CH558363A

CH558363A - Verfahren zur selektiven gewinnung von vinblastin, vinleurosin und vincristin oder deren salzen.

Info

Publication number: CH558363A
Application number: CH1365771A
Authority: CH
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1971-09-15
Filing date: 1971-09-15
Publication date: 1975-01-31

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Gewinnung folgender drei dimerer Alkaloide von Vinca rosea L.

(Catharanthus roseus G. Don) in Form der Basen oder von Salzen; Vincaleukoblastin (VLB; allgemein bekannter Name: vinblastine; im weiteren Vinblastin), Leurosin (VLR; allgemein bekannter Name: vinleurosine; im weiteren Vinleurosin) und Leurocristin (VCR; allgemein bekannter Name: vincristine; im weiteren Vincristin).

In letzter Zeit arbeiten die Pharmakologen in aller Welt mit beträchtlicher Intensität an der Herstellung zytostatisch wirkender, zur medizinischen Behandlung von Krebskranken geeigneten Verbindungen. Zu den bedeutendsten Ergebnissen dieser Forschungen gehört die Auffindung der dimeren Alkaloide von Vinca rosea L. und deren Einführung in die Therapie. Diese Präparate haben sich seit nun schon beinahe einem Jahrzehnt in der klinischen Praxis auf dem Gebiet der Onkologie als die verhältnismässig wirksamsten Mittel erwiesen.

Das Vinblastin ist ein seit 1959 bekanntes Oncolyticum, dessen klinische Anwendung eine beträchtliche Verminderung der Zahl der weissen Blutkörperchen im Blut zur Folge hat. Es erwies sich als wirksam bei der Hodgkin-Krankheit, bei akuter Leukämie und auch bei resistentem Choriocarcinom [z.B.

Johnson, I.S., Wright, H.F., Svoboda G.H. und Vlantis, J Cancer Res. 20 (1960) 1016].

Die Wirkung des Vinleurosins ist noch weniger bekannt.

Das Wirkungsgebiet scheint das gleiche wie das des Vinblastins zu sein [Johnson u.M.: Cancer Res. 23 (1963) 1390; Antitumoral effects of Vinca rosea alkaloids. Proceedings first symposium of the G. E. A. Excerpta Medica Foundation, Amsterdam 1966].

Vincristin wurde erstmals von G. H. Svoboda beschrieben bzw. isoliert [Svoboda, G. H.: Alkaloids of Vinca rosea (Catharanthus roseus) IX. Extraction and Characterisation of Leurosidine and Leurocristine. Lloydia 24 (1961)173-178].

Es stellte sich bald heraus, dass dieses neue Alkaloid, obgleich es hinsichtlich seiner Wirkung dem früher aufgefundenen Vinblastin gleicht, vom pharmakologischen Standpunkt aus wesentlich vorteilhafter ist. Bei In-vitro-Versuchen unterbindet Vincristin die Mitose neuplastischer Zellen in der Metaphase [z.B. Cardinali, G., Aboul Enein, M. I. M.: Studies on the Antimitotic Action of Leurocristine (Vincristine). Blood 21 (1963) 102]. Bei der klinischen Anwendung hat sich Vincristin im Vergleich zu den bisher bekannten Chemotherapeutica in Fällen von akuter Leukämie im Kindesalter als sehr vorteilhaft erwiesen. Während früher bei den meisten Fällen dieser Krankheit keine therapeutischen Erfolge erzielt werden konnten, kann jetzt durch Vincristin ungefähr in der Hälfte der Fälle eine völlige Remission erreicht werden [z.B. Haggard, M.

E.: Vincristine (NSC-67574/ therapy for Acute Leukemia in Children. Canc. Chemother. Rep. 52 (1968) 477], dem Vincristine kommt also eine lebensrettende Bedeutung zu. Bei bösartigen Hartgeschwulsterkrankungen im Kindesalter konnten ebenfalls in 65 von 94 Fällen eine bedeutende Regression erreicht werden [Selavry, O., Holland, J. F. und Wolman, I. J.: Canc. Chemother. Rep. 52 (1968) 497].

