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Verfahren zur Herstellung von Cystein enthaltenden Peptiden Die vorliegande Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cystein enthaltenden Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Thiolgruppe des Cysteins während der zur Herstellung der Peptidkette notwendigen Reaktionsstufen durch einen Alkylcarb- amoylrest schützt.
Bei der Synthese von Polypeptiden, die Cysteinreste enthalten -seien dies nun natürliche oder künstlich hergestellte - muss die Thiolgruppe des Cysteinrestes geschützt werden, da sonst unerwünschte Nebenreaktionen eintreten können. Die bisher meist verwendete Schutzgruppe für die Thiolgruppe ist der Benzylrest; daneben wurde auch der Triphenylmethyl-, der Carbobenzoxy-, der Benzoyl- und der Acetylrest als Thiolschutzgruppe verwendet.
Diesen Gruppen haften aber verschiedene Nachteile an: Die Benzylgruppe ist nur durch Einwirkung von Natrium in flüssigem Ammoniak abspaltbar. Diese Methode kann jedoch z. B. bei Polypeptiden, die Methionin enthalten, nicht verwendet werden und führt auch bei anderen Polypeptiden zu Spaltungen in der Peptidkette, wodurch die Ausbeute am gewünschten Endprodukt stark herabgesetzt wird. Auch die Abspaltung der Triphenylmethylgruppe (Tritylgruppe) bereitet Schwierigkeiten.
Die Verwendung von Carbobenzoxy-, Benzoyl und Acetylgruppen hat hingegen,den Nachteil, dass anwesende freie Aminogruppen durch innere Umlagerung leicht acyliert werden können.
Es wurde nun gefunden, d'ass man zum Schutze der Thiolgruppe des Cysteinrestes beim Aufbau von Poly- peptiden vorteilhafterweise eine Alkylcarbamoylgruppe verwenden kann. überraschenderweise findet hierbei im Gegensatz zu anderen Acylresten keine Wanderung dieser Gruppe an eine anwesende freie Aminogruppe statt.
Die erfindungsgemäss verwendeten Alkylcarbamoylgrup- pen können durch Reaktion eines Alkylisocyanates mit Cystein oder einem Cystein enthaltenden Polypeptid in das Molekül eingeführt werden.
Das erfindungsgemäss geschützte Cystein bzw. Cy- stein enthaltende Peptide können für alle bekannten und bewährten Methoden zur Herstellung höher molekularer Polypeptide verwendet werden, z. B. die Azidmethode, die Carbodümidmethode, die gemischte Anhydrid- methode sowie die Methoden mit aktivierten Estern wie z. B. die Nitrophenylestermethode, da die Alkylearb- amoylgruppedurch diese Verfahren nicht in Mitleidenschaft gezogen wird.
Die erfindungsgemäss in Frage kommende Schutzgruppe ist auch stabil, wenn man den Carbo-tert.-butoxy- rest, wie er zum Schutze der a-Aminogruppe verwendet wird, oder den teri.-Butylesterrest (zum Schutze der Carboxylgruppe) durch Einwirkung von Trifluoressig- säure abspaltet, wie auch bei Abspaltung des Triphenyl- methylrestes von der a Aminogruppe durch wässerige Essigsäure. Ebenso ist die erfindungsgemässe Schutzgruppe auch beständig unter Bedingungen, wie man sie bei der Abspaltung einer Reihe anderer Schutzgruppen verwendet, wie z.
B. bei der Abspaltung der Carbobenz- oxygruppe oder der Benzylestergruppe durch Einwirkung von Bromwasserstoff in Eisessig.
Die Beständigkeit der erfindungsgemässen neuen Schutzgruppe ermöglicht es somit auch, ein Cystein enthaltendes Polypeptid sowohl am Aminoende als auch am Carboxylende zu verlängern.
Die Alkylcarbamoylgruppe selbst kann durch Einwirkung einer wässerigen oder alkoholischen Lösung, einer anorganischen oder organischen Base edler durch Einwirkung einer organischen Lösung von Ammoniak, Hydrazin oder primären Aminen oder aber durch Einwirkung von flüssigem Ammoniak abgespalten werden. Die auf diese Weise erhaltenen Cystein enthaltenden Peptide können nach bekannten Methoden durch milde Oxydation in therapeutisch wertvolle Cystin enthaltende Peptide, z. B. Oxytocin, oder seine Derivate oder Analoge, umgewandelt werden.
