CN104039980A

CN104039980A - 精子蛋白作为早期卵巢癌的检测生物标记物

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Publication number: CN104039980A
Application number: CN201280054743.6A
Authority: CN
Inventors: 维基·马丁·卡斯特; 马丽佐·芝里瓦·因特拉提
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2014-09-10
Also published as: EP2756100A2; EP2756100A4; WO2013040071A3; WO2013040071A2; IN2014CN02496A; CA2848578A1; JP2014527816A; US20150110897A1

Abstract

本发明提供一种利用SP17作为生物学标记物来确定患者是否可能或不太可能经历卵巢癌的方法。本发明还提供了用来治疗被识别为具有患卵巢癌风险的患者或被识别为具有较差预后的患者的方法和疗法。

Description

精子蛋白作为早期卵巢癌的检测生物标记物

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2011年9月15日提交的美国临时申请61/535,309号的优先权，该临时申请的内容通过引用被合并至本文中。

背景

在该说明书中，通过识别引用或通过阿拉伯数字引用了许多公开文献、专利和公开的专利说明书。这些引用文献的完整著录项目信息可在参考文献部分找到。所有在本文中引用或通过阿拉伯数字引用的公开文献、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用被合并至本文中，以更完整地描述本发明所属领域的技术状态。

卵巢癌是妇女健康最严重的威胁之一，在女性癌症相关死亡的主要原因中排名第五，在所有的妇科恶性肿瘤相关死亡中排名第二。(1)目前，血清CA125是判别良性和恶性卵巢病变以及检测复发和监测治疗响应的最广泛使用的生物标记物。(2)但是，因为多达50%的早期卵巢癌和10%的晚期卵巢癌具有正常的CA125水平，因此它显示出局限性。(2,3)因为该疾病的致死率在过去十年没有显著变化，因此急切需要用于卵巢癌的诊断和预测的新手段。

能够在早期无症状阶段检测该疾病的实验将会拯救大多数患者，但是虽然付出了很多努力，在这个方面的进步很不够，并且没有证据表明现有的筛选技术降低了卵巢癌死亡率。(5)CA125可用于评价对治疗和复发的响应，但由于其低特异性(约20%，取决于研究)它不适合用于诊断目的。(6-8)在识别卵巢癌新生物标记物方面正投入很大的努力，以期改善CA125实验。(9)迄今为止，没有一个已识别的生物标记物已显示出达到符合它们临床应用所需的敏感度和特异性的水平(9,10)。

发明内容

CA125(MUC16)是卵巢癌中监测疾病和治疗响应的唯一可用生物标记物。申请人之前已表明，SP17是癌/睾丸抗原(CTA)家族的成员，(11)其是潜在的生物标记物，可允许区分正常卵巢和卵巢癌细胞(12,13)并且可在异种移植小鼠模型中追踪卵巢癌疾病。(14)但是，仅有几项研究调查了SP17作为肿瘤生物标记物的潜能和用途(14-18)，没有人评价外周血中SP17的表达。本文中，申请人评价了游离循环血清SP17水平测量值的统计学显著性作为I-IV期卵巢癌患者、良性卵巢病变和健康妇女的预测和诊断工具。基于申请人的研究，发现了肿瘤相关抗原(精子蛋白17(SP17))在卵巢癌中异常地表达，但在正常卵巢组织中却不存在，使得它成为卵巢癌的新的预测和诊断生物标记物。

如将在本文更详细描述的，申请人利用RT-PCR和免疫组化分析了在来自卵巢癌患者、良性卵巢病变和健康对象的初生卵巢组织中的SP17表达。通过ELISA试验测定了相同对象的血清中的SP17水平和CA125水平。根据该项分析，本发明提供一种确定患者是否可能或不太可能经历卵巢癌(即具有患卵巢癌风险)的方法，该方法包括以下步骤，或实质上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：测定从该患者分离的样品中的SP17基因的表达水平，其中SP17基因表达水平的存在或SP17水平高于预定的第一值表示该患者更可能经历卵巢癌，而不存在SP17基因表达或SP17基因表达低于预定第一值表示该患者不太可能经历卵巢癌。在另一个方面，该方法还包括以下步骤，或实质上是由以下步骤组成，或由以下步骤组成：测定从该患者分离的样品中的CA125基因的表达水平，其中SP17水平和CA125水平的存在或SP17和CA125水平高于预定第一值表示该患者更可能经历卵巢癌；而CA125水平的存在或CA125水平高于预定第一值并且SP17水平不存在或SP17水平低于预定第一值表示该患者不太可能经历卵巢癌。

本发明还提供一种确定卵巢癌患者是否可能或不太可能具有较长或较短总生存期的方法，该方法包括以下步骤，或实质上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：测定从该患者分离的样品中的SP17基因的表达水平，其中SP17基因表达水平的存在或SP17水平高于预定的第一值表示该患者更可能具有较短的总生存期，而不存在SP17基因表达或SP17基因表达低于预定第一值表示该患者可能具有较长的总生存期。在另一个方面，该方法进一步包括以下步骤，或实质上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：测定从该患者分离的样品中的CA125基因的表达水平，其中SP17水平和CA125水平的存在或SP17和CA125水平高于预定第一值表示该患者较不可能具有较长总生存期；而CA125水平的存在或CA125水平高于预定第一值并且SP17水平不存在或SP17水平低于预定第一值表示该患者更可能具有较长总生存期。

附图说明

图1A和1B显示原代卵巢癌细胞中的SP17表达。图1A.在不同样品中进行PCR以分析正常卵巢、良性卵巢肿瘤疾病、卵巢癌患者和Skov-3卵巢癌细胞系中SP17的存在状况。睾丸作为内部阳性对照。在睾丸、卵巢癌患者样品和Skov-3细胞系中可检测到阳性条带信号。图1B.不同卵巢样品上的IHC。正常卵巢和良性卵巢肿瘤疾病未被染色，而所有卵巢癌阶段都显示出阳性棕色染色。所给出的图片表示在所有阶段的不同肿瘤。

图2A和2B显示Kaplan-Maier生存曲线。两种标记物的对数秩检验p<0.001。

图3A至3E图示了SP17和CA125测试的诊断表现。A至D显示SP17和CA125的ROC曲线。每组通过z-检验比较SP17的AUC和CA125 AUC。A. SP17 AUC=0.985, CA125 AUC=0.869, z-检验 p=0.047; B. SP17 AUC=0.988, CA125 AUC=0.969, z-检验p=0.992; C. SP17 AUC=0.991, CA125 AUC=0.941, z-检验 p=0.997; DSP17 AUC=0.992, CA125 AUC=0.982, z-检验 p=0.917; E.结合CA125和SP17测试的算法，用于早期检测卵巢癌。

详细描述

除非另有说明，本发明的实施过程中采用常规的分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学技术、细胞生物学技术、生物化学技术和免疫学技术，这些都属于本领域的技术。这些技术在文献中有详尽解释，例如以下公开文献。参见，例如，Sambrook and Russell eds. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第3版 (2001); 系列书籍CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds. (2007)); 系列书籍 METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc., N.Y.); PCR 1: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)); ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1999)); CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (R.I. Freshney 第5版(2005)); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed. (1984)); Mullis et al. U.S. Patent No. 4,683,195; NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (M.L.M. Anderson (1999)); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press (1986)); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller and M. P. Calos eds. (1987) Cold Spring Harbor Laboratory); GENE TRANSFER AND EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS (S.C. Makrides ed. (2003)) IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987)); WEIR’S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (L.A. Herzenberg et al. eds (1996))。

定义

如本文所使用的，某些术语可具有以下定义的含义。如说明书和权利要求中所使用的，单数形式的“一个”和“该”，除非另有明确说明，都包括单个和多数引用。例如，术语“细胞”包括单个细胞或多个细胞(包括其混合物)。

如本文所使用的，术语“包括”是指该组合物和方法包括所引述的内容，但不排除其他内容。当用来定义组合物和方法时，“实质上由…组成”意味着排除对于该组合物或方法具有任何实质性意义的其他内容。“由…组成”对于所要求保护的组合物而言意味着排除高于痕量的其他组分，且意味着排除实质性方法步骤。由每个这些过渡术语定义的实施方式都在本发明的范围内。因此，该方法和组合物可包括额外的步骤和成分(包括)或包括不重要的步骤和组合物(实质上由…组成)或仅指所述及的方法步骤或组合物(由…组成)。

