Procédé pour inactiver des particules pathogènes virulentes L'invention concerne un traitement de micro organismes ou particules pathogènes virulents, trai tement qui apour effet de modifier les particules ou, en d'autres termes, de les inactiver de manière qu'el les perdent leur aptitude à provoquer des maladies tout en conservant leurs propriétés antigènes, immu nisantes. L'invention se rapporte à un procédé per fectionné d'inactivation de ces particules par voie électrolytique.
Le procédé selon l'invention s'applique au traite ment de n'importe lequel des divers micro-organismes ou particules pathogènes, tels que bactéries, virus, etc. Il s'est cependant montré particulièrement inté ressant pour le traitement des virus et sera donc plus particulièrement décrit et illustré en rapport avec le traitement des virus.
On a proposé plusieurs procédés de préparation de virus inactivés, destinés, par exemple, à être utili sés comme vaccins immunisants, le terme vaccin étant employé ici dans son sens général, c'est-à-dire non limité à la vaccine. Aucun des procédés connus ne s'applique à tous ces micro-organismes. Les pro cédés les plus courants d'inactivation des virus com prennent un traitement chimique, par exemple par la formaldéhyde, ou un traitement par la lumière ultraviolette. Toutefois, ni l'un ni l'autre de ces trai tements ne donne entière satisfaction.
Par exemple, dans le cas du traitement du virus de la poliomyélite par le formol, l'agent chimique n'inactive pas les agrégats de virus. Les particules de virus enfermées dans ces amas peuvent rester dans leur forme infectieuse et doivent donc être éliminées du vaccin, par exemple par filtration, avant l'injection du vaccin dans l'organisme à immuniser. Malheureu sement, cette filtration diminue l'activité de la prépa ration, car chaque filtration entraîne une perte de virus,
de sorte que la quantité totale de virus immu- nologiquement actif dans le système est diminuée. La méthode chimique a également pour inconvénient que la réaction est très lente, de sorte que la :durée du traitement complet est ordinairement de plusieurs jours.
Des difficultés semblables ont été -rencontrées dans le traitement des particules pathogènes par la lumière ultraviolette: On a également proposé de traiter les micro organismes en faisant passer un courant électrique;
sous une densité de courant de 10 à 12 ampères -par 400<I>ce</I> et sous une tension de 20 à 30 volts, à tra vers une suspension des micro-organismes dans un électrolyte tel qu'une solution de chlorure de sodium, contenu dans le compartiment central d'un appareil d'électrolyse à trois compartiments, ledit comparti ment central étant isolé des compartiments des élec trodes par les diaphragmes semi-perméables et les compartiments des électrodes étant remplis d'eau.
Dans ces conditions, l'électrolyte est décomposé par électrolyse, et l'inactivation des micro-organismes que ce traitement peut produire paraît résulter d'une, action chimique des produits de décomposition -de l'électrolyse, et non pas d'une action -directe -du courant électrique. Ce -procédé est donc affecté des défauts communs aux autres procédés chimiques; tout en étant encore plus compliqué. Il -apparaît que le- procédé . électrique décrit ci-dessus n'a eu aucune por tée pratique.
En général, les procédés chimiques nécessitent une filtration ou autre- opération de séparation ayant pour effet une diminution de l'activité., comme on l'a déjà relevé, et sont en outre compliqués par la néces sité d'éliminer ou de neutraliser- le- -réactif .chimique utilisé. Si celui-ci n'est pas soigneusement éliminé ou neutralisé,
le vaccin résultant est susceptible .de-pro.- duire des effets .secondaires d'irritation, dus aux pro duits chimiques résiduels -présents.
L'invention a pour but d'offrir un procédé simpli fié, plus rapide et plus économique; pour inactiver les particules pathogènes en conservant leurs proprié tés immunologiques, sans faire appel à des réactifs chimiques, supprimant ainsi la nécessité d'une filtra tion, élimination ou neutralisation des produits chi miques résiduels.
Ce procédé permet la production de virus ou autres particules pathogènes inactivés, convenant à la préparation de vaccins et produits analogues, et cela de façon plus efficace et plus éco nomique que jusqu'ici.
Les expressions inactivation ou inactivé telles qu'utilisées ici doivent être comprises dans le sens d'une altération des particules pathogènes ayant pour effet de les priver de leur faculté de provoquer la maladie tout en laissant substituer leur faculté de susciter la production d'anticorps spécifiques dans l'animal traité ou, en d'autres termes, en conservant leurs propriétés immunologiques.
On a découvert que les buts mentionnés ci-dessus peuvent être atteints en soumettant les particules pa thogènes virulentes en suspension aqueuse à un pH d'environ 7, à une oxydation par électrolyse en con tact avec l'anode d'une cellule d'électrolyse, à un potentiel constant d'au moins environ 1 volt par rap port à l'électrode au calomel normale, mais inférieur au potentiel de décomposition du système eau électrolyte, tout en empêchant un contact desdites particules avec la cathode de la cellule.
On constate que les particules ainsi traitées ne sont plus infec tieuses mais conservent entièrement, ou presque en tièrement, leur faculté d'assurer une protection immu- nologique lorsqu'elles sont utilisées comme vaccin. Les virus ainsi inactivés seront parfois désignés dans l'exposé qui suit par l'expression vaccin EPC , c'est-à-dire vaccin produit par électrolyse sous poten tiel contrôlé.
Les particules pathogènes, comme d'autres parti cules, sont formées de diverses espèces d'atomes liés ensemble d'une façon quelconque. Il en résulte que des groupes fonctionnels sont présents à la surface des particules ou font partie de l'acide nucléique central. On admet que ce sont ces groupes, ou certains de ceux-ci, qui sont à l'origine du caractère infectieux de la particule, et qu'un changement de leur nature chimique modifie ou détruit l'aptitude des particules à provoquer une maladie.
L'électrolyse sous potentiel contrôlé du procédé selon l'invention est essentiellement une réaction d'oxydation et l'inactivation des particules pathogènes produite par le présent procédé résulte d'une telle oxydation.
Un contact intime entre les particules traitées et l'anode de la cellule est donc essentiel. On favorise ce contact en remuant ou agitant le liquide du com partiment anodique et en maintenant l'anode relati vement exempte de dépôts.
Le potentiel électrique aux bornes de la cellule électrolytique est de préférence d'environ 1 à 2 volts par rapport à au calomel normale, c'est- à-dire inférieur à celui auquel l'eau ou toute autre substance inorganique présente est décomposée. En général, cette tension ne dépasse pas environ 2 volts. Dans la plupart des cas, le potentiel le plus avanta geux est de 1,2 à 1,6 volt environ, par rapport à l'électrode au calomel normale.
Ces conditions de potentiel, ainsi que d'autres conditions décrites ci- après, ont pour effet que le passage du courant élec trique à travers la cellule est uniquement dû à un transfert d'électrons entre le donneur d'électrons, c'est-à-dire les micro-organismes, et l'électrode en fonction, c'est-à-dire l'anode. Ce courant est norma lement d'environ 1 à 10 milliampères, plus souvent d'environ 2 à 7 milliampères, par 10 cm2 d'électrode en fonction. Sous cette tension, il ne se produit aucune décomposition électrolytique de l'électrolyte.
On a observé que si on laisse un dépôt se former sur l'anode, l'intensité du courant diminue. Lorsqu'on constate une tendance à la formation d'un tel dépôt, qui se traduit d'habitude par une diminution de l'in tensité jusqu'à environ 2 milliampères, il y a lieu de retirer périodiquement l'anode et de la nettoyer. Cela est particulièrement important lorsque la matière traitée est souillée par des matières protéiques étran gères.
Il est également essentiel que la solution conte nant le micro-organisme soit maintenue sensiblement neutre, c'est-à-dire à un pH d'environ 7. Lorsque la solution contenant le micro-organisme à traiter n'est pas naturellement neutre, il convient de lui ajouter un tampon approprié.
