CN104116786A - 一种贞芪扶正药物组合物 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种贞芪扶正药物组合物，按重量份计算，它由黄芪和女贞子药材中的多糖类成分提取物30～60份、黄酮类及皂苷类成分提取物13～35份和萜类成分提取物6～20份制成。本发明能够高效、充分地提取黄芪和女贞子中的多糖类、黄酮类、皂苷类和萜类等主要成分，并且简化了提取步骤，操作简便，提高了各有效成分的提取率和纯度，提高了提取效率；此外，通过本发明所述制备方法获得的各有效成分提取物制备的贞芪扶正药物组合物的治疗效果更好，也可以降低药物的服用量。
Description
技术领域
本发明涉及一种贞芪扶正药物组合物，属于贞芪扶正制剂制备技术领域。
背景技术
贞芪扶正制剂有补气养阴、扶正固本之功效。现代药理实验证明能提高人体免疫功能，保护骨髓和肾上腺皮质功能，促进干扰素产生；配合肿瘤患者放、化疗，减轻病人放、化疗期间的毒副作用，促进正常功能的恢复的作用。其处方由黄芪、女贞子组成。目前，贞芪扶正制剂供临床选择的剂型有片剂、胶囊剂、颗粒剂及滴丸剂等。
女贞子、黄芪均富含多种药物有效成分，而在贞芪扶正制剂中起到免疫调节作用的成分主要有：萜类、多糖类、黄酮类和皂苷类成分。
目前，贞芪扶正制剂大多采用传统的制备方法：比如水提醇沉法、醇提水沉法。以黄芪的有效成分为例，利用水提醇沉法进行制备，黄芪多糖的提取会比较充分，但黄芪皂苷的提取率和含量较低；而利用醇提水沉法制备，则可得到较高得率和含量的皂苷，但黄芪多糖的提取率会降低，含量稍有提高。由于需要提取的药物有效成分有多种，通过上述传统的制备工艺得到的贞芪扶正制剂的药物有效成分基本上均为粗提物，提取率和纯度不能满足生产使用的需求，不仅会导致患者的服用量较大，而且还会直接影响产品的质量和临床疗效。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种贞芪扶正药物组合物，该组合物中的多糖类、黄酮类、皂苷类和萜类等主要成分的提取率和纯度高，从而降低制剂服用量，使得贞芪制剂的治疗效果更好。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种贞芪扶正药物组合物，按重量份计算，它由黄芪和女贞子药材中的多糖类成分提取物30～60份、黄酮类及皂苷类成分提取物13～35份和萜类成分提取物6～20份制成。
前述的贞芪扶正药物组合物中，所述多糖类成分提取物的制备方法为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用50％～90％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15，再加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，取沉淀物即得。
优选的，取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用80％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.15，再加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，取沉淀物即得。
前述的贞芪扶正药物组合物中，多糖类成分提取物的制备可进一步将洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，截留分子量3kDa以上的成分，收集所得截留液，浓缩至干。
优选的，超滤膜器件采用中空纤维式或卷式；膜材料采用PVDF或PS。
前述的贞芪扶正药物组合物中，多糖类成分提取物的制备可进一步将洗涤后的沉淀物加水溶解，上处理过的大孔吸附树脂，依次用水、10％～70％的乙醇溶液梯度洗脱，至在洗脱液中加入95％乙醇无沉淀为止，收集洗脱液，浓缩至干。
优选的，所述大孔吸附树脂为MG-1型大孔树脂。
前述的贞芪扶正药物组合物中，所述黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用50％～90％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的大孔树脂柱，用3～5BV水洗涤，再用4～8BV的60％以上乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
优选的，所述黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用80％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的AB-8大孔树脂柱，用3BV水洗涤，再用4BV的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
前述的贞芪扶正药物组合物中，所述黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加50％～90％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的大孔树脂柱，用3～5BV水洗涤，再用4～8BV的60％以上乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
优选的，所述黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加80％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的AB-8大孔树脂柱，用3BV水洗涤，再用4BV的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
前述的贞芪扶正药物组合物中，所述萜类成分提取物的制备方法为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉水提取后的滤渣，加50％～90％乙醇提取2～4次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
