CN104066831A

CN104066831A - 液体回流型高速基因放大装置

Info

Publication number: CN104066831A
Application number: CN201280067750.XA
Authority: CN
Inventors: 安田贤二; 寺薗英之; 服部明弘
Original assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology; Tokyo Medical and Dental University NUC; On Chip Cellomics Consortium
Current assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology; Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2014-09-24
Also published as: CA2857146A1; JP5912034B2; US20140370492A1; EP2787067A1; JP2013110999A; WO2013080939A1; EP2787067A4

Abstract

本发明提供一种液体回流型反应控制装置，包括：可实现更稳定的温度控制的附加机构；包含导入可进行RNA检出的PCR反应前的反转录反应程序的预处理机构；熔解曲线分析功能；对液滴保持及光学测量最佳的芯片技术与PCR反应的光学式测量功能；及依据量化的红外光照射吸收控制手法的温度梯度控制机构。

Description

液体回流型高速基因放大装置

技术领域

本发明涉及一种基因分析装置，其使用了在基础生命科学、医学基础研究、以及医疗现场，适于迅速进行微量基因分析的研究或临床试验的反应容器；且涉及一种基因分析，其用于从例如以人类为首的动物或植物的基因体DNA、传讯RNA等核碱基序列，高速检出特定碱基序列的反应装置。

背景技术

聚合酶链锁反应(Polymerase chain reaction，以下简称为PCR。)是从各种种类的核酸混合物，放大特定碱基序列的方法。通过至少重复一次如下步骤，可使特定核酸序列放大：于混合物中，加入从基因体DNA或传讯RNA经反转录得到的互补性DNA等DNA模板、两种以上的引物与热稳定性酶、镁等的盐类、及4种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，使核酸分离的步骤；使所述引物结合的步骤；及将引物已通过热稳定性酶而结合的核酸作为铸模，使其杂交的步骤。通过使用于DNA放大反应的反应容器升温、降温，以进行热循环。可举出各种温度变化用机构，包括如下：使用加热器或帕耳帖(Peltier)组件、温风的热交换，使包含样本的反应容器的温度变化的机构；通过使反应容器交替接触温度不同的加热器组块或液体总线，以使温度变化的机构；及于具有不同温度区的流路中，流入样本而改变温度的方法。作为现有的市售装置中速度最快的装置，例如Roche公司的侦测系统实时荧光定量仪(Light Cycler)所具有的机构，系于复数个玻璃毛细管的每一个中，导入试料、DNA聚合酶、作为引物的DNA及测量用荧光标记色素，通过吹以例如55℃与95℃两种温度等，温度与欲令其变化的液滴温度相同的温风，使该毛细管内的微量液滴的温度变化，同时对该玻璃毛细管照射荧光色度的激发光，测量所获得的荧光强度。通过该等方法，可重复使样本的温度变化。

另外，通过使流体喷射往试料含有区的外壁冲突，来控制试料温度的流体冲突热循环器装置(日本特表2001-519224(专利文献1))。因此，本发明的发明人为了进行比以往更高速的PCR，开发了照射对水异常具有吸收的红外线，高速转换微小水滴的温度的技术，以及利用循环水，通过与循环水的热交换，可超高速进行温度循环的超高速PCR装置(日本特开2008-278791、日本特开2009-118798、WO2010/113990、WO2011/105507(专利文献2～5))。

先行技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2001-519224

专利文献2：日本特开2008-278791

专利文献3：日本特开2009-118798

专利文献4：WO2010/113990

专利文献5：WO2011/105507

发明内容

本发明所欲解决的问题

如所述，若采用现有技术，在伴随有急遽的温度变化而重复复数种温度之间的循环时，难以达成如下事项：1)严密的温度控制；2)稳定的温度维持；及3)往目标温度移动时，不发生过冲。例如采用加热器或帕耳帖组件时，温度变化速度若甚缓慢，每秒为数℃程度，或由于发热与热传导的关系，在达到目标温度的过程中，为了高速成为目标温度，若无过冲则难以使温度变化。又，基本上若利用固体中的热传导，则于热源与表面之间形成热梯度，不能进行严密的控制。又，在样本触及加热器或帕耳帖组件的瞬间，热量流失，至表面温度回复到预定温度为止发生了延迟。又，使反应槽接触不同的加热器或液体总线时，移动用机构甚为复杂，难以控制加热器或液体总线的温度。进而言之，于具有不同温度区的流路中，流入样本的方法，具有流路本身的表面温度会随着样本的移动而变化，难以控制温度的问题。又，吹以温风来进行温度变化时，由于空气的热容量少，须吹以大量空气，而且同样由于空气的热容量少，因此不易采用电热线等，以1℃为单位，严密控制所吹空气的最终吹出温度。

本发明的发明人自行开发了一种反应控制装置，其系为了连续供给一定的热量，利用恒定的红外光照射或高速回流的温水，可对目标物始终供给能量，可进行正确的温度控制、温度测定及迅速的升温、降温。进而通过于该装置组合荧光检出系统，开发了一种高速PCR检出装置，其系使用随着PCR反应所造成的DNA放大，荧光强度会增加的荧光色素，安装有实时检出该放大反应的荧光检出方法(专利文献2～5)。

于本发明，本发明的发明人进一步改善以往的发明，目的在于提供一种可进行更正确的温度控制、温度测定与迅速的升温、降温的液体回流型反应控制装置。

解决问题的技术手段

有鉴于所述问题，本发明提供一种液体回流型反应控制装置，包括：[1]可实现更稳定的温度控制的附加机构；[2]包含导入可进行RNA检出的PCR反应前的反转录反应程序的预处理机构；[3]熔解曲线分析功能；[4]对液滴保持及光学测量最佳的芯片技术与PCR反应的光学式测量功能；及[5]依据量化的红外光照射吸收控制手法的温度梯度控制机构。

与所述[1](可实现更稳定的温度控制的附加机构)相关连，本发明的反应控制装置的特征在于：在使样本液的温度变化时，针对预定的复数种温度，除了对热交换的介质，使用维持着各温度的热容量大的液体以外，还使用如下机构或手段：将该热容量大的复数种不同温度的液体，保持在一定温度的机构(参考例如图1、13及21所示的热源5、搅拌机构6、泵7、切换阀8、旁通流路9、辅助温度控制机构10、温度传感器16、辅助液体放热机构17等)；一面连续使该热容量大的复数种不同温度的液体循环，一面高速置换的手段(参考例如图1、13及21所示的泵7、切换阀8、旁通流路9、辅助温度控制机构10)、该热容量大的液体与样本液的热交换迅速进行的微小反应槽(参考例如图2、5、8～12、14、15、20所示的热交换槽3及微小反应槽5)；防止微小反应槽中的反应液蒸发的手段(参考例如图1、13、14、15、21所示的反应槽套体2、图15所示的反应槽芯片的构造、图18所示的柱体1301、封入封材1302)。更具体而言由如下构造或机构所构成：由适于热交换的构造及材质所构成的微小反应槽1；用于防止微小反应槽1的反应液蒸发的构造(参考例如图1、13、14、15、21所示的反应槽套体2、图15所示的反应槽的构造、图18所示的封入封材1302、柱体1301)；使适于各反应的温度的液体，循环于微小反应槽外部的热交换槽(参考例如图2、5、8～12、14、15、20)；设置有以高精度维持液体温度的机构(参考例如热源5、搅拌机构6、温度传感器16、辅助液体放热机构17)的复数个液体储存槽4；为了使微小反应槽1的温度迅速变化，用于从任意的液体储存槽4往热交换槽3导引液体的切换阀系统；及于所述阀系统切换时，不同温度的液体的混合防止机构(参考例如图2、5、8～12所示的热交换槽)。

亦即，本发明提供以下的液体回流型反应控制装置。

(1)一种液体回流型反应控制装置，包括：反应槽，所述反应槽包含用于装入样本液的1个或复数个孔(well)；

反应槽套体，为了防止设置于所述孔的样本液滴蒸发而密闭覆盖所述反应槽，且为了防止冷凝而设置有保温构件；热交换槽，为使热传导至所述反应槽而与所述反应槽相接设置，设置有分别用于导入及排出预定温度的液体的进口及出口；

复数个液体储存槽，所述复数个液体储存槽包含：用于将液体分别保持在预定温度且温度可控制的热源；搅拌液体，以使所述储存槽内的温度成为一定温度的液体搅拌机构；及用于获得该储存槽的液体温度控制用的回授信息的温度传感器；

细管，为了将所述复数个液体储存槽间的液面高度调整为大致相同，所述细管将所述各复数个液体储存槽相互予以流体连接；

管状流路，所述管状流路连接所述热交换槽的所述进口及所述出口与所述液体储存槽之间；

泵，所述泵设置于所述管状流路上，可使所述液体以每秒10mL以上循环于所述热交换槽与所述液体储存槽之间；

切换阀，设置于所述管状流路上，用于控制所述循环的所述液体的流向，且通过以预定的时间间隔，切换预定温度的所述液体从所述复数个液体储存槽，往所述热交换槽的流入，来将所述反应槽的温度控制在所需温度；

辅助温度控制机构，所述辅助温度控制机构设置于所述热交换槽与所述液体储存槽之间的所述管状流路上，具有可暂时保持回流的所述液体的预定容积，将所述回流的液体的温度调整到与所述液体储存槽相同的温度后，使其回流至所述液体储存槽，以便将所述液体储存槽的温度变化抑制在最小限度；

荧光检出部，在使所述样本液中含有荧光色素的情况下，所述荧光检出部用于与通过所述切换阀所进行的所述反应槽的温度切换相连动，检出所述孔内的所述荧光色素所发出的荧光，测定荧光强度的时间变化；及

控制分析部，可从所述荧光强度估计所述样本液的温度，根据其结果来控制所述切换阀的动作；

所述样本的用量系每一孔为数十微升以下，循环的所述液体的总容积为每一液体储存槽为数十毫升以上。

(2)如所述(1)所记载的液体回流型反应控制装置，其作为PCR装置使用。

(3)如所述(1)所记载的液体回流型反应控制装置，其中进一步包括冷却机构，所述冷却机构用于使得所述液体储存槽内的液体温度下降而进行控制。

(4)如所述(1)～(3)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述荧光检出部与所述反应槽的所述孔一一对应而设置。

(5)如所述(1)～(4)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽套体系通过所述保温构件保温，以使得该反应槽套体内部的温度保持在75℃以上。

(6)如所述(1)～(5)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述液体储存槽的数目与所述反应槽的设定温度数相同。

(7)如所述(6)所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述液体储存槽的数目为2温度PCR反应用的2、反转录反应用与2温度PCR或3温度PCR反应用的3、或反转录反应用与3温度PCR反应用的4。

