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CN104137148A - 玉米的未成熟穗光度测定法 - Google Patents

玉米的未成熟穗光度测定法 Download PDF

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CN104137148A
CN104137148A CN201280070835.3A CN201280070835A CN104137148A CN 104137148 A CN104137148 A CN 104137148A CN 201280070835 A CN201280070835 A CN 201280070835A CN 104137148 A CN104137148 A CN 104137148A
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CN
China
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Application number
CN201280070835.3A
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English (en)
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T.A.汉塞曼
J.霍肯森
G.李
D.F.劳斯萨尔特
T.M.莫里亚蒂
R.伍德斯
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EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
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Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
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Abstract

本发明提供了用于对玉米的一个或多个未成熟穗进行评价的方法，其中使用数字成像和图像处理对与未成熟玉米穗与产量和其它产量相关性状有关的物理特性进行评估。还提供了用于使用未成熟穗光度测定法识别主导基因的方法。

Description

玉米的未成熟穗光度测定法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2011年12月30日提交的美国临时申请No.61/581,949的权益，该美国临时申请全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开涉及一种用于在产量或产量相关性状方面对玉米植物进行评估的方法，所述方法是通过使用数字成像法和光度分析对玉米植物的未成熟穗进行评价而实现的。
背景技术
存在已经过充分描述的通过玉米植物在田间(例如在产量试验中)的表现对玉米的产量或产量相关性状进行评价的途径，无论这些玉米植物是常规地经由育种手段还是经由遗传工程而产生的。然而，田间测试需要大量的时间、人力、耕种面积以及货币资金，这制约了可以在任何给定的时间段内被评价的玉米植物的数目。关于如何使用较少的资源对玉米植物的产量或产量相关性状进行快速评价的问题仍存在。
发明内容
在一个实施例中，本文提供了用于通过评估未成熟穗的物理特性来对玉米植物进行评价的方法。在这些方法中，采集玉米植物的一个或多个未成熟穗的数字图像；处理所述数字图像；由所述经处理的数字图像对所述一个或多个未成熟穗的物理特性进行测量；并且基于所述一个或多个未成熟穗的一种或多种物理特性对所述玉米植物进行评价。
所述一个或多个未成熟穗的所测量的物理特性可以无限制地包括：所述穗的面积、长度、宽度、周长、颜色、穗丝计数、小穗数目、大小分布以及锥度；并且可以使用二值分割处理所述数字图像。
可以使用图像传感器或通过扫描模拟图像来采集所述数字图像。如果通过图像传感器进行采集，那么所述图像传感器可以是电荷耦合装置(CCD)图像传感器、数字相机、摄像机、颜色传感器、激光/光束传感器、X射线扫描仪/传感器或超声波传感器，并且可以在受控的照明条件下采集或可以使用在算法上或手动地确定的照明条件采集所述数字图像。所述图像传感器可以被配置成使一个或多个未成熟穗以其整体成像或使一个或多个未成熟穗更小的子段成像。
可以非破坏性方式采集所述数字图像。
所述方法还可以包括基于未成熟穗的物理特性预测玉米植物的成熟穗的产量。
在另一个实施例中，存在用于针对产量和/或产量相关性状对可能包含或可能不包含一种或多种目的转基因的玉米植物进行评价的方法，其中在田间或受控的环境设置中种植一株或多株玉米植物；采集所述一株或多株玉米植物的一个或多个未成熟穗的数字图像；使用二值分割处理所述数字图像；由所述经处理的数字图像对所述一个或多个未成熟穗的物理特性进行测量；并且基于所述一个或多个未成熟穗的一种或多种物理特性针对产量和/或产量相关性状对所述一株或多株玉米植物进行评价。
所述一个或多个未成熟穗的所测量的物理特性可以无限制地包括：所述穗的面积、长度、宽度、周长、颜色、穗丝计数、小穗数目、大小分布以及锥度。
可以使用图像传感器或通过扫描模拟图像来采集所述数字图像。如果通过图像传感器进行采集，那么所述图像传感器可以是电荷耦合装置(CCD)图像传感器、数字相机、摄像机、颜色传感器、激光/光束传感器、X射线扫描仪/传感器或超声波传感器，并且可以在受控的照明条件下采集或可以使用在算法上或手动地确定的照明条件采集所述数字图像。所述图像传感器可以被配置成使一个或多个未成熟穗以其整体成像或使一个或多个未成熟穗更小的子段成像。
