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CN104163869B - 重组细菌辨识蛋白及其用途 - Google Patents

重组细菌辨识蛋白及其用途 Download PDF

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CN104163869B
CN104163869B CN201410203062.2A CN201410203062A CN104163869B CN 104163869 B CN104163869 B CN 104163869B CN 201410203062 A CN201410203062 A CN 201410203062A CN 104163869 B CN104163869 B CN 104163869B
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rhamnose
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Abstract

本发明关于一种包含SEQ ID NO:1及细菌辨识凝集素的重组蛋白以及其用途，包含在样本中检测病原体、移除内毒素、测定内毒素或类内毒素物质的存在以及测定包含鼠李糖‑鼠李糖、鼠李糖‑N‑乙酰甘露糖胺、N‑乙酰甘露糖胺‑鼠李糖、鼠李糖‑半乳糖或半乳糖‑鼠李糖的病原体相关分子模式的存在，以及作为医药、抑菌剂、去污染剂、表面活性剂或诊断工具之用途。

Description

重组细菌辨识蛋白及其用途
技术领域
本发明系关于一种新颖重组蛋白及其用途，该重组蛋白包含人工肽及细菌辨识凝集素。
背景技术
凝集素为一可辨识特定糖类结构且广泛遍布于生物中之糖类结合蛋白质族群。依其糖类辨识区域(CRD)之序列相似度及糖类结合特异性，动物凝集素被分类成多种家族。它们在不同的生理过程中扮演不同的角色，例如作为细胞表面受体，参与细胞与细胞之间的交互作用以影响生长及分化过程；或在免疫反应过程中辨识外来分子。近年，来自海洋资源之体液凝集素的生化与生理特性已被深入研究。海洋生物凝集素(如鲎之血浆凝集素)多能辨识脂多糖(LPS)。脂多糖(或内毒素)通常包含一被称为脂质A之疏水性区段，一不重复之“核心”寡糖以及一远程多糖(或O-抗原)。细菌辨识凝集素(BRL)，一种可辨识细菌及结合脂多糖的蛋白质，为分离自台湾三棘鲎(Tachypleus tridentatus)的血淋巴蛋白质。细菌辨识凝集素与鲎凝集素-3(tachylectin-3)(一自日本三棘鲎变形细胞分离出之凝集素)展现68％之序列相似性。自血淋巴分离出之原生细菌辨识凝集素可与肺炎链球菌R36A(革兰氏阳性)，肠炎弧菌(革兰氏阴性)及大肠杆菌Bos-12(革兰氏阴性)三种细菌以剂量依赖且可饱和的方式结合。自台湾三棘鲎血浆纯化之原生细菌辨识凝集素呈现不同的糖基化程度，以及经蛋白酶部分水解状态，以致很难测定确切具有细菌结合活性的部份。由于鲎为一古海洋节肢动物且直接从血淋巴分离出原生细菌辨识凝集素不符合人道主义，重组之细菌辨识凝集素(rBRL)已以基因工程制造且表达于嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)KM71之酵母菌菌株。然而，嗜甲醇酵母菌KM71中之糖基化细菌辨识凝集素表达量低，每500毫升培养液中只有约0.6毫克之纯细菌辨识凝集素可经由脂多糖-琼脂糖凝胶(LPS-Sepharose)CL-4B层析管柱纯化分离。
内毒素的检测及移除对生技产业具有广大的市场。每年全球医药诊断市场持续成长，目前的病原诊断极依赖耗费人力及时间之传统细菌培养及菌落计算方法。为了抑制病原菌，抗生素为具有高特异性之有力抑菌剂。但具抗生素抗药性之病原株的出现及研发新型抑菌剂的迟缓，找到替代的治疗方式非常迫切。开发检测及治疗病原菌的新策略是必要的。
发明内容
重组融合蛋白可藉由使用亲和性标签增加蛋白质之表达及帮助其纯化，以克服低表达量的困难。
本发明设计一人工肽以增加一目标融合蛋白之可溶性。该人工肽之氨基酸序列实例包括但不限于SEQ ID NO:1。
由台湾三棘鲎血淋巴获得之鲎细菌辨识凝集素(BRL)为一分离自血浆之脂多糖结合蛋白质。一细菌辨识凝集素之氨基酸序列实例包括但不限于SEQ ID NO:2。
本发明已在大肠杆菌表达系统中创造出一新颖重组蛋白rBRL，其包含氨基端39个氨基酸之人工肽及羟基端128个氨基酸之细菌辨识凝集素，例如SEQ ID NO:3。在SEQ IDNO:3中的第1个氨基酸(M)及第41到42个氨基酸(EF)是从pET23a载体获得之残基且可于使用不同载体时被替换，甚至于本发明之一实施方案中可不存在。此外，在SEQ ID NO:3末端的6个残基(HHHHHH)可作用为纯化标签且可以任何具相似功能的其它序列将其替换，甚至于本发明之一实施方案中可不存在。根据以上所述，应注意到本发明也提供一种由氨基酸序列SEQ ID NO:4所组成之重组细菌辨识凝集素。
熟谙此技艺者将了解到任何以上氨基酸序列具相似功能的突变体都包含在本发明之范畴中。
