CN104059855B - 一种治理土壤重金属污染的复合真菌制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合真菌菌剂，其含有Epicoccum nigrum、Leptosphaerulina chartarum、Lecanicillium sp.和Peyronellaca pomorum四种菌种。所述菌剂可用于治理土壤重金属污染。本发明利用了真菌菌体而不是细菌，其单位生物量要远远大于细菌菌剂，吸附效果更佳，并且可采用固态培养，成品可以是固体颗粒，使用更加方便。

Description

一种治理土壤重金属污染的复合真菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种治理土壤重金属污染的复合真菌制剂及其制备方法。

背景技术

随着人类工业化进程的迅速扩张，土壤的重金属污染问题是我国目前环境保护领域一大亟待解决的难题。土壤重金属污染问题事关重大，牵涉到水源、土地的正常使用，食品安全，是关系到环境健康、人民生命财产安全的重大问题。全国大面积的污染、快速出现的污染新区域、复杂多变的污染问题使得传统的治理技术方法无法达到满意的治理效果。因此，我们需要一种更加高效、成本低廉、对环境友好无害、低维护的先进技术。随着人们对于微生物界认识的逐步深入，科学家开始将微生物用于治理环境，这是更加环保、低碳、生态友好、融合自然的方法。

传统的土壤重金属污染治理方法基本属于物理、化学范畴。物理方法包括换土法、客土法、电动力学法、热解吸法、提取法等。换土法是将污染的表层土壤转移后换上新的无污染的土壤；客土法是向污染土壤中加入大量的无污染土壤，覆盖在表层或混匀。电动力学法是在土壤外加直流电场，通过电解、电迁移、扩散、电渗、电泳等作用使重金属离子做相对运动，在一端电极将重金属收集。热解吸法对土壤进行加热升温从而将重金属通过挥发离开土壤环境。提取法利用试剂与土壤中的重金属作用，形成可溶性物质，再用水将污染物冲至根耕层外，加入一定药剂与重金属形成沉淀最终提取出来。化学方法包括施加改良剂、加入还原性有机物等。改良剂一般指碱性物质(如石灰性物质)，加入改良剂使得土壤pH值升高，降低重金属的溶解性，从而能够降低植物对于土壤中重金属的吸收。加入还原剂可以使土壤中的某些重金属改变价态，维持在毒性较低的形态。其中，利用微生物的特性修复重金属污染是目前的研究热点，但大部分研究都处于初期阶段，并未产生成熟的可应用于实际的技术方法。胡原(2009，申请公布号：CN101838086)公开了一种生物制剂及用生物制剂处理污泥的方法。该技术采用了椰子汁与碳酸钙的混合制剂来处理生物活性污泥。孙红文等(2009)公开了一种修复土壤重金属污染的生物复合制剂。该技术利用了一种细菌菌种—枯草芽孢杆菌的吸附重金属的特性，将该细菌悬液和一定量腐植酸加入肥料中，起到了固定重金属和改良农田的作用。

在现有技术中，换土客土法存在工程量大以及二次污染严重的问题，因此仅限于面积较小的污染地区；电动力法耗电量巨大，成本过于昂贵；热解吸法需要提供大量热能，因此耗能量大，也大大提高了成本。化学法大多需要投加大量的化学药剂，不但成本昂贵，而且极易产生大量污泥，造成二次污染。生物修复中的植物修复法需要的生长周期很长，见效慢，同时对于不同重金属的超富集植物的选取也很有难度。而利用微生物处理土壤重金属污染的成熟技术很少，专利也较少。胡原的专利技术利用了污泥内部自身存在的微生物群落，并没有培养产生特定的微生物菌落，因此只能应用于含微生物成分的污泥中，而无法适用于其他土壤类型，应用范围过窄。孙红文的专利则利用了枯草芽孢杆菌悬液，但其单位生物量和吸附效果并不理想。

因此，本领域中需要单位生物量高，吸附效果好，使用方便的治理土壤重金属污染的微生物制剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有治理土壤重金属污染的传统方法的局限和不足，提供一种绿色环保、无二次污染、成本低廉、使用简便的利用复合真菌制剂来治理土壤重金属污染的技术以及复合真菌制剂的制取方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

在第一方面，本发明提供一种复合真菌菌剂，其特征在于，所述菌剂含有Epicoccum nigrum、Leptosphaerulina chartarum、Lecanicillium sp.和Peyronellaca pomorum四种菌种。