优选的，所述萜类成分提取物的制备方法为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉水提取后的滤渣，加80％乙醇提取三次，每次加6倍量乙醇，提取1小时，滤过，合并三次滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入2倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
前述的贞芪扶正药物组合物中，所述黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，采用50％～90％乙醇提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理过的D101、HPD-100、DM301或AB-8大孔吸附树脂水洗至无色后，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
优选的，所述黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子按2:1的重量配比混合后，粉碎成粗粉，采用80％乙醇提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理过的AB-8大孔吸附树脂水洗至无色后，用40％～95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
申请人对组合物中各提取物的用量比例进行了筛选实验研究。
取小鼠190只，雌雄各半，随机分成19组(本发明贞芪扶正药物组合物组16个，贞芪扶正泡腾片组、正常对照组和模型对照组各1个)，每组10只。
1、本发明贞芪扶正药物组合物组中各提取物的提取方法如下：
多糖类成分提取物：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用50％～90％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15，再加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，取沉淀物即得。
黄酮类和皂苷类成分提取物：
①将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用50％～90％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的大孔树脂柱，用3～5BV水洗涤，再用4～8BV的60％以上乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
②将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加50％～90％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的大孔树脂柱，用3～5BV水洗涤，再用4～8BV的60％以上乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
萜类成分提取物：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉水提取后的滤渣，加50％～90％乙醇提取2～4次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，采用50％～90％乙醇提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理过的D101、HPD-100、DM301或AB-8大孔吸附树脂水洗至无色后，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
2、贞芪扶正泡腾片的制备方法如下(发明专利200510031693.1)：将重量配比为2:1的黄芪、女贞子加水煎煮三次，第一次加水10倍量，煎煮3小时；第二次加水8倍量，煎煮2小时；第三次加水8倍量，煎煮1小时；滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.08～1.10，60℃时测，喷雾干燥，得干膏；取干膏，加入乳糖、酒石酸、甜菊素，混合，粉碎成细粉，用乙醇制软材，制粒，60～65℃干燥，整粒，备用；另取聚乙二醇-6000熔融，加入碳酸氢钠，搅拌均匀，冷却后粉碎成细粉，过筛，与上述酸颗粒、硬脂酸镁混匀，压片。
3、对正常对照组和模型对照组均予等容2％吐温80的蒸馏水灌胃，各组连续给药10天，给药量按原生药材计为4.5g·kg-1·d-1；给药第8天起除正常对照组外，其他各组均在皮下注射环磷酰胺40mg·kg-1·d-1，每天1次，共3次。给药第4天，各组小鼠腹腔注射5％CRBC悬液0.2mL/只，进行免疫；末次给药后24小时，各鼠股动脉取血于离心管中，室温下放置1小时，2000rpm离心10min，取血清用生理盐水稀释100倍；取稀释血清1mL，与5％鸡红细胞(CRBC)悬液0.5mL、100％补体0.5mL混合，在37℃恒温箱中保温30min，后于0℃冰箱内终止反应；离心，取上清液于分光光度计540nm处比色，另设不加血清的空白对照，取其上清液作为空白凋零，以光密度(OD)值作为判定血清溶血素效价的指标，数据采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。各组对血清溶血素的影响实验结果见下表。
表1各组对血清溶血素的影响比较
注：与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。
实验结果显示，本发明贞芪扶正药物组合物对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠血清溶血素效价有明显增强作用。其中，多糖类在30～60重量份，黄酮类与皂苷类在13～35重量份，萜类在6～20重量份所组成的贞芪扶正制剂的效果强于现有贞芪扶正制剂；且当多糖类为40重量份、黄酮类与皂苷类为25重量份、萜类为10重量份时，效果最佳；多糖类为40重量份、黄酮类、皂苷类与萜类为35重量份时，效果仅次之。
为确保贞芪扶正药物组合物中各有效成分的提取率，申请人对提取工艺条件进行了一系列的试验研究和筛选。
1、实验仪器(见表2)
表2
| 仪器名称 | 生产厂家 |
| BS124S电子分析天平 | 北京赛多利斯仪器系统有限公司 |
