Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches der Antibiotika Verdamicin I, Sisomicin, G418 und Gentamicin A oder der einzelnen Komponenten dieser Mischung bzw. Säureadditionssalzen solcher Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der imstande ist das oben definierte Gemisch zu pro.
duzieren, kultiviert, dass Gemisch isoliert und gewünschtenfalls in seine einzelnen Komponenten zerlegt und dass man das so erhaltene Gemisch beziehungsweise die einzelnen Komponenten in Säureadditionssalze überführt.
Für das erfindungsgemässe Verfahren eignen sich Mi- kroorganismen der Gattung Micromonospora, insbesondere solche der Art Micromonospora grisea.
Der Microorganismus Micromonospora grisea (im weiteren manchmal als M. grisea bezeichnet) wurde aus Erdproben aus der Nähe von Topeka, Kansas, erhalten. Der Mikroorganismus wurde beim United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Divison, Peoria, lllinois, wo Subkulturen erhältlich sind, hinterlegt, und erhielt die Bezeichnung NRRL 3800.
Micromonospora grisea wurde auf Grund seiner taxonomischen und Wachstums-Eigenschaften auf einer Anzahl von Standardmedien als eine neue Gattung der Micromonospora klassifiziert. Micromonospora grisea bildet beim Kultivieren auf verschiedenen Medien, z. B. dem unten angeführten Kennzeichnungs-Medium ein grau-grünes Pigment. Das unterscheidungskräftigste Kennzeichen des Micromonospora grisea ist seine Fähigkeit, unter kontrollierten Bedingungen ein antibiotisch wirksames Produkt zu bilden, welches aus vier, im folgenden näher erläuterten Hauptkomponenten und kleineren Mengen anderer Substanzen, die noch zu identifizieren sind, besteht.
Kennzeichnungs medium Difco Hefe O,501o Sucrose 3,0% Kalziumkarbonat 0,1 01o Difco Agar 1,5 /o Wasser (destilliert) 1,0 Liter
Wenn das sterilisierte Medium mit Micromonospora grisea beimpft und bei 26 bis 28 C für 24 Tage bebrütet wird, werden folgende Farbentwicklungen beobachtet: Sporulationsbereich: schiefergrün g231i,graugrün 150 bei längerer Bebrütung kann der Sporulationsbereich schwarz werden.
Vegetativ-Bereich: leicht getönt g3gc, leicht gelblich braun 76.
Micromonospora grisea kann weiters durch die folgenden tazonomischen Daten gekennzeichnet werden:
Medium 3% NZ Amin Type A, 1% Dextrose
1,5% Agar
Beobachtungen (21 Tage nach Beimpfung) Makroskopisch Mikroskopisch Wachstum mittelmässig, gefaltet; Mycel lang, spärlich verzweigt, Peripherie: leicht getönt 0,5-0,8 t in Durchmesser.
g3gc, leicht gelblich braun 76 Sporen verhältnismässig reichlich Zentrum: biberfarben g31i, einzeln gebildet, erscheinen dunkel graugelbbraun 81. braun färbig bei einfallendem
Licht, 1,0-1,5 im Durchmesser scheinen rauhwandig zu sein.
Micromonospora grisea reduziert Nitrat nicht, wächst gut auf Gelatin unter Hydrolyse und wächst in 1,59/o Natriumchlorid enthaltenden Medien, wächst aber nicht in ähnlichen Medien, die 3% Natriumchlorid enthalten.
Micromonospora grisen braucht für gutes Wachstum und antibiotische Ploduktion assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen. Eine llielzahi solcher Quellen kann ver vendet werden.
Dieser Mikroorganismus ist neror und wächs. bei s empe- raturen von 20' bis 40 OC. vorzuC.sweise 280 bis 35 ? i/ bei pH-Werten von 6,5 bis ,5 vorzugs--.veise 7.2 bis Ö,.
Zusätzlich zu den vo en2n.l,en ta:'.onomischen Daten.
wird der M. grisea in den Tabellen 1, ?o und Ili weiter gekenn- zeichnet:
Tabelle I
Beobachtungen von Kolonien des Micromonospora grisea auf verschiedenen Medien Medium Beobachtung Czapeks Medium Wachstum: schlecht, nicht (Glucose) beschreibbar Asparagin-Glucose Vachstum: mitteimässig bis Medium schlecht, körnig, heilbraun g31g, mässig gelblich braun
77 Kalziummalat .Agar Wachstum: schlecht, nicht beschreibbar WGewöhnliches Agar Wachstum:
schlecht nicht (Wasser Agar) eschreibbnr Medium Beobachtung Nähr-Agar Wachstum: schlecht, nicht beschreibbar Loefflers Serum Wachstum: schlecht, keine Medium (Difco) Reaktion
Kartoffel Wachstum: gut, gefaltet, leicht getönt g3gc, hell gelblich braun 76
Pepton-Glucose Wachstum: schlecht, nicht Agar beschreibbar
Ei-Agar Wachstum: schlecht, keine (Dorset Egg Reaktion
Medium Difco) Stärke Wachstum: gut, gefaltet Agar gerillt, kein Luftmycel
Farbe: senfbraun g21s11, mässig olivegrün 107
Hydrolyse:
positiv Laclcmus Teilweise peptonisiert mit Milch (Difco) Säure-Reaktion Zellulose Zersetzung sehr langsam,
Medium braucht 3-6 Monate oder länger
Bennetts Agar Wachstum: gut, gefaltet, g24ml efeufarben, dunkel graugrün 151 Emersons Agar Wachstum: mittelmässig, flach, g3gc leicht getönt, hell gelb lich braun 76 Tomatenmark Wachstum: mittelmässig, erhöht, gerillt, g4ga marillenfarbig, hell orange 52 Glukose Hefe- Wachstum: gut, gefaltet, g31 E extrakt Agar kamelfarbig, mässig gelblich braun 77 Kartoffelscheibe Wachstum: gut, gefaltet, leicht getönt g3ge, hell gelblich braun 76
Sucrose Wachstum: mittelmässig, flach,
Nitrat Agar g3ec hellbeige, hell grau (Czapelts Agar) gelblich braun 79
Tyrosin Agar Wachstum:
schlecht, keine Beobachtungen nach 2,7 Farbreaktion und 14 Tagen (nach Gordon und Smith, 1. Bact. 54 :147)
Pepton- Wachstum: mittelmässig, Eisen-Agar keine Farbreaktion Eeobachtungen neen 2,7 und 14 Tagen
Glucose-Asparagin- Wachstum: mittelmässig bis Agar schlecht, körnig, g31g hell braun, mittleres gelblich braun 77
Milch Hydrolyse: positiv, Wachstum: schlecht Czapek-Glucose Wachstum nach 3 und 10 Tagen
Lösung schlecht;
Maserung nicht beobachtbar; eine klasse
Strohfarbe in dem Brei nach
10 Tagen Bebrütung vorhanden
Tabelle II
Verwendung von Kohlenhydraten
Kohlehydrat Wachstum
L (+) Arabinose gut
D (- Arabinose gut
D (+) Glucose gut
D (-) Lävulose gut
D (+) Mannose gut
Sucrose gut
D (+) Xylose gut
Stärke gut
Dulcit schlecht
D (+) Galaktose schlecht
Glycerin schlecht i-Inosit schlecht ss-Laktose schlecht
D (+) Mannit schlecht a-D (+) Melibiose schlecht
D (+) Melizitose schlecht
D (+) Raffinose schlecht
L (+) Rhamnose schlecht
Salicin
Zur Kontrolle:
: O,501o Hefeschlecht
Extrakt
Tabelle III
Verwendung von Stickstoffquellen
Stickstoff-Quelle Wachstums ( + 1% Glukose) Beobachtungen O,501o Dico
Hefe Extrakt gut
1,0% NZ Amin
Type A gut
1% Asparagin schlecht
1% Glutaminsäure schlecht
1% 01o Natriumnitrat schlecht
1% Ammoniumnitrat Schlecht
In Tabelle IV sind M. grisea and M.rhodorangea mit anderen Micromonospora, welche
Antibiotika produzieren, verglichen:
Tabelle IV
Vergleich von Micromonospora grisea mit anderen Micromonospora
M. purpurea M. echinospora M. carbonacea M. carbonacea M. megalomicea M. grisea (NRRL 2953) (NRRL 2985) var. carbonacea var. aurantiaca (NRRL 3274 & (NRRL 3800) (NRRL 2972) (NRRL 2997) 3275) Sporenträger ja ja ja Ja ja ja lang Sporenträger ja* ja ja ja Ja ja verzweigt Sporenträger ja* ja ja ja ja ja kurz Wachstum auf mittelmässig mittelmässig mittelmässig mittelmässig schlecht schlecht Nähr-Agar bis schlecht bis schlecht bis schlecht bis schlecht Wachstum auf schlecht schlecht mittelmässig mittelmässig nein gut Kartoffel Gelatine schwach schwach ja ja nein ja Verflüssigung Stärke ja ja ja ja ja ja Hydrolyse Sucrose ja ja ja ja ja ja Umwandlung Zellulose im schwachen im schwachen im schwachen im schwachen nein langsam Zersetzung Ausmass ange- Ausmass ange- Ausmass ange- Ausmass ange
griffen griffen griffen griffen Antagonisten Gentamicin Gentamicin Everninomicin Everninomicin Megalomicin Antibioticum G418
Verdamicin 1,
Sisomicin
Gentamicin A
Die Fermentation des Micromonospora grisea wird unter Anwendung von Standardverfahren zur Herstellung von Antibiotika durch Kultivierung von Mikroorganismen durchgeführt.
Wesentliche Mengen an Antibiotika werden erzeugt, wenn die betreffenden Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium welches assimilierbare Kohlenstoff- und Sticlc- stoffquellen enthält, unter aeroben, vorzugsweise submersen aeroben Bedingungen, Icultiviert werden. Beispiele assimilierbarer I(ohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie jene in den Tabellen 11 und V angegebene, insbesondere Glukose, Xy- lose und Mannose. Beispiele assimilierbarer Stickstoffquellen sind Proteine und Aminosäuren, und diese enthaltende Substanzen, wie z. B. Rindfleischextrakt, Hefeextrakt und Sojabohnenmehl. Gutes Wachstum und Antibiotikumbildung werden erhalten, wenn die in den folgenden Beispielen 1 und 5 bis 7 angeführten Fermentationsverfahren angewendet werden. Die Medien können mit Spurenmengen anorganischer Salze, wie z. B.
Magnesiumsulfat, Eisensulfat und insbesondere Kobaltchlorid, ergänzt werden, um die Antibiotilcumbil- dung zu erhöhen.
Die Fermentation wird gewöhnlich in zwei oder drei Stufen durchgeführt, wobei die erste Stufe oder die ersten zwei Stufen der Keimung des Mikroorganismus gewidmet sind, um ein geeignetes Inokulum zu erzeugen. In der Regel erfordern grosse (Tank)Fermentationen zwei Keimungsstufen, während Schüttelflaschen-Fermentationen nur eine Keimungsstufe erfordern. Die Keimungsstufen werden unter aeroben Bedingungen unter Schütteln, vorzugsweise Dreh Schüttel bei z. B. 250 bis 400 Umdrehungen pro Minute, gewöhnlich bei einer Temperatur im Bereich von etwa 25 bis 35 OC für 1 bis 4 Tage durchgeführt. Die letzte Fermentationsstufe (Produktionsstufe) wird durch Beimpfung eines geeigneten Mediums mit dem vorher bereiteten Inokulum unter sterilen Bedingungen eingeleitet.
Die Produktionsstufe der Fermentation wird gewöhnlich im selben Temperaturbereich wie die Keimungsstufe durchgeführt. Weiteres braucht sie gewöhnlich etwa 4 bis etwa 7 Tage, um Spitzenwirksamkeit zu erreichen. Zum Unterschied von der Keimungsstufe, bei der der pH-Wert gewöhnlich stabil bleibt, erfordert die Produktionsstufe eine Regulierung des pH-Wertes auf einen Bereich von etwa 7,2 bis etwa 8,3.
Im Laufe der Fermentation, insbesondere nach den ersten 24 Stunden, wird die Fermentation, in geeigneten Zeitabständen (z. B. alle 6 bis 8 Stunden) überprüft, um festzustellen, wann die Spitze der antibiotischen Aktivität erreicht ist.
Die Prüfung ist vorzugsweise eine Standard-Scheiben-Platten-Probe unter Verwendung eines Standard-Mediums und Test-Organismus. Einzelheiten bevorzugter Proben werden in einem späteren Abschnitt der Beschreibung gegeben.