本发明的所述菌剂为固体。优选地所述菌剂中菌体颗粒的粒径可以为1-3mm，更优选为2mm。

在本发明的菌剂中，所述四种菌种的质量比例可以为1:1:1:1:1。

在第二方面，本发明提供如第一方面所述菌剂的生产方法，其特征在于，所述方法包括分别培养所述四种菌种，之后将所培养的四种菌种混合。

在本发明的所述菌剂的生产方法中，所述分别培养所述四种菌种的方法可以包括：

(a)一级种子培养；

(b)二级种子培养；

(c)扩大培养；

(d)收集菌体；

(e)任选地，菌体干燥；和

(f)任选地，菌体粉碎。

在本发明的所述菌剂的生产方法中，所述扩大培养可以为固体扩大培养，优选地所述扩大培养可以在以葡萄糖和蛋白胨为主的琼脂固体培养基中进行，并且优选地，所述扩大培养可以在大型玻璃圆形培养皿中进行。

本发明的所述菌剂的生产方法可以包括：

(1)所述一级种子培养为斜面试管一级种子培养：

配制四组无菌斜面试管培养基，其配方1kg培养基包含：为葡萄糖18～23g，蛋白胨8～12g，琼脂12～16g，氯化钠0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.2g，氯化钾0.3～0.6g，余量为水，将已经分离纯化的所述四种菌种分别接种至各组斜面中进行单独培养，培养温度23℃-27℃，优选地24℃-26℃，最优选地25℃，培养4-6天，优选地4.5-5.5天，更优选地5天，菌体长满斜面，分别获得所述四种菌种的一级种子；

(2)所述二级种子培养为Petri dish二级种子培养：

配制四组无菌Petri Dish培养基，其配方为1L培养基中含有无水乙酸钠0.24-0.26g，优选地0.245-0.255g，更优选地0.25g，酵母提取物0.12-0.16g，优选地0.13-0.15g，更优选地0.14g，琼脂12-16g，优选地13-15g，更优选地14g，四水氯化锰300-500μmol/L，优选地350-450μmol/L，更优选地400μmol/L，HEPES4.0-4.2g，优选地4.05-4.15g，更优选地4.1g，余量为去离子水，pH为5-7；

在无菌条件下分别在四组培养基中接入所述四种菌种的一级种子，将所述四种菌种在分离的条件下单独进行培养，培养温度23℃-27℃，优选地24℃-26℃，最优选地25℃，培养时间为7～10天，优选地8-9天，更优选地8.5天，获得所述四种菌种的二级种子；

(3)所述扩大培养为大型玻璃培养皿扩大培养：

配制培养基，其配方为1kg培养基包含：为葡萄糖18～23g，蛋白胨8～12g，琼脂12～16g，碳酸氢钠0.15g，三水磷酸氢二钾0.35g，硫酸镁0.05g，七水硫酸亚铁0.1g，氯化钠0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.2g，氯化钾0.3～0.6g，余量为水，制成无菌固体培养基，并将所述固体培养基分装至大型玻璃圆形培养皿中；

扩培接种：在无菌条件下分别在四组培养基中接入所述四种菌种的二级种子，将所述二级种子挖取小块接入大型玻璃圆形培养皿中，所述四种菌种在分离的条件下单独进行培养，培养温度为23℃-27℃，优选地24℃-26℃，最优选地25℃，培养时间为9～14天，优选地10-13天，更优选地11-12天，pH为5-8，优选地6-7，更优选地6.5；

(4)收集菌体：

在无菌条件下，将扩培生长完成的所述四种菌种的菌体分别转移至单独的无菌晾架；

(5)菌体干燥

在无菌条件下，将晾架上的菌体通过干燥箱的自然风干进行干燥，干燥温度20℃-25℃，优选地21℃-24℃，更优选地22℃-23℃，湿度在20％以下；

(6)菌体粉碎

在无菌条件下，将自然风干的所述四种菌种的菌体分别放入无菌粉碎机中进行粉碎操作，获得所述四种菌种的粉碎菌体；

(7)混合菌体

分别取所述四种菌种的粉碎菌体，充分混合，获得所述菌剂。

在第三方面，本发明提供了第一方面所述的菌剂治理重金属污染土壤的方法，所述方法包括，将本发明提供了第一方面所述的菌剂与所述重金属污染土壤接触，优选地所述重金属污染为锰金属污染。

在本发明的治理重金属污染土壤的方法中，所述菌剂的用量可以为5g菌剂/kg土样以上。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用了真菌菌体而不是细菌，因为真菌的单位生物量要远远大于细菌，因此本发明的复合菌剂的吸附效果更佳

(2)本发明可采用固态培养，生产制作的成品可以是固体颗粒，使用更加方便。

(3)本发明的真菌制剂中包含四种真菌，其相互配合具有加成的作用效果。

附图说明

图1是本发明不同菌剂投加量下菌体对镉的吸附效率变化图。

图2是本发明不同菌剂投加量下菌体对锌的吸附效率变化图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1.复合真菌制剂的生产方法