所有数字表示(包括范围值)，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，都是近似值，可上(+)下(-)改变0.1。要理解的是，虽然不总是明确表述，但所有数字表示前都有术语“约”。术语“约”也包括精确值“X”和“X”的些微改变，如“X+0.1”或“X-0.1”。还要理解的是，虽然不总是明确表述，但本文所述的试剂仅是示例性的，其等价物在本领域是已知的。

术语“识别”是将一个患者与一群可能对治疗具有相同或相似临床响应的患者紧密关联或依附。

术语“辅助性”癌症患者是指在通过手术移除肿瘤后施用疗法或化疗方案的患者，通常称辅助性化疗。辅助性疗法通常用来使可能的癌症复发降到最低或防止复发。作为选择，“新辅助性”疗法是指在手术前施用疗法或化疗方案，通常是为了在手术前缩小肿瘤从而使得手术期间移除的组织最小化。

如本文所使用的，术语“患者”是指动物、哺乳动物或人类患者。仅为解释性目的，哺乳动物包括但不限于人、猴、鼠、牛、马、猪或羊。

精子蛋白17(SP17)是高度保守的哺乳动物睾丸和精子中的蛋白，并且已被特征化为多种人恶性肿瘤中的肿瘤相关抗原。

术语“遗传标记物”或“生物标记物”是指感兴趣基因的多态性区域的和/或感兴趣基因的表达水平的等位变体。

术语“野生型等位基因”是指当以两份拷贝存在于对象中时导致产生野生型表型的基因的等位基因。特定基因可具有几种不同的野生型等位基因，因为基因中的某些核苷酸变化可能不影响具有两份拷贝的含核苷酸变化的基因的对象的表型。

术语“多态性”是指同时存在不止一种形式的基因或其部分。具有至少两种不同形式(即两种不同核苷酸序列)的基因的部分被称作“基因的多态性区域”。多态性区域可为单个核苷酸，该核苷酸在不同等位基因中不同。

“多态性基因”是指具有至少一个多态性区域的基因。

“单体型”是通常作为一个单元遗传的一组紧密关联的基因的一组等位基因。术语“感兴趣基因的多态性区域的等位变体”是指该感兴趣基因的一个区域具有在其他个体的该基因的那个区域中发现的多个核苷酸序列中的一个。

术语“基因型”是指整个细胞或特定基因的特定等位组合，在某些方面，是指与该基因相关的特定多态性，但术语“表型”是指特定基因型的可检测的外在表现。

当用于基因时，“表达”是指由基因转录的mRNA的产生，或由基因编码的蛋白产品的产生。基因的表达水平可通过测定细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定。在一个方面，基因的表达水平被表示为与作为内对照的管家基因相比的相对水平。在另一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可直接与来自不同样品的该基因的表达水平比较，并使用内对照以除去抽样误差。

“内对照”或“管家”基因是指任何组成性或普遍表达的基因。这种基因的例子包括，但不限于，β-肌动蛋白、转移受体基因、GAPDH基因或其等价体。在本发明的一个方面，内对照基因是β-肌动蛋白。

术语“过表达”或“表达不足”是指测试样品中的基因与对照样品中该基因的表达水平相比表达增加或减少，或存在差异表达。在一个方面，该测试样品是病细胞，对照样品是正常细胞。在另一个方面，测试样品是被实验操作的或被生物学改变的细胞，对照样品是进行实验操作或生物学改变之前的细胞。在另一个方面，测试样品是来自患者的样品，对照样品是来自健康个体的相似样品。在又一个方面，测试样品是来自患者的样品，对照样品是来自不具有期望的临床结果的患者的相似样品。在一个方面，差异表达比对照样品中检测到的表达水平高或低约1.5倍，或约2.0倍、或约2.5倍、或约3.0倍、或约5倍、或约10倍、或约50倍、或大于约100倍。作为选择，该基因被称作“过表达的”或“表达不足的”。作为选择，该基因也可被称作“上调的”或“下调的”。

本文用于基因的“预定值”的选择使该基因的表达水平高于该预定值的患者比该相同基因的表达水平低于该预定值的患者可能具有更期望的或较不期望的临床结果，或相反情况。基因(例如本发明中公开的基因)的表达水平与临床结果相关。本领域技术人员可通过将具有更期望的临床结果的患者的基因的表达水平与具有较不期望的临床结果的患者的该基因表达水平比较从而确定该基因的预定值。在一个方面，预定值是能最佳地将患者分成具有更期望的临床结果的群组和具有较不期望的临床结果的群组的基因表达值。这样的基因表达值可利用本领域熟知的方法通过数学方法或统计学方法确定。

作为选择，高于该预定值的基因表达简称为“高表达”，低于该预定值的基因表达简称为“低表达”。

“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”是在本文中互换使用的术语。要理解的是，这些术语不仅指特定对象细胞，而且指这种细胞的子代或潜在子代。因为在连续换代过程中由突变或环境影响可能造成出现某些改变，这种子代实际上可能不同于亲本细胞，但仍被包括在本文所使用的术语的范围内。

词语“多核苷酸的扩增”包括例如PCR方法、连接扩增法(或连接酶链式反应，LCR)和扩增方法。这些方法在本领域是已知的且已广泛使用。参见，例如，U.S. Pat. No. 4,683,195和4,683,202 以及Innis et al., 1990 (PCR)；和Wu, D.Y. et al. (1989) Genomics 4:560-569 (LCR)。通常，PCR程序描述了一种基因扩增方法，其包括(i)引物序列特异性地杂交至DNA样品(或文库)中的特异基因，(ii)随后的利用DNA聚合酶的扩增，包括多个循环的退火、延伸和变性，以及(iii)筛选出正确尺寸条带的PCR产物。所使用的引物是具有足够长度和适当序列以启动聚合的寡核苷酸，即，每个引物都被特异性地设计以与要被扩增的基因位点的每条链互补。

用于进行PCR的试剂和硬件商业上是可获得的。用来从特定基因区域扩增序列的引物优选与靶区域或其侧翼区的序列互补或特异性杂交。扩增产生的核酸序列可直接被测序。或者，扩增的序列在序列分析前被克隆。用于酶扩增的基因片段的直接克隆和序列分析的方法在本领域是已知的。

本文使用的术语“分离的”是指分子或生物学材料或细胞学材料实质上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指核酸(如DNA或RNA)，或蛋白质或多肽，或细胞或细胞器，或组织或器官，分别与天然来源中存在的其他DNA或RNA，或蛋白质或多肽，或细胞或细胞器，或组织或器官分离。术语“分离的”还指核酸或多肽基本不含细胞材料、病毒材料或培养基(当通过重组DNA技术生产时)，或基本不含化学前体或其他化学物质(当化学合成时)。而且，“分离的核酸”包括自然状态下不是作为片段存在且在自然状态下不会被发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还用来指从其他细胞蛋白质中分离的多肽，并且包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还用来指从其他细胞或组织分离的细胞或组织，并且包括培养的和改造的细胞或组织。

当基因的表达水平或遗传标记物或多态性被用来作为选择用于本文所述治疗的患者的基础时，在治疗之前和/或期间，该表达水平或遗传标记物或多态性被测定，并且所获得的值被临床医生用来评价以下项目中的任何一个：(a)个体对初始接受治疗的可能的适宜性；(b)个体对初始接受治疗的可能的不宜性；(c)对治疗的响应性；(d)个体对继续接受治疗的可能的适宜性；(e)个体对继续接受治疗的可能的不宜性；(f)调整剂量；(g)预测临床获益的可能性；或(h)毒性。如本领域技术人员所理解的，在临床环境下测定遗传标记物或多态性明确地表明该参数被用来作为启动、继续、调整和/或停止本文所述的治疗的实施的基础。

本文所使用的术语“治疗”意在包括治愈以及改善该病症或疾病的至少一种症状。例如，在癌症的情况下，对治疗的响应包括恶病体质的减轻、存活时间的增加、肿瘤进展时间的延长、肿瘤质量的降低、肿瘤负荷的降低和/或对出现肿瘤转移的时间、出现肿瘤复发的时间、肿瘤响应、完整响应、部分响应、稳定疾病、进行性疾病、无进展生存期、总生存期的延长，每个都通过美国国家癌症研究所和美国食品和药品监督局对于新药批准所设定的标准来测定。参见Johnson et al. (2003) J. Clin. Oncol. 21(7):1404-1411。