Diese Oxydation kann auch direkt ohne vorherige Isolierung des Cystein enthaltenden Polypeptids in einem Arbeitsgang vorgenommen werden.
Die Erfindung wird in dien folgenden Beispielen beschrieben.
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Beispiel 1 S-Äthyl-carbamoyl-L-cystein Man löst 475 g L-Cystein-hydrochlorid in 4,5 1 Dimethylformamid, kühlt auf 0 , gibt 235g Äthylisocyanat zu, lässt während 16 Std. bei 20 stehen, dampft zur Trockne ab, wäscht den Rückstand mit Äthyläther, dekantiert, löst in 5 1 Wasser, wäscht mit Äthyläther, stellt auf einen pH von 6,5 ein, konzentriert die wässerige Phase auf etwa 1000 cm3, filtriert und wäscht die entstandene kristalline Masse mit Eiswasser und anschliessend mit Athanol und trocknet. Man erhält S-Äthyl-carbamoyl-L-cystein. Smp. 219 . [a] D =-37 in Salzsäure (6n).
Beispiel 2 N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cystein Zu einem auf 0 gekühlten Gemisch von 2000 cm3 10 % iger wässeriger Kaliumbicarbonatlösung und 200 em3 Chlorameisensäurebenzylester gibt man unter starkem Rühren 142 g S-Äthylcarbamoyl-Lcystein zu, rührt noch während 2 Std., gibt 2000 cm3 Wasser zu, wäscht mit Äthyläther, säuert die wässerige Phase an, extrahiert das ausgeschiedene Öl mit Äthyläther, trocknet über Natriumsulfat, dampft ab-, löst den Rückstand in 1000 cm3 siedendem Essigester, gibt 3000 cm3 Petrol- äther zu und lässt kristallisieren. Man filtriert, wäscht mit Petroläther und trocknet. Man erhält N-CarbobenzoxyS-äthylcarbamoyl L-cystein. Smp. 122 . [a] = D -62 in Dimethylformamid.
Beispiel 3 Bis-N-carbobenzoxy-L-cystin Man löst 33 g N-Carboben7-oxy-S-äthylcarbamoyl-Lcystein in 200 cm3 25 % iger Ammoniaklösung, lässt 1 Std. bei 20 stehen, gibt 300 cm3 Wasser zu, wäscht mit Äthyläther, bläst Luft durch die Lösung bis zur negativen Nitroprussiat-Reaktion, säuert mit verdünnter Salzsäure an, extrahiert mit Essigester, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus Chloroform um. Man erhält Bis-Ncarbobenzoxy-ILcystin. Smp. 119 . [a] D = -91 in Eisessig.
Beispiel 4 Bis-N-carbobenzoxy-Lcystin Man löst 33g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylL-cystein in 200 cm3 Natriumhydroxyd (2n) auf, lässt 1 Stdl. bei 20 stehen und arbeitet wie in Beispiel 3. Man erhält Bis-N carbobenzoxy-L-cistin. Smp. 115 . [a] D= -92 in Eisessig.
Beispiel 5 N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-Lcystein-2,4,5trichlorphenylester Man löst 163g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylLcystein und 125 g 2,4,5 Trichlorphenol in 2500 cm3 Acetonitril, kühlt auf -10 , gibt 105g Dicyclohexylcarbodiimid zu, schüttelt 16 Std. bei 20 , filtriert, wäscht den Niederschlag mit Pyrid'in, dampft die vereinigten Filtrate ab und kristallisiert den Rückstand aus Äthanol. ManerhältN-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinD 2,4,5-trichlorphenylester. Smp. l58 . [a] =-38 in Dimethylformamid.
Beispiel 6 N-Carbobenzoxy-Sr-äthylcarbamoyl-L-cYsteinyl-LprolylLrleucyl-glycinamid Man löst 33,3g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylIrcystein 2,4,5-trichlorphenylester und 19,1 g L-Prolyl-
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L-leucyl-glycinamid in 100 cm3 Dimethylformamid, lässt 16 Std. stehen, gibt 500 cm3 Äthyläther zu, filtriert die gebildeten Kristalle, wäscht mit Essigester .und trocknet. Man erhält N-Carbobenzoxy-S-äthylcabamoyl-L-cysteinyl!-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Smp. 204 . [ajD = -67 in Dimethylformamid.