L'invention et ses avantages seront mieux com pris à la lecture de la description qui suit et des exemples illustrés par le dessin annexé dans lequel La fig. 1 représente de façon conventionnelle et un peu schématique une cellule électrolytique parti-. culiérement avantageuse pour l'exécution de l'électro lyse sous potentiel contrôlé du présent procédé, et la fig. 2 est un graphique contenant plusieurs courbes correspondant à différents potentiels électri ques, en volts, par rapport à l'électrode normale au calomel, obtenues en portant le pourcentage de virus infectieux survivant (en ordonnées),
en fonction de la durée du traitement en heures (en abscisses), dans le cas du traitement de la souche de Lee du virus type B de la grippe. Les pourcentages de virus infectieux survivant sont rapportés à l'infectiosité de la suspen sion originale de virus avant le début du traitement.
La cellule électrolytique représentée à la fig. 1 comprend un compartiment cathodique 1 et un com partiment anodique 2 séparés par un diaphragme 3, formé d'un disque de verre fritté à fine porosité, c'est à-dire à pores d'une grosseur maximum de 4 - 5,5 microns. Le compartiment anodique contient une anode de platine 4 de forme semi-circulaire et d'envi ron 10 cm2 de surface effective. L'anode est connec tée à la source électrique par le conducteur 5.
Le compartiment anodique contient également une électrode de référence 6 destinée à la mesure exacte de la tension aux bornes de la cellule. Cette électrode est munie d'une membrane de dialyse .et d'anneaux de retenue 7. En variante, un pont de sel peut être connecté à une électrode au calomel nor male, de la manière connue. Pour maintenir un con tact plus intime entre la matière traitée et l'électrode 4, des moyens d'agitation de la suspension sont dis posés dans le compartiment anodique. Ces moyens consistent en un agitateur mécanique 8.
Le compartiment cathodique contient une élec trode de platine 9 portant une connexion 10. Les deux compartiments sont munis d'un robinet 11 pour la vidange ou pour le prélèvement d'échantillons, et le compartiment anodique est muni d'un embranche ment latéral 12, également pour le prélèvement d'échantillons. En outre, les deux compartiments sont fermés par un capuchon 13 s'adaptant sur le corps principal du compartiment, par l'intermédiaire d'un joint rodé conique normalisé 14.
La cellule est construite en verre en dehors des parties indiquées comme étant formées d'autres ma tières, et sa forme est prévue pour permettre son im mersion dans un bain glacé. Elle est connectée à des moyens d'alimentation en courant continu permettant de faire varier le potentiel de façon exactement con trôlée, comprenant des moyens de mesure exacte de la tension et de l'intensité. Ces moyens sont bien connus et il n'est pas nécessaire de les décrire.
A titre d'exemple de mise en #uvre du procédé, une portion mesurée d'une solution de virus virulent est diluée avec un volume égal d'un tampon au phos phate bien connu, comme celui préparé en dissolvant des quantités équimoléculaires de phosphate mono- sodique et de phosphate disodique dans un poids égal d'eau, ce qui donne une solution tamponnée à un pH d'environ 7, et cette solution est placée dans le compartiment anodique.
Le volume de la solution de virus ainsi diluée et tamponnée doit être suffisant pour remplir le compartiment anodique à un niveau tel que l'anode soit toujours submergée, compte tenu du prélèvement périodique d'échantillons en cours d'opération.
Dans le compartiment cathodique, on introduit une solution composée de volumes égaux de la solu tion de tampon au phosphate décrite ci-dessus et d'eau distillée déminéralisée. Aucune solution de virus n'est introduite dans le compartiment ca thodique.
La cellule électrolytique est prévue pour être submergée dans un bain glacé ou pour être autrement maintenue à 40 C; comme mentionné ci-dessus, de façon que le virus présent dans le compartiment ano dique ne puisse pas être inactivé par la chaleur. Le potentiel électrique est alors appliqué aux bornes de la cellule, la tension par rapport à l'électrode de réfé rence étant contrôlée et réglée dans les limites men tionnées précédemment.
La durée du traitement et le potentiel optimum se sont montrés très variables suivant les différents types et souches de virus, le facteur temps dépendant quelque peu des tensions appliquées ainsi que de la concentration des micro-organismes dans le compar timent anodique. La concentration des organismes dans -le compartiment anodique ne paraît nullement critique, mais on a constaté que lorsque cette con centration diminue, le temps nécessaire pour l'inacti vation du micro-organisme diminue également.
Bien qu'au cours des expériences décrites ci-après, la cel lule ait été maintenue à la température du bain glacé afin d'éliminer la possibilité d'effets thermiques, la température du traitement est par ailleurs d'impor tance apparente minime ou nulle.
Comme mentionné, le potentiel électrique opti mum varie, dans les limites indiquées, toutes choses égales, suivant le micro-organisme particulier en trai tement, et il est donc recommandable de procéder à des essais préliminaires pour déterminer le potentiel optimum pour le micro-organisme ou souche de virus particulier à traiter.
Le disque de verre fritté 3 est scellé dans le tube de raccordement des compartiments. II sert à empê cher une migration du virus, ou autre micro-orga nisme en traitement, du compartiment anodique au compartiment cathodique, tout en permettant le pas sage du courant électrique entre les deux comparti ments. Ainsi, toute réaction inverse, par exemple une réduction, qui autrement pourrait âvoir lieu sur la cathode, est empêchée. Le disque de verre fritté peut être remplacé par d'autres diaphragmes ou membranéi aptes à contenir les micro-organismes tout en permettant le passage du courant électrique.
Dans les expériences décrites ci-après, on a uti lisé des électrodes de platine, qui se sont montrées spécialement avantageuses en raison des propriétés de stabilité et d'absence de toxicité du platine, de sorte que les réactions qui pourraient être cause d'un traitement chimique des micro-organismes ont été évitées. Les électrodes de platine sont également recommandables d'une manière générale pour la mise en aeuvre du procédé selon l'invention. On peut cependant utiliser des électrodes de n'importe quelle matière qui ne se décompose pas dans les conditions d'électrolyse prescrites et n'affecte pas défavorable ment l'activité immunologique des micro-organismes.
De même, bien que le tampon au phosphate dé crit ci-dessus se soit montré très efficace pour main tenir le pH voulu dans le compartiment anodique, tout en étant dépourvu d'effets défavorables sur l'ac tivité immunologique des micro-organismes traités, d'autres tampons connus, aptes à maintenir un pH sensiblement neutre et n'affectant pas défavorable ment l'activité immunologique des micro-organismes sont utilisables. Le tampon peut être ajouté à la so lution du micro-organisme sous forme solide ou en solution. Dans certains cas, il apparaît que la solu tion du micro-organisme contient un tampon naturel, de sorte que l'adjonction d'un tampon supplémen taire est superflue.
D'autre part, n'importe quel élec trolyte stable aux tensions indiquées peut être utilisé dans le compartiment cathodique à la place de la solution de tampon décrite ci-dessus.
On a constaté qu'un dépôt s'accumule fréquem ment sur l'anode en cours d'opération. Ce dépôt se traduit -par une diminution de l'intensité du courant traversant la cellule. S'il en est ainsi, il convient de retirer l'anode de la cellule et de la nettoyer. Ce net toyage s'effectue avantageusement en immergeant l'anode dans de l'acide nitrique concentré chaud pen dant environ 5 mn, puis en rinçant l'électrode dans l'eau distillée.
On plonge ensuite l'électrode dans de l'alcool éthylique absolu puis on la flambe. Après refroidissement dans de l'eau distillée stérile froide, l'électrode est remise en place et le traitement élec- trolytique poursuivi. Il est souvent avantageux de nettoyer ainsi l'anode à intervalles d'environ 1/2 h en cours d'opération.
