CN104046628A - 一种重组植物ta-siRNA基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提供一种重组植物ta-siRNA基因，所述重组植物ta-siRNA基因按如下方法制备：根据植物ta-siRNA基因设计特异性引物，以植物总RNA为模板进行PCR扩增，获得含植物ta-siRNA基因的扩增产物；再根据植物病毒的基因序列设计长度为21个核苷酸的siRNA序列，将一个或多个siRNA序列拼接成siRNA串联序列，然后将siRNA串联序列替换植物ta-siRNA基因中产生ta-siRNA的区域，获得重组植物ta-siRNA基因；本发明通过对植物ta-siRNA基因进行改造，插入人工设计的不同病毒siRNA序列，从而使改造的植物ta-siRNA基因产生抗病毒的ta-siRNA，实现多重抗病毒的功效。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种植物抗病毒基因工程技术，利用该技术可达到多重抗病毒的功效。
(二)背景技术
植物病毒病害是三大植物病害之一，每年对全球农业造成巨大损失。近年来，由于种植的集约化、品种的单一化造成植物病毒病害时有暴发流行。在田间，农作物要面对复杂外界环境，不仅可能同时面对几种病毒相继或同时侵染，而且即使同一种病毒也可能由不同差异的分离物组成。例如，烟草可被几百种植物病毒侵染，水稻可被近二十种植物病毒侵染(张仲凯，2001)。几种病毒复合侵染往往会加重病毒的症状，造成更严重的经济损失。多病毒相继侵染和复合侵染对抗病毒研究提出更严峻的挑战，但是广谱或多重抗病毒的研究目前只有零星的报道，(Jan et al.,2000；Bucher et al.,2006)。相关的专利也少之又少，目前仅有几例相关的专利(WO2010/123904，CN101519659)。
RNA沉默是一种普遍存在于真核生物体内的，发生在RNA水平的，基于核酸序列特异性的相互作用来调控基因表达、抵御病毒、转座子等外来入侵核酸的机制(Matzke et al.,2001)。RNA沉默启始于细胞内的双链RNA(dsRNA)的产生，包括植物自身通过RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)，DNA聚合酶(Polymerase)或病毒复制产生。这些sRNA在植物体内Dicer等酶的作用下可在双链部分产生21-24nt的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。siRNA与Argonaute(AGO)等蛋白一起组装成RNA沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)并将同源基因或病毒基因组沉默。由于RNA沉默是一种普遍存在于真核生物体内的，发生在RNA水平的，基于核酸序列特异性的相互作用来调控基因表达、抵御病毒、转座子等外来入侵核酸的机制(Matzke et al.,2001)，并且目前发现几乎所有RNA病毒和DNA病毒都可以成为RNA沉默的靶标(Bisaro,2006；Ribeiro et al.,2007)，因此RNA沉默被认为在抗病毒方面具有重要的应用价值。事实上，基于植物RNA沉默机理的转基因培育抗病毒作物技术得到了较快的发展，其中抗黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus,CMV)、番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)、辣椒花叶病毒(Paper mosaic virus,PMV)等黄瓜、番木瓜和辣椒品种已开始在全国多地推广种植。
TAS基因是一类不编码蛋白质的基因，这类基因转录产生的mRNA中含有一个miRNA(例如miR390、miR173等)的结合序列，因此可被含有相应miRNA的RISC识别，随后在RDR6、DCL4等酶的作用下在miRNA结合位点的5′或3′的固定位置上进行切割，产生多个21nt的siRNA(图1)。这些siRNA又能与植物体内一些蛋白质编码基因的mRNA结合，并在RISC的作用下对其进行切割降解(Allen et al.,2005；Yoshikawaet al.,2005)。由于这些siRNA是植物内源产生的，并且是反式(trans)起作用的，因此被命名为trans-acting siRNA(ta-siRNA)。