Verfahren zur Herstellung von epimeren a-Amino-benzylpenicillinen Im Hauptpatent Nr. 387 63.5 sind Penicillin- derivate mit wertvollen antibiotischen Eigenschaften beschrieben, welche erhalten wurden durch Ein führung einer Aminoacyl-Substituentengruppe in die
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worin Ph einen Phenylrest bedeutet.
Das Vorkommen eines asymmetrischen Kohlen stoffatoms (gekennzeichnet durch den Stern) in der Seitenkette dieser Verbindung zeigt an, dass sie in zwei optisch aktiven isomeren Formen vorkommen kann. Diese isomeren Formen sind Epimere und nicht enantiomorph im Hinblick auf die Tatsache, dass die bei der Synthese verwendete 6-Amino-penicillansäure ihrerseits eine optisch aktive Verbindung ist.
Der Ausgangsstoff, der zur Herstellung von a-Amino- benzylpenicillin bisher verwendet worden ist, war die optisch inaktive DL-Form der a-Amino-phenylessig- säure mit dem Ergebnis, d'ass das erhaltene Penicillin aus einem Gemisch der beiden Epimeren bestund. Die Isolierung, Reinigung und Prüfung eines solchen Pro duktes stellen schwierige Probleme und es ist als Handelspräparat wenig erwünscht, insofern als seine Zusammensetzung von Ansatz zu Ansatz variieren kann.
Die DL-a-Amino-phenylessigsäure wurde nun mehr zerlegt und ausgehend von den Zerlegungspro dukten zwei epimere Formen eines a-Amino-benzyl- penicillins hergestellt.
Das Patent betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 6-[D()a - Amino - phenylacetamido] - penicillan- Aminogruppe von 6-Amino-penicillansäure. Eine dieser Verbindungen ist ein a-Amino-benzylpenicillin mit der Strukturformel säure und 6-[L(-i-)a-Amino-phenylacetamido]-peni- cillansäure, welches dadurch gekennzeichnet ist,
dass 6-Amino-penicillansäure gekuppelt wird mit der D- oder L-Form einer a-Amino-phenylessigsäure, deren Aminogruppe geschützt ist, bzw. einem Salz einer sol chen Säure, worauf die schützende Gruppe unter mil den Reaktionsbedingungen abgespalten wird.
Die DL-a-Amino-phenylessigsäure wurde nach bekannten Verfahren zerlegt [Betei and Meyer, Ber. (l908) 41,<B>2073:</B> Ingersoll und Adams, J. Amer. Chem. Soc. (1925) 47, 1168]. Die beiden epimeren Formen wurden aus der D- und L-Form der Säure hergestellt (vg1. Schweizer Patent Nr. 387 635).
Zur Vermeidung einer Racemisi'erung werden zweckmässig während des ganzen Verfahrens milde Reaktionsbedingungen angewendet. Bei der Abspal tung der schützenden Gruppe müssen milde Reak tionsbedingungen eingehalten werden, damit eine Zer störung des Penicillin-Kerns unterbleibt. Die beiden verschiedenen Formen des a-Amino-benzylpenicillins wurden isoliert und in analytisch reiner Form erhal ten.
Die 6-[D(-)a-Amino-phenylacetamido]-penicil- lansäure erwies sich sowohl als besser wasserlöslich beim iso-elektrischen Punkt, wie auch als stärker aktiv gegenüber verschiedenen Arten von Bakterien in vitro als die 6-[L(--,)a-Amino-phenylacetamido]- penicillansäure.
<I>Beispiel 1</I> D(-)a - (Carbobenzyloxyamino)-phenylessigsäure Smp. 130-130,5 [a]D = 119,4 (C=3 in Äthanol) wurde hergestellt durch Einwirkung von Benzyl- chlorcarbonat auf eine eiskalte Lösung von D(-)a- Amino-phenylessigsäure in einem Äquivalent norma ler wässriger Natronlauge, wobei weitere Natronlauge zugesetzt wurde, um während der Dauer der Reak tion den pH-Wert zwischen 8 und 9 zuhalten.
4,8 ml Äthyl-chlorcarbonat wurden zu einer eis kalten Lösung von 14,3 g des vorstehend erwähnten Ca'rbobenzyloxy-derivats und 8,3 ml Triäthylamin in 420 ml trockenem Aceton hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei 0 5 Minuten lang gerührt, wobei Triäthyl- amin-hydrochlorid ausfiel und sich in der Lösung ein Mischanhydrid bildete.