所述一个或多个未成熟穗可以手动或使用机器收获，或可以保留在植物上。
产量相关性状可以无限制地包括生物量、氮胁迫耐受性或耐旱性。
可以使所述玉米植物暴露于氮和/或水限制性条件。
在另一个实施例中，提供了用于对目的转基因(或包含目的转基因的构建体)对玉米的产量或产量相关性状的影响进行高通量分析的方法，其中在受控的环境设置中一群种植转基因玉米植物；采集所述群体中两株或更多株玉米植物的未成熟玉米穗的数字图像；使用二值分割处理所述数字图像；计算所述一群转基因植物的至少一种所测量的物理特性的平均值或中值以及变异系数；并且进行统计检验以确定所述一群转基因植物中的单个成员与所述一群转基因植物关于至少一种物理特性的平均值或中值之间是否存在显著的差异。
所述一个或多个未成熟穗的所测量的物理特性可以无限制地包括：所述穗的面积、长度、宽度、周长、颜色、穗丝计数、小穗数目、大小分布或锥度。
可以使用图像传感器或通过扫描模拟图像来采集所述数字图像。如果通过图像传感器进行采集，那么所述图像传感器可以是电荷耦合装置(CCD)图像传感器、数字相机、摄像机、颜色传感器、激光/光束传感器、X射线扫描仪/传感器或超声波传感器，并且可以在受控的照明条件下采集或可以使用在算法上或手动地确定的照明条件采集所述数字图像。所述图像传感器可以被配置成使一个或多个未成熟穗以其整体成像或使一个或多个未成熟穗更小的子段成像。
所述一个或多个未成熟穗可以手动或使用机器收获，或可以保留在植物上。
产量相关性状可以无限制地包括生物量、氮胁迫耐受性或耐旱性。
可以使所述玉米植物暴露于氮和/或水限制性条件。
在另一个实施例中，提供了对作物植物的未成熟繁殖部分进行评价以评估转基因或重组核酸构建体对作物植物的种子产量的影响的方法。在这些方法中，在不将所述部分从所述作物植物上以物理方式取下的情况下获得所述作物植物的未成熟繁殖部分的数字图像，并且分析所述数字图像以评估所述转基因或所述重组核酸构建体对种子产量的影响。所述繁殖部分可以是玉米植物的未成熟穗。
所述转基因可以过表达。
重组核酸构建体可以是RNAi构建体。
附图说明
根据以下具体实施方式和附图可以更充分地了解本公开。
图1示出了用于分析的一个或多个未成熟穗的图像。A)图示了单穗图像，并且B)示出了多穗图像。
图2示出了在进行二值分割处理后准备用于进行测量分析的图像。A)图示了单穗图像，并且B)示出了多穗图像。
图3示出了在氮未耗竭小区中(正常氮条件)每株植物的籽粒产量与R1期时的穗长之间的关系。
图4示出了氮耗竭小区中每株植物的籽粒产量与R1期时的穗长之间的关系。
图5示出了在氮未耗竭小区中(正常氮条件)每株植物的籽粒产量与R1期时的穗重之间的关系。
图6示出了在氮耗竭小区中每株植物的籽粒产量与穗重之间的关系。
图7示出了在干旱胁迫条件下具有对比鲜明的表现的两种杂交种的穗丝数目与穗生物量之间的关系。
图8示出了在2010年-2011年生长季节中在Viluco研究站所进行的田间实验中所测量的穗生物量与穗面积之间的关系。
图9示出了三个育种群体的从未成熟穗期的穗面积所估算的穗生物量(×100g)与在田间干旱胁迫条件下的产量(bu/a)之间的关系。
图10示出了由X射线成像所获得的未成熟穗的图像。(A)示出了“较年幼的”未成熟穗的纵面图和剖面图，而(B)示出了“较年长”而仍未成熟的穗的纵面图和剖面图。
具体实施方式
本文阐述的每篇参考文献的公开内容据此在它们与本文所实施的方法有关的方面全文以引用的方式并入。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包括复数涵义。因此，例如，“一株植物(a plant)”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞(acell)”的涵义包括一个或多个细胞以及它们为本领域技术人员所知的等同物，诸如此类。
概述
由于未成熟穗的性状与种子产量和其它成熟穗性状相关，因此对未成熟穗进行图像分析提供了一种合理的用于预测诸如但不限于种子产量和穗重之类的田间表现以及诸如但不限于开花-抽丝间期之类的其它繁殖参数的手段。
数字成像和适当的图像处理(例如二值分割)允许对单独玉米植物的未成熟穗的表型进行高通量定量测量。据显示，未成熟穗的表型与产量和产量相关性状有关。未成熟穗的光度测定法和二值图像分割的应用可以包括但不限于：对植物间的遗传变异进行研究；针对产量、产量相关性状或胁迫耐受性对植物进行筛选(例如作为育种计划的一部分)；针对胁迫耐受性对植物间变异度进行定量；对穗类型进行表征以指导育种；测量对田间微小环境变异的基因型反应，从而快速地评价所引入的转基因和/或基因区域(QTL)对产量和/或产量相关性状的影响；确定杂交物的子代在表型上与每个亲本的相似度；等等。
植物生长
“环境条件”指的是植物生长的条件，诸如水的可用性、营养物质(例如氮)的可用性或者昆虫或病害的存在。
可以将植物种植在“受控的环境设置”中，诸如温室或生长室，其中水和营养物质的可用性受到控制，包括但不限于以下的其它因素也受到控制：温度、对极端气候因素的暴露以及害虫。作为另外一种选择，可以将植物种植在屏风帐或田间环境中，其中几乎不控制至不控制环境影响。
使用本公开的方法进行评价的植物和植物部分(例如未成熟穗)可以包含或可以不包含一种或多种目的转基因。
对于包含转基因的植物，可以使用任何多种实验设计将由所转化的玉米胚芽产生的转基因(T0代)植物的品系群体种植在环境受控的温室中以减少或消除环境误差。可以由相同的愈伤组织获得T0代姐妹植物，并且可以将本公开的方法应用于所述姐妹植物中的一种或多种。在T0代阶段未经受本公开的方法的T0代姐妹植物可以被选用于进行基于姐妹植物表现的探索性测试，然后与快速生长的近交系杂交以获得下一代供分析用的种子(T1代)。