| 116摇摆式粉碎机 | 海南佳惠食品机械厂 |
| R-220旋转蒸发仪 | 瑞士布其公司 |
| 真空干燥箱 | 上海一恒实验仪器总厂 |
2、计算公式
下面以多糖类成分为例：
(1)多糖提取率计算公式：多糖提取率＝(提取物中多糖总量/黄芪及女贞子中多糖的总量)×100％；
(2)多糖得率计算公式：(二次纯化所得多糖总量/一次纯化物总量)×100％；
(3)多糖纯度计算公式：(二次纯化所得多糖总量/二次纯化物总量)×100％。
3、多糖类成分提取工艺筛选
(1)多糖类成分提取工艺参数筛选
为寻找多糖类成分较佳的提取工艺条件，选取不同的提取剂乙醇浓度、提取次数、浓缩相对密度、加入沉淀剂后的含醇量和静置时间作为考察因素(沉淀剂、洗涤剂均采用95％乙醇)，计算多糖类成分的提取率，结果见表3。
表3
由实验可知，取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用50％～90％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至1.08～1.20，再加入95％乙醇使含醇量达70％～90％，静置12～30小时，过滤，取沉淀物用95％乙醇进行洗涤，得到的多糖提取率均高于90％；但从数据中可看出，相同条件下加入沉淀剂后的含醇量达90％后的提取率比加入沉淀剂后的含醇量为70％或80％时的提取率幅度增长不大，因此从节约生产成本的角度看，我们选择“加入95％乙醇使含醇量达70％～80％”；相同的，当浓缩相对密度为1.20、静置时间为30小时的提取率比浓缩相对密度为1.15、静置时间为24小时的提取率增长幅度不大，因此从省时、节能降耗的角度看，我们选择“浓缩相对密度为1.08～1.15、静置时间为12～24小时”。多糖类成分的优选提取工艺为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用80％乙醇提取3次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.15，再加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，取沉淀物即得。
(2)多糖类成分二次纯化方法筛选
先用水提醇沉法提纯黄芪和女贞子中的多糖，再分别运用超滤法、大孔树脂法、盐析法、金属络合物法进行二次纯化。对不同纯化工艺的多糖得率和纯度进行了比较，以便确定更优的纯化工艺，结果见表4。
表4
由上表可知，选用超滤法或大孔树脂法对多糖提取物进行二次纯化，其多糖得率和纯度是较高的。因此本发明选用超滤法或大孔树脂法对水提醇沉法提取得到的多糖进行二次纯化。
(3)多糖类成分纯化工艺参数的筛选
①超滤法：所述多糖类成分提取物的制备方法为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用50％～90％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至1.08～1.15，再加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，将洗涤后的沉淀物加水溶解后上中空纤维超滤膜或卷式超滤膜进行超滤，截留分子量3kDa以上的成分，收集所得截留液，浓缩至干，即得多糖类成分提纯物。计算多糖得率及多糖纯度，结果见表5。
表5
| 截留分子量 | 多糖得率(％) | 多糖纯度(％) |
| 500Da～3kDa | 85.59 | 70.85 |
| ≥3kDa | 83.78 | 97.50 |
| ＞6kDa | 80.00 | 97.78 |
由上表可知，选用中空纤维超滤膜或卷式超滤膜进行超滤对多糖提取物进行二次纯化，截留分子量选择大于3kDa，其多糖得率和纯度是较高的。这是由于黄芪和女贞子中黄酮、皂苷、萜类等成分的分子量都较小，其中几百道尔顿的居多，而多糖的分子量主要在1～5万Da左右，并且在3000Da～6000Da分子量段也有分布；因此，为了最大量的提取得到多糖，且不受其他有效成分的影响，故选择截留量为3000Da。
②大孔树脂法：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用50％～90％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至1.08～1.15，再加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，将洗涤后的沉淀物加水溶解，上处理过的大孔吸附树脂，依次用水、10％～70％的乙醇溶液梯度洗脱，至在洗脱液中加入95％乙醇无沉淀为止，收集洗脱液，浓缩至干即得多糖类成分提纯物。
a)树脂类型筛选
分别采用“阳离子交换树脂上样、蒸馏水洗脱”，“大孔吸附树脂上样、蒸馏水洗脱”，“聚酰胺柱上样、蒸馏水洗脱”对按本发明水提醇沉法提取的多糖提取物进行二次纯化，计算多糖质量和纯度，结果见表6。
表6
| 吸附剂 | 洗脱剂 | 多糖质量(g) | 多糖纯度(％) |
| 阳离子交换树脂 | 蒸馏水 | 2.225 | 86.7 |
| 大孔吸附树脂 | 蒸馏水 | 2.485 | 96.8 |
| 聚酰胺柱 | 蒸馏水 | 2.346 | 91.4 |
由上表可知：采用大孔吸附树脂为吸附剂得到的多糖纯度高、效果好。下面对不同类型大孔吸附树脂纯化多糖的效果进行比较试验，结果见表7。
表7不同类型大孔吸附树脂对多糖的饱和吸附容量和解吸率
由上表可知：采用MG-1型大孔树脂时，对多糖的饱和吸附容量及解吸率均较高，分别达到700mg/g以上和70％以上，因此，采用MG-1型大孔树脂。
b)洗脱剂及浓度筛选
分别选择蒸馏水、30％乙醇、40％甲醇、0.2mol/L NaOH作为洗脱剂，分别考察其洗脱能力，采用紫外分光光度计法测定多糖含量，计算解吸率，试验结果见下表。
表8
| 洗脱剂 | 解吸率(％) |
| 蒸馏水 | 94.38 |
| 30％乙醇 | 94.92 |
| 40％甲醇 | 91.63 |
| 0.2mol/L NaOH | 70.37 |
表中数据表明，蒸馏水和一定浓度的甲醇、乙醇均具有较好的洗脱效果；但基于甲醇有毒，对人体危害大，我们选择用水和乙醇作为洗脱剂进行洗脱。
分别选择蒸馏水、5％乙醇、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇作为洗脱剂，分别考察其洗脱能力，采用紫外分光光度计法测定多糖含量，计算解吸率，试验结果见下表。