Die Suspension wurde auf -50 abgekühlt und zu derselben unter kräftigem Rühren so schnell als möglich eine eiskalte Lösung von 13 g 6-Amino-penicillansäure in 420 ml 3 % iger wässriger Natriumbicarbonatlösung hinzugegeben, wo bei dafür gesorgt wurde, dass die Temperatur der Mischung nie über 0 C ansteigen konnte. Die er haltene klare Lösung wurde 30 Minuten lang bei 0 C gerührt, das Rühren weitere 30 Minuten lang fortgesetzt, während welcher Zeit die Temperatur der Lösung auf Raumtemperatur anstieg, wonach die Lösung schliesslich mit dreimal 400 ml Äther extra hiert und lediglich die wässrige Phase zurückbehalten wurde.
Die wässrige Lösung wurde auf einen pH-Wert von 2 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt und die dabei freigesetzte 6-[D(-)a-(Carbobenzyloxyamino)- phenylacetamido]-penicillansäure mit dreimal 150 ml Äther extrahiert.
Eine partielle Reinigung dieses Zwi schenproduktes wurde durchgeführt, indem es inForm des Natriumsalzes in wässriger Natriumbicarbonat- lösung reextrahiert wurde, worauf nach erneuter Einstellung des pH-Wertes auf 2 eine Extraktion der freien Säure mit Äther angeschlossen wurde. Schliess lich wurde das Produkt wieder in das Natriumsalz übergeführt, indem man die ätherische Lösung mit so viel 3 % iger Natriumbicarbonatlösung schüttelte,
um eine neutrale wässrige Phase zu erhalten. Die letztere wurde abgetrennt und bei niedriger Tempe ratur und niedrigem Druck verdampft. Das erhaltene Präparat wurde schliesslich über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet und stellte verhältnismässig reines Natrium - 6 - [D(-)a - (Carbobenzyloxyamino)- phenylacetamido]-penicillanat im Gewicht von 13 g dar. Das Präparat ergab bei der Papierchromato- graphie nur eine einzelne Zone antibiotischer Aktivi tät.
Eine Suspension von 125 ml, enthaltend 38 g Palladium (30; ö) auf Bariumcarbonat, wurde in einer Wasserstoffatmosphäre bei Zimmertemperatur und atmosphärischem Druck während einer Stunde ge schüttelt. Eine neutrale Lösung von 20,4 g Natrium- 6-[D(-)a-(Carbobenzyloxyamino) - phenylacetamido] - penicillanat in 250 ml Wasser wurde hiernach zuge geben und das Schütteln unter Wasserstoff eine wei tere Stunde lang fortgesetzt.
Die Suspension wurde filtriert und die vereinigten Filtrate und wässrigen Waschlösungen mit n-Salzsäure behandelt, um den pH-Wert auf 2 einzustellen, wonach dreimal mit 100 ml Äther gewaschen wurde. Die wässrige Phase wurde auf pH 4,65 vermittels 3%iger Natriumbicar- bonatlösung eingestellt und hierauf bei niedriger Tem peratur und niedrigerem Druck auf ein Volumen von ungefähr 5,0 ml eingeengt, wonach feine farblose Na deln sich abschieden.
Nach 30 Minuten wurden die Kristalle abgetrennt, mit ein wenig kaltem Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet. Man erhielt reines ö-[D(-)a-Amino- phenylacetamido]-penicillansäure-monohydrat im Ge wicht von 5,5 g, [a]D = -:- 281 (C = 1 in Was ser) Zersetzung bei etwa 202 C. Umkristallisieren aus Wasser veränderte die optische Drehung nicht.
EMI0002.0072
Analyse:
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 52,5 <SEP> % <SEP> H <SEP> 5,7 <SEP> % <SEP> N <SEP> 11,9
<tb> S <SEP> 8,9
<tb> Berechnet <SEP> für: <SEP> CICHi9N304S.HNO:
<tb> C <SEP> <B>52,3%</B> <SEP> H <SEP> <B>5,8%</B> <SEP> N <SEP> <B>11,9%</B>
<tb> S <SEP> 8,7 Weitere 9@ g weniger reinen Produktes wurden durch Konzentrieren des wässrigen Filtrates erhalten. Wie die erste Menge, gab dieses Produkt lediglich eine einzige Zone antibiotischer Aktivität bei der Papierchromatographie, welche sich von derjenigen unterschied, die mit dem nicht reduzierten Carbo- benzyloxy-Zwischenprodukt erhalten wurde.