“有效量”用来表示施用或递送至患者的化合物或制剂的最可能产生对治疗的期望的响应的量。该量通过患者的临床参数而凭经验确定，所述临床参数包括，但不限于，疾病期、年龄、性别、组织学一级肿瘤复发可能性。

术语“临床结果”、“临床参数”、“临床响应”或“临床终点”是指与患者对疗法的反应相关的任何临床观察结果或测量结果。临床结果的非限制性的例子包括肿瘤响应(TR)、总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、无病生存期、出现肿瘤复发的时长(TTR)、出现肿瘤进展的时长(TTP)、相对风险(RR)、毒性或副作用。

术语“可能响应”是指具有某种基因型的患者相比处境相似但不具有该基因型的患者而言相对较大可能具有完整响应或部分响应。作为选择，术语“不太可能响应”是指具有某种基因型的患者相比处境相似但不具有该基因型的患者而言相对较小可能具有完整响应或部分响应。

术语“适于治疗”或“适合处以治疗”是指该患者相比具有相同疾病并接收相同治疗但具有为比较的目的而被考虑的不同特征的患者而言可能表现出一种或多种期望的临床结果。在一个方面，所考虑的特征是遗传多态性或体细胞突变。在另一个方面，所考虑的特征是基因或多肽的表达水平。在一个方面，更期望的临床结果是相对较高的肿瘤响应可能性或相对较好的肿瘤响应，例如肿瘤负荷降低。在另一个方面，更期望的临床结果是相对较长的总生存期。在另一个方面，更期望的临床结果是相对较长的无进展生存期或出现肿瘤进展的时长。在另一个方面，更期望的临床结果是相对较长的无病生存期。在进一步的方面，更期望的临床结果是肿瘤复发的相对降低或延迟。在另一个方面，更期望的临床结果是相对降低的转移。在另一个方面，更期望的临床结果是相对较低的相对风险。在又一个方面，更期望的临床结果是相对降低的毒性或副作用。在一些实施方式中，同时考虑不止一个临床结果。在一个这样的方面，具有例如遗传多态性的基因型的特征的患者，与具有相同疾病并接收相同治疗但不具有该特征的患者相比，可能表现出不止一个更期望的临床结果。如本文所定义的，该患者被认为是适于治疗的。在另一个这样的方面，具有某个特征的患者可能表现出一个或多个期望的临床结果，但同时表现出一个或多个较不期望的临床结果。临床结果随后将被整体考虑，并据此做出该患者是否适于该治疗的决定，并考虑患者的特定情况以及这些临床结果的相关性。在一些实施方式中，在做整体决定时，无进展生存期或总生存期比肿瘤响应的比重大。

当将一个患者与另一个患者比较时，或当将一个患者群体与另一个患者群体比较时，使用了“具有相同癌症”。例如，这两个患者或患者群体每个都具有或患有结肠癌。

对治疗的“完整响应”(CR)界定出具有可评价但不可测疾病的患者，其肿瘤和所有疾病征兆消失。

对治疗的“部分响应”(PR)界定出具有不如完整响应的任何响应的患者，该患者被简单地分类为显示部分响应。

“稳定疾病”(SD)表示该患者是稳定的。

“进行性疾病”(PD)表示治疗后肿瘤生长了(即变得更大)、扩散了(即转移至其他组织或器官)或整体上癌症变得更严重。例如，自治疗开始肿瘤生长了超过20%通常表示进行性疾病。“无病存活期”表示在癌症或肿瘤治疗后患者不具有癌症或肿瘤迹象的生存时长。

对治疗的“不响应”(NR)界定出肿瘤或疾病征兆保持恒定或已发生进展的患者。

“总生存期”(OS)是指与无病或未治疗个体或患者相比预期寿命的延长。

“无进展生存期”(PFS)或“出现肿瘤进展的时长”(TTP)表示治疗期间和之后癌症没有生长的时长。无进展生存期包括患者具有完整响应或部分响应的时间量，以及患者具有稳定疾病的时间量。

“无关联”是指统计学分析显示多态性区域的等位变体或基因表达水平与临床参数之间没有关系。

本文所用的由美国国家癌症研究所定义的“肿瘤复发”是指通常在癌症无法被检测的时间段后癌症复发(回归)。癌症可能回归至于原始(原发)肿瘤相同的地方或身体的另一个地方。这也称作复发癌。

“出现肿瘤复发的时长”(TTR)被定义为从癌症诊断出的日期到第一次复发、死亡或直到最后一次联系(如果该患者在最后一次联系时没有任何肿瘤复发)的时间。如果该患者没有复发，那么TTR在死亡时或在最后一次跟进时被检查(censor)。

“相对风险”(RR)在统计学和数学流行病学上是指与暴露相关的事件(或患病)的风险。相对风险是发生在被暴露群体与非暴露群体中的事件的可能性比率。

如本文所使用的，术语“I期癌症”、“II期癌症” 、“III期癌症”和“IV期”是指癌症的TNM分期。I期癌症通常表明原发性肿瘤限于原始器官。II期癌症是指原发性肿瘤已扩散至紧邻排空肿瘤区域的周围组织和淋巴结。III期是指原发性肿瘤很大，并固定至更深的结构中。IV期是指原发性肿瘤很大，并固定至更深的结构中。参见CANCER BIOLOGY, 2nd Ed., Oxford University Press (1987)第20和21页。

“肿瘤”是由细胞的不受控的侵袭性复制导致的组织异常生长，其没有任何生理学功能。“肿瘤”也被称为瘤。

术语“血液”是指包括在对象中循环的血液的所有成分的血液，包括但不限于，红血细胞、白血细胞、血浆、凝血因子、小蛋白、血小板和/或冷沉淀。它通常是指当病人献血时所捐献的血液类型。

非限制性实施方式

本发明还提供诊断方法、预测方法和治疗方法，这些方法至少部分地基于对本文涉及的感兴趣基因的表达水平的测定来实现。

例如，利用本文所述的诊断试验获得的信息可用于确定一个对象是否适于给定类型的癌症治疗，或是否可能经历肿瘤复发或具有较长总生存期。基于预测信息，医生可推荐出治疗方案，以用于降低患者的恶性肿瘤质量或肿瘤或治疗个体的癌症。

作为选择，确定一个对象是否更可能或较不可能具有较长或较短总生存期，可被表述为识别一个对象更可能经历肿瘤复发，或识别一个对象较不可能经历肿瘤复发。

要理解的是，利用本文所述的诊断试验获得的信息可被单独使用或与其他信息结合使用，所述其他信息例如是，但不限于，基因型或其他基因的表达水平、临床化学参数、组织病理学参数、或对象的年龄、性别和体重。当单独使用时，利用本文所述的诊断试验获得的信息可用于确定或识别治疗的临床结果、选择治疗的患者、或治疗患者等。另一方面，当与其他信息结合使用时，利用本文所述的诊断试验获得的信息可用于辅助确定或识别治疗的临床结果、辅助选择治疗的患者、或辅助治疗患者等。在特别的方面，本文所公开的一个或多个基因的基因型或表达水平被用在一组基因中，每个基因都对最终的诊断、预测或治疗有贡献。

本发明提供了一种确定患者是否可能或不太可能经历卵巢癌的方法，该方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：确定从该患者分离的样品中SP17基因的表达水平，其中SP17基因表达水平的存在或高于预定第一值表示该患者更可能经历卵巢癌，而不存在SP17基因表达或SP17基因表达低于预定第一值表示该患者不太可能经历卵巢癌。在另一个方面，该方法还包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：确定从该患者分离的样品中CA125基因的表达水平，其中SP17水平和CA125水平的存在或者SP17和CA125水平高于预定第一值表示该患者更可能经历卵巢癌；而CA125水平的存在或CA125水平高于预定第一值并且不存在SP17水平或SP17水平低于预定第一值表示该患者不太可能经历卵巢癌。

