CN104007269B - 一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述试剂盒中包括：（1）鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原；（2）标准阳性血清；（3）标准阴性血清；（4）稀释液；并提供了其应用。本发明提供的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，其有益效果包括以下方面：试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本发明中的试剂盒在检测样品时只需要使用几种简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养鸭场也可以使用；结果判定直观，眼观即可；操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是鸭疫里氏杆菌病的病原，可引起家鸭、鹅、火鸡及多种家禽和野禽发病，导致的鸭的疾病称为鸭传染性浆膜炎（duck infectious serositis）。发病鸭比较明显的病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎等。类似的病理变化也见于火鸡和其它禽类。本病最早于1932年在美国纽约州的长岛发现，随后迅速蔓延至世界各地。我国在1982年首次证实本病存在，目前各养鸭省区均有发生，且发病率和死亡率很高，给养鸭业造成重大经济损失。
RA血清型众多，目前报道确认的有21个血清型，各血清型间缺乏有效的交叉免疫保护，给疫苗预防带来了很大难度。我们从山东、河南以及广东的鸭场中分离到87株RA，用玻板凝集试验和试管凝集试验对其血清型进行了鉴定。其中血清1型27株，血清2型25株，血清10型18株，其它血清型17株，说明目前我国流行的优势RA血清型为1、2和10型。
用试剂盒检测RA抗体是诊断RA感染进而开展RA流行病学调查的有效手段。琼脂扩散试验可检测RA血清抗体，但敏感性较低。另外，间接ELISA方法研究的较多，使用的抗原种类有灭活全菌体、超声波破碎菌体后的裂解物、脂多糖、表达的重组蛋白等。绝大多数报道仅仅初步建立了ELISA方法，并没有进一步对所建立的方法进行优化，也没有开展临床试验，验证ELISA方法的实际应用效果。到目前为止，没有一种实现商品化的检测RA血清抗体的试剂盒，在国内外都是空白。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，鉴于目前我国流行的优势RA血清型为1、2和10型，提供了一种可简单快速的检测RA血清1、2和10型抗体的试剂盒，用来开展大范围的RA流行病学调查和免疫水平监测。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述试剂盒中包括：
（1）鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原；
（2）标准阳性血清；
（3）标准阴性血清；
（4）稀释液。
进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述制备鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的鸭疫里默氏杆菌菌株为田间分离株，分别为血清1型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6。
进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原是将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。
进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：
1）静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4℃静置3-5天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为PH 7.2的磷酸盐缓冲液，制备好的绵羊红细胞用PH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至10%浓度，得到绵羊红细胞悬液；
2）将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；
3）以步骤2）得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤1）得到的绵羊红细胞悬液，得到鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原，三种抗原致敏红细胞的终浓度为50μg/ml-100μg/ml。
进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，述标准阳性血清的制备方法为：取-75℃冻存的鸭疫里默氏杆菌甘油菌血清1型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6，用接种环蘸取菌液，划线接种于含5%绵羊血的营养肉汤琼脂平板上，置于37℃、5% CO2箱中培养15-20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml含5%小牛血清的营养肉汤中，37℃，200r/min培养15-18小时，然后把10ml菌液转接到200ml含5%小牛血清的营养肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养12-15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用PH7.2磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用鸭疫里默氏杆菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，按常规破碎程序超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清与弗氏完全佐剂等体积混匀，免疫兔，得到分离血清，效价达25及以上即为标准阳性血清。
进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述标准阴性血清的制备方法为：收集体重2.5公斤的健康新西兰白兔的颈动脉血，室温过夜，再以离心转速3000r/min离心15min，取上清即得到标准阴性血清。
进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述稀释液的制备方法为：配制PH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1%的兔血清和质量体积百分比为0.01%的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。
本发明的第二个目的是提供了上述一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒在检测鸭疫里默氏杆菌血清1型、血清2型和血清10型抗体效价中的应用。