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Beispiel 7 N Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cys@teinyl-LrprolylL-leucyl-glycinamid Man löst 22g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylLrcystein in 250 cm3 Chloroform, gibt 10 cm3 TriäthyPamin zu, rührt bei 0 und gibt tropfenweise 7,0 cm3 Chlorameis,ensäureäthylester zu.
Nach 10 Minuten gibt man 19,1 g L-Prolyl-L-leucyl-glycinamid in 250 cm3 Dimethylformamid gelöst zu, rührt noch während 4 Std. bei 20 , konzentriert auf die Hälfte der Volumen, giesst 1000 cm3 Wasser zu, filtriert und reinigt wie unter Beispiel 6. Man erhält N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-L-prolyl-L 1#eucyl-glycinamid mit den in Beispiel 6 beschriebenen FÄgenschaften.
Beispiel 8 N-Carbabenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-LprolylLleucyl-glycinanud Man löst 22 g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylL-cystein und 19 g LProlyl-L-leucyl-glycinamid in 250 cm3 Dimethylformaniid, kühlt auf -10 , gibt 15 g Dicyclohexyl-carbod!iimid zu, schüttelt während 16 Std. bei 20 , filtriert, eng das Filtrat auf 100 ml ein und reinigt wie beim Beispiel 6. Man erhält N-Carbob.enzoxyS-äthylcarbamoyl- L -cysteinyl- L -prolyl-L-leucyl-glycinamid mit den in Beispiel 6 beschriebenen Eigenschaften.
Beispiel 9
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N-Carbobe:nzoxy-L-asparaginyl-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid Man löst 33 g von dem oben erhaltenen N-Carbobenzoxy- L, -asparaginyl- S. @äthylcarbamoyl- L -cysteinylL-prolyl-L-leucyl-@glycinamid in 300 cm3 einer 4n Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, konzentriert auf 100 cm3, fällt mit Äthyläther, filtriert, wäscht mit Äthyläther, löst den Rückstand in 150 cm3 Dimethylformamid, gibt 27 g N-Carbobenzoxy-Lasparagin-2,4,5-trichlorphenylester und 15,6 cm3 Triäthylanun zu und schüttelt während 12 Std., wobei eine kompakte Masse erhalten wird. Man gibt Essigester zu, filtriert, wäscht den Rückstand mit heissem Methanol, filtriert und trocknet. Man erhält N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl- S@-äthylcarbamoyl- L -cysteinyl L -prolyl- L leucyliglycinamid. Smp. 228 . [a] D = -60 in Dimethylformamid.
Beispiel 10
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N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-äthylearbamoyl-Lcys@teinyl-L-prolyl-L-lbucyl-glycinamid Man löst 27 g N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl-S- äthylcarbamoyl-Lcysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid in 300 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, konzentriert auf 100 cm-9, fällt mit Äthyläther aus, filtriert, wäscht mit Äthyläther, löst den Rückstand in 150 cm3 Dimethylformamid, gibt 25 g N-Carbobenzoxy-L-glutamin-2,4,5-trichlorphenylester und 14 cm3 Triäthylamin zu, entfernt das Triäthylaminhydrobromid durch Filtration, lässt das Filtrat wäh-
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rend 72 Std. bei 20 stehen, gibt Essigester zu, filtriert und wäscht den kristallinen Rückstand mit siedendem Essigester und Aceton.
Man erhält N-Carbobenzoxy-Lglutaminyl-L-asparaginyl-S-äthylcarbamoyl-LcysteinylL-propyl-Lleucyl-glycinamid. Smp. 218 . [a122 = -56 in Dimethylformamid.
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Beispiel 11 N-Carbobenzoxy-L-isoleucyl-LglutanänylL-asparaginyl-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolylL-leucyl-glycinamid Man löst 21g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl- S- äthylcarbamoyl- L -cysteinyl- L -prolyl- L leucyl-glycinamid in 200 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, engt auf 100 cm@ ein, fällt mit Äthyläther, filtriert, wäscht mit Äthyläther, löst den Rückstand in 75 cm3 Dimethylformamid, gibt 12 g N-Carbobenzoxy-L-isoleucin-p-nitrophenylester und 7 cm3 Triäthylamin zu, filtriert das Tri- äthylaminhyd'robromid ab, lässt die Lösung während 3 Tagen stehen, gibt Essigester zu, filtriert, wäscht mit Essigester und Aceton und trocknet.
