CN104007103A - 精液的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种精液的检测方法、试剂盒及其应用。所述方法或试剂盒能够减少精液样品的用量，方便检测出精浆的氧化应激水平，又能检测其中的白细胞污染程度和精子的氧化应激能力，提高检出率。
Description
技术领域
涉及一种生物样品的检测方法和检测试剂盒，尤其涉及人体精液样品的检验方法和检验试剂盒。
背景技术
正常精液是一种混合物，在射精时由睾丸和附睾的分泌液及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。最终射出的混合物是一种粘稠的液体，即射出的精液以团块状连续数次射出，通过输精管切除术前后的比较显示，就体积而言有90%是自附属腺体的分泌物，其中主要是前列腺和精囊腺，少部分来自尿道球腺和附睾。
精液的两个主要量化指标：1．精子总数，反应睾丸的生精状况和睾丸后管道系统的通畅程度；2．体积，反应腺体的分泌能力。
精子功能主要受精子自身的活力、运动、形态和精浆成份的影响。在固定条件下，精液样本质量主要受睾丸生精功能、附属腺体的分泌、近期患病情况尤其高热性疾病，以及其它如禁欲时间的长短的影响。
精液中常含有一定的非精子细胞成分，部分与临床关系密切，通常包括泌尿生殖道上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞，后两种统称为“圆细胞”。这些细胞成分在染色后的涂片中（放大1000倍）难以区别，但可以通过过氧化物过氧化物酶技术和全白细胞单克隆抗原技术来进行鉴别。
目前有相当证据表明，少量白细胞在调节自身免疫应答中起着重要作用，但在病理情况下，也即男性或女性生殖道中过量存在的白细胞极其代谢产物，则会影响男性精子的功能，降低精子活力和授精能力。一般认为，精液中的白细胞主要通过释放活性氧（Reactive OxygenSpecies，ROS）导致精子细胞膜脂质过氧化途径而损伤精子功能。由于精液中存在复杂的氧化及抗氧化系统，单纯通过形态学检测精液白细胞数量有一定的局限性，因此评价精液活性氧水平，特别是精液中白细胞的氧化应激水平的方法将是传统检测方法的极好补充。
检测精浆中活性氧水平和通过自由基生成能力来快速检测精液中是否存在白细胞污染，并可评估精子的氧化应激能力，反映精子生成过程的整体质量，在研究分析男性不育的病因以及治疗中有着重要的意义，并可应用与男性不育干预治疗效果的评估。
样本的采集和检查都按照规范化程序进行，其结果才有价值。本章所述操作流程被认定为进行精液评估的基本组成步骤。
发明内容
本申请的主要涉及一种检验精液氧化应激的方法或试剂盒。
在一些实施方案中，提供一种检验精液氧化应激的方法，所述方法包括，
向20μl-200μl精液样品中加入10μl-100μl鲁米诺溶液和10μl-100μl的过氧化物酶溶液，反应后得到混合物A，记录混合物A的分光光度值Dr；
向混合物A中加入10μl-100μl fMLP溶液，反应后得到混合物B,记录混合物B的分光光度值Df；以及
向混合物B中加入10μl-100μl PMA溶液，反应后得到混合物C,记录混合物C的分光光度值Dp；
根据Df/Db比值的对数值确定此精液是否为白细胞精子症，和/或根据Dp/Dr比值的对数值确定精子的氧化应激值是否正常。
在一些实施方案中，提供一种检验精液氧化应激的试剂盒，所述试剂盒包括，
鲁米诺溶液；
过氧化物酶溶液；
fMLP溶液；
PMA溶液；以及
任选地，所述试剂盒还包括阳性对照品（例如，0.02% H2O2，硼酸钠溶液）和/或阴性对照品（例如，PBS）。
在一些实施方案中，所述方法或试剂盒中使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液、PMA溶液的工作浓度为：
鲁米诺溶液(2.5mM)；
过氧化物酶溶液(12.5IU/ml)；
fMLP溶液(0.2mM)；以及
PMA溶液(0.4μM)。
在一些实施方案中，所述试剂盒能够提供单次使用的单份的10μl-100μl鲁米诺溶液、10μl-100μl的过氧化物酶溶液、10μl-100μlFMLP溶液以及10μl-100μl PMA溶液等检测试剂。因此，所述试剂盒包含至少一份这样的检测试剂。
在一些实施方案中，本申请公开的试剂盒还包含标准品，其通过所包含的检测试剂，尤其是单份检测试剂检测后，能够绘制出ROS的标准曲线。在另一些实施方案中，所述试剂盒包含述阴性标准品和/或阳性标准品。在一些实施方案中，所述阳性标准品为白细胞污染对照品。Df/Db比值的对数值≥1.25，说明所述精液样品中为白细胞精子症。
