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CH426699A - Process for preparing a composition containing thermally stable lysozyme - Google Patents

Process for preparing a composition containing thermally stable lysozyme

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Publication number
CH426699A
CH426699A CH620363A CH620363A CH426699A CH 426699 A CH426699 A CH 426699A CH 620363 A CH620363 A CH 620363A CH 620363 A CH620363 A CH 620363A CH 426699 A CH426699 A CH 426699A
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
sep
lysozyme
sugar
composition containing
thermally stable
Prior art date
Application number
CH620363A
Other languages
French (fr)
Inventor
Dubois-Prevost Raoul
Original Assignee
Lysofrance Soc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lysofrance Soc filed Critical Lysofrance Soc
Publication of CH426699A publication Critical patent/CH426699A/en

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Description

       

  Procédé de préparation d'une     composition    contenant du lysozyme stable     thermiquement       La présente invention a     pour    objet un     procédé     pour la préparation d'une     composition        contenant    du  lysozyme, stable     thermiquement,    caractérisé en ce  qu'on soumet une matière naturelle contenant du  lysozyme à une     extraction    au moyen d'un acide et  qu'on mélange la solution aqueuse de sel d'acide de  lysozyme     ainsi    obtenue avec un agent stabilisant  constitué par au     moins    un     diol,    ou un polyol.  



  Le lysozyme est un produit naturel sensible  aux variations des     conditions    extérieures ; il est ins  table et se dégrade en présence d'eau, d'autant plus  vite que les solutions en sont plus diluées.     Le    lyso  zyme est également instable à la chaleur,     cette    ins  tabilité étant d'ailleurs     différente    selon l'état d'humi  dité du     lysozyme    : à sec le lysozyme résiste jusqu'à  1200 C à la décomposition; tandis qu'en     solution     aqueuse, il reste stable jusqu'à 65 - 700 C, se dégrade  lentement vers     80o    C, puis se dégrade brutalement  vers 1000 C.  



  Or, on a fait la     constatation    que des solutions  de lysozyme mélangées à l'un des agents     précités     sont plus stables que les solutions aqueuses simples.  La solution aqueuse de lysozyme est de     préférence     obtenue par extraction à partir de blanc     d'#uf    et  la stabilisation de cette solution     s'effectue    de pré  férence en ajoutant une quantité de sucre portant  sa     concentration    jusqu'à     celle    du sirop du Codex       pharmaceutique,    à     savoir        environ        65%.     



  L'eau de ce sirop peut être évaporée par des  procédés bon marché, pour donner une poudre sucrée  d'excellente conservation.  



  Dans les deux cas, la     composition    obtenue à  savoir le lysozyme en sirop ou en poudre sucrée,  est vraiment concentrée et     parfaitement    stable.    Cette     composition    peut être associée à du sucre  en vue d'obtenir un sucre dont la     concentration    en  lysozyme est au maximum de 100 parties par       million.     



  A cet effet on peut pulvériser la solution sucrée  de     lysozyme    en particules très divisées sous     faible     pression. Cette pulvérisation a lieu sur du sucre en  mouvement lui-même de façon que les     particules     très fines de la pulvérisation     permettent    une répar  tition homogène du lysozyme qui se fixe sur chaque  grain de sucre sous     forme    d'une fine particule de  sirop par     adsorption,        particule    qui devient     elle-          même    du sucre     lysozymé    par évaporation de l'eau  dans la tour de séchage,

   sans que la chaleur ait pu  détruire l'enzyme car     l'évaporation    de l'eau du sirop  absorbe les calories qui auraient pu dégrader le  lysozyme.  



  Le moment de     cette    pulvérisation, pour tenir  compte des risques de perte de solution, est choisi  à la sortie des     turbines,    juste à l'entrée de la tour  de séchage.  



  La pulvérisation     des    solutions de lysozyme dans  ces     conditions    n'augmente l'humidité du sucre que  de     2'%,    ce qui ne provoque aucune     surcharge     importante à l'appareillage de séchage.  



  Dans     certains    cas, la     présence    de sucre commu  nique à la     composition    un goût parfois peu     compa-          tible    ou même incompatible avec l'emploi envisagé  pour celle-ci, par exemple l'incorporation dans un       dentifrice    ou bien peut rendre difficile la réalisation  d'émulsions, ou nuire à la solubilité de     principes     actifs, par exemple     dans    le cas de la préparation de  pommades et/ou d'onguents et de solutions.