Wenn die Spitze der antibiotischen Aktivität erreicht ist, wird das Produkt gewonnen, im allgemeinen durch eine Kombination von Stufen, wie Ansäuern, Filtration, Adsorption, Elution und Eindampfen, z. B. Lyophilisation. In einem bevorzugten Isolierverfahren werden vorhandene Kalziumionen als ein unlösliches Salz ausgefällt, die ganze Brühe angesäuert, vorzugsweise mit einer Mineralsäure, und das Fermentationsgemisch durch Filtration oder Zentrifugiren geklärt.
Nach dem Neutralisieren wird das anitbiotische Produkt auf ein geeignetes Kationen-Austausch-Harz adsorbiert, z. B. ein schwach saures lonen-Austausch-Harz in der Ammoniumform, mit verdünntem Alkali, vorzugsweise Ammoniumhydroxyd, eluiert und durch Eindampfen, z. B. durch Lyophilisation, isoliert.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensweise werden zirka 5 bis 8 gll der Fermentation 0,calsäure zu der ganzen Brühe hinzugefügt, um Kalzium als das unlösliche Oxalat auszufällen, und der pH-Wert der Fermentation wird mit star ker Mineralsäure, z. B. 6n Schwefelsäure, auf 2,0 eingestellt, um die Antibiotika aus dem Mycel freizusetzen. Nach dem
Filtrieren wird die geklärte Brühe mit Ammonium hydroxyd neutralisiert, die Antibiotika werden auf Amberlite IRC-50
NH4 20-50 Mesh Ionen-Austausch-Harz (Rohm und Haas,
Philadelphia, Pennsylvania) adsorbiert und die verbrauchte (extrahierte) Brühe wird weggeleert.
Die antibiotische Zusam mensetzung wird von dem Harz mit einer Base, vorzugs weise 2n Ammoniumhydroxyd, eluiert und das Eluat wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und zur Trok szene eingedampft, z. B. durch Lyophilisation.
Die Feststellung der Antibiotika und Bestimmung der Ho mogenität der Fraktionen bei der Kultivierung von Micromonospora grisea wird mittels Papierchromatographie durchgeführt und wird durch zwei Verfahren erreicht:
1) durch die Verwendung von Reagenzien und
2) durch ein Microbial-Verfahren. Das erste Verfahren wird durchgeführt, indem Papierchromatogramme mit 0,25% Ninhydrin im Pyridin-Azeton besprüht und daraufhin auf 105 "C für mehrere Minuten erhitzt werden. Die Zonen erscheinen gegen einen weissen Hintergrund als farbige Flekken.
Microbiale Feststellung der antibiotischen Zonen wird durchgeführt, indem man das Papier auf eine mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P besäte Agarplatte legt. Nach 10 Minuten wird das Papier entfernt und nach einer geeigneten Inkubationsperiode (gewöhnlich 16 bis 18 Stunden) werden Inhibitionszonen beobachtet, die die Antibiotika darstellen.
Diese und ähnliche Teste zeigen, dass das mittels des oben beschriebenen Fermentationsverfahrens erhaltene antibiotische Produkt aus einer Mehrzahl von Komponenten besteht.
Vier der Komponenten scheinen den Hauptanteil des Produktes darzustellen; diese werden im folgenden als die vier Hauptkomponenten bezeichnet.
Die Trennung dieser Komponenten kann mittels einer Anzahl von bekannten Techniken erreicht werden, wie z. B. Ge genstrom-E:ctraktion oder Chromatographie auf Ionen-Austausch-Harzen oder auf anderen festen Adsorbenten, wie z. B. Silicagel, Chromosorb und Zellulose. Die Silicagel-Chromatographie wird bevorzugt. Die ersten zwei der vier Haupt komponenten werden mit der niederen Phase einer Lösungsmittel-Mischung bestehend aus Chloroform, Isopropanol und konz. Ammoniumhydroxyd (2 :1:1 v/v) eluiert; die Elution wird mit der niederen Phase einer 1:1:1-Mischung derselben Lösungsmittel fortgesetzt bis die Desorption der verbleibenden Antibiotika vollständig ist.
Aufgrund verschiedener physikalischer, chemischer und biologischer Daten kann gezeigt werden, dass die vier Haupt komponenten folgende sind:
1. Verdamicin I; ein bisher unbekanntes Antibiotikum.
2. Sisomicin; die biologischen Eigenschaften des Sisomycin sind im Journal of Antibiotics, Band XXIII Nr. 11, Seiten 551-565 beschrieben. Die Herstellung und Eigenschaften des Antibiotikums sind in der belgischen Patentschrift Nr.
735 145 beschrieben.
3. Antibiotikum G-410; ebenfalls ein bisher unbekanntes Antibiotikum.
4. Gentamycin A; die antibakteriellen Eigenschaften des Gentamycin A wurden von Weinstein et al in Antimicrobial Agents und Chemotherapy, 1965, Seiten 816-820 festgehalten, und seine Struktur wurde von Maehr und Schaffner im Journal of the American Chemical Society, 89 : 25, 6. Dezember 1967, veröffentlicht
Das Verhalten dieser vier Hauptkomponenten bei der Pa pier-Chrematographie wird in Tabelle V dargelegt.
Zusätzlich zu den vier Hauptkomponenten ist manchmal die Anwesenheit anderer antibalçterieller Materialien feststellbar. Diese Materialien werden jedoch in solch geringen Men- gen gebildet, dass ihre Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung noch nicht erfolgreich durchgeführt wurden. Beispielsweise wurde ein roher, im wesentlichen alle bei der Fermentation erzeugten Antibiotika enthaltender Extrakt im Volumen auf ein sirupartiges Konzentrat eingeengt. Das Konzentrat wurde dann einer fallenden Chromatographie auf Chromar 500 für etwa 1 Stunde unter Verwendung eines Systems bestehend aus Chloroform, Methanol und konz. Ammoniumhydroxyd (1 :1 :1 v/v) unterworfen.
Als das Chromatogramm gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538P bioautographier wurde, waren kleine Mengen von drei zusätzlichen Fermentationsprodukten schwach feststellbar. Diese Produkte hatten die folgenden RfWerte (so genau wie dies bestimmt werden konnte): 0,41, 0,30 und 0,12.
Tabelle V
Vergleiche von Rr und R,-Werten
Rf der Antibiotika
Papier Verda- Siso- Anti- Genta
Chromatographische micin micin bioti- micin
Systeme I kum A G418
Chloroform: 0,65 0,58 0,41 0,18 Methanol: konz. Ammonium hydroxyd (1:1:1) auf Chromar 500
Blatt, ansteigend
Rt der Antibiotika t=6 Stunden Chloroform: 0,40 0,21 0,05 Methanol: 17% Ammonium hydroxyd 2:1:1 auf Whatman Nr. 1 Papier fallend
Rt der Antibiotika t=16 Stunden 2 Butanon: 0,44 0,36 0,27 tert-Butanol: Methanol: konz.
Ammoniumhydroxyd 16:3:1:6 auf Whatman Nr. 1 Papier, fallend
Rt = Entfernung der Zone vom Ursprung
Entfernung vom Ursprung zum Ende des Papieres zur Zeit t Aus den folgenden physiochemischen Daten und dem chemischen Abbau wird angenommen, dass das Antibiotikum G418 die in der untenstehenden Formel I gezeigte Struktur hat Aus der genannten Strukturformel können jedoch keine Schlüsse bezüglich Stereochemie gezogen werden:
EMI5.1
Wenn das im wesentlichen reine Antibiotikum G-418 einem chromatographischen Standard-Verfahren unterworfen wird, zeigt es folgendes Schema: Rt (16 Stdn) Rf Rt(16Stdn) I. Chloroform-Methanol-konz. Ammoniak 0,40 auf Chromar 500 (aufsteigend) II. 2-Butanon-tert.-Butanol- 0,24
Methanol-konz. Ammoniak (fallend) III. 80% wässeriges Phenol (aufsteigend) 0,32 IV. Methanol-Wasser, +3% NaCl (fallend) 0,64 V.
Propanol-Pyridin-Essigsäure- 0,51
Wasser (aufsteigend) Rt = Entfernung der Zone vom Ursprung
Entfernung vom Ursprung zum Ende des
Papiers bei Zeit t
Antibiotikum G418 ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum und gehört daher zur Klasse, welche Gentamicin, Neomycin, Paromoycin, Sisomicin und Kanamycin umfasst. Es wird gewöhnlich in Form eines amorphen weissen Feststoffes mit folgenden physikalischen Konstanten isoliert; Schmelzpunkt 138 bis 144 C; Drehung: + 140 0C :e 9" (c=0,3, H2O); Moleku largewicht (Massenspektrometrie) = 497; Summenformel: C20H40OioN4 (Base): C20H40O10N42H2SO4 (Sulfat).
N.M.R-Spektrum: Im wesentlichen wie in Fig. 4 der angeschlossenen Zeichnungen gezeigt, welches aus einer Lösung erhalten wurde, die 15% des Antibiotikums G418 in Deuterium-Methanol enthält mit 3% Tetramethylsilan, welches als Standard zugesetzt wurde.
I.R.-Spektrum: In einem Nujolmull, im wesentlichen wie in Fig. 3 der angeschlossenen Zeichnungen gezeigt, welches die folgenden kennzeichnenden Absorptionsbänder hat: 3,02 , (S) 9,07 lt (S) 11,86 u (W) 6,32 lt (M) 9,49 lt (S) 13,05 u (W) 7,76 lt (W) 9,77 lt (S) 13,87 lt (W) 8,70 lt (M) 10,42 lt (M) (S) = Stark, (M) = Mittel, (W) = Schwach
Wie bereits erwähnt, deutet die physikalisch-chemische Analyse des Verdamicin I darauf hin, dass es sich um eine neue Substanz handelt;
es ist strukturell jedoch mit Gentamicin C2 ver vandt. Die Hydrolyse dieser beiden Antibiotika mit 6n Chlorwasserstoffsäure bei 100 "C für 2 Stunden und anschliessende Papierchromatographie in einem Lösungsmittelsystem bestehend aus entweder (1) n-Butanol:Pyridin:Was ser:Essigsäure im Verhältnis 6 :4:3 1 v/v oder (2) Propanol:- Pyridin:Wasser:Essigsäure im Verhältnis 6 :4 :3: 1 v/v, sowie Besprühung der Chromatogramme mit Ninhydrin, zeigt eindeutig, dass Gentamicin C2 und Verdamicin I unterschiedliche Hydrolyseprodukte liefern. In beiden Systemen deuten die Chromatogramme auf die Anwesenheit von zwei gemeinsamen Produkten; eines davon ist 2-Deoxystreptamin.
Das verbleibende Hydrolyseprodukt von Verdamicin list jedoch anders als das entsprechende von Gentamicin C2.
Aufgrund der unten angeführten physikalischen und chemischen Daten und nach Analyse seiner Hydrolyseprodukte wird angenommen, dass Verdamicin I die folgende strukturelle Formel ohne stereochemische Festsetzung hat:
EMI6.1
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des
Verdamicin I sind in Tabelle VI angeführt:
:
Tabelle VI
Chemische und physikalische Eigenschaften des
Verdamicin I
Base Sulfat Elementar- Durchschnitt Durchschnitt Durchschnitt Durchschnitt analyse von 2 von 2 von 2 von 2 C 47,98 48,04 31,10 30,95 H 8,13 8,22 6,61 6,60 N 13,43 13,28 8,99 8,69 O (durch 30,45 30,47 Diff.) SO4 - - 29,30 Drehung +155,7 +167,1 +96,50 +99,4 (Wasser) c=0,3 c=0,3 c=0,3 c=0,3 Äquivalent- 108,5 104,9 gewicht pKa 8,1 8,1 Summenformel C20H39O7N5 Analysen übereinstimmend mit C20H3907N5 - 3H2O
Verdamicin I bildet gern Solvate und Hydrate, von welchen es schwer ist das ungelöste oder das wasserfreie Antibiotikum zu erhalten.
Dementsprechend stimmt die Elementaranalyse gemäss Tabelle VI in vorbildlicher Weise mit dem Antibiotikum als Trihydrat (d. h. C20H39O7N5 3H2O) überein.
Verdamicin I zeigt keine Absorption im Ultra-Violett-Bereich von 220-400 lt. Weiterhin ist es stabil gegen Kochen für wenigstens dreissig (30) Minuten in 0,1 molaren Puffern im pH-Bereich von 2-10.
Verdamicin 1 (freie Base) hat ein charakteristisches kernmagnetisches Resonanzspektrum (NMR), wie dies in Fig. 2 der angeschlossenen Zeichnungen gezeigt ist. Das NMR Spektrum wurde unter Verwendung eines Varian A-60-A Spektrometers (Varian Associates, 611 Hanson Way, Palo Alto, Kalifornien) mit einer Lösung von etwa 0,31 ml, die etwa 22 mg Antibiotikum in einer Deutorium-oxyd (D2OSDi- methylsulfoxyd (DMSO) Mischung enthielt, erhalten. Das Spektrum ist aufgezeichnet in Teilen/Million (PPM) von 3ATrimethylsilyl)-propansulfonsäure- Natriumsalz, dem inneren Standard.