添加人工肽SEQ ID NO:1可成功增加细菌辨识凝集素的表达并简化纯化步骤。重组细菌辨识凝集素(rBRL)保留对脂多糖及脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)的结合活性，且意外地在经由比较可被重组细菌辨识凝集素结合的脂多糖及脂磷壁酸后，发现在一样本中包含鼠李糖-鼠李糖(Rha-Rha)、鼠李糖-N-乙酰甘露糖胺(rhamnose-N-acetyl-mannosamine,Rha-ManNAc)、N-乙酰甘露糖胺-鼠李糖(ManNAc-Rha)、鼠李糖-半乳糖(Rha-Gal)或半乳糖-鼠李糖(Gal-Rha)的病原体相关分子模式(PAMP)对于细菌辨识凝集素的辨识扮演一重要的角色。在抑菌活性方面，藉由重组细菌辨识凝集素对特定细菌表面成分的辨识，重组细菌辨识凝集素可明显地以剂量依赖的方式抑制绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1的生长，其半数抑制浓度(IC50)为4.3μM。该基因工程制造的重组细菌辨识凝集素可被开发为一检测剂及一抑菌剂，针对样本中在细胞表面上具有包含鼠李糖-鼠李糖、鼠李糖-N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺-鼠李糖、鼠李糖-半乳糖或半乳糖-鼠李糖之病原体相关分子模式的病原菌，如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)及炭疽杆菌(Bacillus anthracis)。
除非另外特别加以定义，于此叙述中所用的名词将具有熟知此技艺者可了解之普通且常见之含意。
因此，本发明提供一种由氨基酸序列SEQ ID NO:1所组成之肽片段。本发明亦提供一种使用SEQ ID NO:1以增加目标蛋白质表达量的方法，包含(a)融合SEQ ID NO:1与目标蛋白质以形成一重组蛋白；及(b)藉由一表达宿主来表达该重组蛋白。较佳地，该目标蛋白质为自鲎属(Tachypleus)获得之细菌辨识凝集素，且其表达宿主为细菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳类动物细胞。更佳地，该细菌系大肠杆菌。该方法不仅简化目标蛋白质的纯化步骤，更在融合SEQ ID NO:1至目标蛋白质后保留该目标蛋白质的活性。
本发明亦提供一种重组蛋白，包含SEQ ID NO:1及一细菌辨识凝集素。在一较佳实施例中，该SEQ ID NO:1位于氨基端且该细菌辨识凝集素位于羟基端。较佳地，该人工肽系SEQ ID NO:1。较佳地，该细菌辨识凝集素系自三棘鲎血细胞中所获得之鲎细菌辨识凝集素；更佳地，该细菌辨识凝集素系由SEQ ID NO:2所示之氨基酸序列组成。在一较佳实施例中，该重组蛋白系由SEQ ID NO:3所示之氨基酸序列组成。在另一实施例中，该重组蛋白系由SEQ ID NO:4所示之氨基酸序列组成。
本发明进一步提供一种在一样本中检测病原体的方法，包含将该样本与经标记物质标记之上述重组蛋白接触以形成一被标记的重组蛋白-病原体复合物，并测量该复合物之标记物质以检测病原体。较佳地，该样本中的病原体表面含有脂磷壁酸、脂多糖或由鼠李糖-鼠李糖、鼠李糖-N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺-鼠李糖、鼠李糖-半乳糖或半乳糖-鼠李糖或彼等之任何组合所组成之病原体相关分子模式(PAMP)。在一较佳实施例中，该病原体为细菌。较佳地，该细菌系选自由沙门氏菌种(Salmonella species)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯氏菌(Klebsiella)I-714、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、李斯特单胞菌(Listeriamonocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒杆菌(Salmonella entericaserovar typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪炼球菌(Streptococcus faecalis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、志贺氏菌种(Shigella species)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、转糖链球菌(Streptococcus mutans)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)及其孢子、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)及其孢子、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)及其孢子、彼尔姆短杆菌(Brevibacterium permense)VKM Ac-2280、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)及炭疽杆菌(Bacillus anthracis)所组成之群组。