本发明还提供了一种确定卵巢癌患者是否可能或不太可能具有较长或较短总生存期的方法，该方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：确定从该患者分离的样品中SP17基因的表达水平，其中SP17基因表达水平的存在或水平高于预定第一值表示该患者更可能具有较短的总生存期，而不存在SP17基因表达或SP17基因表达低于预定第一值表示该患者可能具有较长的总生存期。在另一个方面，该方法还包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：确定从该患者分离的样品中的CA125基因的表达水平，其中：SP17水平和CA125水平的存在或者SP17水平和CA125水平高于预定第一值表示该患者较不可能具有较长的总生存期；而CA125水平的存在或CA125水平高于预定第一值并且不存在SP17水平或SP17水平低于预定第一值表示该患者更可能具有较长的总生存期。

简言之且仅为解释的目的，本领域技术人员可通过将具有更期望的临床参数的患者的基因的表达水平与具有较不期望的临床参数的患者的基因表达水平相比较来确定该预定值。在一个方面，预定值是能最佳地将患者分成具有更期望的临床参数的群体和具有较不期望的临床参数的群体的基因表达值。这种基因表达值可利用本领域熟知的方法通过数学或统计学方法确定。

合适的用于本发明的方法的样品包括但不限于血液样品、尿液样品或血清样品。

用于测定基因表达水平的方法在本领域是已知的，并在本文简要描述。这些方法的非限制性例子包括包含以下步骤、或实质上由以下步骤组成的、或由以下步骤组成的方法：测定由该基因转录的mRNA的量、mRNA原位杂交、PCR、实时PCR或微阵列。这些方法用于辅助患者，例如动物、哺乳动物或人患者。仅为解释的目的，哺乳动物包括但不限于猴、鼠、羊、马、犬、牛、猪或人患者。

作为上述每个发明的替代性实施方式，合适的患者样品包括选自以下的组织或细胞、或实质上由选自以下的组织或细胞组成、或由选自以下的组织或细胞组成：非转移性肿瘤组织、非转移性肿瘤细胞、转移性肿瘤组织或转移性肿瘤细胞。在另一个方面，患者样品可为分离自该肿瘤附近的正常组织。

SP17蛋白和CA125蛋白的抗体也可被用于疾病诊断和预测。这种诊断方法可被用来检测肽的表达水平的异常、或结构和/或组织的异常、肽的细胞内或亚细胞内位置。这可通过例如免疫荧光技术(使用荧光标记的抗体)来实现，并结合使用光学显微检测、流式细胞术检测或荧光检测。用于本发明的抗体(或其片段)可额外地在组织学上(例如在免疫荧光或免疫电镜中)被用于原位检测肽或其等位变体。原位检测可通过从患者移除组织学样品并将本发明的被标记抗体施用至其上来实现。该抗体(或片段)优选通过将被标记的抗体(或片段)覆盖在生物学样品上而被施加。通过使用这样的程序，不仅可以检测对象多肽的存在，而且可检测其在被检查的组织中的分布。使用本发明，本领域的技术人员将容易意识到，任何各种组织学方法(例如染色程序)可被改变以实现这种原位检测。

在一个实施方式中，在于样品中识别感兴趣基因的多态性区域之前，需要首先扩增该感兴趣基因的至少一部分。扩增可通过例如PCR和/或LCR根据本领域已知的方法进行。PCR的各种非限制性例子包括本文描述的方法。

组装PCR或聚合酶循环组装(PCA)是通过在具有短重叠区段的长寡核苷酸库上进行PCR来人工合成长DNA序列。寡核苷酸分正向和反向，重叠区段决定PCR片段的顺序，从而选择性地产生最终的长DNA产物(参见Stemmer et al. (1995) Gene 164(1):49-53和U.S. Pat. No.: 6,335,160; 7,058,504或7,323,336)。

不对称PCR被用来优选扩增原始DNA的一条链，而非其他。它用于仅需具有两条互补链中的其中一条的某些类型的测序和杂交探测中。PCR正常进行，但对所选择的链使用很多过量的引物。由于在有限引物用完后反应中的扩增缓慢，因此需要使用额外的PCR循环(参见Innis et al. (1988) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85(24):9436-9440和U.S.专利号: 5,576,180; 6,106,777或7,179,600)。该方法的一种新近的改变称为线性指数PCR(Linear-After-The-Exponential-PCR，LATE-PCR)，其使用具有比过量引物高的解链温度(Tm)的有限引物以维持反应效率，因为有限引物浓度降低了中期反应(Pierce et al. (2007) Methods Mol. Med. 132:65-85)。

菌落PCR使用细菌菌落，例如大肠杆菌，其可通过PCR快速筛选出正确的DNA载体构建体。使用无菌牙签挑出经选择的细菌菌落，并将其轻拍到PCR母混合液或无菌水中。当使用标准聚合酶时，以在95℃延长的时间来启动PCR，或者当使用特殊的嵌合DNA聚合酶时，以在100℃缩短的变性步骤来启动PCR(Pavlov et al. (2006) "Thermostable DNA Polymerases for a Wide Spectrum of Applications: Comparison of a Robust Hybrid TopoTaq to other enzymes", in Kieleczawa J: DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Jones and Bartlett, pp. 241-257)。

解旋酶依赖性扩增类似于传统PCR，但使用恒定温度而不是随变性和退火/延伸循环而变化。DNA解旋酶是解链DNA的酶，其用来代替热变性(参见Myriam et al. (2004) EMBO reports 5(8):795–800和U.S.专利号7,282,328)。

热启动PCR是一种降低PCR的初始设置阶段非特异性扩增的技术。该技术可通过在添加聚合酶前加热反应组分至解链温度(如95℃)而手动进行(Chou et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:1717-1723和U.S.专利号: 5,576,197和6,265,169)。已开发出特殊的酶系统，其在环境温度抑制聚合酶活性，这是通过结合抗体(Sharkey et al. (1994) Bio/Technology 12:506-509)或通过存在仅在高温激活步骤脱开的共价结合抑制剂来实现的。热启动/冷结束PCR是利用新的杂交聚合酶实现的，该酶在环境温度是失活的，但在延伸温度是持续激活的。

序列间特异性(ISSR)PCR是用于DNA指纹图谱的方法，其扩增一些简单重复序列之间的区域，以产生具有多种扩增片段长度的独特指纹(Zietkiewicz et al. (1994) Genomics 20(2):176-83)。

反向PCR是当仅知道一个内部序列时用来实现PCR的一种方法。这在识别不同基因组插入物的侧翼序列时特别有用。这涉及一系列的DNA消化和自身连接，导致产生位于未知序列的任一端的已知序列(Ochman et al. (1988) Genetics 120:621-623和U.S.专利号: 6,013,486; 6,106,843或7,132,587)。

连接介导的PCR使用连接至感兴趣DNA的小DNA连接体以及退火至DNA连接体的多个引物；它已被用于DNA测序、基因组步移和DNA足迹分析(Mueller et al. (1988) Science 246:780-786)。

甲基化特异性PCR(MSP)用于检测基因组DNA中CpG岛的甲基化(Herman et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 93(13):9821-9826和U.S.专利号: 6,811,982; 6,835,541或7,125,673)。DNA首先用亚硫酸氢钠处理，从而将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，其被PCR引物识别为胸腺嘧啶。随后在被修饰的DNA上进行两个PCR，使用相同的引物对，但引物序列中任何CpG岛处除外。在这些点，一个引物对识别具有胞嘧啶的DNA以扩增甲基化的DNA，一个引物对识别具有尿嘧啶或胸腺嘧啶的DNA以扩增未甲基化的DNA。使用qPCR的MSP也可用来获得关于甲基化的定量而非定性信息。

多重连接依赖性探针扩增(MLPA)允许仅使用单个引物对来扩增多个靶标，从而避免多重PCR的分辨率限制(见下文)。

多重PCR使用在单个PCR混合物中的多个、独特引物对来产生对不同DNA序列特异的不同尺寸的扩增子(参见U.S.专利号: 5,882,856; 6,531,282或7,118,867)。通过一次靶定多个基因，可从单次测试中获得额外的信息，否则需要使用几倍的试剂和多次进行。每个引物对的退火温度必须被优化以在单个反应内正确地起作用，并且扩增子尺寸(即它们的碱基对长度)应当足够不同以当通过凝胶电泳观察时形成不同的条带。