在整个过程中可以对每株植物进行鉴定和跟踪，并且可以将从每株植物收集的数据自动地与该植物相关联。举例来说，每株植物可以具有机器可读标记(诸如通用产品代码(UPC)条形码)，所述标记可以包括关于植物特征以及在田间或温室中的位置的信息。
图像采集
术语“未成熟穗”一般指从出现第一条穗丝的阶段直到抽丝后约20天(DAS)为止的穗。在温室中进行测试时可以例如在抽丝后第8天对未成熟穗进行评估，而可以在R1(第一繁殖)期或在约1至约50条穗丝可见时进行田间评估。
可以获取已经由手或机器收获而从植物上取下的未成熟穗或仍连接至植物的未成熟穗的图像。
所述图像可以是一个穗或多个穗，或甚至一个或多个未成熟穗的更小子段的图像。
使用受控的照明条件(即可再现的照明条件)允许光谱滤光器的使用简化和数据标准化；然而，在不存在受控的照明条件的情况下，可以算法或手动方式对照明条件进行确定并且可以进行另外的校准以辅助图像处理。还可以对图像的质量(照明、对比度、色彩平衡、色彩保真度等)进行调控以改善用于分析目的的图像。
为了采集图像，可以使用各种类型的图像传感器，包括但不限于：电荷耦合装置(CCD)图像传感器、相机、摄像机、颜色传感器、激光/光束传感器、超声波传感器、X射线扫描仪/传感器或其它类型的图像传感器。图像传感器可以提供彩色成像，这是因为在使用光谱滤光器的情况下，彩色成像可能是所期望的。图像传感器可以提供用于在与可见光谱相比更宽或不同的光谱范围内成像。所述图像传感器可以被配置成使整个单个穗、多个穗或一个或多个未成熟穗的更小子段成像。如果直接采集模拟图像而非数字图像，则可以经由扫描或其它手段将模拟图像转换成数字图像。作为另外一种选择，在穗移动穿过光场时所拦截的光量可以提供二维或三维数据收集的另选手段。
可以非破坏性方式采集数字图像，即对仍处于植物上或苞叶内的一个或多个完整未成熟穗进行图像采集。
图像处理
可以使用诸如Image Pro Plus(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)之类的图像处理软件从数字图像中自动地提取每个未成熟穗的数据。可以进行各种图像处理操作，例如将与未成熟穗对象相关的图像像素与背景和/或外部碎片划分开的技术或算法。
“二值图像”具有仅由以下两种可能的值组成的有限的像素强度范围：开或关(或分别是一和零)。“二值分割”包括将像素设置为开或关，这取决于它与预先选择的阈值水平相比较的结果。阈值水平的选择可以对所得到的二值图像的外观造成影响。在选择阈值水平时，期望将目的特征(即“开”或白色的像素)(例如与未成熟穗相关的那些)与缺少样品信息的背景像素(即“关”或黑色的像素)区分开。可以手动地或以自动化方式对适当的阈值水平进行选择，自动化方式尤其适用于处理大量的数字图像。
可以通过将所采集的图像与先前表征的参考图像进行比较，校正图像质量的偏差，分离并且识别未成熟穗对象并且应用空间校准处理以将像素单元测量结果转换成公制测量单位来实现二值分割。可以使用预定义的颜色和尺寸大小信息将未成熟穗与由样品固定器所产生的外来物质和/或背景分离。也可以在分离和识别步骤中使用数字滤波处理。
可以使用各种方法和算法来帮助对阈值水平进行选择。
可以记录未成熟穗对象的每个整体或子段的数据，无限制地包括对象面积、短轴长度、长轴长度、宽度、周长、穗的颜色(诸如红色、蓝色、绿色密度)、穗丝计数和/或关于穗大小、形状、形态、位置或颜色的其它信息(例如穗的小穗数目、大小分布以及锥度)。应了解的是，这些数据项可能与在育种中目的各种性状有关。举例来说，已显示，未成熟玉米穗(即处于R1期)的穗长和穗宽显著地与在田间每株植物的籽粒产量有关(参见实例7；图3-6)。
图1和2分别示出了在处理(即二值图像分割)之前和之后的图像。
另外，可以成批模式自动地从图像中提取数据而使得能够每天不费力地处理许多图像，从而减少手动处理这么多图像所需的时间和货币资金。
在使用X射线扫描仪/传感器时，可以使用多种X射线成像和分析技术，无限制地包括：X射线计算机断层摄影术、螺旋扫描、三维重建以及表面平面化。
数据评价
使用未成熟穗光度测定法
可以使数据与其它数据成对，以使得可以通过回归或用于使变量组相互关联的其它统计技术对数据对之间的关系进行确定。应当理解的是，数据对之间存在的关系的类型可能不同，并且因而，可以应用不同的数学或统计工具。还应当理解的是，可以使多组数据相互关联而不是使两组数据相互关联(成对)。
从图像中提取的数据可以用于对小区内的变异度进行定量。“小区”简单来说是种植有具有相似遗传背景的多株植物的区域。小区内变异度描述了该小区内植物之间的变异。小区内变异度量度的类型的例子无限制地包括标准误差、标准偏差、相对标准偏差、偏度、峰度、方差、变异系数以及四分位数间距。
可以使用未成熟穗光度测定法针对产量和/或产量相关性状对玉米植物进行评价。所述方法包括种植一株或多株玉米植物，采集一个或多个未成熟穗的数字图像，使用二值分割处理所述数字图像，使用所述处理过的图像测定所述一个或多个未成熟穗的物理特性，以及针对未成熟穗的物理特性对玉米植物进行评价以获得相对于其它玉米植物的对一株或多株玉米植物的产量和/或一种或多种产量相关性状的评估。