Die vom pharmakologischen Standpunkt aus in Frage kommenden dimeren Alkaloide von Vinca rosea, Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin, sind Minor-Alkaloide der Pflanze, d.h.

von den mehr als 60 in der Pflanze vorkommenden Alkaloiden gerade solche, die nur in sehr geringen Mengen zugegen sind.

Vinblastin und Vinleurosin machen zusammen nur 1-2% der Menge der Gesamt-Alkaloide der Pflanze aus, Vincristin kommt sogar nur in noch um zwei Grössenordnungen geringeren Konzentrationen vor. Es ist daher verständlich, dass deren Abtrennung von den anderen Alkaloiden, Gewinnung und Herstellung in einer für Arzneimittel zu fordernden Reinheit ein sehr sorgfältiges Verfahren erfordert, das wesentlich komplizierter als die für die Abtrennung der Alkaloide bekannten Methoden ist.

Es sind zahlreiche Verfahren zur Gewinnung von Vinblastin und Vinleurosin sowie Vincristin bekannt [Nobel, R. L. und Mitarb.: Ann. N.Y. Acad. Sci. 76 (1958) 882; britische Patentschrift Nr. 870 723; US-Patentschrift Nr. 3 097 131 und 3 205 220; Svoboda, G. H. und Mitarb.: J. Am. Assoc. Sci. ed.

48 (1959) 659; ungarische Patentschrift Nr. 153 200 und
154 7.15; belgische Patentschrift Nr. 624 046], die alle auf einem sauren oder basischen Aufschluss der getrockneten Droge bzw. auf einer sauren oder basischen Vorbehandlung, auf der Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, auf der bei einem oder zwei verschiedenen pH-Werten erfolgenden Überführung der Alkaloide aus wässriger Lösung in das organische Lösungsmittel und schliesslich auf der chromatographischen Fraktionierung des in das organische Lösungsmittel überführten Alkaloidgemisches beruhen.

Obwohl im Verlaufe der weiteren Entwicklung die drei pharmakologisch verwendbaren dimeren Alkaloide mit den angeführten Methoden in immer besserer Qualität und immer besseren Ausbeuten aus der Droge isoliert werden konnten, bereitet der mehrfache Phasenwechsel, aber hauptsächlich die komplizierte chromatographische Trennung noch immer Schwierigkeiten bei der technischen Anwendung dieser Verfahren. Die Kompliziertheit der chromatographischen Trennung ist leicht an der Tatsache zu erkennen, dass die drei dimeren Alkaloide Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin, deren Anteil an der mehr als 60 Alkaloide enthaltenden Gesamtalkaloidmenge 1-2% beträgt, angereichert werden müssen, danach zu isolieren und schliesslich in einer der Verwendung als Arzneimittel entsprechenden Reinheit herzustellen sind.

Die chromatographische Trennung der Gesamt-Alkaloide ist eine sehr umständliche, langwierige und grosse Sorgfalt beanspruchende Operation und erfordert chromatographische Trennsäulen von sehr grossen Dimensionen. Die Grösse der chromatographischen Einrichtung wird ausser durch die Masse der Trennsäule auch gut durch die Menge des zur Trennung zu verwendenden Al203 gekennzeichnet: nach der ungarischen Patentschrift Nr. 154 715 sind zur Gewinnung von aus einer Tonne Droge erhaltbaren 150 g Vinblastin 240 kg Al203 notwendig.

Die Erfindung ermöglicht gegenüber den bisher bekannten Verfahren eine wesentliche Vereinfachung bzw. eine Ausschaltung der Nachteile der auf mehrfachem Phasenwechsel und auf einer komplizierten chromatographischen Trennung beruhenden Verfahren, eine beträchtliche Verminderung der Ausmasse der chromatographischen Einrichtung und weiterhin die gleichzeitige Gewinnung der drei darzustellenden dimeren Alkaloide in besseren Ausbeuten als bisher und in entsprechender Qualität. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass aus dem aus der Droge hergestellten, grosse Mengen roher Alkaloide enthaltenden Gemisch ein - überwiegend aus Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin bestehendes - Alkaloid Salz unmittelbar abzuscheiden ist, aus dem auf verhältnismässig einfache Weise die obigen Komponenten zu gewinnen sind.