巢式PCR通过降低DNA的非特异性扩增产生的背景来提高DNA扩增的特异性。两对引物被用在两个连续的PCR中。在第一个反应中，一对引物被用来生成DNA产物，该DNA产物在预期靶标两侧仍可包含非特异性扩增的DNA片段。该产物被用在第二个PCR中，其使用的引物对的结合位点完全不同或部分不同于第一个反应中的每个引物，并且该结合位点位于第一个反应中的每个引物的3'端(参见U.S.专利号: 5,994,006; 7,262,030或7,329,493)。巢式PCR在特异性扩增长DNA片段时比常规PCR通常更加成功，但它需要对靶序列有较详细的认识。

重叠延伸PCR是一种遗传工程技术，其允许构建出具有变化的DNA序列，该变化在最长的实际引物长度的限度之外插入。

定量PCR(Q-PCR)，也称作RQ-PCR、QRT-PCR和RTQ-PCR，被用来在反应后或实时测定PCR产物的量。参见美国专利号6,258,540; 7,101,663或7,188,030。Q-PCR是定量测定DNA、cDNA或RNA起始量的可供选择的方法。Q-PCR通常用来确定DNA序列是否存在于样品中以及它在样品中的拷贝数。目前最高准确度的该方法是如在以下文献中所述的数字PCR：U.S.专利号6,440,705; U.S. 公开号2007/0202525; Dressman et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci USA 100(15):8817-8822 and Vogelstein et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96(16):9236-9241。更普遍地，RT-PCR是指逆转录PCR(见下文)，其通常与Q-PCR联用。QTR-PCR法适用荧光染料(如Sybr Green)或含荧光团DNA探针(例如TaqMan)，从而实时测定扩增产物的量。

逆转录PCR(RT-PCR)是一种用来从细胞或组织RNA中扩增、分离或识别已知序列的方法(参见U.S.专利号: 6,759,195; 7,179,600或7,317,111)。该PCR之前先使用逆转录酶将RNA转化为cDNA。RT-PCR广泛地用于表达图谱，以确定基因的表达或识别RNA转录体的序列，包括转录起始位点和转录终止位点，并且在基因的基因组DNA序列是已知时用来绘制基因中外显子和内含子的位置。基因的5'端(对于转录起始位点)通常通过RT-PCR方法识别，即cDNA末端的快速扩增(RACE-PCR)。

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)用来分离已知序列两侧的未知序列。在已知序列内，TAIL-PCR使用具有不同退火温度的一对巢式引物；简并引物被用来从未知序列的另一方向扩增(Liu et al. (1995) Genomics 25(3):674-81)。

降落式PCR是PCR的变体，其致力于通过随着PCR循环进行而逐步降低退火温度来降低非特异性背景。初始循环时的退火温度通常高于所用引物的T_m几度(3-5℃)，而在后面循环中，退火温度低于引物T_m几度(3-5℃)。较高的温度为引物结合提供较大的特异性，较低的温度使得从初始循环期间形成的特异性产物的扩增更有效(Don et al. (1991) Nucl Acids Res 19:4008和U.S.专利号6,232,063)。

在本发明的一个实施方式中，探针被标记有两种荧光染料分子从而形成所谓的“分子信标” (Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1996) Nat. Biotechnol. 14:303-8)。这种分子信标通过减轻结合至寡核苷酸探针的相对端的染料之间的分子内荧光淬灭而导引结合至互补的核酸序列。分子信标用于基因分型已被描述(Kostrikis, L.G. (1998) Science 279:1228-9)，并且也描述过同时使用多个信标(Marras, S.A. (1999) Genet. Anal. 14:151-6)。如果淬灭分子具有足够的光谱重叠从而当淬灭分子与特定荧光团彼此靠近时(例如在分子信标中)，或当它们被连接至寡核苷酸探针的末端相隔约1至约25个核苷酸时，实质上抑制荧光团的荧光。

被标记的探针也可与感兴趣的基因或抗体的扩增一起使用。(Hollandet al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280)。授予Gelfand等的美国专利号5,210,015描述了基于荧光的方法以在PCR期间实时测量扩增产物。这种方法要么使用嵌入染料(例如溴化乙锭)来表示存在的双链DNA的量，要么它们使用含荧光淬灭对的探针(也成为“Taq-Man”法)，其中探针在扩增期间被裂解从而释放出荧光分子，该荧光分子的浓度与存在的双链DNA的量成比例。扩增期间，当杂交至靶序列时，探针被聚合酶的核酸酶活性消化，从而导致荧光分子与淬灭分子分离，从而导致来自报道分子的荧光出现。Taq-Man法使用含报道分子-淬灭分子对的探针，其特异性地退火至含多态性的靶多核苷酸区域。

探针可被固定值表面以用作“基因芯片”。这种基因芯片可被用来通过本领域技术人员已知的多种技术来检测基因变化。在一种技术中，寡核苷酸被排列在基因芯片上，以通过杂交法来测序，从而确定DNA序列，如U.S. 专利号6,025,136和6,018,041所述的那样。本发明的探针也可被用于基因序列的荧光检测。这种技术已在例如美国专利号5,968,740和5,858,659中描述。探针也可被固定至电极表面，以通过电化学方法检测核酸序列，例如Kayem等在美国专利号5,952,172中以及Kelley, S.O. et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:4830-4837所描述的那样。

本发明还提供一种遗传标记物的预测面板(prognostic panel)，所述遗传标记物选自(但不限于)本发明识别的感兴趣的基因。该预测面板包括探针或引物，该探针或引物可用来扩增和/或确定SP17的分子结构(单独)或SP17与CA125的分子结构。该探针或引物可被连接至固相载体或由固相载体支撑，例如，但不限于，基因芯片或微阵列。探针或引物可被可检测地标记。

在一个方面，该面板含有本文出现的探针或引物以及其他探针或引物。在另一个方面，该面板包括一个或多个上述探针或引物以及其他物质。在另一个方面，该面板仅由上述探针或引物组成。

引物或探针可被附着至表面以用作“基因芯片”或“微阵列”。这种基因芯片或微阵列可被用来通过许多本领域技术人员已知的方法检测遗传变化。在一种技术中，寡核苷酸被排列在基因芯片上，用于通过杂交法或测序法确定DNA序列，例如US专利号6,025,136和6,018,041中所概述的那样。本发明的探针也可用于荧光检测基因序列。这种技术已在例如美国专利号5,968,740和5,858,659中描述。探针也可附着至电极表面从而实现核酸序列的电化学检测，如Kayem等在美国专利号5,952,172中以及Kelley et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:4830-4837所描述的。

各种“基因芯片”或“微阵列”和类似技术在本领域是已知的。这样的例子包括，但不限于，LabCard (ACLARA Bio Sciences Inc.); GeneChip (Affymetric, Inc); LabChip (Caliper Technologies Corp); 带有电化学感应的低密度阵列 (Clinical Micro Sensors); LabCD System (Gamera Bioscience Corp.); Omni Grid (Gene Machines); Q Array (Genetix Ltd.); 带有液相表达技术的高通量自动质谱系统 (Gene Trace Systems, Inc.);热喷射点样系统 (Hewlett Packard Company); Hyseq HyChip (Hyseq, Inc.); BeadArray (Illumina, Inc.); GEM (Incyte Microarray Systems); 可分配12至64个点样点到多个载玻片上的高通量微阵列系统 (Intelligent Bio-Instruments); Molecular Biology Workstation 和NanoChip (Nanogen, Inc.); 微流体玻璃芯片 (Orchid biosciences, Inc.); 具有4个PiezoTip压电式按需滴定尖端的BioChip点样仪 (Packard Instruments, Inc.); FlexJet (Rosetta Inpharmatic, Inc.); MALDI-TOF质谱仪(Sequnome); ChipMaker 2和ChipMaker 3 (TeleChem International, Inc.); 以及如在Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129-153中描述的GenoSensor (Vysis, Inc.)。“基因芯片”或“微阵列”的例子还在以下文献中描述：美国专利公开号2007/0111322、2007/0099198、2007/0084997、2007/0059769和2007/0059765以及美国专利号7,138,506、7,070,740和6,989,267。

在一个方面，含有用于感兴趣基因的探针或引物的“基因芯片”或“微阵列”可单独提供或与其他探针和/引物结合提供。合适的样品是来自患者的基因组DNA、RNA提取物，或者其组合以及扩增产物(如需要)。DNA或RNA样品与基因芯片或微阵列面板在适合感兴趣的基因杂交至包含在基因芯片或微阵列上的探针或引物的条件下接触。该探针或引物可被可检测地标记，从而识别感兴趣基因中的多态性。作为选择，化学反应或生物学反应可被用来识别与感兴趣基因的DNA或RNA杂交了的探针或引物。随后，借助上述装置和方法可确定患者的遗传概貌。

