CN104003844A

CN104003844A - 萃取与发酵耦联分离发酵液中2,3-丁二醇的方法

Info

Publication number: CN104003844A
Application number: CN201410223050.6A
Authority: CN
Inventors: 戴建英; 刘春娇; 修志龙
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2034-05-23
Also published as: CN104003844B

Abstract

本发明公开了一种萃取与发酵偶联分离发酵液中2,3-丁二醇的方法。该方法为：向2,3-丁二醇发酵液中加入一定量的糖或/和无机盐，溶解，得到含糖混合液；向含糖混合液中加入有机溶剂，振荡混合，混合液在15～40℃下静置或离心至分相，上相为富含2,3-丁二醇的有机相，下相为富含糖的水相；上相在低于105℃条件下进行减压蒸馏除去有机溶剂和水，得2,3-丁二醇粗品；下相去除有机溶剂，加入水稀释至糖浓度为80～200g/L，接入菌体，进行2,3-丁二醇的发酵。本发明的方法操作简单、分离能耗低，实现了发酵与分离的耦合，是一种具有工业应用前景的从发酵液中分离2,3-丁二醇的方法。

Description

萃取与发酵耦联分离发酵液中2,3-丁二醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及到微生物发酵液的分离技术，特别涉及一种利用萃取技术耦合发酵分离发酵液中2,3-丁二醇的方法。

背景技术

2,3-丁二醇是一种重要的化工原料和液体燃料，被广泛应用于化工、医药、食品、燃料及航空航天等多个领域。2,3-丁二醇脱氢得到双乙酰，是食品风味添加剂和抗菌添加剂。2,3-丁二醇催化脱水形成甲乙酮，是高效的液体燃料添加剂，也是良好的低沸点溶剂，应用于树脂、油墨、胶水、润滑剂等行业；脱水得到1,3-丁二烯，可用来合成橡胶、聚亚胺酯等材料；酯化形式2,3-丁二醇可应用于药物、化妆品、洗涤剂等。2,3-丁二醇有较高的燃烧值且辛烷值非常高，是优质的液体燃料，可用于航空航天等领域。由于2,3-丁二醇具有2个手性原子，异构体较多，化学法合成较困难且过程繁琐、不易操作，能耗大、成本高，所以2,3-丁二醇的生产主要以可再生资源为原料，通过微生物代谢将单糖转化为目标产物。生物转化法生产2，3-丁二醇，发酵液中除目标产物外，还有乙酸、乙醇、乳酸、琥珀酸等副产品，以及可溶性蛋白、核酸、多糖以及大量的菌体、有机盐、无机盐等小分子，导致发酵液成分十分复杂。2,3-丁二醇沸点高，并具有强亲水性，且发酵液中产物浓度较低，导致其提取工艺复杂、成本偏高。因此，2,3-丁二醇的分离提纯是阻碍其规模化、工业化生产的瓶颈问题。

为了经济高效的从发酵液中分离目标产物，发展了很多的分离方法，包括蒸发、蒸馏、膜过滤、全蒸发、离子交换层析、液液萃取、反应萃取等等，其中萃取因易放大、低能耗，工业化前景良好。传统的蒸馏和精馏法分离2,3-丁二醇能耗巨大，发酵液中生物大分子的存在导致传热效率下降、产品收率较低。逆流汽提法曾被认为是最适合于2,3-丁二醇的分离提取方法，但这种分离方法能耗较大。盐析作用分离发酵液中的2,3-丁二醇，其回收率较高。Afschar等利用碳酸钾盐析分离糖蜜发酵液中的2,3-丁二醇，其回收率可达94％-96％。但该方法中盐使用量偏高且发酵液需要进行一系列的预处理，操作过于繁琐，不适于大规模的工业化应用。反应萃取能降低产品的亲水性而提高分配系数；但是，反应剂也能和副产物及杂质反应。有机溶剂萃取法是分离2,3-丁二醇的有效方法，但因2,3-丁二醇的高亲水性导致回收率偏低且溶剂使用量巨大，只限于实验室规模而不适用于大规模工业化生产。传统的高分子聚合物双水相体系萃取条件温和，容易放大，可连续操作；但由于水溶性高聚物大多粘度较大，不易定量操作，难以挥发，需要反萃取，使后续分离较为麻烦，且高聚物一般价格比较昂贵，其工业化应用受到限制。我们开发了利用有机溶剂和无机盐组成的新型双水相体系盐析萃取发酵液中的1,3-丙二醇和2,3-丁二醇(中国专利：CN101012151A；CN101012152A)的技术，取得令人满意的结果。该技术操作简单、条件温和、选择性高、能耗小。虽然该技术中盐的用量低于盐析，但浓度仍很高，下相的盐必须回收利用以便降低分离成本。