在一些实施方案中，所述试剂盒是用来实施本申请所公开的方法的试剂盒。
在一些实施方案中，所述Dr/Db比值的对数值来判断精液样品中精浆的氧化应激值是否处于正常范围。通常为，Dr/Db比值的对数值≤0.75，说明所述精液样品中精浆的氧化应激能力正常。
在一些实施方案中，所述Df/Dbr比值的对数值来判断精液样品中是否存在白细胞污染。通常为，Df/Db比值的对数值≥1.25说明所述精液样品中存在白细胞污染。
在一些实施方案中，所述Dp/Dr比值的对数值大于等于0.9，说明所述精液样品中的精子氧化应激能力正常。通常为，Dp/Dr比值的对数值大于等于0.9说明所述精液样品中精子氧化应激能力正常。
在一些实施方案中，所述精液样本的检测用量与现有技术比较，明显减少，例如，200μl、150μl、100μl、75μl、50μl或30μl。由于本申请公开的方法或其试剂盒使用的精液样品用量减少，所以能够利用有限的精液样品进行重复试验或其它项目的分析。
在一些实施方案中，本申请公开的方法和试剂盒能够同时分析精液中的白细胞污染和精子的氧化应激能力，即精子的活力，从而能够在一次检查中鉴别出不育症是由于白细胞污染还是精子活力降低而引起的，或者二者均存在。
因此，本申请所公开的精液氧化应激的检测方法及其试剂盒为快速检测精液中是否存在白细胞污染、精浆和精子的氧化应激能力提供了一种新的评估方法和手段。
附图简要说明
图1A和图1B分别显示白细胞含量与化学发光值的对数线性关系。图1A为fMLP刺激下,白细胞含量与化学发光值的对数线性关系;图1B为PMA刺激下，白细胞含量与化学发光值的对数线性关系。
图2A和图2B分别显示使用鲁米诺-过氧化物酶系统观察到的精液的化学发光图形。图2A显示在存在白细胞污染的情况下，加入白细胞特异探针fMLP后，产生一个ROS峰。图2B显示如果没有白细胞污染，fMLP反应的ROS峰则消失，而由PMA引发一个显著的由精子产生的化学发光信号。
具体实施方式
一方面，本申请涉及一种检验单份精液氧化应激的方法。
另一方面，本申请涉及一种检验单份精液氧化应激的试剂盒。
在一些实施方案中，提供一种检验单份精液氧化应激的方法，所述方法包括，
取计数后的20μl-200μl精液样品于样品管内，记录样品的发光值数据1为Db；
向20μl-200μl精液样品中加入10μl-100μl鲁米诺溶液(2.5mM)和10μl-100μl的过氧化物酶溶液(12.5IU/ml)，反应后得到混合物A，记录混合物A的发光值Dr；
向混合物A中加入10μl-100μl fMLP溶液(0.2mM)，反应后得到混合物B,记录混合物B的发光值Df；以及
向混合物B中加入10μl-100μl PMA溶液(0.4μM)，反应后得到混合物C,记录混合物C的发光值Dp；
Dr/Db比值的对数值来确定此精液中的精浆氧化应激能力是否正常，和/或Df/Db比值的对数值确定此精液是否为白细胞精子症，和/或根据Dp/Dr比值的对数值确定精子的氧化应激值。
在一些实施方案中，提供一种检验精液氧化应激的试剂盒，所述试剂盒包括，
鲁米诺溶液
过氧化物酶溶液；
fMLP溶液；
PMA溶液；以及
任选地，所述试剂盒还包括阳性对照品（例如，0.02% H2O2，硼酸钠溶液，pH8.7）和/或阴性对照品（例如，PBS，pH8.7）。
在一些实施方案中，所述试剂盒能够提供单次使用的单份的10μl-100μl鲁米诺溶液、10μl-100μl的过氧化物酶溶液、10μl-100μlFMLP溶液以及10μl-100μl PMA溶液等检测试剂。
在一些实施方案中，所述方法或试剂盒中的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液以及PMA溶液的用量或单份用量是欲检测精液体积的二分之一。例如，当欲检测的精液为100μl时，鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液以及PMA溶液的用量为50μl；当欲检测的精液为200μl时，鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液以及PMA溶液的用量为100μl；当欲检测的精液为150μl时，鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液以及PMA溶液的用量为75μl；当欲检测的精液为75μl时，鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量约为35-40μl；当欲检测的精液为50μl时，鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液以及PMA溶液的用量为25μl。