(8)如所述(1)～(7)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽的底面及壁面系由厚度1微米至100微米、包含铝、镍、镁、钛、铂、金、银、铜的金属，或硅所形成。

(9)如所述(1)～(8)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述孔的底面形状为平底状、半球状、三角锥状、或球状。

(10)如所述(1)～(9)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中于所述各孔，反应所需试药以干燥状态预先内包，所述试药通过与样本溶液接触溶出而进行反应。

(11)如所述(1)～(10)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽套体进一步包含孔洞或光学窗，容易测定来自该反应槽内的所述样本的光学讯号；该光学窗包含光学上透明的发热体。

(12)如所述(1)～(11)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽及所述反应槽套体设置为可对于所述热交换槽拆装。

(13)如所述(12)所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽及所述反应槽套体对所述热交换槽的拆装方式为如下任一方式：

(a)于所述反应槽的外周设置筒状套体，于所述热交换槽设置筒状反应槽承口，于所述反应槽的所述套体的外表面、及所述热交换槽的反应槽承口的内表面设置螺纹槽，通过沿着所述螺纹槽的旋转运动，可于所述热交换槽，将所述反应槽可拆装地安装的方式；

(b)将所述反应槽外周的所述筒状套体及所述热交换槽的所述筒状的反应槽承口分别制成锥形状，对于所述反应槽承口，使所述反应槽可拆装地压入固定的方式；

(c)所述反应槽具有芯片状的形态，将该反应槽芯片固定于载玻片状的反应槽套体内，于所述热交换槽的反应槽承口设置导轨，沿着所述导轨可拆装地安装所述载玻片状的反应槽的方式；及

(d)将所述载玻片状的反应槽套体，插入于具有铰链的玻片承座，通过所述铰链机构的旋转动作，将所述载玻片状的所述反应槽套体，对于所述热交换槽的所述反应槽承口可拆装地安装的方式。

(14)如所述(12)或(13)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其进一步为了一面处于所述液体正在回流的状态，一面使得所述液体不会漏至所述液体回流型反应控制装置的外部且可将所述反应槽从所述热交换槽拆装，所述热交换槽设置有空气导入口及液体排出口，用于于所述反应槽及所述反应槽套体的拆装时，排出所述热交换槽的液体。

(15)如所述(1)～(14)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述液体储存槽的所述热源系为了有效利用热对流而配置于所述液体储存槽的底面，该液体搅拌机构系通过连续或以10％以上的负载循环搅拌该液体储存槽的液体，可将该液体储存槽内的所述液体的温度分布抑制在5℃以内。

(16)如所述(1)～(15)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中通过所述切换阀，可将所述复数个液体储存槽中任意液体储存槽的液体，导引至所述热交换槽，并可使所述热交换槽中的所述液体回到原本的液体储存槽。

(17)如所述(15)或(16)所记载的液体回流型反应控制装置，其中通过所述切换阀的控制来置换所述热交换槽的所述液体时，控制所述切换阀使得所述热交换槽内部的所述液体，会被导引至所保持的温度与其温度最接近的液体储存槽。

(18)如所述(1)～(17)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述辅助温度控制机构包含隔热材、加热器、及冷却机构，使得从所述热交换槽返回的液体的温度，与回流去处的所述液体储存槽内的液体的温度成为相同温度，抑制结合所述切换阀与所述液体储存槽的所述流路内部的所述液体的温度变动。

(19)如所述(1)～(18)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中进一步包含旁通流路，结合所述切换阀与所述液体储存槽的所述流路内部的所述液体不因所述阀的切换而被导引至所述热交换槽，且通过所述旁通流路而往所述液体储存槽回流，以连续置换来自所述液体储存槽的液体，由此抑制回流于所述流路内的液体的温度变动。

(20)如所述(1)～(19)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述切换阀系由滑动于剖面呈圆形或多角形的中空构造中的活塞所构成，通过所述活塞的位置来控制与所述反应槽相接的液体的温度。

(21)如所述(20)所记载的液体回流型反应控制装置，其中于所述切换阀中，所述活塞通过(a)、(b)、(c)而滑动：

(a)对于连接于该活塞的活塞杆，机械性地加施外力；

(b)使用本身为磁体的活塞或磁体安装于内部的活塞，通过所述活塞与包含设置于所述切换阀外部的电磁线圈的磁场产生机构的相互作用；及

(c)于活塞两端，通过所述循环的液体的流向产生压力差。

(22)如所述(1)～(19)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中于所述切换阀中，

旋转体能够可旋转地插入于所述热交换槽，而所述旋转体系圆柱状、圆盘状、圆锥状的旋转体，复数个沟槽作为从所述液体储存槽送来的液体的流路而形成于外表面，进而形成有可进行流体联络并连接于所述各沟槽的通道状流路；

所述通道状流路的端部分别作为所述切换阀的进口或出口而发挥功能；

通过所述旋转体旋转，当导入于所述进口的温度不同的液体流于所述沟槽部分时，会与反应槽外部接触。

(23)如所述(1)～(22)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述循环的液体系使用热容量大且黏性低的液体。

(24)如所述(1)～(23)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述循环的液体系使用沸点高于水沸点的液体。

(25)如所述(1)～(24)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述循环的液体系使用凝固点低于水凝固点的液体。

(26)如所述(1)～(25)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中使用注射泵将所述循环的液体予以送液。

(27)一种使用如所述(1)～(26)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置进行PCR的方法，包含：

使用嵌入剂型荧光色素；

通过所述荧光检出部，于PCR的延长反应结束时，且于进行热改质前的时序，且以特定反应液温度进行荧光检出。

(28)一种使用如所述(1)～(26)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置进行PCR的方法，包含：

使用具有特定荧光波长的探针荧光色素；

通过所述荧光检出部，于PCR的延长反应结束时点以后，开始下一延长反应前的时序，且以特定反应液温度进行荧光检出。

与所述[2](包含导入可进行RNA检出的PCR反应前的反转录反应程序的预处理机构)及[3](熔解曲线分析功能)相关连，本发明提供以下液体回流型反应控制装置。

(29)如所述(1)～(26)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽及/或所述热交换槽进一步包含温度传感器；

通过设置于所述液体储存槽及所述反应槽及/或所述热交换槽的所述温度传感器，将附加于所述液体储存槽的所述热源及所述冷却机构进行回授控制，将所述液体储存槽的温度控制在预定温度。

(30)如所述(1)～(26)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽及/或所述热交换槽进一步包含温度传感器；

所述热交换槽进一步包含温度控制装置；

在通过所述切换阀停止液体往所述热交换槽流入的情况下，通过设置于所述反应槽及/或所述热交换槽的温度传感器及所述温度控制装置，将静止于所述热交换槽内的液体的温度控制在预定温度。

(31)如所述(13)所记载的液体回流型反应控制装置，其中于搬运所述反应槽芯片的至少一部分导轨上，设置有温度板及温度传感器，用于与反应槽芯片接触，将反应槽芯片的温度保持在一定温度，为了防止反应槽芯片上的反应液蒸发，而将反应槽套体内的温度保持在预定温度。

(32)如所述(29)或(30)所记载的液体回流型反应控制装置进行熔解曲线分析的方法，包含如下步骤：

以所述各温度传感器监测所述各液体的温度，同时于所述液体储存槽与所述反应槽之间，使液体回流，令所述反应槽所保持含荧光色素的样本液的温度，于预定的温度范围内，以预定的温度变化率变化的步骤；

使用光学测量模块，测量伴随于所述样本液的温度变化的所述荧光色度的强度变化的步骤；及

分析所述样本液的温度与所述荧光色素的强度的相关关系的步骤。

(33)一种使用如所述(31)所记载的液体回流型反应控制装置进行RTPCR的方法，包含如下步骤：

一面以所述各温度传感器监测所述各液体的温度，同时于所述液体储存槽与所述反应槽之间，使液体回流，

一面于所述导轨的所述温度板上，配置所述反应槽，以适于反转录的第1温度，将所述反应槽所保持含RNA及DNA聚合酶的样本液的温度，保持预定时间的步骤；及

上述步骤后，沿着所述导轨滑动所述反应槽，使所述反应槽与所述回流的液体呈接触状态，以预定次数重复由第2温度下的预定时间的热改质程序、第3温度下的预定时间的退火程序、及第4温度下的预定时间的延长程序所组成的放大循环的步骤。

与所述[4](对液滴保持及光学测量最佳的芯片技术与PCR反应的光学式测量功能)相关连，本发明提供以下液体回流型反应控制装置及方法。

(34)如所述(1)～(26)及(29)～(30)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中于所述反应槽的所述各孔的样本配置场所，设置有用于保持测定中的样本位置的支柱(柱体(pillar))。

(35)如所述(1)～(26)及(29)～(30)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中于所述反应槽的所述各孔的样本配置场所，配置有支柱(柱体(pillar))，以便将用于防止样本液蒸发的密封剂以所述柱体支撑的方式覆盖于该孔，通过所述柱体，防止测定中的所述样本液附着于用于防止样本液蒸发的密封剂。

(36)如所述(1)～(26)及(29)～(30)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中于所述反应槽的各孔的样本配置场所，配置有混合(或结合)了与样本的测定荧光波长不同的荧光试料的支柱(柱体(pillar))，可利用作为样本的荧光强度的参考荧光强度(参考(reference))。

(37)如所述(1)～(26)及(29)～(30)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中于所述反应槽的各孔的样本配置场所，配置有混合(或结合)了与样本的测定荧光波长不同的荧光试料的支柱(柱体(pillar))，使经放大的试料的DNA可杂交的探针或引物，结合于所述柱体表面，由此以使得在所述柱体表面附近发出反应中的荧光，可将所述柱体作为荧光增强的诱导管来使用。

(38)如所述(1)～(26)及(29)～(30)中任一项所记载的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽系芯片状反应槽，贴合了复数片在光学上具穿透性的平板状材料，至少1片所述平板状材料经过微加工，形成可通过毛细现象导入并封入样本液的反应液的微小流路及储存层。

(39)一种液体反应控制装置，包括：样本保持部，包含用于保持样本液的1个或复数个孔；雷射装置，发出对所述样本液的水具有吸收的红外雷射光；灰阶ND滤光片圆盘，可使来自所述雷射装置的雷射光的强度连续变化；旋转控制机构，控制所述圆盘的旋转速度；光学系统，用于导引所述雷射光经过所述灰阶ND滤光片圆盘而至所述孔的所述样本液；温度控制机构，用于控制所述孔的温度；及光学测定装置，包含测量所述孔内的所述样本液的光学影像的光学摄像机。