表9
| 洗脱剂 | 解吸率(％) |
| 蒸馏水 | 94.44 |
| 5％乙醇 | 41.37 |
| 10％乙醇 | 71.88 |
| 30％乙醇 | 94.82 |
| 50％乙醇 | 92.73 |
| 70％乙醇 | 10.55 |
| 90％乙醇 | 1.12 |
表中数据表明，随着洗脱剂乙醇浓度的增加，洗脱效果也随之增强，当乙醇浓度达到30％时，洗脱效果最好，高于30％后，洗脱效果逐渐减弱，当浓度达到70％时，洗脱效果已经很差；因此选择蒸馏水、10％～70％乙醇作为洗脱剂依次进行洗脱。
4、黄酮类和皂苷类成分纯化工艺筛选
(1)纯化工艺方法筛选
将黄芪、女贞子粗粉加水提取，过滤，滤渣备用，滤液浓缩后加乙醇沉淀，过滤，滤液备用；沉淀用乙醇洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用一定浓度的乙醇提取，过滤，滤液浓缩后加水沉淀；滤液与备用滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，浓缩后采用下表中不同方法进行纯化；或将黄芪、女贞子粗粉用一定浓度的乙醇提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加水沉淀，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入乙醇沉淀，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，浓缩后采用下表中不同方法进行纯化。其中提取率＝(提取物中黄酮(皂苷)总量/黄芪及女贞子中黄酮(皂苷)的总量)×100％；纯度＝(提纯物中黄酮或皂苷总量/提取物总量)×100％，结果见表10。
表10
由上表可知，通过“大孔树脂法”进行纯化，其黄酮类和皂苷类成分的纯度是最高的，因此选用“大孔树脂法”作为黄酮类和皂苷类成分的纯化工艺。
(2)纯化工艺参数筛选
为寻找黄酮类和皂苷类成分较佳的纯化工艺条件，选取不同的提取剂乙醇浓度、树脂类型、洗脱剂乙醇体积和洗脱剂乙醇浓度作为考察因素，分别计算黄酮类和皂苷类成分的得率，结果见表11。
表11
由上表可知，所述黄酮类和皂苷类成分的最佳纯化工艺为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用80％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的AB-8大孔树脂柱，用3BV水洗涤，再用4BV的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得；或将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加80％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的AB-8大孔树脂柱，用3BV水洗涤，再用4BV的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
5、萜类成分提取工艺筛选
(1)提取工艺方法筛选
表12
由上表可知，醇提水沉法的提取率高于水提醇沉法，因此选用醇提水沉法来提取萜类成分。
(2)提取工艺参数筛选
为寻找萜类成分较佳的提取工艺条件，选取不同的提取剂乙醇浓度、提取次数及体积、提取时间、浓缩温度和浓缩相对密度作为考察因素，计算萜类成分的提取率，结果见表13。
表13
由上表可知，所述萜类成分提取物的优选制备方法为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉水提取后的滤渣，加80％乙醇提取三次，每次加6倍量乙醇，提取1小时，滤过，合并三次滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入2倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
6、黄酮类、皂苷类以及萜类成分提取工艺筛选
(1)提取工艺方法筛选
采用不同提取方法对黄芪和女贞子中的黄酮类、皂苷类以及萜类成分进行提取，并分别计算黄酮类、皂苷类及萜类成分的提取率和纯度，其中提取率＝(提取物中黄酮(皂苷或萜类)总量/黄芪及女贞子中黄酮(皂苷或萜类)的总量)×100％；纯度＝(提纯物中黄酮、皂苷或萜类总量/提取物总量)×100％，结果见表14。
表14
| 方法 | 提取率(％) | 纯度(％) |
| 黄酮类 | 皂苷类 | 萜类 | 黄酮类 | 皂苷类 | 萜类 | |
| 乙醇提取+大孔树脂法 | 87.62 | 62.30 | 83.22 | 16.20 | 65.62 | 35.16 |
| 水提取+大孔树脂法 | 70.51 | 50.12 | 13.01 | 7.15 | 26.40 | 15.33 |
| 乙醇提取+溶剂沉淀法 | 87.62 | 62.30 | 83.22 | 13.55 | 47.65 | 23.16 |
| 水提取+溶剂沉淀法 | 70.51 | 50.12 | 13.01 | 3.62 | 20.13 | 12.08 |
由上表可知，先用乙醇提取黄芪和女贞子中的黄酮类、皂苷类及萜类成分，再采用大孔树脂法对提取物进行纯化，其黄酮类、皂苷类及萜类成分的提取率是最高的，因此选用“乙醇提取+大孔树脂法”作为黄酮类、皂苷类及萜类成分的提取工艺。
(2)提取工艺参数筛选
为寻找黄酮类、皂苷类及萜类成分较佳的提取工艺条件，选取不同的提取剂乙醇浓度、树脂类型和洗脱剂乙醇浓度作为考察因素，分别计算黄酮类、皂苷类及萜类成分的得率，结果见表15。
表15
由上表可知，所述黄酮类、皂苷类及萜类成分的最佳提取工艺为：将黄芪、女贞子按2:1的重量配比混合后，粉碎成粗粉，采用50％～90％乙醇提取(以80％乙醇最佳)，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理过的AB-8大孔吸附树脂水洗至无色后，用40％～95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
