CN104169432B - 高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法 - Google Patents

Abstract

公开了提供无需繁杂的操作地定量被检试样中的HDL3的方法。一种高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，其包括使被检试样和与高密度脂蛋白3特异性地反应的表面活性剂反应，定量胆固醇，前述表面活性剂为选自由聚氧亚乙基多环苯基醚和聚氧亚乙基苯乙烯化苯基醚组成的组中的至少一种。

Description

高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法

技术领域

本发明涉及高密度脂蛋白3(以下有时称为“HDL3”)中的胆固醇(以下有时将HDL3中的胆固醇称为“HDL3胆固醇”或“HDL3-C”)的定量方法。

背景技术

高密度脂蛋白(HDL)胆固醇，由于从包括动脉硬化壁的各组织接收胆固醇，与蓄积于细胞内的胆固醇的去除作用相关，因此也被称为胆固醇逆向转运系统。已知与冠状动脉硬化等动脉硬化疾病存在负相关，HDL为低值作为脂质异常症之一而设置低值界限，已知作为动脉硬化的指标是有用的。

HDL由脱辅基蛋白与磷脂、胆固醇、中性脂肪构成。HDL的比重为d=1.063～1.210g/mL，进而分为d=1.063～1.125g/mL的HDL2和d=1.125～1.210g/mL的HDL3这两种级分。通过脂蛋白的分布曲线在d=1.125部分发现缺口，由此开始比重重的部分为HDL3。另外，还存在根据HDL中的脱辅基蛋白中载脂蛋白(apolipoprotein)E含量差，将载脂蛋白E含量多的HDL作为富含载脂蛋白E的HDL的亚级分的分类方法。

已知不仅迄今为止的HDL蛋白整体，而且在HDL2和HDL3各亚级分中表现出不同的作用。已知临床上由于CETP缺损HDL不会代谢为LDL、IDL，HDL胆固醇量增加。由于CETP缺损而增加了的HDL为HDL2。据称HDL2具有抗动脉硬化作用。另外也据称，由于CETP缺损富含载脂蛋白E的HDL升高，富含载脂蛋白E的HDL的胆固醇争夺能力强，具有抗血小板作用，据称在HDL中更正面。另外，由于肝脂酶活性的降低HDL3不会变化为HDL2，HDL3增加。暗示了由于HDL3的增加所导致的冠状动脉疾病的发病率的增加。由这些倾向分别测定HDL亚级分预想有助于判断动脉硬化疾病的有无、原因。另外，现在基于这些HDL亚级分的作用，各厂商进行了抑制CETP的作用、减少LDL胆固醇量、增加HDL胆固醇量的治疗药的开发。

确立HDL亚级分的简便的测定方法有可能实现详细的作用的阐明、它们的治疗效果。

迄今为止，作为HDL亚级分的测定方法已知的方法，已知超离心法、高效液相色谱(HPLC)法、HDL3沉淀法(专利文献1)、NMR法等。

超离心为通过离心、利用脂蛋白的比重之差来分级的方法，存在下述缺点：作业需要熟练、花费很多天数、或者费用昂贵。冈崎等人提出的利用HPLC来分开HDL2和HDL3的方法中，作业需要时间、需要特别的仪器。HDL3沉淀法为通过含有2价金属离子和硫酸葡聚糖的试剂将HDL3以外聚集，通过离心来回收上清液部分的HDL3，并用自动分析装置进行测定的方法。仍然存在下述缺点：作业需要熟练、另外为用手的方法，有时需要检样的前处理操作，直至测定为止花费某种程度的时间，并非通用。另外，NMR法为通过磁共振来测定脂蛋白的颗粒数的方法，但是需要特殊的机械，并非一般性的方法。

需要说明的是，存在HDL亚级分的分析方法(专利文献2)。能够通过通用自动分析装置测定，但是采用通过使用表面活性剂来抑制HDL3以外的脂蛋白不受酶的作用的方法，HDL3反应中存在目的以外的脂蛋白，对测定产生影响、或者不能完全抑制的情况下有可能测定了HDL3以外的脂蛋白。

替代这样的方法、简便且可以选择性更好地对胆固醇量进行定量的试剂的发明成为必要。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009-207463号公报