(40)一种液体回流型反应控制装置，包括：反应槽，包含用于装入样本液的1个或复数个孔；

热交换槽，为使热传导至所述反应槽而与该反应槽相接设置，设置有分别用于导入及排出预定温度的液体的进口及出口；

液体储存槽，设置有用于将液体保持在预定温度的温度可控制的热源及温度传感器；

管状流路，连接所述热交换槽的所述进口及所述出口与所述液体储存槽之间；

泵，设置于所述管状流路上，可使所述液体循环于所述热交换槽与所述液体储存槽之间；

雷射装置，发出对所述样本液的水具有吸收的红外雷射光；

灰阶ND滤光片圆盘，可使来自所述雷射装置的雷射光的强度连续变化；

旋转控制机构，控制所述圆盘的旋转速度；

光学系统，用于导引所述雷射光经过所述灰阶ND滤光片圆盘而至所述孔的所述样本液；及

光学测定装置，包含测量所述孔内的所述样本液的光学影像的光学摄像机。

(41)一种使用如所述(1)～(26)、(29)～(31)、及(34)～(40)中任一项所记载的反应控制装置进行PCR的方法。

(42)如所述(41)所记载的方法，其中

以光学检出器，移动操作于所述反应槽的复数个孔上，由此测定所述光学检出器数以上的样本数。

本发明的效果

以回流液体控制反应槽温度的本发明的优点可举出如下：1)严密的温度控制、2)稳定的温度控制、3)往目标温度移动时不会过冲。关于可解决温度过冲问题，由于始终回流的液体的温度大致一定，因此反应槽表面的温度与液体的温度大致可于瞬间平衡。在本发明中，与回流液体相比较，反应槽及样本的热容量微乎其微，因此基本上不会产生热梯度。当然反应槽的温度不会超过液体的温度。若依据本发明，通过依序使不同温度的液体流入热交换槽，可于0.5秒内使温度变化30℃以上。因此，若依据本发明，可极为缩短温度变化所需的时间，例如可比现有的装置，显著缩短用于完成PCR反应的总时间。

于按照本发明的反应控制装置，通过使保持在一定温度的液体接触热传导率良好的反应槽外部，进而以不同温度的液体迅速置换，可实现高精度控制样本温度，及迅速的升温、降温。若依据本发明，可进行高速、高精度、高放大率的PCR反应。

又，本发明可防止样本溶液加热所造成的样本液蒸发，因此就使用微量样本的PCR反应甚为有利。

附图说明

图1系表示本发明的反应控制装置的全体构成的模式图；

图2系本发明的反应控制装置所使用的热交换槽的概略图；

图3系表示本发明的反应控制装置所使用的反应槽形态及冻结干燥试药的溶解方法的模式图；

图4系表示本发明的反应控制装置所使用的圆柱型反应套体及其对热交换槽的安装方法的模式图；

图5系表示本发明的反应控制装置所使用的阀的切换顺序的模式图；

图6系表示使用本发明的反应控制装置进行关于(A)温度变化的数据、及(B)PCR反应的结果图；

图7系表示本发明的反应控制装置所使用的载玻片型反应套体及其对热交换槽的安装方法的模式图；

图8系表示本发明的反应控制装置所使用的滑动型活塞阀的驱动机构的模式图；

图9系表示本发明的反应控制装置所使用的滑动型活塞阀的驱动机构的模式图；

图10系表示本发明的反应控制装置所使用的回转式阀的驱动机构的模式图；

图11系表示本发明的反应控制装置所使用的滑动型活塞阀的驱动机构的模式图；

图12系表示本发明的反应控制装置所使用的温度设定型阀的驱动机构的模式图；

图13系表示根据本发明的一个实施例，反应控制装置的构成的模式图；

图14系表示根据本发明的一个实施例，反应控制装置的反应槽的构成的模式图；

图15系表示根据本发明的一个实施例，反应槽中的反应槽芯片的搬运系统以及进行反转录反应的装置构成的模式图；

图16系表示根据本发明的一个实施例，反应槽的试料的荧光检出方法的构成的模式图；

图17系表示根据本发明的一个实施例，反应槽的试料的荧光检出方法的构成的模式图；

图18系表示根据本发明的一个实施例，反应槽的构造的模式图；

图19系表示根据本发明的一个实施例，反应槽的构造及检出方法的模式图；

图20系表示根据本发明的一个实施例，反应槽的构造的模式图；

图21系表示根据本发明的一个实施例，反应控制装置的构成的模式图；

图22系表示根据本发明的一个实施例，反应控制装置的构成的模式图；以及

图23系表示根据本发明的一个实施例，反应控制装置的构成的ND滤光片的穿透率的角度相依性的模式图。

具体实施方式

用于实施发明的实施例

下面参考附图，说明有关本发明的实施例，下面所述实施例为例示，本发明的范围不得受到下述实施例所限定。

图1系表示根据本发明的一个实施例，反应控制装置的全体构成的模式图。本发明的反应控制装置典型上包括：反应槽(reaction vessel)1、反应槽套体2、热交换槽(heat exchangevessel)3、液体储存槽(liquid reservoir tank)4、热源5、搅拌装置6、泵7、切换阀8、旁通流路9、及辅助温度控制机构10。优选进一步包括：荧光检出器201、及用于送出控制讯号203的控制分析部202、及光学窗(或孔洞)204。

根据本发明的优选实施例，液体储存槽4系通过微量液体可移动于槽间的细连结管15所连接，以使得不会在液体高速循环中，各槽中液体的高度产生差异，水位高度差异导致压力差产生。又，为了以短时间实现热交换，如图1所示，从各储存槽4始终通过泵7来使液体循环，不诱导至热交换槽3时，仍通过切换阀8，将液体诱导至旁通流路9，亦使其始终循环。又，循环液体系配管如下：在回到储存槽4前，通过辅助温度控制机构10进行微调而回流，使其成为与储存槽4的液体温度相同的温度。在此，辅助温度控制机构10被装入有加温机构及冷却机构，通过帕耳帖(Peltier)组件等实现加温与冷却双方，或使用阻抗加热机构的加温系统与空气散热片型的冷却机构均可。又，液温传感器16设置于各储存槽4及各辅助温度控制机构10，依据来自该传感器的温度信息，可控制热源5及辅助温度控制机构10，以使液温成为各所需温度。在此，液温传感器宜使用由直接接触液体也不会腐蚀的材料所形成的热阻器、或经防蚀被覆的热电偶等。

又，根据本发明的优选实施例，于各储存槽，在来自热源的热供给产生水蒸汽等气体，从而发生储存槽内的压力上升时，为了防止槽损坏，且为了防止起因于气体压力差，经由连结管而产生液面高度，设置了有效将产生的气体排出至槽外的压力泄阀2003。

反应槽1典型上系由具有复数个凹坑(孔(well))的铝、镍、或者金的薄板等所构成。为了提高热传导性，凹坑区的薄板厚度宜比周围更薄，典型上为10至30微米的厚度，但不限定于此。为了整体上确保强度，相邻凹坑间的区域宜加厚，典型上厚度在100微米至500微米的范围，但不限于此。反应槽1典型上固定于四角、圆形等形状的反应槽套体2的底面而一体地形成。反应槽1及反应槽套体2典型上对于热交换槽3可拆装地构成(参考图4)。

导入于热交换槽3的液体的温度，系由设置于液体储存槽4内部的热源5控制。为了从热源5表面迅速取得热，使液体储存槽4内部的温度均匀，宜备有搅拌机构6。液体储存槽4中的液体系由泵7导引至流路内部。通过切换阀8，液体被导引至热交换槽3，或被导引至旁通流路9，不经过热交换槽3而直接回到液体储存槽4。因应需要，通过辅助温度控制机构10缜密地控制，将循环中变化的液体温度，修正为与储存槽4内的设定温度相同的温度之后排出，抑制液体储存槽4内部的温度变动。

导入于热交换槽3的液体亦可使用水，但不限定于此，只要是热容量大，且黏性低的液体(例如：液体氨)，可使用任意的液体。其中，从安全性的观点来看，宜使用非毒性、非可燃性的液体。又，例如通过使用沸点高于水的液体，可一面防止循环于装置内的液体凝固，一面亦可确实进行到水凝固点为止的温度变化。

优选如图1所示，于反应槽套体2设置荧光色素的激发光以及荧光会穿透的光学窗，以便可针对1个或复数个反应槽的每一个，测量由于反应槽1内的样本液的反应而变化的样本液中的荧光色素的荧光强度变化。又，通过设置荧光检出器201，可测量已测量到的各反应槽1的荧光强度的时间变化。于图1的实施例，于复数个荧光检出器201各个的内部，具备激发光照射机构及荧光检出机构，例如可采用进行PCR反应时，可独立测量滴下不同引物、或不同样本液的复数个反应槽1各个不同的PCR放大信息的构成。又，由荧光检出器201取得的荧光强度数据系由控制分析部202记录，具有估计通过PCR反应所得的样本液内的DNA量、或者mRNA量的功能。进而言之，于控制分析部202，具有通过取得切换阀8的切换信息，从荧光强度的时间变化，来估计阀切换后的样本液的温度变化是否达到目标温度的功能，以及亦具有根据该结果控制阀切换的功能。此系利用荧光色素普遍所具有基于水分子运动的荧光消光是取决于液温，从荧光强度就单位时间来看的变化量小或者为零而估计，尤其在确认使DNA改质的高温状态达成时甚为有效。

又，于图1所示的实施例，表示了于各反应槽1配置1个检出器的构成，但搭配组合荧光激发用光源及冷却CCD摄像机等可量化检出荧光的摄像机，以测量复数个反应槽1的荧光强度变化亦可。或者，于使用数目少于反应槽1的检出器时，通过将可高速移动于X-Y面的机械式驱动机构，与检出器搭配组合，来测量所有反应槽1的荧光强度亦可。

又，样本液容量系每一孔可使用0.1μL～100μL的范围，但不限于此。优选样本液容量系每一孔为0.1～数十(例如90、80、70、60、50、40、30、20、10)μL，但根据需要，进一步以低容量，例如每一孔使用0.5μL～10μL、每一孔使用1μL～5μL、每一孔使用1μL～2μL等亦适宜。于孔中除了样本液以外，亦可含有用于防止样本液蒸发的矿物油等。矿物油容量宜为数μL(例如：3～4μL)，但不限定于此，对本领域技术人员而言，当然可依孔大小或样本量适当变更。

