CN104024856B - 基于pI的蛋白质分级 - Google Patents

Abstract

提供了用于基于pI分级检测并收集分析物，通过电泳和pI分离分析物，和使用pI聚焦和后续的结晶纯化目标分子的方法和装置。

Description

基于pI的蛋白质分级

相关专利申请的交叉引用

本申请请求美国临时专利申请编号61/555,564、61/555,592和61/555,674的优先权，全部于2011年11月4日递交，且均通过引用全文纳入本文用于全部目的。

背景技术

目前基于等电聚焦的蛋白质/肽分级技术有至少两种缺陷。首先，样品在固定或有限的pH范围内分离，导致各样品的分级效果未能达到最优。其次，样品分级所需的pH梯度是由化学品(两性电解质)建立的，导致经分离的样品受到化学品污染和(潜在的)对下游分析的干扰。

发明内容

在一些实施方式中，本发明提供了一种分离和检测样品中分析物的装置，所述装置包括用于沿一条轴线盛放含多种分子分析物的溶液的腔室，在腔室的轴线的第一末端有样品注射端口且在轴线的第二末端有出口；用于在腔室内沿轴线施加电场的电源；通过双极膜与所述腔室分离的一个或多个离子源，用于通过注射离子流在所述腔室中沿所述轴线建立pH梯度，能够在pH梯度中形成一级或多级pH；操纵所述一个或多个离子源以调节pH梯度来使得所述分子分析物沿轴线分别迁移的控制器；以及一个或多个出口，以允许通过所述出口将一种或多种分析物收集至容器或分析仪器(如质谱仪或其他检测系统)内。在一些实施方式中，所述一个或多个离子源是质子注射器或氢氧根注射器。

在一些实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质(或其他目标分子，包括但不限于核酸)的蛋白质混合物，其中所述腔室包含第一和第二电极以及至少一个位于腔室壁上电极之间的质子注射器或氢氧根注射器，通过双极膜与腔室中的样品分离；使用质子注射器或氢氧根注射器在腔室内产生pH梯度，并施加跨电极的电压，从而基于蛋白质等电点(pI)对腔室内的蛋白质进行定位；通过与通道流体连通的端口捕获一种或多种蛋白质；并且对一种或多种捕获的蛋白质进行凝胶电泳。

在一些实施方式中，所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从电泳凝胶中收集一种或多种蛋白质。

在一些实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离一种或多种目标蛋白质(或其他目标分子，包括但不限于核酸)的方法，所述方法包括，向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质的蛋白质混合物，其中所述腔室与一个或多个离子源相连，所述离子源通过双极膜与所述腔室分隔，用于通过注射离子流在所述腔室内沿所述轴线建立pH梯度，能够在pH梯度中形成一级或多级pH；对腔室内蛋白质进行电泳；并且随后使用质子和/或氢氧根注射器在腔室内建立pH梯度，从而基于蛋白质等电点(pI)对腔室内的蛋白质进行定位。

在一些实施方式中，在产生pH梯度期间继续进行电泳。在一些实施方式中，所述从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法也包括收集一种或多种目标蛋白质。

在一些实施方式中，本发明提供了一种同时根据等电点和电泳迁移率分离多种分子分析物的装置，所述装置包括，用于沿一条轴线盛放含多种分子分析物的溶液的腔室，其中所述腔室包含一个或多个与腔室流体连通的端口，端口可位于腔室内以根据分析物的pI捕获所需的分析物，或者能够移动以将一个或多个端口定位在一个或多个所需的位置处；用于在腔室内沿轴线施加电场的电源；通过注射离子流在所述腔室内沿所述轴线建立pH梯度、且能够在pH梯度中形成一级或多级pH的一个或多个质子/氢氧根源；操纵所述一个或多个离子源以调节pH梯度来使得所述分子分析物沿轴线分别迁移的控制器；以及一个或多个与所述一个或多个端口流体连通的电泳通道，从而允许对所述一个或多个端口中捕获的分析物进行电泳。在一些实施方式中，所述质子或氢氧根源是通过双极膜与腔室分隔的质子注射器或氢氧根注射器。

在一些实施方式中，本发明提供了一种同时根据等电点和电泳迁移率分离多种分子分析物的装置，所述装置包括，用于沿一条轴线盛放含多种分子分析物的溶液的腔室；用于在腔室内沿轴线施加电场的电源；通过注射离子流在所述腔室内沿所述轴线建立pH梯度、且能够在pH梯度中形成一级或多级pH的一个或多个质子/氢氧根源；操纵所述一个或多个离子源以调节pH梯度来沿轴线分别迁移和捕获所述分子分析物的控制器。在一些实施方式中，所述质子或氢氧根源是通过双极膜与腔室分隔的质子注射器或氢氧根注射器。