        Dans ce cas, on     utilisera    comme agent stabilisant  au lieu du sucre, un     diol    ou un polyol tel que     l'éthy-          lène-glycol,    le     propylène-glycol,    le     glycérol,    le     pen-          taérythritol,    le sorbitol, le     mannitol,        l'inositol    et le       quercitol.     



  Pour démontrer l'efficacité des agents     envisagés     sur la stabilisation des     solutions    de     lysozyme,    on a       effectué    une     comparaison    de     stabilité    à     différentes     températures et pendant     différentes    durées entre une  solution aqueuse témoin contenant 100     Etg/ml    de  lysozyme et des     solutions        identiques    contenant en       outre        35        %        (p/v)

          de        chacun        des        agents        étudiés.        La     technique d'essai est celle     décrite    par     SMOLELIS      &      HART-SELL    (J.

       Bact.    1949,<I>58,</I> 731) et consiste  à évaluer la lyse d'une     culture    fraîche centrifugée  et lavée de     Micrococcus        Lysodekticus    à pH 6,2 et  à température ambiante,

   après     addition    des diffé  rentes     solutions        lysozymées.        Les        conditions    de trai  tement préalable de ces     solutions    en vue de     l'appré-          ciation    de la stabilité du lysozyme     sont    les suivantes  
EMI0002.0049     
  
    <I>Température <SEP>   <SEP> C <SEP> Durée</I>
<tb>  45 <SEP> 8 <SEP> jours
<tb>  60 <SEP> 3 <SEP> 'heures     
EMI0002.0050     
  
    <I>Température <SEP>   <SEP> C <SEP> Durée</I>
<tb>  80 <SEP> 2 <SEP> heures
<tb>  100 <SEP> 1 <SEP> heure       Le calcul permettant la     comparaison        

  entre        .les    dif  férentes activités se fait d'après la formule  
EMI0002.0054     
  
EMI0002.0055     
  
    dans <SEP> laquelle <SEP> Al. <SEP> = <SEP> activité <SEP> relative,
<tb>  Te <SEP> = <SEP> temps <SEP> en <SEP> secondes <SEP> nécessaire
<tb>  à <SEP> la <SEP> solution <SEP> étalon <SEP> pour <SEP> abais  ser <SEP> d'environ <SEP> 400/1000 <SEP> la <SEP> i
<tb>  densité <SEP> optique <SEP> du <SEP> substrat.
<tb>  T@ <SEP> = <SEP> temps <SEP> mis <SEP> <I>par</I> <SEP> la <SEP> solution
<tb>  essayée <SEP> pour <SEP> obtenir <SEP> le <SEP> même
<tb>  résultat.

         II est bien évident qu'il y aura action protec  trice quand     Ar    sera supérieure à 1 et que cette action  sera d'autant plus     efficace    que     Ar    sera élevée.  



  Les résultats obtenus pour un     certain    nombre  des agents indiqués ont été les suivants  
EMI0002.0060     
  
    Valeur <SEP> de <SEP> Ar
<tb>  Produits <SEP> essayés <SEP> Températures
<tb>  45o <SEP> 60,, <SEP> 800 <SEP> 1000
<tb>  Ethylène <SEP> glycol <SEP> .<B>...................... <SEP> .....</B> <SEP> ...- <SEP> 1,88 <SEP> 1,41 <SEP> 1,76 <SEP> 4,3
<tb>  Propylène <SEP> glycol <SEP> <B>.....................</B> <SEP> .<B>.......</B> <SEP> .<B>------</B> <SEP> 2,1 <SEP> 1,46 <SEP> 2,22 <SEP> 4,3
<tb>  Glycérol <SEP> ..<B>.....</B> <SEP> __<B>-------------</B> <SEP> ..........................._ <SEP> 1,46 <SEP> 1,82 <SEP> 1,15 <SEP> 2,22
<tb>  Sorbitol <SEP> <B>--------</B> <SEP> . <SEP> <B>-------------</B> <SEP> ._-. <SEP> ......... <SEP> -. <SEP> ..........