<I>Beispiel 2</I> Die L(+)a-(Carbobenzyloxyamino) - phenylessib säure, Smp. 130-130,5 , [a]D = + 117 (C = 3 in Äthanol), wurde aus L(+)cc-Amino-phenylessig- säure nach der für sein Enantiomorphes beschrie benen Methode hergestellt.
Das erhaltene Produkt im Gewicht von 14,3g wurde in das Mischanhydrid mit Äthylchlorcarbonat übergeführt, wie dies vor stehend geschrieben worden ist und gekuppelt mit 6- Amino-penicillansäure (13 g), wobei 17,6 g eines ver hältnismässig reinen Natrium-6-[L(+)a-(Carboben- zyloxyamino)-phenylacetamido]-penicillanates erhal ten wurden. Das Produkt ergab eine einzelne Zone antibiotischer Aktivität bei der Papierchromatogra- phie.
Die Hydrierung dieses Zwischenproduktes wurde in derselben Art und Weise durchgeführt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben worden ist. Die erste Kristall menge im Gewicht von 6,2 g bestund aus reiner wasserfreier 6-[L(+)a-Amino-phenylacetamido]-pe- nicillansäure, [a]D = @ 209 (C = 0,2 in Wasser), Zersetzung bei etwa 205 C. Umkristallisieren aus Wasser änderte die optische Drehung nicht.
EMI0003.0001
Analyse:
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 54,9,% <SEP> H <SEP> 5,6% <SEP> N <SEP> 11,8
<tb> S <SEP> <B>9,2%</B>
<tb> Berechnet <SEP> für <SEP> C1r,H19N30=S:
<tb> C <SEP> 55,0 <SEP> % <SEP> H <SEP> 5,5 <SEP> % <SEP> N <SEP> 12,0
<tb> S <SEP> <B>9,2%</B> Weitere 6 g weniger reinen Produktes wurden erhalten durch Konzentrieren des wässrigen Filtrates. Wie die erste Menge, ergab dieses Produkt lediglich eine einzelne Zone antibiotischer Aktivität bei der Papierchromatographie, welche sich von derjenigen unterschied, die mit dem nichtreduzierten Carbo- benzyloxy-Zwischenprodukt erhalten wurde.
<I>Beispiel 3</I> Eine Menge von 7,25 g = 0,0256 Mol D(-)ia- (Carbobenzyloxyamino)-phenylessigsäure (Smp.128 bis 129 C), [a ]D =-116,5 [C = 1 in Alkohol] und 4,25 ml Triäthylamin wurden in 210 ml Aceton ge löst und bei 0 C 5 Minuten lang gerührt. Zum Ge misch wurden 2,4 ml = 0,0255 Mol Äthylchlor- formiat hinzugefügt und das Gemenge sofort in ein Trockeneis-Aceton-Bad von -510 C gesetzt.
Eine Lö sung 6,5 g = 0,030 Mol 6-Amino-penicillansäure und 16g Natriumbicarbonat in 210 ml Wasser wurden auf einmal hinzugefügt und das Gemisch vom Trok- keneis-Aceton-Bad entfernt, wonach eine halbe Stunde lang zwischen -10 und 0 und schliesslich eine weitere halbe Stunde lang bei Zimmertempera tur gerührt wurde. Die Lösung wurde mit einem Liter Äther verdünnt und die abgeschiedene wüssrige Schicht abgetrennt. Der pH-Wert wurde durch Zu gabe von konzentrierter Salzsäure auf 2 erniedrigt, und das Penicillin mit zweimal 3-00 ml Äther extra hiert.
Der Äther wurde mit Wasser und schliesslich mit 75 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung ge waschen. Die wässrige Bicarbonatlösung wurde mit 8 g 5 % igem Palladium auf Strontiumcarbonat (Engel- hard) versetzt und bei 3,5 kg/cm2 in einem Nieder druckreduktor nach Parr eine Stunde lang hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, und der pH-Wert des Filtrates durch Zugabe von konzentrierter Salz säure auf 2 erniedrigt,
wonach mit Äther extrahiert wurde. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 4,65 durch Zugabe von festem Natriumbicarbonat einge stellt und die Lösung unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe) bei 32 auf ein Volumen von 20 ml eingeengt. Es schied sich eine feste kristalline Substanz ab, die abfiltriert wurde und 2,85g wog.