Man erhält N-Carbobenzoxy-L -isoleucyl- L -glutaminyl- L -asparaginyl-S- äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Smp. 240 . [a] -40 in Dimethylformamid.
12= Beispiel 12 N,O-Bis-carbobenzoxy-L-tyrosyl-LisoleucylL-glutaminyl-Lasparaginyl-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-Lproyl-Lleucyl-glycinamid Man löst 14g N-Carbobenzoxy-Lisoleucyl-L-glutaminyl-Lasparaginyl-S-äthylcarbamoyl-Lcisteünyl L-prolyl-L-leucyl-glycinamid in 150 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, engt auf 50 cm3 ein, fällt mit Äthyläther, filtriert, wäscht mit Äthyläther, löst den Rückstand in 200 cm3 Dimethylformamid, gibt 10g N,O-Bis-carbobenzoxy-Ltyrosin- 2,4,5-trichlor-phenylester und 4,2 cm3 Triäthylamän zu, filtriert, lässt das Filtrat während 72 Std. bei 20 stehen, engt auf 50 cm3 ein, gibt 500 cm3 Essigester zu, filtriert den entstandenen kristallinen Niederschlag, wäscht mit Essigester und Methanol und trocknet.
Man erhält N,OBis-carbobenzoxy-L-tyrosyl-Lisoleucyl-L-glutaminyl-Lasparaginyl-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Smp. 236 . [a] D=-42 in Dime@thylformamid.
Beispiel 13 N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinylL tyrosyl-Lisoleucyl-L-glutaminyl-LasparaginylS-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucylglycinamid Man löst 12,5 g N,O-Bis-carbobenzoxy-LtyrosylL - isoleucyl-L -glutaminyl- L asparaginyl- S -äthylcarbamoyl- L -cysteinyl- L -prolyl- L -leucyl - glycinamid in 125 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, engt auf 30 cm3 ein, fällt mit Äthyläther, filtriert, wäscht mit Essigester, löst den Rückstand in 50 ml Dimethylformamid, gibt 6 g N-Carbobenzoxy- S -äthylcarbamoyl- L -cystein-2,4,5-trschlorphenylester und 3 cm3 Triäthylamin zu, schüttelt während 72 Std., gibt Essigester zu, filtriert, wäscht mit Essigester und siedendem Methanol, filtriert und trocknet.
Man erhält N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-Lcystei-
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nyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-Lasparaginyl S- äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Smp. 237-240 . [a] = D -64 in Dimethylformamid.
Beispiel 14 S-Äthylcarbamoyl-Lcysteinyl-Ltyrosyl-L-isoleucylL-glutan-inyl-L-a.sparaginyl-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-L-prolyl@Lleucyl-glycinamid-trihydrobromid Man löst 10 g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-Lrtyrosyl-Lrisoleucyl-Lglutaminyl-L-asparaginyl-S-äthylcarbamoyl-. L-cysteinyI L-prolyl- L -lvucylglycinamid in 100 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. bei 20 , konzentriert auf 50 cm3, fällt mit Äthyläther, filtriert und trocknet. Man erhält S-Äthylcarbamoyl-Lcysteinyl-Ltyrosyl-L-isol@eucyl- Lglutaminyl- L-asparaginyl-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L leucyl-glycinamid-trihydrobromid. Smp. 90-93 . [a] D=-35 in Dimethylformamid.
Beispiel 15 L-Cysteinyl-Ltyrosyl-Lisoleucyl-LglutaminylL-a,sparaonyl-L#-cysteinyl:Lprodyl Lleucyl-glycinamid Man löst 5 g von dem oben erhaltenen S-Äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-T-#isoleucyl-L-glutaminyl@Lasparaginyl-S-äthylcarbamoyl,L-cysKeinyl: L-prolyl-Lleucyl-glycinamid-trihydrobromid in 1500 cm3 trockenem flüssigem Ammoniak, lässt 16 Std. in einem Druckgefäss bei 20 stehen, dampft den Ammoniak ab und trocknet im Hochvakuum. Der Rückstand enthält das L-Cysteinyl- L-tyrosy1- Lisoleucyl-Lglutaminyl-ILasparaginy14-cysbeinyl-L-prolyl Lleucyl-glycinamid.