   <SEP> 1,37 <SEP> 1,11 <SEP> 1,54 <SEP> 2,67
<tb>  Pentaérythritol<B>............</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> .<B>-------------</B> <SEP> -<B>------</B> <SEP> 1,41 <SEP> 0,37 <SEP> 0,48 <SEP> 0,66
<tb>  Mannitol <SEP> <B>------</B> <SEP> ...-_<B>...... <SEP> ...... <SEP> ......</B> <SEP> .........<B>......</B> <SEP> 1,75 <SEP> 1,00 <SEP> 1,00 <SEP> 1,00       Il ressort clairement de ces     résultats    que l'addition  de     diols    et de polyols, aux     solutions    de lysozyme a  un effet stabilisateur     spectaculaire    sur     celles-ci,    et  cela spécialement aux     températures    plus élevées,  auxquelles, comme indiqué dans le préambule,

   ces       solutions    ont     précisément    une     forte    tendance à se  dégrader.  



  La proportion de ces agents stabilisateurs pour  laquelle les     résultats    reportés ci-dessus ont été     obte-          nus        est        de        35%.        Toutefois,        cette,        proportion        peut     être plus basse ou plus élevée, à la fois selon la  nature de l'agent protecteur     choisi    et selon 1e, tem  pérature et/ou la durée     de        conservation    de la solu  tion de lysozyme à protéger.

   Le nombre de variables       intervenant    dans cette évaluation de la     concentration     pour un cas     particulier    est     tel    qu'il     n'est    pas possi  ble de donner une règle précise pour le choix de la       proportion    à     utiliser.    On peut cependant indiquer  d'une manière très générale que l'on peut dans    l'ensemble     utiliser    des     proportions    de 10 à 75     b/9    et       de        préférence        de        20    à  <RTI  

   ID="0002.0097">   40'%        de        l'agent        protecteur     choisi dans les classes définies plus haut. On     obtient,     en fait, une stabilisation à toutes les     concentrations.     Seul le degré de cette     stabilisation    peut varier en  fonction     de    la     concentration    en agent stabilisateur.  



  L'association du sucre avec le lysozyme,     réalisée     par l'intermédiaire     d'une    composition obtenue con  formément à l'invention a démontré une     surprenante          efficacité    contre la     carie        dentaire.    On a constaté  que l'association de 10 à 25     gamma    de lysozyme  par gramme de sucre     ordinaire        empêche        l'apparition     de la carie     dentaire    et l'ostéolyse     alvéolaire    (voir  en     particulier    l'article du Dr R.

       DUBOIS-PREVOST     dans   Hygie  , 18 juin 1961, pages 5 à 16).  



  De très nombreuses préparations à     usage    sani  taire ou thérapeutique, peuvent être préparées à par  tir des     compositions    obtenues conformément à l'in  vention, telles que     dentifrices,    pommades, solutés ou      onguents, et     contenant    du lysozyme dont la     stabilité     est assurée grâce à la     présence    d'un     diol    ou d'un  polyol, y     compris    le sucre,

   ces préparations bénéfi  ciant alors en outre éventuellement     des    propriétés       adoucissantes        ete        émollientes    de l'agent     stabilisateur     compris dans la composition utilisée pour réaliser  ces préparations.



  Process for preparing a composition containing thermally stable lysozyme The present invention relates to a process for the preparation of a composition containing lysozyme, thermally stable, characterized in that subjecting a natural material containing lysozyme to an extraction by means of an acid and mixing the aqueous solution of lysozyme acid salt thus obtained with a stabilizing agent consisting of at least one diol, or one polyol.



  Lysozyme is a natural product sensitive to variations in external conditions; it is unstable and degrades in the presence of water, the faster the more dilute the solutions are. Lysozyme is also unstable to heat, this instability being moreover different according to the state of humidity of the lysozyme: when dry, lysozyme resists decomposition up to 1200 C; while in aqueous solution, it remains stable up to 65 - 700 C, degrades slowly around 80o C, then degrades abruptly around 1000 C.



  However, it has been observed that lysozyme solutions mixed with one of the aforementioned agents are more stable than simple aqueous solutions. The aqueous lysozyme solution is preferably obtained by extraction from egg white and the stabilization of this solution is preferably carried out by adding a quantity of sugar bringing its concentration up to that of the syrup of the Pharmaceutical Codex, namely about 65%.



  The water in this syrup can be evaporated by inexpensive methods, to give a sweet powder of excellent preservation.



