复制增殖的量。本图7的右下角紫色图为未接种HSV-1的体外培养vero细胞(见图4)；上面3张图为感染了HSV-1的体外培养vero细胞；下面左下角和中间2张图为小鼠模型脑组织匀浆接种于Vero细胞，绿色荧光表明大量HSV-1在Vero细胞增殖。

图8.正常脑组织石蜡切片，HE染色后光学显微镜下观察图像。从图8中可见正常的脑组织，结构层次清晰，无充血或者炎性细胞浸润。(放大倍数见图中标尺)

图9.HSV-1接种小鼠脑病变组织病理学光学显微镜照片1，显示HSV-1感染小鼠模型建立成功。图9中可见：大量的核被深染的单核炎性细胞聚集并粘附在血管壁上，且呈现向周围组织扩散的倾向。(放大倍数见图中标尺)

图10.HSV-1接种小鼠脑病变组织病理学光学显微镜照片2，表明HSV-1感染小鼠模型建立成功。图10中可见：大量的核深染的单核炎性细胞聚集在脑组织，形成灶状。(放大倍数见图中标尺)

图11.HSV-1接种小鼠脑病变组织病理学光学显微镜照片3，表明HSV-1感染小鼠模型建立成功。图11中可见：大片脑组织坏死，脑细胞裂解；细浆释出，细胞边界不清，染成红色，模糊一片；胞核深染、浓缩、碎片散在红色细胞质区域。(放大倍数见图中标尺)

图12.Reov-dsRNA EnII诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)效果研究结果统计分析图。图12中：1为生理盐水(NS)组；2为Reov-dsRNA EnII组；3为Poly[I:C]组。从图12可见：以空白对照(NS)组的干扰素为本底，与NS对比，Reov-dsRNA EnII和Poly[I:C]均能有效诱导3种IFNs，使各种IFNs水平显著上调；与Poly[I:C]对比，Reov-dsRNA EnII诱导各种IFNs效果显著高于Poly[I:C]，提示了Reov-dsRNA EnII极大的应用潜能。

图13.Reov-dsRNA EnII预防HSV-1感染实验研究中Reov-dsRNA EnII诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)效果的统计分析图。图13中：1为生理盐水(NS)组；2为Reov-dsRNA+HSV-1组；3为Poly[I:C]+HSV-1组。从图13可见：以空白对照(NS)组的干扰素为本底，Reov-dsRNA+HSV-1组和Poly[I:C]+HSV-1组表达3种IFNs的产生量显著地高于NS组。这就表明，Reov-dsRNA和Poly[I:C]都能有效地诱导各种干扰素的表达，使各种IFNs水平显著上调；并且，与Poly[I:C]对比，Reov-dsRNA诱导各种IFNs的效果显著高于Poly[I:C]。这就为在病毒入侵前用Reov-dsRNA EnII建立起抗病毒感染的免疫机制，抵抗病毒入侵致病提供了实验室理论依据；亦为使用Reov-dsRNA EnII应对突发性公共卫生事件提供了实验室理论依据。

图14.Reov-dsRNA EnII治疗HSV-1感染实验研究中Reov-dsRNA EnII诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)效果的统计分析图。图14中：1为仅用HSV-1感染组；2为HSV-1+Reov-dsRNA组；3为HSV-1+Poly[I:C]组。从图14可见：与仅用HSV-1感染的组1比较，先用HSV-1造成感染后再用Reov-dsRNA治疗的组2(HSV-1+Reov-dsRNA组)和先用HSV-1造成感染后再用Poly[I:C]治疗的组3(HSV-1+Poly[I:C]组)表达3种IFNs的产量极为显著地增高。这就表明，Reov-dsRNA和Poly[I:C]都能有效地在HSV-1感染后诱导各种干扰素的表达，使各种IFNs水平显著上调；并且，与Poly[I:C]对比，Reov-dsRNA诱导各种IFNs的效果显著高于Poly[I:C]。这就为在病毒入侵感染后应用Reov-dsRNA EnII进行治疗，实现抗病毒病提供了实验室理论依据；亦为使用Reov-dsRNA EnII治疗未知病毒感染提供了实验室理论依据。