Ein Gramm derselben wurde aus 1'0 ml Wasser um kristallisiert, indem der pH-Wert durch Zugabe weni ger Tropfen konzentrierter Salzsäure auf 2 erniedrigt wurde und hiernach wieder auf 4,65 vermittels festem Natriumbicarbonat erhöht wurde. Man erhielt 0,25 g des reinen 6-[D(-)a-Amino-phenylacetamid'o]-peni- cillansäure-monohydrates. Das Produkt schmolz bei 2010 C unter Zersetzung.
EMI0003.0054
Analyse <SEP> für <SEP> C1sH19N304S.H20: <SEP> N <SEP> 11,4 <SEP> %.
<tb> Gefunden: <SEP> N <SEP> 11,14%.
Spezifische Drehung [a]25 = + 287 C (C = 0,1 in Wasser).
Zu 5,5 g = 0,0193 Mol D()a-(Carbobenzyloxy- amino)-phenylessigsäure und 2,6 g = 0,0243 Mol <I>Beispiel 4</I> 2,6-Lutidin in 25 ml p-Dioxan und 25 ml trockenem Aceton wurden bei 0 C 1,83 ml<B>=O,0193</B> Mol Äthylchlorformiat hinzugegeben. Es entstund eine weisse Fällung und das Gemisch wurde 20 Minuten lang gerührt. Eine Lösung von 4,9 g 6-Arnino-peni- cillansäure in 50 ml Wasser und 15 ml 2,6-Lutidin wurde auf einmal hinzugefügt.
Die klare Lösung wurde eine halbe Stunde lang gerührt und mit 500 ml Äther verdünnt. Die wässrige Schicht wurde abge trennt und festes Natriumbicarbonat hinzugefügt zur Einstellung des pH-Wertes auf B. Der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde auf 2 erniedrigt durch Zu gabe von konzentrierter Salzsäure, wonach das Peni cillin mit Äther extrahiert wurde.
Die ätherische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und extrahiert mit 25 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung. Die Natriumbicarbonatlösung, welche das Penicillin ent hielt, wurde zu 10 g eines 5 % igen Palladium-Kata- lysators auf Diatomeenerde (Engelhard) hinzuge geben, wonach durch Zugabe von weiteren 15 ml Wasser eine Paste erzeugt wurde.
Das Penicillin wurde bei 3,5 kg/cm2 Druck in einem Niederdruck reduktor nach Parr während einer Stunde bei Zim mertemperatur hydriert. Infolge der Bildung eines Kolloids wurde das Gemenge durch Seitz-Filter fil triert. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von kon zentrierter Salzsäure auf 2 erniedrigt, wonach mit Äther extrahiert wurde, um das Ausgangspenicillin zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und ihr pH-Wert durch Zugabe von festem Natrium- bicarbonat auf 4,65 eingestellt.
Durch Verdampfen unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe), bei 32 C wurde das Volumen der Lösung auf 20 ml eingeengt. Das 6 - [D()a - Amino-phenylacetamido]- penicillansäure-monohydrat kristallisierte aus und wurde abfiltriert.
EMI0003.0104
Analyse <SEP> für <SEP> C1OH19N304S.H20: <SEP> N <SEP> 11,4 <SEP> %.
<tb> Gefunden: <SEP> N <SEP> 11,34%.
<I>Beispiel 5</I> Die in Beispiel 4 beschriebene Verfahrensweise wurde nachgearbeitet unter Verwendung von L('-, )ri- (Carbobenzyloxyamino) - phenylessigsäure [a125 = +g5,5' <B>(C=l</B> in Alkohol) anstelle von D(-)a- (Carbobenzyloxyamino)-phenylessigsäure. Anstatt von 5 % Palladium auf Diatomeenerde gemäss Beispiel 4,
wurde jedoch 5 % Palladium auf Strontiumcarbonat verwendet. Das 6-[L(+)a-Amino-phenylacetamido]- penicillansäure-monohydrat, welches hierbei erhalten wurde, wies folgende spezifische Drehung und Ele mentaranalyse auf: [a]25 = 2011 C (C = 0,197 in Wasser).