目前，还没有分离方法简单、分离效果好、能耗低，适用于工业化生产的从发酵液中分离2,3-丁二醇的方法。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述目前盐析萃取法分离发酵液中2,3-丁二醇时下相的高浓度盐回收困难、废水排放多等的问题，提出一种萃取与发酵偶联分离发酵液中2,3-丁二醇的新方法，该方法将发酵液中加入糖或糖和少量无机盐萃取2,3-丁二醇，萃取2,3-丁二醇后的下相经稀释后直接用于2,3-丁二醇的发酵从而实现下相的重复利用，避免了盐析萃取下相盐需要回收的问题，是一种很有工业应用前景的从发酵液中分离2,3-丁二醇的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：

一种萃取与发酵偶联分离发酵液中2,3-丁二醇的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将糖或/和可溶性无机盐溶解于2,3-丁二醇发酵液中，得含糖混合液；

2)向步骤1)的含糖混合液中加入有机溶剂，振荡混合，混合液在15～40℃下静置或离心至分相，得到上层的有机相和下层的水相共存体系；

3)步骤2)中的有机相，在低于105℃条件下进行减压蒸馏除去有机溶剂和水，得2,3-丁二醇粗品；

4)步骤2)中所述的水相，去除有机溶剂，加入水稀释至糖浓度为80～200g/L，接入菌体，进行2,3-丁二醇的发酵。

在上述技术方案中，步骤4)中所述的水相去除有机溶剂后加入水稀释至糖浓度优选为100～150g/L，更优选为110～130g/L。

进一步地，在上述技术方案中，所述的2,3-丁二醇发酵液为含菌体的2,3-丁二醇发酵液或去除菌体的2,3-丁二醇发酵清液，2,3-丁二醇发酵液中2,3-丁二醇的浓度为40～160g/L，优选为60～120g/L,更优选为80～100g/L。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤1)所述的糖在含糖混合液中的浓度为100～500g/L，优选为150～400g/L，更优选为250～350g/L；所述可溶性无机盐在含糖混合液中的浓度为1～100g/L，优选为10～50g/L，更优选为15～25g/L。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤2)中所述的含糖混合液与有机溶剂的体积比为0.5～2:1，优选为1～1.5:1，更优选为1:1。

进一步地，在上述技术方案中，步骤1)中所述的糖为葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、菊芋、糖蜜、木糖母液中的一种或两种以上以任何比例混合的混合物，其中优选为木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖；更优选为葡萄糖。在本发明中，步骤1)所述的糖不局限于所述的糖，本领域技术人员还可以采用根据公知常识能够实现本发明的技术方案的其他单糖、二糖、多糖、以及主要成分为上述糖类的工业副产物或废弃物。

进一步地，在上述技术方案中，所述可溶性无机盐为硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或两种以上的混合物，优选为磷酸氢二铵。

进一步地，在上述技术方案中，步骤2)中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、油醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、丙酮、二氧六环、四氢呋喃中一种或两种以上的混合溶液，其中优选为正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、戊醇中的一种或两种以上的混合溶液，更优选为异丙醇、叔丁醇、戊醇中的一种或两种以上的混合溶液，最优选为叔丁醇。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤4)中所述的去除有机溶剂的方法为减压蒸馏或气提法，其中减压蒸馏的温度为20～50℃，压力为-0.08～-0.1MPa；气提法采用的气体为CO₂。

