CN1040321A

CN1040321A - 2′，5′-寡聚腺苷酸衍生物的治疗用途

Info

Publication number: CN1040321A
Application number: CN89106235A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·J·萨哈道尔尼克; 沃尔福岡·坡夫雷德勒
Original assignee: Temple Univ School of Medicine
Current assignee: Temple Univ School of Medicine
Priority date: 1988-06-09
Filing date: 1989-06-09
Publication date: 1990-03-14
Anticipated expiration: 2004-06-09
Also published as: ES2016464A6; EP0716856A2; PT90816A; DE68929321D1; DE68929321T2; IL90499A; DK291390A; AU637975B2; WO1989012380A2; DE68927055D1; DK174025B1; DE68927055T2; ATE141796T1; PT90816B; JP2947580B2; WO1989012380A3; EP0420872B1; JPH03504970A; NZ229422A; DK291390D0

Abstract

2′、5′-寡聚腺苷酸的合成类似物是有效的治疗试剂，尤其是对HIV感染。其中，所述腺苷酸上的糖苷配基，该糖基部分，和/或端部该苷已被修饰，该类似物可用于治疗以疗以2-5A通道缺陷为特征的失调症的组合物和方法中。

Description

本发明涉及2′，5′-寡聚腺苷酸类似物的某种治疗用途以及这种类似物的药物组合物。

本发明主题完整的命名要用极长的术语，本领域的熟练技术人员惯常将这些术语以他们所熟知的方式进行缩写，下面列出的就是这些通常的，惯用的缩写形式，本说明书中将采用这些缩写形式。

缩写

A：腺苷或腺苷酸或腺苷酰基

虫草品或C或3′-dA：3′-脱氧腺苷（3′-脱氧腺苷酸）

ara-A：9-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤

EHNA：赤-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤

A-3′-氨基：3′-氨基-3′-脱氧腺苷

杀结核菌素：4-氨基-7（β-D-呋喃核糖）吡咯并-〔2，3-d〕嘧啶

3′-dATP：3′-三磷酸脱氧腺苷

ATP：三磷酸腺苷

I：肌苷或肌苷酸或腺苷酰基

木-A或木腺苷：9-β-D-木阿糖呋喃腺嘌呤

dCF或2′-脱氧助间型霉素：（R）-3-（2-脱氧-β-D-赤戊呋喃）-3，6，7，8-四氢咪唑并〔4，5-d〕〔1，3〕二氮杂草-8-酚

2-5A或2′，5′-寡聚（A），或2′，5′-寡聚腺苷酸：带有2′，5′-磷酸二酯键和一个在5′一端的三磷酸的腺苷酸寡聚物

2′，5′-虫草品类似物或2′，5′-寡聚虫草品：带有2′，5′-磷酸二酯键和一个在5′一端的三磷酸的3′-脱氧腺苷酸的寡聚物

2′，5′-An或核心低聚物：带有2′，5′-磷酸二酯键的腺苷酸的寡聚物

2′，5′-A₃或2′，5′-腺苷酸三聚物核心：腺苷酰基-（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）腺苷

2′，5′-A₄或2′，5′-腺苷酸四聚物核心：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）腺苷

2′，5′-3dA₃或2′，5′-C-C-C或2′，5′-虫草品三聚物核心：3′-脱氧腺苷酰（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰-（2′，5′）3′-脱氧腺苷

2′，5′-C-C-C-C或2′，5′-虫草品四聚物核心：3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧酰苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-腺苷

3′，5′-A₃：腺苷酰基（3′，5′）腺苷酰基（3，5′）腺苷

2′，5′-I₃或2′，5′-肌苷三聚物核心：腺苷酰基-（2′，5′）腺苷酰基（3′，5′）肌苷

EBV：Epstein-Barr病毒

EBNA：与早期核抗原有关的Epstein-Barr病毒

HIV：人类免疫缺失病毒，包括HIV-1，HIV-2，以及所有其它的HIV亚型

HBLV：人类B-细胞淋巴变病毒

HTLV：人类T-细胞白血病病毒，包括HTLV-Ⅰ，HTLV-Ⅱ和HTLV-Ⅲ，以及所有其它的HTLV亚型。

IFNα：α-干扰素

rIFN-αA：重组α-干扰素

dsRNA：双股核糖核酸

2′，5′-A-A-Tu：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）杀结核菌素

2′，5′-Tu-Tu-Tu：2′，5′-杀结核菌酰基（2′，5′）杀结核菌酰基（2′，5′）杀结核菌素

2′，5′-A-A-ara-A：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）ara-A

2′，5′-C-C-A：3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）腺苷

2′，5′-A-C-C：腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷-（2′，5′）3′-脱氧腺苷

2′，5′-A-A-C：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷

2′，5′-C-A-C：3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰（2′，5′）3′-脱氧腺苷

2′，5′-A-C-A：腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）腺苷

2′，5′-木-A₃：木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷酰基-（2′，5′）木腺苷

2′，5′，-木-A₄：木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷酰基-（2′，5′）木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷

AC：乙酰基

Bz：苯基

MMTr：5′-O-对-甲氧基三苯甲基

2′，5′-三苯甲基-C₃：5′-O-对-甲氧基三苯甲基-3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷

2′，5′-三苯甲基-A₃：5′-O-对-甲氧基三苯甲基腺苷酰基-（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）腺苷

2′，5′-C-C-dCF：3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）2′-脱氧助间型霉素

2′，5′-A-A-A-3′-氨基：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基-（2′，5′）3′-氨基-3′-脱氧腺苷

SiTBD：叔-丁基二甲基甲硅烷基或-Si（CH₃）₂C（CH₂）₃

2′，5′-A（si）-A（si）-A：3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基-腺苷酰基（2′，5′）3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基腺苷酰基（2′，5′）-腺苷

2′，5′-A-A-A-3′-O-甲基：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基-（2′，5′）3′-O-甲基腺苷

2′，5′-A-A-A-3′-O-戊基：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基-（2′，5′）3′-O-戊基腺苷

2′，5′-A-A-A-3′-O-己基：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-O-己基腺苷

2′，5′-A-A-A-3′-O-庚基：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-O-庚基腺苷

2′，5′-EHNA-A-A：赤-9-（2-羟基-3-壬基）-腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）腺苷

由腺苷酰（A）和3′脱氧腺苷酰（C）部分组成的“四聚物”化合物的缩写形式表示如下：

2′，5′-A-A-C-C：腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷

随着对有关由于干扰素诱导的抗病毒情况知识的不断了解，人们已经把注意力集中在作为抗病毒应答介体的2′，5′-低聚核苷酸的化学和酶催化合成及其生物特性，2′，5′-寡聚（A）是在植物和动物体中天然的，能起广谱抗病毒作用的一种成份。2-5A通道，也就是人们所知道的2-5A/核糖核酸酶L通道或抗病毒系统广泛地认为在干扰素的抗病毒机制中起作用，还对细胞生长的调节及分化起作用，根据该通道，可以由ATP通过2′，5′-寡聚腺苷酸合成酶〔ATP：（2′，5′）寡聚（A）-腺苷酰转移酶（EC2，7，7，19）〕（下文称为“2-5A合成物”）合成得到2-5A，该酶用dsRNA激活，2-5A通过与其唯一已知的靶酶，即特异的2-5A依赖的内核糖核酸酶RNase L键合并使其活化而、发挥其生物作用。后一种酶裂解病毒和细胞的mRNA或rRNA，从而抑制蛋白质的合成，参见Hovanessian等人，Eur.J.Biochem.93：515-526（1979）;Kerr等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.75：256-260（1978）但是真正2-5A分子在生物系统中的短的半衰期是公认的对控制病毒复制是不利的。

“人类B-淋巴变病毒”也就是已知的“人类B-细胞淋巴变病毒”（HBLV），其特征是一种大分子量的双股DNA基因组，该病毒在形态上类似于疱疹病毒科的病毒，但与已知的人类和非人类灵长目疱疹病毒在宿主范围、体外生物作用，抗原性能和基因组上存在差别。参见Salahuddin等人，Science.234：596-601（1986）Josephs等人，Science 234：601-602（1986）已经发现该病毒能选择性地感染刚刚分离的人类B-细胞，这些细胞被转变成具有核和细胞质粒包合体的大的，可折射光的单或双核细胞、人们怀疑HBLV是引起慢性类单核增生综合症的原因所在，该综合症的症状为持续一年以上的慢性疲劳。

