Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen Antibiotika S 74811F-1 (Formel I)
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und S 7481/F-2 und Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika.
Erfindungsgemäss gelangt man zu den neuen Antibiotika S 7481/F-1 und S 74811F-2, indem man einen Stamm der Pilzgattung Cylindrocarpon lucidum auf oder in einem Nährmedium züchtet, die neuen Antibiotika S 7481/F1 und S 7481/F-2 aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise durch extraktive undloder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
Der neue erfindungsgemäss verwendete Stamm der Pilzgattung Cylindrocarpon lucidum wurde aus einer im Staate Wisconsin, USA gefundenen Erdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, all., USA unter der Nummer NRRL 5760 deponiert.
Der neue Stamm NRRL 5760 der Pilzgattung Cylindrocarpon lucidum wächst auf Malzextrakt-Agar bei Temperaturen zwischen 18 und 36 , vorzugsweise bei 27". Die Oberfläche der gewachsenen Kolonien ist bleich braungelb gefärbt, in honigfarben bis braun übergehend. Das gebildete Luftmycel ist weiss und spärlich. Die Rückseite zeigt ein bleiches Weinrot und die Färbung geht mit der Zeit in ein rötliches Braun über. Der Stamm NRRL 5760 der Pilzgattung Cylindrocarpon lucidum entspricht in seiner Morphologie und Physiologie der Beschreibung in CMI Mycological Papers 104, 21(1966).
Der neue Stamm NRRL 5760 lässt sich auf vielartigen Nährböden, die die üblichen Nährstoffe für Pilze enthalten, züchten. So verwendet dieser Stamm die für die kohlenstoffheterotrophen Organismen üblicherweise verwendeten Nährstoffe, z. B. Saccharose, Glucose, Maltose, Lactose als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Corn steep, Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw.
als Stickstoffquelle sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.
Die neuen Antibiotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 kann man in der Weise herstellen, dass man ein flüssiges Nährmedium mit einer Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 beimpft, und die Kultur 9 bis 13 Tage, vorzugsweise 11 Tage bei 27 und einem pH-Wert von 4,4 bis 8,8, vorzugsweise bei pH 8,1 inkubiert wird. Die Züchtung kann vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur erfolgen. Sobald eine maximale Menge an Antibiotika produziert ist, wird filtriert und die Antibiotika durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise aus der Kulturlösung gewonnen.
Eine Methode, die sich als vorzugsweise erwiesen hat, besteht in der Extraktion des Mycels gegebenenfalls nach vorhergehender mechanischer Zerkleinerung mit 900/cigem Methanol, anschliessendem Abdampfen des Methanols und mehrmaliger Extraktion des resultierenden Gemisches mit Äthylenchlorid. Diesem Extrakt wird der aus dem Kulturfiltrat gewonnene Äthylenchloridextrakt beigefügt. Es können jedoch auch andere organische mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, Essigester, Methylenchlorid oder Butylacetat verwendet werden. Die organische Lösung wird eingedampft, der Rückstand chromatographiert, vorzugsweise an Silicagel mit einer Chloroform/Methanollösung (98 : 2), wobei die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt und nochmals mit einer Methanollösung an Sephadex LH-20 chromatographiert werden.
Die Trennung und Reinigung der beiden Antibiotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 erfolgt hierauf durch erneutes Chromatographieren an Silicagel.
Die neuen Antibiotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 zeichnen sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und können daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmen beide Antibiotika das Wachstum von Aspergillus niger. Insbesondere zeichnen sich aber die beiden neuen Wirkstoffe durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung kann wie folgt gezeigt werden: a) Lokale Hämolyse im Gel in vitro, Jerne-Test:
Die Hemmung der Hämolysenhöfe in O/o gegenüber Kontrollen beträgt bei einer Dosis von 2x60 mg/kg i. p. 990/0, bei einer Dosis von 1x150 mg/kg p. o. 90% und bei einer Dosis von 3x200 mg/kg p. o. 99,5O/o.
b) Hämagglutinationstest (HAT) an der Maus:
Erfasst werden die gegen Schaferzythrozyten gebildeten Antikörper. Die Hemmung wird im suppressiven Index (ski) ausgedrückt, wobei die unbehandelte Kontrolle mit 1,00 angegeben wird; Sl = 0,3 nach p. o. 5x200 mg/kg.