本发明中，利用糖和有机溶剂萃取2,3-丁二醇的萃取操作方式可以是间歇的，也可以是连续的；对于分配系数较小的体系可以采用多级萃取的方式。

本发明中，所述2,3-丁二醇发酵液可以用絮凝、过滤、微滤或离心的方法进行预处理，除去菌体；如果不经预处理直接进行萃取操作，菌体分布于下相。

本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)萃取用糖的来源广泛且廉价，糖不与目标成分反应，糖是环境温和的，如不改变环境的pH；

(2)富含2,3-丁二醇的有机相中的有机溶剂可回收后重复利用，且有机溶剂的比热远比水的低，可以极大降低蒸馏过程中回收2,3-丁二醇的能耗；

(3)与传统的盐析萃取过程中所用的盐相比，所需的糖浓度较低，避免了传统盐析萃取过程的高盐浓度，对设备没有腐蚀；

(4)水相的糖可循环利用于发酵过程，减少了污水的处理和排放，提高了残余底物的利用率。

综上，本发明采用萃取与发酵偶联的方法分离一个典型的生物基化学品—2,3-丁二醇，该方法将糖溶解于2,3-丁二醇发酵液后用有机溶剂萃取得到2,3-丁二醇，萃取率达到80％以上，下相经稀释后直接用于2,3-丁二醇的发酵从而实现下相的重复利用，避免了盐析萃取下相盐需要回收的问题。本发明的方法操作简单、分离能耗低，实现了发酵与分离的耦合，是一种具有工业应用前景的从发酵液中分离2,3-丁二醇的方法。

附图说明

图1为葡萄糖/叔丁醇体系的相图。

图2为葡萄糖用量和叔丁醇用量对2,3-丁二醇分离效果的影响，其中图1A为葡萄糖用量和叔丁醇用量对2,3-丁二醇分配系数的影响；图1B为葡萄糖用量和叔丁醇用量对2,3-丁二醇回收率的影响。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。

以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。

1.在下述的实施例中用于2,3-丁二醇发酵的菌株为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，是本实验室诱变所得，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC6053)。

种子培养基(1L)：葡萄糖80g，(NH₄)₂HPO₄6.0g，KCl1.8g，EDTA0.51g，MgSO₄·7H₂O0.6g，微量元素：FeSO₄·7H₂O0.0225g，ZnSO₄·7H₂O0.0075g，MnSO₄·7H₂O0.0038g，柠檬酸0.21g，柠檬酸钠0.294g。

发酵培养基(1L)：葡萄糖135g，(NH₄)₂HPO₄18.0g，KCl1.8g，EDTA0.51g，MgSO4·7H₂O0.88g，微量元素：FeSO₄·7H₂O0.0225g，ZnSO₄·7H₂O0.0075g，MnSO₄·7H₂O0.0038g，柠檬酸0.21g，柠檬酸钠0.294g。

2.2,3-丁二醇发酵液的制备：

(1)将阴沟肠杆菌接种至种子培养基中，在35～38℃、200～300rpm摇床培养12～18h；

(2)将步骤(1)的菌培养液按10％的接种量接入发酵培养基中，在37℃、200rpm摇床培养48～90h，得2,3-丁二醇发酵液，发酵结束时残糖浓度10～15g/L。

在具体实施方式中，在步骤(1)中的菌培养液也可以采用发酵罐发酵，具体为：用Biotech5L全自动发酵罐，将步骤(1)中的菌培养液按10％的接种量接入到2L发酵培养基中，用5mol/L NaOH控制pH为5.8，在37℃、250r/min条件下发酵。发酵过程中保持通200ml/L﹒min的压缩空气，葡萄糖起始浓度为135g/L，发酵过程中补加固体葡萄糖，保持发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度在20～100g/L左右，培养72～90h，得2,3-丁二醇发酵液，发酵结束时残糖浓度10～15g/L。