专利文献2：日本特开2001-346598号公报。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供无需繁杂的操作地定量被检试样中的HDL3的方法。

用于解决问题的方案

本申请发明人进行了深入研究，结果发现了与HDL3特异性地反应的表面活性剂。于是想到使被检试样与这种表面活性剂反应，定量胆固醇，由此能够定量被检试样中的HDL3胆固醇，并且实验性地确认该想法可行，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，其包括使被检试样和与高密度脂蛋白3特异性地反应的表面活性剂反应，定量胆固醇，前述表面活性剂为选自由聚氧亚乙基多环苯基醚和聚氧亚乙基苯乙烯化苯基醚组成的组中的至少一种。

发明的效果

通过本发明，能够无需超离心、前处理等繁杂的作业地用自动分析装置特异性地定量被检试样中的HDL3胆固醇。另外，通过由作为现有技术的被检体中HDL总胆固醇定量法得到的总HDL胆固醇量，算出与HDL3胆固醇量的差，由此还能够定量HDL2胆固醇量。

附图说明

[图1]为表示本发明的实施例3中进行的本发明中求得的HDL3胆固醇与通过沉淀法求得的HDL3胆固醇的相关关系的图。

[图2]为表示本发明的实施例3中进行的由本发明中求得的HDL3胆固醇和总HDL胆固醇通过计算求得的HDL2胆固醇、与由通过沉淀法求得的HDL3胆固醇和总胆固醇利用计算求得的HDL2胆固醇的相关关系的图。

[图3]为表示本发明的实施例4中进行的本发明中求得的HDL3胆固醇与通过超离心法求得的HDL3胆固醇的相关关系的图。

[图4]为表示本发明的实施例4中进行的由本发明中求得的HDL3胆固醇和总HDL胆固醇利用计算求得的HDL2胆固醇、与通过超离心法求得的HDL2胆固醇的相关关系的图。

具体实施方式

作为供于本发明的方法的被检试样，若是想要定量该试样中的HDL3胆固醇的试样则没有特别限定，但是优选为血清、血浆或它们的稀释物，特别优选血清或其稀释物。

在本发明的方法中，使被检试样和与HDL3特异性地反应(与HDL3以外的脂蛋白几乎不反应)的表面活性剂反应。作为与HDL3特异性地反应的表面活性剂，为选自聚氧亚乙基苯乙烯化苯基醚和聚氧亚乙基多环苯基醚中的至少一种。

更具体而言，作为聚氧亚乙基多环苯基醚，可列举出Newcol-610(商品名、日本乳化剂社制、以下公司名为制造公司、与公司名一并记载的全部为商品名)、Newcol-710(日本乳化剂)，作为聚氧亚乙基苯乙烯化苯基醚，可列举出アデカトールPC-10(アデカ)、ブラウノンDSP-12.5(青木油脂)、ブラウノンTSP-16(青木油脂)、ノイゲンEA-137(第一工业制药)、ノイゲンEA-157(第一工业制药)。这些表面活性剂可以单独使用或组合两种以上来使用。

本发明中，对于表面活性剂使用“反应”的说法时，指的是表面活性剂进行保护从而酶容易对脂蛋白发挥作用以导出到反应系统外、或者酶不能对脂蛋白发挥作用。

表面活性剂的浓度优选为0.01～5.0%(w/v)，进一步优选为0.05～3.0%(w/v)。

本发明的方法中，通过上述表面活性剂的反应来定量胆固醇。胆固醇的定量方法本身是公知的，可以采用公知的任意一种方法，下述实施例中也有具体记载。例如，对于脂蛋白中的酯型胆固醇使用胆固醇酯酶进行水解，产生游离型胆固醇和脂肪酸，使用胆固醇氧化酶使得所产生的游离型胆固醇和原来存在于脂蛋白中的游离胆固醇产生胆甾烯酮和过氧化氢，使其在过氧化物酶的存在下形成醌色素来进行定量。作为产生醌色素的化合物，可列举出例如HDAOS(N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、DAOS(N-乙基-N-(-2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠)或TOOS(N-乙基-N(-2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺钠二水合物)和4-氨基安替比林，若为可以产生醌色素的组合则不限于它们。后述的前工序中使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的情况下，本发明的工序(使得HDL3特异性的表面活性剂进行反应的工序)中，可以直接使用前工序中使用的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，无需新添加。