治疗方法

本发明还提供治疗通过本发明的方法识别出的可能具有卵巢癌或患有卵巢癌且预后较差(例如较短的总生存时间)的患者。有效量的合适治疗剂被施用至该患者，并且该患者的预后可通过重复本发明所述的方法来监测。“有效量”是指足以实现有益的或期望的结果的量。有效量可通过一次或多次施用、实施或剂量而实施。已批准的治疗药物在以下网址中列出：cancer.gov/cancertopics/druginfo/ovariancancer，最后一次访问是在2011年9月12日。这些药物的非限制的例子包括阿霉素PFS；阿霉素RDF；BEP和卡铂。这些药物可被施用给通过本发明的方法被识别为适于该治疗的对象或个体。治疗量可通过经验确定，并会随着正治疗的病状、正治疗的对象以及试剂的效用和毒性而改变。

试剂盒

如本文所述的，本发明提供用于单独测定SP17表达水平或与结合测定CA125表达水平的诊断方法。在一些实施方式中，该方法使用包含与感兴趣基因互补的核苷酸序列的探针或引物。因此，本发明提供用于进行这些方法的试剂盒以及执行本发明的方法的说明书。因此，在一个方面，本发明还提供用于识别卵巢癌患者以及单独地用于识别更可能具有肿瘤复发和/或较长或较短总生存期的卵巢癌患者的试剂盒，该试剂盒包含以下材料、或实质上由以下材料组成、或由以下材料组成：用于单独测定SP17表达水平或结合测定CA125表达水平的合适的引物或探针或微阵列，以及使用说明书。

在一个方面，如果SP17表达水平被检测到或高于预定第一值，或当CA125和SP17基因表达水平存在或高于该预定值，那么试剂盒的成分和说明书识别出该患者为更可能经历肿瘤复发或较短总生存期的患者。在一个方面，在试剂盒中进一步提供治疗方案和/或疗法。

在一个特别的方面，试剂盒的成分和说明书被用来诊断患者的卵巢癌，该试剂盒包含以下材料、或实质上由以下材料组成、或由以下材料组成：进行本发明所述方法的合适试剂以及使用说明书。在一个方面，在试剂盒中进一步提供治疗方案和/或疗法。

在另一个方面，试剂盒的成分和说明书被用来在SP17基因表达不存在或低于预定第一值时，或如果CA125水平存在或高于该预定值但SP17水平不存在或低于该预定值时，确定患者是否较小可能经历肿瘤复发或较长总生存时间。

简言之且仅为说明之目的，本领域技术人员可通过比较具有更多期望临床参数的患者的基因的表达值与具有较少期望的临床参数的患者的基因的表达值来确定所述第一预定值和第二预定值。在一个方面，预定值是能最佳地将患者分成具有较多期望的临床参数的群体和具有较少的期望临床参数的群体的基因表达值。该基因表达值可通过本领域熟知的方法通过数学或统计学方法确定。

这些方法可用于辅助动物、哺乳动物或人类患者。仅为说明之目的，哺乳动物包括但不限于猴、鼠、牛、马、猪或羊。卵巢癌可为转移性的，并且该癌症可为I期、II期、III期或IV期。

用于试剂盒的方法的合适样品包括，但不限于血液、血清或尿液或它们的组合。

试剂盒可单独包括至少一种能够特异性地杂交至SP17的探针或引物，或联合地包括用于测定CA125基因的表达水平的探针和/或引物，以及使用说明书。所述试剂盒优选包括上述核酸中的至少一种。用于扩增感兴趣基因的至少一部分的优选试剂盒包含两种引物，其中至少一个能够杂交至等位变体序列。这种试剂盒适合用于通过例如荧光检测、电化学检测或其他检测来检测基因型。

包含在试剂盒中的用作探针或引物的寡核苷酸可被可检测地标记。标记物可被直接检测(例如荧光标记物)或间接检测。间接检测可包括本领域技术人员已知的任何检测方法，包括生物素-抗生物素相互作用、抗体结合等。荧光标记的寡核苷酸也可含有淬灭分子。寡核苷酸可被结合至表面。在一个实施方式中，优选的表面是二氧化硅或玻璃。在另一个实施方式中，该表面是金属电极。

本发明的其他试剂盒包含进行实验必需的至少一种试剂。例如，该试剂盒可包含酶。或者，该试剂盒可包含缓冲液或任何其他必要试剂。

温育核酸探针与测试样品的条件取决于试验中所用的形式、所使用的检测方法、试验中所用核酸探针的类型和性质。本领域技术人员会意识到，任何一种可普遍获得的杂交、扩增或免疫分析形式都可轻易地被改造而使用用在本发明中的核酸探针。这种实验的例子可在以下文献中找到：Chard, T. (1986) An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Bullock, G.R. et al., Techniques in Immunocytochemistry Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, P. (1985) Practice and Theory of Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands。

用在诊断试剂盒中的测试样品包括细胞、蛋白质或细胞的膜提取物、或生物学流体(例如唾液、血液、血清、血浆或尿液)。用在上述方法中的测试样品会基于试验形式、检测方法的性质以及用作被分析样品的组织、细胞或提取物而变化。制备细胞的蛋白质提取物或膜提取物的方法在本领域是已知的，并且可被轻易改造而获得与所使用的系统相容的样品。

所述试剂盒可包括阳性对照、阴性对照、试剂、引物、测序标记物、本发明所述的用于确定感兴趣基因的表达水平的探针和抗体中的所有或部分。

这些推荐的试剂盒成分可以本领域技术人员习惯使用的方式包装。例如，这些推荐的试剂盒成分可以溶液形式或液相分散体等形式提供。

用于检测基因表达水平的方法在本领域是已知的并且在本文简要描述。这些方法的非限制性例子包括包含以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成的方法：确定转录自该基因的mRNA的量、mRNA原位杂交、基因芯片或微阵列的使用、PCR、实时PCR或微阵列。这些方法可用于辅助患者，例如动物、哺乳动物或人类患者。仅为说明之目的，哺乳动物包括但不限于猴、鼠、羊、马、犬、牛、猪或人患者。在一个方面，患者是II期癌症患者并且在手术或手术切除后还未接收任何额外治疗。在另一个方面，患者为III期癌症患者并且在手术或手术切除后将接收或已接收额外治疗。

各种“基因芯片”或“微阵列”以及相似技术在本领域是已知的。它们的例子包括，但不限于，LabCard (ACLARA Bio Sciences Inc.); GeneChip (Affymetric, Inc); LabChip (Caliper Technologies Corp); 带有电化学感应的低密度阵列 (Clinical Micro Sensors); LabCD System (Gamera Bioscience Corp.); Omni Grid (Gene Machines); Q Array (Genetix Ltd.); 带有液相表达技术的高通量自动质谱系统 (Gene Trace Systems, Inc.);热喷射点样系统 (Hewlett Packard Company); Hyseq HyChip (Hyseq, Inc.); BeadArray (Illumina, Inc.); GEM (Incyte Microarray Systems); 可分配12至64个点样点到多个载玻片上的高通量微阵列系统 (Intelligent Bio-Instruments); Molecular Biology Workstation 和NanoChip (Nanogen, Inc.); 微流体玻璃芯片 (Orchid biosciences, Inc.); 具有4个PiezoTip压电式按需滴定尖端的BioChip点样仪 (Packard Instruments, Inc.); FlexJet (Rosetta Inpharmatic, Inc.); MALDI-TOF质谱仪(Sequnome); ChipMaker 2和ChipMaker 3 (TeleChem International, Inc.); 以及如在Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129-153中描述的GenoSensor (Vysis, Inc.)。“基因芯片”或“微阵列”的例子还在以下文献中描述：美国专利公开号2007/0111322、2007/0099198、2007/0084997、2007/0059769和2007/0059765以及美国专利号7,138,506、7,070,740和6,989,267。

本发明已被大体描述，通过参考以下实施例将会更容易理解，该实施例仅为本发明的特定方面和实施方式的说明，并不用来限制本发明。

实验方法

人对象招募

申请人研究了323个对象的人群，包括I-IV期卵巢癌、良性卵巢肿瘤和健康对照。

研究审核委员会批准

所有临床材料是在当地伦理委员会(University Hospital of Groningen and Texas Tech University Health Sciences Center)的批准下和患者同意的情况下获得的。