按照上述方法制备得到的2,3-丁二醇发酵液中2,3-丁二醇的浓度为40～160g/L。

2,3-丁二醇发酵液经8000rpm，10min离心，除菌体，得到2,3-丁二醇发酵清液。

3.从2,3-丁二醇发酵液或2,3-丁二醇发酵清液中分离2,3-丁二醇的方法，包括以下步骤：

1)将糖或/和无机盐溶解于2,3-丁二醇发酵液或2,3-丁二醇发酵清液中，得含糖混合液；

2)向步骤1)的含糖混合液中加入有机溶剂，振荡混合，混合液在15～40℃下用XH-C漩涡混匀器或电动搅拌机混匀，室温静置12小时分相，得到水相和有机相两层液相共存体系，其中上相(有机相)富含2,3-丁二醇，其中有机溶剂回收可重复使用，下相(水相)富含糖；取样测定上相和下相中2,3-丁二醇的浓度，计算2,3-丁二醇的分配系数(K_BD)和回收率(Y)；并测定相比(R)，具体计算公式为：

①相比(R)＝V_上/V_下其中V_上为上相的体积，V_下为下相的体积；

②分配系数(K_BD)＝C_上/C_下，其中C_上为上相中2,3-丁二醇浓度(g/L)，C_下为下相中2,3-丁二醇浓度(g/L)；

③回收率(Y)＝C_上V_上/CV，其中C_上和V_上分别为上相中2,3-丁二醇的浓度和上相体积，C和V分别为上述步骤1)中的2,3-丁二醇发酵液或2,3-丁二醇发酵清液中的2,3-丁二醇的浓度和2,3-丁二醇发酵液或2,3-丁二醇发酵清液的体积。

3)取步骤2)中的有机相，在低于105℃条件下进行减压蒸馏除去有机溶剂和水，得2,3-丁二醇粗品；

在上述方法中，步骤1)所述的糖为葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、菊芋、糖蜜、木糖母液中的一种或两种以上以任何比例混合的混合物，含糖混合液中所述糖的浓度为100～500g/L；所述无机盐为硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或两种以上以任何比例混合的混合物，含糖混合液中所述无机盐的浓度为1～100g/L；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、油醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、丙酮、二氧六环、四氢呋喃中一种或两种以上以任意比例混合的混合溶液。

在上述方法中，步骤1)中可以单独加入糖，也可以将糖和无机盐同时加入，盐的加入能起到缩短成相时间、提高产物分配系数、减少上相糖量和下相溶剂量等作用。

在上述方法中，步骤4)中，去除水相中的有机溶剂时，尽可能降低水相中残余有机溶剂的含量，避免有机溶剂对细胞的毒性，有利于进一步的发酵，本领域技术人员根据需要可以控制水相中残余有机溶剂的含量。在本发明具体实施方式中，去除有机溶剂至在最终发酵体系中的有机溶剂含量低于5g/L。

4.在2,3-丁二醇发酵液、2,3-丁二醇发酵清液、上相、下相中测定2,3-丁二醇含量的方法：采用气相色谱法进行测定2,3-丁二醇的浓度，色谱柱为毛细管柱， 30m×Φ0.32mm，厚度为0.25μm；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为210℃；柱温的起始温度为60℃，以2℃/s阶升到70℃，再以30℃/s阶升至180℃，保持5min；后进样器，进样口温度为210℃，进样量2μL，样品为每组三个平行，取平均值。

