CN104073563A - 一种用于检测alk融合基因的荧光定量pcr方法及检测试剂盒 - Google Patents
一种用于检测alk融合基因的荧光定量pcr方法及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种采用荧光定量PCR检测基因突变的方法，特别涉及一种不限融合类型的ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。本发明的方法包括：设计激酶区和非激酶区的特异性引物和探针；设计荧光定量PCR反应体系，利用特异性引物扩增样品中的基因靶序列；利用探针和扩增产物的杂交，检测反应体系中FAM和HEX荧光信号强度作为结果的判断标准。使用本发明提供的试剂盒可检测不限融合类型的ALK融合基因突变，特异性强，灵敏度高，可检出低至10个拷贝的突变，检测速度快，只需90分钟即可完成检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种采用荧光定量PCR检测融合基因的方法，特别涉及一种用于检测间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic Lymphoma Kinase，ALK)融合基因的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，可在突变含量只有0.1％的临床样本中检测出低至10个拷贝的融合基因突变分子。
背景技术
肺癌是世界范围内发病率和死亡率均最高的恶性肿瘤。分子靶向药物作为治疗肺癌的新的有效手段，在临床得到越来越广泛的应用。特异性抑制间变性淋巴瘤激酶(ALK)的靶向药物克唑替尼(crizotinib)对由于ALK基因融合而导致ALK激酶活性过高的非小细胞肺癌病人具有很好的疗效，已于2011年获美国食品与药品监管局(FDA)批准上市。此外，数个类似的针对ALK的靶向药物亦已进入临床研究。克唑替尼等靶向药物的使用前提是病人的肿瘤细胞必须高表达ALK激酶；而ALK基因融合是导致ALK激酶高表达的最主要原因。因此，准确地检测肿瘤组织中ALK基因融合对临床筛选出可受益于克唑替尼等靶向药物的肺癌患者具有指导作用。目前临床主要开展的ALK基因融合的方法包括荧光原位杂交和免疫组织化学方法。这两种方法存在操作复杂、主观性强、耗时长、费用高等缺点，因而难以在临床普遍使用。临床上迫切需要一种简便、快速、准确、经济的ALK基因融合检测方法，用以指导肺癌的个性化治疗。
ALK基因与其他基因发生融合突变可导致ALK激酶片段大量表达并自发性激活[1]。其中，EML4-ALK融合基因为迄今所发现的在非小细胞肺癌中发生率最高的ALK融合类型。EML4-ALK基因融合是由于人类第二号染色体短臂发生倒置(inversion)，导致棘皮动物微管相关蛋白样4基因(EML4)与ALK非正常连接所致[2]。此外，研究还发现ALK可与KIF5B、NPM等基因发生融合[4，5]。这些融合基因的蛋白质产物由于融合伴侣(如EML4，NPM等)的特性而形成二聚体，进而引发ALK激酶片段的不依赖于配体的自发性激活。活化的ALK激酶通过激活下游的细胞生长调控相关信号通路如P13K/AKT和MAPK等，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡，从而引起细胞的瘤变[2]。动物实验已经证实EML4-ALK基因融合突变可导致小鼠肺癌的发生[3]。
准确、方便地检测肺癌细胞中的ALK融合情况是明确筛选适合于克唑替尼等靶向药物治疗的病人的基础。但是，目前对于ALK融合基因的检测方法尚缺乏一个明确的标准。荧光原位杂交方法(fluorescent in situhybridization，FISH)是基础和临床研究中检测基因融合的常用方法。FISH的原理是基于两种不同荧光标记的探针(绿色和红色)分别结合在ALK基因5’端两个相邻的区域，在正常细胞中这两种荧光紧密相连；当ALK基因发生断裂时，这两种荧光产生分离[6]。FISH方法具有直观的优点，但存在荧光探针不稳定、技术要求高、操作复杂、耗时长、费用高等缺点。临床上使用的另外一种检测方法是免疫组织化学方法。免疫组化方法检测的是ALK蛋白质分子的表达水平。其最大的优点是能在检测ALK的蛋白表达水平的同时，观察肿瘤组织的细胞形态和病理特征[7]。但是，由于ALK在肺癌细胞中的表达水平往往较低，免疫组化方法会造成假阴性结果；此外，免疫组化往往难以对ALK的水平进行准确的定量，结果判读较主观，而且耗时较长、抗体不稳定[7]。