图2系本发明的反应控制装置所使用的热交换槽3的概略图。作为基本构成，热交换槽3包括：导入不同温度的液体的进口A(11)、进口B(12)。又，热交换槽3设置有用于使热交换槽3的液体，回到液体储存槽4的复数个出口、出口A(13)及出口B(14)。分别而言，图2A系模式性表示从进口A(11)，导入来自液体储存槽4的某温度的液体，并从出口A(13)排出的状况；图2B系模式性表示从进口B(12)，导入来自液体储存槽4的某温度的液体，并从出口B(14)排出的状况。进口的数目不限定于2，可准备与欲使样本液温度变化的复数种温度一致的数目，且为2温度份量以上的复数个进口。例如欲达成3温度系统时，进口的数目为3个。出口的数目亦与进口的情况相同，不限定于2。再者，图2中的箭头系大致表示于热交换槽3导入或从热交换槽3排出的液体流动方向。

循环于热交换槽3与液体储存槽4的间的液体总容积，系考虑用于循环的液体的流速、液体的热容量或温度的稳定性等，例如为了实现反应槽1的温度变化的高速性与温度稳定性，将流速设在每秒10mL以上时，一般为数十mL以上的总容量，宜为100mL以上，更宜为200mL以上，进而最宜为300mL以上。容积上限可考虑装置的可搬性等来适当设定。

热交换槽3的容量宜为每孔的样本量的约10倍以上，更宜约为100倍以上，若约为1000倍以上最适宜。典型上，热交换槽的容量系对于1孔约为0.01mL～10mL，更宜约为0.05mL～数mL(例如9、8、7、6、5、4、3、2、1mL)，最宜约为0.1mL～2mL。

图3系表示本发明的反应控制装置所使用的反应槽形态及冻结干燥试药的溶解方法的模式图。可使用各种形状的反应槽或孔，图3A为在本发明的一个实施例中，分别表示了与热交换槽3的液体相接的面如下：平坦的反应槽A(21)；半球状的反应槽B(22)；三角锥状的反应槽C(23)；球状的反应槽D(24)；及于球状凹坑中具有圆锥状构筑物，可保持液滴的稳定位置与扩大接触面积的反应槽C’(231)。若考虑热传导效率，本领域技术人员当可容易理解与热交换槽的液体相接的面积越大，效率越佳。

反应所需的试药若预先冻结干燥，较为便利。如图3B所示，可于反应槽26的底部，预先调制冻结干燥试药25。又，若于分注样本时所用的分注芯片27内部，预先形成栓塞状的冻结干燥试药25，则可通过上下移动样本液28，使试药容易溶解于样本中。又，于尼龙纤维等成束的纤维珠29表面，预先形成冻结干燥试药25，通过插入于反应槽26内部的样本28中搅拌，亦可溶解冻结干燥试药。

图4系表示本发明的反应控制装置所使用的圆柱型反应套体32及其对热交换槽37的安装方法的模式图。由于直接处理由薄膜所构成的反应槽，较为不便，因此如图4A所示，若将反应槽31固定于反应槽套体32，较为便利。反应槽套体32宜以隔热性材质的聚苯乙烯、聚碳酸酯、PEEK、压克力等来形成。又，对反应槽31的迅速且高精度的升温、降温而言，期望尽量压低与反应槽31的结合面积(例如：5mm²以下)。

图4B系作为将反应槽31安装于热交换槽37的一个实施例，表示于反应槽套体32表面，预先形成螺纹槽34，将反应槽套体32旋入热交换槽37的反应槽承口33的方法。如图4B所示，为了保持水密性，宜于开口部安装封材35。图4C进一步表示其他安装方法。如图4C所示，亦可采用锥形状反应槽套体36，仅以压力安装于热交换槽38。

图5系表示本发明的反应控制装置所使用的阀的切换顺序的模式图。表示了用于于反应槽导入液体的进口阀A(41)、进口阀B(43)、用于导引至外部的出口阀A(42)及出口阀B(44)。从进口阀A(41)导引的液体系从出口阀A(42)回到液体储存槽4，从进口阀A(43)导引的液体系从出口阀B(44)回到别的液体储存槽4。通过交互轮替该两种状态，可使反应槽中的样本反应。进而期望的阀切换方法，除了所述两种状态以外，通过一瞬间同时开放进口阀B(43)与出口阀A(42)，或进口阀A(41)与出口阀B(44)，可抑制不同温度的液体混合，容易进行各个系统的液体储存槽的温度控制。

液体循环速度并未特别限定，一般约为1mL/秒～100mL/秒，更宜为5mL/秒～50mL/秒，最宜为7mL/秒～15mL/秒。为了使储存槽中的温度不降低而循环至热交换槽3，液体宜通过泵7，始终从储存槽以10mL/s以上的高速循环。

图6A系表示从有关通过使用所述机构可实现的温度控制的数据所得的线图。如图6A所示，可于1.5秒的短时间，使温度从60℃升温至92℃或回到60℃。图6B系表示实时PCR的结果的线图。进行PCR时的溶液条件如下。以反应缓冲剂1.0μL、2mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)1μL、25mM硫酸镁1.2μL、10％胎牛血清0.125μL、SYBR Green I0.5μL、引物两种各0.6μL、杀菌水3.725μL、KOD plus polymerase0.25μL、基因体DNA1.0μL的比率混合。温度条件首先以95℃进行10秒，接着将95℃1秒、60℃3秒的温度变化进行40循环。液体循环速度约为10mL/秒。

图7系表示有关本发明的反应控制装置所使用的反应槽59及反应槽套体51对热交换槽的拆装方法的变化。反应槽59展伸于载玻片型反应槽套体51而安装(图7A)。将该载玻片型反应槽套体51安装于热交换槽时，可沿着导轨53，使反应槽套体51往横向滑动，推压于封材54而固定(图7B)。又，亦可将载玻片型反应槽套体51插入于玻片承口55，活用铰链56推压于封材57(图7C)。

图8系表示本发明的反应控制装置所使用的阀切换机构的变化的模式图，其表示与图5不同的滑动型活塞阀的驱动机构。作为改变反应槽66的温度的阀机构，使用可往左右滑动的活塞65。于活塞65的左侧，从进口A(61)对热交换槽67导入液体，从出口A(62)导引至外部。于活塞65的右侧，从进口B(63)对热交换槽67导入液体，从出口B(64)导引至外部。若活塞65对于反应槽66往右滑动，则反应槽66会与从进口A(61)导入的液体的温度达到平衡，反之，若往左侧滑动，则会与从进口B(63)导入的液体的温度达到平衡。又，活塞65位于反应槽66的正下方时，液体可不漏泄而拆下反应槽66。活塞65宜由隔热性良好的材料制作，或内部宜成为空洞，充满气体，亦或成为真空状态。再者，图8中的箭头大致表示液体的流动方向。

图9系表示本发明的反应控制装置所使用的活塞阀的活塞的驱动机构的数种变化。一方法系活塞71与活塞杆72成为一体，从外部直接运作的方法(图9A)。其他方法系以铁、镍等强磁性材料制作活塞73，或于其他材料制作的活塞内部，装入磁铁74。于外部设置电磁线圈75，通过控制电流来使活塞73左右滑动(图9B)。进一步的方法亦可通过控制进口侧的压力或出口的流体阻抗，利用活塞76两侧的压力差，使活塞76往左右滑动(图9C)。再者，图9中的刷白箭头表示活塞的运动方向，涂黑箭头表示流体的流向，通过箭头方向大致表示流体的流动方向，通过箭头粗细大致表示流量。

图10系表示本发明的反应控制装置所使用的阀切换机构的其他形态。旋转阀81插入于剖面呈圆形的热交换槽83内部，而所述旋转阀81系由结合有作为旋转轴82的倾斜的椭圆形板材所组成。旋转阀81系将热交换槽83分隔为左右，通过转动旋转轴82，可将从热交换槽的右部或左部导入的液体，导引至反应槽84。图10的旋转阀81的形状为倾斜的平板，但亦可为其他螺旋螺纹等形状，若通过使旋转轴旋转，可产生同样的效果即可。再者，图10中的涂黑箭头表示旋转轴82的旋转方向，刷白箭头大致表示液体的流动状况。

图11系表示通过阀以外的构造来置换液体的构造。热交换槽98系由隔膜A(95)及隔膜B(96)所区隔。从隔膜A(95)导入的液体系通过出口A(92)导出至外部。由于隔膜的存在，不会从进口B(93)或出口B(94)导出(图11A)。从进口A(91)导入的液体的压力凌驾于从进口B(93)导入的液体的压力时，通过将隔膜A(95)及隔膜B(96)往左侧推出，从进口A(91)导入的液体的热会传至反应槽97(图11B)。从进口A(91)及进口B(93)导入的液体的压力关系为相反时，反应槽97的温度会与从进口B(93)导入的液体的温度达到平衡状态(图11C)。隔膜宜由耐热橡胶等耐热性良好的薄膜制作。再者，图11中的箭头大致表示液体的流动方向。

图12系表示本发明的反应控制装置所使用的温度设定型阀的进一步其他驱动机构的模式图。于本发明，可设定的温度不限定于两种温度。于图12表示可将反应槽的温度设定为3种以上的构造。于热交换槽103，插入侧面形成有沟槽102的转阀101。于转阀101两侧，设有进口及出口。例如从进口A(104)导入的液体系经过流路108而流入沟槽102，对反应槽109传热之后，从出口A(105)导引至外部。相对于此，从进口B(106)导入的液体不与反应槽109相接，从出口B(107)导引至外部。然而，通过旋转转阀101，可使得从任意进口导入的液体与反应槽相接(图12C)。通过伴随着经过时间111而旋转转阀101，可如图12C的线图所示令温度110变化。转阀101宜由隔热性材料制作。

图13系针对省略了本发明的反应控制装置的3温度型系统的控制系统部分的描述，表示一个实施例的全体构成的模式图。用于引起本发明的高速PCR反应的反应控制装置在典型上包括：反应槽(reaction vessel)1；反应槽套体2，防止来自外部对于反应槽上的PCR反应液滴的污染及液滴蒸发；热交换槽(heat exchange vessel)3，导入有热交换用的高速循环液；3个液体储存槽(liquid reservoir tank)4，以个别的温度保持3种温度的液体；以及对于各储存槽设置有：热源5、搅拌装置6、泵7、切换阀8、旁通流路9、及辅助温度控制机构10。为了实现高速PCR，从各个储存槽，液体系往液体流动方向18的箭头方向循环，于接头90，从各储存槽经各切换阀而接合有流路，诱导至通往热交换槽3的流路而构成，又，从热交换槽3流出的液体亦于下游侧的接头90，分支成通往各储存槽的回流流路，使位于热交换槽3的上游侧及下游侧双方的各分支流路的各切换阀8同时连动，为了高温、中温、低温的各储存槽4的任一储存槽液体的循环而切换，可瞬间将对于热交换槽3导入的高速循环液体切换为高温、中温、低温的任一温度。在此，为了便于理解而模式性表示装置构成及配管配置，因此各零件间的配管长度并未表示如实际长度，但连结接头90与各切换阀8的间的管长度，为使高速液体量几乎无残留，宜采邻接于接头90的方式配置切换阀8。又，为了使从各储存槽4供给至热交换槽3的高速循环液体的温度下降维持在最小限度，应使得从各储存槽4通往热交换槽3的流路长度成为最小长度，在构成上嵌入于各储存槽4与热交换槽3之间的零件，宜为仅嵌入有切换阀8的两个零件(机构)的最少数目的零件嵌入。另，关于从热交换槽3回流至各储存槽4的流路长度，即使稍长，由于会在通过下游辅助温度控制机构10进行温度补正后回流至储存槽4，因此不构成问题。又，泵7的设置位置为了确实于热交换槽3维持流速，供给高速循环液体，而且不对热交换槽3供给时，通过切换阀瞬间且确实经过辅助温度控制机构10回流至各储存槽，宜将泵7设置于各储存槽4与供给至热交换槽3的上游侧的切换阀8之间，配置成始终从储存槽4直接压出高速回流液体的构成。又，为了将从各储存槽4对热交换槽3供给的高速循环液体的温度下降维持在最小限度，该等流路的流路内径宜为2mm以上。