  In both cases, the composition obtained, namely lysozyme in syrup or in sweet powder, is really concentrated and perfectly stable. This composition can be combined with sugar in order to obtain a sugar whose lysozyme concentration is at most 100 parts per million.



  For this purpose, the sweet lysozyme solution can be sprayed into highly divided particles under low pressure. This spraying takes place on the moving sugar itself so that the very fine particles of the spray allow a homogeneous distribution of the lysozyme which is fixed on each grain of sugar in the form of a fine particle of syrup by adsorption, particle which itself becomes lysozymated sugar by evaporation of the water in the drying tower,

   without the heat being able to destroy the enzyme because the evaporation of the water from the syrup absorbs the calories which could have degraded the lysozyme.



  The moment of this spraying, to take into account the risk of loss of solution, is chosen at the outlet of the turbines, just at the inlet of the drying tower.



  Spraying the lysozyme solutions under these conditions only increases the humidity of the sugar by 2%, which does not cause any significant overload on the drying apparatus.



  In certain cases, the presence of sugar communicates to the composition a taste which is sometimes incompatible or even incompatible with the use envisaged for the latter, for example incorporation into a toothpaste or else can make it difficult to prepare. emulsions, or adversely affect the solubility of active ingredients, for example in the case of the preparation of ointments and / or ointments and solutions.

        In this case, instead of sugar, a diol or a polyol such as ethylene glycol, propylene glycol, glycerol, pentaerythritol, sorbitol, mannitol, pentaerythritol, sorbitol, mannitol, or inositol and quercitol.



  To demonstrate the effectiveness of the agents envisaged on the stabilization of lysozyme solutions, a comparison of stability at different temperatures and for different times between a control aqueous solution containing 100 Etg / ml of lysozyme and identical solutions containing additionally 35 % (w / v)

          of each of the agents studied. The test technique is that described by SMOLELIS & HART-SELL (J.

       Bact. 1949, <I> 58, </I> 731) and consists in evaluating the lysis of a fresh centrifuged and washed culture of Micrococcus Lysodekticus at pH 6.2 and at room temperature,

   after addition of the various lysozymium solutions. The conditions for the preliminary treatment of these solutions with a view to assessing the stability of lysozyme are as follows
EMI0002.0049
  
    <I> Temperature <SEP> <SEP> C <SEP> Duration </I>
<tb> 45 <SEP> 8 <SEP> days
<tb> 60 <SEP> 3 <SEP> 'hours
EMI0002.0050
  
    <I> Temperature <SEP> <SEP> C <SEP> Duration </I>
<tb> 80 <SEP> 2 <SEP> hours
<tb> 100 <SEP> 1 <SEP> hour The calculation allowing the comparison

  between the different activities is done according to the formula
EMI0002.0054
  
EMI0002.0055
  
    in <SEP> which <SEP> Al. <SEP> = <SEP> relative <SEP> activity,
<tb> Te <SEP> = <SEP> time <SEP> in <SEP> seconds <SEP> necessary
<tb> to <SEP> the <SEP> solution <SEP> standard <SEP> for <SEP> lowers <SEP> by approximately <SEP> 400/1000 <SEP> the <SEP> i
<tb> optical <SEP> density <SEP> of the <SEP> substrate.
<tb> T @ <SEP> = <SEP> time <SEP> put <SEP> <I> by </I> <SEP> the <SEP> solution
<tb> tried <SEP> to <SEP> get <SEP> the same <SEP>
<tb> result.

         It is quite obvious that there will be a protective action when Ar is greater than 1 and that this action will be all the more effective as Ar is high.



  The results obtained for a number of the agents indicated were as follows
EMI0002.0060
  
    <SEP> value of <SEP> Ar
<tb> Products <SEP> tested <SEP> Temperatures
<tb> 45o <SEP> 60 ,, <SEP> 800 <SEP> 1000
<tb> Ethylene <SEP> glycol <SEP>. <B> ...................... <SEP> ..... </B> < SEP> ...- <SEP> 1.88 <SEP> 1.41 <SEP> 1.76 <SEP> 4.3
<tb> Propylene <SEP> glycol <SEP> <B> ..................... </B> <SEP>. <B> .... ... </B> <SEP>. <B> ------ </B> <SEP> 2.1 <SEP> 1.46 <SEP> 2.22 <SEP> 4.3
<tb> Glycerol <SEP> .. <B> ..... </B> <SEP> __ <B> ------------- </B> <SEP> .. ........................._ <SEP> 1.46 <SEP> 1.82 <SEP> 1.15 <SEP> 2.22
<tb> Sorbitol <SEP> <B> -------- </B> <SEP>. <SEP> <B> ------------- </B> <SEP> ._-. <SEP> ......... <SEP> -. <SEP> ..........