人类免疫缺失病毒（“HIV”），也就是人们所知道的人类T-细胞白血病病毒Ⅲ（HTLV-Ⅲ”）是获得性免疫缺乏综合症的病原剂，该病毒是D型反转录病毒，象所有的反转录病毒一样，HIV复制的基本特征为将正股RNA基因组反转录成DNA，该过程需要一种依赖于与RNA的DNA聚合酶，即反转录酶，这种酶是病毒编码的，且发现与成熟的HIV病毒粒子中基因组的RNA有关，反转录酶对反转录病毒和需要较短反转录步骤的病毒的排他性使得反转录酶成为抗病毒，尤其是抗反转录病毒，治疗干预的主要目的。

因此，人们要求有一种用比真正2-5A代谢更稳定，更有效的化合物来控制由HBLA引起的慢性疲劳HIV，以及其它的以2-5A通道缺陷为特征的疾病的方法。

根据本发明，提供了一种治疗哺乳动物2-5A通道缺陷为特征的失调症的方法，该方法包括给这些哺乳动物施用至少一种分子式如下面所示的化合物或它的药用盐。

其中：n是从1-8的正整数

m是0、1、2或3

只要所有R在同一化合物中不都是-OH，则每一个R，可以相同或不同地选自于氢、羟基、氨基、C₁-C₁₀烷氧基和-OSi（CH₃）₂C（CH₃）₃

优选地，n为1至3，为1或2更好，最好在核苷酸2′-末端上的R基团不是羟基，即2′-末端核苷酸不是腺苷。

用于本发明方法中的化合物的例子包括下列核心化合物，它们相应的5′单双和三磷酸酯以及它们的药用盐。

R选自于氢和羟基中的化合物

2′，5′-C-C-C，

2′，5′-A-A-C，

2′，5′-A-C-C，

2′，5′-C-C-A，

2′，5′-C-A-C，

2′，5′-C-C-A，

2′，5′-A-C-A，还有A和C结合的各种四聚物，它们包括组不限于：

2′，5′-C-C-C-C，

2′，5′-A-A-A-C，

2′，5′-A-A-C-C，

2′，5′-A-A-C-A，以及类似物

R选自于羟基和C₁-C₁₀烷氧基，特别是C₁-C₇烷氧基的化合物，例如：

2′，5′-A-A-A-3′-O-甲基

2′，5′-A-A-A-3′-O-戊基

2′，5′-A-A-A-3′-O-己基

2′，5′-A-A-A-3′-O-庚基

R选自羟基和氨基的化合物，例如

2′，5′-A-A-A-3′-氨基

R选自于羟基和OSi（CH₃）₂C（CH₃）₃的化合物例如：

2′，5′-A（si）A（si）A

在所述发明中，在治疗哺乳动物的以2-5A通道缺陷为特征的失调症的方法中包括给这些哺乳动物施用至少一种选自于下面列出的化合物：

2′，5′-A-A-ara-A，

2′，5′-A-A-Tu，

2′，5′-Tu-Tu-Tu，

2′，5′-I₃，

2′，5′-木-A₃，

2′，5′-木-A₄，

2′，5′-C-C-dCF，

2′，5′-EHNA-A-A，以及

5，6-二氯苯并咪唑酰基（2′，5′）5，6-二氯苯

并咪唑酰基（2′，5′）5，6-二氯苯并咪唑核糖苷或者是其5′单一，双一，和三磷酸酯，或者是它们的药用盐。

本发明还进一步涉及用于治疗哺乳动物以2-5A通道缺陷为特征的任何一种失调症的药物组合物，它包括至少一种上述化合物和一种药用载体。

附图简述

图1表示用下列2′，5′-寡聚腺苷酸类似物进行HIV-1反转录酶抑制的效果：P₂C₃（实心圈）;PC₄（空心圈）;P₃C₃（实心方块）;PC₃（空心方块）;C₃（实心三角）;A-C-A（空心三角）。反转录酶反应中含有作为模板引物的聚（A）-（dT）₁₅，作为酶的Triton X-100活化的HTLV-Ⅲ_B溶胞产物，并用〔³H〕dTTP结合（如例9中所述）进行监视，对比值平均为129，000cpm（每分钟计数），而背景值平均为10，000cpm。

图2表示下列物质对体外HIV-Ⅰ感染的效果：（Ⅰ）虫草品，（Ⅱ）2′，5′-A₃，（Ⅲ）2′，5′-C₃和（Ⅳ）2′，5′-pC₃，（Ⅴ）（2′，5′）-A-C-A以及（Ⅵ）2′，5′-pC₄。在存在和不存在效应物时用HTLV-Ⅲ_B攻击MT-2细胞，通过如例9中所述的病毒染色吸收定量测定细胞致病效果，每一个数据点代表三个值的平均数，标准误差小于平均值的10%。

图3是2′，5′-C₃和rIFN-αA（A），或失配dsRNA（B）结合起来的抗-HIV-1效果的图示，结合药物指数由剂量-效果曲线的斜率计算得到，并对百分保护值或影响分数制图。浓度分别为：2′，5′-C₃为3.1-100微克/毫升;rIFN-αA为9.8-312.5国际单位/毫升;失配dsRNA为1.6-25微克/毫升。

本发明的详细描述

外源、代谢稳定的2-5A类似物的投药，将对以2-5A通道缺陷为特征的失调症增强保护，特别将对动物和人体中的反转录病毒感染产生保护，这里引用的“2-5A缺陷”是指一种现象状态或2-5A通道的中断。以2-5A缺陷为特征的疾病例如包括：反转录病毒感染，尤其是HTLV感染，特别是HIV感染，慢性疲劳和皮肤T-细胞淋巴瘤;慢性骨髓白血病;急性白血病;癌症;T-细胞白血病;早老性痴呆;帕金森氏病;多发性硬化症;自免疫疾病;以及外科和其它创伤引起的免疫机能障碍。

这种缺陷在例如上述的由慢性病毒感染，免疫细胞缺陷或两者共同引起的失常疾病中是很明显的，2-5A通道缺陷特别表现在以慢性病毒感染和免疫细胞缺陷为特征的疾病中。

通过对2-5A分子上的3′-羟基基团和其它地方作结构修饰，可以使2-5A类似物明显地增加对2′-磷酸二酯酶和细胞核的代谢稳定性，同时又能保持活化RNaseL的能力。通过端部核苷酸的取代而对天然2-5A作类似调整可以获得一种更稳定的分子，由于提高了稳定性，结果使代谢稳定的2-5A类似物更持久，并具有效高的细胞内浓度。

2-5A类似物的持久的药物活性提供了一个更加有利的治疗率。与代谢不稳定的2-5A相比它可以减小给药的频率，由于许多以2-5A通道缺陷为特征的疾病具有长期性质，减小给药频率就显得十分重要。

2-5A类似物对治疗由反转录病毒引起的感染特别有用，与反转录病毒感染有关的2-5A通道缺陷包括由于病毒干扰2-5A合成酶受dsRNA活化而引起的通道失活，如果2-5A合成酶缺乏活化，那么2-5A的产生以及RNaseL的活化就要降低，根据本发明，施用外源、代谢稳定的2-5A类似物可以抵消在2-5A通道中因反转录病毒引起的缺陷。2-5A类似物象真正2-5A一样，均能活化使病毒RNA断裂的RNaseL

2-5A类似物对于保护由各种人类T-细胞白血病病毒（集体性“HTLN”），例如HTLN-Ⅰ，HTLV-Ⅱ，HTLV-Ⅲ和HTLV-Ⅳ引起的感染特别有用，HTLV-Ⅰ引起皮肤下-细胞淋巴瘤;HTLV-Ⅱ引起Sezany淋巴瘤;HTLV-Ⅲ和HTLV-Ⅳ目前被认为是多发硬化症的病原剂。每一种HTLV病毒均是反转录病毒，和“HIV-Ⅰ”一样，已知HTLV-Ⅲ能引起获得性免疫缺陷综合症（“AIDS”，爱滋病），人们还相信该化合物在治疗HIV-2中是有用的，HIV-2是血清学差异的第2种HIV亚型，以后（HIV）就是指HIV-1或HIV-2以及目前或今后为人们所知的其它HIV亚型。

