CN104001208B - 一种生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料及其制备方法。一种生物高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料，为共混物，包括生物可降解高分子、甲壳素纳米晶；甲壳素纳米晶与生物可降解高分子的质量比为1:100～1:10。通过冷冻/致孔剂沥出法制备了生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合骨组织支架材料。该复合支架支架平均孔隙率>85﹪，孔径可调控，压缩模量为2MPa～12MPa。通过在生物高分子多孔支架中引入甲壳素纳米晶，支架的力学强度和生物活性得到了提高，细胞在支架上的黏附及矿化活动得到了促进。该生物高分子/甲壳素纳米晶复合支架可作为骨组织工程支架应用于骨修复领域。

Description

一种生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法

技术领域

   本发明属于生物医用材料及组织工程技术领域，涉及一种生物高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料及其制备方法。

背景技术

组织工程的目的是研究开发用于修复、维护人体受损的组织或器官替代物。组织工程基本由细胞分离及培养、构建细胞培养支架、细胞/支架复合物的体外培养、移植这四部分构成。其中细胞培养支架材料在支持细胞生长、引导组织再生、控制组织结构和释放生物活性因子方面起到重要作用。

组织工程中所用到的细胞培养支架必须满足一下几点要求：（1）具有良好的生物相容性，（2）具有一定的力学性能，（3）具有适宜的孔隙率及孔径，以保证营养物质及代谢废物的扩散，（4）具有良好的可加工性和较低的加工成本，以便临床及商业化应用。组织工程支架中，较高的孔隙率和较大的孔径对于组织的形成具有促进作用，然而过高的孔隙率和孔径同时也会降低支架的力学性能。对于骨组织工程支架，一般认为数微米的孔径以及纳米孔隙有利于蛋白质的吸附及细胞黏附；孔径在10μm～50μm有利于纤维和毛细血管的长入；孔径在200μm～300μm有利于骨长入。而孔隙率则需要控制在75﹪以上细胞接种培养才有可能成功。

目前的生物可降解骨组织支架如聚（3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯）（PHBV）、聚乳酸（PLA）、聚己内酯(PCL)多孔支架亲水性差，不具备生物活性，细胞不能在支架上很好地黏附；而且力学性能有待提高。针对这些缺点，可通过在支架中引入甲壳素纳米晶来改善。甲壳素具有良好的生物性能，具体如下：（1）在体内产生抗原的可能性很小，免疫原性低，对白细胞和巨噬细胞具有趋同化作用，可促进巨噬细胞的吞噬功能和水解活性，刺激淋巴因子和炎性介质的产生；（2）对纤维蛋白原的吸附能力强，能增加血小板的聚集，激活凝血系统，促使伤口封合；（3）能促进上皮细胞再生，通过促进纤维细胞迁移、扩增缩短伤口愈合时间等。有研究表明，含有甲壳素的支架能够显著促进细胞在其表面上的黏附与铺展。（EURO POLYM J. 2007,43:4123-35；J APPL POLYM SCI. 2010,117:3406-18）

在生物体内，甲壳素以直径为2.5nm到25nm的微纤形式存在。可以通过强酸酸解等方式除去甲壳素中的非晶区从而分离出具有纳米尺度的甲壳素晶体，即甲壳素纳米晶。由于甲壳素纳米晶尺寸极小，分子链排列高度有序，不同于其他晶体所存在的位错、空穴等缺陷，因此甲壳素纳米晶具有很高的强度和刚性，非常适合做为纳米增强材料。与传统的无机纳米粒子增强材料相比，甲壳素纳米晶具有可再生性、生物降解性、生物相容性、易于化学改性等特点，可替代传统的无机纳米粒子作为生物活性填料增强生物可降解高分子多孔支架。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种生物高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料。

一种生物高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料为共混物，该共混物包括生物可降解高分子、甲壳素纳米晶；甲壳素纳米晶与生物可降解高分子的质量比为1:100～1:10。

本发明的另一个目的是提供了上述生物高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法。

    本发明方法包括以下步骤：

步骤（1）.将生物可降解高分子溶于有机溶剂A中，40～90℃加热并磁力搅拌2～4小时，得到质量体积浓度为5～20﹪(单位为g/ml)的生物可降解高分子溶液；将甲壳素纳米晶超声分散在有机溶剂B，分散均匀后得到质量体积浓度为1～5﹪(单位为g/ml)的甲壳素纳米晶溶液；然后将甲壳素纳米晶溶液加入到生物可降解高分子溶液中，磁力搅拌15～30分钟，得到混合溶液，其中混合溶液中甲壳素纳米晶与生物可降解高分子的质量比为1:100～1:10；