Verdamicin I-Sulfat hat ein charakteristisches infrarotes Absorption Spektrum in Mineralöl (Nujol), wie dies in Fig. 1 der angeschlossenen Zeichnungen gezeigt ist. Die charakteristischeren Absorptionsbänder sind in der folgenden Tabelle XII aufgezeigt.
Tabelle VII
Charakteristische Infrarot-Absorptionsbänder
Verdamicin I-Sulfat 2,9-3,8 lt (VS,V brd.) 7,25 lt (Nujol) 3,38-3,52 lt (Nujol) 7,25 lt (W-M) 4,25 lt (Shd.) 8,6-9,6 lt (VS,V brd.) 4,S0 lt (W, brd.) 10,30 11 (W-M) 5,93 lt (Shd.) 10,92 lt (Shd.) 6,16 (MS) 11,42 ,u (W) 6,50 lt (MS) 12,10 lt (VW, brd.) 6,83 lt (Nujol) 12,75 lt (VW, brd.) Abkürzungen: brd. = breit; M = Mittel; Shd. = Schulter; S stark; V = sehr; W = schwach.
Weitere chemische und physikalische Eigenschaften der Antibiotika Verdamicin I und G-418 sind in den folgenden Tabellen VIII und IX angegeben:
Tabelle VIII
Antibiotische Klassifikationsteste
Ninhydrin Sakaguchi Hypochlorit Elson Mor
Spray Reagenz Stärke KI gan Test Verdamicin I Positiv Negativ Positiv Negativ Sulfat Antibiotikum Positiv Negativ Positiv Negativ G418 Sulfat
Tabelle IX
Löslichkeit (Terminologie entsprechend U.S.Pharmacopeia XVIII, Seite 8) Lösungs- Verdamicin I Verdamicin I Antibiotikum Antibiotimittel Sulfat G418 kum G-418
Sulfat Methanol wenig unlöslich wenig unlöslich löslich löslich Chloro- wenig sehr wenig sehr wenig sehr wenig form löslich löslich löslich löslich Benzol sehr wenig unlöslich unlöslich unlöslich löslich
Die mikrobiologische Probe des Antibiotikums G-418 ist eine <RTI
ID=7.21> Standard-Scheiben-Platten-Probe unter Verwendung von Difco Antibiotikum Medium Nr. 5 und Bacillus subtilis A.T.C.C. 6633 als Testorganismus. Die physikalischen Bedingungen des Tests sind im wesentlichen die von Grove und Randall für Neomycin in Assay Methods of Antibiotics beschriebenen, veröffentlicht von Medical Encyclopedia Incorporated (1955). Die Probe wurde gegen eine Standard-Präparation von Antibiotikum G-418 mit einer bestimm- ten Potenz von 1000 mcg!mg durchgeführt. Ein Milcro- gramm des Standards ergibt eine Inhibitionszone von 16,511.5 mm im Test.
Das Standard-Antibiotikum-Sulfat-Salz ergibt etwa 750 mcg/mg gegen die Standard-Antibiotilsum-Base.
Die mikrobiologische Probe von Verdamicin 1 und anderen mittels M. grisea hergestellten Antibiotika ist eine Scheiben Platten-Probe, wobei Staphylococcus aureus ATCC 6538P als Testorganismus verwendet vlird. Die physikalischen Beding gungen der Probe sind ähnlich wie die für Gentamicin beschriebenen [Oden et al., Antimicrobial Agents and Chemot- herapy, (1963) American Society for Micrnbiologyj. Die normale Verdamicin I Base hat eine bestimmte Potenz von 1000 mcg/mg. Ein mcg des Standards bei den Bedingungen dieser Probe erzeugt eine Inhibitionszone von 17,0t1,3 mm.
Verdamicin I Base ergibt 1000 mcg/mg in der iSentamicin- probe und die Kurve der Ansprechdosen von Verdamicin läuft parallel zu der von Gentamicin. Verdamicin I-Sulfat ergibt 674 mcg[mg in der Gentamicinprobe und 695 mcgimg gegen die eigene Base als Vergleichsstandard.
Die erfindungsgemäss erhältlichen neuen Antibiotika Verdamicin I und G418 sind basisch und bilden mit organischen und anorganischen Säuren Säureadditionssalze, Beispiele solcher Säuren sind Schwefel-, Chlorwasserstoff-, Phosphor-, Toluol-p-sulfon-, Bernstein-, Malein-, Essig-, ropion-, Cyclopropancarbon-, Adamantancarbon; Furoin-, Benzoe- und Phenyl essigsäure; die Salze umfassen weiters die Alkalimetall-Derivate der antibiotischen Salze der zweibasischen oder dreibasischen Säuren.
Im allgemeinen sind die Salze wasserlöslich und können durch Behandlung einer wässrigen Lösung des Antibiotikums mit einer stöchiometrischen Menge an Säure und Lyophilisierung der sich ergebenden Lösung gebildet werden. Die Salze werden auch aus einer wässrigen Lösung durch den Zusatz von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. niederen Alkylketonen (z. B. Aceton), niederen Alkoholen (z. B. Methanol), cyclischen äthern (z.B. Tetrahydrofuran), oder niederen tert. Amiden, wie z. B.
Dimethylformamid und Diäthylacetamid, ausgefällt.
In den Tabellen ; und XI sind die in vitro antibakteriellen Aktivitäten von Antibiotikum G-418 gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien, bei Verwendung von in der Technik anerkannten Standard-Verfahren, aufgezeigt:
Tabelle X
In Vitro antibakterielle Aktivität-Medium: Tryptose Phosphatbrühe pH 7,2 bis 7,5 Organismus MIC* (mcg/ml) Staphylococcus aureus 209P 0,8
Gray 7,5
Wood 0,8
Ziegler 0,8 Streptococcus sp. C > 25
C203 17,5
Escherichia coli Sc 3,0
894 7,5
Klebsiella pneumoniae DA20 3,0
Pseudomonas aeruginosa VA6 3,0
37 17,5 *Minimale hemmende Konzentration.
Tabelle XI In Vitro antibakterielle Aktivität (Mueller-Hinton-Brühe pH 7,2-7,5) Organismus MIC (mcg/ml) Bacillus subtilis 6633 3,0 Staphylococcus aureus 12 3,0
1257 0,3
Sm 1 0,3
6 0,3
23 0,3
26 3,0
32 7,5 Streptococcus sp. 30 7,5
27 7,5 16245 7,5
6589 7,5
3045 7,5 Escherichia coli 777 3,0
887 3,0 Pseudomonas aeruginosa 1262 17,5
1236 17,5
20 3,0
83 7,5 Proteus mirabilis 12 453 7,5 morganii 8019 0,8 rettgeri 9250 0,3
In Tabelle XII sind die mit Antibiotikum G418 in vivo erhaltenen antibakteriellen Ergebnisse angegeben. Die zur Erzielung der Ergebnisse verwendeten Tiere waren Carworth Farms CF-1 Mäuse, mit einem Gewicht von etwa 18-20 g, unterteilt in Gruppen von 7. In vivo Schutz (PD50) wird bestimmt durch intraperitonale Injizierung der Mäuse mit einer lethalen Dosis pathogener Bakterien.
Eine Gruppe Mäuse dient als Kontrolle; die anderen Gruppen erhalten eine Stunde später verschiedene Einzeldosen Antibiotikum G418. Die nicht geschützten Kontrolltiere sterben in 18 bis 24 Stunden. Der Test endet 48 Stunden nach Infektion, und die Anzahl lebender Mäuse in jeder Gruppe, die Antibiotikum G418 erhielten, werden gezählt. Die Ergebnisse werden mittels statistischer Standard-Methoden analysiert, um PDs0-Werte mit 95% Vertrauensgrenzen zu bestimmen.
Tabelle XII
Antibakterielle Wirksamkeit in Vivo
A. Schutzwirkung Organismus Weg PD50 (mg/kg) Staphylococcus aureus Gray S.C. 2,5
Oral 40
Escherichia coli Sc. S.C. 1,5
Staphylococcus aureus St.M. S.C. 3,0
Nr.1
Pseudomonas aeruginosa Nr. 1S.C. 5,0
B. Akute Toxizität Weg LD50 (mg/kg)
I.V. 140
Tabelle XIII zeigt in vivo Testergebnisse, die die antipro tozoale Wirksamkeit von Antibiotikum G418 veranschauli chen. Die Träger für die Teste waren jung entwöhnte männli che Royal Hart Ratten (3 bis 4 Wochen alt) mit einem Ge wicht von etwa 50 bis 70 g.
Das Testverfahren ist eine Abwandlung eines von R. J.
Schnitzer auf den Seiten 355-443 in Experimental Chemotherapy Band 1, Academic Press, New York (1963) beschriebenen Verfahrens.
Tabelle XIII Orale Wirksamkeit von Antibiotikum G418 und Bezugssubstanzen gegen experimentale Cecal E. Histolytica Infektionen bei Ratten.
Präparat Orale Dosis Tage Parasit- A.D.I.* mglkg/Tag behan- ologische delt Heilungen/Total Antibiotikum 25 6 19/19 0 G418 12,5 6 24/24 0
10 3 7/7 0
10 1 4/7 0,7
6,5 6 4/4 0
6,5 3 4/5 0,4
6,5 1 2/5 1,0
3,5 6 5/6 0,2
3,5 3 0/7 1,7 Präparat Orale Dosis Tage Parasit- A.D.l.
mglkgTag behan- ologische d-It Heilungenffotal Paromomycin 25 6 6/7 0
12 6 4/8 0,8
10 3 2/6 1,0
10 1 0/7 2,1
6,5 6 2/4 1,3
6,5 3 1/5 1,0
6,5 1 0/4 1,0
3,5 6 1/6 1,5
3,5 3 1/7 1,9 Metronidazole 25 6 1/5 0,8
13 6 2/6 0,8
6,5 6 1/4 0,8
6,5 3 0/3 1,7
6,5 1 0/4 1,5 Kontrollen mit 6 4/45 2,2 Wasser behandelt *A.D.I. bedeutet Durchschnittsgrad an Infektion aufgrund grober Beobachtung der pathologischen Änderungen in der Cecum und mikroskopischer Beobachtung der Anzahl gefundener Amoebae. Diese Beobachtungen sind auf einer Skala von Null bis vier aufgezeichnet, wobei Null eine im wesentlichen normale Cecum darstellt. Unbehandelte aber infizierte Kontrollen erreichen etwa 2 bis 4.
In den aufgezeigten Daten sind die Kontrollen durchschnittlich 2,2.
Verdamicin I zeigt ein breites Spektrum antibakterieller Wirksamkeit bei in vitro Testan gegen repräsentative grampositive und gram-negative Bakterien. Es ist wirksam gegen kanamycinbeständige Bakterien, scheint jedoch überschneidend mit Gentamicin zu sein. Das Antibiotikum zeigt keine wesentliche in vitro Aktivität gegen Hefe.
Tabelle XIV zeigt die minimale Hemmkonzentration von Verdamicin I-Sulfat gegen repräsentative Arten von Bakterien und Hefe. Die Versuche wurden in Hefe-Fleisch-Brühe (pH 7,4) durchgeführt, wobei die Inhibition nach 24 Stunden bestimmt wurde. Zum Vergleich werden Ergebnisse mit Gentamicin-Sulfat angegeben.
Tabelle XIV
Minimale Hemmkonzentration-MlC (mcg/ml)
Verdamicin I-Sulfat Gentamicin Organismus 24 Stunden 48 Stunden Sulfat
24 Stunden Staphylococcus 0,3 0,75 0,1 aureus 209P Streptococcus 0,75 3,0 3,0 pyogenes C Streptococcus 0,3 0,75 1,0 pyogenes 6 Aerobacter aero- 0,3 0,3 0,6 genes 3 Aerobacter aero- 0,3 0,3 0,3 genes 4 Escherichia 0,3 0,75 0,75 coli Sc Escherichia 0,3 0,75 0,3 coli 5 Escherichia 0,3 0,3 0,3 coli 19 Klebsiella 0,3 0,3 0,3 pneumoniae Ad KR*
Verdamicin Sulfat Gentamicin Organismus 24 Stunden 48 Stunden Sulfat
24 Stunden Klebsiella 0,3 0,3 0,3 pneumoniae 17 KR Proteus 0,3 0,3 0,3 mirabilis MeF Proteus 0,3 03, 03,
vulgaris 2 Pseudomonas 0,075 0,3 0,3 aeruginosa 8689 Pseudomonas 0,75 0,75 0,5 aeruginosa Miller Salmonella 0,3 0,75 1,0 paratyphi B1 Salmonella 0,3 0,3 0,5 paratyphi B2 Candida > 10 > 10 > 50 albicans 406 Candida > 10 > 10 > 50 albicans 401 Candida > 10 > 10 > 50 albicans 411 Saccharomyces > 10 > 10 > 50 cerevisiae *KR = kanomycinbeständig
Verdamicin I wurde in vivo gegen vier (4) Arten von in fektiösen Bakterien in Mäusen getestet, wobei als einzelne subcutane Dosis eine (1) Stunde nach Infektion mittels in traperitönaler Injektion eine lethale Menge Pathogen verab reicht wurde. Eine Gruppe Mäuse dient als Kontrolle; die an deren Gruppen erhielten verschiedene Dosen Verdamicin I.