受HTLV感染的病人，特别是受HTLV-1感染的病人已经证明在血液单核细胞中2-5A和/或RNaseL的活性异常地低，与之相反，来自健康个人的血液单核细胞平均来说，表现上较高的2-5A水平，且RNaseL活性很容易观察到，类似地，来自感染慢性疲劳症的个人的血液单核细胞则表现出较低的2-5A水平，且RNA裂解产物显示出新型外观，这种新型RNA裂解产物不同于在正常个人的血液单核细胞中看到的特定裂解产物。

虽然本发明的实践在此被描述为用来治疗通常被看成是一种原型反转录病毒的HIV-1感染，但也可以将本发明的方法用来治疗任何一种其病原因子由一种反转录病毒组成的疾病其它使人受感染的反转录病毒包括例如如前所述的各种非HIV，HTLV病毒。

通过施用外源、代谢稳定的2-5A类似物可以抵消与疾病状态有关的2-5A系统缺陷，从而对以2-5A通道缺陷为特征的各种疾病，尤其是反转录病毒感染，特别是HIV感染进行治疗。

当用作为药物时，可以将2′，5′-寡聚腺苷酸类似物吸收在药用的载体中，用来制备本发明药物组合物的载体可以是有机的或无机的，在性质上可以是固体的或液体的。合适的固体载体包括动物胶、微晶纤维素、乳糖、淀粉和硬脂酸镁。合适的液体载体包括水和醇。例如乙醇、苯甲醇和聚乙二醇、优选的，用于可注射制剂的液体载体包括水、盐水溶液、葡萄糖溶液和苷醇溶液，如含水丙二醇或含水聚乙二醇。配方的性能可以通过添加一种或多种具有某种性能的助剂来提高，例如加入粘度提高剂表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、矫味剂、稳定性提高剂、着色剂、悬浮剂、粒化剂、涂覆剂、分解调节剂、推进剂、乳化剂以及湿润剂。得到的组合物可以是溶液、悬浮液、片剂、胶囊、药膏、酏剂、可注射的组合物以及类似物。

给药剂量取决于感染或疾病的严重程度以及对象的大小及重量，根据疾病的性质以及对象大小、重量，该剂量可以在很宽的范围内变化。根据实例，该化合物可以在水中、磷酸盐缓冲盐水中或其它合适的液体中制成0.1-100毫克/毫升的溶液，也可以制成含有0.01-1克活性化合物的片剂。

该化合物可以以水溶性盐形式施用，药用的水溶性盐包括例如该活性化合物的钠，钾、铵盐，它们很容易溶于水中或盐水溶液中，该配方中可以含有一些附加剂，例如一种糖或蛋白质以保持渗透平衡。

对于患有、或怀疑患有、或容易患有任何一种以2-5A通道缺陷为特征的疾病的动物或人类，可以以0.1毫克到1克的剂量施用2′，5′-寡聚腺苷酸类药物。每天的总剂量例如可以从约0.001克变化到大约1克，当然也可以给于更低或更高的剂量，优选的每日剂量是约0.01克到约0.1克活性成分。该化合物可以通过几种途径中的任何一种施用，包括但不限于：静脉内注射，皮下注射或肌肉内注射以及口服给药。完成这些给药的技术均是医药领域常规的，熟知的。给药频率可一天几次或一周几次，采用静脉内注射尤其是用于治疗HIV时，最好采用含有0.1～1.0毫克/毫升活性组分的溶液。

还可以预料通过局部施用2′，5′-低聚腺苷酸类似物可以治疗以2-5A通道缺陷为特征的任何一种疾病状况有关的皮肤病，可以将足量的，含有一种或多种2′，5′-低聚腺苷酸类似物的制剂覆盖在患处或感染区域，活性试剂的有效浓度从大约10^-3M至大约10^-5M，10^-4M左右更好。

除了用常用载体给药以外，2-5A类似物也可以通过一系列特别的寡聚核苷酸或核酸输送技术来施用，例如通过密封在单层脂质体或重建仙台病毒膜中，或者通过与载体分子如聚（L-赖氨酸）结合。这些方法均公开在普通转让的共同未决定美国专利申请112，591中，其相应的国际专利申请为WO89/03683，该文献的全部公开通过参考被结合在本文中。

2′，5′-低聚腺苷酸类似物可以如下进行化学合成，通过用苯甲酰基闭塞6-氨基位置，用对-甲氧基三苯甲基闭塞5′-位置，3′-位置，可以用叔-丁基二甲基甲硅烷基闭塞，也可以不闭塞，从而制得保护好的腺苷-2′-磷酸二酯。通过用乙酰基、苯甲酰基或叔-丁基二甲基甲硅烷基闭塞2′和3′位置可以制得保护好的核苷酸。适当保护的腺苷-2′-磷酸二酯的制备过程为：向N⁶-苯甲酰-5′-O-（4-甲氧基三苯甲基）腺苷上的3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基-异构-3′-羟基基团中加入叔-丁基二甲基甲硅烷基基团，即用咪唑（在吡啶中）缩合前一种化合物和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯化物的化合物，从而产生3′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基衍生物，用2，5-二氯苯-偶磷三唑化合物（在吡啶中）对该衍生物进行磷酸化即能产生适当保护的腺苷-2′-磷酸二酯。该制备过程被描述在R.Charubala，E.Uhlmann和W.Pfleideres的Liebigs Ann.Chem.，2392（1981）以及R.Charubala，W.Pfleiderer的Tetrahedron Lett.21，4077（1980）中，这些文献通过参考具体地结合在本文中。在一种缩合试剂（它会产生闭塞磷酸盐的功能）存在下，用保护好的核苷与保护好的腺苷-2′-磷酸二酯缩合，从而形成完全保护的二核苷-单磷酸三酯。

用去三苯甲基试剂使所得到的完全保护的缩合物在末端5′位处脱去三苯甲基，并用腺苷-2′-磷酸二酯缩合，如上所述地保护，从而形成一种完全保护的2′，5′三核苷二磷酸双三酯，或2′，5′三聚物核心，然后用适当的去保护试剂处理该完全保护的三聚物核心，从而完全去除保护并转化成2′，5′-三聚物核心。

此外，这些由作为2-5A合成酶底物的，从核苷酸形成的2′，5′-寡聚腺苷酸类似物也可以通过酶催化制得，例如根据美国专利4，464，359中所述的方法，该文献通过参考结合入本文。

三聚物核心2′，5′-A-A-ara-A的制备过程在Engles J.，Tetrahedron Lett.21，4339（1980），中报道，该文献通过具体结合在本文中，由此用喹啉-8-磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑作偶联剂，用完全保护的N⁶，3′-O-二苯甲酰基-5′-O-三苯甲基腺苷酰（2′-O-三溴乙基-5′）N⁶3′-O-二苯甲酰基腺苷-2′-（三溴乙基氰基乙基磷酯缩合核苷N⁶，2′-O-，3′-O-三苯甲酰阿糖-呋喃腺苷。通过用三氟化硼/甲醇进行脱三苯甲基过程，然后对三溴乙基部分进行电化学解保护。（CH₃CN，Hg池，在阳极电解液中的NaHCO₃）从而使得到的三聚物三酯进行最后的脱保护。用丁铵/甲醇使该二酯物脱去苯甲酰，从而形成腺苷酰-（2′，5′）腺苷酰（2′，5′）9-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤。

2′，5′-I₃的制备过程描述在Charubala等人的Tetrahedran Lett 23 4789（1982）中，通过参考，该文献被具体结合在本文中。

三聚物核心2′，5′-木-A₃和四聚物核心2′，5′-木-A₄的制备过程描述在Grosselin，G和Imbach，J.L.的Tetrahedron Lett.22，4699（1981）中，该文献通过参考被结合在本文中。由此，可以通过下列方法合成三聚物和四聚物核心木-A₃和木-A₄：用叔-丁基二甲基甲硅烷基氯化物处理N⁶-3′-O-二苯甲酰基化的木呋喃糖，从而产生N⁶-3′-O-二苯甲酰基化的木呋喃糖的甲硅烷化衍生物，用甲醇钠脱去该衍生物的苯甲酰基，形成了2′-甲硅烷基衍生物，用单甲氧基三苯甲基基团保护该2′-甲硅基衍生物上的原始羟基，并将所得到的5′-三苯甲基化-2′-甲硅烷基衍生物与等摩尔当量的苯甲酸酐（溶于吡啶中）在4-二甲基氨基吡啶存在下进行反应，从而产生N⁶和3-O-苯甲酰基化-5′-三苯甲基化-2′-甲硅烷基化衍生物，用氟化四丁铵除去叔-丁基二甲基甲硅烷基基团就可以得到N⁶和3-O-二苯甲酰基化-5′-三苯甲基化衍生物，随后使该衍生物苯甲酰化，脱去三苯，结果产生N⁶，2′，3′-O-三苯甲酰木腺苷。

