CN104026015A - 利用茉莉酸甲酯诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用茉莉酸甲酯诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，采用如下步骤：(1)铁皮石斛种子播撒于1/2MS培养基表面，在温度23～25℃，光照强度1500～1700lx，光暗比为10h/14h条件下进行培养，获得铁皮石斛组培苗；(2)用2％的无水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为10mmol/L的茉莉酸甲酯母液，将茉莉酸甲酯母液添加到1/2MS培养基中至茉莉酸甲酯终浓度为48～52μmol/L；然后将铁皮石斛组培苗转苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的1/2MS培养基，在26～28℃、相对湿度66～68％、光强1800～2000lx、光暗比为12h/12h条件下培养29～31天。本发明在组织培养中通过施加少量的茉莉酸甲酯，即可大幅提高铁皮石斛中石斛碱的积累效率，投资少，效果显著，方便易行。
Description
技术领域
本发明提供一种利用茉莉酸甲酯诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，属于生物技术领域。
背景技术
石斛碱是铁皮石斛最主要的生理活性成分之一，其药理的强弱与生物碱含量有一定的关系。对铁皮石斛石斛碱的生物学功能和药理药效研究表明它具有增强机体免疫力、抗癌、降血压、以及镇静和止痛作用。
铁皮石斛在自然条件下繁殖率低、生长缓慢、被过度采挖利用以及生态环境的破坏，导致野生资源濒临灭绝，限制了石斛碱生产和进一步开发利用。随着组织培养技术的日趋成熟，国内外学者利用组织培养技术进行铁皮石斛的快速繁殖，以提高繁殖系数，解决资源紧缺的问题。但离体培养的石斛原球茎、组培苗等的石斛碱含量和化学组成及作用等方面与野生石斛相当，仍不能有效解决石斛资源短缺的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种技术工艺简单易行、廉价高效且能显著提高铁皮石斛生产石斛碱效率的利用茉莉酸甲酯诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法。其技术方案为：
一种利用茉莉酸甲酯诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，其特征在于采用如下步骤：
1)制备铁皮石斛组培苗：铁皮石斛种子播撒于1/2MS培养基表面，在温度23～25℃，光照强度1500～1700lx，光暗比为10h/14h条件下培养至苗高3～4cm，获得诱导培养的铁皮石斛组培苗；
2)积累石斛碱：用2％的无水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为10mmol/L的茉莉酸甲酯母液。将茉莉酸甲酯母液添加到培养基中至茉莉酸甲酯终浓度为48～52μmol/L；然后将铁皮石斛组培苗转苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的培养基中，在26～28℃、相对湿度66～68％、光强1800～2000lx、光暗比为12h/12h条件下培养29～31天。
所述利用茉莉酸甲酯诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，其特征在于：步骤1)中，培养基采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基，石斛种子采用浙江雁荡山铁皮石斛种子。
本发明与现有技术相比，其优点是：在组织培养中施加了少量的茉莉酸甲酯，大幅提高了铁皮石斛中石斛碱的积累效率，具有投资少、效果显著、方便易行的特点，对于降低石斛碱的生产成本、满足石斛碱的大规模生产具有重要意义。
具体实施方式
实施例1：
步骤1、制备铁皮石斛组培苗：选用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度23℃，光照强度1500lx，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽，日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3～4cm，即获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。
步骤2、诱导铁皮石斛积累石斛碱：茉莉酸甲酯采用美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产的茉莉酸甲酯。先用2％的无水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为10mmol/L的茉莉酸甲酯母液，将茉莉酸甲酯母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培养基中，至茉莉酸甲酯终浓度为48μmol/L，然后将石斛组培苗转苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的1/2MS培养基，与空白对照组同时在26℃、相对湿度66％、光强1800lx、光暗比为12h/12h条件下培养31天。
实施例2：