Während der Versuche wurde nämlich festgestellt, dass diese drei dimeren Alkaloide abweichend von dem bisherigen Verfahren auf wesentlich einfachere Art zu gewinnen sind, wenn diese vor der chromatographischen Trennung angereichert werden und man dieses angereicherte, die gewünschten dimeren Alkaloide zu etwa 70% enthaltende Alkaloid-Konzentrat chromatographiert. Die Anreicherung ist derart auszuführen, dass die Droge mit neutralem, wässrigem Methanol ausgelaugt wird, ohne die Droge vor oder während der Extraktion einer basischen oder sauren Behandlung zu unterwerfen.

Aus dieser heiklen, sich leicht zersetzenden, bei der Aufarbeitung des Auszuges gewonnenen Alkaloidmasse können die drei dimeren Alkaloide vom überwiegenden Teil der begleitenden Alkaloide in Form von Säureadditionssalzen, vorteilhafterweise in Form der Sulfatsalze, abgetrennt werden. Auf diese Weise ist die Konzentration dieser Verbindungen 30-40 mal höher als in den bei den bisher bekannten Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung kommenden Alkaloid Gemischen. Die chromatographische Trennung ist somit viel einfacher und mit wesentlich kleiner dimensionierten Trennsäulen zu erreichen, weil die gewünschten dimeren Alkaloide von nur in kleinen Mengen vorliegendem Begleitmaterial abzutrennen sind.

Die vorteilhafte Vereinfachung und die Verkleinerung der Säulenausmasse bei der nach dem erfindungsgemässen Verfahren auszuführenden chromatographischen Trennung kann wieder am einfachsten durch die AhOs-Menge gekennzeichnet werden, die für die Fraktionierung des aus einer Tonne der Droge zu erhaltenden Alkaloid-Gemisches erforderlich ist: diese Menge beträgt bei dem erfindungsgemässen Verfahren etwa 20 kg, während bisher 240 kg benötigt wurden.

Die Erfindung ist also ein Verfahren zur selektiven Gewinnung von drei dimeren Alkaloiden aus Vinca rosea L., Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin, oder deren Säureadditionssalzen durch Auslaugen der Droge mit wässrigem Methanol, Einengung des Auszuges bis praktisch zur Methanol-Freiheit, Ansäuern der eingeengten Lösung, Filtration von den durch Ansäuern gefällten Begleitstoffen, Auslaugung der sauren, wässrigen Lösung unter Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, Alkalisierung der die Alkaloide enthaltenden sauren, wässrigen Phase, Ausziehen der Alkaloide mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln und Eindampfen der wasserfreien, organischen Lösung bis zur Trockne unter Erhalt eines Alkaloid-Gemisches und Gewinnung der Alkaloide durch Chromatographieren mit teilweise desaktiviertem Apo3, dadurch gekennzeichnet,

dass die Droge mit neutralem Methanol ausgelaugt wird und das Alkaloid-Gemisch in höchstens 10% Säure enthaltendem Äthanol gelöst wird und das Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin in Form von Säureadditionssalzen kristallisiert und das nach Filtrierung noch geringe Mengen von Begleitstoffen enthaltende Salzgemisch entweder a) in Form der Säureadditionssalze oder b) in Form der nach Alkalisierung der Säureadditionssalze freigesetzten Basen an mit Wasser teilweise desaktiviertem Al203 chromatographiert, danach fraktioniert eluiert wird, und aus den Eluatfraktionen Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin oder deren Säureadditionssalze gewonnen werden.

Die praktische Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt vorteilhafterweise auf folgende Art:
Man laugt die gemahlene Droge (Vinca rosea L.) mit 5 bis 20%, vorteilhafterweise 10%, Wasser enthaltendem Methanol mehrmals aus und engt die filtrierten und vereinigten Auszüge unter vermindertem Druck bis zur Entfernung von praktisch des ganzen Methanols ein. Danach wird der wässrige Rückstand zur Entfernung der nicht zu den Alkaloiden gehörenden Begleitkomponenten mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert und der entstehende Niederschlag abfiltriert. Die saure wässrige Lösung wird mehrmals mit Benzol ausgelaugt, danach die abgetrennte, saure wässrige Phase alkalisch gemacht und die alkalische wässrige Lösung ebenfalls mit Benzol mehrmals bis zur Alkaloid-Freiheit ausgelaugt.