在一些实施方式中，所述腔室包含适用于电泳的筛分介质。在一些实施方式中，所述腔室包含一个或多个与腔室流体连通的端口并且端口位于腔室中以根据分析物的pI捕获所需的分析物，或者端口能够移动以将一个或多个端口定位在一个或多个所需的位置处。

在一些实施方式中，本发明提供了一种从样品中纯化目标蛋白质的方法，所述方法包括，向腔室中加入样品，所述样品含有包含所述目标蛋白质的蛋白质混合物；使用质子和/或氢氧根注射器在腔室中产生pH梯度，从而基于蛋白质等电点(pI)对腔室内的蛋白质进行定位；收集所述目标蛋白质，从而从混合物的其他组分中纯化所述目标蛋白质；以及捕获后对所述蛋白质进行结晶。

在一些实施方式中，通过与通道流体连通的端口收集所述目标蛋白质。在一些实施方式中，通过与通道流体连通的多个端口收集多种目标蛋白质。

附图说明

图1A和1B分别显示了质子和氢氧根注射器，包含与通道/腔室相邻的一个小隔室，其中浸有Pt电极，以及将隔室与通道/腔室分隔的双极膜。

图2显示了可能的电解质及其与质子注射器的相互作用。应当意识到，使用氢氧根注射器可提供类似的相互作用。

图3就质子/氢氧根注射器装置显示了一种实施方式。

图4显示了在质子注射器或氢氧根注射器装置中使用的集成式一次性通道的实施方式。可按需要设置用于使流体接触质子/氢氧根注射器隔室的狭缝。例如，在一些实施方式中，腔室中的狭缝为1-1000微米，在一些实施方式中约100微米。可按需要设计狭缝的数量和大小以建立多级pH梯度。如图4所示，任选例如纤维素或其他亲水膜，作用是覆盖未使用的狭缝和/或可任选覆盖双极膜，覆盖程度是使得样品组分与双极膜之间存在亲和力。在一些实施方式中，可使用亲水涂料代替亲水膜覆盖双极膜并阻止样品组分与之结合。此外，还有狭缝可用于将样品提取出或注射入通道。

图5A-C显示了pH分级梯度的产生和使用该梯度分离目标分子。图中，双极膜(2)产生了一个大的pH差异，从而使样品中不需要的组分(1)远离目标分析物聚焦。第二双极膜(4)以目标分析物(3)的pI为中心建立了较小的pH差异。可任选地在腔室中的通道(5)内收集目标分析物(3)。

图6显示了pH分级梯度的产生和使用该梯度分离多种目标分子。该实施方式可用于后续应用，进行电泳或其他应用。

图7显示了pH分级梯度的产生和使用该梯度分离目标分子。这可用于例如蛋白质清除、捕获和直接注射入质谱(MS)或其他检测方法。

图8A-D显示了使用pH梯度分离和收集目标分子。

图9A-B显示的实施方式中，本文所述腔室或通道适用于将分析物输送至质谱(图9A)或光源(图9B)。

图10A-C显示了对目标分子进行的数字pH分析分离。

图11显示了在一个维度中基于两种分离标准对分子进行分离的实施方式。图11显示了图中从顶部至底部运行的同一通道在四个时间点(a)、(b)、(c)和(d)的情况。通道左侧的数字表示pH，在沿通道每个显示有pH的位置都有一个质子或氢氧根注射器。图中显示了样品组分(111、112、113、114、115)在各时间点((a)、(b)、(c)和(d))的电泳移动的情况。

图12显示了基于pI和另一维度的第二个分离标准对分子进行分离。

图13显示了一个实施方式，其中基于pI从污染物中分离目标蛋白质并随后进行结晶。从污染物中分离蛋白质，移至腔室内，可任选地使用集成回路，并进行结晶、快速冷冻和/或成像。

图14A显示了在缓冲液中电泳并在同一充有缓冲液的腔室内通过H⁺注射进行“捕捉”的绿色荧光蛋白(GFP)信号。图14B显示了GFP沉淀/“捕捉”且加入CY5标记的抗GFP抗体后的CY5信号。所用缓冲液为4mM柠檬酸钠、4mM磷酸钠(磷酸氢二钠)、4mM焦磷酸钠和13mM硫酸钠、pH 8.5。