   <SEP> 1.37 <SEP> 1.11 <SEP> 1.54 <SEP> 2.67
<tb> Pentaerythritol <B> ............ </B> <SEP>. <B> ........ </B> <SEP>. <B> - ------------ </B> <SEP> - <B> ------ </B> <SEP> 1.41 <SEP> 0.37 <SEP> 0, 48 <SEP> 0.66
<tb> Mannitol <SEP> <B> ------ </B> <SEP> ...-_ <B> ...... <SEP> ...... <SEP>. ..... </B> <SEP> ......... <B> ...... </B> <SEP> 1.75 <SEP> 1.00 <SEP> 1 , 00 <SEP> 1.00 It is clear from these results that the addition of diols and polyols, to lysozyme solutions has a dramatic stabilizing effect thereon, especially at higher temperatures, at which, as indicated in the preamble,

   precisely these solutions have a strong tendency to degrade.



  The proportion of these stabilizing agents for which the results reported above were obtained is 35%. However, this proportion may be lower or higher, both depending on the nature of the protective agent chosen and depending on the temperature and / or the shelf life of the lysozyme solution to be protected.

   The number of variables involved in this evaluation of the concentration for a particular case is such that it is not possible to give a precise rule for the choice of the proportion to be used. It can, however, be stated in a very general manner that it is generally possible to use proportions of 10 to 75 b / 9 and preferably of 20 to <RTI

   ID = "0002.0097"> 40 '% of the protective agent chosen from the classes defined above. In fact, stabilization is obtained at all concentrations. Only the degree of this stabilization can vary as a function of the concentration of stabilizing agent.



  The association of sugar with lysozyme, produced by means of a composition obtained in accordance with the invention, has demonstrated surprising efficacy against dental caries. It has been found that the association of 10 to 25 gamma of lysozyme per gram of ordinary sugar prevents the appearance of dental caries and alveolar osteolysis (see in particular the article by Dr R.

       DUBOIS-PREVOST in Hygie, June 18, 1961, pages 5 to 16).



  Very many preparations for sanitary or therapeutic use can be prepared by shooting compositions obtained in accordance with the invention, such as dentifrices, ointments, solutes or ointments, and containing lysozyme, the stability of which is ensured thanks to the presence a diol or a polyol, including sugar,

   these preparations then also optionally benefiting from the softening and emollient properties of the stabilizing agent included in the composition used to make these preparations.

Claims (1)

REVENDICATION Procédé pour la préparation d'une composition contenant du lysozyme stable thermiquement, carac térisé en ce qu'on soumet une matière naturelle con tenant du lysozyme à une extraction au moyen d'un acide et qu'on mélange la solution aqueuse de sel d'acide de lysozyme ainsi obtenue avec un agent stabilisant constitué par au moins un diol ou un polyol. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le stabilisateur est employé à raison de 10 à 75 % (p/v). 2. CLAIM A process for the preparation of a composition containing thermally stable lysozyme, characterized in that a natural material containing lysozyme is subjected to an extraction by means of an acid and that the aqueous salt solution is mixed. lysozyme acid thus obtained with a stabilizing agent consisting of at least one diol or one polyol. SUB-CLAIMS 1. Method according to claim, characterized in that the stabilizer is used in an amount of 10 to 75% (w / v). 2. Procédé selon la revendication et la sous- revendication 1, caractérisé en ce que l'agent sta bilisateur est le sucre. 3. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'agent stabilisateur est l'éthylène-glycol, le propylène-glycol ou le glycérol, à une concentration comprise entre 20 et 40%. 4. Process according to claim and sub-claim 1, characterized in that the stabilizing agent is sugar. 3. Method according to claim, characterized in that the stabilizing agent is ethylene glycol, propylene glycol or glycerol, at a concentration of between 20 and 40%. 4. Procédé selon la revendication et les sous revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la solu tion de lysozyme stabilisée avec du sucre est des- sédhée. Process according to claim and sub-claims 1 and 2, characterized in that the lysozyme solution stabilized with sugar is desedinated.
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