Pour déterminer la durée de traitement optimum pour un micro-organisme particulier, on peut soutirer de temps en temps des prises aliquotes de la solution du compartiment anodique, et en déterminer l'acti vité et l'inactivation de la manière connue. En géné ral; on a constaté que le virus infectieux est complè tement inactivé en 3-4 heures environ dans le cas du virus de la grippe, alors- que certaines souches de virus de la poliomyélite nécessitent environ 36 à 48 heures de traitement. A titre de comparaison, l'inac tivation par traitement au formol nécessite 4-7 jours pour le virus de la grippe et 10-14 jours pour le virus de la poliomyélite.
<I>Exemple Z</I> On a introduit 25 ml de la souche de Lee du virus de la grippe, type B, partiellement purifié par un cycle d'ultracentrifugation et de remise en suspen sion, dans le compartiment anodique d'une cellule électrolytique en substance telle que représentée à la fig. 1, chacun des compartiments de la cellule ayant une capacité de 100 ml et la surface effective de l'anode en platine étant d'environ 10 cm2. On a éga lement ajouté dans le compartiment anodique 25 ml d'une solution tampon au phosphate 0,2 molaire, de pH 7,
préparée en ajoutant des quantités équimolé culaires de phosphate monosodique et de phosphate disodique à de l'eau distillée déminéralisée. Dans le compartiment cathodique, on a introduit 25 ml de la même solution tampon de phosphate et 25 ml d'eau distillée déminéralisée. A l'exception de la solution de virus, toutes les solutions utilisées étaient stériles.
Un pont d'agar et sel, dans lequel l'électro lyte conducteur est un tampon au phosphate au même pH que décrit ci-dessus, a été utilisé pour con necter une électrode au calomel normale avec le liquide du compartiment anodique de la cellule. L'électrode au calomel, destinée à la mesure exacte du potentiel aux bornes de la cellule, a été connectée au pôle négatif de la cellule par l'intermédiaire d'un voltmètre électronique.
On a submergé la cellule électrolytique dans un bain glacé pendant toute l'opération et on a main tenu un potentiel électrique de travail de 1,3 - 1,4 volt par rapport à l'électrode de référence, pendant toute la durée de l'expérience. Toutes les demi-heures environ, on a retiré l'anode de platine de la cellule et on l'a soigneusement nettoyée comme décrit ci- dessus.
Toutes les heures, on a prélevé des prises aliquo tes de la solution du compartiment anodique et on les a inoculées à des embryons de poulet de 10 jours, le volume d'inoculum étant chaque fois de 0,1 ml par neuf. On a laissé les neufs fertiles incuber à 360 C pendant 48 h, puis on les a récoltés et on a dosé le virus dans le fluide allantoïdique extrait des différents #ufs.
Les résultats de ces expériences, exprimés en doses 50 % infectieuses par millilitre de fluide allan- todique après différentes durées de traitement de la matière, sont rassemblés dans le tableau suivant. A titre de comparaison, le résultat d'épreuves effectuées avec le virus non traité figure également.
EMI0004.0049
<I>Tableau <SEP> I</I>
<tb> Durée <SEP> de <SEP> traitement, <SEP> Heures <SEP> Doses <SEP> 50% <SEP> infectieuses/ntl
<tb> <B>0 <SEP> 1077</B>
<tb> 1 <SEP> 107,5
<tb> 2 <SEP> 10e7
<tb> <B>3 <SEP> 10.J</B>
<tb> 4 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 0 En plus de la mesure de l'effet du traitement d'électrolyse sous potentiel contrôlé sur l'infectiosité, on a déterminé l'influence de ce traitement sur la faculté du virus de la grippe d'agglutiner les globu les rouges de sang de poulet.
La faculté du virus de la grippe à provoquer l'hémo-agglutination, désignée ici HA , dépend de l'intégrité de la couverture protéique de la particule de virus. Dans la prépara tion commerciale des vaccins contre la grippe, l'ac tivité HA des préparations, après inactivation au formol ou par irradiation ultraviolette, est utilisée comme indication de l'activité antigène résiduelle qui, comme mentionné, dépend de l'intégrité de la cou verture protéique.
Les résultats de nos essais d'hémo- agglutination sur le virus avant le traitement et après 3 et 4 h de traitement, respectivement, sont indiqués dans le tableau suivant
EMI0004.0060
<I>Tableau <SEP> II</I>
<tb> Durée <SEP> du <SEP> traitement, <SEP> Heures <SEP> Unités <SEP> HA/ml
<tb> 0 <SEP> 1280
<tb> 3 <SEP> 1280
<tb> 4 <SEP> 1280 Les résultats de ces mesures indiquent qu'il n'y a aucune perte mesurable d'activité HA après 4 h d'électrolyse sous potentiel contrôlé du présent pro cédé, bien que l'infectiosité du virus soit complète ment détruite par un traitement d'une telle durée.
Ces épreuves montrent qu'un traitement conforme à l'invention et d'une durée de 4 h n'a aucun effet sur l'intégrité de la couverture protéique des particules de virus. La souche de Lee du virus de la grippe, utilisée dans les expériences ci-dessus, est une souche stan dard de virus de la grippe utilisée sur une grande échelle dans les travaux de laboratoire, et qui est bien connue dans ce domaine.
Les méthodes utilisées pour l'évaluation des préparations de virus sont admi ses et reconnues dans cette spécialité et sont décrites dans les publications suivantes : Standard Method of Prèparing Chicken Embryo for Vaccine Produc tion, as described by Beveridge and Burnet , Med. Res. Council, 1946, Special Report Series 256 ;
Method of obtaining 50 6/o Infective Dose, based on procedure described by L.J. Reed and H. Muench , Amer.
Jour. Hygiene, 1938, Vol. 27, p. 493 ; et Hemagglutination Titer obtained by method of<B>LE.</B> Salk , Jour. of Immunology; 1944, Vol. 49, page 87.
Les expériences décrites, utilisant le virus de la grippe de Lee, ont été répétées quatorze fois avec sensiblement les mêmes résultats.
<I>Exemple 2</I> On a répété le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant la souche PR-8 du virus de la grippe (type A), le potentiel aux bornes de la cellule étant de 1,6 - 1,7 volt par rapport à l'électrode au calomel. Des prises aliquotes ont été prélevées du comparti ment anodique toutes les demi-heures et leur infec- tiosité a été mesurée comme décrit dans l'exemple 1. Ces infectiosités, exprimées en doses 50% infec tieuses par millilitre, sont rassemblées dans le tableau suivant.
A titre de comparaison, le résultat d'une me sure sur le virus non traité figure également.
EMI0005.0039
<I>Tableau <SEP> 111</I>
<tb> Durée <SEP> du <SEP> traitement, <SEP> Heures <SEP> Doses <SEP> 50% <SEP> infectieuses/ml
<tb> 0 <SEP> 1,07.2
<tb> 1/2 <SEP> 106,2
<tb> 1 <SEP> <B>106,2</B>
<tb> 1 <SEP> 1/2 <SEP> 106.2
<tb> 2 <SEP> 1041s
<tb> 21/2 <SEP> 104.2
<tb> 3 <SEP> 10E.5
<tb> 3 <SEP> 1/2 <SEP> 101.s
<tb> 4 <SEP> 0 Ainsi qu'il ressort de ce tableau, le virus a été complètement inactivé par 4 h de traitement. Comme dans l'exemple 1, l'activité d'hémo-agglutination s'est montrée inchangée pendant toute la durée de l'expé rience.
L'exemple 2. a été répété huit fois dans des conditions sensiblement identiques avec les mêmes résultats que ci-dessus. <I>Exemple 3</I> Le mode opératoire de l'exemple 1 a été appliqué au traitement du virus de la poliomyélite. Cependant, en raison de la durée prolongée du traitement qui est nécessaire pour l'inactivation de ce virus particulier, on a placé la cellule électrolytique dans une chambre froide maintenue à 4 C, au lieu d'employer un bain glacé.
