CH428097A - Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotica - Google Patents

Description

      Verfahren        zur        Herstellung    neuer     Antibiotiea       Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren  zur Herstellung eines neuen     Antibioticums,    das im fol  genden     Anguidin    genannt wird. Das     Antibioticum        An-          guidin    entsteht bei der Züchtigung von Stämmen der       Pilzspecies        Fusarium        anguioides        Sherb.    in einer Nähr  lösung. Es wird aus letzterer isoliert.  



  Stämme der     Pilzspecies        Fusarium        anguioides        Sherb.     wurden aus Bodenproben     verschiedenster    Herkunft iso  liert. Morphologisch entsprechen sie den Umschrei  bungen der     Species,    wie sie in     Gilman,    J. C. 1957:  A Manual of     Soil    Fungi,     2nd        ed.,        The    Iowa     State     College Press,     Ames.    Iowa, USA, 450 S,     vergleiche    auch  von     Wollenweber,    H. W. und O.

   A.     Reinking,    1935,  Die     Fusarien,    Berlin, S. 355, gegeben worden sind.  Kulturen eines Stammes der     Pilzspecies        Fusarium          anguioides    wurden bei der Fermentation Division of       the        Northern    Regional Research     Laboratory    in     Peoria,          Illinois/USA,    unter der Bezeichnung     NRRL    3020 depo  niert.  



  Für die Herstellung der neuen, antibiotisch wirk  samen Verbindung können auch Stämme verwendet  werden, wie sie z. B. durch Selektion oder Mutation  unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgen  strahlen oder durch Anwendung anderer Massnahmen,  wie z. B. durch Behandlung von Laboratoriumskul  turen mit geeigneten Chemikalien, leicht gewonnen wer  den können.  



  Die Züchtung erfolgt beispielsweise in ruhender       Oberflächenkultur    oder aber     submers    unter Schütteln  oder in     Fermentern    mit     Begasung    durch Luft oder  Sauerstoff unter Rühren. Als Temperatur eignet sich  eine solche zwischen 12 und 30  C. Stämme der ange  führten     Pilzspecies    von     Fusarium        anguioides        Sherb.     lassen sich auf vielerlei     Nährböden,    die die üblichen  Nährstoffe enthalten, züchten.

   So verwenden solche  Stämme die für     Kohlenstoff-heterotrophe    Organismen  üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glu  cose, Stärke,     Dextrin,        Lactose,    Rohrzucker usw., als       Kohlenstoffquelle,    organische und     anorganische    stick-    stoffhaltige Verbindungen, wie     Pepton,    Hefe oder  Fleischextrakte,     Ammoniumsulfat,        Ammoniumnitrat,          Aminosäuren    usw., als Stickstoffquelle sowie die übli  chen Mineralsalze und Spurenelemente.  



  Es wurde nun gefunden,     dass    sich aus Kulturlösungen  einer Reihe von Stämmen der     Pilzspecies        Fusarium          anguioides        Sherb.    die neue antibiotische wirksame Ver  bindung     Anguidin    in reiner und kristallisierter Form  isolieren     lässt.     



  Eine Durchführungsform der Erfindung zur Her  stellung von     Anguidin    besteht darin, dass ein     flüssiges     Nährmedium mit einer Kultur eines Stammes von       Fusarium        anguioides        Sherb.    beimpft und 2 bis 25 Tage       inkubiert    wird. Sobald eine maximale Menge an     Angui-          din    produziert ist, wird     filtriert.    Der     gewünschte    Stoff  kann nach verschiedenen Methoden aus dem Filtrat  isoliert werden.

   Die antibiotisch wirksamen Stoffe kön  nen aus dem Kulturmedium durch     extraktive    oder       adsorptive    Arbeitsmethoden gewonnen werden. Für die  technische Produktion werden erstere bevorzugt, da sie  weniger zeitraubend und weniger kostspielig sind. Zur  Extraktion eignen sich vorzugsweise mit Wasser nicht  mischbare organische Lösungsmittel, wie chlorierte       Kohlenwasserstoffe,    z.