图15A显示了在缓冲液中电泳并在同一充有缓冲液的腔室内通过H⁺注射进行“捕捉”的绿色荧光蛋白(GFP)信号。图15B显示了GFP沉淀/“捕捉”且加入CY5标记的抗兔(非特异性)抗体后的CY5信号。所用缓冲液为4mM柠檬酸钠、4mM磷酸钠(磷酸氢二钠)、4mM焦磷酸钠和13mM硫酸钠、pH 8.5。

具体实施方式

如此处所详述，提供的方法和装置允许在装置的腔室内从样品中检测、纯化和/或分离目标分子(如蛋白质、肽、核酸等)，可任选地使用1)电场以移动目标物，连同2)使用质子或氢氧根注射器电子控制腔室分区中的溶液pH值。所述方法利用目标物电荷的pH依赖性，例如通过将接近分区的溶液pH值设置为等于或接近感兴趣目标物的pI的特定pH，使得带电的目标物定位在特定分区中。在目标物的pI处，目标物变为不带电从而在电场中不再移动。下文叙述了多个使用这一方面的数种实施方式。

所述装置可具有多种配置。在一些方面，所述装置包含至少一个含有第一和第二电极的腔室，用于在电场中移动带电目标物。腔室可包含一个或多个(如1、2、3、4、5或更多个)通过双极膜与腔室分隔的质子或氢氧根注射器，其中所述注射器包含一个电极，从而能够对水分子进行电水解。参见图2。术语“腔室”和“通道”在本文中同义使用。这些术语包括长度远大于宽度(如10x、100x、1000x)的容器，允许沿腔室的长轴放置多个注射器。

在不限制本发明范围的前提下，这里指出已构建以下尺寸的腔室。

“狭缝”指腔室中孔隙的尺寸，质子或氢氧根注射器通过狭缝与腔室相连。狭缝处的双极膜将腔室与注射器隔离。

电极的方向(即，哪个是阴极哪个是阳极)取决于溶液中待移动分子的电荷和待移动的方向。例如，当在阳极和阴极之间的腔室内溶液中存在电压差时，带正电荷的分子向阴极移动而带负电荷的分子向阳极移动。

通常，电极应定向为使得它们彼此尽可能地靠近，即正对彼此。虽然其他配置也可被考虑并有可能，但电压和电阻将随着距离增加。

在一些情况下，腔室内的电极会干扰和/或结合腔室内的目标分子(如蛋白质)。因此，在一些实施方式中，使用膜或凝胶分隔电极与腔室，从而避免目标分子结合电极。

腔室的大小和形状是可变的。虽然腔室被描述为管道或通道(即电极间的距离比其他轴向的距离长)，但也可使用其他配置。

质子或氢氧根“注射器”至通过孔或“狭缝”与分腔室或其他容器(如储器)分离并由双极膜分隔的一个或多个隔室，所述隔室含有电极。根据隔室内电场的方向(如阴极和阳极的方向)，隔室可被设计用于通过双极膜注射质子或氢氧根离子并注入邻近的腔室内。

通过控制电流和配置，可以控制腔室内靠近质子或氢氧根注射器的溶液的pH值。通常希望增加双极膜的表面积以降低电阻。

膜通过形成将隔室内的溶液与腔室分开的屏障，例如至少达到腔室内溶液的水平，来将隔室与腔室“分隔”。举例来说，在腔室顶部为开口(或者含有可移除的顶盖)的实施方式中，膜可被设计用来将隔室与腔室完全分隔，所述分隔至少达到腔室和/或隔室内溶液的水平，或者达到设计的溶液最大加载量的水平。如所要求的那样，可将膜设计为高于溶液水平以避免从一部分至另一部分的意外转移(如泼洒)。如果需要，膜可由固体物质(如塑料)“加框”，或者另行固定在腔室和隔室之间。

电极可以是由任意导体或半导体物质形成。例如在一些实施方式中，一个或多个电极包含金属。在一些实施方式中，所述金属是锌、铜或铂。例如，电极可以是铂或镀铂的。通常希望电极的表面积最大，例如扁平的电极可以提供比电线更多的表面积。

国际专利申请公开号WO2009/027970描述了在特定环境(如电解质溶液和凝胶等)中用于生成质子或氢氧根离子局部浓度、质子或氢氧根浓度梯度和所需的质子或氢氧根浓度分布的方法和装置(例如，质子或氢氧根注射器)。国际专利申请公开号WO2011/021195和WO2011/021196描述了使用质子/氢氧根注射器进行等电聚焦的方法和装置及所显示的数据。