c) Hauttransplantationstest bei der Maus:
Bei H-2 histoinkompatiblen Mäusen wird die Überlebenszeitverlängerung des Hauttransplantates gegenüber unbehan delten Kontrolltieren nach einer Dosis von 7x200 mg/kg p. o. knapp signifikant verlängert.
d) Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) an der Ratte:
Die experimentell hervorgerufenen Nervengewebsschädi gungen, die bei unbehandelten Kontrolltieren 8 von 10 Tie ren lähmten, ergab bei der gleichen Anzahl Versuchstieren, die mit 13x25 mg/kg i. p. behandelt worden sind, einen 1000/eigen Schutz.
e) Oxazolon-Test an der Maus:
Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver
Index (ski) ausgedrückt; 51 = 0,6 nach 6x75 mg/kg p. o.
Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung können die Verbindungen zur Prophylaxe und Behandlung von
Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen angewandt werden.
Die neuen Antibiotika besitzen ebenfalls eine arthritishemmende Wirkung. So wirken sie z. B. im Freund-Adjuvans-Ar thritis-Latenzzeitversuch an der Ratte in Dosen von etwa 50 mg/kg Körpergewicht stark schwellungshemmend.
Aufgrund ihrer arthritishemmenden Wirkung können die Antibiotika zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und rheumatischen Krankheiten angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art des Antibiotikums, der Administratiqn und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei
Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nöti genfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verab reicht werden. Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg der neuen Anti biotika neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthal ten.
Als Heilmittel können die neuen Antibiotika allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten
Hilfsstoffen verabreicht werden.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 1:
10 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Saccharose,
10 g Corn steep, 3 g NaNO3, 1 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4 7H2O, 0,5 g KCI und 0,01 g FeSO4 7H2O enthält, werden mit 100 ml Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 angeimpft und in Penicillinflaschen mit je 700 ml Inhalt während 11 Tagen bei 27 inkubiert.
Das aus der Kulturbrühe abgetrennte Mycel wird im Turrax durch Zerschlagen und Umrühren mit 3,5 Liter 900/ciges Methanol extrahiert und das durch Abnutschen vom Lösungsmittel getrennte, zerkleinerte Mycel noch zweimal in gleicher Weise mit 900/obigem Methanol behandelt. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum bei 40 Badtemperatur soweit eingedampft, dass die Flüssigkeit zur Hauptsache nur noch aus Wasser besteht. Das resultierende Gemisch extrahiert man sechsmal mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid durch Ausschütteln, worauf die vereinigten Äthylenchloridlösungen durch Ausschütteln mit Wasser gereinigt und im Vakuum bei 40 Badtemperatur eingedampft werden.
Den so erhaltenen Rückstand chromatographiert man an 250 g Kieselgel (Kieselgel 60 Merck , Korngrösse 0,063 bis 0,200 mm) unter Verwendung von Chloroform mit einem Zusatz von 2% Methanol als Eluierflüssigkeit, die in 200 ml messenden Fraktionen aufgefangen wird. Die im Platten-Diffusionstest gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksamen Fraktionen werden vereinigt, in beschriebener Weise zur Trockene verdampft und nach Lösen in Methanol an 110 g Sephadex LH 20 mit dem gleichen Lösungsmittel chromatographiert, worauf man diejenigen der 20 ml messenden Fraktionen vereinigt, die im gleichen Test wie oben sich gegen Aspergillus niger als antibiotisch aktiv erweisen. Bei der Prüfung im Dünnschichtchromatogramm, z.
B. mittels Kieselgel auf Polygram -Folien und Hexan-Aceton (1:1) als Fliessmittel, zeigt sich, dass der Rückstand der in oben beschriebener Weise eingedampften Methanollösung zur Hauptsache aus den beiden neuen Substanzen S 7481/F-1 und S 7481/F-2 besteht. Sie werden getrennt und gleichzeitig gereinigt, indem man ihr Gemisch unter Verwendung der tausendfachen Menge Kieselgel der oben erwähnten Qualität und von Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind, erneut chromatographiert. Die Prüfung der Eluatfraktionen, deren Volumen in Milliliter halb so gross ist wie das Gewicht des Kieselgels in Gramm, im Dünnschichtchromatogramm ergibt, dass die Substanz S 7481/F-1 zuerst im Eluat erscheint, gefolgt von einem Gemisch der beiden und schliesslich von einheitlichem S 7481/F-2.