在一些实施方案中，所述方法或试剂盒中的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液以及PMA溶液可以是浓缩液，在使用时，利用分析缓冲液，例如PBS缓冲液、生理盐水、林格氏液等稀释成所述方法中使用的浓度。因此，在一些实施方案中，本申请公开的试剂盒中还包括诸如PBS缓冲液、生理盐水、林格氏液、细胞培养基、平衡盐溶液或其组合等的分析缓冲液或稀释液，其可以用于稀释样品或试剂，或作为阴性对照品使用。相应地，在一些实施方案中，本申请公开的方法还包括用上述诸如PBS缓冲液、生理盐水、林格氏液、细胞培养基、平衡盐溶液或其组合等的分析缓冲液或稀释液来稀释样品或稀释浓缩的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液以及PMA溶液的步骤，以使其达到工作浓度，即所述方法或试剂盒所使用的浓度。
在一些实施方案中，所述方法或试剂盒中使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液、PMA溶液的工作浓度为：
鲁米诺溶液(2.5mM)；
过氧化物酶溶液(12.5IU/ml)；
fMLP溶液(0.2mM)；以及
PMA溶液(0.4μM)。
在一些实施方案中，为了方便检测，本申请公开的方法中所述的反应是在室温静置3-15分钟，或者在37°C温浴静置3-10分钟或约5分钟完成的。
在一些实施方案中，本申请公开的试剂盒还包含标准品，其通过所包含的检测试剂，尤其是单份检测试剂检测后，能够绘制出ROS的标准曲线。
在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含阴性对照品和/或阳性对照品。所述阳性对照例如，0.02% H2O2，硼酸钠溶液，pH8.7；阴性对照品例如，PBS，pH8.7。
在一些实施方案中，所述阳性标准品为白细胞污染对照品，其本申请公开的Df/Db比值的对数值确定此精液是否为白细胞精子症。
在一些实施方案中，所述Dr/Db比值的对数值来判断精液样品中精浆的氧化应激值是否处于正常范围。通常为，Dr/Db比值的对数值≤0.75，说明所述精液样品中精浆的氧化应激能力正常。
在一些实施方案中，所述Df/Db比值的对数值来判断说明精液样品中存在白细胞污染。通常为，Df/Db比值的对数值≥1.25说明所述精液样品中存在白细胞污染。
在一些实施方案中，所述所述Dp/Dr比值的对数值大于等于0.9，说明所述精液样品中的精子氧化应激能力正常。通常为，所述Dp/Dr比值的对数值大于等于0.9说明所述精液样品中精子氧化应激能力正常。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含指导使用该试剂盒的说明书。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒是实施本申请公开的检验精液氧化应激的方法的试剂盒。
在一些实施方案中，所述精液样本的检测量与现有技术比较，明显减少，例如，200μl、150μl、100μl、75μl、50μl或30μl，通常为100μl的未处理的精液，例如无需分离、离心精液，即可完成本申请公开的精液氧化应激反应的检测，从而避免了对精子细胞产生损害，又能从中分析白细胞的污染和精子的氧化应激能力。由于本申请公开的方法或其试剂盒使用的精液样品量减少，所以能够利用有限的精液样品进行重复试验或其它项目的分析。
在一些实施方案中，所述的分光度值是利用化学发光仪来检测的，通常检测3、5、10、12、15或20秒，更通常检测10秒。
本申请公开的分析缓冲液或稀释液包括但不限于细胞培养基、缓冲液、林格氏液、生理盐水和平衡盐溶液。细胞培养基的实例包括BME、MEM、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199等。缓冲液的实例包括磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及碳酸盐。
在一些实施方案中，所述分析缓冲液或稀释液为等渗缓冲液，优选为等渗磷酸盐缓冲液(PBS)。
本申请公开的术语“个体”，是指哺乳动物或人，包括但不限于人、灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。