RT-PCR

通过前述^19,20标准技术进行逆转录PCR。SP17转录用引物为5’-GGA TCC ATG TCG ATT CCA TTC TC-3’ (SEQ ID NO: 1)和5’-CTC GAG TCA CTT GTT TTC CTC TTT TTC-3’ (SEQ ID NO: 2)。

免疫组化

脱石蜡和复水后，如前所述^19,21，使组织切片经历抗原修复和染色。在用苏木精(Fisher Scientific, PA, USA)对比染色后，利用光学显微镜(Leica DMLA, IL, USA)拍照。

SP17 ELISA

将1μL血清稀释在50 μL标准碳酸盐缓冲生理盐水(包被缓冲液)中稀释，从而进行ELISA。稀释的血清以一式三份添加至96孔平板并在4℃温育过夜。非特异性位点通过用平板1% W/V BSA PBS溶液在室温下温育平板2小时来饱和。BSA被移除，并添加50 μL鼠抗SP17一级抗体(申请人实验室中研发并在PBS中以1:50稀释；该抗体抗人SP17蛋白，使用GenBank登陆No. NP_059121.1生成)¹³，并在37℃温育2小时。平板用PBS+0.025% Tween-20(PBS-t)洗涤三次，并与连有HRP德抗鼠二级抗体(Abcam, 在PBS中以1:4000稀释, 50 μL/孔)温育2小时。在用PBS-t洗涤3次后(300 μL/孔)，添加显色底物并在黑暗环境下温育5分钟。在405nm处读取吸光光度值。使用系列稀释的纯化抗原来确定血清中的SP17浓度。

CA125 ELISA

根据制造商指引，使用FDA认证的方法ARCHITECT CA 125 II?试验(Abbott Park, IL, USA)测定CA125。

统计分析

使用GraphPad 5统计软件(GraphPad Software, Inc., CA, USA)并设置显著性水平为0.05，进行统计分析。

结果

研究组特征

申请人研究了一共323个对象(136个卵巢癌患者、45个良性卵巢肿瘤和142个年龄相符的健康志愿者)。对象分布如下：13% I期，6% II期，20% III期，4% IV期，44%健康，13%良性卵巢肿瘤。44%的卵巢癌是I/II级，55%是III级。卵巢癌患者、良性卵巢肿瘤患者和健康对照的平均年龄是59岁。

SP17在健康对象、良性卵巢肿瘤和卵巢癌病变的原代细胞中以不同水平表达

评价了正常卵巢、良性卵巢肿瘤样品和卵巢癌原代细胞的SP17 mRNA(图1A)。在来自卵巢癌患者的样品中可检测到阳性条带，但在良性卵巢肿瘤样品和健康对照中不存在转录体。在蛋白质水平，SP17可在I-IV期的所有卵巢癌肿瘤样品中检测到，但在正常卵巢中(图1B)或在所分析的45个良性卵巢病变的任何一个中(图1B)都没有显示出蛋白质表达。

与年龄相匹配的健康女性或具有良性卵巢肿瘤的女性相比卵巢癌患者的血清SP17浓度显著较高。

表I显示了在健康对照、良性卵巢肿瘤或卵巢癌患者在诊断时测定的平均SP17和CA125血清浓度：如单因素ANOVA所确认的，平均SP17和CA125水平在各组间显著不同。Dunn多重比较检验显示，与卵巢癌患者相比，SP17和CA125在健康组和良性组明显较低(表I)。卵巢癌不同阶段之间或健康组与良性组之间没有显著性差异(p>0.05)。

SP17血清浓度与总生存期相关

为评估SP17血清测定值是否可作为生存时间的合适的预后指标，建立了Kaplan-Meier生存曲线(图2A和2B)并进行了对数秩检验(α=0.05)。因为已知CA125水平与生存时间相关，因此进行了相同的分析，以利用CA125值作为阳性对照。总生存期被定义为从初次手术到因卵巢癌而死亡或最后一次跟进日之间的时间。申请人建立了4.7 ng/mL的截断水平作为健康对照组的平均SP17血清浓度加2个标准差(95^th百分位数)。对CA125进行了平行的分析，得出截断值为40 U/mL。根据SP17值高于或低于4.7 ng/mL，或CA125值高于或低于40 U/mL，将卵巢癌患者分成两组。SP17和CA125水平都与总生存期有关(图2A和2B)。

SP17测试比CA125在判别早期卵巢癌和良性卵巢肿瘤方面显示出更好的灵敏性

为比较SP17和CA125测试在正确诊断早期或晚期卵巢癌(分别为I/II期和III/IV期)方面的表现，按如下方法在四个不同设置中建立了ROC(受试者操作特征)曲线(图3A至3D)。在判别是良性肿瘤还是早期或晚期卵巢癌方面(图3A和3B)，以及判别是健康对照还是早期或晚期卵巢癌方面(图3C和3D)，评价了SP17测试和CA125测试。当判别良性肿瘤与I/II期卵巢癌时，通过z-检验(p<0.05)比较，SP17的曲线下面积(AUC)明显高于CA125。在所有其他测试条件下，SP17和CA125的AUC(p>0.05)相似。在以99.9%的固定特异性比较这两项测试时，在判别良性卵巢肿瘤还是I/II期卵巢癌方面，SP17的灵敏度比CA125高40倍(SP17灵敏度=88.3%，CA125灵敏度=2.2%)；在所有其他测试的设置中，未检测到灵敏度的统计学显著差异。

CA125与SP17结合测试在判别早期卵巢癌与良性卵巢肿瘤或健康对照中具有高特异性和灵敏度。

使用不同阈值计算CA125和SP17结合测试的特异性和灵敏度。当CA125使用35 KU/L截断值且SP17使用4.6 ng/mL截断值时，获得了该测试的最优表现：图3E显示了该结合测试的算法。使用不同于生存分析时用得截断值水平(CA125: 35 v.s. 40 KU/L，SP17: 4.6 v.s. 4.7 ng/mL)，获得了结合测试的最高特异性和灵敏度。如果CA125水平高于35 KU/L，该对象被归类为潜在的卵巢癌患者并进行SP17评价。如果SP17水平高于4.6 ng/mL，则确认诊断，否则该对象被归类了健康或具有可能的良性卵巢肿瘤。申请人评价了如下不同组之间判别的测试表现：I/II期卵巢癌与良性肿瘤，I/II期卵巢癌与健康对照，I/II期卵巢癌与无恶性对象(良性肿瘤和健康对照)。对晚期(III/IV)卵巢癌以及所有阶段(I-IV)期卵巢癌也进行了相同的分析。为评价结合CA125和SP17的诊断测试的表现，计算了灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和音响预测值(NPV)(表II)。

讨论

该报告证实，CTA SP17是用于卵巢癌患者的预后和诊断目的的可靠生物标记物。申请人已说明，其可在具有良好预后的良性卵巢肿瘤和卵巢癌之间做出判别。最后，申请人提供了证据证明SP17结合CA125可用于恶性病变的早期检测。

目前，卵巢癌筛选仅在该病的患病率相当高时才在临床上验证，即携带BRCA1/2突变的女性，或具有卵巢癌或乳腺癌家族史的女性。(9)自1981年发现作为潜在生物标记物监测病程后，(22)CA125测量值单独或与经阴道超声(TVU)一起已被广泛用作诊断测试，用于卵巢癌的早期检测，但成功率有限。(23-25)人们一直努力发现新的肿瘤生物标记物，以改善CA125测试特异性和灵敏度。(8)超过30中血清生物标记物已被单独或与CA125结合研究，(9)最有希望的是HE4(26)、间皮素、(27)IL-7。据报道，(28)血清HE4试验(结合CA125)在包括健康对照、子宫内膜异位和卵巢癌的组中具有92.9%灵敏度和95%特异性。(26)基于所评价的组中卵巢癌患病率，预期的PPV为57.2%。当将卵巢癌患者与健康对照比较时，结合CA125的间皮素测试具有86.5%灵敏度和98%特异性，(27)预期PPV为89.5%。申请人之前已显示，当比较I-IV期卵巢癌和携带良性卵巢肿瘤的年龄相匹配女性时，基于IL-7和CA125的测试具有69%灵敏度和100%特异性，预期PPV为100%(28)。