Aus dem Gemisch können durch Wiederholung der Chromatographie unter den gleichen Bedingungen weitere Mengen der beiden Substanzen gewonnen werden.
Das neue Antibiotikum S 7481/F-1 hat folgende Eigenschaften:
Amorphes, farbloses Pulver vom Smp. 137-140 (Zers.); [a]r2)0 = -236" (CHCl3, c = 0,5); UV: siehe Fig. 1; JR: siehe Fig. 2; Protonen-NMR: siehe Fig. 3.
Löslichkeit: Leicht löslich in den meisten gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln, praktisch unlöslich in Petroläther und Wasser. Verhalten im Dünnschichtchromatogramm (Substanzflecken sichtbar gemacht mit Joddampf): a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform +4% Methanol als Fliessmittel: Rf = 0,52.
b) Kieselgel auf Folien Polygram ; Hexan/Aceton 1:1 als Fliessmittel: Rf = 0,37; Chloroform/Aceton 2 :1 als Fliessmittel: Rf = 0,34.
Elementaranalyse (Probe in Benzol gelöst, Lösung zur Trockene eingedampft, Rückstand im Hochvakuum 5 Stunden bei 100" getrocknet): Gefunden C 61,8, H 9,4, N 13,0, 0 597ovo.
Die gefundenen Worte stehen in Übereinstimmung mit der Bruttoformel C62Hji1NllOl2.
Im Hydrolysat, das man durch Kochen der Verbindung S 7481/F-1 mit 6 N Salzsäure erhält (20 Stunden), können die Aminosäuren Alanin, a-Aminobuttersäure, N-Methyleucin, N-Methylglycin und Valin nachgewiesen werden.
Das neue Antibiotikum S 7481/F-2 hat folgende Eigenschaften:
Amorphes, farbloses Pulver vom Smp. 127-130 (Zers.); [a]D = -243" (Chloroform, c = 0,5); UV: siehe Fig. 4; IR: siehe Fig. 5; Protonen-NMR: siehe Fig. 6.
Löslichkeit: Leicht löslich m den meisten gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln; praktisch unlöslich in Petroläther und Wasser.
Verhalten im Dünnschichtchromatogramm (Substanzflekken sichtbar gemacht mit Joddampf): a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform + 4% Methanol als Fliessmittel: Rf = 0,46 b) Kieselgel auf Folien Polygram ; Hexan/Aceton 1:1 als Fliessmittel: Rf = 0,28; Chloroform/Aceton 2 :1 als Fliessmittel: Rf = 0,26.
Elementaranalyse (Probe 5 Stunden im Hochvakuum bei 100" getrocknet): Gefunden C 61,7, H 9,1, N 13,1, 0 16,5%.
Die gefundenen Werte stehen in Übereinstimmung mit der Bruttoformel C61H100N11O12.
Die als Ausgangsmaterial zur Beimpfung verwendete Konidien- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 5760 hergestellt, welche 10 Tage auf einem Agarmedium, das pro Liter 20 g Malzextrakt, 20 g Agar, 4 g Hefeextrakt und entmineralisiertes Wasser enthält, gezüchtet wird. Die Konidien und das Mycel werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.
Diese Suspension dient zur Animpfung der oben erwähnten Nährlösung.
Beispiel 2:
250 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Saccharose, 10 g Corn steep, 3 g NaNO3, 1 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4 7H2O, 0,5 g KCI und 0,01 g FeSO4 - 7H2O enthält, werden mit 2,5 Liter Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 angeimpft und in Penicillinflaschen mit je 700 ml Inhalt während 11 Tagen bei 27 inkubiert.
Aus der Kulturbrühe wird das Mycel durch Zentrifugieren abgetrennt und im Ultra-Turrax mit 80 Liter 900/obigem Methanol homogenisiert, darauf die methanolische Extraktlösung durch Zentrifugieren vom Feststoff getrennt und der letztere noch zweimal in gleicher Weise mit 900/obigem Methanol extrahiert. Die vereinigten Extraktlösungen werden im Vakuum bei 30 bis 40 auf 15 Liter konzentriert Die verbleibende wässrige Phase extrahiert man achtmal mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid. Jeder der Äthylenchloridextrakte wird mit 5 Liter Wasser gewaschen. Die Äthylenchloridlösungen werden nach Vereinigung im Vakuum bei 30 bis 40 eingedampft.