Beispiel 16 Oxytocin L Cysteinyl- L-tyrosyl- Lisoleucyl- Lglutaminyl-L asparaginyliL:-cysteinyl-L-proly hL;leucyl-glycinamid wird in 5 Liter O,Oln-Essigsäure gelöst und bei einem pH von 6,5 bis 8,0 durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff während einer Stunde bei 0 bis 40 oxydiert. Man bringt die Lösung, die die Substanz enthält, auf einen pH von 4,0 bis 5,0 und dampft nach Zusatz von 50 g Natriumchlorid oder von 0,64g Methansulfonsäure zur Trockne ein, wobei ein trockenes Pulfer (Oxytocin) erhalten wird, das gut haltbar ist. Es kann aufbewahrt werden und bei Gebrauch klar gelöst werden. Man kann jedoch auch die Lösung direkt verwenden, eventuell nach Verdünnen mit Wasser oder einer Salzlösung.
Beispiel 17 Oxytocin Man verfährt wie in Beispiel 16. Man oxydiert aber am Ende bei 0 bis 40 durch Zusatz von 7,5 cm3 einer ln-Lösung von Wasserstoffperoxyd in Wasser bei einem pH von 4,0 bis 6,0 (anstatt der Oxydation durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff).
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Process for the production of cysteine-containing peptides The present invention relates to a process for the production of cysteine-containing polypeptides, characterized in that the thiol group of the cysteine is protected by an alkylcarbeamoyl radical during the reaction steps necessary for the production of the peptide chain.
In the synthesis of polypeptides that contain cysteine residues - be they natural or artificially produced - the thiol group of the cysteine residue must be protected, since otherwise undesirable side reactions can occur. The protective group most commonly used to date for the thiol group is the benzyl radical; the triphenylmethyl, carbobenzoxy, benzoyl and acetyl radicals were also used as thiol protective groups.
However, these groups have various disadvantages: The benzyl group can only be split off by the action of sodium in liquid ammonia. However, this method can e.g. B. not used with polypeptides containing methionine and also leads to cleavages in the peptide chain in other polypeptides, whereby the yield of the desired end product is greatly reduced. The cleavage of the triphenylmethyl group (trityl group) also causes difficulties.
The use of carbobenzoxy, benzoyl and acetyl groups, on the other hand, has the disadvantage that any free amino groups present can be easily acylated by internal rearrangement.
It has now been found that an alkylcarbamoyl group can advantageously be used to protect the thiol group of the cysteine residue in the construction of polypeptides. Surprisingly, in contrast to other acyl radicals, this group does not migrate to a free amino group that is present.
The alkylcarbamoyl groups used according to the invention can be introduced into the molecule by reacting an alkyl isocyanate with cysteine or a cysteine-containing polypeptide.
The cysteine or cysteine-containing peptides protected according to the invention can be used for all known and proven methods for the production of higher molecular weight polypeptides, eg. B. the azide method, the carbodiimide method, the mixed anhydride method and the methods with activated esters such. B. the nitrophenyl ester method, since the alkylene amoyl group is not affected by this method.
The protective group in question according to the invention is also stable if the carbo-tert-butoxy radical, as used to protect the α-amino group, or the teri-butyl ester radical (to protect the carboxyl group) is removed by the action of trifluoroacetic acid Acid is split off, as is also the case when the triphenylmethyl radical is split off from the a amino group by aqueous acetic acid. Likewise, the protective group according to the invention is also stable under conditions such as those used in the cleavage of a number of other protective groups, such as, for.
B. when splitting off the carbobenzoxy group or the benzyl ester group by the action of hydrogen bromide in glacial acetic acid.
The stability of the new protective group according to the invention thus also makes it possible to extend a polypeptide containing cysteine both at the amino end and at the carboxyl end.
The alkylcarbamoyl group itself can be split off by the action of an aqueous or alcoholic solution, an inorganic or organic base, more nobly, by the action of an organic solution of ammonia, hydrazine or primary amines, or by the action of liquid ammonia. The cysteine-containing peptides obtained in this way can be converted into therapeutically valuable cystine-containing peptides, eg by mild oxidation, by known methods. B. oxytocin, or its derivatives or analogs.
This oxidation can also be carried out directly in one operation without prior isolation of the cysteine-containing polypeptide.