   B.     Methylenchlorid,        Äthylenchlo-          rid,    Chloroform und dergleichen, ferner Alkohole mit  geringer Wasserlöslichkeit, wie     Butanol,        Amylalkohol     und dergleichen,     Alkylester    von Fettsäuren wie     Äthyl-          acetat,        Propylacetat,        Butylacetat,        Amylacetat    und der  gleichen, wenig wasserlösliche     Ketone,    wie     Methyliso-          butylketon,        Methylamylketon    und dergleichen.

   Andere  Lösungsmittel mit ähnlichem Charakter können eben  falls verwendet werden. Der Extrakt aus der Kultur  flüssigkeit kann vorzugsweise im Vakuum zur Trockne  eingedampft werden, wobei man das     Antibioticum    in  roher Form erhält. '  Zur Reinigung auf     chromatographischem    Wege  eignen sich     adsorbierende    Mittel, wie     aktivierte    Ton  erde,     Silikagel,        Magnesiumsilikat    und dergleichen.  



       Anguidin    kann wie folgt charakterisiert werden:           Anguidin    hat einen Schmelzpunkt von 162-164  C  (aus Benzol oder einem Gemisch von Benzol und     Hep-          tan).    Der     spezifische    Drehungswert ist     [a}D'    c - -27o  (c = 1,28     in    Chloroform). Die Analyse ergab für       C19H2607,        Mol.-Gew.    366,41:  
EMI0002.0009     
  
    Ber.: <SEP> C <SEP> 62,28 <SEP> % <SEP> H <SEP> <B>7,15 <SEP> /wo</B> <SEP> O <SEP> 30,57
<tb>  Gef.: <SEP> C <SEP> 62,1 <SEP> % <SEP> H <SEP> 7,1 <SEP> % <SEP> O <SEP> 30,3 <SEP> %.

         Die     Molekulargewichtsbestimmung    nach Rast     (Cam-          pher)    hat das     Molekulargewicht    359 ergeben. Das     Anti-          bioticum        enthält    weder N noch S noch Halogen. Das       UV-Absorptionsspektrum    in     Alkohol    zeigt     Endadsorp-          tion    bei 192,5     mu        (log    a = 4,02).

   Das     IR-Spektrum     zeigt Banden bei 3420, 2960, 1735, 1680, 1450-1438,  1370, 1250, 1170, 1110, 1090-1078, 1048-1026, 990,  960, 920, 700 cm-' (in     KBr).        (Fig.    1)     Chemische     Untersuchungen, die mit dem     kristallisierten        Antibio-          ticum    angestellt wurden, ergaben, dass     Anguid'in    bei  der Mikrohydrierung     (Palladium-Kohle-Katalysator    in  Äthanol) 1,18     Mol        Wasserstoff    aufnimmt.

   Die     O-Me-          thyl-Bestimmung    nach     Zeissel    ergab 0,0%, die O Acetyl-    Bestimmung (saure     Verseifung)    ergab 27,3 %. Die Test  reaktionen nach     Benedict        Fehling,        Tollens,        Millon,    so  wie mit     Eisenchlorid    und     Kaliumpermanganat    in Aceton  sind negativ.

   Brom wird in     Tetrachlorkohlenstoff    lang  sam entfärbt.     Anguidin    ist löslich in Aceton, Äthanol,       Dioxan,    Chloroform,     Methylenchlorid,        Pyridin,    Benzol,       Toluol,    schwer löslich in Wasser.     Diäthyläther,        Diisopro-          pyläther,        Pentan,        Hexan    und     Heptan.     



  Die antibiotische Wirksamkeit von     Anguidin    wurde  mittels Verdünnungstests (2 % Malzbrühe,     Ablesung     nach 20stündiger Inkubation bei 37  C) geprüft. Durch       Anguidin    wird das Wachstum von     Candida        albicans     (Stamm S 5) bei einer Konzentration 1 : 1000 total  und das von     Saccharomyces        cerevisiae    (Stamm S 8)  partiell     gehemmt.     