将前面的N⁶和3-O-二苯甲酰化-5′-三苯甲基化衍生物与过量的O-氯苯-磷-二-（1，2，4-三唑）在乙腈-吡啶混合物中进行反应然后再与含水三乙胺反应，结果形成了2′-磷酸三酯，用N⁶，2′，3′-O-三苯甲酰木腺苷在1-1，3，5-三甲基苯磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑存在下与该磷酸三酯缩合，从而产生完全保护的二核苷磷酸三酯，然后用对-甲苯磺酸在氯仿和甲醇的混合物（4∶3）中处理该产物使之脱去三苯甲基，将脱去三苯甲基的产物的磷酸三酯进行最后缩合，并用硅胶色谱法进行纯化，结果产生完全保护的三核苷二磷酸三酯（三聚物核心闭塞体）通过用四甲基胍盐-顺-4-硝基苯甲醛肟、氨水和80%乙酸处理该保护好的三聚物核心，即可以获得完全解除保护的三聚物核心。

ENHA的制备过程可以根据EVans等人在J.Am Chem.Soc.92：4751（1970）中所述的工艺进行，然后与适当保护的腺苷缩合，并如前所述地进行保护，缩合和解除保护，结果形成2′，5′-EHNA-A-A，用同样方式，可以由dCF和腺苷制得2′，5′-C-C-dCF.dCF的制备方法列于美国专利US 3，923，785和Backer等人的J.Am.Chem.Soc 101：6127（1979）中，这两篇文献均通过参考结合在本文中。类似地用同样方法通过缩合由市场上买到的5，6-二氯苯并咪唑核糖（Sigma目录，No.D5893）可以制得2-5A类似物5，6-二氯苯并咪唑基-（2′，5′）5，6-二氯苯并咪唑基-（2′，5′）5，6-二氯苯并咪唑核苷。

用于实施本发明的2′，5′-寡聚腺苷酸类似物的制备在下列非限制性实施例中被说明。

例1

结构被修饰了的2′，5′-腺苷酸三聚物核心的制备

通常以下列方式制备各种结构修饰了的新型2′，5′-腺苷酸三聚物核心类似物

按照Charubala，R.Uhlmann.E.和Pfleiderer，W.在Liebigs Ann.Chem.，2392（1981）中和Char-ubala R.，Pfleiderer.W.，在Tetrahedron Lett，21 4077（1980）中所述的方法，由腺苷或虫草品制备一毫摩尔适当保护了的，具有反应剂（Ⅰ）通式的腺苷-2′-磷酸二酯。适当保护的腺苷-2′-磷酸二酯的例子由列于表1中的化合物

1和2代表。

表1

化合物名称化合物编号 R R′

吡啶嗡N⁶苯甲酰-3′-O-

-叔-丁基二甲基甲硅烷基-5′ 1 OSiTBD 2-氯苯

-O-对-甲氧基三苯甲基腺苷

-2-（2-氯苯）-磷酸酯

吡啶嗡N⁶-苯甲酰-5′-O-

-对-甲氧基三苯甲基-3′-脱 2 H 2-氯苯

氧腺苷-2′-（2-氯苯）-磷

酸酯

将反应剂（Ⅰ）和具有原反应剂（Ⅱ）通式的保护好的核苷结合起来，反应剂（Ⅱ）以列于表2中的化合物3-9为例

表2

化合物

化合物名称编号 R R′ X

N⁶-苯甲酰基-2′，

3′-2-O-叔-丁 3 OSiTBD SiTBD N

基二甲基甲硅烷基-腺

苷

N⁶，2′-O-二苯甲

酰基-3′-脱氧腺苷 4 H BZ N

N⁶-苯甲酰基-2′

-O-乙酰基-3′- 5 H AC N

脱氧腺苷

N⁶，2′－0－二苯甲

酰基－3′－0－正一戊 60－正－C₅H₁₁BZ N

基腺苷

N⁶，2′－0－二苯甲

酰基－3′－0－正一 70－正－C₇H₁₅BZ N

庚基腺苷

N⁶－笨甲酰基－2′－

O－叔－丁基二甲基甲 8 NHCOOCH₂CH₂

NO₂SiTBD N

硅烷基－3′一对一硝

基苯一乙氧基羰基氨基

－3′－脱氧腺苷

2′.3′一二－O－叔

一丁基一二甲基甲硅烷 9 OSiTBD SiTBD N

基一杀结核菌素

化合物3和9的制备过程如下：用单甲氧基三苯甲基氯化物（在吡啶中）处理N⁶-苯甲酰基化的腺苷，从而产生5′-单氧基三苯甲基衍生物，用叔-丁基二甲基甲硅烷基氯（在吡啶和甲基咪唑的混合物中）处理该衍生物，形成N⁶-苯甲酰基-2′，3′-二-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基-5′-单甲氧基三苯甲基腺苷，用乙酸除去三苯甲基基团，结果产生化合物3。化合物9可以用N⁶-苯甲酰基化杀结核菌素起始类似地合成得到。这些制备方法已在Charubala等人的Liebigs Ann.Chem.2392（1981）中描述。

化合物4的制备过程如下：用单甲氧基三苯甲基氯处理N⁶-苯甲酰基化的3′-脱氧腺苷，从而产生N⁶-苯甲酰基-5′-O-单甲氧基三苯甲基-3′-脱氧腺苷，通过用苯甲酰氯使2′-羟基基团苯甲酰基化，随后再用80%乙酸进行30分钟脱三苯甲基，将上述产物转化成N⁶-2′-O-二苯甲酰基-3′-脱氧腺苷，在Tetrahedron Lett 21，4077（1980）中，描述了该制备方法。

化合物5的制备过程如下：在吡啶中，用叔-丁基二苯氯硅烷将N⁶-苯甲酰腺苷转化成5′-甲硅烷基化腺苷，用原乙酸三乙酯，然后用三氟化硼/乙醚和碘化钠（在CH₃CN中）处理（0℃，1小时），该5′-甲烷基化腺苷，结果产生3′-碘乙酰基衍生物，再用三丁基氢化锡在甲苯中，80℃处理1小时，以及用氟化四丁铵（在四氢呋喃中）进行脱甲硅烷基，将该碘乙酰基衍生物转变成化合物5，该制备方法在Engles.J.的Teterahedron Lett.21 4339（1980）中已描述，该文献被参考结合在本文中。

化合物6和7的制备过程如下：用三苯甲基氯在吡啶中处理N⁶苯甲酰基腺苷并回流2小时，用氯仿萃取以分离出N⁶-苯甲酰基5′-三苯甲基腺苷。通过用硫酸钠干燥除去氯仿相中的水，利用制备性硅胶薄层色谱（在氯仿/乙醇中）分离出N⁶-苯甲酰基-2′，5′-二-O-三苯甲基腺苷和N⁶-苯甲酰基-3′，5′-二-O-三苯甲基腺苷，分别用正-戊基氯和正-庚基氯处理分离出的化合物（在氢氧化钠在甲苯中的悬浮液中回流）就可以制得化合物6和7，通过在乙酸中加热回流，随后加入乙醚和水使该溶液中和，其反应产物用氯仿萃取，然后用氯仿∶甲醇（4∶1）在硅胶平板上进行薄层层析，通过在乙酸中回流加热1小时，冷却，用乙醚萃取，然后再浓缩，冷却除去三苯甲基和苯甲酰基基团，从而产生晶体化合物6和7，该制备方法可以根据Blank.H.U.Franne.D.，Myles，A和Pfleiderer，W.，在Justus Liebigs Ann.Chem.742，34（1970）中所述的方式进行，该文献被参考结合在本文中。