Dans cette expérience, le potentiel aux bornes de la cellule a été maintenu à 1,6 - 1;8 volt par rap port à l'électrode au calomel. L'infectiosité des échan tillons respectifs, déterminée par la technique des taches sur cultures de cellules de rein de singe, décrite par J.S. Youngner, Journal of Immunology, 1956, Vol. 76, p.
288, est indiquée dans le tableau suivant
EMI0005.0049
<I>Tableau <SEP> IV</I>
<tb> Unités <SEP> de <SEP> formation <SEP> de <SEP> taches
<tb> Durée <SEP> de <SEP> traitement, <SEP> Heures <SEP> par <SEP> millilitre
<tb> 0 <SEP> 4,6 <SEP> X <SEP> 107
<tb> 9 <SEP> 7,0 <SEP> X <SEP> 106
<tb> 18 <SEP> 2,4 <SEP> X <SEP> 103
<tb> 27 <SEP> 0;6
<tb> 35 <SEP> 0,1
<tb> 43 <SEP> 0,1 L'expérience ci-dessus a été répétée trois fois avec sensiblement les mêmes résultats. <I>Exemple 4</I> Le mode opératoire de l'exemple 3 a été appliqué au virus de la vaccine, le potentiel électrique étant de 1,75 - 1,80 volt par rapport à l'électrode de référence au calomel.
La matière traitée, qui contenait initiale- ment environ 106 particules infectieuses par milli- litre, a été rendue totalement non infectieuse par 13 h de traitement dans les conditions indiquées.
Le dosage des virus de la poliomyélite et de la vaccine dans les exemples 3 et 4 a été .effectué par la méthode décrite dans le mémoire de J,S. Youngner mentionné ci-dessus.
<I>Exemple 5</I> Du virus PR-301 de la grippe; purifié et concen tré (PR-8 de l'exemple 2 concentré vingt fois) a été inactivé comme décrit dans l'exemple 2, sous un potentiel de 1,5 - 1,6 volt par rapport à une électrode Ag-AgI. La solution résultante de virus inactivé a été diluée à diverses concentrations avec une solution saline physiologique et un millilitre des solutions diluées respectives a été ensuite inoculé par voie sous- cutanée à des cobayes, en employant cinq animaux pour chaque concentration.
En plus; le vaccin non dilué a été inoculé à cinq cobayes, à titre de compa raison. Egalement à titre de comparaison, on a ino culé à un nombre égal de cobayes le vaccin résultant de l'inactivation du même virus par traitement au formol suivant la technique connue, non dilué et di lué aux concentrations indiquées.
Les différents animaux ont été saignés après deux semaines et après quatre semaines et les teneurs en anticorps spécifiques de leur sang ont été dosées par la méthode standard d'inhibition de l'hémo-agglutina- tion. Les résultats de ces dosages des anticorps spé cifiques formés par le vaccin obtenu conformément à l'invention, c'est-à-dire par électrolyse sous poten tiel contrôlé, et formés par le vaccin produit par le procédé au formol, respectivement, sont indiqués dans le tableau suivant
EMI0006.0001
<I>Tableau <SEP> V</I>
<tb> Titre <SEP> moyen <SEP> en <SEP> anticorps
<tb> Dilution <SEP> des <SEP> vaccins
<tb> Non <SEP> dilué <SEP> 1 <SEP> :4 <SEP> 1 <SEP> :.16 <SEP> 1 <SEP> :64 <SEP> 1 <SEP> :
256
<tb> Vaccin <SEP> EPC <SEP> 2 <SEP> semaines <SEP> <B>--- <SEP> --------</B> <SEP> ... <SEP> . <SEP> .<B>---</B> <SEP> .. <SEP> .<B>_</B> <SEP> .<B>--------- <SEP> ---- <SEP> -------</B> <SEP> _ <SEP> 266'\ <SEP> 106 <SEP> 17 <SEP> 40 <SEP> 10
<tb> Vaccin <SEP> EPC <SEP> 4 <SEP> semaines <SEP> ._.....<B>--------------</B> <SEP> .. <SEP> <B>------ <SEP> ----</B> <SEP> .<B>----------- <SEP> -----</B> <SEP> .._ <SEP> <B>381</B> <SEP> 60 <SEP> 14 <SEP> 32 <SEP> 1
<tb> Vaccin <SEP> au <SEP> formol <SEP> 2 <SEP> semaines <SEP> <B>---------- <SEP> -- <SEP> -------</B> <SEP> .......... <SEP> . <SEP> <B>-------- <SEP> -</B> <SEP> 134 <SEP> 134 <SEP> 121 <SEP> 121 <SEP> 40
<tb> Vaccin <SEP> au <SEP> formol <SEP> 4 <SEP> semaines <SEP> <B>--------</B> <SEP> .__<B>-----</B> <SEP> .. <SEP> _.<B>----- <SEP> ---- <SEP> -------</B> <SEP> .
<SEP> 80 <SEP> - <SEP> 106 <SEP> 35 <SEP> 35
<tb> y- <SEP> Inverse <SEP> de <SEP> la <SEP> dilution <SEP> moyenne <SEP> du <SEP> sérum <SEP> produisant <SEP> l'inhibition <SEP> de <SEP> l'hémo-agglutination. Les chiffres ci-dessus sont résumés et complétés par les chiffres du tableau suivant, dans lequel on a rassemblé les rapports du nombre d'animaux mon trant une réaction d'anticorps au nombre total d'ani maux dans chaque groupe vivant au moment du sai gnement. <I>Tableau VI</I> Dilution Non dilué .1:4 .1 : 16 1:64 2 4 2 4 2 4 2 4 sera. sera. sera. sera. sera. sera. sera. sera.
EPC 4/4 4/4 5/5 5/5 3/5 2/4 3/3 3/3 Formol...... 4/4 4/4 4/4 1/1 5/5 5/5 5/5 4/5 Dans ces rapports, le numérateur est le nombre de cobayes montrant une augmentation d'anticorps à la suite de la vaccination et le dénominateur est le nombre de cobayes inoculés et survivants. Les chif fres précédents montrent que le vaccin EPC du pré sent procédé est sensiblement équivalent aux vaccins produits par traitement au formol, du point de vue de la réaction d'anticorps produite.
<I>Exemple 6</I> On a répété les essais de l'exemple précédent sensiblement comme décrit, sauf que l'on a égale ment inoculé le virus non inactivé de la grippe PR-301, non dilué et dilué, à un nombre égal de cobayes.
Les rapports des animaux montrant une réaction d'anticorps au nombre total d'animaux des groupes respectifs vivant au moment des saignements sont rassemblés dans le tableau suivant
EMI0006.0014
<I>Tableau <SEP> VII</I>
<tb> Dilution <SEP> du <SEP> vaccin
<tb> Non <SEP> dilué <SEP> <B><I>1:</I></B> <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> :25 <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 125 <SEP> 1:625
<tb> 2 <SEP> sera. <SEP> 4 <SEP> sera. <SEP> 2 <SEP> sera. <SEP> 4 <SEP> sera. <SEP> 2 <SEP> sera. <SEP> 4 <SEP> sera. <SEP> 2 <SEP> sera. <SEP> 4 <SEP> sera. <SEP> 2 <SEP> sera. <SEP> 4 <SEP> sera.
<tb> Non <SEP> traité <SEP> . <SEP> <B>---- <SEP> ---------</B> <SEP> _. <SEP> <B>--- <SEP> --</B> <SEP> 3/3 <SEP> 3/3 <SEP> 4/4 <SEP> 3/3 <SEP> 3/3 <SEP> 1/1 <SEP> 4/4 <SEP> 2/2 <SEP> 2/3 <SEP> 1/1
<tb> Traité <SEP> EPC <SEP> _...<B>------- <SEP> -----</B> <SEP> -_.<B>----</B> <SEP> ._ <SEP> 4/4 <SEP> 3/3 <SEP> 3/3 <SEP> 2/2 <SEP> 4/4 <SEP> 3/3 <SEP> 2/4 <SEP> 2/2 <SEP> 1/3 <SEP> 2/2
<tb> Traité <SEP> au <SEP> formol <SEP> .<B>--------</B> <SEP> .....