Die bei dem Auslaugen der alkalischen wässrigen Lösung erhaltenen, vereinigten benzolischen Lösungen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält so ein braunes amorphes Alkaloid-Gemisch von lockerer Struktur. Das Alkaloid Gemisch wird in höchstens 10% Schwefelsäure enthaltender äthanolischer Lösung aufgelöst, wobei zugleich der pH-Wert der Lösung auf 4,0-5,0 eingestellt wird. Die Lösung wird mit Kristallen der dimeren Alkaloidsulfate angeimpft und die Kristallisation durch Ankratzen der Gefässwand in Gang gebracht, danach lässt man 2 Tage lang bei Zimmertemperatur kristallisieren. Das ausgeschiedene und abfiltrierte, aus den Sulfaten von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und begleitenden Alkaloiden bestehende Kristallgemisch wird gelöst und direkt chromatographiert.

Zum Lösen und zur Eluierung wird eine Methylenchlorid-Chloroform-Mischung im Verhältnis 2:1, zur chromatographischen Trennung eine mit Wasser teilweise inaktiviertes Al203 enthaltende Trennsäule verwendet. Die Fraktionen 1 bis 3 enthalten den überwiegenden Teil der noch zugegenen Begleitalkaloide, die Fraktionen 2 bis 9 Vinblastin und Vinleurosin. Vincristin beginnt in Spuren in der 9. Fraktion zu erscheinen und die Elution ist mit der 18. Fraktion beendet.

Die Vinblastin und Vinleurosin enthaltenden Fraktionen werden zur Trockne eingedampft, danach löst man den Rückstand in Äthanol und nach dem Auskristallisieren des Vinleurosins wird Vinblastin aus der Mutterlauge mit höchstens 10% Schwefelsäure enthaltendem Äthanol in Form des Sulfates ausgefällt, abfiltriert und danach zur weiteren Reinigung umkristallisiert.

Die das Vincristin enthaltenden Fraktionen können auch aufgearbeitet werden, indem man den Trockenrückstand in Äthanol löst und das Vincristin auskristallisieren lässt, welches auf gleiche Weise wie oben, in verdünnter äthanolischer Schwefelsäure gelöst, durch Abscheiden des kristallinen Sulfates gereinigt wird.

Man kann auch so verfahren, dass man die Alkaloid-Basen chromatographiert. In diesem Fall wird das aus den Sulfaten von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und Begleitalkaloiden bestehende Kristallgemisch in Wasser gelöst und die Lösung mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,0-9,0 eingestellt.

Aus der alkalischen Lösung werden die Alkaloid-Basen mit Chloroform wiederholt ausgeschüttelt, die vereinigten Chloroform-Lösungen mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und danach unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das hauptsächlich die drei dimeren Alkaloide enthaltende Alkaloid-Basen-Gemisch wird in einer Benzol und Chloroform im Verhältnis 1:1 enthaltenden Mischung gelöst und an einer Trennsäule an mit Wasser teilweise inaktiviertem Al2O3 chromatographiert. Zur Eluierung wird ein Lösungsmittelgemisch gleicher Zusammensetzung verwendet. Die Fraktionen 1 bis 10 enthalten Vinblastin und Vinleurosin, die Fraktionen 13 bis 17 Vincristin. Die Aufarbeitung der auf papierbzw. dünnschichtchromatographischem Wege identifizierten Vinblastin und Vinleurosin bzw.

Vincristin enthaltenden Fraktionen erfolgt auf die weiter oben bereits beschriebene Weise.