未成熟穗的光度测定法还可以用于对目的转基因和/或包含目的转基因的构建体对产量或产量相关性状的影响进行高通量分析。如本文所述，这些方法结合了高通量转基因功能分析(美国公布号2007/0186313 A1)和高通量T1表型分析。在这些方法中，将一群转基因玉米植物种植在受控的环境设置中；采集一个或多个未成熟穗的数字图像；使用二值分割处理所述数字图像；并且评价这些未成熟穗的物理特性。在一个方面，计算所述一群转基因植物的一种或多种物理特性的平均值或中值以及变异系数，并且进行统计检验以确定对于该一种或多种物理特性来说所述一群转基因植物中的单个成员的平均值或中值与所述一群转基因植物的平均值或中值相比是否存在显著的差异。该差异可以被认为是可归因于该目的转基因。可以在转基因品种发育过程中早期，例如早在T0代和T1代时对转基因影响进行测量，从而不再需要产生多地点重复的田间试验所需的种子。此外，可以在多种环境条件(例如最佳环境或胁迫诱导性环境)下对该影响进行评价。与传统的转基因功能测试方法(例如在产量试验中)相比，可以大规模地(每年数千至数万种基因)，以显著更低的成本(由于人力和田间资源减少)并且快得多地完成对转基因影响的评价。
“产量相关性状”可以包括但不限于以下任何性状：叶夹角、开花-抽丝间期(ASI)、持绿能力、早期生长速率、总体生长速率、最大生物量、总生物量、氮胁迫耐受性以及耐旱性。优选地，产量相关性状是生物量、氮胁迫耐受性或耐旱性。
玉米植物可以包含目的转基因并且另外在本文被称为“转基因植物”。术语“转基因植物”指的是在基因组内包含一种或多种异源性多核苷酸的植物。举例来说，异源性多核苷酸被稳定地整合到基因组内，以使得该多核苷酸传给连续几代。异源性多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。每个异源性多核苷酸均可以赋予转基因植物以不同的性状。
可以使用将减少或消除实验误差来源的任何多种实验设计来种植植物。设计的一些例子包括但不限于：单因素设计、嵌套设计、析因设计、随机化区组设计、裂区设计、重复测量设计以及不重复设计。本领域的普通技术人员应熟悉这些和其它实验设计。
可以将植物种植在水限制性条件下。“水限制性条件”是指水的量不足以维持最佳的植物生长和发育的植物生长环境。本领域技术人员将会识别当中的水足以维持最佳的植物生长和发育的条件。术语“干旱”和“水限制性条件”在本文可互换使用。
当在水限制性条件下一种基因型生长优于另一种时，该植物一般被称为“具有耐旱性”。“耐旱性”是植物在干旱条件下在长时间段内保持存活而未表现出实质性的生理或物理性退化的性状。“干旱”指的是可供植物使用的水减少，特别是在长时间时可能会对植物造成损害或阻止它顺利生长(例如限制植物生长或种子产量)。
“耐旱性植物”是表现出耐旱性的植物。耐旱性植物可以是如下的植物，在水限制性条件下相对于来自对照植物的未成熟穗，该植物的未成熟穗表现出至少一种物理特性增强。
本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件以及对已经受了模拟的或天然存在的干旱条件的植物的耐旱性进行评价的方案。举例来说，可以通过在一段时间内向植物给予少于正常所需的水或不给予水来模拟干旱条件。干旱胁迫实验可以包括慢性胁迫(即缓慢干燥)和/或可以包括两次急性胁迫(即突然排水)，这两次急性胁迫由一天或两天的恢复隔开。慢性胁迫可以持续8-10天。急性胁迫可以持续3-5天。
可以将植物种植在氮限制性条件下。“氮限制性条件”指的是总可用氮(例如来自硝酸盐、氨或其它已知氮源)的量不足以维持最佳的植物生长和发育的植物生长环境。本领域技术人员将会识别当中的总可用氮足以维持最佳的植物生长和发育的条件。本领域技术人员将会识别是什么构成了足量的总可用氮，以及是什么构成了用于向植物提供氮的土壤、基质以及肥料输入物。氮限制性条件将根据许多因素而变化，这些因素包括但不限于具体的植物和环境条件。
当在氮限制性条件下一种基因型生长优于另一种时，该植物一般被称为“具有氮胁迫耐受性”。“氮胁迫耐受性”是植物的性状并且指的是植物在氮限制性条件下存活的能力。
“氮胁迫耐受性植物”是表现出氮胁迫耐受性的植物。氮胁迫耐受性植物可以是如下的植物，在氮限制性条件下相对于来自对照植物的未成熟穗，该植物的未成熟穗表现出至少一种物理特性增强。
本领域的普通技术人员熟悉模拟氮胁迫条件以及对已经受了模拟的或天然存在的氮限制性条件的植物的氮胁迫耐受性进行评价的方案。
本公开的一些方法涉及破坏性测定法。因此，可以选择与使用本公开的方法进行评价的植物具有遗传相似性的植物，诸如包含相同的构建体的植物或具有相同的遗传组成的近交系或杂交种，然后对它们进行进一步测试以实现育种的目的。然而，可以非破坏性方式对未成熟穗的性状进行评估。举例来说，可以使用X射线扫描仪/传感器来收集一个或多个数字图像。X射线可以穿透植物组织并且允许对隐藏的和/或内部的植物部分进行观测。因此，可以对仍处于植物上和/或苞叶内的完整未成熟穗测定穗的物理特性，否则可能需要对穗进行破坏性采样。
还提供了对作物植物的未成熟繁殖部分进行评价以评估转基因或重组核酸构建体对作物植物的种子产量的影响的方法。在这些方法中，在不将所述部分从所述作物植物上以物理方式取下的情况下获得所述作物植物的未成熟繁殖部分的数字图像，并且分析所述数字图像以评估所述转基因或所述重组核酸构建体对种子产量的影响。
该作物植物可以是玉米、大豆、高粱、加拿大油菜、小麦、稻或大麦。繁殖部分可以是穗(ear)、豆荚、种子穗、小穗或穗(spike)，或本领域的普通技术人员已知的任何带有种子的结构。
所述转基因可以过表达。
重组核酸构建体可以是RNAi构建体。
实例
提供以下实例以说明而非限制要求保护的本公开。应了解的是，本文所述的实例和实施例仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将能够识别可以改变而不背离本公开的精神或所附权利要求书的范围的各种试剂或参数。
实例1
应用于转基因植物的图像分析数据评价方法
植物材料
由已经过包含目的基因的构建体转化的玉米愈伤组织长成T0代植物。由相同的愈伤组织获得T0代姐妹植物，并且将一株或多株植物种植在环境受控的温室中以对包括长度、宽度、面积、每穗穗粒数、生物量以及比生长速率在内的一种或多种性状进行评价。基于性状表现对T0代植物进行选择，然后使所选的T0代植物的姐妹植物与GASPE Flint(一种快速生长的矮小的近交系)杂交以获得T1代种子。