产生醌色素的化合物的浓度例如若为TOOS则浓度优选为0.5～3.0mmol/L程度，若为4-氨基安替比林则优选为0.1～2.0mmol/L，另外，过氧化物酶的浓度优选为0.4～5.0U/mL。

反应液可以使用通常的生物化学反应中使用的各种缓冲液，优选pH处于5～8之间。作为溶液，优选为Good’s、tris、磷酸、甘氨酸的缓冲溶液，优选作为Good’s缓冲液的双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基乙基)甲烷(Bis-Tris)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)、1.5钠盐、一水合物(PIPES1.5Na)、2-羟基-3-吗啉代丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)和哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)。

反应温度优选为25～40℃程度，进一步优选为35～38℃，最优选为37℃。反应时间没有特别限定，通常为2～10分钟程度。

本发明的方法，可以使得被检试样与上述表面活性剂直接反应来进行，但是若首先进行将HDL或HDL3中的胆固醇以外的胆固醇转移到反应系统外的前工序，对于该前工序后的试样进行上述本发明的方法则可以更正确地定量HDL3胆固醇，所以优选。

前述前工序优选在与HDL以外的脂蛋白反应的表面活性剂或与HDL3以外的脂蛋白反应的表面活性剂的存在下进行。

作为与HDL以外或HDL3以外的脂蛋白反应的表面活性剂，可列举出聚氧亚乙基脱水山梨糖醇衍生物、聚氧亚乙基-聚氧亚丙基缩合物、聚氧亚乙基硬脂胺等非离子表面活性剂；酰胺醚硫酸酯(盐)（amideethersulfate）、聚氧亚乙基烷基醚硫酸钠等阴离子表面活性剂；椰子油脂肪酸-酰胺丙基二甲基-氨基乙酸甜菜碱、烷基二甲基-氨基乙酸甜菜碱、月桂基甜菜碱等两性表面活性剂；以及月桂基三甲基氯化铵等阳离子表面活性剂，但是不限于它们。

更具体而言，对于与HDL以外或HDL3以外的脂蛋白反应的表面活性剂的例子，作为非离子表面活性剂，可列举出作为聚氧亚乙基脱水山梨糖醇单油酸酯的ノニオンOT-221(日油)、作为聚氧亚乙基-聚氧亚丙基缩合物的プルロニックF68(アデカ)、プルロニックF88(アデカ)、プルロニックF127(アデカ)、プルロニックP103(アデカ)、プルロニックP123(アデカ)、作为聚氧亚乙基硬脂胺的ナイミーンS210(日油)、エマルゲンA500(花王)；作为阴离子表面活性剂，可列举出作为酰胺醚硫酸酯(盐)的サンアミドCF-10(日油)、作为聚氧亚乙基烷基醚硫酸钠的レベノールWX(花王)；作为两性表面活性剂，可列举出作为椰子油脂肪酸-酰胺丙基二甲基-氨基乙酸甜菜碱的ニッサンアノンBDF-SF(日油)、作为烷基二甲基-氨基乙酸甜菜碱的ニッサンアノンBF(日油)、作为月桂基甜菜碱的アンヒトール24B(花王)；作为阳离子表面活性剂，可列举出作为月桂基三甲基氯化铵的コータミン24P(花王)。这些表面活性剂可以单独使用或者组合两种以上来使用。

前工序中使用的表面活性剂的浓度优选为0.01～5.0%(w/v)，更优选为0.03～3.0%(w/v)程度。

前工序中，受到表面活性剂的反应而将胆固醇转移到反应系统外。在此，“转移到反应系统外”指的是通过消去或保护胆固醇及其酯，在之后的工序中，使得胆固醇及其酯不参与。

在此，“消去”指的是将被检试样中的脂蛋白的胆固醇分解，使在之后的工序中不作用于胆固醇测定的反应。作为用于消去脂蛋白胆固醇的方法，可列举出使得胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶发挥作用，将所产生的过氧化氢使用过氧化氢酶分解为水和氧的方法。另外，可以使用过氧化物酶使得氢供体与所产生的过氧化氢反应，转化为无色醌，但是不限于它们。胆固醇的消去方法本身在该领域中周知，在下述实施例中也有具体记载。