生物信息学分析和实验验证，拟南芥基因组中包括8个TAS基因(TAS1a、TAS1b、TAS1c、TAS2、TAS3a、TAS3b、TAS3c和TAS4)，这些TAS基因产生ta-siRNA的过程具有高度保守、位置固定、产生高效(可同时产生多个)的特点(Allenand Howell,2010)。因此，通过改造该基因ta-siRNA产生相位的序列可实现同时沉默几个基因或多重抗病毒。例如，de la Luz Gutierrez-Nava等用不同长度FAD2基因(一种脂肪酶去饱和酶)片段甚至一个人工设计的、与FAD2互补的21nt的siRNA替换TAS1c基因中的一个ta-siRNA，将该经过改造的人工TAS基因转入拟南芥，转基因拟南芥成功地产生相应ta-siRNA，并将内源FAD2基因沉默，并且该人工TAS基因可被拟南芥稳定遗传(de la Luz Gutierrez-Nava et al.,2008)。WO2007/039454描述了将ta-siRNA初级转录产物中的位相用siRNA替换，以沉默或减弱植物内源基因的表达，包括玉米八氢番茄红素去饱和酶基因，拟南芥PDS基因。
(三)发明内容
本发明目的是通过对植物ta-siRNA基因进行改造，插入人工设计的不同病毒siRNA序列，从而使改造的植物ta-siRNA基因(重组植物ta-siRNA基因)产生抗病毒的ta-siRNA，实现多重抗病毒的功效。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种重组植物ta-siRNA基因，所述重组植物ta-siRNA基因按如下方法制备：根据植物ta-siRNA基因设计特异性引物，以植物总RNA为模板进行PCR扩增，获得含植物ta-siRNA基因的扩增产物，然后将扩增产物插入至植物表达载体中，获得含植物ta-siRNA基因的表达载体；再根据植物病毒的基因序列设计长度为21个核苷酸的siRNA序列，将一个或多个siRNA序列拼接成siRNA串联序列(采用全基因合成法合成siRNA串联序列)，然后将siRNA串联序列替换含植物ta-siRNA基因表达载体的植物ta-siRNA基因中产生ta-siRNA的区域，获得重组植物ta-siRNA基因；所述替换的方法为：在siRNA串联序列5′端加入限制性内切酶2识别位点，3′端加入限制性内切酶3识别位点，用全基因合成法合成完整序列，用限制性内切酶2和3消化以释放该片段，并插入至同样经过限制性内切酶2和3消化的植物ta-siRNA基因表达载体中，得到重组植物ta-siRNA基因表达质粒。
进一步，所述ta-siRNA序列由1～8种植物病毒的siRNA序列合成，优选3种，更优选黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒或马铃薯X病毒。
进一步，所述重组植物ta-siRNA基因可通过植物表达载体进行表达，并产生和siRNA序列一致的ta-siRNA。
本发明还提供一种重组植物ta-siRNA基因在制备多重抗病毒转化体中的应用，具体所述的应用为：
(1)引物设计
根据GenBank中植物ta-siRNA基因的序列设计特异性引物。其中，正向引物从ta-siRNA基因的mRNA序列的5′端开始，并在5′端加入一个限制性内切酶序列(限制性内切酶1识别位点)。反向引物从ta-siRNA基因5′至3′方向第一个ta-siRNA的末端开始，但3′端最后6个碱基以一个限制性内切酶的序列进行替换(限制性内切酶2识别位点)，并再加入另一个限制性内切酶序列(限制性内切酶3识别位点)。
(2)植物ta-siRNA基因的克隆
以植物总RNA为模板，用步骤(1)设计的引物进行RT-PCR扩增，获得植物ta-siRNA基因的序列，插入至T载体中，并进行序列测定分析。
(3)植物ta-siRNA基因表达载体的构建
用限制性内切酶1和3消化步骤(2)中获得的质粒，以释放ta-siRNA序列。将释放的ta-siRNA序列插入经过同样限制性内切酶酶切的植物双元表达载体中，获得含植物ta-siRNA基因的表达载体。
(4)抗病毒siRNA的设计与组装
从GenBank中下载目标病毒的基因组序列，用WMD3-Web microRNAdesigner(Plant J.,2008,53:674-690)设计针对上述病毒的候选高效siRNA。用TargetSearch和Blastn程序以设计的siRNA搜索植物的基因组和转录组，去除可能与之基因组序列匹配并造成错靶沉默的siRNA，最终获得高效、特异性的抗病毒siRNA序列。