实施例1不同糖对2,3-丁二醇分离效果的影响

按照上述3(从2,3-丁二醇发酵液或2,3-丁二醇发酵清液中分离2,3-丁二醇的方法)中步骤1)-3)所述的方法从2,3-丁二醇发酵清液中分离2,3-丁二醇。其中，2,3-丁二醇发酵清液中2,3-丁二醇的浓度为85.54g/L，2,3-丁二醇发酵清液中加入不同种的糖(糖的种类，如表1)溶解后，加入不同有机溶剂(有机溶剂种类，如表1)，混合、常温下静置、分相，取样测定上相和下相中2,3-丁二醇的浓度，计算2,3-丁二醇的分配系数(K_BD)和回收率(Y)；并测定相比(R)，结果如表1。有机溶剂与2,3-丁二醇发酵清液的体积比为1:1，糖的用量为发酵清液30％(w/v)。

表1.不同种类的糖对2,3-丁二醇分离效果的影响

从表1中可以看出，葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、菊芋分别与正丙醇、异丙醇和碳酸二甲酯形成的体系对发酵液中的2,3-丁二醇均具有较好的分离效果，其中所述糖与正丙醇形成的体系对2,3-丁二醇的回收率均达到70％以上，与异丁醇形成的体系对2,3-丁二醇的回收率均达到50％以上。另一方面，同一有机溶剂与各种糖形成的体系，2,3-丁二醇的回收率差别不是很大；由于葡萄糖为发酵的常用底物，因此以下实验选葡萄糖作为相分离剂。

实施例2不同有机溶剂对2,3-丁二醇分离效果的影响

按照上述3(从2,3-丁二醇发酵液或2,3-丁二醇发酵清液中分离2,3-丁二醇的方法)中步骤1)-3)所述的方法从2,3-丁二醇发酵清液中分离2,3-丁二醇。其中，2,3-丁二醇发酵清液中2,3-丁二醇的浓度为69.70g/L，2,3-丁二醇发酵清液中加入2,3-丁二醇发酵清液质量的15％和30％的葡萄糖溶解，得含糖混合液。两种含糖混合液中分别加入不同有机溶剂(有机溶剂种类，如表2)，混合，有机溶剂与2,3-丁二醇发酵清液的体积比为1:1，常温下静置、分相，取样测定上相和下相中2,3-丁二醇的浓度，计算2,3-丁二醇的分配系数(K_BD)和回收率(Y)；并测定相比(R)，结果如表2。

表2.有机溶剂对2,3-丁二醇分离效果的影响

注：“-”：均相。

从表2中可以看出，除油醇外，其他醇类的回收率普遍较高，而酯类体系的回收率普遍低。其中，葡萄糖/异丙醇体系中，2,3-丁二醇的回收率最高，达到83.13％，但该体系的相比太大；丙酮体系与正丙醇体系的回收率次之，随后是叔丁醇体系。考虑到回收率以及下相残留溶剂对细胞的毒性，叔丁醇为较好的萃取有机溶剂。一方面，叔丁醇/葡萄糖体系2,3-丁二醇的回收率较高；另外，下相循环发酵时，叔丁醇对细胞的毒性较小，有利于细胞的生长。

实施例3葡萄糖/叔丁醇体系的相图

采用浊度法绘制双水相体系相图，实验过程如下：首先称取一定量的葡萄糖(m₁)加入一定量的溶剂(m₂)溶解；然后逐滴加入叔丁醇(m₃)直至混合溶液恰好出现浑浊，在平衡过程中，滴加一滴水，溶液马上变澄清，再多加一点叔丁醇，溶液又马上浑浊，则可以判定该组成点为临界点。以所加入的葡萄糖的质量分数(Y_糖)为横坐标，以相应的叔丁醇的质量分数(Y_醇)为纵坐标绘制双水相体系相图，如图1。Y_糖和Y_醇的计算公式如下：

分别以蒸馏水和40g/L和150g/L2,3-丁二醇溶液为溶剂绘制相图，实验结果如图1所示。

图1的结果表明，葡萄糖/叔丁醇体系具有较宽的分相范围，在葡萄糖浓度范围8～45％(w/w)、合适的醇浓度下，都能形成稳定的双水相体系。当葡萄糖浓度较低时，葡萄糖的糖析能力较弱，因此分相需要较多的有机溶剂，随着葡萄糖浓度的升高，葡萄糖的糖析作用也相应增强，故分相所需的叔丁醇浓度在逐渐降低。