于图1的例中亦已说明，于各储存槽及各辅助温度控制机构，配置有测量液体温度的液温传感器16，根据该传感器16的各信息，可将各储存槽4的热源5的温度控制、及通过各辅助温度控制机构10的液体温度，微调成与储存槽4的温度相同的温度。又，通过导入该辅助温度控制机构10，可使储存槽4的温度缓冲功能成为最小，可将储存槽4的容量，亦即循环液体量保持在最小。又，于本实施例，相对于图1实施例的2温度PCR反应，可实现分别对应于改质、退火、延长3种状态的3温度PCR反应而构成。在此，有关高温、中温、低温3温度的控制，就高温而言，(图13，中央储存槽4)为了改质而保持95℃以上的高温，因此储存槽温度仅利用加温系统即足够，但就中温、低温储存槽而言，有时须根据使用酶的种类，进行其反应温度，亦即储存槽温度的微调。在此，可通过来自热源的热量供给，容易地实现各储存槽4内的液体温度上升，而降低温度时，例如可通过附加于储存槽4的辅助温度放热机构17来降低液温。该辅助温度放热机构17仅于欲使储存槽4内的液体温度降低时动作，采用通过嵌入机构内的泵系统，以高速吸入储存槽内的液体，并通过嵌入有空冷式或帕耳帖组件等冷却机构的流路的程序，来使液体的热量放热，直到最后确认成为通过设置于储存槽4内的液温传感器16所设定的液温为止，可进行液体冷却。

因此，各储存槽4的液体如图1至图6的说明所描述，从热源5对储存槽4供给热，通过温度传感器16的回授控制，将各储存槽的温度保持在高温(热改质温度)、中温(延长反应温度)、低温(退火反应温度)。又，由于以高于室温的高温进行温度控制，因此为了有效进行热对流，热源位置宜设置于储存槽4的底面，而且不仅使储存槽4内的液体温度进行热对流，为了使其高速成为均温，通过搅拌机构6等使得液体的温度分布成为一样的机构进行动作，以使温度成为均温而构成。然后，从各储存槽4，始终以例如流速10mL/秒，通过泵6排出液体，不通过设置于该泵的后段的切换阀8，将液体诱导至热交换槽3时，使其通过旁通流路9而回流至辅助温度控制机构10，将液体温度微调成储存槽4的设定温度后，回流至储存槽4。亦即，进行储存槽4→泵7→切换阀8→辅助温度控制机构10→储存槽4的循环，预先完成准备态势。另，在欲使反应槽1的温度变化为该液体温度时，将泵7后段的切换阀8往热交换槽3方向切换，且亦开关从热交换槽3排出的液体流动方向的切换阀8，循环如储存槽4→泵7→切换阀8→热交换槽3→切换阀8→辅助温度控制机构10→储存槽4，使反应槽1的温度变化为与预定的储存槽4的液体温度相同的温度。

又，于3个储存槽4，由于在该切换程序中，液体回流会发生些许的量偏差，因此在独立运用3个储存槽时，于重复反应程序中，于液面高度产生差异，可能发生液体从槽溢出，或从3个槽的送液速度产生差异。为了处置此问题，亦可设置连结管15，作为辅助性使液面高度齐平的机构。该连结管15的目的在于使液面高度齐平，并不以积极移动不同温度的液体作为目的，因此宜为充分细的管。又，其配置位置宜为各储存槽4的底面附近。

使用3温度的储存槽4进行PCR反应时，与图6B的2温度时的PCR反应相同，使用典型例来说明本装置系统的动作。在此，以如下步骤进行3温度PCR反应。首先，作为初始反应，使温度成为94℃以上，以进行反应的双链DNA进行热改质，从设定为95℃或96℃的高温储存槽4，将高温液体回流10秒以上，使反应槽1的温度成为94℃以上达10秒以上。在此，设定所述高温储存槽4的温度，使得进行热改质时的温度，即使于反应槽1整体的温度分布产生差异时，温度最低处的温度仍为94℃以上。由此，制作单链DNA，并且依酶类而定，活化PCR反应所需的酶类。接着，使引物与DNA特殊结合的退火步骤，通过来自为使反应槽温度约略成为60℃而设定液温为60℃的低温储存槽4的液体回流，使得反应槽1的温度成为60℃，将该循环进行1秒，最后是通过耐热性DNA聚合酶的互补DNA链的延长反应，为使反应槽1约略成为72℃，于设定为中温的储存槽4的温度成为72℃的条件下，将中温的储存槽4的液体循环进行3秒，于延长结束时，再次进行热改质步骤，以来自高温储存槽4的95℃液体的循环1秒，使得反应槽1的温度进展至94℃以上的温度，接着以低温60℃1秒、中温72℃3秒的反应作为1循环，重复反应约略40循环，由此可进行作为目标的DNA序列区的放大。在此，为了实际上使得温度不从储存槽4的温度发生下降，须以对于送液至热交换槽3充分的高速，使液体回流。于本实施例，液体的循环速度约为10mL/秒，以防止温度下降的形式，可进行温度变化。又，于所述实施例，退火温度系依设计的引物，与最佳引物的结合温度会有不同，因此宜利用后述的熔解曲线分析，算出最佳的退火温度，于该温度，设定低温储存槽4的温度。又，于所述实施例，延长反应时间设定为3秒，但不限定于此，通过从DNA聚合酶的延长速度与目标序列尺寸的关系算出，可适当决定设定时间。例如由代表性的Taq聚合酶所造成的DNA延长速度，在70℃时，约为60核苷酸/秒，因此在该酶的情况下，以3秒的延长反应，可放大150～180碱基长的目标区。因此，为了有效实现本发明的装置系统下的高速PCR反应，宜将目标区集中于数百碱基长而进行引物设计，根据目的选择最佳的DNA聚合酶，尽量使用进行高速反应的聚合酶。

又，以所述3温度进行循环时，可搭配组合终点型测量与采实际时间(实时)的放大测量的至少两种测量法。于图1亦已表示，于本发明的高速基因放大装置，可嵌入光学检出系统，就光学上监测目标基因产物的放大。一般使用由于被带进称为嵌入剂型的双链DNA的氢结合区，荧光强度会大幅变化的荧光色素进行测量时，就量化地测量产物量而言，目标DNA产物为双链系甚为重要。因此，终点型由于可于反应结束后测量，因此宜于反应结束后，在可于双链DNA状态下测量的温度范围内，令其稳定而测量，或者于最后放大循环结束后，立即测定荧光强度，通过与放大反应开始前的荧光强度比较分析，来估计由双链DNA所造成的荧光强度的放大量。在此，作为重要的注意点，由于荧光色素会有溶液中的荧光强度取决于溶液温度而变化的热荧光消光现象，因此测量时的温度务必以相同温度进行，此甚为重要。

另，于实际时间测量，从估计各放大循环的放大量来看，须于各循环测量。各循环的测量时序宜于所述延长反应接近结束，热改质正要开始前测量。在此，同样为了排除热荧光消光的影响，在各循环测量时的溶液温度宜设为相同温度。又，于一般称为TaqMan探针法，使用具有5’-3’核酸外切酶功能的DNA聚合酶、及为了对应荧光能量移动而嵌入有给体荧光色素与受体荧光色素的探针DNA片段而测量时，由于5’-3’核酸外切酶反应是于DNA聚合酶的延长反应时进展，因此于终点型，将测量开始前的给体荧光色素与受体荧光色素，于各自的荧光波长测定荧光强度后，进行基因放大反应，于结束后，将给体荧光色素与受体荧光色素，于各自的荧光波长测定荧光强度后，量化地检出探针DNA实际上被酶所分解的程度，由此可分析目标碱基序列的有无。在此，同样为了排除热荧光消光的影响，测量时的溶液温度宜设为相同温度。另，于实际时间侧量，探针DNA片段的分解反应若于聚合酶的延长反应时进展之后，各放大循环的延长反应结束时，或者热改质时，进行退火时的给体荧光色素的波长与受体警告色素的波长的荧光强度测量即可。其中，在此作为应留意点，同样为了排除热荧光消光的影响，测量时的溶液温度宜设为相同温度。

又，使用于本发明的高速PCR反应的反应槽1可为抛弃式芯片，因此进行交换时，须采取排出充满于热交换槽3中的液体，成为无液体状态后，取下反应槽套体2，然后取下反应槽1的程序。因此，于图13所示的实施例，配置为空气的流入管2001夹住阀(切换阀)8而与热交换槽3接触，又，热交换槽3的液体的排出管2002同样经过阀(切换阀)8、液体排出泵6，连接于通往储存槽4的1个辅助温度控制机构10的循环路径。实际上，于使用3温度的储存槽4的液体进行基因放大反应等时，装设于管2001、2002的2个阀8被关闭，不会对来自3个储存槽4的液体的回流造成影响。于基因放大反应结束的阶段，切换与3个储存槽4结合的6个切换阀8，不与本热交换槽3进行液体交换而切离，其后将连接于管2001、2002的各个阀8予以连接，使用泵7，将热交换槽3内部的液体送液至例如低温用的储存槽4的辅助温度控制机构10，热交换槽3内部能以空气来充满。如此之后，交换反应槽1，重新装上别的反应槽1，封闭连接于管2001、2002的切换阀8，当从出自储存槽4的回流系统开始将液体送液时，热交换槽3内被液体充满，可重开一般的基因放大反应。