The invention is described in the following examples.
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Example 1 S-Ethyl-carbamoyl-L-cysteine Dissolve 475 g of L-cysteine hydrochloride in 4.5 l of dimethylformamide, cool to 0, add 235 g of ethyl isocyanate, leave to stand for 16 hours at 20, evaporate to dryness, washes the residue with ethyl ether, decanted, dissolved in 5 l of water, washed with ethyl ether, adjusted to a pH of 6.5, concentrated the aqueous phase to about 1000 cm3, filtered and washed the resulting crystalline mass with ice water and then with ethanol and dries. S-ethyl-carbamoyl-L-cysteine is obtained. M.p. 219. [a] D = -37 in hydrochloric acid (6n).
EXAMPLE 2 N-Carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-L-cysteine 142 g of S-ethylcarbamoyl-L-cysteine are added with vigorous stirring to a mixture, cooled to 0, of 2000 cm3 of 10% aqueous potassium bicarbonate solution and 200 cm3 of benzyl chloroformate, and the mixture is stirred for a further 2 hours ., add 2000 cm3 of water, wash with ethyl ether, acidify the aqueous phase, extract the precipitated oil with ethyl ether, dry over sodium sulphate, evaporate, dissolve the residue in 1000 cm3 of boiling ethyl acetate, add 3000 cm3 of petroleum ether and lets crystallize. It is filtered, washed with petroleum ether and dried. N-carbobenzoxyS-ethylcarbamoyl L-cysteine is obtained. M.p. 122. [a] = D -62 in dimethylformamide.
EXAMPLE 3 Bis-N-carbobenzoxy-L-cystine 33 g of N-carboben7-oxy-S-ethylcarbamoyl-lcysteine are dissolved in 200 cm3 of 25% ammonia solution, left to stand for 1 hour at 20, 300 cm3 of water are added and washed with Ethyl ether, air blows through the solution until the nitroprussiate reaction is negative, acidified with dilute hydrochloric acid, extracted with ethyl acetate, evaporated and the residue recrystallized from chloroform. Bis-Ncarbobenzoxy-ILcystine is obtained. M.p. 119. [a] D = -91 in glacial acetic acid.
EXAMPLE 4 Bis-N-carbobenzoxy-Lcystine 33 g of N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoylL-cysteine are dissolved in 200 cm3 of sodium hydroxide (2N), left for 1 hour. stand at 20 and work as in Example 3. Bis-N carbobenzoxy-L-cistine is obtained. M.p. 115. [a] D = -92 in glacial acetic acid.
EXAMPLE 5 N-Carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-Lcysteine-2,4,5-trichlorophenyl ester 163 g of N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-cysteine and 125 g of 2,4,5-trichlorophenol are dissolved in 2500 cm3 of acetonitrile, cooled to -10, and 105 g of dicyclohexylcarbodiimide are added , shakes for 16 hours at 20, filtered, the precipitate was washed with pyridin, the combined filtrates were evaporated and the residue was crystallized from ethanol. N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-L-cysteine D 2,4,5-trichlorophenyl ester is obtained. M.p. l58. [a] = -38 in dimethylformamide.
Example 6 N-Carbobenzoxy-Sr-ethylcarbamoyl-L-cYsteinyl-LprolylLrleucyl-glycine amide 33.3 g of N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-rcysteine 2,4,5-trichlorophenyl ester and 19.1 g of L-prolyl are dissolved
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L-leucyl-glycine amide in 100 cm3 dimethylformamide, left to stand for 16 hours, add 500 cm3 ethyl ether, filter the crystals formed, wash with ethyl acetate and dry. N-carbobenzoxy-S-ethylcabamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycine amide is obtained. M.p. 204. [ajD = -67 in dimethylformamide.
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Example 7 N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-L-cys @ teinyl-Lrprolyl-L-leucyl-glycine amide Dissolve 22 g of N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-rcysteine in 250 cm3 of chloroform, add 10 cm3 of triethyamine, stir at 0 and add dropwise cm3 of chloroform, enoic acid ethyl ester.
After 10 minutes, 19.1 g of L-prolyl-L-leucyl-glycine amide dissolved in 250 cm3 of dimethylformamide are added, the mixture is stirred for another 4 hours at 20, concentrated to half the volume, 1000 cm3 of water is poured in, filtered and cleaned as in Example 6. N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L 1 eucyl-glycine amide with the properties described in Example 6 is obtained.