Zur Entfettung wird der Extraktrückstand in der Weise zwischen Petroläther und 900/obigem Methanol verteilt, dass er nach Lösen in 2 Liter 90%igem Methanol nacheinander mit dreimal je 2 Liter Petroläther (Siedepunkt 30 bis 35 ), die sich in drei Schütteltrichtern befinden, geschüttelt wird, worauf die drei Petrolätherphasen hintereinanhiert werden. Zu den vereinigten methanolischen Lösungen gibt man 3 Liter Wasser und konzentriert das Gemisch im Vakuum bei 30 bis 40 auf ein Volumen von 2 Liter. Das wäss- rige Konzentrat extrahiert man durch fünfmaliges Ausschütteln mit je 2 Litern Äthylenchlorid: die Äthylenchloridlösungen werden mit je 0,5 Liter Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum bei 30 bis 40 zur Trockene eingedampft.
Den Rückstand unterwirft man der Chromatographie an der 25fachen Menge Sephadex LH20, wobei Methanol als Elutionsmittel dient. Das Eluat wird in 250 ml messenden Fraktionen aufgefangen; diejenigen von ihnen, die sich im Platten Diffusionstest als gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksam erweisen, werden vereinigt und im Vakuum bei 30 bis 40 zur Trockene eingedampft. Anschliessend chromatographiert man den Rückstand an der 70fachen Menge Aluminiumoxyd (neutral) der Aktivitätsstufe 1, wobei zur Elution Gemische von Toluol und Essigester dienen. Mit Toluol, dem 15% Essigester zugesetzt wurden, erscheint in den ersten zehn Fraktionen (Volumen der Fraktionen: halb so viele Liter wie Adsorbens in kg) zuerst die Hauptmenge der Substanz S 7481/F-1, gefolgt von einem Gemisch von S 7481/F-1 und S 7481/F-2.
Einen weiteren Anteil desselben Gemisches gewinnt man, zusammen mit wenig Fremdsubstanz, beim nachfolgenden Eluieren mit Toluol-Essigester (1:1). Der Nachweis der Substanzen in den Eluatfraktionen erfolgt dabei auf dünnschicht-chromatographischem Wege, z. B. mittels Kieselgel auf Polygram -Folien und Hexan-Aceton (1:1) als Fliessmittel. Aus den vereinigten Fraktionen, welche die Substanz S 7481/F-1 in einheitlicher Form enthalten, wird sie durch Eindampfen im Vakuum bei 30 bis 40 und anschliessendes Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum bei 50 gewonnen. Die vereinigten Eluatfraktionen, welche das Gemisch enthalten, werden unter den gleichen Bedingungen ebenfalls eingedampft.
Zur Gewinnung von weiterem S 7481/F-1 und von einheitlichem S 7481/F-2 wird der Rückstand der Chromatographie an der tausendfachen Menge Kieselgel unterworfen, wobei Chloroform, das 2 /o Methanol enthält, als Elutionsmittel verwendet wird, wie dies, so wie das weitere, in Beispiel 1 beschrieben wurde.
The present invention relates to the new antibiotics S 74811F-1 (formula I)
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and S 7481 / F-2 and methods of making these antibiotics.
According to the invention, the new antibiotics S 7481 / F-1 and S 74811F-2 are obtained by cultivating a strain of the fungus genus Cylindrocarpon lucidum on or in a nutrient medium, the new antibiotics S 7481 / F1 and S 7481 / F-2 from the Fermentation broth isolated in a manner known per se by extractive and / or adsorptive working methods and then purified by chromatography or by means of countercurrent distribution.
The new strain of the fungal genus Cylindrocarpon lucidum used according to the invention was isolated from a soil sample found in the state of Wisconsin, USA, and a culture thereof was deposited with the United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, all., USA under the number NRRL 5760 .