EMI0004.0001
Analyse <SEP> für <SEP> C16H13N204S.H20:
<tb> C <SEP> 52,3 <SEP> ö <SEP> H <SEP> 5,7 <SEP> ö <SEP> N <SEP> 11,4 <SEP> %.
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 52,44% <SEP> H <SEP> <B>5,69%</B> <SEP> N <SEP> <B>11,26%.</B> Die minimale inhibitorische Konzentration (M.
I. C.). in mg/ml in vitro gegenüber einer Anzahl von gram-negativen Mikroorganismen wurde be stimmt durch Verdünnungsreihen in Agar, wobei ein direkter Vergleich der Aktivität gegenüber diesen Organismen gemacht wurde zwischen 6 - [D()a - Amino - phenylacetamido] - penicillansäure (A),
6 - [L(+)a-Amino-phenylacetamido]-penicillansäure (B) und Penicillin G.
Die dabei erhaltenen Resultate befinden sich in der nachfolgenden Tabelle:
EMI0004.0024
M. <SEP> I. <SEP> C. <SEP> mg/ml
<tb> A <SEP> B <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb> <B>(710/"</B> <SEP> rein) <SEP> (93 <SEP> % <SEP> rein)
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 25,0
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 12,5 <SEP> 12,5 <SEP> 50,0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 25,0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 2,5 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0,5 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0,5 <SEP> 1,25 <SEP> 2,5
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0,6 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5
<tb> Salm. <SEP> typhimurium <SEP> 0,5 <SEP> 5,0 <SEP> 0,6
<tb> Salm. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 6,25
<tb> Sahn. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 5,0
<tb> Salm.
<SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 6,25
<tb> Salm. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 5,0 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb> Shigella <SEP> shigae <SEP> 1,25 <SEP> 5,0 <SEP> 5,0
<tb> Shigella <SEP> schmitzi <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 6,25
<tb> Shigella <SEP> Bonnei <SEP> 6,25 <SEP> 25,0 <SEP> 50,0
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 5,0
Process for the preparation of epimeric α-amino-benzylpenicillins In the main patent no. 387 63.5 penicillin derivatives are described with valuable antibiotic properties, which were obtained by introducing an aminoacyl substituent group into the
EMI0001.0008
where Ph is a phenyl radical.
The presence of an asymmetric carbon atom (indicated by the asterisk) in the side chain of this compound indicates that it can exist in two optically active isomeric forms. These isomeric forms are epimers and not enantiomorphic in view of the fact that the 6-amino-penicillanic acid used in the synthesis is itself an optically active compound.
The starting material that has hitherto been used to produce α-aminobenzylpenicillin was the optically inactive DL form of α-aminophenylacetic acid, with the result that the penicillin obtained consisted of a mixture of the two epimers. The isolation, purification and testing of such a product pose difficult problems and it is undesirable as a commercial preparation in that its composition can vary from batch to batch.
The DL-a-aminophenylacetic acid was now broken down more and, starting from the decomposition products, two epimeric forms of an a-aminobenzyl penicillin were produced.
The patent relates to a process for the preparation of 6- [D () a - amino - phenylacetamido] - penicillan-amino group of 6-amino-penicillanic acid. One of these compounds is an a-amino-benzylpenicillin with the structural formula acid and 6- [L (-i-) a-amino-phenylacetamido] -penicillanic acid, which is characterized by
that 6-amino-penicillanic acid is coupled with the D- or L-form of an α-amino-phenylacetic acid, the amino group of which is protected, or a salt of such an acid, whereupon the protective group is split off under the reaction conditions.
The DL-α-amino-phenylacetic acid was broken down according to known methods [Betei and Meyer, Ber. (1908) 41, 2073: Ingersoll and Adams, J. Amer. Chem. Soc. (1925) 47, 1168]. The two epimeric forms were made from the D- and L-form of the acid (cf. Swiss Patent No. 387 635).
In order to avoid racemization, it is expedient to use mild reaction conditions throughout the process. When the protective group is split off, mild reaction conditions must be observed so that the penicillin core is not destroyed. The two different forms of α-amino-benzylpenicillin were isolated and obtained in analytically pure form.