图15.分别应用Reov-dsRNA EnII、Poly[I:C]、HSV-1后实验动物血清中3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)产量的比较研究统计分析图。图15中：1为HSV-1应用组、2为Poly[I:C]应用组、3为Reov-dsRNA EnII应用组。从图15可见：HSV-1诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的作用最低；Poly[I:C]诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的作用显著比HSV-1强；Reov-dsRNA EnII诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的作用最强，显著超过了Poly[I:C]。这就显著提示了：Reov-dsRNA EnII的创新性、科学价值、以及显著的临床应用价值。

图16.以HSV-1为本底作空白对照，Poly[I:C]作阳性药物对照，研究Reov-dsRNA EnII预防HSV-1感染时诱导实验动物产生IFN-α、IFN-β、IFN-γ效果的统计分析图。图16中：1为仅用HSV-1处理组；2为Poly[I:C]+HSV-1处理组，即先用Poly[I:C]处理，后用HSV-1攻毒；3为Reov-dsRNA+HSV-1处理组，即先用Reov-dsRNA EnII处理，后用HSV-1攻毒。该研究旨在探讨Reov-dsRNA EnII预防HSV-1感染作用的基础上进一步研究Reov-dsRNA EnII诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)产生与其预防HSV-1感染的关系。从图16可见：HSV-1有一定的体内诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的效果；以HSV-1为本底作空白对照，进一步获得Poly[I:C]体内诱导3种干扰素的作用比HSV-1显著强；Poly[I:C]+HSV-1为阳性药物对照，再进一步获得Reov-dsRNA EnII体内诱导3种干扰素的作用显著超过了Poly[I:C]，在三者中体内诱导3种干扰素的作用最强。这就更进一步提示了：Reov-dsRNA EnII的创新性、科学价值、以及显著的临床应用价值。

图17.以HSV-1为本底作空白对照，Poly[I:C]作阳性药物对照，研究Reov-dsRNA EnII治疗HSV-1感染时诱导实验动物产生IFN-α、IFN-β、IFN-γ效果的统计分析图。图17中：1为仅用HSV-1处理组；2为HSV-1+Poly[I:C]处理组，即先用HSV-1感染动物，后用Poly[I:C]治疗；3为HSV-1+Reov-dsRNA EnII处理组，即先用HSV-1感染动物，后用Reov-dsRNA EnII治疗。该研究旨在探讨Reov-dsRNA EnII治疗HSV-1感染作用的基础上进一步研究Reov-dsRNA EnII诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)产生与其治疗HSV-1感染作用的关系。从图17可见：HSV-1有一定的体内诱导3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的效果；以HSV-1为本底作空白对照，进一步获得Poly[I:C]体内诱导3种干扰素的作用比HSV-1显著强；HSV-1+Poly[I:C]为阳性药物对照，再进一步获得Reov-dsRNA EnII体内诱导3种干扰素的作用显著超过了Poly[I:C]，在三者中体内诱导3种干扰素的作用最强。同样地，该研究更进一步提示了：Reov-dsRNA EnII的创新性、科学价值、以及临床应用价值。

图18.不同研究组3种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)表达水平比较研究柱状图。图18中：^*表示各研究组与空白对照组比较，P＜0.05；^**表示各研究组与HSV-1感染模型组比较，P＜0.05；△表示Reov-dsRNA+HSV-1组与Poly[I:C]+HSV-1组比较，P＜0.05；△△表示HSV-1+Reov-dsRNA组与HSV-1+Poly[I:C]组比较，P＜0.05。

具体实施方式

基于本发明专利要求是“呼肠孤病毒dsRNA(Reovirus dsRNA)在医用内源性干扰素诱导剂(EnII)制备中的应用”，这种Reov-dsRNA EnII将通过注射直接应用于人体，诱导人体产生各种内源性干扰素(Endo-Interferons，ENIs)，从而赋予人体抗病毒、抗肿瘤以及广泛的防病、治病和增强体质的功能，亦能用于应对突发性公共卫生事件。所以，本节将以具体的实施例进一步阐述本发明。在此，我们强调如下实施例仅用于进一步说明本发明，而非用于限制本发明要求的保护范围。