The new strain NRRL 5760 of the fungal genus Cylindrocarpon lucidum grows on malt extract agar at temperatures between 18 and 36, preferably at 27 ". The surface of the colonies that have grown is pale brown-yellow, turning honey-colored to brown. The aerial mycelium formed is white and sparse. The reverse shows a pale wine red and the color changes over time into a reddish brown.The strain NRRL 5760 of the mushroom genus Cylindrocarpon lucidum corresponds in its morphology and physiology to the description in CMI Mycological Papers 104, 21 (1966).
The new strain NRRL 5760 can be grown on a variety of nutrient media containing the usual nutrients for fungi. So this strain uses the nutrients commonly used for the carbon heterotrophic organisms, e.g. B. sucrose, glucose, maltose, lactose as the carbon source, organic and inorganic nitrogen-containing compounds such as corn steep, peptone, yeast or meat extracts, sodium nitrate, ammonium nitrate, amino acids, etc.
as a nitrogen source and the usual mineral salts and trace elements.
The new antibiotics S 7481 / F-1 and S 7481 / F-2 can be prepared by inoculating a liquid nutrient medium with a conidia and mycelium suspension of the strain NRRL 5760, and the culture for 9 to 13 days, preferably 11 Days at 27 and a pH of 4.4 to 8.8, preferably at pH 8.1 is incubated. The cultivation can preferably take place under aerobic conditions in a surface culture. As soon as a maximum amount of antibiotics is produced, it is filtered and the antibiotics are obtained from the culture solution in a manner known per se by extractive and / or adsorptive working methods.
One method which has proven to be preferred consists in the extraction of the mycelium, if appropriate after previous mechanical comminution with 900 / cigem methanol, subsequent evaporation of the methanol and repeated extraction of the resulting mixture with ethylene chloride. The ethylene chloride extract obtained from the culture filtrate is added to this extract. However, other organic water-immiscible solvents, such as. B. chloroform, ethyl acetate, methylene chloride or butyl acetate can be used. The organic solution is evaporated and the residue is chromatographed, preferably on silica gel with a chloroform / methanol solution (98: 2), the fractions active against Aspergillus niger being combined and chromatographed again on Sephadex LH-20 with a methanol solution.
The two antibiotics S 7481 / F-1 and S 7481 / F-2 are then separated and purified by repeated chromatography on silica gel.
The new antibiotics S 7481 / F-1 and S 7481 / F-2 are characterized by interesting chemotherapeutic and pharmacological properties and can therefore be used as medicinal products. Both antibiotics inhibit the growth of Aspergillus niger. In particular, however, the two new active ingredients are characterized by an immunosuppressive and anti-inflammatory effect.
The immunosuppressive effect can be shown as follows: a) Local hemolysis in the gel in vitro, Jerne test:
The inhibition of the hemolytic zones in O / o compared to controls is at a dose of 2 x 60 mg / kg i. p. 990/0, at a dose of 1x150 mg / kg p. o. 90% and at a dose of 3x200 mg / kg p. o. 99.5O / o.
b) Hemagglutination test (HAT) on the mouse:
The antibodies formed against sheep cell blood cells are recorded. The inhibition is expressed in the suppressive index (ski), the untreated control being given as 1.00; Sl = 0.3 according to p. o.5x200 mg / kg.
c) Skin graft test in the mouse:
In H-2 histoincompatible mice, the increase in survival time of the skin graft compared to untreated control animals after a dose of 7x200 mg / kg p. o. just significantly extended.
d) Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in rats:
The experimentally induced nerve tissue damage, which paralyzed 8 out of 10 animals in untreated control animals, resulted in the same number of test animals treated with 13x25 mg / kg i. p. have been treated, a 1000 / own protection.
e) Oxazolone test on the mouse:
The decrease in ear swelling is called suppressive
Expressed index (ski); 51 = 0.6 after 6x75 mg / kg p. O.
Due to their immunosuppressive effect, the compounds can be used for the prophylaxis and treatment of
Diseases that are related to influencing the defense reaction in a negative sense are used.
The new antibiotics also have an arthritis-inhibiting effect. So they work z. B. in the Freund adjuvant arthritis latency test on rats in doses of about 50 mg / kg body weight strongly antiperspirant.
Due to their arthritis-inhibiting effect, antibiotics can be used for the prophylaxis and treatment of arthritis and rheumatic diseases.