    所述的生物可降解高分子为聚（3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯）（PHBV）、聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）中的一种或多种；

所述的甲壳素纳米晶形状为针状或棒状，宽度10～40nm ，长度200～500nm；

所述的有机溶剂A为二氧六环、四氢呋喃的一种或二氯甲烷与二氧六环的混合溶剂；其中二氯甲烷与二氧六环的混合溶剂中二氯甲烷与二氧六环的加入量为任意比例；

所述的有机溶剂B与有机溶剂A选用的物质相同；

    步骤（2）.将无机粒子加入到步骤（1）混合溶液中，混合均匀后倒入模具中，置于-80～4℃下冷冻4～24小时，得到冷冻凝固的生物可降解高分子/甲壳素纳米晶混合物；生物可降解高分子/甲壳素纳米晶混合物中生物可降解高分子与无机粒子的质量比为1:3～1:9；

    所述的无机粒子为氯化钠、二水合酒石酸钠或四水合酒石酸钾钠中的一种或多种，粒径为100～500μm；

    作为优选，冷冻温度为-20～4℃；

    步骤（3）.将步骤（2）冷冻凝固的生物可降解高分子/甲壳素纳米晶混合物从模具中取出，浸泡在冰水中并磁力搅拌，每隔4～6小时换一次冰水，磁力搅拌2～3天，除去有机溶剂和无机粒子，得到生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架；

    步骤（4）.将步骤（3）生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架真空干燥2～3天。

    本发明的有益效果是：

通过筛选不同粒径的无机粒子并控制冷冻温度，制备出不同孔径范围的生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架。本发明制备得到的复合支架平均孔隙率>85﹪，孔隙连通性好，压缩模量为2MPa～12MPa。通过在生物可降解多孔支架中引入甲壳素纳米晶，可以增加支架的力学强度，提高支架的生物活性，促进细胞在复合支架多孔支架表面的黏附及矿化，有利于骨组织的重建与修复。本发明复合支架克服了原生物可降解高分子多孔支架不具备生物活性的缺点，能够促进细胞在支架表面黏附和矿化，可作为骨组织修复材料。

附图说明

图1为实施例1制备得到的PHBV/甲壳素纳米晶复合支架扫描电镜图片；

图2为实施例1制备得到的PHBV/甲壳素纳米晶复合支架与纯PHBV多孔支架的压缩模量对比；

图3为实施例1制备得到的PHBV/甲壳素纳米晶复合支架与纯PHBV多孔支架的压缩应力对比。

具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

实施例1.

步骤（1）.称取重均分子量为25万，羟基戊酸酯摩尔含量（HV﹪）为20﹪的PHBV粉末2g,溶解于10ml二氧六环中, 90℃磁力搅拌2小时形成PHBV溶液。将0.1g甲壳素纳米晶超声分散于10ml二氧六环中，分散均匀后得到甲壳素纳米晶溶液；然后将分散好的甲壳素纳米晶溶液加入到PHBV溶液中，磁力搅拌30分钟后倒入圆柱形模具中。

步骤（2）.称取用标准筛筛分过粒径范围在200～350μm的氯化钠颗粒6g，加入上述混合溶液中。将模具置于漩涡混合仪上混合均匀，放入-20℃冰箱冷冻4小时。

步骤（3）.将冷冻凝固的PHBV/甲壳素纳米晶混合物从模具中取出，放入500ml冰水水中，每隔4小时换一次蒸馏水，磁力搅拌2天，去除氯化钠和二氧六环溶剂。

步骤（4）.将所得的PHBV/甲壳素纳米晶多孔支架从蒸馏水中取出，真空干燥2天。

如图1所示，实施例1制备得到的PHBV/甲壳素纳米晶复合支架的大孔孔径为275±71μm，小孔孔径约10μm。

如图2、3所示，添加甲壳素纳米晶可以提高PHBV多孔支架的力学性能，PHBV多孔支架的压缩模量由4.07MPa增加为11.4MPa，说明甲壳素纳米晶能够对PHBV多孔支架起到增强作用。