实施例1.呼肠孤病毒(Reovirus)扩增用vero细胞和其他敏感细胞的培养传代细胞系的复苏及培养传代(以vero细胞为例)

1.1Vero细胞培养与增殖

采用DMEM培养基，加10％小牛血清，调pH至7.0-7.4，置37℃、5％CO₂条件下培养，增殖Vero细胞，步骤如下。

1.1.1从液氮罐中取出非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)冻存管，迅速置于预先调好温度的37℃水中水浴，轻轻晃动冻存管，使冻存管内的细胞悬液1min内迅速完全融化。

1.1.2融化后将冻存管进行离心，将冻存管放入离心机，800-1000rpm，10-20min，使细胞完全沉淀；吸弃上清液，加入1.5mL DMEM培养液，吹打使沉淀重新悬浮。

1.1.3再次将冻存管离心，800-1000rpm，10-20min，使细胞完全沉淀；吸弃上清，加入含10﹪(v/v)小牛血清的DEME培养液，吹打沉淀分散细胞；用同样的培养液调节细胞悬液，使终浓度为(0.8-1.2)×10^3-4细胞/mL。

1.1.4按每8-12mL细胞悬液接种一培养瓶，补足培养液，37℃，5﹪CO₂(v/v)条件下静置培养；24小时后换DMEM培养液，以除去未贴壁的细胞和细胞碎片。

1.1.5每天裸眼观察培养液的变化，镜下观察培养细胞生长状态，每1～2天换上述DMEM培养液一次。

1.1.6待细胞生长铺满瓶底80％以上即可进行细胞传代培养，从培养箱中取出细胞培养瓶，弃去培养液，用无钙镁磷酸盐平衡缓冲液(1×PBS，pH7.4)洗细胞2-3次；加入0.25％(w/v)胰蛋白酶溶液6-10滴；转动培养瓶，使胰蛋白酶溶液能浸润整个细胞面；置于37℃培养箱温育数分钟，光学显微镜下观察到细胞收缩变圆后，小心弃去胰蛋白酶溶液。

1.1.7加入含10％(v/v)小牛血清的DMEM培养基，用吸管轻轻吹打附着在瓶壁上的细胞，使之全部脱落到培养液中，形成细胞悬液。

1.1.8向细胞悬液中补加含10％(v/v)小牛血清的DMEM培养基至终体积15-25mL，平均分装细胞悬液到2-3个新培养瓶中。

1.2细胞经传代后的培养

采用含10％(v/v)小牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％(v/v)CO₂条件下继续培养，即为传代。

实施例2.Reovirus(见图1、图2)增殖

2.1选取状态良好的vero细胞，待细胞汇生达80％-90％汇合时，吸弃培养液；用pH7.4的1×PBS(NaCl：8g、KCl:0.2g、Na₂HPO₄：1.44g、KH₂PO₄：0.24g、H₂O：800ml；盐酸调pH7.4，补H₂O到1000ml)洗涤贴壁细胞2-3次。

2.2按2-4MOI(multiplicity of infection)接种呼肠孤病毒(Reovirus)于培养细胞；37℃吸附病毒1～2小时后，弃病毒液，加含2％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO₂(v/v)条件下维持培养。

2.3随后每12小时光镜下观察一次，至细胞出现明显病变效应，即CPE达90％时收获病毒感染的贴壁细胞瓶，置-20℃保存备用。

实施例3.Reovirus毒力测定

3.1取出-20℃保存备用Reovirus感染细胞，反复冻融病毒3次，释放病毒成Reovirus悬液。

3.2用1×PBS(pH7.4)对Reovirus悬液作10×梯度稀释，即梯度从10⁰-10^-8，稀释时注意，每个梯度稀释完成后更换枪头。

3.3胰蛋白酶消化Reovirus后，加入15ml细胞培养液以分散细胞。

3.4血球计数板细胞计数(1ml细胞数＝每格平均细胞数×4×10⁶×稀释倍数)得细胞量为3.86×10⁸/ml，每孔加入100μl细胞悬液。

3.5 96孔板置于37℃，5％CO₂(v/v)条件下孵化12小时后，吸去培养液，加入梯度稀释的病毒液，每个梯度6孔，每孔100μl，注意每个梯度加液时需更换枪头。