<SEP> 4/4 <SEP> 3/3 <SEP> 4/4 <SEP> 2/2 <SEP> 4/4 <SEP> 2/2 <SEP> 4/4 <SEP> 4/4 <SEP> 3/4 <SEP> 1/2 Les chiffres ci-dessus montrent que le nouveau vaccin EPC est équivalent au virus non traité et au vaccin inactivé au formol en ce qui concerne l'apti tude à susciter la production d'anticorps chez les animaux.
<I>Exemple 7</I> Pour illustrer l'effet d'une variation du potentiel électrique dans les limites prescrites lors du traite ment d'un virus particulier, on a conduit une série d'essais sur le virus de la grippe, souche de Lee, et on a évalué la substance résultante par la méthode décrite dans l'exemple 1, en utilisant pour les diffé rents essais des potentiels électriques de 1,1 - 1,2 volt, 1,3 - 1,4 volt, 1,45 - 1,55 volt et 1,6 - 1;65 volt, respectivement, par rapport à l'électrode au calomel, des prises aliquotes étant prélevées du compartiment anodique toutes les demi-heures en vue de la déter mination du nombre de doses 50 % infectieuses <B>(ID,,)</B> par millilitre.
Les résultats de ces essais, expri més en pourcentage de virus infectieux survivant par rapport à l'infectiosité de la suspension originale de virus avant qu'elle soit soumise au nouveau traite ment d'inactivation, portés graphiquement (en ordon née) en fonction du temps de traitement en heures (en abscisse), aux potentiels respectifs, sont montrés sur le graphique constituant la fig. 2 du dessin. Il ressort de ce graphique que la vitesse d'inactivation augmente avec le potentiel, dans les limites prescrites. Il apparaît en outre qu'à la tension la plus basse aucun inactivation appréciable de ce virus particulier n'a eu lieu au cours d'une période de 4 heures.
Dans la mise en aeuvre du procédé selon l'inven tion, il est spécialement avantageux d'employer pour le traitement un virus quia été purifié jusqu'au point où il ne contient plus une concentration élevée de protéines non virusales. Bien que des préparations de virus contenant des pourcentages élevés de protéines non virusales puissent être traitées conformément à l'invention, on a constaté que la durée nécessaire de traitement de ces préparations de virus impures aug mente notablement.
Par exemple, on a constaté qu'un virus de la grippe PR-8 purifié et concentré, contenant 10e2 doses 50 % infectieuses par millilitre, peut être complètement inactivé en 4 heures, alors que, dans les mêmes conditions de traitement, un virus de la grippe PR-8 concentré et impur, contenant 10',
5 doses 50 % infectieuses par millilitre, n'est inactivé que jusqu'à 1045 avec la même durée de traitement.
De même; lors du traitement du virus de la grippe de Lee sous un potentiel de 1,45 - 1,55 volt par rap port à l'électrode au calomel normale, on a constaté que dans le cas du virus impur il reste encore un peu de virus infectieux au bout de 8 heures de traite ment, alors que dans le cas du traitement du virus purifié, une inactivation complète est obtenue en 3 1/2 h. Ainsi, bien que cela ne soit pas essentiel à une mise en oeuvre satisfaisante du procédé, il est très désirable que les virus à traiter soient aussi exempts de protéines étrangères qu'il est raisonnablement possible.
Method for inactivating virulent pathogenic particles The invention relates to a treatment of virulent pathogenic microorganisms or particles, which treatment has the effect of modifying the particles or, in other words, inactivating them so that they lose their suitability. to cause disease while retaining their antigenic, immunizing properties. The invention relates to a perfected method of inactivating these particles electrolytically.
The method according to the invention is applicable to the treatment of any of the various pathogenic microorganisms or particles, such as bacteria, viruses, etc. However, it has been shown to be particularly useful for the treatment of viruses and will therefore be more particularly described and illustrated in connection with the treatment of viruses.
Several methods of preparing inactivated viruses have been proposed, for example for use as immunizing vaccines, the term vaccine being used herein in its general sense, i.e. not limited to vaccinia. None of the known methods applies to all of these microorganisms. The most common methods of inactivating viruses include chemical treatment, for example with formaldehyde, or treatment with ultraviolet light. However, neither of these treatments is entirely satisfactory.
For example, in the case of treatment of the polio virus with formalin, the chemical agent does not inactivate virus aggregates. The virus particles trapped in these clumps can remain in their infectious form and must therefore be removed from the vaccine, for example by filtration, before the vaccine is injected into the body to be immunized. Unfortunately, this filtration reduces the activity of the preparation, because each filtration results in a loss of virus,
so that the total amount of immunologically active virus in the system is decreased. The chemical method also has the disadvantage that the reaction is very slow, so that the duration of the complete treatment is usually several days.
Similar difficulties have been encountered in treating pathogenic particles with ultraviolet light: It has also been proposed to treat microorganisms by passing an electric current;
under a current density of 10 to 12 amperes -per 400 <I> ce </I> and under a voltage of 20 to 30 volts, through a suspension of microorganisms in an electrolyte such as a chloride solution of sodium, contained in the central compartment of a three-compartment electrolysis apparatus, said central compartment being isolated from the electrode compartments by the semi-permeable diaphragms and the electrode compartments being filled with water.
Under these conditions, the electrolyte is decomposed by electrolysis, and the inactivation of the microorganisms which this treatment may produce appears to result from a chemical action of the decomposition products of electrolysis, and not from an action. -direct -of electric current. This -procédé is therefore affected by the defects common to other chemical processes; while being even more complicated. It -appears that the- process. electrical described above had no practical significance.
In general, chemical processes require filtration or other separation operation which has the effect of decreasing activity, as already noted, and are further complicated by the need to remove or neutralize. the chemical reagent used. If this is not carefully removed or neutralized,
the resulting vaccine is likely to produce side effects of irritation, due to the residual chemicals present.
The object of the invention is to offer a simplified, faster and more economical method; to inactivate pathogenic particles while retaining their immunological properties, without resorting to chemical reagents, thus eliminating the need for filtration, elimination or neutralization of residual chemical products.
This process allows the production of viruses or other inactivated pathogenic particles, suitable for the preparation of vaccines and similar products, and this in a more efficient and economical manner than hitherto.
The expressions inactivation or inactivated as used herein are to be understood in the sense of an alteration of the pathogenic particles having the effect of depriving them of their ability to cause disease while allowing their ability to induce the production of specific antibodies to be substituted. in the treated animal or, in other words, retaining their immunological properties.
It has been found that the above-mentioned objects can be achieved by subjecting the virulent phathogenic particles in aqueous suspension at a pH of about 7 to oxidation by electrolysis in contact with the anode of an electrolytic cell. , at a constant potential of at least about 1 volt relative to the normal calomel electrode, but less than the decomposition potential of the water-electrolyte system, while preventing contact of said particles with the cathode of the cell.
It is observed that the particles thus treated are no longer infectious but retain entirely, or almost entirely, their ability to provide immunological protection when they are used as a vaccine. The viruses thus inactivated will sometimes be designated in the following description by the expression EPC vaccine, that is to say vaccine produced by electrolysis under controlled potential.
Pathogenic particles, like other particles, are made up of various kinds of atoms bonded together in some way. As a result, functional groups are present on the surface of the particles or are part of the core nucleic acid. It is believed that it is these groups, or some of these, that are responsible for the infectivity of the particle, and that a change in their chemical nature modifies or destroys the ability of the particles to cause disease.