进一步的，上述的应用，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为：
a）在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1-12孔，第8排的1-8孔各加稀释液50μl；
b）在血凝板1-6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl，用排枪从血凝板1-6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔；在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔；在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5-8孔为空白对照；
c）每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μl；
d）血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37℃静置1.5-2小时；
e）根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，其优越性包括以下方面：
a．试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本发明中的试剂盒在检测样品时只需要110°血凝板、移液器、移液器枪头和玻璃盖板等简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养鸭场也可以使用；
b．结果判定直观，眼观即可；
c．操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；
d．成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。
附图说明
图1为RA血清1型间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清以及大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清。
图2为RA血清2型间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清以及大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清。
图3为RA血清10型间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清以及大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清。
图1-3中，“﹢”表示检测标准阳性血清，“﹣”表示检测标准阴性血清，“空白”表示不加血清的空白对照，“大肠”表示检测大肠杆菌的阳性血清，“沙门”表示检测沙门氏菌的阳性血清，“巴氏”表示检测巴氏杆菌的阳性血清。RA血清1型、2型和10型间接血凝抗原分别检测同型标准阳性血清，检测到的血清抗体效价分别为211（图1）、210（图2）和29（图3）；检测阴性血清、空白对照均成立；检测大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清均呈现阴性反应。
图4为琼脂扩散试验检测RA血清1型标准阳性血清。
图5为琼脂扩散试验检测RA血清2型标准阳性血清。
图6为琼脂扩散试验检测RA血清10型标准阳性血清。
图4-6中，RA血清1型、2型和10型抗原分别检测同型标准阳性血清，检测到的血清抗体效价分别为27（图4）、25（图5）和25（图6）。
具体实施方式
实施例1：
本发明涉及的检测鸭疫里默氏杆菌（RA）血清1、2和10型抗体效价的间接血凝试剂盒中包括：
RA抗原1瓶（冻干），-20℃冻存；
标准阳性血清1瓶（0.5ml），-20℃冻存；
标准阴性血清1瓶（0.5ml），-20℃冻存；
稀释液3瓶（10ml/瓶），4℃保存。
试剂盒可检测40-50份血清，保存期为1年。
用来制备抗原的RA菌株为田间分离株，共3株：WF2（血清1型，2010年分离），WF7（血清2型，2010年分离），XY6（血清10型，2010年分离），保存于中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室。
本发明的试剂盒中各种试剂的制备方法是：
1．间接血凝抗原：
将WF2、WF7、XY6菌株增菌培养，超声破碎后，再离心取上清，作为抗原致敏鞣酸处理后的绵羊红细胞；
2．标准阳性血清：
将WF2、WF7、XY6菌株增菌培养，灭活后与佛氏佐剂混合，免疫健康新西兰白兔，获得高效价的血清抗体；
3．标准阴性血清：
采自健康新西兰白兔的血清；
4．稀释液：
PH7.2的磷酸盐缓冲液（0.1M/L），含1%兔血清和0.01%叠氮钠。
本发明的试剂盒的使用方法是：
a．在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1-12孔，第8排的1-8孔各加稀释液50μl；
b．在血凝板1-6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl，用排枪从血凝板1-6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔，在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔，在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5-8孔为空白对照；
c．每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μl；
d．血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37℃静置1.5-2小时；
e．根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
本发明的具体实施方法为：
一、RA间接血凝抗体检测试剂盒组成：
试剂盒中包括RA抗原1瓶（冻干），-20℃冻存；标准阳性血清1瓶（0.5ml），-20℃冻存；标准阴性血清1瓶（0.5ml），-20℃冻存；稀释液3瓶（10ml/瓶），4℃保存，试剂盒可检测40-50份血清，保存期为1年，检测RA血清1、2和10型血清抗体的试剂盒分别组装。
二、RA间接血凝抗体检测试剂盒的制备：
1．标准阳性血清的制备：
首先取出-75℃冻存的RA甘油菌WF2（血清1型）、WF7（血清2型）和XY6（血清10型），用接种环蘸取少量菌液，划线接种于含5%绵羊血的营养肉汤琼脂平板上，置于37℃、5% CO2箱中培养15-20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml含5%小牛血清的营养肉汤中，37℃，200r/min培养15-18小时，然后把10ml菌液转接到200ml含5%小牛血清的营养肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养12-15小时；培养完毕后，将全部菌液6000r/min离心15min，用PH7.2磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，作为超声破碎用菌体；