Die nicht geschützten Kontrollen starben in 18 bis 24 Stun den. Der Versuch endet 48 Stunden nach Infektion, und die
Anzahl lebender Mäuse in jeder Gruppe, die Verdamicin I er halten haben, wurden gezählt. Die Ergebnisse wurden mit tels statistischer Standard-Methoden analysiert und PDs0-Werte mit 95% Vertrauensgrenzen bestimmt.
In Tabelle XV sind die Ergebnisse dieser in vivo Versu che angegeben, welche zeigen, dass Verdamicin I ein starkes antibakterielles Mittel gegen gram-positive und gram-nega tive Organismen ist. Zum Vergleich sind mit Gentamicin er haltene Ergebnisse aufgezeigt. Tabelle XV gibt auch die akute Toxizität von Verdamicin I bei intravenöser Verabrei chung an.
Tabelle XV
Schützwirkung in Mäusen PD50 (mg/kg) Organismus Weg Verdamicin I Gentamicin Staphylococcus S.C. 2,5 2,4 aureus Gray Streptococcus S.C. 1,0 5,0 pyogenes C Escherichia S.C. 1,5 1,7 coli 10536 Pseudomonas S.C. 2,0 1,7 aeruginosa 8689
Akute Toxizität in Mäusen
Weg LD50 (mg/kg) i.V. 75
Die antibiotische durch Kultivierung von Micromonospora grisea erhaltene Mischung, welche hauptsächlich Verdamicin I, Sisomicin, Antibiotikum G418 und Gentamicin A umfasst, zeigt ein breites Spektrum antibakterieller Wirksamkeiten, wenn sie in vitro gegen gram-positive und gram-negative Bakterien getestet wird. Tabelle XVI zeigt die minimalen Hemmkonzentrationen der antibiotischen Mischung gegen repräsentative Arten von Bakterien und Hefe. Die Versuche wurden in Hefe-Fleisch-Brühe (pH 7,4) durchgeführt.
Tabelle XVI Organismus MIC (mcg/ml)
Bacillus subtilis 6633 0,03
Staphylococcus aureus 209P 0,8
Staphylococcus aureus G 0,3
Streptococcus pyogenes C 3,0
Escherichia coli 10536 0,8
Escherichia coli 3 0,8
Klebsiella sp. 803 0,8
Proteus sp. 126 0,8
Proteus sp. McFadden 0,3
Pseudomonas aeruginosa Sc 0,3
Pseudomonas aeruginosa 13 0,3
Salmonella sp. Sc 3,0
Wie oben gezeigt, sind Antibiotikum G418 und Verdamicin I und deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze hochwirksame Antibiotika, die dem Wachstum von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen entgegenwirken. Sie sind z. B. wirksam gegen Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, Eschecheria coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus und Pseudomonas.
Weiterhin beeinträchtigt Antibiotikum G-418 das Wachstum von Helminthes, wie z. B. Syphacia obvelata und Hymenolepsis nana, und Protozoen, insbesondere parasitärer Protozoen wie z. B. Trichomonas vaginalis und Entamoeba histolytica.
Beide Antibiotika sind jedoch unwirksam gegen Hefe und Fadenpilze wie z. B. Saccharomyces, Candida, Aspergillus und Trichophyton.
Die Antibiotika und deren pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze können unter in vivo oder in vitro Bedingungen verwendet werden. Sie können zum Verhindern des Wachstums oder zur Vernichtung empfindlicher Arten der oben beschriebenen Organismen und in Verbindung mit Seifen und Reinigungsmitteln zum Entfernen solcher Organismen von den Oberflächen von Laboreinrichtungen, chirurgi schen Instrumenten, Labor-Glaswaren und dergleichen verwendet werden. In Anbetracht ihrer in vivo Wirksamkeit können die Antibiotika und deren pharmazeutisch annehmbaren Säureaddidionssalze zum Vernichten oder Wachstumverhindern empfindlicher Organismen in Säugetieren verwendet werden, z. B. in Mäusen, Ratten, Katzen, Hunden und Rindern.
Die Antibiotika und deren pharmazeutische annehmbaren Säuredadditionssalze können auch zur Behandlung von durch empfindliche Organismen in Menschen hervorgerufene Krankheiten verwendet werden.
Zur Zubereitung für ihre in vivo Verwendung wird ein aus Antibiotikum G418 und Verdamicin I und deren pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze ausgewähltes Antibiotikum in eine zur therapeutischen Verabreichung geeignete Form gebracht, z. B. durch Vermischen mit einem pharmazeutischen Träger oder Bindemittel. Durch die Erfindung werden daher pharmazeutische Zusammensetzungen geschaffen, die als wirksamen Bestandteil mindestens eine Verbindung, die aus Antibiotikum G418 und Verdamicin I und deren pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze ausgewählt wird, zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Bindemittel enthält. Die Zusammensetzungen können in der Form einer Doseneinheit, z. B. ein geformtes Produkt, sein.
Die Zusammensetzungen liegen jedoch vorzugsweise in Form von injizierbaren Präparaten in Ampullen oder Salben, Cremen oder Lotionen vor.
Beispiel 1
Herstellung des Antibiotikumsmittels M. grisea in Schüttelflaschen.
a) Bereitung des Inokulums: Eine 300-ml-Flasche enthaltend 100 ml des folgenden sterieln Mediums wird mit M. grisen beimpft: Medium A.
Fleischextrakt 3g Tryptose 5g Hefe-Extrakt 5g Dextrose 1g Stärke 24 g Kalziumkarbonat 2 g Leitungswasser 1000 ml
Die Flasche wird unter fortlaufendem Schütteln auf einem Drehschüttler bei 250 bis 300 rpm (Umdrehungen pro Minute) bei 25 bis 35 bebrütet bis wesentliches Wachstum erreicht wird. Dies dauert gewöhnlich 1 bis etwa 4 Tage.
b) Fermentation: Eine 2,0 Liter-Flasche enthaltend 500 ml des untenstehenden Mediums wird mit 5% des in Stufe a) bereiteten Inokulums beimpft.
Medium B.
Sojabohnenmehl 30 g Dextrin 50 g Kalziumkarbonat 7 g Dextrose 5g Leitungswasser 1000 ml
Das beimpfte Medium wird in einem Temperaturbereich von etwa 26 "C bis etwa 35 "C für etwa 4 bis etwa 7 Tage unter fortlaufendem Schütteln auf einem Drehschüttler bei 200-300 rpm fermentiert. Die Fermentation wird periodisch nach den ersten 48 Stunden geprüft, um festzustellen, wann die Spitze der antibiotischen Wirksamkeit erreicht ist, und von diesem Zeitpunkt an wird die Fermentation nach dem Verfahren des Beispiels 4 aufgearbeitet.
Beispiel 2 14 Liter Tankfermentation von M. grisea a) Keimungsstufe: Ein 25 ml Anteil des wie in Beispiel 1 bereiteten Inokulums wird in eine 21-Erlenmeyer-Flasche ge geben, die 500 ml steriles Inokulum-Medium enthält. Das Inokulum wird etwa 2 bis etwa 4 Tage unter fortlaufendem Schütteln bei etwa 280 rpm bei etwa 28 "C bebrütet.
b) Fermentationsstufe: Der volle Inhalt der Keimungsflasche wird in ein 14-Liter-Fermentationsgefäss, das 10 Liter steriles Medium B enthält, gegeben. Die Fermentationsmischung wird bei etwa 35 "C unter ständigem Schütteln bei etwa 250-500 rpm für etwa 90 Stunden bebrütet. Der pH-Wert wird während der Fermentation zwischen 7,2 und 8,3 gehalten, während das Kulturmedium mit etwa 3 bis etwa 5 Liter pro Minute belüftet wird. Die Fermentationsmischung wird periodisch nach den ersten 48 Stunden geprüft, um festzustellen, wann die Spitze der antibiotischen Wirksamkeit erreicht wird, und von diesem Zeitpunkt an wird die Fermentation nach dem Verfahren des Beispiels 3 aufgearbeitet.
Beispiel 3
95 Liter (25 Gallonen) Tankfermentation von M. grisea Inokulumstufe Medium C Hefe-Extrakt 5,0 g Fleischextrakt 3,0 g Trypton 5,0 g Kartoffelstärke 24,0 g Cerelose 1,0 g Kalziumkarbonat 1,0 g Wasser 1,0 Liter
1,0 Liter des Mediums C wird mit der oben angeführten Zusammensetzung hergestellt. Der pH-Wert wird auf 7,3 eingestellt und aliquote Teile von 0,5 Liter werden in 2-Liter-Erlenmeyerflaschen gegeben. Das Medium wird für 45 Minuten bei 121 "C sterilisiert. Danach wird auf Raumtemperatur abgekühlt und jede Flasche wird mit 5 ml einer M. grisea Kultur beimpft. Jede Flasche wird für 72 Stunden in einem Drehschüttler (200 rpm) bei 30 "C bebrütet.
Das Inokulum (25 ml pro FIasche) wird zu 0,5 Liter steriles Medium C gegeben und jede Flasche wird für 48 Stunden auf einem Drehschüttler bei 30 "C bebrütet. 5,0 Liter dieses Inokulums werden vereint und zu 90 Liter sterilen Mediums C hinzugefügt, die Temperatur wurde auf 30 "C gebracht, der pH-Wert auf etwa 7,3-7,7. die Belüftung beträgt etwa 1-2 Kubikfuss (28-56 Liter) pro Minute, und die Schüttelung etwa 200-400 rpm.
Die Fermentation wird für etwa 100 bis etwa 130 Stunden fortgesetzt bis die Spitze der antibiotischen Wirksamkeit erreicht ist, und dann wird die Fermentation gemäss Beispiel 4 aufgearbeitet.
Beispiel 4
Isolierung des antibiotischen Komplexes
Zu 60 Liter der gemäss den Beispielen 1 bis 3 hergestellten Fermentationsbrühe werden etwa 400 g Oxalsäure unter heftigem Schütteln hinzugefügt. Der pH-Wert der Fermentationsmischung wird mit 6 n Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt und es wird für etwa 20 Minuten geschüttelt. Die angesäuerte Fermentationsmischung wird filtriert und das Filtrat zurückbehalten. Der Mycelkuchen wird mit Leitungswasser gewaschen und die Waschflüssigkeit wird mit der filtrierten Brühe vereint. Zu diesem Zeitpunkt ist es vorteilhaft, die Filtrate und Waschflüssigkeiten von etwa 60 Liter Fermentationen (d. h. etwa 180 Liter) zu vereinen. Die vereinten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mit 6 n Ammoniumhydroxyd neutralisiert (man braucht etwa 500 bis etwa 900 ml).
Der antibiotische Komplex wird auf IRC-50 in der Ammonium-Form adsorbiert, indem die neutrale Brühe durch eine Harzsäule, welche 2" hoch (5,1 x 65,6 cm) ist, hindurchgeführt. Die Durchflussgeschwindigkeit wird auf etwa 175-200 Minute gebracht bis die ganze Brühe verarbeitet ist. Die Säule wird mit deionisiertem Wasser (etwa 20 Liter) farbfrei gewaschen. Der antibiotische Komplex wird mit 2 n Ammoniumhydroxyd bei einer Geschwindigkeit von etwa 80 ml/Minute desorbiert, anschliessend mit deionisiertem Wasser, wenn der pH-Wert des Eluates 10 erreicht hat. Das Eluat wird im Vakuum auf etwa 1 Liter eingeengt und lyophilisiert, um den antibiotischen Komplex zu erhalten. Wenn das Eluat stark gefärbt ist, kann eine Behandlung mit IRA-401S vorgenommen werden.