The electrolysis under controlled potential of the process according to the invention is essentially an oxidation reaction and the inactivation of the pathogenic particles produced by the present process results from such oxidation.
Intimate contact between the treated particles and the anode of the cell is therefore essential. This contact is promoted by stirring or agitating the liquid of the anode compound and keeping the anode relatively free of deposits.
The electrical potential across the electrolytic cell is preferably about 1 to 2 volts with respect to normal calomel, i.e. less than that at which water or any other inorganic substance present is broken down. Typically this voltage does not exceed about 2 volts. In most cases, the most advantageous potential is about 1.2 to 1.6 volts, compared to the normal calomel electrode.
These potential conditions, as well as other conditions described below, have the effect that the passage of electric current through the cell is only due to a transfer of electrons between the electron donor, i.e. that is to say the microorganisms, and the electrode in function, that is to say the anode. This current is normally about 1 to 10 milliamps, more often about 2 to 7 milliamps, per 10 cm2 of electrode in operation. At this voltage, no electrolytic decomposition of the electrolyte occurs.
It has been observed that if a deposit is allowed to form on the anode, the intensity of the current decreases. When there is a tendency for such a deposit to form, which usually results in a decrease in current to about 2 milliamps, the anode should be periodically removed and cleaned. . This is particularly important when the material being treated is contaminated with foreign proteinaceous materials.
It is also essential that the solution containing the microorganism is kept substantially neutral, that is to say at a pH of about 7. When the solution containing the microorganism to be treated is not naturally neutral, a suitable buffer should be added to it.
The invention and its advantages will be better understood on reading the following description and the examples illustrated by the appended drawing in which FIG. 1 conventionally and somewhat schematically shows a partial electrolytic cell. particularly advantageous for carrying out the electrolysis under controlled potential of the present process, and FIG. 2 is a graph containing several curves corresponding to different electric potentials, in volts, relative to the normal calomel electrode, obtained by plotting the percentage of infectious virus surviving (on the ordinate),
according to the duration of the treatment in hours (on the x-axis), in the case of the treatment of the Lee strain of influenza B virus. The percentages of infectious virus surviving are related to the infectivity of the original virus suspension before the start of treatment.
The electrolytic cell shown in fig. 1 comprises a cathode compartment 1 and an anode compartment 2 separated by a diaphragm 3, formed of a sintered glass disc with fine porosity, i.e. with pores with a maximum size of 4 - 5.5 microns . The anode compartment contains a platinum 4 anode of semicircular shape and approximately 10 cm2 of effective surface. The anode is connected to the electrical source by conductor 5.
The anode compartment also contains a reference electrode 6 intended for the exact measurement of the voltage at the terminals of the cell. This electrode is provided with a dialysis membrane and retaining rings 7. Alternatively, a salt bridge can be connected to a normal calomel electrode, in the known manner. To maintain a more intimate contact between the material treated and the electrode 4, means for agitating the suspension are placed in the anode compartment. These means consist of a mechanical stirrer 8.
The cathode compartment contains a platinum electrode 9 carrying a connection 10. The two compartments are provided with a valve 11 for emptying or for taking samples, and the anode compartment is provided with a lateral branch 12, also for taking samples. In addition, the two compartments are closed by a cap 13 fitting on the main body of the compartment, by means of a standard conical ground joint 14.
The cell is constructed of glass apart from the parts indicated as being formed from other materials, and its shape is designed to allow its immersion in an ice bath. It is connected to direct current supply means making it possible to vary the potential in an exactly controlled manner, comprising means for exact measurement of the voltage and the current. These means are well known and it is not necessary to describe them.
As an example of performing the method, a measured portion of a solution of virulent virus is diluted with an equal volume of a well known phos phate buffer, such as that prepared by dissolving equimolecular amounts of mono phosphate. - sodium and disodium phosphate in an equal weight of water, which gives a buffered solution at a pH of about 7, and this solution is placed in the anode compartment.
The volume of the virus solution thus diluted and buffered must be sufficient to fill the anode compartment to a level such that the anode is always submerged, taking into account the periodic collection of samples during the operation.
Into the cathode compartment is introduced a solution composed of equal volumes of the phosphate buffer solution described above and distilled demineralized water. No virus solution is introduced into the sodium compartment.
The electrolytic cell is intended to be submerged in an ice bath or to be otherwise maintained at 40 C; as mentioned above, so that the virus present in the anoid compartment cannot be inactivated by heat. The electric potential is then applied to the terminals of the cell, the voltage with respect to the reference electrode being checked and adjusted within the limits mentioned above.
The duration of the treatment and the optimum potential have been shown to be very variable according to the different types and strains of virus, the time factor depending somewhat on the voltages applied as well as on the concentration of the microorganisms in the anode compartment. The concentration of organisms in the anode compartment does not appear to be critical at all, but it has been observed that when this concentration decreases, the time required for the inactivation of the microorganism also decreases.
Although during the experiments described below the cell was maintained at the temperature of the ice bath in order to eliminate the possibility of thermal effects, the temperature of the treatment is otherwise of minimal or no apparent importance. .
As mentioned, the optimum electric potential varies, within the limits indicated, all other things being equal, depending on the particular microorganism being treated, and it is therefore advisable to carry out preliminary tests to determine the optimum potential for the microorganism. or particular virus strain to be treated.
The sintered glass disc 3 is sealed in the connecting tube of the compartments. It serves to prevent migration of the virus, or other microorganism undergoing treatment, from the anode compartment to the cathode compartment, while allowing the passage of the electric current between the two compartments. Thus, any reverse reaction, eg reduction, which might otherwise take place at the cathode, is prevented. The sintered glass disc can be replaced by other diaphragms or membranes capable of containing the microorganisms while allowing the passage of electric current.
In the experiments described below, platinum electrodes were used, which have been shown to be especially advantageous due to the stability and non-toxic properties of platinum, so that reactions which could be the cause of a chemical treatment of microorganisms were avoided. Platinum electrodes are also generally recommendable for carrying out the process according to the invention. However, electrodes can be used of any material which does not decompose under the prescribed electrolytic conditions and does not adversely affect the immunological activity of microorganisms.
Likewise, although the phosphate buffer described above has been shown to be very effective in maintaining the desired pH in the anode compartment, while being devoid of adverse effects on the immunological activity of the microorganisms treated, other known buffers capable of maintaining a substantially neutral pH and not adversely affecting the immunological activity of microorganisms can be used. The buffer can be added to the solution of the microorganism in solid form or in solution. In some cases it appears that the solution of the microorganism contains a natural buffer, so that the addition of an additional buffer is superfluous.
On the other hand, any stable electrolyte at the voltages indicated can be used in the cathode compartment in place of the buffer solution described above.
It has been observed that a deposit frequently accumulates on the anode during operation. This deposition results in a reduction in the intensity of the current passing through the cell. If so, the anode should be removed from the cell and cleaned. This cleaning is advantageously carried out by immersing the anode in hot concentrated nitric acid for about 5 min, then by rinsing the electrode in distilled water.
The electrode is then immersed in absolute ethyl alcohol and then it is ignited. After cooling in cold sterile distilled water, the electrode is replaced and the electrolytic treatment continued. It is often advantageous to clean the anode in this way at intervals of about 1/2 hour during operation.
To determine the optimum treatment time for a particular microorganism, aliquots of the solution can be taken from time to time from the anode compartment, and their activity and inactivation determined in known manner. In general; it has been found that the infectious virus is completely inactivated in about 3-4 hours in the case of influenza virus, while some strains of polio virus require about 36 to 48 hours of treatment. By comparison, inactivation by formalin treatment requires 4-7 days for influenza virus and 10-14 days for polio virus.