将上述制备的RA菌液置于碎冰中，再放到超声破碎仪中，按常规破碎程序超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清；
测定上述制备的上清中的蛋白浓度：经紫外分光光度计检测，WF2、WF7和XY6菌液上清中的蛋白浓度分别为10.49mg/ml、12.43 mg/ml 和11.28 mg/ml，这些上清液作为制备RA阳性血清用抗原，以及后续致敏绵羊红细胞的抗原，冻存于-75℃备用；
将上述制备的WF2抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2.5公斤左右的健康新西兰白兔，接种抗原量200μg/只，2周后用同等剂量的抗原（与等体积弗氏不完全佐剂混合）加强免疫1次，间隔2周后再加强免疫1次，第3次免疫后2周，兔耳静脉采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达25及以上为合格阳性血清，若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准；
同时制备WF7血清2型、XY6血清10型标准阳性血清，所用的方法与制备WF2血清1型标准阳性血清的方法相同；
经琼脂扩散试验检测，所制备的RA菌株1、2和10型标准阳性血清的抗体效价均达到25及以上，符合标准。
2．标准阴性血清的制备：
选取体重2.5公斤左右的健康新西兰白兔，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，取上清即为标准阴性血清；
3．稀释液的制备：
配制PH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1%的兔血清和质量体积百分比为0.01%的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。
4．RA间接血凝抗原制备：
静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4℃静置3-5天后，按常规方法对细胞进行洗涤、戊二醛固定、1/40000的鞣酸处理，此过程中所用的溶液均为PH7.2的磷酸盐缓冲液，制备好的红细胞用PH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至10%浓度；
致敏用抗原与制备标准阳性血清中所用的抗原相同，即为WF2、WF7和XY6菌液的超声裂解上清，蛋白浓度分别为10.49mg/ml、12.43 mg/ml 和11.28 mg/ml，抗原制备方法与步骤1“标准阳性血清的制备”相同；
首先确定致敏绵羊红细胞的最佳抗原量，取制备好的10%浓度的红细胞5份，每份5ml，取制备好的WF2菌株（血清1型）抗原，以终浓度25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml分别致敏红细胞，致敏时放于37℃水浴中，致敏时间为30min，期间每隔5min混匀一次，以防细胞沉淀，致敏后用PH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤4遍，再用稀释液洗涤1遍，最后用稀释液将红细胞悬浮至50ml，细胞终浓度为1%。共得到5种不同终浓度的蛋白致敏的间接血凝抗原，分别标记为AG1、AG2、AG3、AG4和AG5。
检测抗原质量：取2块110°血凝板，在第1块板的第1-5排的1-12孔、第2块板的第1-5排的1-8孔，分别加入稀释液，50μl/孔，然后在第1块板的第1-5排的第1孔，分别加入50μl标准阳性血清，用排枪依次往后作2倍倍比稀释，直至第12孔，在第2块板的第1-5排的第1孔，分别加入50μl标准阴性血清，用排枪依次往后作2倍倍比稀释，直至第4孔，第5-8孔为空白对照，最后加入充分摇匀的间接血凝抗原，25μl/孔。2块板的第1排均加入AG1，第2排加入AG2，第3排加入AG3，第4排加入AG4，第5排加入AG5。然后将血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37℃静置1.5-2小时；
结果判定：以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
与制备WF2间接血凝抗原相同的方法，制备WF7、XY6间接血凝抗原，并检测抗原质量。
5种不同浓度的抗原致敏红细胞，得到的间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清的结果如表1所示。
。
由表1可知，WF2、WF7和XY6三种抗原以25μg/ml的终浓度致敏绵羊红细胞，制备的血凝抗原检测其对应的标准阳性血清，检出的血清效价均为27；以50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml的终浓度分别致敏红细胞，制备的血凝抗原检测其对应的标准阳性血清，检出的血清效价分别为211、210和29，但200μg/ml时有前置现象。因此，确定以上三种抗原致敏红细胞的最佳终浓度为50μg/ml～100μg/ml。
根据确定的最佳致敏红细胞抗原量大批量制备血凝抗原，致敏、洗涤后用稀释液将红细胞悬浮至10%浓度，分装至10ml规格的玻璃瓶中，1ml/瓶，放于大型冻干机内冻干，保存于-20℃。
三、试剂盒的使用方法示例：
1．按需取出冻存的抗原，用稀释液将抗原彻底悬浮、混匀，10ml/瓶，稀释好的抗原若没有用完，可放于4℃短期保存，不可冻存；
2．在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1-12孔，第8排的1-8孔各加稀释液50μl；
3．在血凝板1-6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl，用排枪从血凝板1-6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔，在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔，在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5-8孔为空白对照；
4．每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μl；
5．血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37℃静置1.5-2小时；
6．结果判定：
红细胞全部凝集（﹢﹢﹢﹢）；75％红细胞凝集（﹢﹢﹢）；50％红细胞凝集（﹢﹢）；25％红细胞凝集（﹢）；无凝集（﹣），阳性血清对照1-9孔应呈现﹢﹢﹢﹢～﹢﹢凝集；阴性血清和空白对照应呈现﹣。
在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔。以呈现﹢﹢凝集的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
血清稀释倍数1:4出现﹢﹢以下者判为阴性；血清稀释倍数1:4出现﹢﹢以上、1:8出现﹢﹢以下者判为可疑；血清稀释倍数1:8出现﹢﹢﹢以上者判为阳性，并可确定抗体效价。
四、RA血凝抗原检测异型血清：