“保护”指的是进行保护使得被检试样中的脂蛋白不会在之后的工序中在胆固醇测定中反应。为了保护脂蛋白，可列举出使用特异性地保护各脂蛋白的表面活性剂使得胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶不发挥作用的方法，但是不限于它们。

利用将前工序中产生的过氧化氢用过氧化氢酶分解的前工序的情况下，使用作为过氧化氢酶的抑制剂的叠氮化钠，添加到第二工序的反应液中。此时的叠氮化钠的浓度通常为0.1g/L～1.0g/L程度。

本申请发明人进而发现，磷脂酶和/或鞘磷脂酶作用于脂蛋白，但是几乎不作用于HDL3。因此，通过除了上述表面活性剂，还共存磷脂酶和/或鞘磷脂酶(以下有时将两者总称为“磷脂酶等”)，可以进一步正确地定量HDL3胆固醇，所以优选。

作为磷脂酶，若至少作用于磷脂酰胆碱即可，优选磷脂酶A、磷脂酶C和磷脂酶D，特别优选磷脂酶C和磷脂酶D。作为鞘磷脂酶，若至少作用于鞘磷脂即可。磷脂酶等有市售，因此可以优选使用市售品。磷脂酶等可以单独使用或组合两种以上来使用。

磷脂酶等的终浓度(使用两种以上的情况下其总浓度、以下相同)优选为0.1～100U/mL程度，更优选为0.2～50U/mL程度。

需要说明的是，前工序中共存表面活性剂的情况下，反应条件(反应温度、时间、缓冲液等)也如前文所述。

前工序，也可以通过同时添加用于将胆固醇转移到反应系统外的酶系、表面活性剂，将利用酶进行的反应工序和利用表面活性剂进行的反应工序作为单一的工序同时进行。需要说明的是，第一工序和第二工序中使用不同的表面活性剂。

前工序中，使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的情况下，胆固醇酯酶的浓度优选为0.1～10.0U/mL程度，更优选为0.2～3.0U/mL程度。胆固醇氧化酶的浓度优选为0.05～10.0U/mL程度，更优选为0.1～1.0U/mL程度。需要说明的是，胆固醇酯酶若作用于酯型胆固醇则没有特别限制，例如可以使用旭化成社制的胆固醇酯酶(CEBP)、东洋纺社制的胆固醇酯酶(COE-311、COE-312)等市售品。另外，胆固醇氧化酶若作用于游离型胆固醇则没有特别限制，例如可以使用旭化成社制的胆固醇氧化酶(CONII)、东洋纺社制的胆固醇氧化酶(COO-311、COO-321、COO-331)等市售品。

前工序中，使用过氧化物酶的情况下，过氧化物酶的浓度优选为2.0～5.0U/mL程度，进一步优选为3.0～4.0U/mL程度。另外，使用转化为无色醌的化合物的情况下，其浓度优选为0.4～0.8mmol/L程度。

前工序的其它条件(反应温度、反应时间、缓冲液等)与上述本发明的方法相同即可。

以下基于实施例对本发明进行更具体的说明。但是本发明不被下述实施例所限定。

实施例

实施例1

HDL2级分和HDL3级分如以下所述分级。使用含有HDL的被检试样、即血清中使用了氯化钠和溴化钠的溶液，通过超离心，以HDL2与HDL3的分界线的比重(1.125)进行分级以分离，回收各级分。

利用超离心分级为CM～VLDL级分、LDL级分、HDL2级分、HDL3级分，使下述试剂A进行反应，进而添加下述试剂B，进行测定。测定中，向各级分2μL添加试剂A150μL，进行5分钟加温反应后，添加试剂B50μL，进而进行5分钟加温反应，测定主波长600nm、副波长700nm的吸光度。