The 6- [D (-) a-Amino-phenylacetamido] -penicillanic acid proved to be more soluble in water at the iso-electric point and also to be more active against various types of bacteria in vitro than the 6- [L (- -,) a-Amino-phenylacetamido] - penicillanic acid.
<I> Example 1 </I> D (-) a - (Carbobenzyloxyamino) phenylacetic acid mp. 130-130.5 [a] D = 119.4 (C = 3 in ethanol) was prepared by the action of benzyl chlorocarbonate to an ice-cold solution of D (-) a-aminophenylacetic acid in one equivalent of normal aqueous sodium hydroxide solution, further sodium hydroxide solution being added in order to maintain the pH between 8 and 9 for the duration of the reaction.
4.8 ml of ethyl chlorocarbonate were added to an ice-cold solution of 14.3 g of the above-mentioned Ca'rbobenzyloxy-derivative and 8.3 ml of triethylamine in 420 ml of dry acetone. The mixture was stirred at 0 for 5 minutes, triethylamine hydrochloride precipitating out and a mixed anhydride formed in the solution.
The suspension was cooled to -50 and an ice-cold solution of 13 g of 6-amino-penicillanic acid in 420 ml of 3% aqueous sodium bicarbonate solution was added to the same with vigorous stirring as quickly as possible, where it was ensured that the temperature of the mixture never rose could rise above 0 C. The clear solution obtained was stirred for 30 minutes at 0 C, stirring continued for a further 30 minutes, during which time the temperature of the solution rose to room temperature, after which the solution was finally extracted three times with 400 ml of ether and only the aqueous phase was retained has been.
The aqueous solution was adjusted to a pH of 2 by adding hydrochloric acid and the 6- [D (-) a- (carbobenzyloxyamino) phenylacetamido] penicillanic acid released was extracted three times with 150 ml of ether.
A partial purification of this intermediate product was carried out by re-extracting it in the form of the sodium salt in aqueous sodium bicarbonate solution, whereupon, after the pH was readjusted to 2, the free acid was extracted with ether. Finally, the product was converted back into the sodium salt by shaking the ethereal solution with enough 3% sodium bicarbonate solution
to obtain a neutral aqueous phase. The latter was separated and evaporated at low temperature and low pressure. The preparation obtained was finally dried over phosphorus pentoxide in vacuo and was relatively pure sodium 6 - [D (-) a - (carbobenzyloxyamino) phenylacetamido] penicillanate weighing 13 g. The preparation gave only one in paper chromatography single zone of antibiotic activity.
A suspension of 125 ml containing 38 g of palladium (30; δ) on barium carbonate was shaken in a hydrogen atmosphere at room temperature and atmospheric pressure for one hour. A neutral solution of 20.4 g of sodium 6- [D (-) a- (carbobenzyloxyamino) - phenylacetamido] - penicillanate in 250 ml of water was then added and the shaking under hydrogen continued for a further hour.
The suspension was filtered and the combined filtrates and aqueous washing solutions were treated with n-hydrochloric acid to adjust the pH to 2, followed by washing three times with 100 ml of ether. The aqueous phase was adjusted to pH 4.65 using 3% sodium bicarbonate solution and then concentrated to a volume of approximately 5.0 ml at low temperature and low pressure, after which fine colorless needles were deposited.
After 30 minutes the crystals were separated off, washed with a little cold water and dried over phosphorus pentoxide in vacuo. Pure ö- [D (-) a-aminophenylacetamido] -penicillanic acid monohydrate weighing 5.5 g, [a] D = -: - 281 (C = 1 in water) decomposition at about 202 C. Recrystallization from water did not change the optical rotation.
EMI0002.0072
Analysis:
<tb> Found: <SEP> C <SEP> 52.5 <SEP>% <SEP> H <SEP> 5.7 <SEP>% <SEP> N <SEP> 11.9
<tb> S <SEP> 8.9
<tb> Calculates <SEP> for: <SEP> CICHi9N304S. ENT:
<tb> C <SEP> <B> 52.3% </B> <SEP> H <SEP> <B> 5.8% </B> <SEP> N <SEP> <B> 11.9% </B>
<tb> S <SEP> 8.7 A further 9 g of less pure product were obtained by concentrating the aqueous filtrate. Like the first batch, this product gave only a single zone of antibiotic activity on paper chromatography, which was different from that obtained with the unreduced carbenzyloxy intermediate.