3.5用封口膜将96孔板结合处封闭，置于37℃，5％CO₂(v/v)条件下孵化，每12小时观察一次，记录细胞病变孔数，使用Reed-Muench方法计算TCID₅₀(TCID₅₀的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例x稀释系数的对数的差)为4.86×10⁶/ml。

实施例4.Reovirus初提取

4.1弃去Reovirus致细胞病变的培养瓶中培养液，橡皮垫帚刮下带毒细胞，集中收集在无菌试管中；

4.2加入10倍体积焦碳酸二乙酯(DEPC)水，使带毒细胞充分溶解；

4.3-20℃反复冻融3次，12000-15000rpm，4℃离心10-15min，弃沉淀，收集上清；

4.4上清液加饱和硫酸铵，使硫酸铵终浓度为70％(按1份病毒上清加3份饱和硫酸铵)，于25℃(或室温)沉淀2个小时，然后4000rpm离心30min，取含病毒沉淀，备作病毒dsRNA纯化用。

实施例5.TRIzol法提取制备Reovirus RNA

5.1等体积1×PBS(pH7.4)溶解上述含病毒沉淀，装透析袋；

5.2用DEPC水于4℃透析24-48小时，期间每隔3-6小时换DEPC水一次，以彻底除去硫酸氨后转入EP管；

5.3加9.5倍体积Trizol Reagent漩涡震荡30秒，裂解病毒，待溶液清亮后，冰浴8-12分钟；

5.4加0.2倍体积氯仿到裂解病毒液，搅拌溶液，冰育10-15min；

5.5用12000g，4℃，离心12-15min，取上层水相收集Reovirus RNA于EP管中；

5.6加入等体积异丙醇于EP管，充分混匀，冰孵育10min，10000-12000g，4℃，离心8-12min，管底可见无色透明Reovirus RNA沉淀

5.7弃上清，加入0.8-1.2ml75％乙醇，颠倒数次洗涤沉淀；

5.8 12000g，4℃，离心4-6min，弃上清，留沉淀Reovirus RNA，风干；

5.9加适量DEPC水溶解Reovirus RNA，-20℃储存备用。

实施例6.制备Reovirus dsRNA的鉴定评价

6.1采用常规10-12％聚丙烯凝胶电泳技术(PAGE)解析Reovirus基因组图谱，以鉴定Reovirus dsRNAs。用TBE缓冲液(10mmol/L Tris-Cl,pH7.4，1mmol/L EDTA)配制10-12％聚丙烯凝胶，胶厚1.5mm；用电泳缓冲液(89mmol/L Tris-硼酸，2mmol/L EDTA，pH8.0)作电极缓冲液；Reovirus dsRNA待测样品加1/6体积的6×负载缓冲液(Loading buffer：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈蓝，40w/v％蔗糖)，混匀后按每孔3μg dsRNA上样。以7V/cm电压进胶，4V/cm电压分离。电泳4～5小时，0.5μg/ml溴化乙靛(EB)染色30～60min，去离子水漂洗后，紫外灯下分析结果。

6.2紫外分光光度法评价制备Reovirus dsRNA的纯度。由于本专利所测对象ReovirusdsRNA是天然的大分子dsRNA，非人工合成的寡核苷酸或引物，其CG含量比较均匀，所以，UV分光光度法可以理想地用于纯度测定。

6.2.1取2μl制备的-20℃储存的Reovirus dsRNA，经空白液稀释至50μl，作为待测样品，借助UV分光光度计分别测定OD₂₃₀、OD₂₆₀、OD₂₈₀、OD₃₂₀等四个点的值，用以联合分析待测样品纯度。

6.2.2计算出OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，以评估提取Reovirus dsRNA的纯度，比值大于或等于2.0者为合格。纯净的RNA样品，比值大于2.0。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。如果OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间，说明样品纯度达标，OD₂₆₀的数值有效；否则，OD₂₆₀的值判为无效。自-20℃储存的Reovirus dsRNA取出2μl，再用DEPC水作25倍稀释后用紫外分光光度计检测OD₂₆₀和OD₂₈₀值，分别为：OD₂₆₀＝0.428；OD₂₈₀＝0.207。所提取的Reovirus dsRNA纯度为A₂₆₀/A₂₈₀值＝2.0676，说明提取的Reovirus dsRNA纯度较高。