与现有技术相比，本发明能够高效、充分地提取黄芪和女贞子中的多糖类、黄酮类、皂苷类和萜类等主要成分，并且简化了提取步骤，操作简便，提高了各有效成分的提取率和纯度，提高了提取效率；此外，通过本发明所述制备方法获得的各有效成分提取物制备的贞芪扶正药物组合物的治疗效果更好，也可以降低药物的服用量。
具体实施方式
本发明实施例1：一种多糖类成分提取物的制备方法：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用80％乙醇提取3次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.15，再加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，将洗涤后的沉淀物加水溶解后上PVDF/PS中空纤维超滤膜进行超滤，截留分子量3kDa以上的成分，收集所得截留液，浓缩至干，即得。
本发明实施例2：一种多糖类成分提取物的制备方法：取黄芪、女贞子粗粉用50％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.08，再加入95％乙醇使含醇量达70％，静置12小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，将洗涤后的沉淀物加水溶解后上PVDF/PS卷式超滤膜进行超滤，截留分子量3kDa以上的成分，收集所得截留液，浓缩至干，即得。
本发明实施例3：一种多糖类成分提取物的制备方法：取黄芪、女贞子粗粉，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.12，再加入95％乙醇使含醇量达75％，静置24小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，将洗涤后的沉淀物加水溶解，上处理过的MG-1型大孔吸附树脂，依次用水、10％～70％的乙醇溶液梯度洗脱，至在洗脱液中加入95％乙醇无沉淀为止，收集洗脱液，浓缩至干，即得。
本发明实施例4：一种多糖类成分提取物的制备方法：取黄芪、女贞子粗粉用90％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.10，再加入95％乙醇使含醇量达80％，静置18小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，将洗涤后的沉淀物加水溶解，上处理过的D101型大孔吸附树脂，依次用水、10％～70％的乙醇溶液梯度洗脱，至在洗脱液中加入95％乙醇无沉淀为止，收集洗脱液，浓缩至干，即得。
本发明实施例5：一种黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用80％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的AB-8大孔树脂柱，用3BV水洗涤，再用4BV的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
本发明实施例6：一种黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达70％，静置12小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用50％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的D-101大孔树脂柱，用4BV水洗涤，再用6BV的60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
本发明实施例7：一种黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达80％，静置24小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用90％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.15的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的DM-301大孔树脂柱，用5BV水洗涤，再用8BV的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
本发明实施例8：一种黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加80％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的AB-8大孔树脂柱，用3BV水洗涤，再用4BV的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
本发明实施例9：一种黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加50％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达70％，静置12小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的S-8大孔树脂柱，用4BV水洗涤，再用6BV的60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
本发明实施例10：一种黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加90％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达80％，静置24小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.15的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的DA-201大孔树脂柱，用5BV水洗涤，再用8BV的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
本发明实施例11：一种萜类成分提取物的制备方法：取黄芪、女贞子粗粉，加80％乙醇提取3次，每次加6倍量乙醇，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入2倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