生长条件和转基因测试
将T1代种子以距表面2″的均匀深度和植物之间8.5″的种植密度(约72K植物/英亩)播种在50％蒙脱石和50％SB300的土壤混合物中。将每株T1代植物种植在典型的200号花盆(容积等于1.7L)中并且使用包含关于植物的遗传特征、种植日期以及温室位置的信息的条形码标记进行标记。使用DsRED荧光筛选或ELISA试纸条测试将转基因植物与它们的非转基因分离体区分开，所述筛选或测试检测与目的基因相关的标记基因的存在。
实验设计
使用具有固定区组的裂区组设计以使空间变异减到最低程度。针对每种构建体评价多个品系，并且对于每个品系，使用15株转基因阳性植物和15株转基因阴性植物。阳性植物和阴性植物在每个品系区组内完全随机化。将来自具有相同构建体的品系的转基因阴性植物汇集在一起并且用作构建体空白组，该构建体空白组代表对照组。
未成熟穗的收获
使用嫩芽袋(shoot bag)覆盖穗嫩芽以防止授粉并且对抽丝的第1天进行监测。然后在最初抽丝后第8天收获未成熟(未授粉)的穗并且将它们放置在嫩芽袋或其它合适的容器中，使用包含样品标识号以及采样识别所需的任何其它信息的条形码标签进行标记。
图像采集
在到期时用手或机器收获未成熟穗并且可以在受控的照明条件下获取数字图像。可以获取玉米的一个或多个未成熟穗的图像。不需要使用受控的照明，但提供了标准化的条件，从而简化了图像分析处理。在不存在受控的照明条件的情况下，可以进行照明条件的算法或手动确定并且可以进行另外的校准以帮助提供适当的图像处理条件。还可以对图像的质量(照明、对比度、色彩平衡、色彩保真度等)进行调控以改善用于分析目的的图像。
为了采集图像，可以使用各种类型的图像传感器。所用的图像传感器可以包括电荷耦合装置(CCD)图像传感器、相机、摄像机、颜色传感器、激光/光束传感器、超声波传感器、X射线扫描仪/传感器或其它类型的图像传感器。当前的成像传感器使用对可见光谱进行检测的可商购获得的数字相机。然而，图像传感器可以提供用于在与可见光谱相比更宽或不同的光谱范围内成像。所述图像传感器可以被配置成使整个单个穗、多个穗或一个或多个未成熟穗的更小子段成像。如果直接采集模拟图像而非数字图像，则可以经由扫描或其它手段将模拟图像转换成数字图像。作为另外一种选择，在穗移动穿过光场时所拦截的光量可以提供二维或三维数据收集的另选手段。
图像分析
使用图像处理软件对未成熟穗的照片进行数字图像分析以提取数据。可以被用于提取数据的图像处理软件的一个实例是Image Pro Plus(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)。可以进行各种图像处理操作，例如将与目的未成熟穗对象相关的图像像素与一般图像背景和/或外部碎片划分开的技术或算法。可以记录未成熟穗对象的每个整体或子段的数据信息，无限制地包括对象面积、短轴长度、长轴长度、宽度、周长、穗的颜色(诸如红色、蓝色、绿色密度)、穗丝计数和/或关于穗大小、形状、形态、位置或颜色的其它信息(例如穗的小穗数目、大小分布以及锥度)。
以完全自动化方式，使用执行以下步骤以对穗对象与背景或外来物质实现二值分割并且产生可用的测量数据输出的算法来进行图像分析处理。
1.将主题图像与先前表征的参考图像相比较以确保根据设定的方案进行图像采集处理并且主题穗对象的预期光谱特征在图像分析程序的容许偏差范围内以实现可接受的结果。
2.通过触发自动光谱校正进程或通过触发将关于该图像不适合于进行自动化分析的信息返回到进程管理器的错误处理进程来解决与预期图像质量的偏差。可以使用诸如图1中所示的可商购获得的标准化比色图表来将图像光谱校正到所需的水平并且提供空间校准参考。
3.一旦满足图像质量参数，就对一个或多个穗对象进行独特地识别并且使用预定义的颜色和尺寸大小配置信息将所述一个或多个穗对象与一般图像背景分离，所述配置信息将穗对象与由样品固定器(托盘、桌子、平台)产生的外来物质和一般背景光谱分离。作为另外一种选择，可以使用数字滤波处理以分离和识别穗对象以进行数据提取。参见图1和2。
4.在识别和分离穗对象之后，应用空间校准处理以将像素单元测量结果转换成公制测量单位(例如cm)。自动地生成所校准的结果并且输出到数据文件以总结和解释成描述性的性状。
图1A和1B分别是玉米的单个未成熟穗样品和多个未成熟穗样品的数字图像。这些数字图像代表所要处理的输入图像样本。图2A和2B图示了进行分割处理以将未成熟穗对象像素与背景像素分离的结果。一旦已在图像上识别出穗对象像素，就收集测量结果并且创建数据输出。单个穗的实例数据输出示于表1中。
表1：单个穗的数据输出实例
实例2
未成熟穗光度测定数据的再现性
为了评价未成熟穗光度测定法的再现性，使长度在4至24cm范围内的十个未成熟穗各自成像十次，在每张照片之间取走穗并且将它放回原位。穗长的变异系数(CV)在0.3％-2.2％的范围内，平均值是0.9％。穗面积的变异系数在0.6％-6.8％的范围内并且平均值是2.1％。应注意会增加变异度的因素包括穗的不对称性以及用于照亮样品室的相机闪光灯所造成的阴影。穗的径向不对称性可能略微影响宽度和面积。在非常长的穗上通常会注意到闪光灯造成的阴影并且可能增加穗长和面积的变异度。在所分析的有限集合中，不对称性所造成的穗面积变异度的增加是阴影所造成的穗面积变异度的增加的近三倍，从而表明与由相机系统参数所引入的变异度相比，所研究的材料的“天然”变异度对所测量的参数的变异度有更大的影响。
实例3
在低氮条件下的未成熟穗光度测定数据分析