更佳地，该细菌系选自由C群沙门菌(Salmonella serogroup C)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、19F型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae serotype19F)、19A型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae serotype19A)、19B型肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae serotype19B)、23F型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniaeserotype23F)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株、李斯特单胞菌(Listeriamonocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒杆菌(Salmonella entericaserovartyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪炼球菌(Streptococcus faecalis)及粪肠球菌(Enterococcus faecalis)所组成之群组。在一较佳实施例中，该重组蛋白系由氨基酸序列SEQ ID NO:3组成。在另一实施例中，该重组蛋白系由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成。
本发明还提供一种将样本中内毒素移除方法，其包含以下步骤：(a)将上述之重组蛋白与一被直接或非特异性地固定于一固态载体样本培育或接触，其中该重组蛋白能结合内毒素形成一重组蛋白与内毒素的复合物，及(b)将该复合物与该样本分离。
本发明更提供一检测样本中内毒素或类内毒素物质存在的方法，其包含将该样本与经标记物质标记之上述重组蛋白接触以形成一被标记的重组蛋白-内毒素复合物，并测量该复合物中标记物质以检测内毒素。较佳地，该内毒素或类内毒素物质系选自内毒素或微生物(如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌、真菌、酵母菌及藻类)的表面抗原。
本发明更提供一种在样本中测定包含鼠李糖-鼠李糖、鼠李糖-N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺-鼠李糖、鼠李糖-半乳糖或半乳糖-鼠李糖的病原体相关分子模式存在的方法，其包含将该样本与经标记物质标记之上述重组蛋白接触形成一被标记的重组蛋白-病原体相关分子模式复合物，并测量该复合物中之标记物质以检测病原体相关分子模式。
本发明更提供一种在有需要的病患中预防及/或治疗与病原体感染有关的病况的方法，其包含：向该病患施用一药学有效量之包含上述重组蛋白之组合物，其中该重组蛋白作用为包含鼠李糖-鼠李糖、鼠李糖-N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺-鼠李糖、鼠李糖-半乳糖或半乳糖-鼠李糖的病原体相关分子模式的拮抗物。
本发明更提供本发明之重组蛋白做为医药，于医疗、公共或私人环境做为抑菌剂，于食品工业、动物饲料或化妆品工业作为针对细菌污染之去污染剂，作为针对被细菌污染过表面的表面活性剂，或于医疗、食品或饲料诊断或环境诊断做为诊断工具之用途。
附图说明
图1显示重组细菌辨识凝集素(rBRL)的纯化分析。
以0.1mM之异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导并于16℃下培养16小时后，经由离心收集含有重组细菌辨识凝集素的细胞溶解物上清液并置于镍离子结合亲和性层析管柱加以纯化。将每一分层之等分试样以15％(w/v)之十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
M道：分子量标记物；N道：未经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之大肠杆菌细胞溶解物；I道：经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之大肠杆菌细胞溶解物；P道：细菌均质后之不可溶之沉淀物；S道：细菌均质后之上清液；F道：纯化后流出之上清液；W1道：含20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、200mM氯化钠、5mM咪唑清洗管柱之流出液；W2道：含20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、50mM咪唑的清洗管柱之流出液；E道：含20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、300mM咪唑洗提的纯化蛋白质；C道：浓缩后的纯化蛋白质。