6.2.3OD₂₃₀表示样品中存在多肽、苯酚、碳水化合物等的污染。纯净的样品，OD₃₂₀一般是0。我们制备品Reovirus dsRNA要求OD₃₂₀为0。

6.3制备Reovirus dsRNA的进一步纯度评价。

6.3.1结合前述提取的Reovirus dsRNA的PAGE图谱背景分析所提取的Reovirus dsRNA纯度，评估其他核酸的存在。

6.3.2借助前述PAGE，采用蛋白多肽染色，以显示PAGE图谱背景有无蛋白多肽污染或污染程度。

实施例7.制备Reovirus dsRNA浓度的测定及其含量计算

对Reovirus dsRNA纯品用UV分光光度计测定其OD₂₆₀值，以计算出纯化样品的浓度，并计算出所制备Reovirus dsRNA的含量。

自-20℃储存的Reovirus dsRNA取出2μl，再用DEPC水作25倍稀释后用紫外分光光度计检测OD₂₆₀＝0.428，那么，低温储存的Reovirus dsRNA溶液浓度＝OD₂₆₀×稀释倍数×50＝0.428×25×50＝535.0μg/mL＝0.535mg/mL；-20℃储存的8.65L(8650.48mL)溶液中Reovirus dsRNA含量＝0.535mg/mL×8650.48mL＝4627mg＝4.628g。

实施例8.单纯疱疹病毒1型(HSV-1)增殖

能敏感增殖单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的任何细胞都可以作为其增殖细胞。此实施例7以Vero细胞为例。

8.1选取处于对数生长期的培养细胞(如Vero细胞、Hep-2细胞、…..等)，待细胞汇生达80％-90％汇合时，吸弃培养液；1×PBS(pH7.4)洗涤贴壁细胞2-3次。

8.2接种HSV-1病毒液1.0ml于培养瓶中，轻轻晃动培养瓶，让病毒液覆盖细胞。

8.3于37℃作病毒吸附1小时，吸弃剩余病毒液；添加含2％小牛血清的维持培养液培养。

8.4置37℃，5％CO₂培养24小时。待细胞出现，如细胞胀大、变圆、脱落等，明显细胞病变效应(CPE)时，收集病毒培养液。

8.5将病毒培养液于-20℃反复冻融3次，以充分释出病毒，成为HSV-1悬液，800-1000rpm，离心8-15min，无菌收获病毒上清液，TCID₅₀技术检测病毒滴度约为10⁷TCID₅₀/ml，-20℃保存备用。

实施例9.单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒力测定

能敏感增殖HSV-1的任何细胞都可以作为该病毒效价测定的细胞。此实施例8亦以Vero细胞为例。

9.1传代的Vero细胞，胰酶消化成单个细胞悬液，吹打均匀。

9.2吸取少量细胞悬液，血球计数板计数，将细胞数量调整到合适的数量级。

9.3吸取细胞悬液，按每孔100μl加入96孔板，37℃，5％CO₂条件下培养。

9.4用维持液对HSV-1原液(10⁰)用1×PBS(pH7.4)作对数稀释，以成10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等，每作一个稀释度更换一根吸管，以防病毒滴度后延。

9.5待细胞在96孔板底部长成单层后，吸弃培养液，每孔加入稀释的病毒液100μl；96孔板周围孔全部加1×PBS(pH7.4)，每稀释度加6个复孔。

9.6培养板置37℃吸附1.5-2.0小时后，吸弃病毒液，加入不含血清的细胞维持液；置37℃，5％CO₂条件下培养，每12小时观察细胞病变，记录每个梯度细胞病变孔数。

9.7计算比距，用Reed-Muench方法计算TCID₅₀(TCID₅₀的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例×稀释系数的对数的差)，获得病毒浓度为10⁶-10⁸TCID₅₀/ml，无菌生理盐水稀释成10⁵TCID₅₀/ml，-20℃保存备用。