(1)斜面试管一级种子培养：

根据1kg培养基包含葡萄糖18g，蛋白胨8g，琼脂12g，氯化钠0.1g，氯化钙0.1g，氯化钾0.3g，余量为水的配方配制斜面试管培养基。制作四组斜面试管培养基，将已经分离纯化的四种菌种分别接种至各组斜面中进行单独培养。培养温度控制在23-25℃，4-6天后菌体即长满斜面。斜面培养结束后的试管放置在4℃冰箱中保藏。

(2)Petri dish二级种子培养：

培养基配制：配制1L培养基中含有无水乙酸钠0.24-0.26g，酵母提取物0.12-0.16g，琼脂12-16g，四水氯化锰300-500μmol/L，HEPES4.0-4.2g，去离子水1L，调至pH为7。将培养基在温度120℃的条件下灭菌30-40min。从高温高压灭菌锅中取出的培养基溶液需要在恒温60℃水浴中冷却至60℃。冷却后的培养基取等量的20mL分装至直径100mm高20mm规格的一次性Corning圆形培养皿中，冷却凝固后用封口膜密封，4℃条件下保存。

二级种子的培养：将制取好的Petri Dish培养基等量分为四组，在无菌条件下分别在四组培养基中接入四种菌种，四种菌种在分离的条件下单独进行培养。培养温度24～27℃、培养时间为7～10天，培养基菌态表面光滑无染菌。

(3)大型玻璃培养皿扩大培养：

培养基配制：葡萄糖18g，蛋白胨8g，琼脂12g，碳酸氢钠0.15g，三水磷酸氢二钾0.35g，硫酸镁0.05g，七水硫酸亚铁0.1g，氯化钠0.1g，氯化钙0.1g，氯化钾0.3g，制成固体培养基，每瓶装量约为1Kg，在130℃下灭菌消毒30min。从高温高压灭菌锅中取出的培养基溶液需要在恒温60℃水浴中冷却至60℃。冷却后的培养基取等量的70mL分装至直径200mm高30mm规格的大型玻璃圆形培养皿中，冷却凝固后用封口膜密封，4℃条件下保存。

扩培接种：将制取好的大型玻璃圆形培养基等量分为四组，在无菌条件下分别在四组培养基中接入四种菌种，将一级种子菌种挖取小块接入大型玻璃圆形培养皿中，四种菌种在分离的条件下单独进行培养。培养温度为25～27℃，培养时间为9～14天，pH约为5～8，经检测无杂菌后进入下一步处理。

(4)菌体生物量收集：

在严格灭菌消毒(臭氧消毒2h之后再经紫外消毒30min)后的环境中，将大型玻璃培养皿中扩培生长完成的菌体转移至无菌塑料晾架，每种真菌菌种的收集过程一致，但需要设置分别单独的晾架，过程中杜绝交叉污染，整个过程保持无菌清洁。

(5)菌体干燥

在无菌室中将放置在晾架上的菌体通过干燥箱的自然风干使之达到干燥状态。四种菌种分别设有独立的干燥箱。整个干燥过程保持无菌清洁，室内通风经过空气过滤器的过滤，确保空气无菌无杂质颗粒。温度控制在20-25℃，无需额外加热系统。湿度控制在20％以下。

(6)菌体粉碎

将自然风干的四种菌种的菌体进入无菌粉碎机中进行粉碎操作。粉碎之后的颗粒粒径在1-3mm左右。

(7)罐装及贮存

分别取等量的四种菌种的粉碎菌体(即四种菌种的质量比例为1:1:1:1，各占总量的25％)，将其充分混合，使用无菌广口棕色玻璃试剂瓶进行菌体颗粒的罐装。装瓶后放置在避光、干燥、室温条件下保存。

实施例2.采用本发明的复合真菌制剂处理含高浓度锰的土壤样品

将本发明的复合真菌制剂施入重庆某含高浓度锰的土壤样品中，取得良好的治理效果(表1)。复合真菌制剂的用量为5g制剂/kg土样。锰污染的土壤取自重庆某锰矿所在地的表层土壤，共取四处地点的土壤作为样品，四处土壤中含锰的浓度有所差别。从表1可以看出，本发明的复合真菌制剂对于土壤中锰浓度的耐受范围和适应范围较广，无论是～10mg/kg还是～100mg/kg的含锰浓度都能够起到很好的效果，去除率都达到了96％以上。