<I> Example 2 </I> The L (+) a- (carbobenzyloxyamino) - phenylessib acid, melting point 130-130.5, [a] D = + 117 (C = 3 in ethanol), was derived from L ( +) cc-amino-phenylacetic acid prepared by the method described for its enantiomorph.
The product obtained weighing 14.3 g was converted into the mixed anhydride with ethyl chlorocarbonate, as has been written before and coupled with 6-amino-penicillanic acid (13 g), 17.6 g of a relatively pure sodium 6- [L (+) a- (Carboben- zyloxyamino) -phenylacetamido] -penicillanates were obtained. The product revealed a single zone of antibiotic activity on paper chromatography.
The hydrogenation of this intermediate was carried out in the same manner as that described in Example 1. The first set of crystals weighing 6.2 g consisted of pure anhydrous 6- [L (+) a-Amino-phenylacetamido] -penicillanic acid, [a] D = @ 209 (C = 0.2 in water), Decomposition at about 205 C. Recrystallization from water did not change the optical rotation.
EMI0003.0001
Analysis:
<tb> Found: <SEP> C <SEP> 54.9,% <SEP> H <SEP> 5.6% <SEP> N <SEP> 11.8
<tb> S <SEP> <B> 9.2% </B>
<tb> Calculates <SEP> for <SEP> C1r, H19N30 = S:
<tb> C <SEP> 55.0 <SEP>% <SEP> H <SEP> 5.5 <SEP>% <SEP> N <SEP> 12.0
<tb> S <SEP> <B> 9.2% </B> A further 6 g of less pure product were obtained by concentrating the aqueous filtrate. Like the first batch, this product revealed only a single zone of antibiotic activity on paper chromatography, which was different from that obtained with the unreduced carbenzyloxy intermediate.
<I> Example 3 </I> An amount of 7.25 g = 0.0256 mol of D (-) ia- (carbobenzyloxyamino) phenylacetic acid (m.p. 128 to 129 C), [a] D = -116.5 [C = 1 in alcohol] and 4.25 ml of triethylamine were dissolved in 210 ml of acetone and stirred at 0 C for 5 minutes. 2.4 ml = 0.0255 mol of ethyl chloroformate were added to the mixture, and the mixture was immediately placed in a dry ice-acetone bath at -510 C.
A solution 6.5 g = 0.030 mol of 6-amino-penicillanic acid and 16 g of sodium bicarbonate in 210 ml of water were added all at once and the mixture was removed from the dry ice-acetone bath, after which for half an hour between -10 and 0 and finally stirred for a further half an hour at room temperature. The solution was diluted with one liter of ether and the deposited aqueous layer was separated off. The pH was lowered to 2 by adding concentrated hydrochloric acid, and the penicillin was extracted twice with 3-00 ml of ether.
The ether was washed with water and finally with 75 ml of saturated sodium bicarbonate solution. The aqueous bicarbonate solution was mixed with 8 g of 5% palladium on strontium carbonate (Engelhard) and hydrogenated at 3.5 kg / cm2 in a Parr low pressure reducer for one hour. The catalyst was filtered off, and the pH of the filtrate was lowered to 2 by adding concentrated hydrochloric acid,
after which it was extracted with ether. The pH of the solution was adjusted to 4.65 by adding solid sodium bicarbonate and the solution was concentrated under reduced pressure (water pump) at 32 to a volume of 20 ml. A solid crystalline substance separated out, which was filtered off and weighed 2.85 g.
One gram of the same was recrystallized from 10 ml of water by lowering the pH to 2 by adding a few drops of concentrated hydrochloric acid and then increasing it again to 4.65 by means of solid sodium bicarbonate. 0.25 g of the pure 6- [D (-) a-Amino-phenylacetamid'o] -penicillanic acid monohydrate were obtained. The product melted at 2010 C with decomposition.
EMI0003.0054
Analysis <SEP> for <SEP> C1sH19N304S.H20: <SEP> N <SEP> 11.4 <SEP>%.
<tb> Found: <SEP> N <SEP> 11.14%.
Specific rotation [a] 25 = + 287 C (C = 0.1 in water).