通过免疫组化和RT-PCR进行的独立分析确认了SP17在恶性卵巢癌中的选择性表达。这种表达的高特异性表明，SP17染色对于可靠地判别活检组织样品中的良性病症和卵巢癌有帮助。非SP17的CTA也被检测并建议作为卵巢癌中的可能的预后标记物，例如MAGE、GAGE和BAGE。(29)近期，也报道了很多有前景的用于组织学评价和卵巢癌预后的非CTA生物标记物，例如E-钙粘蛋白(30)、CD157(31)、类固醇和外源性受体(SXR)(32)、HMG-辅酶A还原酶(33)、RCAS1(34)、乳腺珠蛋白B(35)、磷脂酰肌醇聚糖-3(36)和IL-7。(28)它们已显示出于肿瘤阶段或分化级别有关，但没有一个具有完全的特异性。因此，包括SP17的一组标记物有可能被证明是在卵巢肿瘤中提供最高预后指数的最佳免疫组织学工具。SP17仅在卵巢癌样品中选择性表达的发现与之前的研究一致，之前的研究表明SP17允许在该疾病的鼠科动物模型中追踪卵巢癌(14)，以及其在83%的原发性卵巢肿瘤中表达，但正常卵巢细胞不表达。(20)基于这些结果，申请人研究了卵巢癌患者和良性卵巢肿瘤患者或健康对照的外周血中的游离循环的SP17蛋白的存在。数据清楚地显示卵巢癌患者中的血清SP17水平显著高于健康群组或良性群组。CA125也获得了相似的结果，其在本研究中被用作参照物，因为它是经过验证的血清学预后指标。(37,38)这是SP17蛋白第一次在健康个体和癌症患者的血清中被分析。

生存曲线显示SP17是总生存期的独立预后指标。卵巢癌管控的临床决定做出过程中的至关重要的一点是基于恶性风险指数(RMI)(39)或基于ACOG–SGO指引来确定恶性风险(37)。(40)因为两个标准都包括测定CA125，申请人使用SP17测试以改善该预估的阳性预测值。

基于先前已证实SP17在恶性卵巢癌细胞中表达但不在健康卵巢组织中表达(12，20)的研究以及本文提供的预后验证，申请人通过ELISA认为SP17是卵巢癌早期诊断的新血清标记物。该数据显示，对于早期卵巢癌和良性卵巢肿瘤或健康对象的差异诊断，SP17结合CA125测试在所讨论的血清生物标记物中提供最高的PPV，但IL-7例外，但与CA125/SP17测试相比，IL-7的敏感度较低²⁸(分别为69%和83.3%)。

总而言之，申请人已显示出通过ELISA实验测定SP17血清浓度可对具有不同预后的对象，特别是良性卵巢肿瘤和卵巢癌，做出有效判别，并且申请人提供了证据表明SP17血清水平是无进展生存期和总生存期的预后指标。申请人首次显示出了适于早期卵巢癌诊断的血清生物标记物，其可能适用于大规模筛查。

表格

表I. SP17血清水平和CA125血清水平的测定。平均血清浓度(a)以及SP17 (ng/mL)和CA125 (KU/L)的95%置信区间(b)。p*，健康对照与卵巢癌群组的Dunn检验p值；p^?，良性组和OC组的Dunn检验p值。

表II. CA125和SP17结合测试的表现。当判别是OC还是良性病症或健康对照时，结合CA125和SP17测试结果的算法被用来计算灵敏度(Sens)、特异性(Spec)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。

虽然本发明已详细描述多个实施方式，但本领域技术人员会理解，可对这些实施方式做出改变而不背离本发明的精神或所附权利要求的范围。

本文示例性描述的发明可在缺少本文未明确公开的任何元件或限制条件的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应作扩大解释而不做出限制。此外，本文使用的术语和表达方式仅为描述目的，并非构成限制，并且并非是指使用这样的术语和表达方式即排除所显示和描述的特征的或其部分的任何等同体，而要意识到在本发明的范围内可能有各种修改。

因此，要理解的是，虽然本发明已通过优选实施方式和任选的特征进行具体公开，但本领域技术人员可想象到对所具体描述的发明做出修改、改进和变化，并且这些修改、改进和变化被认为是在本发明的范围之内。本文提供的材料、方法和实施例是优选实施方式的代表，是示例性的，并且并非意在限制本发明的范围。

本发明已通过本文进行宽泛和概括性地描述。落入所公开的上位概念的较窄的种类和下位群体也构成本发明的一部分。这包括对本发明进行一般性描述，但设定前提或消极限制以从种类物中移除任何主题内容，而不论陪排除的内容是否明确地在本文提及。

此外，当以马库什群组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员会意识到，本发明也据此以该马库什群组的任何单个成员或成员的子群组的形式描述。

所有本文提及的公开文献、专利申请、专利和其他文献都明确地通过引用以其整体合并至本文中，如同每个都单独通过引用合并到本文中一样。如果存在冲突，则以本发明的说明书(包括定义)为准。

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Claims

1.一种用于确定患者是否可能或不太可能经历卵巢癌的方法，该方法包括测定从该患者分离的样品中SP17基因的表达水平，其中SP17基因表达水平的存在或水平高于预定第一值时将该患者识别为更可能经历卵巢癌，而不存在SP17基因表达或SP17基因表达低于预定第一值时将该患者识别为不太可能经历卵巢癌。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括确定从该患者分离的样品中的CA125基因的表达水平，其中：

a. SP17水平和CA125水平的存在，或SP17水平和CA125水平高于预定第一值，则将该患者识别为更可能经历卵巢癌；

b. CA125水平的存在或CA125水平高于预定第一值，并且SP17水平不存在或SP17水平低于预定第一值，则将该患者识别为不太可能经历卵巢癌。

3.一种用于确定卵巢癌患者是否可能，或不太可能，经历更长或更短的总生存期的方法，所述方法包括测定从该患者分离的样品中SP17基因的表达水平，其中SP17基因表达水平的存在或水平高于预定第一值时将该患者识别为更可能经历更短的总生存期，而不存在SP17基因表达或SP17基因表达低于预定第一值时将该患者识别为可能经历更长的总生存期。

4.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括测定从该患者分离的样品中CA125基因的表达水平，其中：

a. SP17水平和CA125水平的存在，或SP17水平和CA125水平高于预定第一值，则将该患者识别为较不可能具有更长的总生存期；

b. CA125水平的存在或CA125水平高于预定第一值，并且SP17水平不存在或SP17水平低于预定第一值，则将该患者识别为更可能具有更长的总生存期。

5.一种治疗需要治疗卵巢癌患者的方法，该方法包括向所述患者施用有效量的适当治疗，其中所述患者通过包含测定从该患者分离的样品中的SP17基因的表达水平的方法被识别为需要所述治疗，其中存在SP17基因表达水平或SP17基因表达水平高于预定第一值时将该患者识别为需要所述治疗。

6.根据权利要求5所述的方法，所述方法进一步包括测定从所述患者分离的样品中CA125基因的表达水平，其中：SP17水平和CA125水平的存在，或SP17水平和CA125水平高于预定第一值，则将该患者识别为需要所述治疗。

7.根据权利要求1至6的任一项所述的方法，其中基因表达水平是通过包含下述步骤的方法测定的，该步骤为测定由所述基因转录的mRNA的量和/或测定所述样品中的SP17蛋白质的量。

8.根据权利要求1至6的任一项所述的方法，其中基因表达水平是通过包含以下各项中的一项或多项的方法来测定的：mRNA原位杂交、PCR、实时PCR或微阵列。

9.根据权利要求1至6的任一项所述的方法，其中基因表达水平是通过包含由免疫组化检测多肽的方法来测定的。

10.根据权利要求1至9的任一项所述的方法，其中所述患者是人类患者。

11.根据权利要求1至10的任一项所述的方法，其中所述样品选自血液、血清或尿液。

12. 用于诊断、预测和/或治疗卵巢癌患者的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测患者样品中SP17基因的表达水平的适当试剂，以及，任选地，用于检测CA125基因的表达水平的适当试剂，以及用来诊断、预测和/或治疗所述患者的说明书。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述患者为动物、哺乳动物、牛、羊、猪、鼠、狗、马或人患者。

14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，所述试剂盒还包含用于治疗所述卵巢癌患者的特定量的有效治疗剂。