上述公开内容总体上描述了本申请的公开的方法试剂盒及其应用，本领域技术人员根据需要对所用试剂浓度和用量进行调整，并且可以对所述实施方案进行任意的组合。以下的实施例进一步对本申请进行示例性的说明。描述这些实施例仅为说明本申请公开的技术方案，而不是限制其范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本申请所附权利要求保护的范围。
实施例
实施例1 白细胞氧化应激梯度实验
材料：白细胞（血液分离获得）；检测试剂盒包含鲁米诺（luminol）、过氧化物酶(HRP)，fMLP和PMA各个试剂组分。
仪器：Berthold Detection Systems公司管式化学发光测定仪SmartLine或96孔板式OrionII。
实验步骤：
细胞梯度稀释：按以下浓度（cells/ml）利用PBS缓冲液对细胞进行稀释。
4.5×105/ml；2.25×105/ml；4.5×104/ml；2.25×104/ml；4.5×103/ml；2.25×103/ml；4.5×102/ml；2.25×102/ml。
取100μl后加入100μl的鲁米诺，100μl的HRP，然后加入100μl的fMLP，检测发光值，待发光值回落后，加入100μl的PMA，检测发光。
空白基线检测：100μl cell+100μl luminol+100μl HRP
样本检测：100μl cell+100μl luminol+100μl HRP+100μl FMLP
100μl cell+100μl luminol+100μl HRP+100μl PMA
检测时间：每0.5min一测，共测3min。
实验结果及分析：
1.空白基线值在70~90左右
2.从测量结果看，在fMLP刺激下，细胞在2min左右出现峰值，随后下降，在10min左右降到200~300。
在PMA刺激下后,刺激后发光值随着时间逐步升高，当上升到一定值后出现一个持续时间较长的平台期。
3.从梯度稀释的结果看，检测发光值随着细胞数目的减少而降低。
1.5min fMLP发光值如下表1所示，基本上到102个数量级。
表1 1.5min白细胞的fMLP发光值
| Cell/ml | 4.5×105 | 2.25×105 | 4.5×104 | 2.25×104 | 4.5×103 | 2.25×103 | 4.5×102 | 2.25×102 | 空白 |
| 光度值 | 106723 | 85120 | 16232 | 8565 | 1890 | 1286 | 226 | 141 | 103 |
3.0min白细胞的PMA发光值如下表2所示，基本上到102个数量级。
| Cell/ml | 4.5×105 | 2.25×105 | 4.5×104 | 2.25×104 | 4.5×103 | 2.25×103 | 4.5×102 | 2.25×102 | 空白 |
| 光度值 | 227344 | 146061 | 18902 | 12310 | 2487 | 1677 | 334 | 166 | 103 |
取FMLP、PMA峰值的测量数据，将发光值和细胞浓度均取对数，作图，计算R2，包含4.5×105~2.25×102不同浓度下8个发光值的结果如图1A和图1B所示。
实施例2 精液中白细胞污染与精子氧化应激能力的检测试验1
一、研究对象
在6000例被调查健康生育男性中，随机抽取，采集禁欲2-7天的精液样本，作为可育健康对照。纳入标准：同居一年以内生育，精液采集时的年龄<40岁。
以及采用编码表以1:10比例随机抽取复旦大学附属妇产科医院集爱遗传与诊疗中心门诊患者，纳入标准：同居两年以上未避孕，性生活正常而未育。排除标准：临床诊断为女性因素导致的不育、无精子症、少精症患者。
参照WHO标准，按精液参数将不育患者分成2组：
精液参数正常组：精子密度≥15×106/ml，前向活动精子率≥32％或者前向活动精子率＋非前向活动精子率≥40％，正常形态率≥4％
少弱精子症组：精子密度≥或<15×106/ml，前向活动精子率<32％同时前向活动精子率＋非前向活动精子率<40％，正常形态率≥4％。
最终，根据精液一般情况的检查结果，将研究对象分为3组，即精液参数正常可育组（230例）、精液参数正常不育组（166例）以及少弱精子症不育组（234例）。
二、方法
（一）精液收集和精液常规检测