实施例10.HSV-1感染动物模型的建立

10.1 60只昆明小鼠(4周龄)，雌雄各半，随机分成6组，每组10只，隔离饲养。

10.2增殖的HSV-1(10⁵TCID₅₀/ml)用无菌生理盐水(0.9％)对数梯度稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5五个梯度。

10.3每组小鼠对应一个梯度，酒精棉球消毒后每只动物沿右侧眼角至耳后根连线中点进针，颅内注射30μl；对照组注射无菌生理盐水30μl。

10.4持续供给食物和水，观察小鼠的进食、体重、毛色等变化，以及腹部是否肿大变色、是否有颤抖抽搐现象的出现；每天记录观察，统计死亡率，观察14天，按Reed-Muench方法计算半数致死量LD₅₀。本次实验表明，3×10²TCID₅₀的HSV-1能使实验小鼠在14天内半数死亡(LD₅₀)。

实施例11.实验动物分组及处理

11.180只小鼠随机分为8组，分别作不同的处理。

组1(空白对照组)，用生理盐水作对照，编号A0；

组2(HSV-1对照组)，只用HSV-1感染作对照，编号A1；

组3(Reov-dsRNA对照组)，只用Reov-dsRNA EnII作对照，编号A2；

组4(Poly[I:C]阳性药物对照组)，只用阳性药物Poly[I:C]作对照，编号A3；

组5(Reov-dsRNA+HSV-1组)，Reov-dsRNA EnII预防HSV-1感染组，即先用Reov-dsRNA EnII，后用HSV-1攻毒，编号B1；

组6(HSV+Reo-dsRNA组)，Reov-dsRNA EnII治疗HSV感染组，即先用HSV-1感染，后用Reov-dsRNA EnII抗病毒治疗，编号B2；

组7(Poly[I:C]+HSV组)，阳性药物Poly[I:C]预防HSV-1感染对照组，即先预防用阳性药物Poly[I:C]，后用HSV-1攻毒，编号C1；

组8(HSV-1+Poly[I:C]组)，阳性药物Poly[I:C]治疗HSV-1感染对照组，即先用HSV-1感染，后用阳性药物Poly[I:C]治疗，编号C2。

11.2处理与观察。

11.2.1对于预防研究组(B1、C1)，每组在病毒感染前12小时与24小时腹腔注射给药2次，每次每只小鼠100μg Reov-dsRNA EnII或Poly[I:C]。

11.2.2对于治疗研究组(B2、C2)以及HSV-1对照组(A1)在颅内注射50LD₅₀/ml HSV-1悬液30μl后，分别于24小时、48小时各组每只小鼠注射100μg Reov-dsRNA EnII或Poly[I:C]。

11.2.3对于对照组(A0、A1、A2、A3)除了实验处理外，在各实验组其余处理时间，各对照组动物均施用等量的生理盐水注射，以保证所用实验动物刺激相同。

11.2.4观察7天，取脑组织作组织病理学分析，以及其他相关指标的测定。

实施例12.受试动物HSV-1感染临床表现

HSV-1感染小鼠后第二天小鼠开始出现感染的早期症状，进食减少、体重急剧下降、消瘦、活动减少、双眼微闭、身体蜷缩颤抖；个别小鼠有前肢不断搔动鼻子与眼睛的中段；第三天开始有小鼠死亡，小鼠颤抖加剧并伴有抽搐的症状。

实施例13.受试小鼠血清干扰素(IFN-α/β/γ)水平的测定(结果见表1)

13.1受试小鼠取血及血清制备

13.1.1左手拇指食指抓住小鼠耳朵及颈部皮肤，小指与无名指固定小鼠尾巴及后肢；中指将小鼠的左前肢压住，剪去胡须，将小鼠头部朝下；

13.1.2用镊子按住眼睛两侧，使小鼠眼睛充血而眼球突出，再用镊子夹去眼球；

13.1.3收集血液并轻轻按压心脏部位，尽量多的收集血液，每只大概能收集0.6～1ml；

13.1.4当血液不再流出时，颈脊髓离断处死小鼠；

13.1.5将收集好的血液置于室温两小时，4℃过夜；

13.1.6待血液凝固，血清析出后，2500-3200rpm，离心8-12min，收集血清到另一个EP管，-20℃冻存，备用。

13.2受试动物血清干扰素水平测定(按说明书操作)