本发明实施例12：一种萜类成分提取物的制备方法：取黄芪、女贞子粗粉水提取后的滤渣，加4倍量的50％乙醇提取1次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08的清膏，搅拌下加入1.5倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
本发明实施例13：一种萜类成分提取物的制备方法：取黄芪、女贞子粗粉水提取后的滤渣，加8倍量90％乙醇提取2次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.15的清膏，搅拌下加入3倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
本发明实施例14：一种黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子按2:1的重量配比混合后，粉碎成粗粉，采用70％～80％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理的AB-8大孔吸附树脂水洗至无色后，用40％～70％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
本发明实施例15：一种黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，采用50％～60％乙醇浸渍提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理的DM301大孔吸附树脂水洗至无色后，用10％～40％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
本发明实施例16：一种黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，采用60％～70％乙醇渗漉提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理的HPD-100大孔吸附树脂水洗至无色后，用70％～95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
本发明实施例17：一种黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物的制备方法：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，采用80％～90％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理的D101大孔吸附树脂水洗至无色后，用70％～95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
本发明实施例18：一种贞芪扶正胶囊，通过以下方法制备而成：取实施例1～4中任一项方法提取的多糖类成分提取物30g，另取采用方法C提取的萜类成分提取物6g、方法B提取的黄酮类成分及皂苷类成分提取物30g；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；在药粉中加入崩解剂、润湿剂、助流剂和吸收剂，制备成贞芪扶正胶囊。
本发明实施例19：一种贞芪扶正滴丸，通过以下方法制备而成：取实施例5～10中任一项方法提取的黄酮类成分及皂苷类成分提取物25g，另取采用方法C提取的萜类成分提取物10g及方法A或D提取的多糖类成分提取物40g；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；将所述的药粉与基质在60～80℃下均匀混合，以10～50滴/分钟的速度滴入0～20℃的冷却剂中，即得贞芪扶正滴丸。
本发明实施例20：一种贞芪扶正糖浆剂，通过以下方法制备而成：取实施例11～13所述方法提取的萜类成分提取物20g，另取采用方法A或D提取的多糖类成分提取物60g、方法B提取的黄酮类成分及皂苷类成分提取物35g；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；取蔗糖，加水，煮沸溶解后，滤过，放冷，在滤液中加入药粉及防腐剂、助溶剂和稳定剂，搅匀，滤过，药液加水，即得贞芪扶正糖浆剂。
本发明实施例21：一种贞芪扶正分散片，通过以下方法制备而成：取实施例14～17中任一项方法提取的黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物19～55g，另取方法A或D提取的多糖类成分提取物30～60g；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；将该药粉按照常规工艺制备成分散片。
本发明实施例22：一种贞芪扶正胶囊，通过以下方法制备而成：取实施例1～4中任一项方法提取的多糖类成分提取物40g，取实施例5～10中任一项方法提取的黄酮类成分及皂苷类成分提取物13g，取实施例11～13所述方法或方法C提取的的萜类成分提取物18g；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；在药粉中加入崩解剂、润湿剂、助流剂和吸收剂，制备成贞芪扶正胶囊。
本发明实施例23：一种贞芪扶正胶囊，通过以下方法制备而成：取实施例1～4中任一项方法提取的多糖类成分提取物40g，取实施例14～17中任一项方法提取的黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物35g；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；在药粉中加入崩解剂、润湿剂、助流剂和吸收剂，制备成贞芪扶正胶囊。
上述实施例18-22中所述的方法A、方法B、方法C、方法D、方法E同下述实验例中的方法A、方法B、方法C、方法D、方法E。
为确保本发明所得制剂产品的药效，申请人对其药效进行了对比实验研究。
1、实验材料
1.1实验药物：
(1)按照本发明实施例18-23分别制得的贞芪扶正制剂。