Diese Behandlung wird gewöhnlich durchgeführt, indem das Eluat der vorhergehenden Säule durch eine Säule von IRA401S (1" Durchmesser x 20" Höhe; d. h. 2,54 x 50,8 cm) mit einer Geschwindigkeit von etwa 120 Minute hindurchgeführt wird. Die IRA401S- Säule wird frei von Antibiotikum gewaschen und das Eluat und die Waschflüssigkeit wird wie oben beschrieben eingeengt.
Beispiel 5 A. Bereitung des Sulfatsalzes des antibiotischen Komplexes
37 g der nach Beispiel 4 erhaltenen rohen Komplex-Base werden in 1000 ml Wasser gelöst und der pH-Wert wird mit Schwefelsäure auf 4,5 eingestellt. Die Lösung wird mit Darco G60 für etwa 'k Stunde gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird auf etwa 100 ml eingeengt und zu einem Methanolüberschuss hinzugefügt. Der entstandene Niederschlag des gemischten Sulfates wird abfiltriert und unter Vakuum ge trocknet.
B. Umwandlung des Sulfatsalzes in die antibiotische Komplex-Base
Die nach Stufe A erhaltenen gemischten Sulfate werden in 1000 ml Chlorofrom suspendiert und Ammoniak-Gas wird durch die Suspension für etwa 'k Stunde durchgeblasen. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat zur Trockenheit eingedampft, um die Antibiotikum-Komplex-Base zu erhalten.
Beispiel 6
Isolierung von Verdamicin I, Sisomicin, Antibiotikum G418 und Gentamicin A
12 lb (5,45 kg) Silicagel werden in der niederen Phase einer Lösungsmittelmischung bestehend aus Isopropanol: Chloroform: konz. Ammoniumhydroxyd (1 :2: I v/v) suspen- diert. Die Suspension wird auf eine chromatographische Säule mit einem inneren Durchmesser von etwa 4" (10,2 cm) gebracht. 100 g des nach Beispiel 4 erhaltenen antibiotischen Komplexes werden in etwa 1,0 Liter der niederen Phase des zur Bereitung der chromatographischen Säule verwendeten Lösungsmittelsystems suspendiert. Die so erhaltene Suspension wird filtriert und die unlöslichen Teile werden zur weiteren Behandlung zurückbehalten. Das Filtrat wird auf etwa 1,0 Liter eingeengt bevor es auf die Säule gebracht wird.
Unter Erhitzen und Rühren wird das vorher erhaltene unlösliche Material (etwa 66 g) in Methanol gelöst und dann filtriert, um das vorhandene anorganische Material (etwa 6 g) zu entfernen. Die methanolosische Lösung wird an Luft gekühlt und nochmals filtriert um das meiste des geringfügig löslichen Gentamicin A Karbonates zu entfernen.
Der antibiotische Komplex, von dem das meiste des Gentamicin A entfernt wurde, wird auf die wie oben bereitete Silicagel-Säule adsorbiert und das Chromatogramm wird mit der Lösungsmittelmischung entwickelt, wobei 2,0-Liter-Fraktionen mit der Säule bei vollem Fluss genommen werden.
Wenn das Sisomicin desorbiert ist (was normalerweise etwa 90 bis etwa 100 Fraktionen erfordert), wird das Verhältnis der Lösungsmittel zu 1:1:1 geändert und Elution wird fortgesetzt bis das verbleibende Material desorbiert ist. Bei der Durchführung der Trennung des antibiotischen Komplexes auf einer Säule dieser Grösse ist die Anzahl der gesammelten Fraktionen im allgemeinen etwa 250 bis 350. Jede Fraktion wird auf Filterpapier getupft und mit Ninhydrin Reagenz getestet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antibiotikum, d. h. Ninhydrin-positives Material, zu bestimmen.
Jene Fraktionen, die antibiotische Substanzen enthalten, werden einer Papier-Chromatographie in einem System bestehend aus Chloroform : Methanol: 17% Ammoniumhydroxyd (2 :1 :1 v/v) unterworfen, an die sich eine Bioautographie gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538P anschliesst, um festzustellen, welche Fraktionen dasselbe Antibiotikum enthalten. Die Fraktionen werden entsprechend der mittels Chromatographie und Bioautographie gemachten Bestimmung vereint, die vereinten Fraktionen werden im Vakuum auf etwa 100 ml eingeengt und dann lyophilisiert.
Die Verteilung der Antibiotika von der Säule ist im wesentlichen wie folgt: Fraktionen Antibiotika 1-65 unwirksame organische
Materialien 66-87 Verdamicin I 88-91 Sisomicin 119-259 Antibiotikum G418 259-Ende zurückgebliebenes Gentamicin A
Beispiel 7
Bereitung von Verdamicin-I-sulfat
500 mg des nach Beispiel 6 bereiteten Verdamicin I werden in 90 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf 4,5 eingestellt. Die Lösung wird mit 1 bis 2 g entfärbender Holzkohle (Darco G-60) für etwa 30 Minuten gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum auf etwa 10 ml eingeengt und unter Rühren in etwa 100 ml Methanol geleert. Die entstandene Sus pension wird filtriert, das feste Produkt mit frischem Methanol gewaschen und dann getrocknet, wobei etwa 450 mg Verdamicin I Sulfat erhalten werden.
Beispiel 8 Bereitung des Verdamicin-I-hydrochlorid
400 mg des in Beispiel 6 bereiteten Verdamicin I werden in etwa 75 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 4,5 eingestellt. Die Lösung wird mit 1 bis 2 g entfärbender Holzkohle ( Darco G-60) für etwa 30 Minuten gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum auf etwa 30 Minuten gerührt und wird im Vakuum auf etwa 75 ml eingeengt und unter Rühren in 150 ml einer Methanol : Azeton (1 :2 v/v) Mischung geleert. Die entstandene Suspension wird filtriert, das feste Produkt mit frischem Azeton gewaschen und getrocknet, wobei etwa 300 mg Verdamicin I-Hydrochlorid erhalten werden.
Das obige Verfahren ist von allgemeiner Anwendbarkeit und kann mit einer äquivalenten Menge der vorher beschriebenen Säuren verwendet werden, um nicht-toxische Säureadditionssalze zu bilden, welche die funktionellen Äquivalente von Verdamicin-I-hydrochlorid und Verdamicin-Isulfat sind.
Beispiel 9 Bereitung der Verdamicin-I-Base
390 mg des wie in Beispiel 7 bereiteten Verdamicin-I-sulfa tes werden in 10 ml Wasser gelöst. Eine IRA-401S-Säule (Amberlite Anionaustauscher-Harz, Rohm und Haas) mit den folgenden Ausmassen wird bereitet: Höhe 25 cm, äusserer Durchmesser 2 cm. Die antibiotische Lösung wird der Harzsäule zugeführt und mit deionisiertem Wasser eluiert bis das Eluat mit Ninhydrin nicht reagiert. Das Eluat wird auf etwa 25 ml eingeengt und dann lyophilisiert, wobei 230 mg Verdamicin I erhalten wird.
Beispiel 10 Herstellung von Antibiotikum-G-418-sulfat
2,6 g des Antibiotikums G-418 werden in 250 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit verdünnter 1-6 n) Schwefelsäure auf 4,2 eingestellt, 5 g Darco G-60 werden der Lösung beigefügt und es wird etwa eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung tropfenweise unter heftigem Schütteln zu 500 ml Methanol hinzugefügt. Die entstandene Suspension wird filtriert, das feste Produkt mit Methanol gewaschen und bei etwa 40 "C im Vakuum getrocknet, wobei 3,36 g Antibiotikum-G-418-sulfat erhalten werden, enthaltend etwa 700 mcg/mg.
In ähnlicher Weise können durch Ersetzen der Schwefelsäure durch eine äquivalente Menge einer anderen anorganischen oder organischen Säure und durch Verwendung von Azeton als Ausfällungsmittel andere Säureadditionssalze hergestellt werden.
The invention relates to a process for the preparation of a mixture of the antibiotics Verdamicin I, Sisomicin, G418 and Gentamicin A or the individual components of this mixture or acid addition salts of such compounds, characterized in that a microorganism is capable of producing the mixture defined above.
reduce, cultivate, isolate the mixture and, if desired, break it down into its individual components, and convert the mixture thus obtained or the individual components into acid addition salts.
Microorganisms of the genus Micromonospora, in particular those of the species Micromonospora grisea, are suitable for the process according to the invention.
The microorganism Micromonospora grisea (hereinafter sometimes referred to as M. grisea) was obtained from soil samples near Topeka, Kansas. The microorganism has been deposited with the United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Divison, Peoria, lllinois, where subcultures are available, and has been designated NRRL 3800.
Micromonospora grisea has been classified as a new genus of Micromonospora on a number of standard media based on its taxonomic and growth characteristics. Micromonospora grisea forms when cultivated on various media, e.g. B. the identification medium listed below is a gray-green pigment. The most distinctive feature of Micromonospora grisea is its ability to form an antibiotic product under controlled conditions, which consists of four main components, which are explained in more detail below, and smaller amounts of other substances that have yet to be identified.
Labeling medium Difco yeast O, 501o sucrose 3.0% calcium carbonate 0.1 01o Difco agar 1.5 / o water (distilled) 1.0 liter
If the sterilized medium is inoculated with Micromonospora grisea and incubated at 26 to 28 C for 24 days, the following color developments are observed: Sporulation area: slate green g231i, gray-green 150 with longer incubation, the sporulation area can become black.
Vegetative area: slightly tinted g3gc, slightly yellowish brown 76.
Micromonospora grisea can also be characterized by the following tazonomic data:
Medium 3% NZ amine type A, 1% dextrose
1.5% agar
Observations (21 days after inoculation) Macroscopically Microscopically Medium growth, folded; Mycelium long, sparsely branched, periphery: slightly tinted, 0.5-0.8 t in diameter.
g3gc, slightly yellowish brown 76 spores relatively abundant Center: beaver colored g31i, formed individually, appear dark gray-yellow-brown 81. brown colored when incident
Light, 1.0-1.5 in diameter appear to be rough-walled.
Micromonospora grisea does not reduce nitrate, grows well on gelatin with hydrolysis, and grows in media containing 1.59% sodium chloride, but does not grow in similar media containing 3% sodium chloride.
Micromonospora grisen needs assimilable carbon and nitrogen sources for good growth and antibiotic production. A number of such sources can be used.
This microorganism is nervous and grows. at temperatures from 20 'to 40 OC. preferably 280 to 35? i / at pH values of 6.5 to .5 preferably -. way 7.2 to Ö ,.
In addition to the vo en2n.l, en ta: '. Onomic data.
the M. grisea is further marked in Tables 1,? o and Ili:
Table I.
Observations of colonies of Micromonospora grisea on different media Medium observation Czapek's medium Growth: bad, not (glucose) writable Asparagine-glucose growth: medium to medium bad, granular, healing brown g31g, moderately yellowish brown
77 Calcium malate Agar growth: poor, not writable W Ordinary agar growth:
bad not (water agar) descriptive medium observation nutrient agar growth: bad, not writable Loeffler's serum growth: bad, no medium (Difco) reaction
Potato growth: good, folded, slightly tinted g3gc, light yellowish brown 76
Peptone-glucose growth: poor, cannot be written on with agar
Egg agar growth: bad, none (Dorset Egg reaction
Medium Difco) Starch Growth: good, folded agar grooved, no aerial mycelium
Color: mustard brown g21s11, moderate olive green 107
Hydrolysis:
positive Laclcmus partially peptonized with milk (Difco) acid reaction cellulose decomposition very slowly,
Medium takes 3-6 months or longer
Bennett's agar growth: good, folded, g24ml ivy-colored, dark gray-green 151 Emerson's agar growth: medium, flat, g3gc slightly tinted, light yellowish brown 76 tomato paste growth: medium, raised, grooved, g4ga apricot-colored, light orange 52 glucose yeast growth : good, folded, g31 E extract agar camel colored, moderately yellowish brown 77 potato slice growth: good, folded, slightly tinted g3ge, light yellowish brown 76
Sucrose growth: medium, flat,
Nitrate agar g3ec light beige, light gray (Czapelts agar) yellowish brown 79
Tyrosine Agar Growth:
bad, no observations after 2.7 color reaction and 14 days (according to Gordon and Smith, 1. Bact. 54: 147)
Peptone growth: moderate, iron agar no color reaction. Observations nee 2.7 and 14 days
Glucose-asparagine growth: medium to poor agar, granular, g31g light brown, medium yellowish brown 77
Milk hydrolysis: positive, growth: poor. Czapek glucose growth after 3 and 10 days
Solution bad;
Grain not observable; a class
Straw color in the pulp
10 days of incubation available
Table II
Use of carbohydrates
Carbohydrate growth
L (+) arabinose good
D (- arabinose good
D (+) glucose good
D (-) levulosis good
D (+) mannose good
Sucrose good
D (+) xylose good
Strength good
Dulcit bad
D (+) galactose bad
Glycerine bad i-inositol bad ss-lactose bad
D (+) mannitol bad a-D (+) melibiosis bad
D (+) melicitis bad
D (+) raffinose bad
L (+) rhamnose bad
Salicin
For control:
: O, 501o yeast bad
extract
Table III
Use of nitrogen sources
Nitrogen source growth (+ 1% glucose) observations 0.5010 Dico
Yeast extract good
1.0% NZ amine
Type A good
1% asparagine bad
1% glutamic acid bad
1% 01o sodium nitrate bad
1% ammonium nitrate Bad
In Table IV are M. grisea and M.rhodorangea with other Micromonospora which
Produce antibiotics, compared:
Table IV
Comparison of Micromonospora grisea with other Micromonospora
M. purpurea M. echinospora M. carbonacea M. carbonacea M. megalomicea M. grisea (NRRL 2953) (NRRL 2985) var.carbonacea var.aurantiaca (NRRL 3274 & (NRRL 3800) (NRRL 2972) (NRRL 2997) 3275) Spore bearer yes yes yes yes yes yes long Spore bearer yes * yes yes yes yes yes branched Spore bearer yes * yes yes yes yes yes short growth to medium medium medium medium medium bad bad nutrient agar to bad to bad to bad to bad growth to bad bad average mediocre no good potato gelatin weak weak yes yes no yes liquefaction starch yes yes yes yes yes yes hydrolysis sucrose yes yes yes yes yes yes conversion cellulose in weak in weak in weak in weak no slow decomposition extent to extent to extent to extent to extent ange
griffen griffen griffen antagonists Gentamicin Gentamicin Everninomicin Everninomicin Megalomicin Antibiotic G418
Verdamicin 1,
Sisomicin
Gentamicin A
Fermentation of Micromonospora grisea is carried out using standard methods for the production of antibiotics by cultivating microorganisms.