最近，Soda等用多重RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组织的EML4-ALK和KIF5B-ALK基因融合，发现该方法与FISH和改良免疫组化方法具有相同的灵敏度和特异性，但却更为方便[4]。RT-PCR方法是先将RNA逆转录成cDNA，再利用分别来自融合基因两个部分的特定DNA序列作为引物对cDNA进行扩增，然后对PCR产物进行测序。但是，该技术存在明显的缺陷：(1)只能检测出已知的突变，不能用于检测新的融合突变，因此会导致假阴性；(2)同时检测多种融合类型需要标本量人，技术复杂；(3)扩增后的后续测序步骤易发生扩增物的扩散而污染操作环境，导致假阳性。
由于针对ALK激酶的靶向药物如克唑替尼等所作用的是因过度表达而导致过高活性的ALK激酶，而不是基因的融合形式，本发明采用一种全新的设计，着眼于对ALK激酶的表达水平变化的检测，而不受限于ALK融合突变的形式和种类。该方法将有效地检测因融合所导致的ALK基因的表达水平的增高，将避免FISH、免疫组化或RT-PCR方法的缺点。
发明内容
为了提高临床检验能力，现提供一种不受限于融合基因类型而可直接检测ALK融合状态及表达水平 变化的分析方法，该方法可以在90分钟检测出ALK基因的突变情况。
本发明的技术方案包含以下步骤：
1.人类ALK基因(NM_004304)位于第二号染色体短臂的反链上，包含29个外显子(30，144，432-29，415，640)；第20号至29号外显子包含蛋白激酶区域。第20号外显子为最常发生的断裂区域。本发明将针对对临床具有最根本意义的蛋白激酶区域，在第20号-29号外显子上选择数个特定序列，设计用于实时荧光PCR系统的特异性引物和荧光标记分子探针，检测ALK基因的总体表达水平(非融合表达+融合表达，T)。同时，在第1号-19号外显子上选择数个特定序列，设计用于实时荧光PCR系统的特异性引物和荧光标记分子探针，检测ALK基因的基本表达水平(非融合表达，B)。如果T值与B值的比例(T/B ratio)等于或大于2，则表明ALK基因存在因融合突变导致的激酶区域过表达；如果T值与B值的比例(T/B ratio)小于2，则表明ALK基因不存在因融合突变导致的激酶区域过表达。
2.建立荧光定量PCR扩增突变基因序列的反应体系，利用特异性引物通过PCR反应大量扩增目的基因序列。本发明提供一种用于检测ALK基因突变的试剂盒，所建立的荧光定量PCR反应体系为：
反应体系总体积为25μL，用去离子水补足体积后，漩涡震荡、短暂离心混匀。
上述荧光定量PCR反应条件是95℃预变性10min后进入以下循环：95℃15sec，61℃1min，进行45个循环。荧光信号收集温度设定在61℃退火温度处。
3.利用特异性探针和扩增产物进行杂交，检测反应体系中FAM和HEX荧光信号的强度。以HEX信号代表非激酶区的扩增情况；以FAM信号代表激酶区的扩增情况。
4.另利用本发明提供的含ALK基因(非融合表达B，融合表达T)特异性序列的两种质粒标准品作为扩增模板，用于制作表达量与Ct阈值之间的标准曲线(检测下限为10个拷贝数)。
本发明所述特异性引物和特异性探针见表1。
所述的一种检测ALK基因融合突变的荧光定量PCR方法不包括样品DNA提取步骡，但对于从甲醛固定石蜡包埋的样品获得的DNA片段依然具有与从新鲜组织样品中提取的DNA同样的扩增和检测能力。
与现有的检测方法相比，本发明具有以下优势：
(1)建立了荧光定量PCR的方法，可不受限于融合类型而直接检测ALK融合状态及表达水平变化；
(2)灵敏度高，能检出5～10拷贝的突变；
(3)特异性强，10～100ng的野生型DNA不会产生非特异性干扰信号；
(4)选择性强，可在99～99.9％的野生型DNA背景下检测出0.1％～1.0％的突变型；
(5)检测操作简便，在封闭的体系中进行DNA扩增和实时荧光检测，检测速度快，仅需90分钟即可完成检测。
表1：特异性引物和探针
附图说明
图1：本发明试剂盒检测ALK基因激酶区的扩增曲线图
图2：本发明试剂盒检测ALK基因非激酶区的扩增曲线图
图3：本发明试剂盒制作ALK基因表达量与Ct阈值之间的标准曲线
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。
实施例：ALK融合基因表达量检测
收集400例不同临床分期的非小细胞肺癌样本(包括肿瘤FFPE组织、肿瘤新鲜组织、痰液、胸腔积液和外周血等)。使用宁波有成生物医药科技有限公司的细胞组织RNA提取试剂盒以及石蜡包埋组织(FFPE)总RNA提取试剂盒提取样本总RNA。提取的RNA溶解于DEPC处理水中，-80℃冰箱保存。
设计能特异性检测ALK基因基本表达水平(非融合表达，B)及总体表达水平(非融合表达+融合表达，T)的引物和荧光探针，其中基本表达水平(B)区域荧光探针使用HEX信号，总体表达水平(T)区域荧光探针使用FAM信号。序列如下：
ALK非激酶区引物序列：