按WHO的《人类精液检验和处理实验手册第五版》[2]精液收集要求，收集新鲜精液。待精液完全液化后使用CASA系统检测精子密度，动力学参数等指标；根据WHO标准，采用Diff-Quik染色法评价精子形态学指标。记录精子畸形率、头部缺陷、中段缺陷、尾部缺陷。
（二）化学发光法检测精液ROS水平
氧自由基能与鲁米诺反应，在酶的催化下产生生物荧光，通过化学发光仪检测产生的光强度，来推算氧自由基的量。甲酰三肽(fMLP)和佛波醇(PMA)是能够激发氧化应激的刺激剂。fMLP作为白细胞的探针，可以刺激其中的NADPH氧化酶系统产生氧自由基；而PMA可以进入精子细胞，激活精子细胞，产生氧化应激。
适用仪器：
Berthold Detection Systems公司管式化学发光测定仪SmartLine或微孔板式化学发光仪Orionll。
检测步骤：
上述收集的新鲜精液，不少于1ml，避免离心或剧烈震荡。精液样品1小时内进行检测为最佳，但不应超过2小时。
取100μl精液于2.0ml离心管内或微孔板微孔内，检测10秒，记录数据1为Db；
加50μl鲁米诺和50μl过氧化物酶溶液，室温充分混匀后，37°C温浴静置5分钟，检测10秒，记录数据2为Dr;
加50μl fMLP于上述离心管内，轻轻吹打，37°C温浴避光静置15分钟，检测10秒，记录数据3为Df；
加50μl PMA于上述离心管内，轻轻吹打，37°C温浴避光静置10分钟，检测10秒，记录数据4为Dp。
根据数据1，2，3，4绘制此样品的ROS曲线图。
阴性、阳性参照品检测:
阴性和阳性参照品检测用于质控和阳性对照，在每次检测使用，反应检测试验的质量。其检测步骤同精液的检测。
【参考值】
1，精浆正常氧化应激值：Dr/Db比值的对数值≤0.75。
2，白细胞污染：Df/Db比值的对数值≥1.25判断为白细胞精子症；
3，精子正常氧化应激值：Dp/Dr比值的对数值>0.9。
（四）统计学分析
使用SAS9.1.3软件包进行统计分析
三、结果
从图2A可见，在存在白细胞污染的情况下，加入白细胞特异探针fMLP后，产生一个ROS峰。继之加入PMA，精子和白细胞群共同产生一个持久的强化学发光信号。从图2B可见，如果没有白细胞污染，fMLP反应的ROS峰则消失，而只有PMA引发一个显著的由精子产生的化学发光信号。
1、一般情况和精液检查结果
不育、精液参数正常的男性166例：他们的精子密度≥15×106/ml，前向活动精子率≥32％或者前向活动精子率＋非前向活动精子率≥40％，正常形态率≥4％。
不育、少弱精子症的男性234例：他们的精子密度≥或<15×106/ml，前向活动精子率<32％同时前向活动精子率＋非前向活动精子率<40％，正常形态率≥4％。
已育、精液参数正常男性230例：他们的精子密度≥15×106/ml，前向活动精子率>32％同时前向活动精子率＋非前向活动精子率>40％，正常形态率≥4％。
各组检查结果符合各组的分组特征要求。
2、精浆氧化应激水平
计算Dr/Db比值的对数值，进行t检验可以发现，不育组人群的精浆氧化应激值明显高于正常可育组，具有统计学意义（表1）。
表1* 精浆氧化应激水平
*：因两两比较时所有比值均为正态分布，两两之间的差异性比较采用“参数检验”。精液参数正常不育和少弱精不育组比较，SIG＞0.05，没有显著性差异。两个不育组分别与可育组相比，SIG均＜0.05，具有显著性差异。
3、白细胞污染检查情况
计算Df/Dr比值的对数值，并进行t检验后可以发现，白细胞精子症的值明显高于非白细胞精子症，具有统计学意义；而且两个不育组的精液白细胞污染比例明显高于可育组，具有统计学意义（表2），这说明白细胞污染会导致精子的活动能力下降，进而导致不育。
表2 精液白细胞污染检查情况
4、精子的氧化应激能力
计算Dp/Df比值的对数值，即加入PMA后样本产生的ROS/精浆ROS的对数，并进行t检验后可以发现，可育组的PMA氧化应激水平明显高于不育组，具有统计学意义（表3）。
表3精子的氧化应激能力
*：因两两比较时所有比值均为正态分布，两两之间的差异性比较采用“参数检验”。精液参数正常不育和少弱精不育比较，SIG均＞0.05，没有显著性差异。精液参数正常不育和少弱精不育分别与可育组相比，SIG均＜0.05，具有显著性差异。这说明精液参数正常不育组中的精子活力明显下降，是导致不育的另外一个主要原因。而且，在无污染的精液参数正常不育患者中，几乎均表现为精子的氧化应激能力下降。
实施例3 精液中白细胞污染与精子氧化应激能力的检测试验2
取50μl精液于2.0ml离心管内或微孔板微孔内，检测10秒，记录数据1为Db；
加25μl鲁米诺和50μl过氧化物酶溶液，室温充分混匀后，37°C温浴静置5分钟，检测10秒，记录数据2为Dr;