图2A及2B显示重组细菌辨识凝集素(rBRL)对病原体相关分子模式(PAMP)的结合活性。
将总量为0.5μg之脂多糖或脂磷壁酸涂于固定于微孔盘并以1μM重组细菌辨识凝集素检测。使用抗His单克隆抗体(1比5000)检测与脂多糖或脂磷壁酸结合之重组细菌辨识凝集素。空白组(Blank)表示加入缓冲液而非重组细菌辨识凝集素的孔洞。所有数据皆为三次实验平均。误差条显示三次实验之标准差(***p<0.001)。
图3显示重组细菌辨识凝集素(rBRL)对革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌的结合活性。
将细菌细胞以每孔5×107个细胞接种然后将1μM重组细菌辨识凝集素置入固定有细菌细胞的微孔盘。接着使用抗His单克隆抗体(1比5000)检测与细菌细胞结合之重组细菌辨识凝集素。空白组(Blank)表示加入缓冲液而非重组细菌辨识凝集素的孔洞。所有数据皆为三次实验平均。误差条显示三次实验之标准差(***p<0.001)。
图4A及4B显示重组细菌辨识凝集素(rBRL)对临床分离病原体之辨识。
将细菌细胞以每孔5×107个细胞接种，然后将1μM重组细菌辨识凝集素置入固定有细菌细胞的微孔盘。接着使用抗His单克隆抗体(1比5000)检测与细菌细胞结合之重组细菌辨识凝集素。空白组(Blank)表示加入缓冲液而非重组细菌辨识凝集素的孔洞。以1μM重组细菌辨识凝集素结合于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1之脂多糖的量作为正对照组及代表100％的结合力。所有数据皆为三次实验平均。
图5显示重组细菌辨识凝集素(rBRL)对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)生长的抑制作用。
将细菌细胞于LB培养基中于37℃培养一整夜。将细胞稀释100倍后继代培养并使其于37％生长4小时。将25μL浓度为每毫升1×106个细胞的细菌与25μL之0μM、1.875μM、3.75μM、7.5μM及15μM回溶于磷酸钠缓冲液(pH值为7.4)之重组细菌辨识凝集素混合并使其于37℃培养4小时。取四分之一稀释浓度的该培养混合物涂在培养盘以并于隔天计算其菌落形成单位(CFU)。与对照组(0μM重组细菌辨识凝集素)比较，以菌落数的减少来计算细胞死亡率。数据代表三次实验的平均且误差条显示三次实验之标准差(***p<0.001)。
具体实施方式
本发明可能以不同的形式实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
实施例1：
材料与方法
试剂
使用大肠杆菌Top10F’(Invitrogen)来建立载体并操作DNA，使用大肠杆菌表达型Rosetta(DE3)(Stratagene)、购于Novagen之pET23a载体来表达蛋白质。产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)ATCC13048、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)ATCC7644、B群副痢疾杆菌(Shigella flexneri group B)ATCC12022、奇异变型杆菌(Proteus micrabilis)ATCC7002、粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)ATCC8100及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC33591系购自台湾的启新生物科技公司。绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1及克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)CG43为张晃猷博士(国立清华大学，生命科学院，新竹，台湾)热心提供。大肠杆菌O26:B6、大肠杆菌O55:B5、绿脓杆菌PAO1、伤寒杆菌(Salmonella enterica serovar typhimurium)脂多糖、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及粪炼球菌(Streptococcus faecalis)脂磷壁酸系购自于Sigma。所有其余缓冲液及试剂均为最高之商业纯度。
蛋白质表达及纯化