Substantial amounts of antibiotics are produced when the microorganisms in question are cultivated in an aqueous nutrient medium which contains assimilable carbon and nitrogen sources under aerobic, preferably submerged aerobic conditions. Examples of assimilable sources of nitrogen are carbohydrates such as those given in Tables 11 and V, in particular glucose, xylose and mannose. Examples of assimilable sources of nitrogen are proteins and amino acids, and substances containing these, such as, for example, beef extract, yeast extract and soybean meal Good growth and antibiotic formation are obtained when using the fermentation procedures set out in the following Examples 1 and 5 to 7. The media can be mixed with trace amounts of inorganic salts such as
Magnesium sulphate, iron sulphate and, in particular, cobalt chloride, can be supplemented in order to increase the formation of antibiotics.
The fermentation is usually carried out in two or three stages, with the first stage or two stages devoted to germination of the microorganism to produce a suitable inoculum. As a rule, large (tank) fermentations require two stages of germination, while shake bottle fermentations only require one stage of germination. The germination stages are carried out under aerobic conditions with shaking, preferably rotary shaking at e.g. B. 250 to 400 revolutions per minute, usually carried out at a temperature in the range of about 25 to 35 OC for 1 to 4 days. The last fermentation stage (production stage) is initiated by inoculating a suitable medium with the previously prepared inoculum under sterile conditions.
The production stage of fermentation is usually carried out in the same temperature range as the germination stage. Further, it usually takes about 4 to about 7 days to reach peak effectiveness. Unlike the germination stage, at which the pH is usually stable, the production stage requires the pH to be regulated within a range of about 7.2 to about 8.3.
In the course of the fermentation, especially after the first 24 hours, the fermentation is checked at suitable time intervals (e.g. every 6 to 8 hours) to determine when the peak of antibiotic activity has been reached.
The test is preferably a standard disk and plate sample using a standard medium and test organism. Details of preferred samples are given in a later section of the specification.
When the peak of antibiotic activity is reached, the product is recovered, generally by a combination of steps such as acidification, filtration, adsorption, elution and evaporation, e.g. B. Lyophilization. In a preferred isolation process, calcium ions present are precipitated as an insoluble salt, the whole broth is acidified, preferably with a mineral acid, and the fermentation mixture is clarified by filtration or centrifugation.
After neutralization, the antibiotic product is adsorbed onto a suitable cation exchange resin, e.g. B. a weakly acidic ion exchange resin in the ammonium form, eluted with dilute alkali, preferably ammonium hydroxide, and by evaporation, e.g. B. by lyophilization, isolated.
In a particularly preferred procedure, about 5 to 8 ml of the fermentation 0, calic acid is added to the whole broth to precipitate calcium as the insoluble oxalate, and the pH of the fermentation is adjusted with strong mineral acid, e.g. B. 6N sulfuric acid, adjusted to 2.0 to release the antibiotics from the mycelium. After this
Filtration, the clarified broth is neutralized with ammonium hydroxide, the antibiotics are on Amberlite IRC-50
NH4 20-50 mesh ion exchange resin (Rohm and Haas,
Philadelphia, Pennsylvania) is adsorbed and the spent (extracted) broth is drained away.
The antibiotic composition is eluted from the resin with a base, preferably 2N ammonium hydroxide, and the eluate is concentrated in vacuo to a small volume and evaporated to dry the scene, for. B. by lyophilization.
The determination of the antibiotics and the determination of the homogeneity of the fractions in the cultivation of Micromonospora grisea is carried out by means of paper chromatography and is achieved by two methods:
1) through the use of reagents and
2) by a microbial process. The first method is carried out by spraying paper chromatograms with 0.25% ninhydrin in pyridine acetone and then heating them to 105 ° C. for several minutes. The zones appear as colored spots against a white background.
Microbial identification of the antibiotic zones is carried out by placing the paper on an agar plate seeded with Staphylococcus aureus ATCC 6538P. After 10 minutes the paper is removed and, after a suitable incubation period (usually 16 to 18 hours), zones of inhibition representing the antibiotics are observed.
These and similar tests show that the antibiotic product obtained by means of the fermentation process described above consists of a plurality of components.
Four of the components appear to be the major part of the product; these are hereinafter referred to as the four main components.
The separation of these components can be achieved by a number of known techniques, such as e.g. B. Ge counter-current-E: ctraction or chromatography on ion exchange resins or on other solid adsorbents, such as. B. silica gel, Chromosorb and cellulose. Silica gel chromatography is preferred. The first two of the four main components are with the lower phase of a solvent mixture consisting of chloroform, isopropanol and conc. Ammonium hydroxide (2: 1: 1 v / v) eluted; the elution is continued with the lower phase of a 1: 1: 1 mixture of the same solvents until the desorption of the remaining antibiotics is complete.
Based on various physical, chemical and biological data, it can be shown that the four main components are:
1. Verdamicin I; a previously unknown antibiotic.
2. sisomicin; the biological properties of sisomycin are described in the Journal of Antibiotics, Volume XXIII No. 11, pages 551-565. The preparation and properties of the antibiotic are described in Belgian patent no.
735 145.
3. antibiotic G-410; also a previously unknown antibiotic.
4. Gentamycin A; the antibacterial properties of gentamycin A were noted by Weinstein et al in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1965, pp. 816-820, and its structure was reported by Maehr and Schaffner in the Journal of the American Chemical Society, 89:25, December 6, 1967, released
The behavior of these four main components in paper chromatography is set out in Table V.
In addition to the four main components, the presence of other antibalçterial materials is sometimes noticeable. However, these materials are formed in such small quantities that their isolation, cleaning and labeling have not yet been carried out successfully. For example, a raw extract containing essentially all of the antibiotics produced in the fermentation was reduced in volume to a syrupy concentrate. The concentrate was then subjected to falling chromatography on Chromar 500 for about 1 hour using a system consisting of chloroform, methanol and conc. Ammonium hydroxide (1: 1: 1 v / v) subjected.
When the chromatogram against Staphylococcus aureus ATCC 6538P was bioautographed, small amounts of three additional fermentation products were faintly detectable. These products had the following Rf values (as accurately as this could be determined): 0.41, 0.30 and 0.12.
Table V
Comparisons of Rr and R, values
Rf of antibiotics
Paper Verda- Siso- Anti-Genta
Chromatographic micin micin biotimicin
Systems I kum A G418
Chloroform: 0.65 0.58 0.41 0.18 methanol: conc. Ammonium hydroxyd (1: 1: 1) on Chromar 500
Leaf, ascending
Rt of antibiotics t = 6 hours chloroform: 0.40 0.21 0.05 methanol: 17% ammonium hydroxide 2: 1: 1 falling on Whatman No. 1 paper
Rt of antibiotics t = 16 hours 2 butanone: 0.44 0.36 0.27 tert-butanol: methanol: conc.
Ammonium hydroxide 16: 3: 1: 6 on Whatman # 1 paper, falling
Rt = distance of the zone from the origin
Distance from the origin to the end of the paper at time t From the following physiochemical data and the chemical degradation, it is assumed that the antibiotic G418 has the structure shown in the formula I below.However, no conclusions can be drawn regarding stereochemistry from the structural formula mentioned:
EMI5.1
When the essentially pure antibiotic G-418 is subjected to a standard chromatographic procedure, it shows the following scheme: Rt (16 hrs) Rf Rt (16 hrs) I. Chloroform-methanol-conc. Ammonia 0.40 on Chromar 500 (ascending) II. 2-butanone-tert-butanol-0.24
Methanol conc. Ammonia (falling) III. 80% aqueous phenol (increasing) 0.32 IV. Methanol-water, + 3% NaCl (decreasing) 0.64 V.
Propanol-pyridine-acetic acid- 0.51
Water (ascending) Rt = Distance of the zone from the origin
Distance from the origin to the end of the
Paper at time t
Antibiotic G418 is an aminoglycoside antibiotic and therefore belongs to the class that includes gentamicin, neomycin, paromoycin, sisomicin and kanamycin. It is usually isolated in the form of an amorphous white solid with the following physical constants; Melting point 138 to 144 C; Rotation: + 140 0C: e 9 "(c = 0.3, H2O); molecular weight (mass spectrometry) = 497; molecular formula: C20H40OioN4 (base): C20H40O10N42H2SO4 (sulfate).
N.M.R spectrum: essentially as shown in Fig. 4 of the accompanying drawings, which was obtained from a solution containing 15% of the antibiotic G418 in deuterium methanol with 3% tetramethylsilane added as a standard.
IR spectrum: In a Nujolmull, essentially as shown in Fig. 3 of the accompanying drawings, which has the following characteristic absorption bands: 3.02, (S) 9.07 lt (S) 11.86 u (W) 6, 32 lt (M) 9.49 lt (S) 13.05 u (W) 7.76 lt (W) 9.77 lt (S) 13.87 lt (W) 8.70 lt (M) 10.42 lt (M) (S) = strong, (M) = medium, (W) = weak
As already mentioned, the physico-chemical analysis of the Verdamicin I indicates that it is a new substance;
structurally, however, it is related to gentamicin C2. The hydrolysis of these two antibiotics with 6N hydrochloric acid at 100 "C for 2 hours and subsequent paper chromatography in a solvent system consisting of either (1) n-butanol: pyridine: water: acetic acid in the ratio 6: 4: 3 1 v / v or ( 2) Propanol: Pyridine: water: acetic acid in the ratio 6: 4: 3: 1 v / v, as well as spraying the chromatograms with ninhydrin, clearly shows that gentamicin C2 and verdamicin I give different hydrolysis products. The chromatograms indicate in both systems the presence of two common products; one of them is 2-deoxystreptamine.
The remaining hydrolysis product of Verdamicin is different from the corresponding one of Gentamicin C2.
Based on the physical and chemical data listed below and after analyzing its hydrolysis products, it is assumed that Verdamicin I has the following structural formula without any stereochemical fixation:
EMI6.1
The chemical and physical properties of the
Verdamicin I are listed in Table VI:
:
Table VI
Chemical and physical properties of the
Verdamicin I.
Base Sulphate Elemental Average Average Average Average Analysis of 2 of 2 of 2 of 2 C 47.98 48.04 31.10 30.95 H 8.13 8.22 6.61 6.60 N 13.43 13.28 8.99 8.69 O (through 30.45 30.47 diff.) SO4 - - 29.30 rotation +155.7 +167.1 +96.50 +99.4 (water) c = 0.3 c = 0.3 c = 0.3 c = 0.3 equivalent - 108.5 104.9 weight pKa 8.1 8.1 Molecular formula C20H39O7N5 analyzes in accordance with C20H3907N5 - 3H2O
Verdamicin I likes to form solvates and hydrates, from which it is difficult to obtain the undissolved or the anhydrous antibiotic.
Accordingly, the elemental analysis according to Table VI agrees in an exemplary manner with the antibiotic as trihydrate (i.e. C20H39O7N5 3H2O).