(5)重组植物ta-siRNA基因表达质粒的构建
将设计的抗病毒siRNA组装成siRNA串联序列，并在5′端加入限制性内切酶2识别位点，3′端加入限制性内切酶3识别位点。用全基因合成法合成完整序列，用限制性内切酶2和3消化以释放该片段，并插入至同样经过限制性内切酶2和3消化的植物ta-siRNA基因表达载体中，得到重组植物ta-siRNA基因表达质粒。
(6)重组植物ta-siRNA基因表达质粒的表达与检测
将重组植物ta-siRNA基因表达质粒通过电击法导入农杆菌中，用花浸染法(拟南芥，参考文献：Weigel和Glazebrook，Arabidopsis.A laboratoryMannal,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002)或组培法(其它作物)将重组植物ta-siRNA基因表达质粒转化至目的植物的基因组中，获得转化植物。用RT-PCR、RACE或Northern blot对重组植物ta-siRNA基因的表达进行检测。
(7)抗病性性分析
用农杆菌浸染法、机械接种法或介体昆虫法接种目的病毒，经过一定时间后对转基因植株中病毒的复制进行检测，获得转基因植株的抗病性信息，完成多重抗病毒体系的构建。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明通过对植物ta-siRNA基因进行改造，插入人工设计的不同病毒siRNA序列，从而使改造的植物ta-siRNA基因(重组植物ta-siRNA基因)产生抗病毒的ta-siRNA，实现多重抗病毒的功效。
(四)附图说明
图1拟南芥AtTAS1a基因转录产物与miR173的作用以及产生ta-siRNA区域的示意图。
图2重组植物ta-siRNA基因表达载体(p2300-AtTAS1)的构造，LB为T-DNA左边界；35S-Ter为35S终止子；nptII为卡那霉素抗性基因；35S为花椰花花叶病毒(CaMV)35S启动子；MCS为多克隆位点；OCS为OCS终止子；RB为T-DNA右边界。
图3转基因拟南芥ta-siRNA表达的检测；A，重组植物ta-siRNA基因的构造；1－6分别为6个不同的抗病毒siRNA序列；B，抗病毒ta-siRNA的Northern blot检测。
图4为拟南芥转化株系TCT2-7对CMV、PVX和TuMV的抗性分析；A，qRT-PCR检测CMV、PVX和TuMV病毒在野生型和转基因PCT2-7拟南芥中的积累量(每种病毒共接种10株转化拟南芥植株，其中对3株植株进行病毒积累量的检测)；其中WT+CMV，WT+PVX和WT+TuMV分别表示野生型拟南芥接种CMV、PVX和TuMV后病毒的含量，PCT2-7+CMV，PCT2-7+PVX，PCT2-7+TuMV分别表示转基因拟南芥PCT2-7分别接种CMV、PVX和TuMV后病毒的含量；B，PCT2-7转基因拟南芥株系接种CMV后的表型。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实试例1
含ta-siRNA的拟南芥重组基因(AtTAS1a)且同时抗黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X)和芫菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)3种病毒
1、用液氮将3周大小的野生型拟南芥植株(Arabidopsis thaliana)组织研磨至粉末，用TRIzol(Invitrogen公司)提取拟南芥的总RNA，用OligodT18-20(购自Invitrogen公司)为引物进行反转录(RT)合成的cDNA。
2、根据拟南芥AtTAS1a基因(GenBank登录号：EU419776，序列1所示)设计特异性正向引物TAS1-KpnI-F：(5'-CCGGTACCCTAACGGCTAAGCCTGAC-3')(下划线为KpnI酶切位点)和反向引物TAS1-BamHI-R：(5'-GGGGATCCAAGGAGACTAGTGACTCATTCGCTTGT-3')(下划线分别为BamH I和Spe I酶切位点)，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增(反应体系为50μL，反应条件为35个循环的94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸50秒)，获得1个大小为400bp的片段。将该片段回收后连接至pGEM-T载体(购自Promega公司)并进行序列测定(上海桑尼公司，序列1)，将与拟南芥AtTAS1a基因序列一致的质粒命名为载体pGEM-AtTAS1a。