实施例4糖和有机溶剂的浓度对2,3-丁二醇分离效果的影响

按照上述3所述的方法从2,3-丁二醇发酵清液中分离2,3-丁二醇。2,3-丁二醇发酵清液中加入适当量的叔丁醇和葡萄糖，形成含有不同浓度叔丁醇和葡萄糖的萃取体系。其中，在该萃取体系中叔丁醇含量分别为30％、40％和50％，葡萄糖含量分别为20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％。所述不同萃取体系对2,3-丁二醇分配系数的影响如图2A所示，对2,3-丁二醇回收率的影响如图2B所示。

从图2可以看出：2,3-丁二醇的分配系数和回收率随着葡萄糖和叔丁醇含量的增加而增大。当葡萄糖的质量分数为26％，叔丁醇的质量分数为40％时，2,3-丁二醇的分配系数为1.19，回收率为63.50％。在葡萄糖含量20-34％，叔丁醇含量30～40％时均有较好的分配系数(0.95-1.35)，2,3-定二醇的回收率均高于40％，最高可达63.50％。

实施例5葡萄糖/叔丁醇体系萃取对带菌发酵液的效果1

取含2,3-丁二醇浓度为96.47g/L的2,3-丁二醇发酵液100mL，加入30g葡萄糖，使糖完全溶解后，再加入100mL叔丁醇，混合、常温静置、分相，得上相153mL，其中2,3-丁二醇的浓度为44.44g/L，下相55mL。2,3-丁二醇的分配系数为0.86，回收率为70.48％。

实施例6葡萄糖/叔丁醇体系萃取对带菌发酵液的效果2

取含2,3-丁二醇浓度为39.89g/L的2,3-丁二醇发酵液100mL，加入30g葡萄糖，使糖完全溶解后，再加入100mL叔丁醇，混合、室温静置、分相，得到上相145mL，其中2,3-丁二醇的浓度为17.84g/L，下相70mL。2,3-丁二醇的分配系数为0.89，回收率为64.85％。

实施例7两种糖或两种有机溶剂对2,3-丁二醇分离效果的影响1

取含108.02g/L2,3-丁二醇的2,3-丁二醇发酵清液4mL，加入0.6g葡萄糖和0.6g蔗糖，使糖完全溶解后，再加入4mL叔丁醇，搅拌均匀，室温静置分相，上相为富含2,3-丁二醇的有机相，体积为7.1mL，2,3-丁二醇的浓度为47.13g/L；下相为富含糖的水相，体积为1.6mL。2,3-丁二醇的分配系数为0.92，回收率为80.31％。

实施例8两种糖或两种有机溶剂对2,3-丁二醇分离效果的影响2

取含108.02g/L2,3-丁二醇的2,3-丁二醇发酵清液4mL，加1.2g葡萄糖，使糖完全溶解后，再加入2mL正丙醇和2mL叔丁醇，搅拌均匀，室温静置分相，上相为富含2,3-丁二醇的有机相，体积为6.7mL，2,3-丁二醇的浓度为46.89g/L；下相为富含糖的水相，体积为2.0mL。2,3-丁二醇的分配系数为0.90，回收率为74.79％。

实施例9无机盐对2,3-丁二醇分离效果的影响1

取2,3-丁二醇发酵清液(2,3-丁二醇的浓度为99.92g/L)4mL，加入0.6g葡萄糖，0.048g磷酸氢二铵，使其完全溶解后，再加入4mL叔丁醇，搅拌均匀，室温静置、分相，得到水相和有机相两层液相共存体系，上相为富含2,3-丁二醇的有机相，体积为6mL，2,3-丁二醇的浓度为56.26g/L；下相为富含糖的水相，体积为2.5mL。2,3-丁二醇的分配系数为2.28，回收率为84.46％。