The doses to be used naturally vary depending on the type of antibiotic, the administration and the condition to be treated. In general, however,
Test animals achieved satisfactory results with a dose of 10 to 200 mg / kg body weight. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 parts or as a sustained release form. For larger mammals, the daily dose is around 50 to 900 mg. For oral applications, the partial doses can contain, for example, around 25 to 300 mg of the new antibiotics in addition to solid and liquid carrier substances.
As a remedy, the new antibiotics can be used alone or in a suitable drug form with pharmacologically indifferent ones
Adjuvants are administered.
In the following examples, which explain the invention in more detail, all temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1:
10 liters of a nutrient solution containing 30 g of sucrose per liter
10 g corn steep, 3 g NaNO3, 1 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4 7H2O, 0.5 g KCI and 0.01 g FeSO4 7H2O are inoculated with 100 ml conidia and mycelium suspension of the NRRL 5760 strain and placed in penicillin bottles each with 700 ml contents incubated for 11 days at 27.
The mycelium separated from the culture broth is extracted in the Turrax by smashing and stirring with 3.5 liters of 900 / ciges methanol and the comminuted mycelium separated by suction from the solvent is treated twice in the same way with 900 / above methanol. The combined filtrates are evaporated in vacuo at a bath temperature to such an extent that the liquid mainly consists only of water. The resulting mixture is extracted six times with the same volume of ethylene chloride by shaking, whereupon the combined ethylene chloride solutions are purified by shaking with water and evaporated in vacuo at a bath temperature.
The residue obtained in this way is chromatographed on 250 g of silica gel (Kieselgel 60 Merck, particle size 0.063 to 0.200 mm) using chloroform with an addition of 2% methanol as the eluting liquid, which is collected in fractions measuring 200 ml. The fractions that are antibiotically active in the plate diffusion test against Aspergillus niger are combined, evaporated to dryness in the manner described and, after dissolving in methanol, chromatographed on 110 g of Sephadex LH 20 with the same solvent, whereupon those of the 20 ml-measuring fractions are combined which are the same Test as above prove to be antibiotic active against Aspergillus niger. When testing in the thin layer chromatogram, e.g.
B. using silica gel on Polygram films and hexane-acetone (1: 1) as the flow agent, it is shown that the residue of the methanol solution evaporated in the manner described above mainly consists of the two new substances S 7481 / F-1 and S 7481 / F-2 exists. They are separated and purified at the same time by re-chromatographing their mixture using a thousand times the amount of silica gel of the quality mentioned above and chloroform to which 2% methanol has been added. Examination of the eluate fractions, whose volume in milliliters is half the weight of the silica gel in grams, in the thin layer chromatogram shows that the substance S 7481 / F-1 appears first in the eluate, followed by a mixture of the two and finally by a uniform S. 7481 / F-2.
Further quantities of the two substances can be obtained from the mixture by repeating the chromatography under the same conditions.
The new antibiotic S 7481 / F-1 has the following properties:
Amorphous, colorless powder of m.p. 137-140 (decomp.); [a] r2) 0 = -236 "(CHCl3, c = 0.5); UV: see Fig. 1; JR: see Fig. 2; proton NMR: see Fig. 3.
Solubility: Easily soluble in most common organic solvents, practically insoluble in petroleum ether and water. Behavior in the thin-layer chromatogram (substance spots made visible with iodine vapor): a) silica gel on glass plates; Chloroform + 4% methanol as eluent: Rf = 0.52.
b) silica gel on polygram foils; Hexane / acetone 1: 1 as eluent: Rf = 0.37; Chloroform / acetone 2: 1 as eluent: Rf = 0.34.
Elemental analysis (sample dissolved in benzene, solution evaporated to dryness, residue dried in a high vacuum for 5 hours at 100 "): Found C 61.8, H 9.4, N 13.0, 0 597ovo.
The words found correspond to the gross formula C62Hji1NllOl2.
In the hydrolyzate, which is obtained by boiling the compound S 7481 / F-1 with 6N hydrochloric acid (20 hours), the amino acids alanine, α-aminobutyric acid, N-methyleucine, N-methylglycine and valine can be detected.
The new antibiotic S 7481 / F-2 has the following properties:
Amorphous, colorless powder of m.p. 127-130 (decomp.); [a] D = -243 "(chloroform, c = 0.5); UV: see Fig. 4; IR: see Fig. 5; proton NMR: see Fig. 6.