Einzelheiten des erfindungsgemässen Verfahrens sind den folgenden Beispielen zu entnehmen:
Beispiel 1
100 kg der getrockneten, hauptsächlich aus Blättern bestehenden, gemahlenen Pflanze Vinca rosea L. (Catharanthus roseus G. Don) werden einmal mit 600 1 und zweimal mit je 400 1 90 %igem wässrigem Methanol ausgelaugt. Die filtrierten und vereinigten methanolischen Auszüge werden unter vermindertem Druck - praktisch bis zur Methanol-Freiheit - auf 140 bis 150 1 eingeengt. Danach säuert man zur Entfernung der verschiedenen extrahierten, nicht zu den Alkaloiden gehörenden Verbindungen mit dem gleichen Volumen 5 %iger wässriger Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von 2 an und filtriert den gebildeten, dunkelfarbigen Niederschlag ab.

Die filtrierte saure wässrige Lösung wird dreimal mit je 500 1 Benzol ausgelaugt und danach der pH-Wert der die Alkaloide enthaltenden, abgesonderten sauren wässrigen Phase mit konzentrierter wässriger Ammoniumhydroxid-Lösung auf 8,59,0 eingestellt. Danach laugt man die alkalische wässrige Lösung bis zur Alkaloid-Freiheit drei- bis viermal mit je 600 1 Benzol aus. Die vereinigte benzolische Lösung wird mit wasserfreiem Natriumsulfat oder Kaliumcarbonat getrocknet und danach filtrierte benzolische Lösung unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden etwa 700 g eines braunen Alkaloid-Gemisches von lockerer Struktur erhalten.

Das Alkaloid-Gemisch wird in höchstens 10% Schwefelsäure enthaltendem Äthanol gelöst, wobei darauf zu achten ist, dass der pH-Wert der Lösung zwischen 4,0-5,0 liegt. Die Lösung wird mit Vinblastinsulfat-Kristallen eingedampft und die Kristallabscheidung beginnt bald nach dem Ankratzen der Gefässwand. Man lässt zwei Tage lang bei Zimmertemperatur kristallisieren und filtriert danach die ausgeschiedenen Kristalle auf einem Glasfilter ab.

Die Ausbeute beträgt, abhängig von der Qualität der Droge, 20-100 g eines aus Vinblastin-, Vinleurosin- und Vincristinsulfat sowie aus den Sulfaten der Begleitalkaloide bestehenden Kristallgemisches. Das Kristallgemisch der rohen Alkaloid Sulfate wird in einem Methylenchlorid und Chloroform im Verhältnis 2:1 enthaltenden Gemisch gelöst, und zwar werden 7 ml pro g angewandt. Diese Lösung wird an einer mit der hundertfachen Menge, mit Wasser teilweise desaktiviertem Al203 gefüllten Säule chromatographiert und danach mit einem Methylenchlorid und Chloroform im Verhältnis 2 1 enthaltenden Gemisch eluiert. Es werden Fraktionen von 30-50 ml aufgefangen. Die ersten drei Fraktionen enthalten den überwiegenden Teil der Begleitalkaloide. Vinblastin und Vinleurosin werden in der 2. bis 9. Fraktion erhalten.

Vincristin beginnt in Spuren in der 9. Fraktion zu erscheinen und wird bis zur 18. Fraktion eluiert. Die auf papier- bzw. dünnschichtchromatographischem Wege identifizierten Vinblastin und Vinleurosin bzw. Vincristin enthaltenden Fraktionen werden getrennt zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 15-75 g eines Vinblastin und Vinleurosin bzw. 0,6-3,0 g eines Vincristin enthaltenden amorphen Trockenrückstandes.

Der Vinblastin und Vinleurosin enthaltende Trockenrückstand wird in der 15-fachen Menge wässrigen Äthanols gelöst.

Das Vinleurosin kristallisiert aus und wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Ausbeute: abhängig von der Qualität des Rohproduktes, 5-17 g Vinleurosin. Fp.: 2022050C; [a]2D6 = +720(CHCl3).

Die Mutterlauge des Vinleurosins, die nun nur noch Vinblastin enthält, wird mit wasserfreiem Äthanol auf das zweifache Volumen verdünnt und der pH-Wert der Lösung mit äthanolischer Schwefelsäurelösung auf 4,0 eingestellt. Die Kristallisation des Vinblastinsulfates beginnt schon während der Zugabe der äthanolischen Schwefelsäure. Man lässt dann 16 Stunden im Kühlschrank kristallisieren. Ausbeute: abhängig von der Qualität des Rohstoffes, 15-70 g rohes Vinblastinsulfat.