  Die Wirksamkeit von     Anguidin    gegen tierische Tu  more wurde an experimentellen Impftumoren der Maus  nachgewiesen. Zu den tierischen Tumoren, die sich als       beeinflussbar        erwiesen    haben,     zählen        Sarkom    37 und       Sarkom    180 der Maus.

   Die folgende Tabelle zeigt die  Wirkung von     Anguidin    bei den genannten Tumoren:  
EMI0002.0071     
  
    Art <SEP> Dosis <SEP> Dauer <SEP> Verträglichkeit
<tb>  1 <SEP> X <SEP> pro <SEP> Tag <SEP> % <SEP> Hemmung <SEP> eingesetzte <SEP> Tiere <SEP> gestorbene <SEP> Tiere
<tb>  Sarkom <SEP> 37 <SEP> 4,0 <SEP> mg/kg <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> 70 <SEP> 6 <SEP> 1
<tb>  Sarkom <SEP> 180 <SEP> l,

  33 <SEP> mg/kg <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> 50 <SEP> 6 <SEP> 1            Anguidin    besitzt auch eine ausgeprägte     Wirkung    in  der     Zellkultur.    Die Wirkung auf Kulturen von embryo  nalen     Fibroblasten    vom Huhn ergab bei     Anguidin    einen  totalen     Mitosestop    bis zur Konzentration von<B>10-75</B>  (0,03     ug/ml).    Auch     in    zehnfach höheren     Konzentratio-          nen    sind keine     Ruhezellschäden    zu beobachten.

   Bei  einer Konzentration von     10-s,0    ist noch eine partielle  Störung des     Mitoseablaufs    festzustellen.  



  Die Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen  in     vitro    (Zellen des     Mäuse-Mastocytoms    P-815) ergab  folgende Resultate: In geeigneter     Nährlösung        vermehren     sich     diese    Tumorzellen     innert    40 Stunden auf das 4- bis  5fache der     Ausgangszellzahl.    Die DE-50 (Konzentration,  welche diese Vermehrung um 50 % hemmt) von     Angui-          din    gegenüber diesen Zellen ist 0,002     yg/ml.    Die akute       Toxizität    von     Anguidin    bei der weissen Maus beträgt  DL-50 10 mg/kg i. v.  



       Anguidin    kann als     Heilmittel,    z: B. in Form pharma  zeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese ent  halten die genannte Verbindung in Mischung mit einem  für die     enterale,        parenterale    oder lokale Applikation  geeigneten organischen oder anorganischen Trägerma  terial. Für dasselbe     kommen    solche Stoffe in Frage,  die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B.

    Gelatine, Milchzucker, Stärke,     Magnesiumstearat,    Talk,       pflanzliche    Öle,     Benzylalkohole,    Gummi     arabicum,          Polyalkylenglykole,    Vaseline,     Cholesterin    oder andere       bekannte        Arzneimittelträger.    Die     pharmazeutischen    Prä  parate können z.

   B. als Tabletten,     Drag6es,    Pulver,  Cremes, Suppositorien oder in     flüssiger    Form als Lösun  gen, Suspensionen oder     Emulsionen.    vorliegen.     Gegebe-          nenfalls    sind sie     sterilisiert    und bzw. oder enthalten       Hilfsstoffe,    wie     Konservierungs=,        Stabilisierungs-,        Netz-          oder        Emulgiermittel:    Sie können auch noch andere thera  peutisch wertvolle Stoffe     enthalten.     



  Die Erfindung wird in den nachfolgenden     Beispei-          len        beschrieben,    ohne dass damit     eine        Einschränkung       des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Tempe  raturen sind in Celsiusgraden angegeben. Die Verhält  niszahlen bei Lösungsmitteln beziehen sich     immer    auf  Volumina.