序列1
拟南芥AtTAS1a基因mRNA序列(GGTACC、ACTAGT和GGATCC分别是Kpn I，Spe I和BamH I的酶切位点)
GGTACCCTAACGGCTAAGCCTGACGTCATATACCAAAAAGAGTAAACATGAGCGCCGTCAAGCTCTGCAAGTACAATCTCATCTTACTCAAAAGTTGAGATAGGTTCTTAGATCAGGTTCCGCCTTTAGATCGAGTCATGGTCTTGTCTGATAGAAAGGTACTTTCTTTTACTTCTCTTGATTAGCGTCTATAGCTAGATTGAGATCGAGTTTGTGAGATGTTAGGTTCGATATCCCTGTCTATTTGTCACCAGCCATGTAGGAGTTTCGTCCCTTCCCCTCCCGTCGCCCTCTCTGTTTTTGGTATTCATTGGAATACGGAGATATATTTTCAAGAGGAGAAATATTGTTTTGTTGTGATTTTTCTCTACAAGCGAATGAGTCACTAGTCTCCTTGGATCC。
RT-PCR扩增反应体系为50μL，其中10×PCR缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL(2U)，正反向引物各1μL(10mM)，模板cDNA1μL，dNTP1uL(10mM)，灭菌水40μL。
3、用KpnI和BamHI对载体pGEM-AtTAS1a进行双酶切后以释放其中AtTAS1a基因片段，并连接于经过同样酶切的p2300-35S载体，经测序(上海桑尼)鉴定正确后，命名为表达载体p2300-AtTAS1(图2)。
4、从GenBank中下载可以侵染拟南芥的3种植物病毒：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)，芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)，马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)的全基因组序列，用WMD3-Web microRNA designer(Plant J.,2008,53:674-690)设计针对上述病毒的候选siRNA。用TargetSearch和Blastn程序对候选siRNA进行BlastN搜索水稻基因组和转录组，去除可能与水稻基因组序列匹配并造成错靶沉默的siRNA，最终获得高效、特异性抗病毒候选siRNA(序列2-7)。
序列2
CMV RNA1(HG917911)2838-2858nt反义序列
TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA
序列3
CMV1(HG917909)129-149nt反义序列
TTTATCGCCGTGGGAGGCTAC
序列4
PVX(EU571480)5473-5493nt反义序列
TAATGACTGCTATGATTGTTA
序列5
PVX(EU571480)4481-4501nt反义序列
TGATGAGAATATCCATCTTAT
序列6
TuMV(AB747315)385-405nt反义序列
AACACGGCATTCGACCTAGGT
序列7
TuMV(AB747315)2888-2908nt反义序列
AATATTAGCCCTTGCTTCGAC。
5、将抗病毒siRNA序列2-7进行组装，并在5′端加入Spe I酶切位点，在3′端加入BamH I酶切位点，完成抗病毒ta-siRNA串联序列的设计(序列8)。采用全基因合成法合成序列8，用Spe I和BamH I双酶切后，分别插入经同样限制性内切酶酶切的p2300-AtTAS1载体中，构建含ta-siRNA的表达质粒p2300-AtTAS1:PCT，即获得了含有ta-siRNA的重组植物基因。
序列8
siRNA串联序列(ACTAGT和GGATCC分别是Spe I和BamH I的酶切位点)