Example 8 N-Carbabenzoxy-S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-LprolylLleucyl-glycinanud Dissolve 22 g of N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoylL-cysteine and 19 g of LProlyl-L-leucyl-glycinamide in 250 cm3 of dimethylformaniide, cool to add 15 g of dicyclohexylcarbodiimide, shake for 16 hours at 20, filtered, narrow the filtrate to 100 ml and purify as in Example 6. N-carbobenzoxyS-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L- prolyl-L-leucyl-glycine amide with the properties described in Example 6.
Example 9
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N-Carbobe: nzoxy-L-asparaginyl-S-ethylcarbamoylL-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycine amide 33 g of the N-carbobenzoxy-L, -asparaginyl-S. @ Ethylcarbamoyl-L-cysteinylL are dissolved -prolyl-L-leucyl- @ glycinamide in 300 cm3 of a 4N solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid, left to stand for 1 hour, concentrated to 100 cm3, precipitated with ethyl ether, filtered, washed with ethyl ether, dissolves the residue in 150 cm3 of dimethylformamide Add 27 g of N-carbobenzoxy-lasparagine-2,4,5-trichlorophenyl ester and 15.6 cm3 of triethylamine and shake for 12 hours, a compact mass being obtained. Acetate is added, the mixture is filtered, the residue is washed with hot methanol, filtered and dried. N-carbobenzoxy-L-asparaginyl-S @ -äthylcarbamoyl-L -cysteinyl L -prolyl-L leucyliglycine amide is obtained. M.p. 228. [a] D = -60 in dimethylformamide.
Example 10
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N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-ethylearbamoyl-Lcys @ teinyl-L-prolyl-L-lbucyl-glycinamide. 27 g of N-carbobenzoxy-L-asparaginyl-S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl are dissolved -L-leucyl-glycine amide in 300 cm3 of a 4N solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid, left to stand for 1 hour, concentrated to 100 cm-9, precipitated with ethyl ether, filtered, washed with ethyl ether, dissolve the residue in 150 cm3 dimethylformamide, 25 g of N-carbobenzoxy-L-glutamine-2,4,5-trichlorophenyl ester and 14 cm3 of triethylamine are added, the triethylamine hydrobromide is removed by filtration, the filtrate is left to
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Stand at 20 for 72 hours, add ethyl acetate, filter and wash the crystalline residue with boiling ethyl acetate and acetone.
N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-ethylcarbamoyl-Lcysteinyl-L-propyl-Lleucyl-glycinamide is obtained. M.p. 218. [a122 = -56 in dimethylformamide.
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Example 11 N-carbobenzoxy-L-isoleucyl-L-glutananylL-asparaginyl-S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolylL-leucyl-glycine amide Dissolve 21 g of N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-ethylcarbamoyl- cysteinyl- L -prolyl- L leucyl-glycine amide in 200 cm3 of a 4N solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid, left to stand for 1 hour, concentrated to 100 cm @, precipitated with ethyl ether, filtered, washed with ethyl ether, dissolves the residue in 75 cm3 of dimethylformamide, 12 g of N-carbobenzoxy-L-isoleucine-p-nitrophenyl ester and 7 cm3 of triethylamine are added, the triethylamine hydrobromide is filtered off, the solution is left to stand for 3 days, ethyl acetate is added, filtered, washed with ethyl acetate and Acetone and dries.
N-carbobenzoxy-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L -asparaginyl-S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycine amide is obtained. M.p. 240. [a] -40 in dimethylformamide.
12 = Example 12 N, O-bis-carbobenzoxy-L-tyrosyl-lisoleucylL-glutaminyl-lasparaginyl-S-ethylcarbamoylL-cysteinyl-L-propyl-Lleucyl-glycinamide Dissolve 14 g of N-carbobenzoxy-lisoleucyl-L-glutaminyl-S-lasparaginyl äthylcarbamoyl-Lcisteünyl L-prolyl-L-leucyl-glycine amide in 150 cm3 of a 4N solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid, left to stand for 1 hour, concentrated to 50 cm3, precipitated with ethyl ether, filtered, washed with ethyl ether, dissolves the residue in 200 cm3 of dimethylformamide, add 10 g of N, O-bis-carbobenzoxy-Ltyrosine-2,4,5-trichlorophenyl ester and 4.2 cm3 of triethylamine, filtered, leave the filtrate to stand for 72 hours at 20, concentrated to 50 cm3 a, 500 cm3 of ethyl acetate are added, the crystalline precipitate formed is filtered off, washed with ethyl acetate and methanol and dried.