为了探究使用未成熟穗光度测定数据在低氮(LN)测定法中评估T1代植物的可行性，将野生型(非转基因)植物种植在典型的200号花盆(容积等于1.7L)中并且使用具有关于植物的遗传特征、种植日期以及温室位置的信息的条形码标记。将种子以距表面2″的均匀深度和植物之间8.5″的种植密度(约72K植物/英亩)播种在100％蒙脱石MVP无土基质中。在种植后第十四天，开始使用低氮或高氮液体肥料进行自动化浇灌并且持续直到收获为止。在出现穗丝时，将穗套袋以防止授粉。在穗丝出现后第8天收获穗并且使用穗光度测定法进行分析。若干个光度测定参数(例如未成熟穗面积和未成熟穗长；表2)在低氮下显示出降低超过40％，然而仍维持相对低的变异系数(CV)。
表2：在低氮条件和正常氮条件下穗光度测定变量和CV
实例4
在T1代低氮测定中对T0代主导基因的表现分析
将低氮测定法应用于转基因植物和它们的非转基因分离体。使用具有固定区组的裂区组设计以使空间变异减到最低程度。对于每种构建体(每种构建体均包含用于评价的主导基因)选择四个品系进行T1代测定。对于每个品系，使用15株转基因阳性植物和15株转基因阴性植物。将阳性植物和阴性植物在每个品系区组内随机配对。在T1代测定中所用的所有构建体(PHP)均是在T0代阶段表现为阳性或阴性的构建体(即在T0代表型测定时两种或更多种穗光度测定性状在P＜0.1下呈显著阳性或阴性)。
T1代低氮结果示于表3中。在所测试的四个品系当中有两个或更多个在至少一种穗光度测定性状方面呈显著阳性或阴性时，称为在T1代时具显著性。在基于T0代穗光度测定数据所选择的四种显著阳性构建体当中，一种(PHPXX708)在T1代低氮测定中也呈显著阳性。另外，在T1代低氮测定中确定四种显著阴性主导基因中的一种(PHPXX560)。
表3：构建体在T0代和T1代低氮测定中的表现
PHP T0代LN测定 T1代LN测定
PHPXX712 显著阳性 中性
PHPXX563 显著阳性 中性
PHPXX708 显著阳性 显著阳性
PHPXX626 显著阳性 中性
PHPXX560 显著阴性 显著阴性
PHPXX570 显著阴性 中性
PHPXX569 显著阴性 中性
PHPXX701 显著阴性 中性
实例5
在干旱条件下的未成熟穗光度测定数据分析
为了探究使用未成熟穗光度测定数据在干旱测定法中评估T1代植物的可行性，将野生型(非转基因)植物种植在典型的200号花盆(容积等于1.7L)中，使用包含关于植物的遗传特征、种植日期以及温室位置的信息的条形码标记进行标记。将种子以距表面2″的均匀深度和植物之间8.5″的种植密度(约72K植物/英亩)播种在50％蒙脱石和50％SB300的土壤混合物中。在10％雄穗出现时，中止自动化浇灌，持续约10天。在10天后，重新开始定期浇灌。在出现穗丝时，将穗套袋以防止授粉。在穗丝出现后第8天收获穗并且使用穗光度测定法进行分析(数据示于表4中)。
表4：在干旱条件和充分浇灌条件下穗光度测定变量和CV
参数 在干旱下的CV 在WW下的CV 相对于WW的降低％
未成熟穗面积 28.30％ 26.00％ 44.10％
未成熟穗长 19.50％ 19.90％ 31.90％
实例6
在T1代干旱测定中对T0代主导基因的表现分析
通过在较长的一段时间内每天递送极少量的液体肥料来施加干旱胁迫。经由用于测定与目的基因相关的标记基因的存在的试纸条测试来识别转基因植物和它们的非转基因分离体。使用具有固定区组的裂区组设计以使空间变异减到最低程度。每种构建体选择六个品系进行T1代测定。对于每个品系，使用15株转基因阳性植物和15株转基因阴性植物。将阳性植物和阴性植物在每个品系区组内随机配对。在T1代测定中所用的所有构建体(PHP)均是在T0代表现为阳性或阴性的构建体(在T0代表型测定时两种或更多种穗光度测定性状在P＜0.1下呈显著阳性或阴性)。表5：构建 体在T0代和T1代干旱测定中的表现
PHP名称 T0代干旱测定 T1代干旱测定
PHPXX316 显著阳性 中性
PHPXX351 显著阳性 显著阳性
PHPXX354 显著阳性 中性
PHPXX355 显著阳性 显著阳性
PHPXX356 显著阳性 显著阳性
PHPXX357 显著阳性 显著阳性
PHPXX359 显著阳性 显著阳性
PHPXX562 显著阳性 显著阳性
PHPXX572 显著阳性 中性
PHPXX595 显著阳性 显著阳性
PHPXX558 显著阴性 显著阳性
PHPXX565 显著阴性 显著阴性
PHPXX580 显著阴性 显著阳性
PHPXX582 显著阴性 中性
PHPXX601 显著阴性 显著阴性
PHPXX627 显著阴性 显著阴性
实例7
未成熟穗参数与田间产量的相关性
进行两个实验以评估在两个发育阶段(R1期(穗丝出现；相当于未成熟穗期)和生理成熟期)时的产量与穗参数之间的相关性。一个实验在氮已耗竭的土壤(“耗竭型”)中进行，并且另一个实验在具有历史正常的氮管理的土壤(“未耗竭型”)中进行。在这两个实验中，在V3发育阶段时施用氮肥。在耗竭型条件下进行的实验由单个可商购的杂交种33W84以及以每英亩0、20、40和60lb氮的比率进行的四种施肥处理组成。所有处理组合重复4次。在未耗竭型条件下进行的第二个实验由在主小区内混杂在一起的三种杂交种(副小区)33W84、33T56和33K42以及以每英亩0、30、60、90、120和150lb N的比率进行的五种施肥处理(主小区)组成。每种处理组合重复五次。
在R1期和生理成熟期时对每个小区中的十株植物进行采样。在R1期时，所测量的参数是SPAD、未成熟穗重、未成熟穗长、未成熟穗宽以及总植物生物量。在生理成熟期时，所测量的参数是穗重、100颗穗粒重、穗粒数、籽粒重以及总生物量。所有测量结果以每株植物为基础来表示。在适当时，对于每个实验进行方差分析以确定主小区、副小区以及主小区×副小区相互作用的显著性。
在跨越不同的氮肥度水平的耗竭型小区和未耗竭型小区中，每株植物的籽粒产量显著地与在R1期(抽丝期)时的穗长和/或穗重相关(图3-6)。