质子/氢氧根注射技术可被用于影响腔室内溶液，或至少注射器附近的腔室内溶液的pH值。简单来说，在一些实施方式中，质子/氢氧根注射器包含与装置腔室相邻的隔室，隔室内含有电极，双极膜将隔室与通道分离，参见例如图1A-1B。双极膜是一种具有一定结构的离子交换膜，其中阳离子交换膜和阴离子交换膜结合在一起，可将水分子分解为质子和氢氧根离子。由双极膜分隔的隔室和通道之间所施加的电压导致水的分解且质子或氢氧根离子被注射到通道内。该技术的优点包括例如无泡水解和将所生成的离子直接注入通道内以缩短反应时间(例如需要时可低于1分钟)。

通过对腔室中电极施加适当的电压，可形成贯穿腔室内溶液的电场，带电分子因而移动。在一些实施方式中，可在腔室内靠近阳极或阴极处加入带电分子(在pH至少部分由质子注射器或氢氧根注射器控制的情形中)，随后施加电压，从而可以在用户设定的时间将带电分子输送至腔室内所需的位置上。

分子移动的方向取决于分子所带电荷和所施加电压的极性。

提供了整合这些装置的系统。系统可包括例如电源和功率调节器以控制腔室和/或注射器内电极的电流和/或电压，参见，例如图3。可以包含用于调节液体流动的泵，用于搅拌或混合腔室内溶液的机制，以及加热或冷却单元。在一些实施方式中，该系统在腔室内包括一个pH和/或电导探针。通常希望将探针放置在电极间远离电场线的距离以利于读取。

用于基于pI分级检测和收集分析物的方法和装置

可使用本文所述质子和/或氢氧根注射器在充有合适的缓冲液的腔室内部生成pH范围跨度为约2-12(可按需要进一步扩展或压缩)的动态可调节pH“梯级”。本文所述的用于控制pH的质子或氢氧根注射器的应用可设计为使得目标分析物在仅仅几分钟内(例如在一些实施方式中，小于如10、20或30分钟)到达其pI。

图5A展示了这类梯度的一个示例。图5A显示了一个实施方式，其中使用腔室两个区域之间相对大的pH差异(左侧)捕获pI在该pH范围内的大部分分析物。右侧显示了较小的pH范围(特别设计成覆盖特定目标分析物的pI)，能够分离目标分析物而不带有样品中的大量其他组分。经适当缓冲的分析物(包括但不限于蛋白质和/或肽)的复杂混合物被输送至腔室内部的电场中，用于在单一pH梯级(参见图5B)或横跨所需pH范围的多重pH梯级中在其相应的等电点(pI)处“捕获”蛋白质(或肽)。随后在一些实施方式中，需要收集经纯化的目标物时，可将不含两性电解质的带电物质从腔室中释放至收获腔室内，用于收集和下游分析，参见例如图5C。可通过例如物理泵、电渗泵、或在(每个)梯度“梯级”处电子调节H⁺/OH^-生成来实现经纯化的目标物从腔室至收集处的移动，参见例如图5C。该方法能够实现多种蛋白质/肽样品(通过样品依赖的方式调节蛋白质/肽的捕获和释放)或其他样品类型(如核酸或其他)的最优化分级，同时不会发生标准等电聚焦中常见的化学两性电解质污染。

如图6所示，在一些实施方式中，多个双极膜(61)被直接置于通道(62)(本文中也可称作“腔室”)狭缝下。分离通道可充有合适的缓冲液。通过双极膜注射质子或氢氧根离子以生成分级梯度，如pH值图中所示(图6)。通过电极(64)和(65)施加正交电场后，肽或蛋白质(63)在与其pI相应的梯级处聚焦。可使用任选的渗透膜或渗透屏(66)建立肽或蛋白质聚焦的腔室。聚焦完成后，通过与通道流体连通的收获口(67)收集目标分析物(例如，肽或蛋白质)，完成特定pI的目标分析物的收集。收集口可具有有利于收集的直径。在一些实施方式中，收集口的直径为100微米或更小，例如直径1-100微米。

在一些实施方式中，该技术用于解决两个问题：对感兴趣蛋白质的清理(例如清除或减少一种或多种污染物)和/或浓缩。

在一些实施方式中，例如图7所示，蛋白质样品被分成至少三级：

-pI高于目标蛋白质(或其他目标分析物)pI的蛋白质等电聚焦在双极膜中所产生的pH梯级包含高于抗原pI的pH的区域(71)中。

-通过产生狭窄的、包含感兴趣蛋白质pI的pH范围梯级，感兴趣的蛋白质在双极膜的区域(72)中聚焦。

-pI低于目标蛋白质pI的蛋白质等电聚焦在双极膜中所产生的pH梯级范围低于感兴趣蛋白质pI的区域(73)中。

通过这种方式，感兴趣的蛋白质可以从其他蛋白质和其他污染物中分离(纯化)并浓缩在收获通道附近区域。随后可经由收获口或通过收获通道(74)收获感兴趣的蛋白质。在一些实施方式中，可使用例如液体流或电泳完成收获。