试剂A

BES缓冲液(pH6.6)100mmol/L

TOOS1.5mmol/L

プルロニックF880.05w/v%

过氧化氢酶600U/mL

胆固醇氧化酶0.8U/mL

胆固醇酯酶2.0U/mL

鞘磷脂酶0.5U/mL

试剂B

BES缓冲液(pH7.0)100mmol/L

叠氮化钠0.1%

各种表面活性剂※2.0w/v%

4-氨基安替比林4.0mmol/L

过氧化物酶3.5U/mL

※组合两种以上的情况下总计2.0w/v%

添加试剂B后，经过单位时间后的各级分的吸光度变化量如表1所示。可以确认对于HDL3发生特异性反应。

[表1]

(单位：mAbs)。

实施例2

利用超离心分级为CM～VLDL级分、LDL级分、HDL2级分、HDL3级分，使下述试剂C进行反应，进而添加下述试剂D，进行测定。测定中，向各级分2μL添加试剂C150μL，进行5分钟加温反应后，添加试剂D50μL，进而进行5分钟加温反应，测定主波长600nm、副波长700nm的吸光度。

试剂C

BES缓冲液(pH6.6)100mmol/L

HDAOS0.56mmol/L

ノニオンOT-2210.01w/v%

过氧化氢酶600U/mL

胆固醇氧化酶0.8U/mL

胆固醇酯酶2.8U/mL

试剂D

BES缓冲液(pH7.0)100mmol/L

叠氮化钠0.1%

Newcol-6102.0w/v%

4-氨基安替比林4.0mmol/L

过氧化物酶3.5U/mL

添加试剂D后，经过单位时间后的各级分的吸光度变化量如表2所示。可以确认对于HDL3发生特异性反应。

[表2]

(单位：mAbs)。

实施例3

使人血清试样与上述试剂A反应，进而添加下述试剂E，进行测定。测定中，向血清2μL添加试剂A150μL，进行5分钟加温反应后，添加试剂E50μL，进而进行单位时间加温反应，测定主波长600nm、副波长700nm的吸光度，作为HDL3胆固醇，另外基于另外测得的总HDL胆固醇通过计算求得HDL2胆固醇。

试剂E

BES缓冲液(pH7.0)100mmol/L

叠氮化钠0.1%

Newcol-7102.0w/v%

4-氨基安替比林4.0mmol/L

过氧化物酶3.5U/mL

通过试剂A和试剂E求得的HDL3胆固醇与通过沉淀法(专利文献1)求得的HDL3胆固醇的相关如图1所示，由通过试剂A和试剂E求得的HDL3胆固醇和总HDL胆固醇利用计算求得的HDL2胆固醇、与由通过沉淀法求得的HDL3胆固醇和总HDL胆固醇利用计算求得的HDL2胆固醇的相关如图2所示。对于HDL3、HDL2而言，都可以确认本发明与沉淀法存在强的相关关系。

实施例4

使人血清试样与下述试剂F反应，进而添加上述试剂E，进行测定。测定中，向血清2μL添加试剂F150μL，进行5分钟加温反应后，添加试剂E50μL，进而进行单位时间加温反应，测定主波长600nm、副波长700nm的吸光度，作为HDL3胆固醇，另外基于另外测得的总HDL胆固醇通过计算求得HDL2胆固醇。

试剂F

BES缓冲液(pH6.6)100mmol/L

HDAOS0.56mmol/L

ノニオンOT-2210.01w/v%

过氧化氢酶600U/mL

胆固醇氧化酶0.8U/mL

胆固醇酯酶2.0U/mL

鞘磷脂酶0.5U/mL

通过试剂F和试剂E求得的HDL3胆固醇与通过超离心法求得的HDL3胆固醇的相关如图3所示，由通过试剂F和试剂E求得的HDL3胆固醇和总HDL胆固醇利用计算求得的HDL2胆固醇、与通过超离心法求得的HDL2胆固醇的相关如图4所示。对于HDL3、HDL2而言，都可以确认本发明与超离心法存在强的相关关系。

Claims (1)

1.一种高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，其包括使被检试样和与高密度脂蛋白3特异性地反应的表面活性剂反应，定量胆固醇，所述表面活性剂为选自由聚氧亚乙基多环苯基醚和聚氧亚乙基苯乙烯化苯基醚组成的组中的至少一种。