实施例2

步骤（1）.称取重均分子量为20万的聚乳酸1g,溶解于10ml二氧六环中，90℃磁力搅拌2小时，形成均一的聚乳酸溶液。将0.1g甲壳素纳米晶超声分散于5ml二氧六环中，分散均匀后得到甲壳素纳米晶溶液；然后将分散好的甲壳素纳米晶加入到聚乳酸溶液中，磁力搅拌30分钟后倒入圆柱形模具中。

步骤（2）.称取用标准筛筛分过粒径范围在200～400μm的四水合酒石酸钾钠颗粒9g，加入上述混合溶液中。将模具置于漩涡混合仪上混合均匀，放入-20℃冰箱冷冻4小时。

步骤（3）.将冷冻凝固的聚乳酸/甲壳素纳米晶混合物从模具中取出，放入500ml冰水水中，每隔4小时换一次蒸馏水，磁力搅拌2天，去除四水合酒石酸钾钠和二氧六环。

步骤（4）.将所得的聚乳酸/甲壳素纳米晶多孔支架从蒸馏水中取出，真空干燥2天。所得聚乳酸/甲壳素纳米晶复合支架的孔隙率为90﹪，压缩模量为7.6±0.8MPa。

实施例3

步骤（1）.称取重均分子量为10万的聚己内酯2g，溶解于20ml二氯甲烷/二氧六环混合溶液中（二氯甲烷与二氧六环体积比为2:8），40℃磁力搅拌2小时，形成均一的聚己内酯溶液。将0.2g甲壳素纳米晶超声分散于10ml二氯甲烷/二氧六环混合溶液中，分散均匀后得到甲壳素纳米晶溶液；然后将分散好的甲壳素纳米晶加入到聚己内酯溶液中，磁力搅拌30分钟后倒入圆柱形模具中。

步骤（2）.称取用标准筛筛分过粒径范围200～300μm的氯化钠颗粒6g，加入上述混合溶液中。将模具置于漩涡混合仪上混合均匀，放入-80℃冰箱中冷冻4小时。

步骤（3）.将冷冻凝固的聚己内酯/甲壳素纳米晶混合物从模具中取出，放入500ml冰水中，每隔4小时换一次蒸馏水，磁力搅拌2天，去除氯化钠颗粒和二氯甲烷/二氧六环混合溶液。

步骤（4）.将所得的聚己内酯/甲壳素纳米晶多孔支架从蒸馏水中取出，真空干燥2天。所得聚己内酯/甲壳素纳米晶复合支架孔隙率为87﹪，压缩模量为11.2±0.6MPa。

实施例4

步骤（1）.将0.25g聚（3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯）（PHBV）、0.25g聚乳酸（PLA）溶于10 ml四氢呋喃中，90℃加热并磁力搅拌4小时，得到PHBV-PLA溶液；将0.05g甲壳素纳米晶超声分散在2.5 ml四氢呋喃，分散均匀后得到甲壳素纳米晶溶液；然后将甲壳素纳米晶溶液加入到PHBV- PLA溶液中，磁力搅拌15分钟，得到混合溶液；

步骤（2）.将4.5g粒径为100～300μm的二水合酒石酸钠加入到步骤（1）混合溶液中，混合均匀后倒入模具中，置于-80℃下冷冻4小时，得到冷冻凝固的PHBV-PLA/甲壳素纳米晶混合物；

    步骤（3）.将步骤（2）冷冻凝固的PHBV-PLA/甲壳素纳米晶混合物从模具中取出，浸泡在冰水中并磁力搅拌，每隔6小时换一次冰水，磁力搅拌3天，除去四氢呋喃和二水合酒石酸钠，得到PHBV-PLA/甲壳素纳米晶复合支架；

    步骤（4）.将步骤（3）PHBV-PLA/甲壳素纳米晶复合支架真空干燥3天。

实施例5

步骤（1）.将0.5g聚乳酸（PLA）、1.0g聚己内酯（PCL）溶于10 ml二氯甲烷/二氧六环混合溶剂(二氯甲烷与二氧六环的体积比为1:1)中，50℃加热并磁力搅拌3小时，得到PLA-PCL溶液；将0.015g甲壳素纳米晶超声分散在0.3 ml二氯甲烷/二氧六环混合溶剂(二氯甲烷与二氧六环的体积比为1:1)，分散均匀后得到甲壳素纳米晶溶液；然后将甲壳素纳米晶溶液加入到PLA-PCL溶液中，磁力搅拌20分钟，得到混合溶液；