加25μl fMLP于上述离心管内，轻轻吹打，37°C温浴避光静置15分钟，检测10秒，记录数据3为Df；
加25μl PMA于上述离心管内，轻轻吹打，37°C温浴避光静置10分钟，检测10秒，记录数据4为Dp。
检测结果与50μl的趋势相同。
四、讨论
正常生育力男性精液中，白细胞密度一般小于1×106/ml，其中粒细胞占50～60％，巨噬细胞占20～30％。白细胞具有多种免疫功能，包括吞噬杀伤作用、抗原递呈作用极分泌作用等，在机体内可以起到吞噬和杀灭多种病原微生物、处理衰老损伤的细胞、将有效的抗原成分递呈给淋巴细胞及分泌多种生物活性物质等作用。精液中所含的吞噬细胞，他们主要的作用为吞噬异物及细菌，病理情况下，在抗精子抗体的作用下也能吞噬精子，使精子密度和活力下降。除此之外，还可以通过释放ROS来影响到精子功能。
精液中过量产生的白细胞是精液ROS的主要贡献者，文献表明，一个白细胞在应激情况下产生的活性氧，可达一个精子在相同应激情况下所产生的100倍以上，所以，即使精液中白细胞数量远低于精子细胞，其所产生的ROS对精子悬液的化学发光信号产生很大的影响。此外，精液中的活性氧的升高与多种因素有关，如吸烟，生殖道感染，精索静脉曲张，环境污染，激素的使用等。活性氧在低浓度发生可以调节正常精子功能，而高浓度ROS危害精子的存活力和功能。但精液中还存在着ROS的清除机制，只有当ROS的生成远大于抗氧化物的清除能力时，才会导致氧化应激的产生。因此，单纯测量精液活性氧水平以及计算白细胞的数量并不能真正反映精液中白细胞的氧化应激能力，用本申请所述方法或试剂盒公开的白细胞特异探针甲酰三肽（fMLP）诱导白细胞产生活性氧，同时考虑精浆活性氧水平及精子密度，也即用白细胞活性氧指数评价白细胞对精液质量的影响，可克服现有方法的局限性。
在本申请中，通过化学发光方法来测定精液中精浆ROS的水平，同时通过甲酰三肽（fMLP）作为白细胞特异的探针，刺激白细胞的NADPH氧化过氧化物酶系统产生氧自由基。用白细胞活性氧指数，也即用fMLP产生的活性氧/精浆活性氧/精子密度，则发现，该指标数值越高，精子的活动率越差，各组间差异显著。在我们的研究中，还发现白细胞ROS指数在弱精症组、少弱精子症组明显高于精子参数正常组，也就是说，在平衡了精浆ROS水平和精子密度的影响后，弱精症组、少弱精子症组精液中白细胞所产生的ROS明显高于精子参数正常组，这也表明着少弱精子症和弱精子症组，精液中存在过量的白细胞，且白细胞产生ROS的能力越强，可能是导致精子活动力低下的重要原因。可见，同时进行白细胞污染、精浆和精子氧化应激能力的检测，能够准确地鉴定出不育症患者，提高检出率，并为后续治疗提供线索。
此外，本申请公开的方法或试剂盒能够利用较小体积的精液样品即可完成精液中白细胞产生ROS的检测以及精子氧化应激能力的分析，使得能够利用有限的精液样品进行重复试验或其它项目的分析，同时又能准确地反映精液的白细胞污染情况以及精子氧化应激能力。
可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本发明要求保护的范围内。
Claims (10)
1.一种检验个体精液氧化应激的试剂盒，所述试剂盒包括，
鲁米诺溶液；
过氧化物酶溶液；
FMLP溶液；
PMA溶液；以及
任选地，阳性对照品和/或阴性对照品。
2.如权利要求1所述试剂盒，其包含至少一份单次使用的10μl-100μl鲁米诺溶液、10μl-100μl的过氧化物酶溶液、10μl-100μlFMLP溶液以及10μl-100μl PMA溶液等检测试剂。
3.如权利要求1-2任一项所述试剂盒，其中所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的量是欲检测精液体积的1/2至1倍。
4.如权利要求1-3任一项所述试剂盒，其中当欲检测的精液为100μl时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量为50μl；
当欲检测的精液为200μl时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量为100μl；
当欲检测的精液为150μl时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量为75μl；
当欲检测的精液为75μl时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量约为35-40μl；或者