用引物5’NdeI-ANP(SEQ ID NO:5)及3’EcoRI-ANP(SEQ ID NO:6)以聚合酶链锁反应(PCR)扩增编码SEQ ID NO:1之DNA片段。编码重组细菌辨识凝集素(SEQ ID NO:2)之DNA片段系用来自三棘鲎RNA所反转录之cDNA以聚合酶链锁反应扩增，并使用引物5’EcoRI-BRL(SEQ ID NO:7)及3’NotI-BRL-6His(SEQ ID NO:8)。将两种纯化的聚合酶链锁反应产物分别用NdeΙ/EcoRI及EcoRI/NotΙ限制酶切，并连接至用相同限制酶处理过的pET23a载体。确定该重组质粒序列后，将其转化至大肠杆菌Top10F’并以含100μg/ml氨苄青霉素(Ampicillin)的琼脂平板筛选。将筛选盘上所挑起的单一菌落置于含有相同浓度抗生素的5毫升LB(Luria-Bertani)培养液(1％胰化蛋白、0.5％酵母菌提取物及0.5％氯化钠)在37℃使其生长一夜以备提取质粒。再将提取出的质粒转化至大肠杆菌表达型Rosetta(DE3)并以含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板筛选。将单一菌落挑起并置于1公升之LB培养液中在37℃使其生长至600nm波长处的吸光值(OD600)达到0.4至0.6。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至最终浓度为0.1mM并于16℃培养16小时诱导蛋白质表达。在4℃以4000xg离心10分钟以收集细胞，并以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次。接着，使细胞沉淀物悬浮于50mL添加有蛋白酶抑制剂(1mM苯甲基磺酰氟(PMSF))的50mL平衡缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、5mM咪唑、pH值为7.4)并于每平方英寸15000磅之压力下通过一细胞均质机(cell homogenizer)3次以将其破碎。在4℃以16000xg离心30分钟使细胞溶解物分成上清液及沉淀物。用Ni SepharoseTM6Fast Flow(GE healthcare)层析管柱纯化上清液。先用平衡缓冲液将管柱预先平衡并于加载样本结束时以50mL平衡缓冲液(W1)及50mL清洗缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、50mM咪唑、pH值为7.4)(W2)清洗。用洗堤缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、300mM咪唑、pH值为7.4)将管柱上之目标蛋白洗脱及回收。最后将洗脱之重组细菌辨识凝集素浓缩并将缓冲液换成Tris缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、pH值为7.4)。
与细菌及病原体相关分子模式结合的酶联免疫吸附试验(ELISA)
将回溶于缓冲液(用于细菌之氯仿与乙醇混合物(1:9(v/v))及用于脂多糖/脂磷壁酸之0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH值为9.6))并连续稀释成所示浓度之50μl细菌(每孔5×107个细胞)、脂多糖或脂磷壁酸的悬浮液加入96孔微孔盘内并于4℃培养一夜。在波长600nm的光密度下以一光谱仪(Hitachi U-3310)测量该培养液的散射光以测定培养液中的细菌浓度。将0.1光密度单位定为约等同于每毫升含有108个细菌。将固定有细菌或病原体相关分子模式的微孔盘用冲洗缓冲液(含0.05％Tween20之磷酸盐缓冲液(PBST))清洗3次，并将未结合之区域以封闭缓冲液(含3％脱脂乳之PBST)于37℃封闭2小时。之后，于每一孔中加入50微升1μM纯化重组细菌辨识凝集素并于37℃培养1.5小时。以纯化蛋白质之平衡缓冲液加入另一微孔作为负对照组。以冲洗缓冲液清洗3次后，于每一孔中加入抗His单克隆抗体(Clontech)(1:5000)并于37℃培养1小时。接着，以冲洗缓冲液清洗3次，于每一孔中加入与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)结合之抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)单克隆抗体(Jackson)(1:5000)并于37℃培养30分钟。之后以冲洗缓冲液清洗3次再于每一孔中加入100μl之3,3'5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(KPL)并于37℃培养15分钟。最后，加入100μl之2N H2SO4以终止该反应。以光谱仪(Thermo)读取于450nm的吸光值。
抗细菌活性分析