图8A-D显示了蛋白质清理和捕获的实施方式。在这些实施方式中，利用电泳生成的pH分级梯度进行蛋白质纯化。一般来说，当纯化过程是基于大分子的某些已知特性(如质量、迁移率、亲和性)时，从混合物中纯化特定大分子是最高效的。亲和柱、电泳、离子交换柱和许多其他纯化技术的情况就是这样。在本文所述实施方式中，分子的相关特性包括其等电点(pI)和电场下的迁移率。

在纯化装置的一些实施方式中，在感兴趣的蛋白质(POI)连同一些杂质(例如样品的其他组分)所加入的通道中建立pH梯级。所述pH梯度根据POI以及周围杂质的pI设计，使得前者的pI在梯级范围内而后者的pI不在。通过这种方式，蛋白会如图7所示聚焦于狭窄的条带，而后者会继续朝通道末端迁移。在杂质和POI的等电点差别分明或者杂质没有pI的情况下，该流程是非常简单的。当pI接近时，可以使用迁移率的差异作为标准之一进行分离。

图8A-D给出了一个实施例。POI和一些杂质(分别用“P”和“I”标记)在恒定pH条件下迁移(图8A)。当杂质比蛋白质更快时(最可能的是此时杂质是小分子或短肽)，两者之间出现间隙(图8B)。当间隙足够大时，如图8C所示将恒定的pH模式转变为酸性抑制模式，导致蛋白质在pH梯级中聚焦而杂质继续朝通道末端迁移(图8D)。在一些实施方式中，除纯化电源外，装置还会包含回收系统，例如用于POI的进一步分析。

图9A-B显示了本文所述技术的一些方面，其中通过pH分级梯度对简单或复杂的蛋白质或肽混合物(样品)进行等电聚焦并检测了样品中的一种或多种目标分析物。如图9A所示，在一些实施方式中，可在建立了pH梯度的腔室末端配置喷嘴或其他装置，用于将等电纯化后的部分直接输送至质谱仪(MS)。这样能够将简化后的样品(从最初的复杂性较高的混合物开始)输送至MS装置且不含两性电解质(这会出现在其他类型的等电聚焦中并会干扰MS)。或者，如图9B所示，可使用其他检测器检测等电聚焦后的分析物，检测器包括但不限于内嵌荧光检测器(用于检测荧光标记的分析物)、光源、UV光源等。

在一些实施方式中，一种或多种目标分子可基于pI通过使用一个或多个质子或氢氧根注射器来聚焦并随后进行电泳。当使用质子/氢氧根注射器时能够将pI部分精确定位在所需位置(例如在第二维通道顶部)。相反地，到等电聚焦(IEF)稳态并且因此条带无法移动通过检测器，这意味着检测器需要沿毛细管移动或者需要对整个毛细管进行成像。在如本文所述进行pH电子控制时，目的条带可以传输至检测器，从而简化设计。

在一些实施方式中，质子注射器或氢氧根注射器介导的pH聚焦方法可用于分析目的。在传统IEF凝胶或胶条中，样品以空间形态进行分析，蛋白质根据凝胶上pH位置在其pI处聚焦。相反地，在使用质子注射器或氢氧根注射器的实施方式中，可建立目标物(如目标蛋白)含量相对于pH值的动态图。图10A-C显示了一个实施例。最初在通过双极膜(102)与通道分离的质子注射器或氢氧根注射器所建立的宽pH梯级中捕获到了含目标物的样品(101)。然后改变梯级较低(或较高)范围的pH值，使得pI高于pHl(该梯度中pH值的低端)且低于pHh(该梯度中pH值的高端)的样品组分(103)开始向通过由第二双极膜(104)与通道分离的第二质子注射器或氢氧根注射器迁移，例如通过扩散或使用通道中的电极使带电组分经电泳进一步沿通道向下移动。通过增加pHl和pHh的pH值，可使样品组分从膜102移动至膜104。通过维持较小的ΔpH值，可使该方法有很高分辨率。可使用任意已知方法检测目标分子，包括但不限于使用吸光度、荧光(通过与蛋白质共价或非共价连接的染料传输)。如图10C所示，在一些实施方式中，使用了发光二极管(105)和光捕获二极管(106)检测经激发染料所放出的光，从而检测蛋白质或其他目标分子。该方法可用于例如确定pI与复杂样品或经纯化的蛋白质的量之间的关系(例如观察带电异构体时)。