化合物8的制备如下：将1毫摩尔3′-氨基-3′-脱氧腺苷与1.2毫摩尔1-甲基-3-硝基苯乙氧基-羧基咪唑鎓氯在二甲基甲酰胺中反应，然后加入六甲基二硅氮烷以封闭2′，5′和6-氨基位置，在室温下将在吡啶中的1.1毫摩尔苯甲酰氯加入，结果产生保护好的N⁶-苯甲酰基2′，5′-二甲硅烷基腺苷，将反应混合物倒入甲醇-NH₃中以除去2′和5′甲硅烷基基团将它与MMTr氯化物在吡啶中反应，产生5′-MMTr衍生物，然后向该5′-MMTr衍生物中加入叔-丁基二甲基甲硅烷基氯（在吡啶和1-甲基咪唑的混合物中），并象例1中那样脱去5′-三苯甲基，结果形成了化合物8。

将反应剂（Ⅰ）和反应剂（Ⅱ）结合起来可以制得具有二聚物（Ⅲ）通式的中间物，其制备过程如下：将0.95毫摩尔反应剂（Ⅱ）和缩合剂2，4，6-三异丙基甲苯磺酰氯（2毫摩尔）和1-甲基咪唑（6毫摩尔）结合在一起并在室温下搅拌1小时，加入30毫升含水磷酸盐缓冲剂（pH7），停止反应，用150毫升氯仿进行萃取，用50毫升水将该氯仿物冲洗两次，并在硫酸钠上干燥1-2小时，然后过滤，将该氯仿液蒸发至较少体积然后放到硅胶柱（20×2.5厘米）上进行纯化，先用氯仿，然后用氯仿/甲醇（99/1，容积/容积）进行色谱分析以提洗该完全保护的二核苷单磷酸三酯，从而产生了通式如（Ⅲ）的二聚物，经过蒸发即能得到二聚物（Ⅲ）的固体泡沫体，二聚物（Ⅲ）以表3中化合物10-17为代表。

将1毫摩尔完全保护的二聚物（Ⅲ）室温下在20毫升的2%对-甲苯磺酸在二氯甲烷/甲醇中（4/1，容积/容积）搅拌30分钟以脱去三苯甲基，加入20毫升磷酸盐缓冲液（pH7），然后用200毫升二氯甲烷萃取几次，用水冲洗其有机相，通过硫酸钠干燥，蒸发至较小体积，然后放到硅胶柱（20×2.5厘米）上进行提纯，先用氯仿（400毫升），然后用氯仿/甲醇（98/2容积/容积）进行提洗，蒸发其主要组分获得产率为80-90%的脱去三苯甲基的二核苷单磷酸三酯（二聚物（Ⅲ）），以表3中化合物18-25为例。

由5′-脱去三苯甲基的二聚物（Ⅲ）可以如下制得完全保护的，以下面表4中的化合物26-34为代表的，具有三聚物（Ⅳ）通式的2′，5′-三核苷二磷酸双三酯。

以3毫摩尔2，4，6-三异丙基甲苯磺酰氯和9毫摩尔1-甲基咪唑作为缩合剂，用1毫摩尔5′-脱去三苯甲基的二聚物（Ⅲ）（化合物18-25）在10毫升无水吡啶中缩合1.05毫摩尔起始腺苷-2′-磷酸二酯（反应剂（Ⅰ）），按上面所述的方式在2小时以后完成，用磷酸盐缓冲剂停止反应，然后用二氯甲烷进行萃取，并以氯仿以及氯仿/甲醇（99/1～98/2，容积/容积）进行硅胶层析，结果产生70～90%完全保护的三聚物（Ⅳ）（化合物26-34），它是一种色谱纯净的非晶形粉末。

可以将该完全保护的2′，5′-三核苷二磷酸双三酯，三聚物（Ⅳ）解除保护以形成三聚物核心（Ⅴ），其过程如下。

用0.073克对-硝基苯甲醛肟和0.07克四甲基胍的溶液在2毫升双噁烷水中（1/1，容积/容积）将0.01毫摩尔三聚物（Ⅳ）在室温下处理16小时，从而使O-氯苯基团去保护，在蒸发至干并和水共蒸发四次以后，加入20毫升浓氢氧化氨，将该溶液在室温下搅拌2天，从而使乙酰基团去保护，将该溶液再次蒸发，将其残留物溶解于25毫升水中并用氯仿冲洗四次，每次用10毫升将其水层蒸发至干燥并与无水吡啶（每次10毫升）共蒸发10次，然后用2毫升，0.5M无水氟化四丁铵在无水吡啶的溶液中将该残留物处理16小时，从而除去叔-丁基二甲基甲硅烷基基团，蒸发后，用5毫升，80%乙酸在室温下将残留物处理6小时，从而使对一甲氧基三苯甲基基团断裂，将溶液再次蒸发，将残留物溶解在15毫升水中，并用氯仿（每次5毫升）萃取4次，将含水层蒸发，并和水共蒸发若干次，直到乙酸气味消失，将其残留物溶解在10毫升水中，并加到DEAE-Sephadex A-25柱（60×1厘米）上用梯度为0.001～0.5M的碳酸氢三胺进行离子交换层析，将其主要组分蒸发，然后和水共蒸发若干次，将该水溶液冷冻干燥分离出三聚物核心（Ⅴ），一种完全脱保护的2′，5′-三核苷二磷酸酯，得到70～90%的非晶形固体，表5中化合物35-45代表了三聚物核心（Ⅴ）。

表5

化合物名称化合物号

R R¹R²R³X

2′，5′-A-A-C 35 H OH OH H N

2′，5′-C-A-C 36 H H OH H N

2′，5′-A-A-Tu 37 H OH OH OH CH

2′，5′-A-A-A- 38 H OH OH O-n-C₆H₁₁N

3′-O-戊基

2′，5′-A-A-A- 39 H OH OH O-n-C₇H₁₆N

3′-O-庚基

2′，5′-A（Si）- 40 H OSiTBD OSiTBD OH N

A（Si）-A

2′，5′-C-C-A 41 H H H OH N

2′，5′-A-C-C 42 H OH H H N

2′，5′-A-A- 43 H OH OH NH₂N

3′-氨基

2′，5′-三苯甲基-A₃44 MMTr OH OH OH N

2′，5′-三苯甲基-C₃45 MMTr H H H N

2′，5′-C-C-C- 46 H₂O₃P H H H N

5′-单磷酸酯

例2

3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基腺苷酰基（2′，5′）3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基腺苷酰基（2′，5′）腺苷的制备

除了省去用氟化四丁铵作处理以解除保护的步骤以外，按照例1中所述的工艺处理0.01毫摩尔N⁶-苯甲酰基-3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基-5′-O-对甲氧基三苯甲基腺苷酰基（2′-O-氯苯基-5′）N⁶-苯甲酰基-3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基腺苷（2′-O-氯苯-5′）N⁶，2′-O-3′-O-三苯甲酰腺苷（化合物31，表4），从而得到2′，5′-A（si）-A（si）-A（化合物40，表5）

例3

腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-氨基-3′-脱氧腺苷的制备

根据例1中所述的解除保护过程处理0.01毫摩尔N⁶-苯甲酰基-3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基-5′-O-对甲氧基三苯甲基腺苷酰（2′-O-氯苯基-5′）N⁶-苯甲酰基-3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基腺苷酰基（2′-O-氯苯基-5′）N⁶-苯甲酰基-2′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基-3′-对-硝基苯乙氧基羰基氨-3′-脱氧腺苷（化合物34，表4）其中对-硝基苯乙氧基羰基基团和甲硅烷基基团在β-消除过程中被氟化四丁铵同时裂解，以后经过脱羧基，就能产生2′，5′-A-A-3′-氨基（化合物43，表5）

例4

5′-O-对-甲氧基三苯甲基腺苷（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）腺苷的制备过程

按照Charubala，R.，Uhlmann，E.，和Pfleiderer，W.，在Liebigs Ann Chem.，2392（1981）中所述的方法制备0.01毫摩尔N⁶-苯甲酰基-3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基-5′-O-对-甲氧基三苯甲基腺苷酰基（2′-O-氯苯-5′）N⁶-苯甲酰基-3′-O-叔-丁基二甲基甲硅烷基腺苷酰基（2′-O-氯苯-5′）N⁶，N⁶-2′-0，3-O-四苯甲酰基腺苷，然后按照例1所述的解除保护方法（除了省去最后一步乙酸处理以外）处理上述产物，将产物2′，5′-三苯甲基-A₃（化合物44，表5）分离，用DEAE-Sephadex A-25色谱法提纯，并冷冻干燥，从而形成非晶形粉末状纯净化合物44，产率为85%