Verdamicin I shows no absorption in the ultra-violet range of 220-400 lt. Furthermore, it is stable against boiling for at least thirty (30) minutes in 0.1 molar buffers in the pH range of 2-10.
Verdamicin 1 (free base) has a characteristic nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum, as shown in Figure 2 of the accompanying drawings. The NMR spectrum was measured using a Varian A-60-A spectrometer (Varian Associates, 611 Hanson Way, Palo Alto, California) with a solution of about 0.31 ml containing about 22 mg of antibiotic in a deutorium oxide (D2OSDi- methyl sulfoxide (DMSO) mixture The spectrum is recorded in parts / million (PPM) of 3A trimethylsilyl) propanesulfonic acid, sodium salt, the internal standard.
Verdamicin I sulfate has a characteristic infrared absorption spectrum in mineral oil (Nujol) as shown in Figure 1 of the accompanying drawings. The more characteristic absorption bands are shown in Table XII below.
Table VII
Characteristic infrared absorption bands
Verdamicin I sulfate 2.9-3.8 lt (VS, V brd.) 7.25 lt (Nujol) 3.38-3.52 lt (Nujol) 7.25 lt (WM) 4.25 lt (Shd .) 8.6-9.6 lt (VS, V brd.) 4, S0 lt (W, brd.) 10.30 11 (WM) 5.93 lt (Shd.) 10.92 lt (Shd.) 6.16 (MS) 11.42, u (W) 6.50 lt (MS) 12.10 lt (VW, brd.) 6.83 lt (Nujol) 12.75 lt (VW, brd.) Abbreviations: brd. = broad; M = medium; Shd. = Shoulder; S strong; V = very; W = weak.
Further chemical and physical properties of the antibiotics Verdamicin I and G-418 are given in the following Tables VIII and IX:
Table VIII
Antibiotic classification tests
Ninhydrin Sakaguchi Hypochlorite Elson Mor
Spray reagent strength KI gan test Verdamicin I positive negative positive negative sulfate antibiotic positive negative positive negative G418 sulfate
Table IX
Solubility (terminology according to U.S. Pharmacopeia XVIII, page 8) Solution Verdamicin I Verdamicin I Antibiotic Antibiotic Sulphate G418 cum G-418
Sulphate methanol little insoluble little insoluble soluble soluble chlorine little very little very little very little form soluble soluble soluble soluble benzene very little insoluble insoluble insoluble soluble
The microbiological sample of antibiotic G-418 is <RTI
ID = 7.21> Standard disc-plate sample using Difco Antibiotic Medium No. 5 and Bacillus subtilis A.T.C.C. 6633 as a test organism. The physical conditions of the test are essentially those described by Grove and Randall for Neomycin in Assay Methods of Antibiotics, published by Medical Encyclopedia Incorporated (1955). The test was carried out against a standard preparation of antibiotic G-418 with a specific potency of 1000 mcg / mg. A Milcrogram of the standard results in an inhibition zone of 16,511.5 mm in the test.
The standard antibiotic sulfate salt gives about 750 mcg / mg against the standard antibiotic base.
The microbiological sample of verdamicin 1 and other antibiotics produced using M. grisea is a disk plate sample, using Staphylococcus aureus ATCC 6538P as the test organism. The physical conditions of the sample are similar to those described for gentamicin [Oden et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, (1963) American Society for Micrnbiologyj. The normal Verdamicin I Base has a certain potency of 1000 mcg / mg. One mcg of the standard at the conditions of this sample creates a zone of inhibition of 17.0 to 1.3 mm.
Verdamicin I Base yields 1000 mcg / mg in the iSentamicin sample and the curve of the response doses of Verdamicin runs parallel to that of gentamicin. Verdamicin I sulfate gives 674 mcg [mg in the gentamicin sample and 695 mcgimg against its own base as a comparison standard.
The novel antibiotics Verdamicin I and G418 obtainable according to the invention are basic and form acid addition salts with organic and inorganic acids. Examples of such acids are sulfur, hydrogen chloride, phosphorus, toluene-p-sulfone, amber, maleic, vinegar and ropion -, cyclopropane carbon, adamantane carbon; Furoic, benzoic and phenylacetic acid; the salts also include the alkali metal derivatives of the antibiotic salts of dibasic or tribasic acids.
In general, the salts are water soluble and can be formed by treating an aqueous solution of the antibiotic with a stoichiometric amount of acid and lyophilizing the resulting solution. The salts are also obtained from an aqueous solution by the addition of water-miscible organic solvents, such as. B. lower alkyl ketones (e.g. acetone), lower alcohols (e.g. methanol), cyclic ethers (e.g. tetrahydrofuran), or lower tert. Amides such as B.
Dimethylformamide and diethylacetamide, precipitated.
In the tables; and XI, the in vitro antibacterial activities of antibiotic G-418 against various gram-positive and gram-negative bacteria, using standard methods recognized in the art, are shown:
Table X
In Vitro Antibacterial Activity Medium: Tryptose Phosphate Broth pH 7.2 to 7.5 Organism MIC * (mcg / ml) Staphylococcus aureus 209P 0.8
Gray 7.5
Wood 0.8
Ziegler 0.8 Streptococcus sp. C> 25
C203 17.5
Escherichia coli Sc 3.0
894 7.5
Klebsiella pneumoniae DA20 3.0
Pseudomonas aeruginosa VA6 3.0
37 17.5 * Minimal inhibitory concentration.
Table XI In Vitro Antibacterial Activity (Mueller-Hinton Broth pH 7.2-7.5) Organism MIC (mcg / ml) Bacillus subtilis 6633 3.0 Staphylococcus aureus 12 3.0
1257 0.3
Sm 1 0.3
6 0.3
23 0.3
26 3.0
32 7.5 Streptococcus sp. 30 7.5
27 7.5 16 245 7.5
6589 7.5
3045 7.5 Escherichia coli 777 3.0
887 3.0 Pseudomonas aeruginosa 1262 17.5
1236 17.5
20 3.0
83 7.5 Proteus mirabilis 12 453 7.5 morganii 8019 0.8 rettgeri 9250 0.3
Table XII shows the antibacterial results obtained with antibiotic G418 in vivo. The animals used to obtain the results were Carworth Farms CF-1 mice, weighing approximately 18-20 g, divided into groups of 7. In vivo protection (PD50) is determined by injecting the mice intraperitoneally with a lethal dose of pathogenic bacteria .
One group of mice serves as a control; the other groups receive various single doses of antibiotic G418 an hour later. The unprotected control animals die in 18 to 24 hours. The test ends 48 hours after infection and the numbers of live mice in each group that received antibiotic G418 are counted. The results are analyzed using standard statistical methods in order to determine PDs0 values with 95% confidence limits.
Table XII
Antibacterial effectiveness in vivo
A. Protective effect organism way PD50 (mg / kg) Staphylococcus aureus Gray S.C. 2.5
Oral 40
Escherichia coli Sc. S.C. 1.5
Staphylococcus aureus St.M. S.C. 3.0
Number 1
Pseudomonas aeruginosa No. 1S.C. 5.0
B. Acute toxicity route LD50 (mg / kg)
I.V. 140
Table XIII shows in vivo test results which illustrate the antiprotozoal effectiveness of antibiotic G418. The carriers for the tests were weaned male Royal Hart rats (3 to 4 weeks old) weighing about 50 to 70 g.
The test procedure is a modification of one of R. J.
Schnitzer on pages 355-443 in Experimental Chemotherapy Volume 1, Academic Press, New York (1963).
Table XIII Oral efficacy of antibiotic G418 and reference substances against experimental Cecal E. Histolytica infections in rats.
Preparation Oral dose days Parasite A.D.I. * mglkg / day treats cures / total antibiotic 25 6 19/19 0 G418 12.5 6 24/24 0
10 3 7/7 0
10 1 4/7 0.7
6.5 6 4/4 0
6.5 3 4/5 0.4
6.5 1 2/5 1.0
3.5 6 5/6 0.2
3.5 3 0/7 1.7 preparation Oral dose days Parasite A.D.l.
mglkgTag treatmentological d-It curesffotal paromomycin 25 6 6/7 0
12 6 4/8 0.8
10 3 2/6 1.0
10 1 0/7 2.1
6.5 6 2/4 1.3
6.5 3 1/5 1.0
6.5 1 0/4 1.0
3.5 6 1/6 1.5
3.5 3 1/7 1.9 metronidazoles 25 6 1/5 0.8
13 6 2/6 0.8
6.5 6 1/4 0.8
6.5 3 0/3 1.7
6.5 1 0/4 1.5 controls treated with 6 4/45 2.2 water * A.D.I. means the average degree of infection based on gross observation of pathological changes in the cecum and microscopic observation of the number of amoebae found. These observations are recorded on a scale from zero to four, with zero representing an essentially normal cecum. Untreated but infected controls score around 2 to 4.
In the data shown, the controls averaged 2.2.
Verdamicin I shows a broad spectrum of antibacterial activity in in vitro tests against representative gram-positive and gram-negative bacteria. It is effective against kanamycin-resistant bacteria, but appears to overlap with gentamicin. The antibiotic shows no significant in vitro activity against yeast.
Table XIV shows the minimum inhibitory concentration of verdamicin I sulfate against representative species of bacteria and yeast. The experiments were carried out in yeast-meat broth (pH 7.4), the inhibition being determined after 24 hours. Results with gentamicin sulfate are given for comparison.
Table XIV
Minimum Inhibitory Concentration-MlC (mcg / ml)
Verdamicin I sulfate gentamicin organism 24 hours 48 hours sulfate
24 hours Staphylococcus 0.3 0.75 0.1 aureus 209P Streptococcus 0.75 3.0 3.0 pyogenes C Streptococcus 0.3 0.75 1.0 pyogenes 6 Aerobacter aero-0.3 0.3 0.6 genes 3 Aerobacter aero- 0.3 0.3 0.3 genes 4 Escherichia 0.3 0.75 0.75 coli Sc Escherichia 0.3 0.75 0.3 coli 5 Escherichia 0.3 0.3 0.3 coli 19 Klebsiella 0.3 0.3 0.3 pneumoniae Ad KR *
Verdamicin sulfate gentamicin organism 24 hours 48 hours sulfate
24 hours Klebsiella 0.3 0.3 0.3 pneumoniae 17 KR Proteus 0.3 0.3 0.3 mirabilis MeF Proteus 0.3 03, 03,
vulgaris 2 Pseudomonas 0.075 0.3 0.3 aeruginosa 8689 Pseudomonas 0.75 0.75 0.5 aeruginosa Miller Salmonella 0.3 0.75 1.0 paratyphi B1 Salmonella 0.3 0.3 0.5 paratyphi B2 Candida> 10> 10> 50 albicans 406 Candida> 10> 10> 50 albicans 401 Candida> 10> 10> 50 albicans 411 Saccharomyces> 10> 10> 50 cerevisiae * KR = kanomycin resistant
Verdamicin I was tested in vivo against four (4) species of in fectious bacteria in mice, a lethal amount of pathogen being administered as a single subcutaneous dose one (1) hour after infection by means of traperitoneal injection. One group of mice serves as a control; the other groups received different doses of Verdamicin I.
The unprotected controls died in 18 to 24 hours. The experiment ends 48 hours after infection, and the
Number of live mice in each group that received Verdamicin I were counted. The results were analyzed using standard statistical methods and PDs0 values were determined with 95% confidence limits.
Table XV shows the results of these in vivo experiments, which show that Verdamicin I is a potent antibacterial agent against gram-positive and gram-negative organisms. For comparison, results obtained with gentamicin are shown. Table XV also gives the acute toxicity of Verdamicin I when administered intravenously.
Table XV
Protective effect in mice PD50 (mg / kg) Organism Path Verdamicin I Gentamicin Staphylococcus S.C. 2.5 2.4 aureus Gray Streptococcus S.C. 1.0 5.0 pyogenes C Escherichia S.C. 1.5 1.7 coli 10536 Pseudomonas S.C. 2.0 1.7 aeruginosa 8689
Acute toxicity in mice
Way LD50 (mg / kg) i.V. 75
The antibiotic mixture obtained by culturing Micromonospora grisea, which mainly comprises verdamicin I, sisomicin, antibiotic G418 and gentamicin A, shows a broad spectrum of antibacterial activities when tested in vitro against gram-positive and gram-negative bacteria. Table XVI shows the minimum inhibitory concentrations of the antibiotic mixture against representative species of bacteria and yeast. The experiments were carried out in yeast-meat broth (pH 7.4).