在一些实施方式中，通道充有凝胶而非液体，并且可通过迁移率和pI标准分离样品组分。例如可如图11所示设计该技术。质子/氢氧根离子注射器促进由质子和氢氧根离子注射入分离通道所生成的空间pH模式的实时变化。结果是，可以按需要调节用于根据等电点分离肽和蛋白质的pH梯度，便于根据等电点和另一分离标准(如电泳迁移率或亲和试验)的后续分离。可按需要选择两种分离步骤的顺序以确保达到最优分离效果。

可使用公开的一维可编程技术代替传统的二维分离凝胶。图11显示了这类分离的一个实施方式，首先根据电泳迁移率随后根据等电点。在这些实施方式中，腔室中的介质是适合电泳的凝胶(包括但不限于线性或交联聚合物，例如琼脂糖、线性或交联聚丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物的聚合物或其他凝胶类型)。例如，设想一个5种蛋白质的混合物，其中两种(114和113)的特征为电泳迁移率相同但等电点不同，两种(113和112)蛋白质的等电点相同但电泳迁移率不同。此外，设想我们的目的是分离113蛋白质。在步骤(a)中，通道的pH值被设为7并根据电泳迁移率分离蛋白质。由于在图11的具体实施例中，相比于蛋白质111和112，113和114蛋白质的迁移率更高，经过一段时间后它们与前者分离(图11，小图(b))。然而，由于电泳迁移率相似，电泳试验无法从114蛋白质中分离113蛋白质。为了从114蛋白质中分离113蛋白质，沿通道调节pH模式使得113蛋白质与114分离(图11，小图(c)、(d))。同时，在通道其他部分对pH模式的适当设计将111、112和115蛋白质推离113和114蛋白质(图11，小图(c)、(d))。该方法的结果是根据两种不同标准(电泳迁移率和等电点)、在同一一维通道内分离所需(113)蛋白质。

在另一选择中，例如如图12所示，根据pI在一维中分离样品，随后根据迁移率进行第二维分离。在一些实施方式中，在包含液体缓冲液的通道(122)中包括多个双极膜(121)(并在图的平面下方或上方附带质子注射器或氢氧根注射器)。通过注射质子或氢氧根离子并沿通道施加电压，分级梯度得以建立且蛋白质聚焦于相应pH梯级中。聚焦完成后，打开位于每个(如垂直)通道两侧的阀门(123)并在电极(124)处施加电压，即可对聚焦后的蛋白质进行第二维分离。可根据分子量、电荷或电荷和分子量进行第二维分离。例如，在一些实施方式中，第二维包含电泳，包括但不限于SDS-PAGE或非变性PAGE分离。分离介质可以是例如交联凝胶、纠缠态聚合物或缓冲液。用于第二分离的缓冲液可置于例如缓冲液池(125)中。所述缓冲液可以是液体或嵌入凝胶内。需要时，可使用两种不同缓冲液进行较高分辨率的不连续分离。

也可通过使用捕获与释放方法以及单个第二维通道实现二维分离。在这种情况下，可在第二维中分离首先被捕获的部分，再分离随后被释放的部分。该分离方法可用于分析目的或需要时可在通道中加入收获端口以收获经分离的分析物。

使用pI聚焦以及后续结晶纯化目标分子的方法和装置

结晶用于分析蛋白质结构。这是一种非常有价值的技术，但同时由于对蛋白质纯度的要求很高而极具挑战性。通常蛋白质被纯化至高于90％纯并浓缩至约10mg/ml。结晶过程在pH＝蛋白质pI下进行。通常结晶过程具有挑战性，经常使用2至5种不同分离步骤以达到高纯度。此后使用分子量截留膜对蛋白质进行浓缩。关于蛋白质结晶和X射线衍射的示例可参见Yamano A等，J Biol Chem.272(15)：9597-600(1997)。

本申请提供了基于质子注射器和/或氢氧根注射器的方法以纯化用于结晶的蛋白质。在一些实施方式中，使用质子/氢氧根注射器技术以将目标蛋白质聚焦在其pI处。这可作为纯化工作流的一部分或在一些实施方式中作为纯化工作流的最后一步或倒数第二步，如在结晶前。在一些实施方式中，可组合该质子/氢氧根注射器步骤，作为最后的纯化和浓缩步骤。在一些实施方式中，该质子/氢氧根注射器步骤提供了与通常使用的色谱步骤正交的附加纯化步骤，并且同时能够高度浓缩蛋白质，从而基本无需进行单独的浓缩步骤。