上游引物Foward Primer(A_SEQ_7)：aaaccacttcatccaccgag
下游引物Reserve Primer(A_SEQ_8)：tgccagaaactgcctcttgacct
探针Probe Primer(A_SEQ_9)：HEX-gcacagcctccctttctatag-BHQ1
ALK激酶区引物序列：
上游引物Foward Primer(A_SEQ_19)：acctacagcatctcgggcta
下游引物Reserve Primer(A_SEQ_20)：gaagatgcccagcacagaca
探针Probe Primer(A_SEQ_21)：FAM-tcatggtgttcttcccgcctttcc-BHQ1
利用Takara公司的逆转录试剂盒将上述提取的RNA逆转录成为cDNA，调节终浓度为50ng/uL作为PCR扩增模板。
另利用本发明提供的含ALK基因(非融合表达B，融合表达T)特异性序列的两种质粒标准品作为扩增模板，用于制作表达量与Ct阈值之间的标准曲线(检测下限为10个拷贝数)。
荧光PCR扩增反应体系总体积为25μL，各成分为：
上述荧光定量PCR反应条件是95℃预变性10min后进入以下循环：95℃15sec，61℃1min，进行45个循环。荧光信号收集温度设定在61℃退火温度处。
采用Roche480II实时荧光定量PCR扩增仪进行检测。检测反应体系中FAM和HEX荧光信号的强度。根据质粒标准品的Ct阈值与已知质粒拷贝数制作标准曲线。再将未知检测样本的基本表达水平(非融合表达，B)及总体表达水平(非融合表达+融合表达，T)所得的Ct阈值代入上述对应的标准曲线中，换算出对应的拷贝数。
如果T值与B值的比例(T/B ratio)等于或大于2，则表明ALK基因存在因融合突变导致的激酶区域过表达；如果T值与B值的比例(T/B ratio)小于2，则表明ALK基因不存在因融合突变导致的激酶区域过表达。
在本实施例中，400例不同临床分期的非小细胞肺癌样本里，ALK基因发生融合突变的样本总共为56例。
参考文献：
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Claims (9)
1.一种检测ALK基因融合突变的方法，该方法的特征在于：不受限于融合基因类型而可直接检测ALK融合状态及表达水平。
2.如权利要求1所述，人类ALK基因(NM_004304)第20号至29号外显子包含蛋白激酶区域，本发明针对对临床具有最根本意义的蛋白激酶区域，在第20号-29号外显子上选择数个特定序列，设计用于实时荧光PCR系统的特异性引物和荧光标记分子探针，检测ALK基因的总体表达水平(非融合表达+融合表达，T)；同时，在第1号-19号外显子上选择数个特定序列，设计用于实时荧光PCR系统的特异性引物和荧光标记分子探针，检测ALK基因的基本表达水平(非融合表达，B)；如果T值与B值的比例(T/B ratio)等于或大于2，则表明ALK基因存在因融合突变导致的激酶区域过表达；如果T值与B值的比例(T/B ratio)小于2，则表明ALK基因不存在因融合突变导致的激酶区域过表达。
3.如权利要求1所述，在激酶区以第20号至29号外显子为模板设计的引物和探针，特别是以20～26号外显子为模板设计的引物和探针，其中最适宜的模板区域为20～23号外显子；在非激酶区以第1号至19号外显子为模板设计的引物和探针，特别是以11～19号外显子为模板设计的引物和探针，其中最适宜的模板区域为11～14号外显子。
4.用于检测ALK基因融合突变的特异性引物和探针，包括8组24条引物和探针，见本发明说明书表1(A-SEQ-1～A-SEQ-24)。
5.一种检测ALK基因融合突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1、2所述的方法和权利要求4所述的8组24条引物和探针。
6.如权利要求4所述的检测ALK基因融合的检测试剂盒，包括以下荧光定量PCR反应体系：
7.如权利要求4所述的检测ALK基因融合突变的检测试剂盒，荧光定量PCR反应条件为：
95℃预变性10min后进入以下循环：95℃15sec，61℃1min，进行45个循环，荧光信号收集温度设定在61℃退火温度处。
8.如权利要求4所述的检测ALK基因融合突变的检测试剂盒，待检测样品包括新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织、石蜡切片和血液。
9.一种用于检测ALK基因融合突变的引物和探针，其特征在于，由A-SEQ-1～A-SEQ-24的寡核苷酸引物和探针或序列与其有至少70％同一性的寡核苷酸组成。
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