ACTAGTTTTAGCCGTAAGCTGGATGGATAATGACTGCTATGATTGTTAAACACGGCATTCGACCTAGGTTTTATCGCCGTGGGAGGCTACTGATGAGAATATCCATCTTATAATATTAGCCCTTGCTTCGACGGATCC。
6、用电击法将含ta-siRNA的表达质粒p2300-AtTAS1:PCT转化农杆菌(Invitrogen)。取PCR鉴定阳性的菌用于拟南芥遗传转化。取花期的野生型拟南芥植株，用花絮浸蘸法(Weigel和Glazebrook，Arabidopsis.Alaboratory Mannal,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002)转化拟南芥。转化后拟南芥放于23℃培养箱中(光周期18：6)继续生长，直至种子成熟，收取种子。将种子播种于Fafard营养土(购自加拿大Sun GroHorticulture公司)中，待拟南芥长出2片真叶后，用40mg/mL的Kana(上海生工)溶液进行喷施，每隔一天喷一次，直至90％以上拟南芥植株发黄死亡。将其中正常生长的拟南芥移栽至新的花盘中，以Fafard营养土继续培养。培养3周后，每株阳性植株各取1片叶片提取总DNA，分别用根据35S启动子和nptII基因设计的特异性引物(nptII-F:5'-GGAGAGGCTATTCGGCTATG-3'和nptII-R:5'-TATTCGGCAAGCAGGCAT-3')进行PCR扩增(反应体系为50μL，反应条件为37个循环的94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒)，保存PCR扩增结果为阳性的植株直至开花、结果，获得转基因T1代种子。将T1代种子用质量浓度5％次氯酸钠水溶液消毒后平铺于含50mg/mL的卡那霉素的MS培养基上培养至2片真叶。将在含50mg/mL的卡那霉素的MS培养基上正常生长的拟南芥植株转移至加拿大土中继续生长直至开花、结果，获得转基因T2代种子。PCR扩增反应体系为50μL，其中10×PCR缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL(2U)，正反向引物各1μL(10mM)，模板cDNA1μL，dNTP1uL(10mM)，灭菌水40μL。
7、对T2代植株再次用35S启动子和nptII基因设计的特异性引物进行PCR扩增鉴定(扩增引物，条件同步骤6中的PCR)。鉴定阳性的植株用TriZol(Invitrogen公司)提取RNA，以磷32同位素标记的序列8为探针，用Northern blot对RNA进行检测，结果表明重组植物ta-siRNA基因中的抗病毒siRNA序列得到有效的表达(图3)。对T2代植株用机械接种法分别接种黄瓜花叶病毒，芜菁花叶病毒和马铃薯X病毒。接种2周后，用Real-time RT-PCR对病毒的基因组进行检测和分析。结果表明转基因植株对所试的CMV、PVX和TuMV都表现出高度的抗性，其中对CMV表现出免疫，即用Real-time RT-PCR在系统叶中不能检测到CMV病毒的基因组(图4)。
Claims (4)
1.一种重组植物ta-siRNA基因，其特征在于所述重组植物ta-siRNA基因按如下方法制备：根据植物ta-siRNA基因设计特异性引物，以植物总RNA为模板进行RT-PCR扩增，获得含植物ta-siRNA基因的扩增产物，然后将扩增产物插入至植物表达载体中，获得含植物ta-siRNA基因的表达载体；再根据植物病毒的基因序列设计长度为21个核苷酸的抗病毒siRNA序列，将一个或多个抗病毒siRNA序列拼接成抗病毒siRNA串联序列，然后用抗病毒siRNA串联序列替换含植物ta-siRNA基因的表达载体的植物ta-siRNA基因中产生ta-siRNA的区域，获得重组植物ta-siRNA基因。
2.如权利要求1所述重组植物ta-siRNA基因，其特征在于所述抗病毒siRNA串联序列由1～8种抗病毒siRNA序列组成。
3.如权利要求1所述重组植物ta-siRNA基因，其特征在于所述植物病毒为黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒或马铃薯X病毒。
4.如权利要求1所述重组植物ta-siRNA基因在制备多重抗病毒转化体中的应用。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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