进而言之，于本发明的装置，通过利用进行液体温度控制的机构，亦可进行熔解曲线测定。进行熔解曲线分析时，例如对反应槽1的反应液，连续从65至95℃，以ramp rate0.11℃/sec给予温度变化，一面以设置于反应槽1内的液温传感器，监测反应槽1的温度，一面使用如图1所示的光学测量模块，测量当时反应槽1的PCR反应液的嵌入剂荧光色素的强度变化等，可测量温度与荧光强度的相关熔解曲线分析的测量。此时，例如使用图13的3个储存槽4中嵌入了辅助温度控制机构10的储存槽，首先降低储存槽内的液温，直到成为预定的低温侧的开始温度。接着，对储存槽内的热源逐渐些许加施热量，一面以温度传感器16进行测量，一面进行恰为0.11℃/sec程度的温度上升的热量供给，在此同时，对热交换槽3供给该储存槽的液体。从热交换槽3返回的液体系以辅助温度控制机构10，调整成与储存槽的温度相同的温度。然后，最后作为最终温度，若达到95℃，为了降低储存槽内的液温，再次通过辅助温度放热机构17，将液体温度降低至当初设定的温度即可。

于图1亦已说明，反应槽1系由反应槽套体2保持在密闭状态。于优选实施例，反应槽套体2系根据由温度传感器16测量的温度数据，通过嵌入于反应槽套体2的加热器始终保持在75℃以上。通过利用该加热器加热，防止套体内的水蒸汽在套体的内表面冷凝，由此，套体内的水蒸汽保持在一定，其结果，反应槽的液滴即使以无添加矿物油等的暴露状态的液滴状态来配置，仍可不蒸发且于50～97℃的范围内进行温度变化。

又，同样地，熔解曲线分析用的温度控制手法，亦可为了以不同于PCR反应的温度，来保持于一定温度而采用。由此，亦可针对反应槽的PCR反应液，进行反转录反应。例如亦能以50℃的液体温度，使液体回流10分钟以上，由此从RNA对DNA进行转录后，将该储存槽的温度调整为一般进行PCR反应的温度，连续从反转录反应进展至PCR反应。

具体上接续于反转录步骤而进行的基因放大反应的步骤，包括单步操作(反转录与放大在1个管内连续进行)或二步操作(反转录与放大在个别的管内进行)两种步骤，在此以单步操作为例来表示操作程序的一个实施例。作为对于短目标的单步RT-PCR用反转录酶，例如使用Tth DNA Polymerase(Roche)时，该反应的最佳反应温度为55～70℃，因此(1)将低温储存槽的温度设定为低于一般退火温度的50～60℃，使该低温储存槽4的液体以30分钟程度回流至热交换槽3，进行反转录反应，接着(2)通过高温储存槽4，对热交换槽3使94℃以上的液体回流约2分钟，进行初始热改质，其后，(3)作为放大循环，以3秒循环进行如下程序及反应：通过来自高温储存槽4的94℃以上的液体进行1秒以上的热改质程序，接着是对应于来自为了退火用而进行了温度调整的低温储存槽4的引物特性，通过45～66℃的液体所进行的退火程序，然后是配合中温储存槽4的酶特性，通过68～70℃的液体进行延长反应。于该反应例中，3种不同温度的储存槽4的1种温度，调整为对于反转录反应最佳的温度，进行反转录反应后，再次重设定为对于PCR反应最佳的温度，进行3温度基因放大反应，亦可同样附加对于反转录反应最佳的温度的第4储存槽4，进行所述程序。

图14系表示用于使反应槽1具有所述熔解曲线分析的测量功能的其他手法的一个实施例。于该实施例，帕耳帖温度控制机构19配置于热交换槽3的底面，在此，于帕耳帖温度控制机构19，贯通有PCR反应用循环液体的流路管20，因此可同样进行所述图13所述的高速PCR反应用的液体循环，进而于进行熔解曲线分析时，使液体流路管20的液流18停止，通过帕耳帖温度控制机构19及热交换槽3内的温度传感器16，控制充满于热交换槽3的静止液体的温度，来进行熔解曲线分析。又，该机构同样可用于反转录反应。届时，可由帕耳帖温度控制机构19提供对于反转录反应最佳的温度及时间，于反转录反应结束时，使用图1所示的2温度基因放大装置的构成、或图13所示的3温度基因放大装置的构成，接着连续进行高速基因放大。

图15系表示本发明的连续抛弃式反应槽1的利用方法的一个实施例，以及备有可进行反转录反应的反应槽1的反应槽部的一个实施例的模式图。本发明的反应槽1系如所述图13的说明所述，可作为抛弃式芯片来使用。此时，如图15的A-A剖面图所示，例如进行高速基因放大反应的反应槽典型上包括：用于进行PCR的反应槽1，以固定反应槽1的O型环1010等保证了隔热性与密闭型的间隔件，夹住反应槽1上下的反应槽套体2与热交换槽3，及用于搬运反应槽的导轨1011，可沿着导轨1011将复数个反应槽1搬运至反应槽部1015。将反应槽1用于反应时，通过以反应槽套体2与热交换槽3夹住，通过O型环1010使反应槽1固定，可从液体储存槽4导入液体。另，搬运时，通过使反应槽套体2与热交换槽3脱离反应槽1，松开O型环1010，可使反应槽1的芯片沿着导轨1011移动而交换。从图15的A-A剖面图可知，反应槽套体2系为了就光学上观察并测量配置于反应槽1上的反应液，可采取在光学上呈透明的构成。此时，于2片薄的玻璃板1013之间，夹入ITO等通过阻抗有效引起发热的透明电极1014，可对光学式观测不造成妨碍且控制反应槽套体2的温度。尤其通过于内侧的玻璃板1013内面设置温度传感器16，调整为75℃以上的温度，可防止反应槽套体2内面冷凝，防止蒸汽压变化，因该结果，可防止配置于反应槽1上的反应液蒸发。

又，通过于导轨1011上反应槽部1015的前段，配置反转录反应槽部1016，可将RNA样本反转录于cDNA，以后段的反应槽部1015，进行高速基因放大。于反转录反应槽部1016，从图15的B-B剖面图亦可知，与反应槽套体2相同构成的套体，为了就光学上观察并测量配置于反应槽1上的反应液，可采取在光学上呈透明的构成。此时，于2片薄的玻璃板1013之间，夹入ITO等通过阻抗有效引起发热的透明电极1014，可对光学式观测不造成妨碍且控制套体内部的温度。尤其通过于内侧的玻璃板1013内面设置温度传感器16，调整为75℃以上的温度，可防止反应槽套体2内面冷凝，防止蒸汽压变化，因该结果，可防止配置于反应槽1上的反应液蒸发。于反应槽1的下面，配置有反转录反应用温度板1012，对反转录最佳的温度设定于例如50℃的状态下，通过紧贴于反应槽1，以50℃使装有PCR溶液的反应槽1的板温度反应30分钟程度，于反转录完毕时，其后通过让导轨滑动于反应槽部1015，以开始PCR。

图16系表示本发明的多样本的基因放大反应的实时检出方法的一个实施例的模式图。本发明的反应检出装置在典型上备有多孔反应槽(reaction vessel)1101、配置为数组状的复数个反应孔1102、及检出装置1201。通过使检出装置1201，于PCR反应中往例如方向1202扫描，检出反应孔1102上的PCR样本的荧光强度，由此设置有以数目少于反应孔数的检出器，测定全样本中的荧光强度的功能。在此，如图13的说明亦已叙述，于采嵌入剂方式进行荧光检出时，宜于PCR的延长反应结束时，且于开始热改质前的双链DNA状态尚维持的时间内测量。又，于TaqMan探针方式，荧光探针的PCR延长反应时产生量变化的荧光探针量的荧光检出时，从PCR延长反应结束后的时序，可于热改质、退火阶段的任一阶段测量。其中，于任一情况下，为了比较测量荧光强度，宜使得含荧光色素的反应液的温度相同。此系为了防止由于具温度相依性的荧光消光，即使反应液内的荧光色素量相同，因温度不同导致荧光强度不同。

图17系表示本发明的多样本的基因放大反应的实时检出方法的一个实施例的模式图。本发明的反应检出装置在典型上包括多孔反应槽1101、设置为数组状的复数个反应孔1102、及检出探针1203。准备与位于1101上的反应孔1102的数目同量的检出探针1203的数组，定点观测PCR样本的荧光强度，以便测量无分段的连续的时间变化，由此可与图16所示的扫描型不同，检出连续的荧光强度变化。

图18系作为用于使反应槽1上的反应液在PCR反应中不干燥的手段，模式性地表示了将封入有为了防止载置于反应孔1102上的样本蒸发而封入的封材1302，黏贴于反应槽1101上的一个实施例。在此，为了使封材1302不与反应孔1102中的样本溶液1303相接，且于反应液滴下时、搬运时、PCR测定中，抑制样本反应液在孔内的移动，于各反应孔的中心构成有柱(柱体(pillar))1301的构造的一个实施例。该柱1301采用由热传导性高的铝等金属的凸纹加工或附加而制作的构造，或以光学上具穿透性的玻璃或塑料来制作。

由此，5～10μL的PCR溶液不移动于PCR反应中，且可防止与密封剂相接。又，通过柱体可于更广的表面积延展液滴，其结果，与单纯于反应槽1101的表面滴下反应液的液滴的情况相比，可于更广的表面积延展液滴，可更有效与热交换槽交换反应液温度。又，柱体1301为光学上透明的塑料或PDMS等高分子构造材料时，通过掺入会发出与实时PCR测定中检出的波长不同荧光的物质，可作为校准PCR的荧光强度的参考来使用。

图19系表示于设置在反应孔1102内，由具光学性传导性或光纤玻璃或塑料等材料形成的柱体1301表面，结合有DNA探针1306或引物，以使PCR反应中的DNA可于附近杂交的一个实施例的模式图。由此，于有效进行PCR反应物放大时，在柱体表面附近，DNA放大物有效结合，可利用柱体的光纤特性，以高于一般的检出感度，将其荧光进行实时PCR反应。发出荧光的手段可利用如图19A所示，使用通过DNA双链时嵌入，以发出荧光的SYBR Green等嵌入剂1304的手段，或利用如图19B所示，PCR反应物1302杂交时，DNA的立体构造崩解，由此结合于DNA探针末端的荧光物质1305发出荧光的荧光共鸣能量移动(FRET)法的探针法等。或者，于柱体1301表面或柱体1301中，导入荧光受体荧光色素，将嵌入剂作为给体荧光色素使用，由此有效放大目标DNA时，结合于柱表面的探针DNA与放大产物DNA结合，嵌入剂荧光有效产生于柱体表面，由此亦可从柱的荧光发光来测量受体发光。此优点若从以往采用嵌入剂的荧光强度变化的指针来观察目标DNA而言，通过荧光能量移动，观察受体荧光的发光信息的与别的嵌入剂荧光色素不同波长的荧光，由此可量化地测量，可实现噪声更低的量化测量。