实施例10无机盐对2,3-丁二醇分离效果的影响2

取含99.54g/L2,3-丁二醇的2,3-丁二醇发酵清液4mL，加入0.6g葡萄糖和0.12g磷酸氢二铵使其完全溶解后，再加入4mL叔丁醇，搅拌均匀，室温静置分相，上相为富含2,3-丁二醇的有机相，体积为6.2mL，2,3-丁二醇的浓度为49.64g/L；下相为富含糖的水相，体积为2.2mL。2,3-丁二醇的分配系数为1.22，回收率为75.28％。

实施例11无机盐对2,3-丁二醇分离效果的影响3

取含2,3-丁二醇99.54g/L的发酵清液4mL，加0.6g葡萄糖和0.36g磷酸氢二铵使其完全溶解后，再加入4mL叔丁醇，搅拌均匀，室温静置分相，上相为富含2,3-丁二醇的有机相，体积为6mL，2,3-丁二醇的浓度为56.26g/L；下相为富含糖的水相，体积为2.4mL。2,3-丁二醇的分配系数为1.61，回收率为76.99％。

实施例12萃取下相的再次发酵

400mL2,3-丁二醇发酵液在8,000rpm离心10min，得湿菌体与2,3-丁二醇发酵清液，菌体置于4℃以备重复利用。

取2,3-丁二醇发酵清液(2,3-丁二醇的浓度为67.64g/L)300mL，加入90g葡萄糖，5.4g磷酸氢二铵使其完全溶解后，再加入300mL叔丁醇，搅拌均匀，室温静置、分相，上相为富含2,3-丁二醇的有机相，体积为395ml，其中2,3-丁二醇的浓度为38.16g/L；下相为富含糖的水相，体积为240ml，其中糖浓度235g/L，叔丁醇浓度为121.53g/L。2,3-丁二醇的分配系数为1.27，回收率为66.67％。下相低温减压蒸馏去除叔丁醇，加水稀释至葡萄糖为112g/L，残留的2,3-丁二醇浓度为13.39g/L，残余叔丁醇浓度为3.77g/L。加水稀释后的下相接入回收的菌体(起始OD₆₂₀为3.8)，在37℃、200rpm条件下摇瓶培养90h，得二次发酵液，其中2,3-丁二醇的浓度达49.52g/L，实际产生36.13g/L，葡萄糖转化率为38.44％。

实施例13

本实施例考察了萃取分离的下相重新发酵产生的发酵液的再次萃取的效果。

按实施例12的方法，得二次发酵液(萃余相再次发酵的发酵液)，其中含2,3-丁二醇38.42g/L，取二次发酵液100mL，加入30g葡萄糖，使其完全溶解后，再加入100mL叔丁醇，混合、室温静置、分相，得上相140mL，下相75mL，2,3-丁二醇分配系数为0.80，回收率为59.87％。

Claims

1.一种萃取与发酵偶联分离发酵液中2,3-丁二醇的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将糖或/和无机盐溶解于2,3-丁二醇发酵液中，得含糖混合液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中所述的2,3-丁二醇发酵液为含菌体的2,3-丁二醇发酵原液或去除菌体的2,3-丁二醇发酵清液，所述2,3-丁二醇发酵液中2,3-丁二醇的浓度为40～160g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中所述的糖在含糖混合液中的浓度为100～500g/L，所述无机盐在含糖混合液中的浓度为1～100g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中所述的含糖混合液与有机溶剂的体积比为0.5～2:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的糖为葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、菊芋、糖蜜、木糖母液中的一种或两种以上的混合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机盐为硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或两种以上的混合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、油醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、丙酮、二氧六环、四氢呋喃中一种或两种以上的混合溶液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4)中所述的去除有机溶剂的方法为减压蒸馏或气提法，其中减压蒸馏的温度为20～50℃，压力为-0.08～-0.1MPa；气提法采用的气体为CO₂。