Das getrocknete und pulverisierte rohe Vinblastinsulfat wird bei Zimmertemperatur in der 20-fachen Menge wasserfreien Methanols gelöst und zu der filtrierten Lösung das vierfache Volumen wasserfreien Äthanols zugegeben. Zur vollständigen Kristallisation des Vinblastins lässt man die Lösung 16 Stunden im Kühlschrank stehen. Bei der Umkristallisation ist eine 90%ige Ausbeute zu erreichen. Ausbeute: abhängig von der Qualität des Rohstoffes, 13-63 g Vinblastinsulfat; [a]26 = -28 (CHCl3).

Zum Zwecke der Identifizierung wird Vinblastin in die Base überführt und aus dieser durch Umkristallisation in Äther Vinblastin-Ätherat hergestellt. Fp.: 201-211 C; [a]26 = + 420 (CHCl3).

Der auf chromatographischem Wege abgetrennte, Vincristin enthaltende amorphe Trockenrückstand von 0,6-3,0 g wird in der 10-fachen Menge wasserfreien Äthanols gelöst und der pH-Wert der Lösung mit äthanolischer Schwefelsäure auf 4,0 eingestellt. Zur vollständigen Kristallisation des Vincristinsulfates lässt man die Lösung 16 Stunden im Kühlschrank stehen.

Die Menge des abfiltrierten, rohen Vincristinsulfates beträgt 60-70% des gelösten, Vincristin enthaltenden amorphen Trockenrückstandes.

Zur Umkristallisation löst man das rohe Vincristinsulfat in möglichst wenig Äthanol gibt danach die vierfache Menge an Äthanol zu, lässt die Lösung zur Auskristallisation 16 Stunden im Kühlschrank stehen und filtriert. Ausbeute: 0,3-1,5 g Vincristinsulfat. Fp.: 21 8-220'C.

Man kann auch so verfahren, dass der auf chromatographischem Wege abgetrennte, Vincristin enthaltende amorphe Trockenrückstand von 0,6-3,0 gin der 5- bis 10-fachen Menge wasserfreien Methanols gelöst und die Vincristinbase zur Kristallisation gebracht wird, die auf die gleiche Art wie oben beschrieben in wasserfreiem Äthanol gelöst und durch Abscheidung als kristallines Sulfat gereinigt wird.

Beispiel 2
Das nach Beispiel 1 gewonnene, abhängig von der Qualität der Droge aus 20-100 g der Sulfate von Vinleurosin, Vinblastin, Vincristin und Begleitalkaloiden bestehende rohe Kristallgemisch wird in Wasser gelöst und die Lösung mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,0-9,0 eingestellt. Die Alkaloide werden viermal mit je 11 Chloroform aus der Lösung ausgeschüttelt, die vereinigten Chloroformlösungen mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert und danach unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 1680 g eines Gemisches der Alkaloid-Basen.

Diese Masse wird in der 3- bis fachen Menge eines aus Benzol und Chloroform im Verhältnis 1:1 bestehenden Gemisches gelöst und danach an einer mit etwa der 40-fachen Menge eines durch Wasser teilweise desaktivierten Al203 gefüllten Säule chromatographiert. Als Elutionsgemisch wird Benzol-Chloroform im Verhältnis 1:1 angewandt.

Nach dem Ablaufen der ersten 2 bis 10 1 des Eluats, die nur geringe Mengen von Begleitalkaloiden enthalten, werden Fraktionen von 0,6-3,0 1 aufgefangen. Die Fraktionen 1-10 enthalten Vinblastin und Vinleurosin, die Fraktionen 11 und 12 sind schon vinblastin- und vinleurosinfrei. Danach wird, abhängig von der Menge des aufgegebenen Kristallgemisches weiter mit 3 bis 18 1 des aus Benzol und Chloroform im Verhältnis 1:1 bestehenden Gemisches eluiert, wobei man Fraktionen von 0,6 bis 3,6 1 auffängt. Die Fraktionen 13-17 enthalten Vincristin.