步骤1、制备铁皮石斛组培苗：选用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度24℃，光照强度1600lx，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽，日光灯下培养日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3～4cm，即获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。
步骤2、诱导铁皮石斛积累石斛碱：茉莉酸甲酯采用美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产的茉莉酸甲酯。先用2％的无水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为10mmol/L的茉莉酸甲酯母液，将茉莉酸甲酯母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培养基中，至茉莉酸甲酯终浓度为50μmol/L，然后将石斛组培苗转苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的1/2MS培养基，与空白对照组同时在27℃、相对湿度67％、光强1900lx、光暗比为12h/12h条件下培养30天。
实施例3：
步骤1、制备铁皮石斛组培苗：选用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度25℃，光照强度1700lx，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽，日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3～4cm，即获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。
步骤2、诱导铁皮石斛积累石斛碱：茉莉酸甲酯采用美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产的茉莉酸甲酯。先用2％的无水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为10mmol/L的茉莉酸甲酯母液，将茉莉酸甲酯母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培养基中，至茉莉酸甲酯终浓度为52μmol/L，然后将石斛组培苗转苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的1/2MS培养基，与空白对照组同时在28℃、相对湿度68％、光强2000lx、光暗比为12h/12h条件下培养29天。
采用以下方法对本发明中茉莉酸甲酯诱导的铁皮石斛组培苗及空白对照组定期进行观察和检测，具体是每天取少量铁皮石斛样品按以下步骤对本发明茉莉酸甲酯诱导的铁皮石斛及空白对照组中的石斛碱含量进行测定：①精确称取5g铁皮石斛苗，80℃杀青30分钟，60℃烘干至恒重，磨成石斛粉(40目)，加入10mL石油醚回流脱脂0.5h，抽滤后溶于50℃的10mL蒸馏水中；②将活化的纤维素酶加入到脱脂后的铁皮石斛粉末中(用量为石斛粉末质量的0.5％)，恒温酶解1.5h，90℃灭活，冷却过滤；③加入90％乙醇浸提三次，每次0.5h，过滤，蒸干乙醇。加入氯仿萃取三次，合并滤液，蒸干氯仿，得石斛总碱；④采用高效液相色谱法测定石斛碱含量，色谱柱Waters Symmetry C18(4.6mmx250mm，5um)，流动相为水(0.1％三乙胺)-乙腈，梯度洗脱条件为0-20-30min，5％-80％-80％乙腈，流速1.0mL/min，检测波长280nm，柱温为常温，进样量20μl；⑤用甲醇溶解石斛碱纯品，配制成不同浓度的纯品石斛碱溶液，按上述色谱条件进样，记录色谱图及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，μg/ml)进行回归分析，得标准曲线的线性方程；⑥将提取的石斛碱样品溶于甲醇中，0.45μm的滤膜过滤后得石斛碱样品溶液。将样品溶液按色谱条件进行测定，记录色谱图，根据各个样品的峰面积按标准曲线的线性方程计算出石斛碱浓度，得出样品中石斛碱的含量。
结果表明：本发明中用茉莉酸甲酯处理的铁皮石斛苗中所检测的石斛碱含量相比于对照组显著提高，处理后铁皮石斛苗石斛碱的平均含量达到0.45～0.49％，是对照的3.21～3.5倍。
Claims (2)
1.一种利用茉莉酸甲酯诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，其特征在于采用如下步骤：
(1)制备铁皮石斛组培苗：铁皮石斛种子播撒于1/2MS培养基表面，在温度23～25℃，光照强度1500～1700lx，光暗比为10h/14h条件下进行培养，获得诱导培养的铁皮石斛组培苗；
(2)积累铁皮石斛石斛碱：用2％的无水乙醇溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为10mmol/L的茉莉酸甲酯母液，将茉莉酸甲酯母液添加到培养基中至茉莉酸甲酯终浓度为48～52μmol/L；然后将铁皮石斛组培苗转苗到上述添加了茉莉酸甲酯母液的培养基中，在26～28℃、相对湿度66～68％、光强1800～2000lx、光暗比为12h/12h条件下培养29～31天。
2.根据权利要求1所述的利用茉莉酸甲酯诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，其特征在于：步骤(1)中，培养基采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基，石斛种子采用浙江雁荡山铁皮石斛种子。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140910 |