      <I>Beispiel 1</I>       Anguidin     100 500-m1     Erlenmeyer-Kolben    mit je<B>100</B> ml       Nährlösung    (pro Liter 8,5 g     NaN03,    2,72 g     KH2P04,     1,23 g     M9S04    7H20, 28 mg     FeS04    - 7H20,

   3 mg       ZnS04    -     7H20    - alles in     analysenreiner    Quali  tät sowie 30 g Glucose     puriss.        PhHV    - 1 g     Bacto        yeast          extract        Difco    und     entmineralisiertes    Wasser enthaltend)  werden mit     Konidiensuspension    des Stammes der     Pilz-          species        Fusarium        anguioides        Sherb.,

          NRRL    3020 (iso  liert aus einer Bodenprobe aus der Gegend von Mar  seille)     beimpft    und 25 Tage     lang    unbewegt bei     ?J7     C  bebrütet und danach bei Raumtemperatur (etwa 20  C)  durch     Baumwollgewebe    filtriert. Das sofort bei -22  C  eingefrorene Filtrat wird 6 Wochen später bei 50  C       Badtemperatur    aufgetaut. Etwa 8 1 der gelblich-trüben  Lösung     (pH    7,2) werden sukzessive mehrmals mit Ben  zin, Essigester und wassergesättigtem     N-Butanol    extra  hiert. Die Extrakte werden zweimal mit je 1,51 Wasser  nachgewaschen und dann am Vakuum bei 50  einge  dampft.

   Der Rückstand des     Essigester-Extraktes    wiegt       0,60_g;    er     wird    an 30 g Kieselgel     chromatographiert.     Die mit Benzol und Chloroform     eluierten    Teile werden  verworfen. Die Fraktionen, die mit     Chloroform-Me-          thanol   <B>(99:</B> 1)     eluiert    wurden, können nach     Wegdamp-          fen    dieses     Lösungsmittelgemisches    und Zugabe von  wenig Benzol kristallisiert werden; in den Mutterlaugen  verbleiben grössere Mengen eines gelben Öls.

   Durch       Umkristallisieren        aller    kristallinen Fraktionen aus     Ben-          zol-Hexan    werden 45 mg     Anguidin    gewonnen.     Smp.     162-163  C.  



  Die Substanz     lässt    sich am Hochvakuum (0,01 mm       Hg)    bei 120  C     Badtemperatur    sublimieren; das Subli-           mat    zeigt den gleichen     Smp.    und     Rf-Wert        im        Dünn-          schicht-Chromatogramm    wie das     Kristallisat.     



       Beispiel   <I>2</I>       Anguidin     Der gleiche     Stanzen    wie im Beispiel 1 wird     in    einem       Fermenter    (New Brunswick Co., New Brunswick USA,  Typ     FS    314), ebenfalls von einer     Konidiensuspension     ausgehend, in 10     Litern    einer Nährlösung, welche von  der in Beispiel 1     erwähnten    nur dadurch abweicht,  dass das     Natriumnitrat    durch 4 g     NH4N03    p. a.

   pro  Liter ersetzt worden ist, 113 Stunden lang unter     Rühren     (450 Umdrehungen pro Minute) und Belüftung (5 Liter  Luft pro Minute bei 27  C)     inkubiert.    Das     Mycel        wird     durch Filtration abgetrennt und das klare gelbe     Filtrat          (pH    5,0) mit Essigester mehrmals extrahiert. Die Ex  trakte werden zweimal mit 1 1 Wasser nachgewaschen  und gemeinsam in einem     Umlaufverdampfer        stark    ein  geengt. Das Konzentrat wird in einem Rotationsver  dampfer zur Trockne eingedampft.

   Der Rückstand    (1,94 g) wird zwischen gleichen Volumina     Petroläther     und 90     igem        wässrigem    Methanol verteilt; in der     Metha-          nol-Wasser-Phase    verbleiben 1,68 g Material, welches  an 85 g     Kieselgel        chromatographiert    wird.

   Mit     Chloro-          form-Methanol   <B>(99:</B> 1) werden 0,72 g Material     eluiert.          Kristallisation    aus     Benzol-Heptan    ergibt 0,39 g     Angui-          din    vom     Smp.    162-164 .

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums Anguidin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm der Pilzspecies Fusarium anguioides Sherb. aus einer Nährlösung züchtet und hierauf das Antibioticum Anguidin aus der Nährlösung isoliert.

   UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass man den Stamm NRRL 3020 der Pilz- species Fusarium anguioides Sherb. verwendet.