本试剂盒采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清中IFN-α、IFN-β、IFN-γ等干扰素的水平。操作程序如下：

13.2.1取出ELISA试剂盒，于室温(20～25℃)放置15～30分钟。实验过程应在室温(20～25℃)内进行。

13.2.2分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。除空白孔外，每孔加入酶标试剂50μl。轻轻晃动混匀，37℃温育60分钟。

13.2.3弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液(预先稀释)，振荡30秒，弃去洗涤液，轻轻拍打并用吸水纸吸干液体，如此重复3次，拍干。

13.2.4每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，在实验台面晃动混匀，37℃暗室显色15分钟。

13.2.5取出酶标板，每孔加终止液(30％-40％浓度氢氧化钠)50μl，终止反应(此时可见蓝色立转黄色)，注意不要起泡。

13.2.6测OD值：以空白孔为对照调零，加终止液后15分钟内，在450nm波长处测各孔的吸光度值(OD值)。

13.2.7根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程；再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。由于样品在测试前已经稀释了5倍，所以最后得到的样品浓度应该乘以5倍的稀释度(实际操作采用的对比稀释)。

表1.各研究组小鼠血清IFN-α、IFN-β、IFN-γ浓度测定结果统计分析表

【注】^*表示各研究组与空白对照组比较，P＜0.05；^**表示各研究组与HSV-1感染模型组比较，P＜0.05；△表示Reov-dsRNA+HSV-1组与Poly[I:C]+HSV-1组比较，P＜0.05；△△表示HSV-1+Reov-dsRNA组与HSV-1+Poly[I:C]组比较，P＜0.05。

实施例14.受试小鼠脑组织取材及组织病理学切片和观察分析

13.1取材与固定：实验动物采血完毕后(见12.1.4)，颈脊髓离断处死小鼠，备作受试小鼠脑组织取材；手术剪刀“V”字型剪开处死小鼠的颈部皮肤，沿小鼠身体长轴方向剪开头皮，剪刀撬开颅骨，完整取出脑组织。

13.2肉眼观察并记录各组各实验动物大脑组织的大体病变。

13.3脑组织浸泡在10％多聚甲醛溶液中，常温过夜。注意:①固定液量应为组织块体积的40倍；②固定时间与使用的固定液种类和组织块大小,温度等有关，一般为3～24h；③固定温度大多可在室温固定,在低温(4℃)时间应延长；④固定容器应大些。

13.4脱水透明：有顺序地经过70％，80％，90％，100％酒精各2～4h，使组织块中的水份逐渐脱去。再将组织块置透明剂二甲苯中透明，一般半小时。

13.5浸蜡包埋：将已脱水透明的组织块置于已事先加热溶化好的石蜡中保温2～4h。待组织块充分被石蜡浸入后可以进行包埋，将石蜡倒入指定的容器，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中，冷却凝固成块即可。

13.6切片与贴片：将包埋好的蜡块置于切片机上，切成5～8μm厚的薄片。用毛笔挑取薄片放于热水中烫平，再贴到事先涂好松油的载玻片上，于45℃恒温箱中烘干。

13.7脱蜡染色：

13.7.1将已贴到载玻片上的切片放入苏木精溶液中染色5分钟；

13.7.2将样本分别经过氨水和酸水中分色，各数秒钟；

13.7.3流水冲洗60分钟后浸入双蒸水片刻；

13.7.4于70％和90％乙醇中脱水各十分钟；

13.7.5置于伊红染色液染色2～3min。

13.8脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。

13.9封片：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标签。

13.10组织病理学观察分析受试动物大脑组织HE染色的实验动物脑组织病理学片，光学显微镜下观察分析各组各实验动物大脑组织病理学变化。

研究总结

1.图1为Reovirus结构示意图、图2为Reovirus-3增殖感染vero细胞的超微切片电镜图，显示：病毒呈球形，双层衣壳，分段基因组排列在单层内衣壳内。图3为10％PAGE解析Reoirus dsRNA基因组图谱。这些条件为我们研发Reov-dsRNA EnII创造了首要条件。