用制备的RA血清1型抗原检测2型和10型标准阳性血清；血清2型抗原检测1型和10型阳性血清；血清10型抗原检测1型和2型阳性血清。结果表明，血凝抗原检测不同血清型的阳性血清时，均可检测到24～25抗体效价，有交叉反应，但远远低于检测到的同型阳性血清抗体效价29～211，说明该抗原可以用来检测同血清型菌株感染或者疫苗免疫后产生的抗体效价。
五、试剂盒的特异性和敏感性检测：
用本发明中的试剂盒检测大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌的阳性血清，结果均呈现阴性，表明特异性较好。RA血凝抗原检测同型阳性血清，如图1-3所示，可检测到的抗体效价为29～211，而用琼脂扩散试验检测，如图4-6所示，抗体效价只检测到25～27，说明该试剂盒的敏感性更高。
六、试剂盒检测田间样品：
对采自规模化鸭场的262份鸭血清，用本发明的试剂盒和琼脂扩散试验分别进行检测，检测结果如表2所示。
。
由表2可知，本发明的试剂盒和琼脂扩散试验分别检测田间鸭血清样本，检测结果的符合率在80%以上，说明本发明的试剂盒的检测结果是可靠的；并且本发明中的试剂盒比琼脂扩散试验具有更高的敏感性，能有效检测同型血清，且操作简单方便，结果判定直观，可在实际生产中推广应用，开展RA流行病学调查和免疫水平监测。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
（1）鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原；
（2）标准阳性血清；
（3）标准阴性血清；
（4）稀释液；
所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原是采用鸭疫里默氏杆菌菌株制备的，所述鸭疫里默氏杆菌菌株为田间分离株，分别为血清1型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6；
所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原是将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的；
所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：
1）静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4℃静置3-5天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为pH 7.2的磷酸盐缓冲液，制备好的绵羊红细胞用pH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至10%浓度，得到绵羊红细胞悬液；
2）将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；
3）以步骤2）得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤1）得到的绵羊红细胞悬液，得到鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原，三种抗原致敏红细胞的终浓度为50μg/ml-100μg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清的制备方法为：取-75℃冻存的鸭疫里默氏杆菌甘油菌血清1型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6，用接种环蘸取菌液，划线接种于含5%绵羊血的营养肉汤琼脂平板上，置于37℃、5% CO2箱中培养15-20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml含5%小牛血清的营养肉汤中，37℃，200r/min培养15-18小时，然后把10ml菌液转接到200ml含5%小牛血清的营养肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养12-15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用pH7.2磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用鸭疫里默氏杆菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，按常规破碎程序超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清与弗氏完全佐剂等体积混匀，免疫兔，得到分离血清，效价达25及以上即为标准阳性血清。
3.根据权利要求2所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准阴性血清的制备方法为：收集体重2.5公斤的健康新西兰白兔的颈动脉血，室温过夜，再以离心转速3000r/min离心15min，取上清即得到标准阴性血清。
4.根据权利要求3所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液的制备方法为：配制pH7.2的浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1%的兔血清和质量体积百分比为0.01%的叠氮钠，即为稀释液。
5.如权利要求1-4任一所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒在检测鸭疫里默氏杆菌血清1型、血清2型和血清10型抗体效价中的应用，所述应用是非疾病的诊断和治疗目的的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为：
a）在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1-12孔，第8排的1-8孔各加稀释液50μl；
b）在血凝板1-6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl，用排枪从血凝板1-6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔；在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔；在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5-8孔为空白对照；
c）每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μl；
d）血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37℃静置1.5-2小时；
e）根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
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| CN104007269A (zh) | 2014-08-27 |
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