例5

5′-O-对-甲氧基三苯甲基-3′-脱氧腺苷酰（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰（2′，5′）3′-脱氧腺苷的制备

根据Charubala，R.，和Pfleiderer.W.在Tetrahedron Lett.21，4077（1980）中所述的方法制得0.01毫摩尔N⁶-苯甲酰基-5′-O-对-甲氧基三苯甲基-3′-脱氧腺苷酰基（2′-O-氯苯-5′）N⁶-苯甲酰基-3′-脱氧腺苷酰（2′-O-氯苯-5′-）N⁶，N⁶，2′-O-三苯甲酰基-3′-脱氧腺苷，然后按照例1中所述的解除保护方法（除了省去了用氟化四丁铵和乙酸处理的步骤以外）处理上述产物，将产物2′，5′-三苯甲基-C₃（化合物45，表5）分离，用DEAE-Sephadex A-25色谱法进行提纯并冷冻干燥，从而得到非晶形纯净化合物。

本发明三聚物核心分子的5′-单磷酸酯可以由完全保护的2′，5′-三核苷二磷酸双三酯通过如例1中所述的脱三苯甲基过程，随后再与二-对硝基苯-乙基磷酰氯反应来制得，经过例1中所述的萃取、层析及除保护就会得到5′-单磷酸三聚物的分离物。该制备过程以例6中的方法为例。

例6

5′-O-磷酰-3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷的制备

0.1毫摩尔N⁶-苯甲酰基-5′-O-对-甲氧基三苯甲基-3′-脱氧腺苷酰（2′-O-氯苯-5′）N⁶-苯甲酰基-3′-脱氧腺苷酰基（2′-O-氯苯-5′）N⁶，N⁶，2′-O-三苯甲酰基-3′-脱氧腺苷的制备过程如下：由3′-脱氧腺苷通过苯甲酰基化，5′-甲苯磺酰化以及2′-磷酰化，用三异丙基甲苯磺酰基-硝基-1，2，4-三唑处理其反应产物N⁶-苯甲酰基（2-三乙基氨-O-氯苯磺酰基-5）-5′-甲苯磺酰基-3′-脱氧腺苷和2′-氰基乙基磷酰基-O-氯苯-3′-脱氧腺苷从而形成二核苷磷酸三酯，N⁶-苯甲酰基（2-O-氯苯磷酰基-5）3′-脱氧腺苷，用N⁶，2′-O-二苯甲酰基-3′-脱氧腺苷缩合由此形成的完全保护的二聚物，从而形成三聚物，根据Charubala R.和Pfleiderer，W.在Tetrahedron Lett.21 4077（1980）中所述的方法制得0.01毫摩尔该三聚物，并用2毫升，2%对-甲苯磺酸溶液在二氯甲烷/甲醇中，（7/3，容积/容积）在室温下处理30分钟以除去对-甲氧基三苯甲基基团，在制备平板上用氯仿/甲醇（95/5容积/容积）进行硅胶色谱法提纯，从而得到90%产率的5′-解除保护的类似物。

将该产物溶解于1毫升无水吡啶中，并用0.27毫摩尔二-硝基苯-乙基-磷酰氯以Himmelsbach，F.和Pfleiberer，W.在Tetrahedron Lett.23，4973（1982）中所述的形式在室温下处理1小时，在用15毫升氯仿稀释后，用磷酸盐缓冲液（pH7）将该反应混合物萃取三次，将其有机层用Na₂SO₄干燥，过滤、蒸发并和10毫升甲苯共蒸发，重复三次，将其残余物在制备平板上进行硅胶色谱提纯（在氯仿/甲醇中，9/1容积/容积）从而产生81%的5′-O-双-对-硝基苯乙基磷酰基-N⁶-苯甲酰基-3′-脱氧腺苷酰基-（2′-O-氯苯-5′）N⁶苯甲酰基-3′-脱氧腺苷酰基（2′-O-氯苯基-5′）N⁶，2′-O-三苯甲酰基-3′-脱氧腺苷它是一种非晶形固体。

根据例1中所述的解除保护方法用O-硝基苯甲醛肟处理0.01毫摩尔上述最后的物质，从而除去O-氯苯保护基团。在蒸发至干燥并和无水吡啶共蒸发若干次后，将该去除保护的产物溶解于10毫升、0.5M的二氮二杂环〔4，3，0〕十一碳烯在无水吡啶中的溶液中，并在室温下搅拌36小时，从而通过β-消除使对-硝基苯乙基基团断裂，将其溶液再次蒸发，然后用20毫升浓氢氧化氨在室温下处理24小时，通过DEAE-Sephadax层析并对主要组分进行冷冻干燥可以使三聚物核心5′-单磷酸酯（化合物46，表5）提纯及分离。

本发明的四聚物核心分子可以通过以下的例7或例8中的方法来制得。

例7

腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷的制备

将0.5毫摩尔完全保护的、具有化学式（Ⅵ）的化合物47和0.4毫摩尔N⁶-苯甲酰基-3′-脱氧腺苷酰基（2′-O-氯苯-5′）N⁶，2′-O-二苯甲酰基-3′-脱氧腺苷（化合物24，表3）溶解在5毫升无水吡啶中。

在加入1毫摩尔2，4，6-三异丙基苯磺酰基氯和3毫摩尔1-甲基咪唑以后，将混合物在室温下搅拌2小时，将其溶液用400毫升氯仿稀释，用400毫升水冲洗两次，然后将其有机层用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干，其残留物用50毫升甲苯共蒸发两次，先用氯仿，后同氯仿/甲醇（99/1-98/1，容积/容积）梯度在硅胶柱（20×2.5厘米）进行色谱法提纯，蒸发后，主要组分能产生固体泡沫体状化合物48（表6），产率为80%化合物48是一种完全保护的，如下列四聚物核心（Ⅶ）通式的2′，5′-四核苷三磷酸三三酯，按照例1中所述的方法将保护基团解除，即能产生2′，5′-A-A-C-C（化合物49，表6）经DEAE Sephadex色谱法，蒸发及冷冻干燥，结果以80%的产率产生非晶性固体。

表6

化合物编号 R R¹R²R³

48 Bz MMTr SiTBD 2-氯苯基

49 H H H H

例8

3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷的制备

将0.1毫摩尔N⁶-苯甲酰基-5′-O-对-甲氧基三苯甲基-3′-脱氧腺苷酰基（2′-O-氯苯-5′）N⁶-苯甲酰基-3′-脱氧腺苷酰（2′-O-氯苯-5′）N⁶，N⁶，2′-O-三苯甲酰基-3′-脱氧腺苷（化合物50，表7），一种完全保护的，如反应剂（Ⅷ）通式的2′，5′-三核苷二磷酸双三酯用2毫升，2%对-甲苯磺酸的二氯甲烷/甲醇（4/1，容积/容积）溶液在室温下处理30分钟。

表7

化合物号 R

50 MMTr

51 H

加入20毫升磷酸盐缓冲剂（pH7）停止反应，将该溶液用200毫升氯仿萃取若干次，将有机层用水洗，通过硫酸钠干燥，过滤并蒸发至较小体积，从而在制备硅胶平板上用氯仿/甲醇，（95/5，容积/容积）进行提纯。用氯仿/甲醇，（4/1，容积/容积）提洗其主带，从而在蒸发后产生5′-去除三苯甲基的化合物51（表7），产率为80%。

然后用0.1毫摩尔吡啶鎓N⁶-苯甲酰基-5′-O-对-甲氧基三苯甲基-3′-脱氧腺苷-2′-（2-O-氯苯）磷酸酯（化合物2，表1）在0.6毫升无水吡啶中，在0.2毫摩尔2，4，6-三异丙基甲苯磺酰氯和0.6毫摩尔1-甲基咪唑存在下将0.05毫摩尔化合物51（表7）在室温下缩合2小时，用100毫升氯仿稀释该溶液，并用水洗两次，通过硫酸钠干燥并蒸发至较小容积，在制备硅胶平板上用氯仿/甲醇（95/5，容积/容积）进行分离，用氯仿提洗其主带。经蒸发即能产生完全保护的2′，5′-四核苷三磷酸三三酯化合物52（表8，如后），它是一种非晶性固体，产率为84%。