当欲检测的精液为50μl时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量为25μl。
5.如权利要求1-4任一项所述试剂盒，还包含阴性和/或阳性标准品。
6.如权利要求1-5任一项所述试剂盒，还包含指导使用该试剂盒的说明书。
7.如权利要求1-6任一项所述试剂盒，其中所述阳性标准品为白细胞污染对照品，其权利要求1所述的Df/Db比值的对数值≥1.25，说明所述精液样品中为白细胞精子症。
8.如权利要求1-7任一项所述试剂盒，其中所述阳性标准品为反映正常氧化应激能力的标准品，其权利要求1所述的Dr/Db比值的对数值小于等于0.75，及Dp/Dr比值的对数值大于等于0.9。
9.如权利要求1-8任一项试剂盒，其中所述个体选自哺乳动物或人，包括但不限于人、灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。
10.一种检验患者精液氧化应激的方法，所述方法包括，
取计数后的20μl-200μl精液样品于样品管内，记录样品的发光值数据1为Db；
向20μl-200μl精液样品中加入10μl-100μl鲁米诺溶液(2.5mM)和10μl-100μl的过氧化物酶溶液(12.5IU/ml)，反应后得到混合物A，记录混合物A的发光值Dr；
向混合物A中加入10μl-100μl FMLP溶液(0.2mM)，反应后得到混合物B,记录混合物B的发光值Df；以及
向混合物B中加入10μl-100μl PMA溶液(0.4μM)，反应后得到混合物C,记录混合物C的发光值Dp；
根据Dr/Db比值的对数值可以判断此精浆氧化应激是否正常，和/或根据Df/Db比值的对数值确定此精液是否为白细胞精子症，和/或根据Dp/Dr比值的对数值确定精子的氧化应激值是否正常；以及
任选地，所述方法是实施权利要求1-9任一项所述试剂盒的方法。
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|---|---|
| CN (1) | CN104007103A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106932597A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-07 | 山东大学 | Atp5a1蛋白531位发生质量偏移的赖氨酸在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106996980A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-01 | 山东大学 | Akap4蛋白733位发生质量偏移的赖氨酸在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106996979A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-01 | 山东大学 | Akap4蛋白186位n‑113.05347在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106996981A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-01 | 山东大学 | Akap4蛋白186位n‑114.04278在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN110286080A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-09-27 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 精液细胞快速分型检测试剂盒及检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN202075277U (zh) * | 2011-05-10 | 2011-12-14 | 北京华方神火科技有限公司 | 一种精子检测室 |
| US20140329237A1 (en) * | 2011-10-30 | 2014-11-06 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Means and methods for assessing sperm nuclear dna structure |