(2)按现有工艺方法(即发明专利200310122216.7、200510038194.5)提取黄芪和女贞子中的多糖类成分、黄酮类成分、皂苷类成分、萜类成分后制得的贞芪扶正制剂。现有技术提取工艺如下：
①发明专利200310122216.7：
多糖类成分(现有技术方法A)：取黄芪、女贞子药材粉碎，加水煎煮三次，每次加6倍量水，煎煮1.0小时，滤过，合并三次滤液，减压浓缩至相对密度为1.15(20℃)的清膏，加乙醇使含醇量达70％，搅匀，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
黄酮类及皂苷类成分(现有技术方法B)：取黄芪，加水煎煮三次，每次加6倍量水，煎煮1.0小时，滤过，合并三次滤液，减压浓缩至相对密度为1.15(20℃)的清膏，加乙醇使含醇量达70％，搅匀，静置24小时，滤过，所得滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.10(20℃)的清膏，滤过，滤液通过D-101大孔树脂柱，用3倍树脂体积的水洗涤，再用4倍树脂体积的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇后，浓缩，干燥，即得。
萜类成分(现有技术方法C)：取女贞子药材粉碎，加80％乙醇回流提取三次，每次加6倍量乙醇，回流提取1小时，滤过，合并三次滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.10(20℃)的清膏，搅拌下加入2倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
②发明专利200510038194.5：
多糖类成分(现有技术方法D)：将黄芪、女贞子加6～15倍量水煎煮3次，合并提取液，滤过，减压浓缩成每1mL相当于1.5g生药的药液，加乙醇至含醇量达60％～80％，静置24h，滤过，沉淀减压低温干燥，加适量蒸馏水溶解，再加乙醇至含醇量达60％～90％，静置24h，滤过，沉淀加蒸馏水溶解成1％的溶液，过中空纤维柱超滤，其截留分子量大于6000，超滤液减压浓缩至干，即得；
皂苷类成分(现有技术方法E)：将黄芪、女贞子水提醇沉后的上清液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水使沉淀溶解，滤过，用乙酸乙酯、正丁醇或异戊醇萃取三次，合并萃取液，用1％的氢氧化钠水溶液洗涤二次，弃去碱水液，减压回收有机溶剂并浓缩至干，即得。
1.2实验动物：昆明种小鼠，♀各半，体重20±0.7g，由贵阳医学院实验动物中心提供；实验室光照充足，通气良好，室温18～22℃，湿度50％～70％，按常规定期消毒；自由饮水、饮食，小鼠饲养笼分笼饲养，动物实验前观察适应5天，复查合格后开始进入正式实验。
2、实验方法
2.1抗疲劳作用
对成年小鼠耐常压缺氧作用的影响：取小鼠310只，雌雄各半，随机分成31组(本发明制剂组28个，现有贞芪扶正制剂组2个，生理盐水对照组1个)，每组10只，连续给药15天，末次给药30分钟后小鼠分别单个放入250mL的广口瓶中，内加适量钠石灰并加盖，用凡士林密封瓶口，观察动物死亡时间，统计分析采用q检验。
结果：试验表明，采用本发明工艺方法提取的有效成分制得的贞芪扶正制剂可使成年小鼠耐缺氧的时间明显延长(P<0.01)，结果见表16。
表16贞芪扶正制剂对成年小鼠耐常压缺氧作用的影响
注：与对照组比较，*P<0.01。
2.2抗炎免疫作用
对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)吞噬鸡红细胞(CRBC)能力的影响：取成年鼠320只，随机分为32组(本发明制剂组28个，现有贞芪扶正制剂组2个，NS组、LMS组各1个)，每组10只，雌雄各半，分别灌胃本发明制得的贞芪扶正制剂、现有贞芪扶正制剂、LMS及等容量NS，共7天。停药后2小时，给每只小鼠腹腔注射5％(V/V)CRBC0.4mL，12小时后将小白鼠脱臼处死，仰位固定于鼠板。剪开腹部皮肤，经腹腔注入NS2mL；转动鼠板1分钟，然后吸取腹腔洗液1mL，滴于载玻片上；每片0.2mL置于37℃孵暖箱内保育30分钟，干后用4％姬姆萨-瑞特氏液染色5小时，油镜下每片计数100个MΦ，按下式计算胸腺指数和脾脏指数，实验结果见表17。
吞噬率＝(吞噬CRBC的MΦ/100个MΦ)×100％
吞噬指数＝被吞噬的CRBC/100个MΦ
表17贞芪扶正制剂对小鼠腹腔MΦ吞噬功能的影响
实验表明，采用本发明工艺方法提取的有效成分制得的贞芪扶正制剂和现有贞芪扶正制剂均可明显的增加小鼠腹腔MΦ吞噬CRBC的吞噬功能，与免疫增强剂LMS的作用近似，并且本发明制得的贞芪扶正制剂比现有贞芪扶正制剂更能增强小鼠腹腔MΦ吞噬CRBC的吞噬功能。
综上所述，采用本发明工艺方法提取的有效成分制备的贞芪扶正制剂对小鼠的抗疲劳以及免疫功能均有明显调节作用，并且效果优于现有贞芪扶正制剂。
Claims (13)
1.一种贞芪扶正药物组合物，其特征在于：按重量份计算，它由黄芪和女贞子药材中的多糖类成分提取物30～60份、黄酮类及皂苷类成分提取物13～35份和萜类成分提取物6～20份制成。
2.根据权利要求1所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于，所述多糖类成分提取物的制备方法为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉用50％～90％乙醇提取2～4次之后的药渣，加水提取，过滤，滤液浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15，再加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，沉淀物用95％乙醇进行洗涤，取沉淀物即得。
3.根据权利要求2所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于：将洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，截留分子量3kDa以上的成分，收集所得截留液，浓缩至干。
4.根据权利要求2所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于：将洗涤后的沉淀物加水溶解，上处理过的大孔吸附树脂，依次用水、10％～70％的乙醇溶液梯度洗脱，至在洗脱液中加入95％乙醇无沉淀为止，收集洗脱液，浓缩至干。