Table XVI Organism MIC (mcg / ml)
Bacillus subtilis 6633 0.03
Staphylococcus aureus 209P 0.8
Staphylococcus aureus G 0.3
Streptococcus pyogenes C 3.0
Escherichia coli 10536 0.8
Escherichia coli 3 0.8
Klebsiella sp. 803 0.8
Proteus sp. 126 0.8
Proteus sp. McFadden 0.3
Pseudomonas aeruginosa Sc 0.3
Pseudomonas aeruginosa 13 0.3
Salmonella sp. Sc 3.0
As indicated above, Antibiotic G418 and Verdamicin I and their pharmaceutically acceptable acid addition salts are potent antibiotics that counteract the growth of Gram-positive and Gram-negative microorganisms. You are e.g. B. effective against Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, Eschecheria coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus and Pseudomonas.
Furthermore, antibiotic G-418 impairs the growth of helminths such as B. Syphacia obvelata and Hymenolepsis nana, and protozoa, especially parasitic protozoa such. B. Trichomonas vaginalis and Entamoeba histolytica.
However, both antibiotics are ineffective against yeast and filamentous fungi such. B. Saccharomyces, Candida, Aspergillus and Trichophyton.
The antibiotics and their pharmaceutically acceptable acid addition salts can be used under in vivo or in vitro conditions. They can be used to prevent the growth or destruction of sensitive species of the organisms described above and, in conjunction with soaps and detergents, to remove such organisms from the surfaces of laboratory equipment, surgical instruments, laboratory glassware, and the like. In view of their in vivo effectiveness, the antibiotics and their pharmaceutically acceptable acid addition salts can be used to kill or prevent the growth of sensitive organisms in mammals, e.g. B. in mice, rats, cats, dogs and cattle.
The antibiotics and their pharmaceutically acceptable acid addition salts can also be used in the treatment of diseases caused by susceptible organisms in humans.
To prepare for their in vivo use, an antibiotic selected from antibiotic G418 and verdamicin I and their pharmaceutically acceptable acid addition salts is brought into a form suitable for therapeutic administration, e.g. B. by mixing with a pharmaceutical carrier or binder. The invention therefore provides pharmaceutical compositions which contain as an active ingredient at least one compound selected from antibiotic G418 and verdamicin I and their pharmaceutically acceptable acid addition salts, together with a pharmaceutical carrier or binding agent. The compositions may be in the form of a unit dose, e.g. B. a molded product.
However, the compositions are preferably in the form of injectable preparations in ampoules or ointments, creams or lotions.
example 1
Production of the antibiotic agent M. grisea in shake flasks.
a) Preparation of the inoculum: A 300 ml bottle containing 100 ml of the following sterile medium is inoculated with M. grisen: Medium A.
Meat extract 3g tryptose 5g yeast extract 5g dextrose 1g starch 24 g calcium carbonate 2 g tap water 1000 ml
The bottle is incubated with continuous shaking on a rotary shaker at 250 to 300 rpm (revolutions per minute) at 25 to 35 until substantial growth is achieved. This usually takes 1 to about 4 days.
b) Fermentation: A 2.0 liter bottle containing 500 ml of the medium below is inoculated with 5% of the inoculum prepared in step a).
Medium B.
Soybean meal 30 g dextrin 50 g calcium carbonate 7 g dextrose 5 g tap water 1000 ml
The inoculated medium is fermented in a temperature range of about 26 "C to about 35" C for about 4 to about 7 days with continuous shaking on a rotary shaker at 200-300 rpm. The fermentation is checked periodically after the first 48 hours to determine when the peak antibiotic activity has been reached, and from this point on the fermentation is worked up according to the procedure of Example 4.
Example 2 14 liter tank fermentation of M. grisea a) Germination stage: A 25 ml portion of the inoculum prepared as in Example 1 is placed in a 21 Erlenmeyer bottle containing 500 ml of sterile inoculum medium. The inoculum is incubated for about 2 to about 4 days with continuous shaking at about 280 rpm at about 28 ° C.
b) Fermentation stage: the full contents of the germinating bottle are placed in a 14 liter fermentation vessel containing 10 liters of sterile medium B. The fermentation mixture is incubated at about 35 "C with constant shaking at about 250-500 rpm for about 90 hours. The pH is maintained between 7.2 and 8.3 during the fermentation, while the culture medium at about 3 to about 5 The fermentation mixture is periodically checked after the first 48 hours to determine when the peak antibiotic activity is reached and from this point on the fermentation is worked up according to the procedure of Example 3.
Example 3
95 liter (25 gallon) tank fermentation of M. grisea inoculum stage Medium C yeast extract 5.0 g meat extract 3.0 g tryptone 5.0 g potato starch 24.0 g cerelose 1.0 g calcium carbonate 1.0 g water 1.0 liter
1.0 liter of medium C is made with the above composition. The pH is adjusted to 7.3 and 0.5 liter aliquots are placed in 2 liter Erlenmeyer bottles. The medium is sterilized for 45 minutes at 121 "C. It is then cooled to room temperature and each bottle is inoculated with 5 ml of an M. grisea culture. Each bottle is incubated for 72 hours in a rotary shaker (200 rpm) at 30" C.
The inoculum (25 ml per bottle) is added to 0.5 liters of sterile medium C and each bottle is incubated for 48 hours on a rotary shaker at 30 ° C. 5.0 liters of this inoculum are combined and added to 90 liters of sterile medium C. , the temperature was brought to 30 ° C, the pH to about 7.3-7.7. the ventilation is about 1-2 cubic feet (28-56 liters) per minute, and the shaking is about 200-400 rpm.
The fermentation is continued for about 100 to about 130 hours until the peak of the antibiotic activity is reached, and then the fermentation is worked up according to Example 4.
Example 4
Isolation of the antibiotic complex
About 400 g of oxalic acid are added to 60 liters of the fermentation broth prepared according to Examples 1 to 3 with vigorous shaking. The pH of the fermentation mixture is adjusted to 2.0 with 6N sulfuric acid and it is shaken for about 20 minutes. The acidified fermentation mixture is filtered and the filtrate retained. The mycelial cake is washed with tap water and the wash liquid is combined with the filtered broth. At this point it is advantageous to combine the filtrates and washes from about 60 liters of fermentations (i.e. about 180 liters). The combined filtrates and washing liquids are neutralized with 6N ammonium hydroxide (you need about 500 to about 900 ml).
The antibiotic complex is adsorbed onto IRC-50 in the ammonium form by passing the neutral broth through a resin column 2 "high (5.1 x 65.6 cm). The flow rate is set to about 175-200 minutes until all the broth has been processed. The column is washed color-free with deionized water (approx. 20 liters). The antibiotic complex is desorbed with 2N ammonium hydroxide at a rate of approx. 80 ml / minute, then with deionized water when the pH- The value of the eluate has reached 10. The eluate is concentrated in vacuo to about 1 liter and lyophilized in order to obtain the antibiotic complex. If the eluate is strongly colored, a treatment with IRA-401S can be carried out.
This treatment is usually carried out by passing the eluate from the previous column through a column of IRA401S (1 "diameter x 20" height; i.e., 2.54 x 50.8 cm) at a rate of about 120 minutes. The IRA401S column is washed free of antibiotic and the eluate and the washing liquid are concentrated as described above.
Example 5 A. Preparation of the sulfate salt of the antibiotic complex
37 g of the crude complex base obtained according to Example 4 are dissolved in 1000 ml of water and the pH is adjusted to 4.5 with sulfuric acid. The solution is stirred with Darco G60 for about 1 hour and then filtered. The filtrate is concentrated to about 100 ml and added to an excess of methanol. The resulting precipitate of the mixed sulfate is filtered off and dried under vacuum.
B. Conversion of the sulfate salt into the antibiotic complex base
The mixed sulfates obtained in step A are suspended in 1000 ml of chloroform and ammonia gas is bubbled through the suspension for about 1 hour. The mixture is filtered and the filtrate evaporated to dryness to obtain the antibiotic complex base.
Example 6
Isolation of Verdamicin I, Sisomicin, Antibiotic G418 and Gentamicin A.
12 lb (5.45 kg) of silica gel are in the lower phase of a solvent mixture consisting of isopropanol: chloroform: conc. Ammonium hydroxide (1: 2: I v / v) suspended. The suspension is placed on a chromatographic column with an internal diameter of about 4 "(10.2 cm). 100 g of the antibiotic complex obtained in Example 4 are added to about 1.0 liter of the lower phase of the solvent system used to prepare the chromatographic column The suspension thus obtained is filtered and the insoluble parts are retained for further treatment The filtrate is concentrated to about 1.0 liter before it is applied to the column.
With heating and stirring, the previously obtained insoluble material (about 66 g) is dissolved in methanol and then filtered to remove the inorganic material present (about 6 g). The methanolic solution is cooled in air and filtered again in order to remove most of the slightly soluble gentamicin A carbonate.
The antibiotic complex, from which most of the gentamicin A has been removed, is adsorbed onto the silica gel column prepared as above, and the chromatogram is developed with the solvent mixture, taking 2.0 liter fractions with the column at full flow.
When the sisomicin is desorbed (which usually requires from about 90 to about 100 fractions) the ratio of solvents is changed to 1: 1: 1 and elution continues until the remaining material is desorbed. When performing the separation of the antibiotic complex on a column of this size, the number of fractions collected is generally about 250 to 350. Each fraction is spotted on filter paper and tested with ninhydrin reagent to determine the presence or absence of antibiotic, i.e. H. Ninhydrin-positive material.
Those fractions which contain antibiotic substances are subjected to a paper chromatography in a system consisting of chloroform: methanol: 17% ammonium hydroxide (2: 1: 1 v / v), which is followed by a bioautography against Staphylococcus aureus ATCC 6538P determine which fractions contain the same antibiotic. The fractions are combined according to the determination made by means of chromatography and bioautography, the combined fractions are concentrated in vacuo to about 100 ml and then lyophilized.
The distribution of the antibiotics from the column is essentially as follows: Fractions Antibiotics 1-65 inactive organic
Materials 66-87 verdamicin I 88-91 sisomicin 119-259 antibiotic G418 259-end residual gentamicin A
Example 7
Preparation of Verdamicin-I-Sulphate
500 mg of the Verdamicin I prepared according to Example 6 are dissolved in 90 ml of water and the pH of the solution is adjusted to 4.5 with dilute sulfuric acid. The solution is stirred with 1 to 2 g of decolorizing charcoal (Darco G-60) for about 30 minutes and then filtered. The filtrate is concentrated in vacuo to about 10 ml and poured into about 100 ml of methanol with stirring. The resulting suspension is filtered, the solid product washed with fresh methanol and then dried, about 450 mg of Verdamicin I sulfate being obtained.
Example 8 Preparation of the Verdamicin-I hydrochloride
400 mg of the Verdamicin I prepared in Example 6 are dissolved in about 75 ml of water and the pH of the solution is adjusted to 4.5 with dilute hydrochloric acid. The solution is stirred with 1 to 2 g of decolorizing charcoal (Darco G-60) for about 30 minutes and then filtered. The filtrate is stirred in vacuo for about 30 minutes and is concentrated in vacuo to about 75 ml and poured into 150 ml of a methanol: acetone (1: 2 v / v) mixture with stirring. The resulting suspension is filtered, the solid product is washed with fresh acetone and dried, about 300 mg of verdamicin I hydrochloride being obtained.
The above procedure is of general applicability and can be used with an equivalent amount of the acids previously described to form non-toxic acid addition salts, which are the functional equivalents of Verdamicin I hydrochloride and Verdamicin Isulfate.
Example 9 Preparation of Verdamicin I Base
390 mg of the Verdamicin-I-sulfa prepared as in Example 7 are dissolved in 10 ml of water. An IRA-401S column (Amberlite anion exchange resin, Rohm and Haas) with the following dimensions is prepared: height 25 cm, outer diameter 2 cm. The antibiotic solution is fed to the resin column and eluted with deionized water until the eluate does not react with ninhydrin. The eluate is concentrated to about 25 ml and then lyophilized, 230 mg of Verdamicin I being obtained.
Example 10 Preparation of Antibiotic G-418 Sulphate
2.6 g of the antibiotic G-418 are dissolved in 250 ml of water and the pH of the solution is adjusted to 4.2 with dilute 1-6 n) sulfuric acid, 5 g of Darco G-60 are added to the solution and it becomes stirred for about an hour at room temperature. The suspension is filtered and the filtrate is concentrated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in 20 ml of water and the solution is added dropwise to 500 ml of methanol with vigorous shaking. The resulting suspension is filtered, the solid product washed with methanol and dried at about 40 ° C. in vacuo, with 3.36 g of antibiotic G-418 sulfate containing about 700 mcg / mg.
Similarly, by replacing the sulfuric acid with an equivalent amount of another inorganic or organic acid and using acetone as the precipitating agent, other acid addition salts can be prepared.