图20系模式性地表示为了有效控制反应液溶液，于反应槽1101中，实现无法仅以现有的液滴滴下来实现1，可于更广的表面积与热交换槽相接的反应液的空间配置，通过微加工技术，于反应槽中构成反应液的导入路径及反应区的一个实施例。本实施例所示的微流路型反应槽1401系于所述图1至19所示的实施例所用的热传道性良好的铝薄板等的反应槽1404上，黏着聚二甲基硅氧烷等具光学穿透性及弹性的材料所组成的流路形成用高分子1403。于该芯片配置有：样本注入口1405；微流路1402，通过毛细现象，从样本注入口导入反应液而通过；反应液储存槽1407，充满反应液；及空气储存槽，回收反应液时按压此，通过空气压从样本注入口1405回收反应液。于该实施例，在将反应液导入于注入口1405之后，以所述图1或图13所示的高速基因放大装置进行基因放大后，按压样本回收用空气储存槽1406，从样本注入口1405回收反应液以5μL以下较妥当，宜将注入口1405至反应液储存槽1407的容积抑制在5μL以内。又，于所述实施例使用了空气储存槽，亦可如图20A-A’剖面图所示，将空气储存槽的位置设在样本排出口1408。此时，于反应后的反应液回收时，通过从样本注入口1405吹入空气，可从样本排出口1408回收。又，于图20的实施例，反应液储存槽1407的高度设定高于微流路1402，但为了更有效进行热交换，尽可能将反应液储存槽1407的高度设定较低，由此可进行更有效的PCR反应。

图21系针对图13所示的实施例，作为温度控制用液体的送液手段，模式性表示使用了注射泵1411时的形态的一个实施例。能以每秒10mL以上的流速进行自动送液及自动吸液的注射泵1411表面，配置有热源5，于注射泵中配置有温度传感器16，将温度控制用的液体导入于热交换槽3时，切换欲送液温度的注射泵1411的切换阀8，从各注射泵经接头90而将液体导入于热交换槽3。然后，从热交换槽3返回的液体具如下功能：经过接头90及切换阀8而储存于辅助温度控制机构10，使液体回到与设定于注射泵1411内的温度相同的温度后，回流至注射泵。然后，来自注射泵的送液结束，来自别的注射泵1411的其他温度的送液开始的际，使得切换阀8与注射泵1411及辅助温度控制机构10连接而进行切换，将液体回收于注射泵1411内而构成。

图22系表示为了反应液的温度控制，照射反应液的水吸收强的红外线，利用该吸收的温度变化的一个实施例。发明人已经针对该聚焦红外光吸收的高速PCR装置技术，记载于日本特开2008-278291，于图22的本实施例，所采用的构成系反应液的温度控制不以红外雷射1510的强度控制来进行，而使用连续为圆状，穿透率阶段性变化的渐变ND滤光片1515，及经由轴体缜密控制该ND滤光片1514的角度的步进马达等马达1513，通过使角度可高度变化，以使光强度高速变化。由此不仅可达成急遽的温度变化，而且通过设为各种一定旋转各速度，不仅可正确且缜密进行反应液的每单位时间的温度梯度，而且可将温度变化自由编程。

图22的本实施例的装置构成系以聚光透镜1502，将来自照明用光源(卤素灯等)1501的可见光，为了可就光学上观察自动XY平台1503上的反应孔盘1507的各反应液的状态，经由物镜1508对准焦点，能以图像观察用摄像机(冷却CCD等)1522来观察。自动XY平台1503可通过X轴用马达1504及Y轴用马达1505驱动，来观察任意坐标的孔。又，通过平台加热器1506，可控制反应孔盘1507的温度，成为例如退火温度等PCR反应中的最低温度的温度。另，红外雷射1510可通过射束扩束器1511、雷射遮断器1512、渐变ND滤光片1515，以红外雷射用分色镜1509导入于显微镜光学系统。又，渐变ND滤光片1515系其中心的轴体1514与步进马达等马达1513相连接，由此可利用渐变ND滤光片1515自由调整红外雷射的穿透率。在此，关于渐变ND滤光片1515表面的ND的渐变模式，一般如图23(a)所示，采用因应其角度，以直线式ND＝ND_MAX·(θ/θ_MAX)的关系变化者即可。或者，通过取决于角度θ，事先写入渐变的模式，由此一面以一定的角速度旋转，一面于水滴照射预定的穿透光强度的红外线亦可。图23(b)系以旋转一圈时，用于进行一般的3温度PCR反应的程序会成为1循环的方式来构成渐变的一个实施例。首先，从穿透光0％的状态一口气上升至100％的穿透，并使水滴温度提高至95度以上的温度，由此进行核酸的热变质，接着使穿透光回到0％，以便预先使外部温度从55度回复到60度程度的退火温度，由此水滴下将至退火温度，进而以ND滤光片圆盘的旋转，使得穿透光穿透例如30％程度，由此可使水滴温度变化为70度，PCR延长反应进展。此时，在以一定角速度旋转圆盘时，各穿透光的照射时间比可通过反应于该渐变模式的空间配置来实现。为了量化测量反应孔中的PCR反应而进行荧光反应，于该光学系统，可将来自荧光激发用光源(水银灯等1517)的激发光，经由荧光激发光源用遮断器1518、荧光激发光用投光透镜1519，通过荧光激发光用分色镜1516导入激发光，并经由调整为不导入加热用红外雷射的波长光以及激发光的摄像机用分色镜1520、成像透镜1521，通过冷却CCD等图像观察用摄像机1522，量化地测量荧光强度而构成。关于图22所述的光学加热法，可与所述图1至21所述的手法灵活地搭配组合。

例如所述图1至21的实施例，通过附加本图22的光学加热法，可不变更储存槽4的温度，简单地嵌入熔解曲线分析功能。具体而言，关于来自储存槽4的高速循环液体的流动，使最低温度的液体预先循环，或于使高速循环液体的导入开始前，对包含目标核酸分子及嵌入剂功能的荧光色素的水滴，连续照射加热用红外雷射，此时，使得构成为减光的渐变程度呈一次函数的线性(直线)减少的渐变ND滤光片1515，以水滴温度充分稳定追随的程度的一定角速度旋转，由此可使水滴温度直线地上升或下降。在此，关于上升，可于使其以ND大小减少的方向旋转时实现，关于下降，可于使其以ND大小上升的方向旋转时实现。通过以每秒0.1弧度以下的缓慢旋转，记录其角度信息及荧光强度变化，以便可通过采用于下所述从角度θ的液滴温度估计法，来获得荧光强度的结果，可进行熔解曲线分析。在此，温度估计法系采用如下手法：将穿透光0％设为θ＝0弧度，穿透光100％设为θ＝2π弧度，预先调整照射光源的红外线强度，使得照射穿透光100％时，水滴温度会成为95度以上，一面原样维持该调整过的荧光强度，一面旋转渐变ND滤光片，以(θ/2π)·(T_MAX-T_MIN)的关系式，从角度θ的测定来估计水滴温度。其中，在此，T_MAX为穿透光100％的照射时的水滴温度，T_MIN为照射前的穿透光0％的水滴温度。

或者，将本构成与如图23(b)所示的1系统高速回流系统搭配组合，亦可简单通过光学式光热转换，来实现高速PCR反应，而所述1系统高速回流系统系于渐变ND滤光片的圆盘上，预先将穿透光的比率以θ采一定速度旋转作为前提，相依于θ来配置，以便使得旋转一圈时，一次或数次PCR反应会结束，由此使得目标在于令液滴的最低温度稳定化的最低温度的高速液体回流。在此，由于高速回流系统为1系统，因此无须嵌入所述图1至21所记载的复杂切换阀或嵌入切换程序，而且储存槽1个即足够，可大幅简化构成。

产业上的可利用性

本发明系作为用于进行要求严密控制样本温度的反应装置甚为有用。本发明亦作为用于进行要求迅速变更样本温度的反应装置甚为有用。

本发明尤其作为可进行高速、高精度、高放大率的PCR反应的PCR装置甚为有用。本发明的装置亦可小型化，因此作为可携式PCR装置甚为有用。

【符号说明】

1 反应槽

2 反应槽套体

3 热交换槽

4 液体储存槽

5 热源

6 搅拌机构

7 泵

8 切换阀

9 旁通流路

90 接头

10 辅助温度控制机构

11 进口A

12 进口B

13 出口A

14 出口B

15 连结管

16 温度传感器

17 辅助液体放热装置

18 液体的流动方向

19 帕耳帖温度控制机构

20 液体的流路管

2001 空气的流入管

2002 热交换槽的液体的排出管

2003 压力泄阀

21、22、23、24、26、231 反应槽

25 冷冻干燥试药

27 分注管

28 样本

29 纤维珠

31 反应槽

32 反应套体

33 反应槽承口

34 螺纹槽

35 封材

36 锥形状反应槽套体

37、38 热交换槽

41 进口阀A

42 出口阀A

43 进口阀B

44 出口阀B

51 反应槽套体

52、58 热交换槽的反应槽承口

53 导轨

54 封材

55 玻片承口

56 铰链

59 反应槽

61 进口A

62 出口A

63 进口B

64 出口B

65 活塞

66 反应槽

67 热交换槽

71 活塞

72 活塞杆

73 活塞

74 磁铁

75 电磁线圈

76 活塞

81 旋转阀

82 旋转轴

83 热交换槽

84 反应槽

91 进口A

92 出口A

93 进口B

94 出口B

95 隔膜A

96 隔膜B

97 反应槽

98 热交换槽

101 转阀

102 沟槽

103 热交换槽

104 进口A

105 出口A

106 进口B

107 出口B

108 流路

109 反应槽

110 温度

111 经过时间

201 荧光检出部

202 控制分析部

203 控制讯号

204 光学窗

1010 O型环

1011 导轨

1012 反转录反应用温度板

1013 玻璃板

1014 透明电极

1015 反应槽部

1016 反转录反应槽部

1101 反应槽

1102 反应孔

1201 荧光检出探针

1202 荧光检出探针的扫描方向

1203 数组化的荧光检出探针

1301 柱体

1302 蒸发防止用封材

1303 PCR溶液

1304 嵌入剂

1305 荧光探针

1306 DNA探针

1401 微流路型反应槽

1402 微流路

1403 流路形成用高分子

1404 反应槽

1405 样本注入口

1406 样本回收用空气储槽

1407 反应液储存槽

1408 样本排出口

1411 样本泵

1501 照明用光源(卤素灯等)