5.根据权利要求4所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于：所述大孔吸附树脂为MG-1型大孔树脂。
6.根据权利要求1所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于，所述黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用50％～90％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的大孔树脂柱，用3～5BV水洗涤，再用4～8BV的60％以上乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
7.根据权利要求6所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于：所述黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加水提取，过滤，滤渣备用；滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，滤液备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；备用的滤渣用80％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液与备用的滤液、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的AB-8大孔树脂柱，用3BV水洗涤，再用4BV的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
8.根据权利要求1所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于，所述黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加50％～90％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达70％～80％，静置12～24小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的大孔树脂柱，用3～5BV水洗涤，再用4～8BV的60％以上乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
9.根据权利要求8所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于：所述黄酮类和皂苷类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，加80％乙醇提取2～4次，合并提取液，过滤，滤渣备用；滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，滤液1备用；备用的滤渣加水提取，过滤，滤液浓缩后加入95％乙醇使含醇量达75％，静置18小时，过滤，滤液2备用；沉淀物用95％乙醇进行洗涤，洗液备用；洗涤后的沉淀物加水溶解后进行超滤，留取分子量小于3kDa的超滤液；将备用的滤液1和滤液2、洗液及分子量小于3kDa的超滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，过滤，将滤液通过预处理过的AB-8大孔树脂柱，用3BV水洗涤，再用4BV的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，即得。
10.根据权利要求1所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于，所述萜类成分提取物的制备方法为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉水提取后的滤渣，加50％～90％乙醇提取2～4次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.08～1.15的清膏，搅拌下加入水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
11.根据权利要求10所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于，所述萜类成分提取物的制备方法为：取黄芪、女贞子粗粉或黄芪、女贞子粗粉水提取后的滤渣，加80％乙醇提取三次，每次加6倍量乙醇，提取1小时，滤过，合并三次滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至20℃相对密度为1.10的清膏，搅拌下加入2倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
12.根据权利要求1所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于，所述黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子粉碎成粗粉，采用50％～90％乙醇提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理过的D101、HPD-100、DM301或AB-8大孔吸附树脂水洗至无色后，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
13.根据权利要求12所述的贞芪扶正药物组合物，其特征在于，所述黄酮类、皂苷类及萜类成分提取物的制备方法为：将黄芪、女贞子按2:1的重量配比混合后，粉碎成粗粉，采用80％乙醇提取，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，过滤，将滤液上预处理过的AB-8大孔吸附树脂水洗至无色后，用40％～95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后即得。
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