实例8
使用未成熟穗光度测定法来选择具有所期望的农学特征的玉米植物
可以将玉米植物，例如近交或杂交的玉米植物种植在温室中或田间，并且可以例如在第一条穗丝可见时(即在穗丝的范围是1至50条时)获得未成熟穗以进行图像采集和分析(描述于实例1中)。然后可以将玉米植物在多种未成熟穗特征方面彼此以及与对照组进行比较，所述特征包括但不限于对象面积、短轴长度、长轴长度、宽度、周长、穗的颜色(诸如红色、蓝色、绿色密度)、穗丝计数和/或关于穗大小、形状、形态、位置或颜色的其它信息(例如穗的小穗数目、大小分布以及锥度)。用这种方式，可以针对所需的农学特征对玉米植物进行分选，然后选择用于实现育种目的。
实例9
使用未成熟穗光度测定法来选择在干旱胁迫下产量增加的玉米植物
在第一朵雌花由于从苞叶中显露出来而变得可见后大约前十天期间，所出现的花的数目(即穗丝数目)与穗生物量之间存在强烈的关系。这种关系可用于将耐旱性玉米杂交种与不耐旱性玉米杂交种分开(图7)，这是因为耐旱性杂交种在这个发育阶段时与不耐旱性杂交种相比趋向于具有更小的穗。
由于在未成熟穗期穗生物量与耐旱性之间的这种关系以及穗面积与穗生物量之间存在密切联系的这一事实(图8)，因而可以使用未成熟穗面积来表征育种群体的耐旱性。因此，可以在未成熟穗期从穗面积估算生物量，然后可以将具有更小穗面积的玉米近交系和/或杂交种选为具有提高的耐旱性。图9示出了三个育种群体的从未成熟穗面积估算的未成熟穗生物量与在干旱胁迫条件下的产量之间的关系。
实例10
使用未成熟穗光度测定法选择的主导基因与对照组相比显示出提高的 田间产量
PHPXX708在T1代低氮测定中呈显著阳性(表3)。在所评价的四个品系(表6)当中，至少两个品系在未成熟穗面积方面显示出显著阳性作用；至少两个品系在未成熟穗长方面显示出显著阳性作用；并且至少两个品系在未成熟穗宽方面显示出显著阳性作用。此外，这些品系中的一个与空白组相比显示出穗丝计数显著增加。
表6：在T1代NUE测定中PHPXX708的表现
*指示显著增加(p＜0.1)
此外，PHMXX558在T1代干旱测定中呈显著阳性。包含PHPXX558的五个品系中的至少两个在未成熟穗面积方面具有显著阳性作用；这些品系中的至少两个在未成熟穗宽方面具有显著阳性作用；至少一个具有显著更长的穗；并且至少一个具有显著更高的穗丝计数(表7)。
表7：在T1代干旱测定中PHPXX558的表现
*指示显著增加(p＜0.1)
相同的主导基因存在于构建体PHPXX708和PHPXX558中。产生包含特定的主导基因的构建体，然后将所述构建体引入到优良玉米中。使包含该转基因的单拷贝纯合转基因近交玉米植物与测交系杂交以产生杂交种子。将所得到的种子推进到在处于干旱或低氮环境下的多个地点进行产量试验。以相同的植物密度种植转基因品系和野生型植物。当在处于干旱和低氮条件下的地点以及在充分浇灌的环境中的所有品系范围内计算平均值时，过表达该转基因的杂交种的产量大于对照组(野生型)。另外，在许多产量试验地点，若干个品系的产量显著优于对照组(数据未示)。
实例11
进行未成熟穗光度测定法以获得小穗计数
可以手动地获得小穗计数，并且可以使用图像处理算法对计数进行校正。小穗数目与产量有关，因此经由未成熟穗光度测定分析所获得的小穗计数可以帮助选择具有提高的产量潜能的植物而作为植物育种计划的一部分。
实例12
使用X射线成像以非破坏性方式收集未成熟穗参数
还可以使用X射线扫描仪/传感器收集一个或多个数字图像而以非破坏性方式获得如本文在方法和实例中所详述的未成熟穗参数的集合。
举例来说，可以使用轴向三维计算机断层摄影术获得未成熟穗的扫描图。可以将若干个穗放置在CFRP(碳纤维增强聚合物)管内。然后可以获得二维图像，并且可以对这些图像进行二值分割。可以获得二维二值化切片的平均以得到穗的最大轮廓。可以使用平均的投影来评价诸如但不限于未成熟穗长和直径的性状。图10示出了由X射线成像获得的未成熟穗的原始图像。

Claims (41)

1.对至少一种玉米植物进行评价的方法，包括：
a.采集所述玉米植物的至少一个未成熟穗的数字图像；
b.处理所述数字图像；
c.由所述经处理的数字图像确定所述至少一个未成熟穗的至少一种物理特性；以及
d.基于所述至少一个未成熟穗的至少一种物理特性对所述至少一种玉米植物进行评价。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个未成熟穗的至少一种物理特性是所述穗的面积、长度、宽度、周长、穗的颜色、穗丝计数、小穗数目、大小分布或锥度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中使用二值分割处理所述图像。
4.根据权利要求1所述的方法，其中使用图像传感器采集所述数字图像。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述图像传感器选自：电荷耦合装置(CCD)图像传感器、数字相机、摄像机、颜色传感器、激光/光束传感器、X射线扫描仪/传感器以及超声波传感器。
6.根据权利要求4所述的方法，其中在受控的照明条件下采集使用图像传感器所采集的所述数字图像。
7.根据权利要求4所述的方法，其中使用在算法上或手动地确定的照明条件采集使用图像传感器所采集的所述数字图像。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述图像传感器被配置成使一个或多个未成熟穗以其整体成像或使一个或多个未成熟穗的更小子段成像。
9.根据权利要求1所述的方法，其中通过扫描模拟图像来采集所述数字图像。