1502 聚光透镜

1503 自动XY平台

1504 X轴用马达

1505 Y轴用马达

1506 平台加热器

1507 反应孔盘

1508 物镜

1509 红外雷射用分色镜

1510 红外雷射

1511 射束扩束器

1512 雷射遮断器

1513 马达(步进马达等)

1514 轴体

1515 渐变ND滤光片

1516 荧光激发光用分色镜

1517 荧光激发用光源(水银灯等)

1518 荧光激发光源用遮断器

1519 荧光激发光用投光透镜

1520 摄像机用分色镜

1521 成像透镜

1522 图像观察用摄像机(CCD等)

Claims

1.一种液体回流型反应控制装置，包括：

反应槽，所述反应槽包含用于装入样本液的1个或复数个孔；

反应槽套体，为了防止设置于所述孔中的样本液滴蒸发，所述反应槽套体密闭覆盖所述反应槽，且为了防止冷凝，所述反应槽套体设置有保温构件；

热交换槽，为使热传导至所述反应槽，所述热交换槽与所述反应槽相接设置，所述热交换槽设置有分别用于导入及排出预定温度的液体的进口及出口；

复数个液体储存槽，所述复数个液体储存槽包含：用于将液体分别保持在预定温度且温度可控制的热源；为了使该储存槽内的温度成为一定温度而搅拌液体的液体搅拌机构；及用于获得所述储存槽的液体温度控制用的回授信息的温度传感器；

切换阀，所述切换阀设置于所述管状流路上，用于控制所述循环的所述液体的流向，且通过以预定的时间间隔，切换预定温度的所述液体从所述复数个液体储存槽，往所述热交换槽的流入，来将所述反应槽的温度控制在所需温度；

控制分析部，所述控制分析部可从所述荧光强度估计所述样本液的温度，根据其结果来控制所述切换阀的动作；

2.根据权利要求1的液体回流型反应控制装置，其作为PCR装置使用。

3.根据权利要求1的液体回流型反应控制装置，其中进一步包括冷却机构，所述冷却机构用于使得所述液体储存槽内的液体温度下降而进行控制。

4.根据权利要求1至3中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述荧光检出部与所述反应槽的所述孔一一对应而设置。

5.根据权利要求1至4中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽套体系通过所述保温构件保温，以使得所述反应槽套体内部的温度保持在75℃以上。

6.根据权利要求1至5中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述液体储存槽的数目与所述反应槽的设定温度数相同。

7.根据权利要求6的液体回流型反应控制装置，其中所述液体储存槽的数目为2温度PCR反应用的2、反转录反应用与2温度PCR或3温度PCR反应用的3、或反转录反应用与3温度PCR反应用的4。

8.根据权利要求1至7中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽的底面及壁面系由厚度1微米至100微米、包含铝、镍、镁、钛、铂、金、银、铜的金属，或硅所形成。

9.根据权利要求1至8中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述孔的底面形状为平底状、半球状、三角锥状、或球状。

10.根据权利要求1至9中任一项的液体回流型反应控制装置，其中于所述各孔，反应所需试药以干燥状态预先内包，所述试药通过与样本溶液接触溶出而进行反应。

11.根据权利要求1至10中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽套体进一步包含孔洞或光学窗，容易测定来自所述反应槽内的所述样本的光学讯号；所述光学窗包含光学上透明的发热体。

12.根据权利要求1至11中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽及所述反应槽套体设置为可对于所述热交换槽拆装。

13.根据权利要求12的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽及所述反应槽套体对所述热交换槽的拆装方式为如下任一方式：

(c)所述反应槽具有芯片状的形态，将所述反应槽芯片固定于载玻片状的反应槽套体内，于所述热交换槽的反应槽承口设置导轨，沿着所述导轨可拆装地安装所述载玻片状的反应槽套体繁冗方式；及

(d)将所述载玻片状繁冗反应槽套体，插入于具有铰链的玻片承座，通过所述铰链机构的旋转动作，将所述载玻片状的所述反应槽套体，对于所述热交换槽的所述反应槽承口可拆装地安装的方式。

14.根据权利要求12或13中任一项的液体回流型反应控制装置，其进一步为了一面处于所述液体正在回流的状态，一面使得所述液体不会漏至所述液体回流型反应控制装置的外部且可将所述反应槽从所述热交换槽拆装，所述热交换槽设置有空气导入口及液体排出口，用于在所述反应槽及所述反应槽套体的拆装时，排出所述热交换槽的液体。

15.根据权利要求1至14中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述液体储存槽的所述热源系为了有效利用热对流而设置于所述液体储存槽的底面，所述液体搅拌机构系通过连续或以10％以上的负载循环搅拌所述液体储存槽的液体，可将该液体储存槽内的所述液体的温度分布控制在5℃以内。

16.根据权利要求1至15中任一项的液体回流型反应控制装置，其中通过所述切换阀，可将所述复数个液体储存槽中任意液体储存槽的液体，导引至所述热交换槽，并可使所述热交换槽中的所述液体回到原本的液体储存槽。

17.根据权利要求15或16的液体回流型反应控制装置，其中通过所述切换阀的控制来置换所述热交换槽的所述液体时，控制所述切换阀使得所述热交换槽内部的所述液体，会被导引至所保持的温度与其温度最接近的液体储存槽。

18.根据权利要求1至17中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述辅助温度控制机构包含隔热材、加热器、及冷却机构，使得从所述热交换槽返回的液体的温度，与回流去处的所述液体储存槽内的液体的温度成为相同温度，抑制结合所述切换阀与所述液体储存槽的所述流路内部的所述液体的温度变动。

19.根据权利要求1至18中任一项的液体回流型反应控制装置，其中进一步包含旁通流路，结合所述切换阀与所述液体储存槽的所述流路内部的所述液体不因所述阀的切换而被导引至所述热交换槽，且通过所述旁通流路而往所述液体储存槽回流，以连续置换来自所述液体储存槽的液体，由此抑制回流于所述流路内的液体的温度变动。

20.根据权利要求1至19中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述切换阀系由滑动于剖面呈圆形或多角形的中空构造中的活塞所构成，通过所述活塞的位置来控制与所述反应槽相接的液体的温度。

21.根据权利要求20的液体回流型反应控制装置，其中在所述切换阀中，所述活塞通过(a)、(b)、(c)而滑动：

(a)对于连接于所述活塞的活塞杆，机械性地加施外力；

(c)于活塞两端，通过所述循环的液体的流向产生压力差。

22.根据权利要求1至19中任一项的液体回流型反应控制装置，其中于所述切换阀中，

23.根据权利要求1至22中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述循环的液体系使用热容量大且黏性低的液体。

24.根据权利要求1至23中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述循环的液体系使用沸点高于水沸点的液体。

25.根据权利要求1至24中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述循环的液体系使用凝固点低于水凝固点的液体。

26.根据权利要求1至25中任一项的液体回流型反应控制装置，其中使用注射泵将所述循环的液体予以送液。

27.一种使用根据权利要求1至26中任一项的液体回流型反应控制装置进行PCR的方法，包含：

使用嵌入剂型荧光色素；

28.一种使用根据权利要求1至26中任一项的液体回流型反应控制装置进行PCR的方法，包含：

使用具有特定荧光波长的探针荧光色素；

通过所述荧光检出部，在PCR的延长反应结束时点以后，开始下一延长反应前的时序，且以特定反应液温度进行荧光检出。

29.根据权利要求1至26中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽及/或所述热交换槽进一步包含温度传感器；

30.根据权利要求1至26中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽及/或所述热交换槽进一步包含温度传感器；

所述热交换槽进一步包含温度控制装置；

31.根据权利要求13的液体回流型反应控制装置，其中在搬运所述反应槽芯片的至少一部分导轨上，设置有温度板及温度传感器，用于与所述反应槽芯片接触，将所述反应槽芯片的温度保持在一定温度，为了防止所述反应槽芯片上的反应液蒸发，而将反应槽套体内的温度保持在预定温度。

32.一种使用根据权利要求29或30的液体回流型反应控制装置进行熔解曲线分析的方法，包含如下步骤：

33.一种使用根据权利要求31的液体回流型反应控制装置进行RTPCR的方法，包含如下步骤：

34.根据权利要求1至26及29至30中任一项的液体回流型反应控制装置，其中于所述反应槽的所述各孔的样本配置场所，设置有用于保持测定中的样本位置的支柱。

35.根据权利要求1至26及29至30中任一项的液体回流型反应控制装置，其中于所述反应槽的所述各孔的样本配置场所，设置有支柱，以便将用于防止样本液蒸发的密封剂以所述支柱支撑的方式覆盖于该孔，通过所述支柱，防止测定中的所述样本液附着于所述用于防止样本液蒸发的密封剂。

36.根据权利要求1至26及29至30中任一项的液体回流型反应控制装置，其中于所述反应槽的各孔的样本配置场所，配置有混合(或结合)了与样本的测定荧光波长不同的荧光试料的支柱1，可作为样本的荧光强度的参考荧光强度。

37.根据权利要求1至26及29至30中任一项的液体回流型反应控制装置，其中于所述反应槽的各孔的样本配置场所，配置有混合(或结合)了与样本的测定荧光波长不同的荧光试料的支柱(柱体(pillar))，使经放大的试料的DNA可杂交的探针或引物，结合于所述柱体表面，由此以使得在所述柱体表面附近发出反应中的荧光，可将所述柱体作为荧光增强的诱导管来使用。

38.根据权利要求1至26及29至30中任一项的液体回流型反应控制装置，其中所述反应槽系芯片状反应槽，贴合了复数片在光学上具穿透性的平板状材料，至少1片所述平板状材料经过微加工，形成可通过毛细现象导入并封入样本液的反应液的微小流路及储存层。

39.一种液体反应控制装置，包括：样本保持部，包含用于保持样本液的1个或复数个孔；

雷射装置，发出对所述样本液的水具有吸收的红外雷射光；

旋转控制机构，控制所述圆盘的旋转速度；

光学系统，用于导引所述雷射光经过所述灰阶ND滤光片圆盘而至所述孔的所述样本液；

温度控制机构，用于控制所述孔的温度；及

40.一种液体回流型反应控制装置，包括：

反应槽，包含用于装入样本液的1个或复数个孔；

热交换槽，为使热传导至所述反应槽而与所述反应槽相接设置，设置有分别用于导入及排出预定温度的液体的进口及出口；

液体储存槽，设置有用于将液体保持在预定温度且温度可控制的热源及温度传感器；

雷射装置，发出对所述样本液的水具有吸收的红外雷射光；

旋转控制机构，控制所述圆盘的旋转速度；

41.一种使用根据权利要求1至26、权利要求29至31、及权利要求34至40中任一项的反应控制装置进行PCR的方法。

42.根据权利要求41的方法，其中