表1：本发明的复合真菌制剂对于含锰土壤的治理效果

实施例3.采用本发明的复合真菌制剂处理含高浓度镉锌的土壤样品

称取受镉污染土壤样品各5g为空白对照，同时准备4组复合真菌制剂处理的样品，每组样品含土样重量5g，其中分别添加微生物菌液量比为20ml、30ml、50ml、100ml，将所有样品的pH值调节为6.0，土壤pH值的调节采用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，室温培养。

实验结果表明，由这四种真菌菌种混合制成的复合菌剂对于土壤中的镉和锌具有很强的固定作用。在加入不同量的菌剂后，土壤溶液中的镉锌浓度与空白对照相比都有很大程度的下降(表2)。随着菌剂投加量的增加，菌体对镉锌的吸附效率有所降低(图1,2)。具体说来，投加20-50mL范围的菌剂时，菌体对镉的吸附效率较高，保持在95％左右。

表1：不同菌剂投加量下土壤溶液中剩余的镉锌含量

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

1.一种复合真菌菌剂，其特征在于，所述菌剂含有黑附球菌(Epicoccumnigrum)，其保藏编号为CGMCC No.5775、Leptosphaerulina chartarum，其保藏编号为CGMCC No.5776、Lecanicillium sp.，其保藏编号为CGMCC No.6337和Peyronellaca pomorum，其保藏编号为CGMCC No.6338四种菌种；所述四种菌种的质量比例为1:1:1:1～3:3:2:1。

2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体。

3.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中菌体颗粒的粒径为1-3mm。

4.权利要求1所述的菌剂的生产方法，其特征在于，所述方法包括分别培养所述四种菌种，之后将所培养的四种菌种混合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分别培养所述四种菌种的方法包括：

(a)一级种子培养；

(b)二级种子培养；

(c)扩大培养；

(d)收集菌体；

(e)菌体干燥；和

(f)菌体粉碎。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述扩大培养为固体扩大培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩大培养在以葡萄糖和蛋白胨为主的琼脂固体培养基中进行。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩大培养在大型玻璃圆形培养皿中进行。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

(1)所述一级种子培养为斜面试管一级种子培养：

配制四组无菌斜面试管培养基，其配方1kg培养基包含：为葡萄糖18～23g，蛋白胨8～12g，琼脂12～16g，氯化钠0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.2g，氯化钾0.3～0.6g，余量为水，将已经分离纯化的所述四种菌种分别接种至各组斜面中进行单独培养，培养温度23℃-27℃，培养4-6天，菌体长满斜面，分别获得所述四种菌种的一级种子；

(2)所述二级种子培养为Petri dish二级种子培养：

配制四组无菌Petri Dish培养基，其配方为1L培养基中含有无水乙酸钠0.24-0.26g，酵母提取物0.12-0.16g，琼脂12-16g，四水氯化锰300-500μmol/L，HEPES 4.0-4.2g，余量为去离子水，pH为5-7；

在无菌条件下分别在四组培养基中接入所述四种菌种的一级种子，将所述四种菌种在分离的条件下单独进行培养，培养温度23℃-27℃，培养时间为7～10天，获得所述四种菌种的二级种子；

(3)所述扩大培养为大型玻璃培养皿扩大培养：

配制培养基，其配方为1kg培养基包含：为葡萄糖18～23g，蛋白胨8～12g，琼脂12～16g，碳酸氢钠0.15g，三水磷酸氢二钾0.35g，硫酸镁0.05g，七水硫酸亚铁0.1g，氯化钠0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.2g，氯化钾0.3～0.6g，余量为水，制成无菌固体培养基，并将所述固体培养基分装至大型玻璃圆形培养皿中；

扩培接种：在无菌条件下分别在四组培养基中接入所述四种菌种的二级种子，将所述二级种子挖取小块接入大型玻璃圆形培养皿中，所述四种菌种在分离的条件下单独进行培养，培养温度为23℃-27℃，培养时间为9～14天，pH为5-8；

(4)收集菌体：

在无菌条件下，将扩培生长完成的所述四种菌种的菌体分别转移至单独的无菌晾架；

(5)菌体干燥

在无菌条件下，将晾架上的菌体通过干燥箱的自然风干进行干燥，干燥温度20℃-25℃，湿度在20％以下；

(6)菌体粉碎

在无菌条件下，将自然风干的所述四种菌种的菌体分别放入无菌粉碎机中进行粉碎操作，获得所述四种菌种的粉碎菌体；

(7)混合菌体

分别取所述四种菌种的粉碎菌体，充分混合，获得所述菌剂。

10.采用权利要求1-3中任一项所述的菌剂治理重金属污染土壤的方法，所述方法包括，将权利要求1-3中任一项所述的菌剂与所述重金属污染土壤接触。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述重金属污染土壤为锰金属污染土壤。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述菌剂的用量为5g菌剂/kg土样以上。