10.根据权利要求1所述的方法，其中以非破坏性方式采集所述数字图像。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括基于所述至少一个未成熟穗的至少一种物理特性预测所述至少一种玉米植物的成熟穗产量。
12.针对产量和/或产量相关性状对玉米植物进行评价的方法，包括：
a.种植玉米植物；
b.采集所述玉米植物的未成熟穗的数字图像；
c.使用二值分割处理所述数字图像；
d.由所述经处理的数字图像确定所述未成熟穗的物理特性；以及
e.针对所述未成熟穗的物理特性对所述玉米植物进行评价。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述物理特性是所述穗的面积、长度、宽度、周长、颜色、穗丝计数、小穗数目、大小分布或锥度。
14.根据权利要求12所述的方法，其中使用图像传感器采集所述数字图像。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述图像传感器选自：电荷耦合装置(CCD)图像传感器、数字相机、摄像机、颜色传感器、激光/光束传感器、X射线扫描仪/传感器以及超声波传感器。
16.根据权利要求14所述的方法，其中在受控的照明条件下采集使用图像传感器所采集的所述数字图像。
17.根据权利要求14所述的方法，其中利用照明条件的算法或手动确定来采集使用图像传感器所采集的所述数字图像。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述图像传感器被配置成使一个或多个未成熟穗以其整体成像或使一个或多个未成熟穗的更小子段成像。
19.根据权利要求12所述的方法，其中通过扫描模拟图像来采集所述数字图像。
20.根据权利要求12所述的方法，其中从所述玉米植物收获所述未成熟穗。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述收获用手或机器来执行。
22.根据权利要求12所述的方法，其中所述产量相关性状选自生物量、氮胁迫耐受性以及耐旱性。
23.根据权利要求12所述的方法，其中所述玉米植物包含目的转基因。
24.根据权利要求12所述的方法，其中所述玉米植物被种植在受控的环境设置中。
25.根据权利要求12所述的方法，其中在氮和/或水限制性条件下进行所述种植步骤a)。
26.根据权利要求12所述的方法，其中以非破坏性方式采集所述数字图像。
27.用于对目的转基因对玉米的产量或产量相关性状的影响进行高通量分析的方法，包括：
a.提供被种植在受控的环境设置中的一群转基因玉米植物；
b.采集来自所述群体中的所述转基因玉米植物中的至少两株的至少一个未成熟玉米穗的数字图像；
c.使用二值分割处理所述数字图像；
d.计算所述一群转基因玉米植物的至少一种物理特性的平均值或中值以及变异系数；以及
e.进行统计检验以确定所述单株转基因玉米植物与所述一群转基因玉米植物之间在至少一种物理特性方面是否存在显著的差异。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述产量相关性状选自：生物量、氮胁迫耐受性以及耐旱性。
29.根据权利要求27所述的方法，其中使用图像传感器采集所述数字图像。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述图像传感器选自：电荷耦合装置(CCD)图像传感器、数字相机、摄像机、颜色传感器、激光/光束传感器、X射线扫描仪/传感器以及超声波传感器。
31.根据权利要求29所述的方法，其中在受控的照明条件下采集使用图像传感器所采集的所述数字图像。
32.根据权利要求29所述的方法，其中利用照明条件的算法或手动确定来采集使用图像传感器所采集的所述数字图像。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述图像传感器被配置成使一个或多个未成熟穗以其整体成像或使一个或多个未成熟穗的更小子段成像。
34.根据权利要求27所述的方法，其中通过扫描模拟图像来采集所述数字图像。
35.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一个未成熟穗的至少一种物理特性是所述穗的面积、长度、宽度、周长、颜色、穗丝计数、小穗数目、大小分布或锥度。
36.根据权利要求27所述的方法，其中从所述至少一种玉米植物收获至少一个未成熟穗。
37.根据权利要求27所述的方法，其中所述一群转基因植物是快速循环的均一玉米品系。
38.根据权利要求27所述的方法，其中所述转基因玉米植物被种植在氮和/或水限制性条件下。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述收获用手或机器来执行。
40.根据权利要求27所述的方法，其中以非破坏性方式采集所述数字图像。
41.对作物植物的未成熟繁殖部分进行评价以评估转基因或重组核酸构建体对所述作物植物中的种子产量的影响的方法，所述方法包括采集所述作物植物的未成熟繁殖部分的数字图像，其中所述未成熟繁殖部分不以物理方式从所述作物植物上取下；以及分析所述数字图像以评估所述转基因或所述重组核酸构建体对种子产量的影响。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述繁殖部分是所述玉米植物的未成熟穗。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述转基因过表达。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述重组核酸构建体是RNAi构建体。
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