将绿脓杆菌PAO1、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)及金黄色葡萄球菌于LB培养液37℃培养一夜。将该细菌继代培养(1:100)并于37℃培养4小时。将细菌离心收集并以10mM磷酸钠缓冲液(pH值为7.4)清洗3次。以分光光度法在波长600nm测定细胞数。将25μL浓度为每毫升106个细胞的细菌与25μL之0μM、0.46875μM、0.9374μM、1.875μM、3.75μM、7.5μM及15μM溶解于磷酸钠缓冲液(pH值为7.4)之重组细菌辨识凝集素混合并使其于37℃培养4小时。将1/4的菌液涂置于LB琼脂平板上并于37℃培养16小时。与对照组比较，观察减少的菌落数可计算出细胞死亡率。
结果
重组细菌辨识凝集素的表达与纯化
重组细菌辨识凝集素系由一氨基端的人工肽及一羟基端的自三棘鲎获得之鲎细菌辨识凝集素所组成。编码人工肽及细菌辨识凝集素之DNA片段个别连接至pET23a载体且将该重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)以表达蛋白质。自1公升培养液中，可经由Nickel亲和性层析管柱纯化获得约6mg之重组细菌辨识凝集素，其回收率为80.6％(图1)。产量比嗜甲醇酵母菌所生产之BRL-6His高5倍，表示融合于细菌辨识凝集素氨基端之人工肽成功促进重组细菌辨识凝集素的表达与纯化。
重组细菌辨识凝集素对脂多糖的结合
先前由嗜甲醇酵母菌KM71表达之BRL-6His是经由大肠杆菌O26:B6脂多糖-琼脂糖凝胶CL-4B纯化，表示细菌辨识凝集素可结合至大肠杆菌O26:B6脂多糖。为了确认重组细菌辨识凝集素对脂多糖及脂磷壁酸的结合活性，藉由ELISA测试4种来自大肠杆菌O26:B6、大肠杆菌O55:B5、绿脓杆菌PAO1及伤寒杆菌的脂多糖及2种来自金黄色葡萄球菌及粪炼球菌的脂磷壁酸。如图2A及2B所示，重组细菌辨识凝集素明显结合于所有4种脂多糖及2种脂磷壁酸，表示将人工肽融合在细菌辨识凝集素的氨基端并不会影响细菌辨识凝集素对脂多糖或脂磷壁酸的结合能力。
重组细菌辨识凝集素对革兰氏阴性及革兰氏阳性菌的结合
为了更进一步确认重组细菌辨识凝集素对革兰氏阴性菌的结合，在此使用细菌结合ELISA来测试7种包括绿脓杆菌、副痢疾杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌及大肠杆菌TOP10F’的不同革兰氏阴性菌及2种包括金黄色葡萄球菌及李斯特单胞菌的革兰氏阳性菌。图3显示重组细菌辨识凝集素明显且选择性地结合至革兰氏阴性绿脓杆菌及革兰氏阳性李斯特单胞菌。
重组细菌辨识凝集素对临床分离之病原体的辨识
了解重组细菌辨识凝集素与特定细菌及病原体之间的互动可引领新式诊断策略的开发，以检测微生物病原体如临床上的感染菌(例如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎菌、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)等)。在此数种临床分离的微生物病原体被用以测试重组细菌辨识凝集素对病原体的结合活性。如图4A所示，重组细菌辨识凝集素可辨识产酸克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌及绿脓杆菌之革兰氏阴性菌，尤其是产酸克雷伯氏菌KO4、KO5及鲍氏不动杆菌AB199，以及绿脓杆菌C1、C2、C4、C6及C8。至于革兰氏阳性菌，重组细菌辨识凝集素可特异性辨识19B与19F血清型肺炎链球菌(图4B)。
重组细菌辨识凝集素对病原体的生长抑制效用
为了探讨重组细菌辨识凝集素的抑菌活性，以绿脓杆菌PAO1、李斯特单胞菌ATCC7644及金黄色葡萄球菌ATCC33591进行测试。将25μL浓度为每毫升1×106个细胞的细菌与25μL之0μM(只有缓冲液)、0.46875μM、0.9365μM、1.875μM、3.75μM、7.5μM或15μM回溶于磷酸钠缓冲液(pH值为7.4)之重组细菌辨识凝集素混合并使其于37℃培养4小时。将1/4体积的该培养混合物涂抹于培养盘中以分析重组细菌辨识凝集素对细菌的生长抑制活性。图5显示重组细菌辨识凝集素以剂量依赖的方式抑制绿脓杆菌的生长，且其半数致死浓度(LC50)为4.305μM。
脂多糖为革兰氏阴性菌外膜的主要组成物，其系一种两性大分子，经由共价键结合的一疏水性脂质及一亲水性多糖组成。先前文献指出某些脂多糖上的O抗原可作为重组细菌辨识凝集素的特异性配体。有趣的是，比较可被重组细菌辨识凝集素所结合之细菌病原体相关分子模式之化学结构(表1)，显示鼠李糖-鼠李糖、鼠李糖-N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺-鼠李糖、鼠李糖-半乳糖或半乳糖-鼠李糖之组成为病原体相关分子模式部份的常见组成，因此它们被视为是重组细菌辨识凝集素结合至这些脂多糖所需的配体。
表1
一个熟知此领域技艺者能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到之结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中之肽、重组蛋白、其制造程序与方法及其用途乃较佳实施例的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。熟知此技艺者将会想到其中可修改之处及其它用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在申请专利范围中界定。