N, OBis-carbobenzoxy-L-tyrosyl-lisoleucyl-L-glutaminyl-lasparaginyl-S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycine amide is obtained. M.p. 236. [a] D = -42 in dimethylformamide.
Example 13 N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-L-cysteinylL tyrosyl-lisoleucyl-L-glutaminyl-lasparaginylS-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucylglycine amide Dissolve 12.5 g of N, O-bis-carbobenzoxy- LtyrosylL - isoleucyl-L -glutaminyl- L asparaginyl- S -äthylcarbamoyl- L -cysteinyl- L -prolyl- L -leucyl-glycinamide in 125 cm3 of a 4N solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid, left to stand for 1 hour, narrowed to 30 cm3 a, precipitates with ethyl ether, filtered, washed with ethyl acetate, the residue is dissolved in 50 ml of dimethylformamide, 6 g of N-carbobenzoxy-S -ethylcarbamoyl-L-cysteine-2,4,5-trschlorphenylester and 3 cm3 triethylamine are added, shake during 72 hours, ethyl acetate is added, filtered, washed with ethyl acetate and boiling methanol, filtered and dried.
N-carbobenzoxy-S-ethylcarbamoyl-Lcystei-
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nyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-lasparaginyl S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycine amide. M.p. 237-240. [a] = D -64 in dimethylformamide.
Example 14 S-äthylcarbamoyl-Lcysteinyl-Ltyrosyl-L-isoleucylL-glutan-inyl-La.sparaginyl-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-L-prolyl@Lleucyl-glycinamid-trihydrobromid Dissolve 10 g of N-carbobenzoxy-S-ethyl-ethyl -Lrtyrosyl-Lrisoleucyl-Lglutaminyl-L-asparaginyl-S-ethylcarbamoyl-. L-cysteinyI L-prolyl- L -lvucylglycine amide in 100 cm3 of a 4N solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid, leaves for 1 hour at 20, concentrated to 50 cm3, falls with ethyl ether, filtered and dried. S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-Ltyrosyl-L-isol @ eucyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamide-trihydrobromide is obtained. M.p. 90-93. [a] D = -35 in dimethylformamide.
Example 15 L-cysteinyl-Ltyrosyl-Lisoleucyl-L-glutaminyl-a, sparaonyl-L # -cysteinyl: Lprodyl-Lleucyl-glycinamide Dissolve 5 g of the S-ethylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-T- # isoleucyl- L-glutaminyl @ Lasparaginyl-S-äthylcarbamoyl, L-cysKeinyl: L-prolyl-Lleucyl-glycinamide-trihydrobromide in 1500 cm3 dry liquid ammonia, left for 16 hours in a pressure vessel at 20, evaporates the ammonia and dries in a high vacuum. The residue contains the L-cysteinyl-L-tyrosy1-lisoleucyl-Lglutaminyl-ILasparaginy14-cysbeinyl-L-prolyl Lleucyl-glycinamide.
Example 16 Oxytocin L Cysteinyl-L-tyrosyl-Lisoleucyl-L-glutaminyl-L asparaginyliL: -cysteinyl-L-prolyhL; leucyl-glycinamide is dissolved in 5 liters of O, Oln-acetic acid and at a pH of 6.5 to 8.0 oxidized by bubbling in air or oxygen for one hour at 0 to 40. The solution containing the substance is brought to a pH of 4.0 to 5.0 and, after the addition of 50 g of sodium chloride or 0.64 g of methanesulfonic acid, is evaporated to dryness, a dry powder (oxytocin) being obtained which is well preserved. It can be stored and cleared when in use. However, the solution can also be used directly, possibly after diluting with water or a salt solution.
EXAMPLE 17 Oxytocin The procedure is as in Example 16. However, at the end of the range from 0 to 40, the oxidation is carried out by adding 7.5 cm3 of an 1n solution of hydrogen peroxide in water at a pH of 4.0 to 6.0 (instead of oxidation Introduction of air or oxygen).