<I> Example Z </I> 25 ml of Lee strain of influenza virus, type B, partially purified by a cycle of ultracentrifugation and resuspension, was introduced into the anode compartment of a electrolytic cell in substance as shown in FIG. 1, each of the compartments of the cell having a capacity of 100 ml and the effective area of the platinum anode being about 10 cm2. 25 ml of a 0.2 molar phosphate buffer solution, pH 7, were also added to the anode compartment.
prepared by adding equimolecular amounts of monosodium phosphate and disodium phosphate to distilled deionized water. In the cathode compartment, 25 ml of the same phosphate buffer solution and 25 ml of demineralized distilled water were introduced. With the exception of the virus solution, all solutions used were sterile.
An agar and salt bridge, in which the conductive electrolyte is a phosphate buffer at the same pH as described above, was used to connect a normal calomel electrode with the liquid from the anode compartment of the cell. The calomel electrode, intended for the exact measurement of the potential at the terminals of the cell, was connected to the negative pole of the cell by means of an electronic voltmeter.
The electrolytic cell was submerged in an ice bath throughout the operation and a working electric potential of 1.3 - 1.4 volts was maintained with respect to the reference electrode, throughout the duration of the operation. experience. About every half hour, the platinum anode was removed from the cell and thoroughly cleaned as described above.
Every hour, aliquots of the solution were taken from the anode compartment and inoculated into 10-day-old chicken embryos, the inoculum volume being 0.1 ml per nine each time. The nine fertiles were allowed to incubate at 360 ° C. for 48 h, then they were harvested and the virus was assayed in the allantoic fluid extracted from the various eggs.
The results of these experiments, expressed in 50% infectious doses per milliliter of allantodic fluid after different durations of treatment of the material, are collated in the following table. For comparison, the results of tests carried out with the untreated virus are also shown.
EMI0004.0049
<I> Table <SEP> I </I>
<tb> Duration <SEP> of <SEP> treatment, <SEP> Hours <SEP> Doses <SEP> 50% <SEP> infectious / ntl
<tb> <B> 0 <SEP> 1077 </B>
<tb> 1 <SEP> 107.5
<tb> 2 <SEP> 10e7
<tb> <B> 3 <SEP> 10.J </B>
<tb> 4 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 0 In addition to measuring the effect of the controlled potential electrolysis treatment on infectivity, the influence of this treatment on the ability of the influenza virus to agglutinate was determined the red blood cells of the chicken.
The ability of the influenza virus to induce hemoagglutination, referred to herein as HA, depends on the integrity of the protein cover of the virus particle. In the commercial preparation of influenza vaccines, the HA activity of the preparations, after inactivation with formalin or by ultraviolet irradiation, is used as an indication of the residual antigen activity which, as mentioned, depends on the integrity of the protein neck.
The results of our haemagglutination tests on the virus before treatment and after 3 and 4 h of treatment, respectively, are shown in the following table.
EMI0004.0060
<I> Table <SEP> II </I>
<tb> Duration <SEP> of <SEP> treatment, <SEP> Hours <SEP> Units <SEP> HA / ml
<tb> 0 <SEP> 1280
<tb> 3 <SEP> 1280
<tb> 4 <SEP> 1280 The results of these measurements indicate that there is no measurable loss of HA activity after 4 h of electrolysis under controlled potential of the present process, although the infectivity of the virus is completely destroyed by such a long treatment.
These tests show that a treatment in accordance with the invention and lasting 4 h has no effect on the integrity of the protein cover of the virus particles. Lee strain of influenza virus, used in the above experiments, is a standard strain of influenza virus widely used in laboratory work, and well known in the art.
The methods used for the evaluation of virus preparations are accepted and recognized in this specialty and are described in the following publications: Standard Method of Preparing Chicken Embryo for Vaccine Production, as described by Beveridge and Burnet, Med. Res. Council, 1946, Special Report Series 256;
Method of obtaining 50 6 / o Infective Dose, based on procedure described by L.J. Reed and H. Muench, Amer.
Day. Hygiene, 1938, Vol. 27, p. 493; and Hemagglutination Titer obtained by method of <B> LE. </B> Salk, Jour. of Immunology; 1944, Vol. 49, page 87.
The experiments described, using Lee's influenza virus, were repeated fourteen times with substantially the same results.
<I> Example 2 </I> The procedure of Example 1 was repeated using the PR-8 strain of the influenza virus (type A), the potential at the terminals of the cell being 1.6 - 1.7 volts against the calomel electrode. Aliquots were taken from the anode compartment every half hour and their infectivity was measured as described in Example 1. These infectiousnesses, expressed in 50% infectious doses per milliliter, are collated in the following table. .
For comparison, the result of a measurement on the untreated virus is also shown.
EMI0005.0039
<I> Table <SEP> 111 </I>
<tb> Duration <SEP> of <SEP> treatment, <SEP> Hours <SEP> Doses <SEP> 50% <SEP> infectious / ml
<tb> 0 <SEP> 1,07.2
<tb> 1/2 <SEP> 106.2
<tb> 1 <SEP> <B> 106.2 </B>
<tb> 1 <SEP> 1/2 <SEP> 106.2
<tb> 2 <SEP> 1041s
<tb> 21/2 <SEP> 104.2
<tb> 3 <SEP> 10E.5
<tb> 3 <SEP> 1/2 <SEP> 101.s
<tb> 4 <SEP> 0 As can be seen from this table, the virus was completely inactivated after 4 h of treatment. As in Example 1, the hemoagglutination activity was shown to be unchanged throughout the experiment.
Example 2 was repeated eight times under substantially identical conditions with the same results as above. <I> Example 3 </I> The procedure of Example 1 was applied to the treatment of the poliomyelitis virus. However, due to the prolonged duration of treatment which is necessary for inactivation of this particular virus, the electrolyte cell was placed in a cold room maintained at 4 ° C, instead of employing an ice bath.
In this experiment, the potential across the cell was maintained at 1.6 - 1.8 volts relative to the calomel electrode. The infectivity of the respective samples, determined by the technique of stains on cultures of monkey kidney cells, described by J.S. Youngner, Journal of Immunology, 1956, Vol. 76, p.
288, is shown in the following table
EMI0005.0049
<I> Table <SEP> IV </I>
<tb> <SEP> units of <SEP> training <SEP> of <SEP> tasks
<tb> Duration <SEP> of <SEP> treatment, <SEP> Hours <SEP> per <SEP> milliliter
<tb> 0 <SEP> 4.6 <SEP> X <SEP> 107
<tb> 9 <SEP> 7,0 <SEP> X <SEP> 106
<tb> 18 <SEP> 2,4 <SEP> X <SEP> 103
<tb> 27 <SEP> 0; 6
<tb> 35 <SEP> 0.1
<tb> 43 <SEP> 0.1 The above experiment was repeated three times with substantially the same results. <I> Example 4 </I> The procedure of Example 3 was applied to vaccinia virus, the electric potential being 1.75-1.80 volts relative to the calomel reference electrode.
The treated material, which initially contained about 106 infectious particles per milliliter, was rendered completely non-infectious by 13 hours of treatment under the conditions indicated.
The assay of the poliomyelitis and vaccinia viruses in Examples 3 and 4 was carried out by the method described in the paper by J, S. Youngner mentioned above.
<I> Example 5 </I> Of the PR-301 influenza virus; purified and concentrated (PR-8 of Example 2 concentrated twenty times) was inactivated as described in Example 2, under a potential of 1.5 - 1.6 volts relative to an Ag-AgI electrode. The resulting solution of inactivated virus was diluted to various concentrations with physiological saline solution and one milliliter of the respective diluted solutions was then inoculated subcutaneously into guinea pigs, employing five animals for each concentration.
More; the undiluted vaccine was inoculated into five guinea pigs, as a comparison. Also by way of comparison, an equal number of guinea pigs were inoculated with the vaccine resulting from the inactivation of the same virus by treatment with formalin according to the known technique, undiluted and diluted to the concentrations indicated.