Solubility: Easily soluble in most common organic solvents; practically insoluble in petroleum ether and water.
Behavior in thin-layer chromatogram (substance spots made visible with iodine vapor): a) silica gel on glass plates; Chloroform + 4% methanol as eluent: Rf = 0.46 b) silica gel on polygram foils; Hexane / acetone 1: 1 as eluent: Rf = 0.28; Chloroform / acetone 2: 1 as eluent: Rf = 0.26.
Elemental analysis (sample dried for 5 hours in a high vacuum at 100 "): found C 61.7, H 9.1, N 13.1, 0 16.5%.
The values found are in accordance with the gross formula C61H100N11O12.
The conidia and mycelium suspension used as starting material for inoculation is produced from a culture of the originally isolated strain NRRL 5760, which is grown for 10 days on an agar medium containing 20 g of malt extract, 20 g of agar, 4 g of yeast extract and demineralized water per liter . The conidia and mycelium are absorbed in physiological saline solution.
This suspension is used to inoculate the above-mentioned nutrient solution.
Example 2:
250 liters of a nutrient solution containing 30 g sucrose, 10 g corn steep, 3 g NaNO3, 1 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4 7H2O, 0.5 g KCI and 0.01 g FeSO4 - 7H2O per liter are mixed with 2 , 5 liter conidia and mycelium suspension of the strain NRRL 5760 inoculated and incubated in penicillin bottles with 700 ml content for 11 days at 27.
The mycelium is separated from the culture broth by centrifugation and homogenized in the Ultra-Turrax with 80 liters of 900 / above methanol, then the methanolic extract solution is separated from the solid by centrifugation and the latter is extracted twice in the same way with 900 / above methanol. The combined extract solutions are concentrated in vacuo at 30 to 40 to 15 liters. The remaining aqueous phase is extracted eight times with the same volume of ethylene chloride. Each of the ethylene chloride extracts is washed with 5 liters of water. The ethylene chloride solutions are evaporated at 30 to 40 in vacuo after being combined.
For degreasing, the extract residue is distributed between petroleum ether and 900 / above methanol in such a way that, after dissolving it in 2 liters of 90% methanol, it is shaken three times with 2 liters of petroleum ether (boiling point 30 to 35), which are in three shaking funnels becomes, whereupon the three petroleum ether phases are sequenced. 3 liters of water are added to the combined methanolic solutions and the mixture is concentrated in vacuo at 30 to 40 to a volume of 2 liters. The aqueous concentrate is extracted by shaking out five times with 2 liters of ethylene chloride each time: the ethylene chloride solutions are washed with 0.5 liters of water each, combined and evaporated to dryness in vacuo at 30 to 40 times.
The residue is subjected to chromatography on 25 times the amount of Sephadex LH20, methanol serving as the eluent. The eluate is collected in fractions measuring 250 ml; those of them which in the plate diffusion test prove to have antibiotic activity against Aspergillus niger are combined and evaporated to dryness in a vacuum at 30 to 40. The residue is then chromatographed on 70 times the amount of aluminum oxide (neutral) of activity level 1, mixtures of toluene and ethyl acetate being used for the elution. With toluene, to which 15% ethyl acetate has been added, the first ten fractions (volume of the fractions: half as many liters as adsorbent in kg) appear first the main amount of the substance S 7481 / F-1, followed by a mixture of S 7481 / F-1 and S 7481 / F-2.
Another portion of the same mixture is obtained, together with a little foreign substance, during the subsequent elution with toluene / ethyl acetate (1: 1). The substances in the eluate fractions are detected by thin-layer chromatography, e.g. B. using silica gel on Polygram films and hexane-acetone (1: 1) as a flow agent. From the combined fractions, which contain the substance S 7481 / F-1 in a uniform form, it is obtained by evaporation in vacuo at 30 to 40 and subsequent drying of the residue in a high vacuum at 50. The combined eluate fractions containing the mixture are also evaporated under the same conditions.
To obtain further S 7481 / F-1 and uniform S 7481 / F-2, the residue is subjected to chromatography on a thousandfold amount of silica gel, chloroform containing 2 / o methanol being used as the eluent, as described above as described further in Example 1.