根据例1中所述的方法除去化合物52上的封闭基因，随后进行DEAE-Sephadex色谱法并冷冻干燥，结果产生四聚物核心2′，5′-C-C-C-C（化合物53，表8）以70%的产率得到一种非晶性固体，化合物53的结构如四聚物核心（Ⅸ）通式。

从完全保护的2′，5′-四核苷三磷酸三三酯通过例1中所述的5′-脱三苯甲基方法，然后再与二-对-硝基苯乙基磷酰氯反应可以制得本发明四聚核心分子的5′-O-单磷酸酯，经过如例1中所述的萃取、色谱法、解封即能使5′-O-单磷酸酯四聚物分离。

该制备过程举例于上面的例6中。

表8

化合物号 R R¹R²

52 Bz MMTr 2-氯苯基

53 H H H

本发明三聚物和四聚物核心分子的5′-二磷酸酯和5′-三磷酸酯可以如下制备：在1毫升的二甲基甲酰胺中的成为无水三丁铵盐形式的0.1毫M单磷酸酯化核心以及0.5毫M1.1-羰基二咪唑中加入0.5毫M溶解于5毫升二甲基甲酰胺中的焦磷酸三丁铵，室温下20小时以后，用5毫升甲醇处理该反应物，蒸发至干并在2×20厘米DEAE纤维柱上进行色谱层析，随着三乙铵碳酸氢盐线性梯度（0-0.4M，3升，pH为7.5）分离5′-双和三磷酸酯，该方法在Hoard，D.E.和Ott，D.G.，在J.Amer.Chem.Soc.87，1785-1788（1965）中描述了，该文献通过参考被结合在本文中，然后通过DEAE-Sephadex A25和Sephadex G-10色谱，将5′-双磷酸酯和5′-三磷酸酯提纯。

通过对2′，5′-寡聚腺苷酸分子上的2′-端核苷、糖苷配基和/或核糖基部分作结构修饰，可以提供能有效抑制病毒复制，尤其是反转录病毒如HIV复制的分子，这些合成分子比天然存在的2′，5′-寡聚腺苷酸分子更具有生物学活性，代谢上更稳定。

本发明化合物的抗反转录病毒活性可以通过下列实验方法来证实，在这些方法中，本发明的任何一种核心化合物或它们的5′-单，-双-，或三磷酸酯对应物可以代替下列实验中的任意一种类似物，具有本说明书中对这样一些化合物所公开的功效。

根据下列实验，可以看到2′，5′-寡聚腺苷酸类似物能在体外明显抑制HIV-1反转录酶活性并保护靶细胞免受HIV-1感染。

例9

体外抑制HIV-1反转录酶活性

细胞和病毒。用高HIV-1允许的T-细胞系MT-2的细胞（Miyoshi等人，nature 294：770-771（1981））作为HIV-1（HTLV-Ⅲ_B）感染过的靶细胞HIV-1（HTLV-Ⅲ_B）是在H9细胞中产生的（Popovic等人，Science 224：497-500（1984）），将原种培养物生长，维持在含有12%热未活化的母牛血清和50微克艮他霉素/毫升的RPMI-1640中，并在37℃下培养，这项研究中给出的感染多重性（即感染的病毒粒子/细胞）的病毒滴度可以由50%组织培养感染剂量值计算得到，该剂量值可以通过在MT-2细胞上进行终点微滴定获得（如Montefios等人在J.Clin.Microbiol.26：231-235（1987）中所述）反转录酶分析测定，将无细胞（0.45微摩尔过滤过的）调节的H9/HTLV-Ⅲ_B培养物上清液，通过在Beckman JA-20转子中以18，000转/分钟在20℃下离心4小时，使病毒浓缩。将从50毫升调节过的培养物液体获得的病毒粒子溶解在0.5毫升含有1.7克摩尔Tris-Hcl（pH7.8）3毫摩尔二硫苏糖醇（DTT），55毫摩尔Kcl，0.32%重量/容积三硝甲苯X-100和33%甘油的溶液中，将该病毒溶胞产物贮藏在-20℃下并用作为HIV-1反转录酶源，加入10微升酶以后，反转录酶反应在100微升反应体积中进行，该反应体积中含有40毫摩尔Tris-Ncl（（pH7.8），4毫摩尔DTT，50毫摩尔Kcl，10毫摩尔MgCl₂，0.0325%重量/容积三硝基甲苯X-100，3微摩尔〔³3H〕DTTP（80居里/毫摩尔，NEN）以及聚（A）、（dT）₁₅（2.5微克/毫升）样板始物，在调节水体积使反应体积保持不变以后，以不同浓度加入抑制剂，在潮湿环境中，将反应物在37℃下培养1小时，加入2毫升，10%冷三氯乙酸停止反应在0.45微米乙酸纤维素微孔滤器上收集其沉淀物，然后将它溶解在10毫升3a70B含水闪烁体中，并用Beckman LS6800液体闪烁分光剂计算其每分钟计数。

感染测定.通过体外微滴度感染测定，（如Montefior等人，同上面文献中所述）可以观察到并定量测定各种化合物的抗-HIV-1的活性。简而言之，即将MT-2细胞一式三份加入到96孔、含有2倍连续稀释效应物的微稀释平板中。加入病毒，使之大量感染HIV-1，将该平板在潮湿的5%CO₂/空气的环境中于37℃下培养4天，然后通过聚-L-赖氨酸粘滞细胞的活体染色（中性红）吸收定量测定的活的细胞数，作为细胞致病效果的测量。此时，病毒对比孔（没有效应物存在的细胞和病毒）中细胞溶解量高于90%;百分保护值由发生在细胞对比孔（没有病毒和效应物存在的细胞）和病毒对比孔之间的A₅₄₀读数范围确定。

细胞毒性测定.细胞毒性可以用MT-2细胞在微孔稀释板中如上所述地进行定量测定，除了其中省去了病毒并且用空（空白）孔代替病毒对比孔以外。居于细胞对比孔和空白孔之间的A₅₄₀读数范围可以被用来计算经过3天培养后试验孔中存活细胞的百分数。

2-5A类似物对HIV-1反转录酶活性的作用示于表9和图1中，例如用2′，5′-虫草品三聚物核心（C₃），三聚物5′-单，双，和三磷酸酯（PC₃，P₂C₃，P₃C₃），2′，5′-虫草品四聚物5′-单磷酸酯（PC₄），还有2′，5′-A-C-A。可以看到取决于浓度的酶活性的抑制作用，（图1）。2′，5′-虫草品三聚物5′-三磷酸酯（P₃C₃）是最有效的抑制剂（60微摩尔时100%抑制），其次是5，6-二氯苯并咪唑核苷2′，5′-三聚物（200微摩尔时73%抑制），2′，5′-PC₄（100微摩尔时58%抑制），2′，5′-A-A-ara-A（200微摩尔时53%抑制），2′，5′-A-C-A（200微摩尔时50%抑制）（表9）

表9

2-5A类似物对HIV-1反转录酶活性的作用

2-5A或2′，5′类似物浓度（微摩尔）百分抑制^a

（腺苷）A 400 0

A₃200 0

pA₃200 29

p₃A₃200 0

虫草品（C） 400 0

C₃200 31

pC₃200 5

p₃C₃60 100

C₄200 39

pC₄100 58

A-C-C 200 42

A-A-C 200 16

C-A-C 200 36^b

A-C-A 200 58

A-A-C-C 200 35^b

A-A-C-A 200 7

pI₃200 35

A-A-ara-A 200 53

Tu-Tu-Tu 200 41

xylo-A₄200 15

A-A-A-3′-氨基 200 43

EHNA-A-A 200 36

5，6-二氯苯并咪唑基（2′，5′）- 200 73

5，6-二氯苯并咪唑基（2′，5′）-

5，6-二氯苯并咪唑核苷

a.对比反应值（即没有抑制剂存在时）高于180，000cpm.而空白反应（无酶存在）值低于12，000cpm。

b.两次或两次以上实验的平均值。

图2中表示了用某种2-5A类似物进行感染测定的结果，参照图2，可以看到2′，5′-虫草品三聚物核心（Ⅰ）和5′-单磷酸酯（Ⅳ）（外源浓度为8-250微摩尔）以及2′，5′-A-C-A（Ⅴ）（外源浓度为1-8微摩尔）具有的取决于浓度的抗HIV-1活性，由失配dsRNA（数据未示出）提供的最佳抗HIV-1活性分别为84%，80%和81%。这是相当明显的抗HIV活性，由此我们可以认为该失配dsRNA是一种有效的体外抗-HIV药物，参见Montefior等人，Proc.natl.Acad.Sci.USA 84：2985-2989（1987）。2′，5′-PC₄（Ⅵ）在浓度为12.5-50微摩尔时取决于浓度的抗HIV-1活性效力较低，C₃和A-C-A在最有效浓度时不显出细胞毒性，而PC₃和PC₄在某些最佳抗病毒浓度时具有较弱毒性。