The different animals were bled after two weeks and after four weeks and the levels of specific antibodies in their blood were assayed by the standard method of inhibiting hemoagglutination. The results of these assays of the specific antibodies formed by the vaccine obtained in accordance with the invention, that is to say by electrolysis under controlled potential, and formed by the vaccine produced by the formalin process, respectively, are shown. in the following table
EMI0006.0001
<I> Table <SEP> V </I>
<tb> Average <SEP> title <SEP> in <SEP> antibody
<tb> Dilution <SEP> of <SEP> vaccines
<tb> No <SEP> diluted <SEP> 1 <SEP>: 4 <SEP> 1 <SEP>: .16 <SEP> 1 <SEP>: 64 <SEP> 1 <SEP>:
256
<tb> Vaccine <SEP> EPC <SEP> 2 <SEP> weeks <SEP> <B> --- <SEP> -------- </B> <SEP> ... <SEP>. <SEP>. <B> --- </B> <SEP> .. <SEP>. <B> _ </B> <SEP>. <B> --------- <SEP> ---- <SEP> ------- </B> <SEP> _ <SEP> 266 '\ <SEP> 106 <SEP> 17 <SEP> 40 <SEP> 10
<tb> Vaccine <SEP> EPC <SEP> 4 <SEP> weeks <SEP> ._..... <B> -------------- </B> <SEP> .. <SEP> <B> ------ <SEP> ---- </B> <SEP>. <B> ----------- <SEP> ---- - </B> <SEP> .._ <SEP> <B> 381 </B> <SEP> 60 <SEP> 14 <SEP> 32 <SEP> 1
<tb> <SEP> formalin <SEP> vaccine <SEP> 2 <SEP> weeks <SEP> <B> ---------- <SEP> - <SEP> ------ - </B> <SEP> .......... <SEP>. <SEP> <B> -------- <SEP> - </B> <SEP> 134 <SEP> 134 <SEP> 121 <SEP> 121 <SEP> 40
<tb> <SEP> formalin <SEP> vaccine <SEP> 4 <SEP> weeks <SEP> <B> -------- </B> <SEP> .__ <B> ---- - </B> <SEP> .. <SEP> _. <B> ----- <SEP> ---- <SEP> ------- </B> <SEP>.
<SEP> 80 <SEP> - <SEP> 106 <SEP> 35 <SEP> 35
<tb> y- <SEP> Inverse <SEP> of <SEP> the <SEP> dilution <SEP> mean <SEP> of <SEP> serum <SEP> producing <SEP> inhibition <SEP> of <SEP> hemo-agglutination. The above figures are summarized and supplemented by the figures in the following table, in which the ratios of the number of animals showing an antibody reaction to the total number of animals in each group living at the time of death have been compiled. annoyance. <I> Table VI </I> Dilution Undiluted .1: 4 .1: 16 1:64 2 4 2 4 2 4 2 4 will be. will be. will be. will be. will be. will be. will be. will be.
EPC 4/4 4/4 5/5 5/5 3/5 2/4 3/3 3/3 Formalin ...... 4/4 4/4 4/4 1/1 5/5 5/5 5/5 4/5 In these reports, the numerator is the number of guinea pigs showing an increase in antibody following vaccination and the denominator is the number of inoculated and surviving guinea pigs. The foregoing figures show that the EPC vaccine of the present method is substantially equivalent to vaccines produced by formalin treatment, from the point of view of the antibody reaction produced.
<I> Example 6 </I> The tests of the previous example were repeated substantially as described, except that the uninactivated influenza virus PR-301, undiluted and diluted, was also inoculated at a equal number of guinea pigs.
The ratios of animals showing antibody reaction to the total number of animals of the respective groups living at the time of bleeding are collated in the following table.
EMI0006.0014
<I> Table <SEP> VII </I>
<tb> Dilution <SEP> of <SEP> vaccine
<tb> No <SEP> diluted <SEP> <B><I>1:</I> </B> <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP>: 25 <SEP> 1 <SEP>:
<SEP> 125 <SEP> 1: 625
<tb> 2 <SEP> will be. <SEP> 4 <SEP> will be. <SEP> 2 <SEP> will be. <SEP> 4 <SEP> will be. <SEP> 2 <SEP> will be. <SEP> 4 <SEP> will be. <SEP> 2 <SEP> will be. <SEP> 4 <SEP> will be. <SEP> 2 <SEP> will be. <SEP> 4 <SEP> will be.
<tb> No <SEP> processed <SEP>. <SEP> <B> ---- <SEP> --------- </B> <SEP> _. <SEP> <B> --- <SEP> - </B> <SEP> 3/3 <SEP> 3/3 <SEP> 4/4 <SEP> 3/3 <SEP> 3/3 <SEP > 1/1 <SEP> 4/4 <SEP> 2/2 <SEP> 2/3 <SEP> 1/1
<tb> Processed <SEP> EPC <SEP> _... <B> ------- <SEP> ----- </B> <SEP> -_. <B> ---- </B> <SEP> ._ <SEP> 4/4 <SEP> 3/3 <SEP> 3/3 <SEP> 2/2 <SEP> 4/4 <SEP> 3/3 <SEP> 2 / 4 <SEP> 2/2 <SEP> 1/3 <SEP> 2/2
<tb> <SEP> treated with <SEP> formalin <SEP>. <B> -------- </B> <SEP> .....
<SEP> 4/4 <SEP> 3/3 <SEP> 4/4 <SEP> 2/2 <SEP> 4/4 <SEP> 2/2 <SEP> 4/4 <SEP> 4/4 <SEP > 3/4 <SEP> 1/2 The above figures show that the new EPC vaccine is equivalent to untreated virus and inactivated formalin vaccine with respect to the ability to elicit antibody production in animals.
<I> Example 7 </I> To illustrate the effect of varying the electrical potential within prescribed limits when treating a particular virus, a series of tests were conducted on the influenza virus, strain of Lee, and the resulting substance was evaluated by the method described in Example 1, using for the various tests electrical potentials of 1.1 - 1.2 volts, 1.3 - 1.4 volts, 1.45 - 1.55 volts and 1.6 - 1; 65 volts, respectively, relative to the calomel electrode, aliquots being taken from the anode compartment every half hour for the purpose of determining the number 50% infectious <B> (ID ,,) </B> doses per milliliter.
The results of these tests, expressed as a percentage of infectious virus surviving relative to the infectivity of the original virus suspension before it was subjected to the new inactivation treatment, shown graphically (in ordinate) according to the treatment time in hours (on the abscissa), at the respective potentials, are shown in the graph constituting FIG. 2 of the drawing. It can be seen from this graph that the rate of inactivation increases with the potential, within the prescribed limits. Further, it appears that at the lowest voltage no appreciable inactivation of this particular virus occurred within a period of 4 hours.
In carrying out the process according to the invention, it is especially advantageous to use for the treatment a virus which has been purified to the point where it no longer contains a high concentration of non-virus proteins. Although virus preparations containing high percentages of non-virus proteins can be processed in accordance with the invention, it has been found that the time required to process such impure virus preparations significantly increases.
For example, it has been found that a purified and concentrated influenza virus PR-8, containing 10e2 50% infectious doses per milliliter, can be completely inactivated within 4 hours, whereas, under the same treatment conditions, a virus of concentrated and impure PR-8 influenza, containing 10 ',
5 doses 50% infectious per milliliter, is only inactivated up to 1045 with the same duration of treatment.
Likewise; when processing Lee's influenza virus at a potential of 1.45 - 1.55 volts compared to the normal calomel electrode, it was found that in the case of the unclean virus there is still some virus remaining infectious after 8 hours of treatment, while in the case of treatment of the purified virus, complete inactivation is obtained in 3 1/2 h. Thus, although this is not essential for a satisfactory performance of the method, it is very desirable that the viruses to be treated be as free of foreign proteins as is reasonably possible.