2.图5和图7为绿色荧光蛋白标记的单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染vero细胞图像，大量的HSV-1在vero细胞内增殖，发出强烈的绿色荧光；被感染的vero细胞出现显著的收缩、变圆、脱落等CPE。图4为未感染HSV-1的vero细胞对照组，未见绿色荧光，无CPE，细胞生长茂盛、呈梭形，排列规则。绿色荧光蛋白标记的HSV-1为本专利研究中HSV-1感染动物模型的建立，Reov-dsRNA EnII的安全性和有效性研究创造了实验室研究材料物质基础。

3.图6为HSV-1感染小鼠模型脑组织匀浆接种Vero细胞，Vero细胞发出清晰的绿色荧光，说明我们从模型动物回收到HSV-1。结合图8-图11，说明HSV-1感染小鼠模型建立成功。

4.进而借助该模型系统在体内研究Reov-dsRNA EnII的安全性、有效性，以及体内预防HSV-1感染、抗HSV-1治疗的效果，揭示了：Reov-dsRNA EnII用于体内安全；诱导内源性干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ有效；能用于预防HSV-1感染和抗HSV-1治疗。

5.从表1和图18可得结论：Reov-dsRNA EnII能在体内安全而有效地诱导IFN-α、IFN-β、IFN-γ，P<0.05。

6.从图12和图15可得结论：Reov-dsRNA EnII和Poly[I:C]在体内能有效诱导IFN-α、IFN-β、IFN-γ表达；并且Reov-dsRNA EnII诱导IFN-α、IFN-β、IFN-γ表达的水平显著高于Poly[I:C](P<0.05)。

7.从图13和图16可得结论：在先用Reov-dsRNA EnII或Poly[I:C]预处理实验动物，再用HSV-1感染实验动物，结果证明：Reov-dsRNA EnII和Poly[I:C]都能在体内有效诱导内源性干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ等的表达，都能有效预防HSV-1感染；并且，Reov-dsRNAEnII在体内诱导这3种干扰素的水平显著高于Poly[I:C]。

8.从图14和图17可得结论：在先感染HSV-1而后用Reov-dsRNA EnII或Poly[I:C]处理的条件下，Reov-dsRNA EnII和Poly[I:C]都能在体内有效诱导内源性干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ等的表达，以实现抗HSV-1感染的治疗；并且进一步证明了Reov-dsRNA EnII在体内诱导这3种干扰素的水平也显著高于Poly[I:C]。

9.统计分析结果显示：Reov-dsRNA EnII预防HSV-1感染组死亡率显著低于poly[I:C]预防HSV-1感染组(P<0.05)，提示Reov-dsRNA EnII具有良好的预防HSV-1感染的效果。

10.统计分析结果显示：Reov-dsRNA EnII治疗HSV-1感染组死亡率显著低于poly[I:C]治疗HSV-1感染组(P<0.05)，提示Reov-dsRNA EnII具有良好的治疗HSV-1感染的效果。

结论

内源性干扰素(ENI)是用内源性干扰素诱导剂(EnII)于体内，直接诱导机体产生的内源性IFNs，能克服外源性干扰素(EXI)的诸多不足和发挥最大的药理学活性。

目前，人类所用的最好的商业化的EnII是Poly[I:C]，具有一系列的缺陷，市场和临床应用都受到极大限制，人类一直在追求安全而有效的医用EnII。所以，寻找和开发新的第二代医用EnII是全世界生物医学家们角逐的领域。

本发明正是提供了这样一种全新的优于Poly[I:C]的Reov-dsRNA EnII，有显著的创新性。

本发明借助体外细胞培养系统增殖Reovirus，进而提取纯化Reovirus dsRNA分子，制备成Reov-dsRNA EnII，直接用于人体；机体遵循自身防御反应方式被诱导产生各种内源性干扰素(ENIs)，赋予人体抗病毒病治疗、抗病毒病预防、抗肿瘤的治疗和联合治疗、以及广泛的防病、治病和增强体质的功能，也具有用于应对突发性公共卫生事件的重要作用。

Claims

1.呼肠孤病毒dsRNA在医用内源性干扰素诱导剂制备中的应用。