与此相反，虫草品（Ⅰ）（0.31-10微摩尔）和2′，5′-寡聚腺苷酸三聚物核心（Ⅱ）（8-250微摩尔）则不具备抗病毒活性，当虫草品外源浓度高于2.5微摩尔时显示细胞毒性，而2′，5′-寡聚腺苷酸三聚物核心在任何浓度下未观察到毒性。2′，5′-虫草品四聚物5′-单磷酸酯（Ⅵ）在体外具有较弱的抗-HIV-1活性（外源浓度为12.5至50微摩尔时，保护率为30%-38%），但当其浓度高于50微摩尔时则对细胞有毒（数据未列出）

在相同的感染测定中，2′，5′-木-A₄在浓度为150微摩尔时具有100%的抑制（浓度为75微摩尔时为91%），而2′，5′-A-A-A-3′-氨基在浓度为75微摩尔时能100%抑制，在这些剂量下没有观察到毒性。

当与其它药物结合使用时，2-5A类似物的抗-HIV活性能有所增加，这一点可以由下列实验证实。

例10

在本例中将测试2′，5′-C₃对重组α-干扰素（rIFN-αA）和干扰素的失配dsRNA诱导物体外抗病毒活性增效或消效的能力。每一种药物单独或结合地取8种无毒性浓度进行标准格子体分析，用Chou和Talay在Adu.Enzyme Regul.22：27-55（1984）中所述的方法对这些数据进行处理。简而言之，由百分保护值计算结合的药物效果，由剂量一效果曲线的斜率计算出结合指数（CI），并对该百分保护值或影响分数作图，CI值小于1时表示增效，大于1时表示消效，等于1时表示相加，这些结果被表示在图3中2′，5′-虫草品三聚物核心和rIFN-αA以及失配dsRNA在每一种药物剂量最有效时具有强力增效作用，rIFN-αA的增效作用强于失配dsRNA。

针对合成或分析过程引用的所有文献通过参考均结合在本文中。

本发明还可以以其他的特定形式体现而不脱离其实质或基本属性。因此，应该将所附的权利要求书而不是说明书作为本发明的范围。

Claims

1、治疗哺乳动物的以2-5A通道缺陷为特征的失调症的组合物的制备方法，它包括将至少一种化学式为

的化合物或它的一种药用盐与一种药用载体结合，

其中n为1至8的正整数，

m为0，1，2或3，

R，只要所有R在同一化合物中不都是羟基，则每个R可以相同或不同地选自于氢、羟基、氨基，C₁-C₁₀烷氧和-OSi(CH₃)₂C(CH₃)₃。

2、根据权利要求1的方法，其中n为1-3。

3、根据权利要求2的方法，其中2′一端核苷酸上的R基团不是羟基。

4、根据权利要求1，用来治疗反转录病毒感染的方法。

5、根据权利要求4，用来治疗HIV感染的方法。

6、根据权利要求2的方法，其中每个R可以相同或不同地选自于氢和羟基。

7、根据权利要求6的方法，其中化合物选自于3′-脱氧腺苷酰基-（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷，以及5′-单，双，三磷酸酯以及它们的药用盐。

8、根据权利要求7的方法，其中化合物包含5′-三磷酸酯或其药用盐。

9、根据权利要求6的方法，其中化合物是选自于3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷。其5′-单，双，三磷酸酯，以及它们的药用盐。

10、根据权利要求6的方法，其中化合物是选自于：腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷，其5′-单，双，三磷酸酯，以及它们的药用盐。

11、根据权利要求6的方法，其中化合物是选自于：腺苷酰基（2′，5′）-腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷，其5′-单，双，三磷酸酯，以及它们的药用盐。

12、根据权利要求6的方法，其中化合物是选自于：3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷，其5′-单，双，三磷酸酯，以及它们的药用盐。

13、根据权利要求6的方法，其中化合物是选自于腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）腺苷，其5′-单，双，三磷酸酯，以及它们的药用盐。

14、根据权利要求13的方法，其中化合物是包含腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）腺苷或其药用盐。

15、根据权利要求6的方法，其中化合物是选自于：腺苷酰基（2′，5′）-腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰（2′，5′）3′-脱氧腺苷，其5′-单，双，三磷酸酯，以及它们的药用盐。

16、根据权利要求6的方法，其中化合物选自于腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰（2′，5′）腺苷，其5′单，双，三磷酸酯，以及它们的药用盐。

17、根据权利要求5的方法，其中每个R是相同的或不同的，由羟基和氨基中选出。

18、根据权利要求17的方法，其中化合物选自于腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-氨基-3′-脱氧腺苷，其5′-单，双，三磷酸酯，以及它们的药用盐。

19、根据权利要求18的方法，其中化合物是包含腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）3′-氨基-3′-脱氧腺苷，或其药用盐。

20、治疗哺乳动物的以2-5A通道缺陷为特征的失调症的组合物的制备方法，还包括将至少一种下列化合物，或其5′-单，双，三磷酸酯或它们的药用盐中选出的化合物与一种药物载体结合;

3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）-（R）-3′-（2-脱氧-β-D-赤戊呋喃糖基）-3，6-7.8-四氢咪唑〔4，5-d〕〔1，3〕二氮杂草-8-酚。

腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）杀结核菌素。

杀结核菌酰（2′，5′）杀结核菌酰（2′，5′）杀结核菌素。

腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）9-β-D-阿糖呋喃腺苷，

肌苷酰基（2′，5′）肌苷酰基（2′，5′）肌苷，

木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷，

木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷，

赤-9（2-羟基-3-壬基）腺苷酰基（2′，5′）-腺苷酰基（2′，5′）腺苷，

5，6-二氯苯并咪唑基（2′，5′）5，6-二氯苯并咪唑基（2′，5′）5，6-二氯苯并咪唑。

21、根据权利要求20，用来治疗反转录病毒感染的方法。

22、根据权利要求21，治疗HIV感染的方法。

23、根据权利要求20的方法，其中化合物是包含3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）3′-脱氧腺苷酰基（2′，5′）-（R）-3-（2-脱氧-β-D-赤戊呋喃糖基）-3，6，7，8-四氢咪唑〔4，5-d〕〔1，3〕二氮杂草-8-酚，其5′-单，双，三磷酸酯，或它们的药用盐。

24、根据权利要求20的方法，其中化合物包含腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）杀结核菌素，其5′单，双，或三磷酸酯，或它们的药用盐。

25、根据权利要求20的方法，其中化合物包含腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）9-β-D-阿糖呋喃腺苷，其5′单，双或三磷酸酯，或它们的药用盐。

26、根据权利要求20的方法，其中化合物包含肌苷酰基（2′，5′）肌苷酰基（2′，5′）肌苷，其5′单，双，或三磷酸酯，或它们的药用盐。

27、根据权利要求20的方法，其中化合物包含木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷，其5′单，双，或三磷酯，或它们的药用盐。

28、根据权利要求20的方法，其中化合物包含木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷酰基（2′，5′）木腺苷，其5′单，双，或三磷酸，或它们的药用盐。

29、根据权利要求20的方法，其中化合物包含杀结核菌酰基（2′，5′）杀结核菌酰基（2′，5′）杀结核菌素，其5′单，双，或三磷酸酯，或它们的药用盐。

30、根据权利要求20的方法，其中化合物包含赤-9（2-羟基-3-壬基）腺苷酰基（2′，5′）腺苷酰基（2′，5′）腺苷，其5′单，双，或三磷酸酯或它们的药用盐。

31、根据权利要求20的方法，其中化合物包含5.6-二氯苯并咪唑基（2′，5′）5.6-二氯苯并咪唑基（2′，5′）5，6-二氯苯并咪唑核苷，其5′单，双，或三磷酸酯，或它们的药用盐。