    步骤（2）.将2g粒径为300～500μm的氯化钠、3g二水合酒石酸钠加入到步骤（1）混合溶液中，混合均匀后倒入模具中，置于4℃下冷冻4小时，得到冷冻凝固的PLA-PCL/甲壳素纳米晶混合物；

    步骤（3）.将步骤（2）冷冻凝固的PLA-PCL/甲壳素纳米晶混合物从模具中取出，浸泡在冰水中并磁力搅拌，每隔5小时换一次冰水，磁力搅拌2天，除去氯化钠、二水合酒石酸钠和二氯甲烷/二氧六环混合溶剂，得到PLA-PCL/甲壳素纳米晶复合支架；

    步骤（4）.将步骤（3）PLA-PCL/甲壳素纳米晶复合支架真空干燥3天。

应用实施例6

    以PHBV/甲壳素纳米晶复合支架为例，将实施例1制备的PHBV/甲壳素纳米晶复合支架在75﹪无水乙醇中浸泡2小时，用大量磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗后，与人脂肪干细胞复进行成骨诱导共培养。将传至第3代的人脂肪干细胞以2×10⁵cells/ml的密度接种于PHBV/甲壳素纳米晶复合支架上，37℃、5﹪CO₂环境中加入人脂肪干细胞生长培养基培养1～3天，用PBS洗去未黏附的细胞，采用DAPI荧光染色方法表征人脂肪干细胞在该种复合支架上的黏附情况，荧光染色结果显示复合支架上细胞黏附数目明显高于未复合的支架。经过1～3天培养后，将生长培养基更换为成骨诱导培养基，每隔2天换一次新液。诱导21天后，采用茜素红染色法表征人脂肪干细胞在该种复合支架上的矿化情况，实验结果显示与不含甲壳素纳米晶的支架相比，复合支架上的矿物质沉积较多，矿化明显。因此该种复合支架不仅孔隙率高，力学性能良好，而且能促进细胞在支架上的黏附、矿化，有利于骨组织的重建与修复。

上述实施例中所用的甲壳素纳米晶形状为针状或棒状，宽度10～40nm ，长度200～500nm；

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1).将生物可降解高分子溶于有机溶剂A中，40～90℃加热并磁力搅拌2～4小时，得到生物可降解高分子溶液；其中生物可降解高分子溶液中生物可降解高分子的质量体积含量为5～20﹪，单位为g/ml；将甲壳素纳米晶超声分散在有机溶剂B，分散均匀后得到甲壳素纳米晶溶液；其中甲壳素纳米晶溶液中甲壳素纳米晶的质量体积含量为1～5﹪，单位为g/ml；然后将甲壳素纳米晶溶液加入到生物可降解高分子溶液中，磁力搅拌15～30分钟，得到混合溶液，其中混合溶液中甲壳素纳米晶与生物可降解高分子的质量比为1:100～1:10；

所述的有机溶剂B与有机溶剂A选用的物质相同；

步骤(2).将无机粒子加入到步骤(1)混合溶液中，混合均匀后倒入模具中，置于-80～4℃下冷冻4～24小时，得到冷冻凝固的生物可降解高分子/甲壳素纳米晶混合物；生物可降解高分子与无机粒子的质量比为1:3～1:9；

步骤(3).将步骤(2)冷冻凝固的生物可降解高分子/甲壳素纳米晶混合物从模具中取出，浸泡在冰水中并磁力搅拌，每隔4～6小时换一次冰水，磁力搅拌2～3天，除去有机溶剂和无机粒子，得到生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架；

步骤(4).将步骤(3)生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架真空干燥2～3天，用于作为骨组织修复材料；

上述方法制备得到的材料为共混物，包括生物可降解高分子、甲壳素纳米晶；甲壳素纳米晶与生物可降解高分子的质量比为1:100～1:10；

生物可降解高分子为聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)、聚己内酯中的一种或多种；

甲壳素纳米晶形状为针状或棒状，宽度10～40nm，长度200～500nm。

2.如权利要求1所述的一种生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法，其特征在于步骤(1)有机溶剂A为二氧六环、四氢呋喃的一种或二氯甲烷与二氧六环的混合溶剂。

3.如权利要求1所述的一种生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法，其特征在于步骤(2)无机粒子为氯化钠、二水合酒石酸钠或四水合酒石酸钾钠中的一种或多种，粒径为100～500μm。

4.如权利要求1所述的一种生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法，其特征在于步骤(2)冷冻温度为-20～4℃。