本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使任何熟习此技艺者能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明之精神及范围。
说明书中提及之所有专利及出版品，都以和发明有关领域之一般技艺为准。所有专利和出版品都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个个别出版品都被具体且个别地指出纳入参考。
在此所适当地举例说明之发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书之描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明之特点或其部份之名词及表达，但需认清的是，在本发明的专利申请范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是熟知此技艺者仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明之申请专利范围内。

Claims (8)

1.一种重组蛋白，由SEQ ID NO:1及细菌辨识凝集素所组成，其中所述细菌辨识凝集素由SEQ ID NO:2所组成。
2.如权利要求1所述的重组蛋白，其由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所组成。
3.如权利要求1或2的重组蛋白在制备用于通过以下方法在样本中检测病原体的试剂中的用途，所述方法包含将待检测样本与经标记物质标记的如权利要求1或2的重组蛋白接触以形成被标记的重组蛋白-病原体复合物，并测量所述复合物中的标记物质，以检测病原体。
4.如权利要求3所述的用途，其中样本中的病原体表面上含有脂磷壁酸、脂多糖或由鼠李糖-鼠李糖、鼠李糖-N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺-鼠李糖、鼠李糖-半乳糖或半乳糖-鼠李糖或它们的任何组合所组成的病原体相关分子模式。
5.如权利要求3所述的用途，其中所述病原体选自以下组中：C群沙门氏菌(Salmonellaserogroup C)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、19F型肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia serotype 19F)、19A型肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia serotype19A)、19B型肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia serotype 19B)、23F型肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia serotype 23F)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒杆菌(Salmonella enterica serovar typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪炼球菌(Streptococcus faecalis)及粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
6.如权利要求1或2的重组蛋白在制备用于通过以下方法在样本中移除内毒素的试剂中的用途，所述方法包含以下步骤：(a)将如权利要求1或2的重组蛋白与被直接或非特异性地固定于固态载体的样本培育或接触，其中所述重组蛋白能结合内毒素以形成重组蛋白与内毒素的复合物，及(b)将所述复合物与所述样本分离。
7.如权利要求1或2的重组蛋白在制备用于通过以下方法在样本中检测内毒素或类内毒素物质的存在的试剂中的用途，所述方法包含将待检测样本与经标记物质标记的如权利要求1或2的所述重组蛋白接触以形成被标记的重组蛋白-内毒素复合物，并测量所述复合物中标记物质以检测内毒素。
8.如权利要求1或2的重组蛋白在制备用于通过以下方法在样本中测定包含鼠李糖-鼠李糖、鼠李糖-N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺-鼠李糖、鼠李糖-半乳糖或半乳糖-鼠李糖的病原体相关分子模式的存在的试剂中的用途，所述方法包含将待测定样本与经标记物质标记的如权利要求1或2的重组蛋白接触以形成被标记的重组蛋白-病原体相关分子模式复合物，并测量所述复合物中标记物质以检测病原体相关分子模式。
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