图13显示了一个可能的实施方式。在该实施方式中，双极膜(131)产生了一个高于目标蛋白质pH的pH梯级，从而捕获所有pI高于目标蛋白质pI的蛋白质。通过由第二双极膜(132)与通道分离的第二质子注射器或氢氧根注射器在目标蛋白质pI处产生一个非常狭窄的pH梯级，从而在该位置捕获和浓缩目标蛋白质。通过由第三双极膜(133)与通道分离的第三质子注射器或氢氧根注射器产生了一个低于目标蛋白质pI的pH梯级，从而捕获所有pI低于目标蛋白质pI的蛋白质。一旦在非常明确的边界内捕获并从而高度浓缩聚焦目标蛋白质后，可通过电泳或液体流将目标蛋白质移动至能够回收或储存蛋白质的地方以用于结晶并在微流盒中直接使用X射线成像。在如图6所示的一些实施方式中，可能同时捕获并处理多种蛋白质。在一些实施方式中，可使用阵列立即结晶多种蛋白质或对同一蛋白质进行多种条件的测试。

在所附权利要求中，术语“一个”或“一种”旨在表示“一个或多个”。在一个步骤或成分前使用的术语“包含”或其变体，诸如“包括”和“含有”旨在表示加入进一步的步骤或成分是可选的且不被排除在外。

术语样品涉及任何类型的样品，包括但不限于生物样品。“生物样品”包括从生物体中获得的多种样品类型。该术语包括体液(如血液、唾液、血清、血浆、尿液和生物来源的其他液体样品)、固体组织样品(例如活体切片或组织培养物或衍生于此的细胞及其后代)。该术语包括获得后经过任意方法处理的样品，如试剂处理、增溶、沉降或某些组分的富集。该术语包括临床样品，也包括细胞培养液中的细胞、细胞上清、细胞裂解液、血清、血浆、其他生物液体和组织样品。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以表示氨基酸残基聚合物。该术语可用于表示一个或多个氨基酸残基是相应自然形成氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及自然形成的氨基酸聚合物、含修饰残基的氨基酸聚合物和非自然形成的氨基酸聚合物。肽可以是任意长度的两个或多个氨基酸，如6-100个、80-50个、10_40个氨基酸等。

术语“氨基酸”表示自然形成的和人工合成的氨基酸，以及功能与自然形成氨基酸相近的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。自然形成的氨基酸指由遗传密码所编码的以及随后被修饰的氨基酸(如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物指基本化学结构与自然形成的氨基酸相同的化合物，例如与一个氢原子、一个羧基、一个氨基和一个R基团相连的一个α碳原子，如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物可含有经修饰的R基团(如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留了与自然形成的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指结构与氨基酸的一般化学结构不同但功能与自然形成的氨基酸相近的化合物。

本说明书中引用的所有专利、专利申请和其他公开参考材料均通过引用全文纳入本文。本文所引用的任何参考材料或任何现有技术与本说明书的明显启示之间存在的任何差异都通过有利于本说明书中的启示来解决。这包括本领域技术人员所能理解的一个词或短语的定义与同一词或短语在本说明书中明确提供的定义之间的任何差异。

实施例

实施例1：基于pI分离目标物

将两种荧光标记肽(一种pI为5.0，一种pI为6.8)置于含pH 8.5磷酸盐缓冲液的腔室中。该腔室包含两个质子注射器，其中第一质子注射器上所施加电流为150μA，第二质子注射器上所施加电流为65μA，从而在溶液中产生具有不同pH值的分离的局部区域。由于电流较高，第一注射器在其附近的腔室区域中建立的pH值比第二注射器附近的pH值更酸。横跨腔室建立了电场，从而根据电荷移动带电分子。pI 6.8的肽聚焦在第一质子注射器附近的区域而pI 5.0的肽聚焦在第二质子注射器附近的腔室区域。这表明通过对分子移动进行电子控制连同使用离子注射器控制溶液中局部区域pH值进行定位的方式，不同pI的分子能够在腔室内溶液的不同区域中移动和分离。

实施例2：基于pI沉淀/捕获目标物

该试验显示了在持续H⁺注射的条件下，一些目标分子在位于其pI处沉淀或附着于通道表面，且随后可免疫检测所得目标物。将绿色荧光蛋白(GFP，1μg)和人类唾液(1.5μg)与STB 8.5(各4mM的柠檬酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠和13mM硫酸钠，pH 8.5)混合并将所得的混合物加入含一个质子注射器的腔室内。设置该注射器以生成包含GFP的pI(～5.4)的pH梯级并通过跨腔室的第一和第二电极施加电压，从而使得GFP在腔室中电泳直至pH梯度处，GFP在此由于缺少电荷而停止移动。等电聚焦后，经过持续H⁺注射(＞15分钟)，可在双极膜(BPM)上“捕捉”GFP。