Die Aufarbeitung der auf papier- bzw. dünnschichtchromatographischem Wege identifizierten Vinblastin und Vinleurosin bzw. Vincristin enthaltenden Fraktionen wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur selektiven Gewinnung von drei dimeren Alkaloiden aus Vinca rosea L., Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin, oder deren Säureadditionssalzen durch Auslaugen der Droge mit wässrigem Methanol, Einengung des Auszuges bis praktisch zur Methanol-Freiheit, Ansäuern der eingeengten Lösung, Filtration von den durch Ansäuern gefällten Begleitstoffen, Auslaugung der sauren, wässrigen Lösung unter Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, Alkalisierung der die Alkaloide enthaltenden sauren, wässrigen Phase, Ausziehen der Alkaloide mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln und Eindampfen der wasserfreien organischen Lösung bis zur Trockne unter Erhalt eines Alkaloid-Gemisches und Gewinnung der Alkaloide durch Chromatographieren mit teilweise desaktiviertem Apo3, dadurch gekennzeichnet,

dass die Droge mit neutralem Methanol ausgelaugt wird und dass das Alkaloidgemisch in höchstens 10% Säure enthaltendem Äthanol gelöst wird und das Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin in Form von Säureadditionssalzen kristallisiert und das nach Filtrierung noch geringe Mengen von Begleitstoffen enthaltende Salzgemisch entweder: a) in Form der Säureadditionssalze oder b) in Form der nach Alkalisierung der Säureadditionssalze freigesetzten Basen an mit Wasser teilweise desaktiviertem Al203 chromatographiert und fraktioniert eluiert wird, und aus den Eluatfraktionen Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin oder deren Säureadditionssalze gewonnen werden.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherung von Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin in Form der Sulfatsalze vorgenommen wird.

2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abscheidung von Vinblastin Vinleurosin- und Vincristinsulfat mit äthanolischer Schwefelsäure durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin in Form von Salzen, vorteilhafterweise in Form der Sulfatsalze, chromatographiert werden.

4. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin in Form der Basen chromatographiert werden.

5. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das an Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin angereicherte Salzgemisch in einem 2 1- Methylenchlorid-Chloroform-Gemisch gelöst und chromatographiert wird.

6. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1 bis 3 sowie 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Eluierung mit einem 2 : 1-Methylenchlorid-Chloroform-Gemisch durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das an Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin angereicherte Basengemisch in einem 1:1-Benzol-Chloroform- Gemisch gelöst und dann chromatographiert wird.

8. Verfahren nach Unteransprüchen 4 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Eluierung mit einem 1:1-Benzol- Chloroform-Gemisch durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Vinblastin und Vinleurosin oder deren Salze enthaltenden Fraktionen zusammen eluiert und diese beiden dimeren Alkaloide nachträglich getrennt werden.

10. Verfahren nach Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem nach der chromatographischen Trennung erhaltenen Vinblastin-Vinleurosin-Gemisch das Vinleurosin durch Lösen in wasserfreiem Äthanol und darauffolgende Kristallisation abgetrennt wird.

11. Verfahren nach Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Vinblastin aus der Mutterlauge des Vinleurosin in Form eines Säureadditionssalzes, zweckmässigerweise in Form des Sulfates gewonnen wird.

12. Verfahren nach Unteranspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Vinblastinsulfat mit äthanolischer Schwefelsäure abgeschieden und gegebenenfalls durch Umkristallisieren gereinigt wird.

13. Verfahren nach Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Vinblastinsalz die Alkaloid-Base in Freiheit gesetzt und gegebenenfalls gereinigt wird.

14. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Vincristin enthaltenden Fraktionen durch Eindampfung zur Trockne gewonnenes Vincristin in wasserfreiem Athanol gelöst und Vincristinsulfat mit äthanolischer Schwefelsäure abgeschieden wird.

15. Verfahren nach Unteranspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Vincristinsulfat durch Umkristallisation gereinigt wird.

16. Verfahren nach Unteranspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Vincristinsulfat die Alkaloid-Base freigesetzt und in ein Säureadditionssalz überführt wird.