-
2013
- 2013-02-21 CN CN201310055555.1A patent/CN104007103A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN202075277U (zh) * | 2011-05-10 | 2011-12-14 | 北京华方神火科技有限公司 | 一种精子检测室 |
| US20140329237A1 (en) * | 2011-10-30 | 2014-11-06 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Means and methods for assessing sperm nuclear dna structure |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| R.JOHN AITKEN ET.AL: "Shedding Light on Chemiluminescence: The Application of Chemiluminescence in Diagnostic Andrology", 《ANDROLOGY LAB CORNER》 * |
| 刘媛: "精子凋亡与精液参数关系及其影响因素初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
| 史庭燕 等: "化学发光氧化应激检测在精液质量评价中的应用", 《国际生殖健康/计划生育杂志》 * |
| 赵洪鑫: "精液氧化应激检测及其在辅助生殖技术中的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106932597A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-07 | 山东大学 | Atp5a1蛋白531位发生质量偏移的赖氨酸在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106996980A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-01 | 山东大学 | Akap4蛋白733位发生质量偏移的赖氨酸在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106996979A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-01 | 山东大学 | Akap4蛋白186位n‑113.05347在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106996981A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-01 | 山东大学 | Akap4蛋白186位n‑114.04278在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106932597B (zh) * | 2017-03-29 | 2018-07-20 | 山东大学 | Atp5a1蛋白531位发生质量偏移的赖氨酸在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106996979B (zh) * | 2017-03-29 | 2018-11-02 | 山东大学 | Akap4蛋白186位n-113.05347在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN106996981B (zh) * | 2017-03-29 | 2018-11-02 | 山东大学 | Akap4蛋白186位n-114.04278在制备重度少弱精诊断试剂中的用途 |
| CN110286080A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-09-27 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 精液细胞快速分型检测试剂盒及检测方法 |
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