虽然并不一定适用于所有目标，持续H⁺注射后GFP沉淀/附着于通道表面。随后关闭H⁺注射流。GFP定位于pH梯级处。随后，在腔室中加入由Dyelight649/DL649标记的抗GFP抗体，沿通道并在GFP沉淀上电泳60分钟。经过Cy5过滤器的信号(也检测DL649荧光)显示抗GFP抗体定位于GFP处，证明该系统检测了定位于pH分级梯度处的目标分子。相反地，显示了使用非特异性抗兔抗体进行的平行实验的结果，此时只能观察到来自于非特异性抗体的背景信号。

可以理解，本文所述实施例和实施方式仅用于说明目的，但从实际出发会暗示本领域技术人员进行多种修改或变化，这些修改或变化应纳入本申请的宗旨和范围，并落入所附权利要求书的保护范围内。本文引用的所有公开材料、发明和发明申请均通过引用全文纳入本文用于全部目的。

Claims (10)

1.一种在一个维度中从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法，所述方法包括，

向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质的蛋白质混合物，其特征在于，所述腔室包含第一和第二电极和位于所述腔室壁上所述电极之间并通过双极膜与所述腔室中的所述样品分离的至少一个质子注射器或氢氧根注射器；

跨越所述电极施加电压，从而使蛋白质基于所述蛋白质的电泳迁移率沿着所述腔室的一个维度定位；

使用所述质子注射器或氢氧根注射器产生pH梯度，从而使蛋白质基于所述蛋白质的等电点(pI)沿着所述腔室的同一个维度定位；并且

使一种或多种蛋白质从腔室移动入与通道流体连通的端口，所述移动通过物理泵或电渗泵实现。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述腔室包括聚丙烯酰胺凝胶。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述方法还包括从所述聚丙烯酰胺凝胶中收集所述一种或多种蛋白质。

4.一种在一个维度中从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法，所述方法包括，

向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质的蛋白质混合物，其特征在于，所述腔室连有通过双极膜与所述腔室分隔的质子和/或氢氧根注射器，用于通过注射离子流在所述腔室内沿一条轴线建立pH梯度，能够在pH梯度中形成一级或多级pH；

沿所述腔室的所述轴线对所述腔室内的蛋白质进行电泳；以及

随后使用质子和/或氢氧根注射器在所述腔室内产生pH梯度，从而使蛋白质基于所述蛋白质的等电点(pI)和电泳迁移率沿着所述腔室的轴线定位。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，在所述pH梯度建立期间继续进行所述电泳。

6.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述方法还包括收集所述一种或多种目标蛋白质。

7.一种在一个维度中同时根据等电点和电泳迁移率分离多种分子分析物的装置，所述装置包括，

用于沿一条轴线盛放含多种分子分析物的溶液的腔室；

用于在所述腔室内沿所述轴线施加电场的电源；

通过注射离子流在所述腔室内沿所述轴线建立pH梯度，能够在pH梯度中形成一级或多级pH的一个或多个质子/氢氧根源；和

操纵所述一个或多个质子/氢氧根源以调节所述pH梯度来引起所述分子分析物沿所述轴线分别迁移并捕获的控制器，

其中所述腔室包含适用于电泳的筛分介质。

8.如权利要求7所述装置，其特征在于，所述腔室包含与所述腔室流体连通的一个或多个端口，并且所述端口能够移动地定位于所述腔室中以根据分析物的位置捕获所需的分析物。

9.一种在一个维度中从样品中纯化目标蛋白质的方法，所述方法包括，

向腔室中加入样品，所述样品含有包含所述目标蛋白质的蛋白质混合物；

跨越电极施加电压，从而使蛋白质基于所述蛋白质的电泳迁移率沿着所述腔室的一个维度定位；

使用质子和/或氢氧根注射器在所述腔室中产生pH梯度，从而使蛋白质基于所述蛋白质的等电点(pI)沿着所述腔室的同一个维度定位；

使所述目标蛋白质从腔室移动入与通道流体连通的一个或多个端口，其中所述移动通过物理泵或电渗泵实现，从而从所述混合物的其他组分中纯化所述目标蛋白质；以及

捕获后对所述蛋白质进行结晶。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，通过与所述通道流体连通的多个端口收集多种目标蛋白质。