To 5.5 g = 0.0193 mol of D () α- (carbobenzyloxy-amino) -phenylacetic acid and 2.6 g = 0.0243 mol <I> Example 4 </I> 2,6-lutidine in 25 ml p Dioxane and 25 ml of dry acetone were added at 0 C. 1.83 ml of 0.0193 mol of ethyl chloroformate. A white precipitate formed and the mixture was stirred for 20 minutes. A solution of 4.9 g of 6-amino-penicillanic acid in 50 ml of water and 15 ml of 2,6-lutidine was added all at once.
The clear solution was stirred for half an hour and diluted with 500 ml of ether. The aqueous layer was separated off and solid sodium bicarbonate was added to adjust the pH to B. The pH of the aqueous solution was lowered to 2 by adding concentrated hydrochloric acid, after which the penicillin was extracted with ether.
The ethereal layer was washed with water and extracted with 25 ml of saturated sodium bicarbonate solution. The sodium bicarbonate solution, which contained the penicillin, was added to 10 g of a 5% palladium catalyst on diatomaceous earth (Engelhard), after which a paste was produced by adding a further 15 ml of water.
The penicillin was hydrogenated at 3.5 kg / cm2 pressure in a low-pressure Parr reductor for one hour at room temperature. As a result of the formation of a colloid, the mixture was filtered through a Seitz filter. The pH was lowered to 2 by the addition of concentrated hydrochloric acid, after which it was extracted with ether in order to remove the starting penicillin. The aqueous layer was separated and its pH was adjusted to 4.65 by adding solid sodium bicarbonate.
The volume of the solution was reduced to 20 ml by evaporation under reduced pressure (water jet pump) at 32.degree. The 6 - [D () a - aminophenylacetamido] - penicillanic acid monohydrate crystallized out and was filtered off.
EMI0003.0104
Analysis <SEP> for <SEP> C1OH19N304S.H20: <SEP> N <SEP> 11.4 <SEP>%.
<tb> Found: <SEP> N <SEP> 11.34%.
<I> Example 5 </I> The procedure described in Example 4 was followed up using L ('-,) ri- (carbobenzyloxyamino) - phenylacetic acid [a125 = + g5,5' <B> (C = l </ B> in alcohol) instead of D (-) a- (carbobenzyloxyamino) -phenylacetic acid. Instead of 5% palladium on diatomaceous earth according to Example 4,
however, 5% palladium on strontium carbonate was used. The 6- [L (+) a-Amino-phenylacetamido] - penicillanic acid monohydrate, which was obtained in this way, had the following specific rotation and elemental analysis: [a] 25 = 2011 C (C = 0.197 in water).
EMI0004.0001
Analysis <SEP> for <SEP> C16H13N204S.H20:
<tb> C <SEP> 52.3 <SEP> ö <SEP> H <SEP> 5.7 <SEP> ö <SEP> N <SEP> 11.4 <SEP>%.
<tb> Found: <SEP> C <SEP> 52.44% <SEP> H <SEP> <B> 5.69% </B> <SEP> N <SEP> <B> 11.26%. < / B> The minimum inhibitory concentration (M.
I. C.). in mg / ml in vitro against a number of gram-negative microorganisms was determined by dilution series in agar, whereby a direct comparison of the activity against these organisms was made between 6 - [D () a - amino - phenylacetamido] - penicillanic acid (A. ),
6 - [L (+) a-Amino-phenylacetamido] -penicillanic acid (B) and penicillin G.
The results obtained can be found in the following table:
EMI0004.0024
M. <SEP> I. <SEP> C. <SEP> mg / ml
<tb> A <SEP> B <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb> <B> (710 / "</B> <SEP> pure) <SEP> (93 <SEP>% <SEP> pure)
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 6.25 <SEP> 12.5 <SEP> 25.0
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 12.5 <SEP> 12.5 <SEP> 50.0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 6.25 <SEP> 12.5 <SEP> 25.0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 2.5 <SEP> 12.5 <SEP> 6.25
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0.5 <SEP> 2.5 <SEP> 2.5
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0.5 <SEP> 1.25 <SEP> 2.5
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0.6 <SEP> 2.5 <SEP> 2.5
<tb> Salm. <SEP> typhimurium <SEP> 0.5 <SEP> 5.0 <SEP> 0.6
<tb> Salm. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 2.5 <SEP> 5.0 <SEP> 6.25
<tb> cream. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 2.5 <SEP> 5.0 <SEP> 5.0
<tb> Salm.
<SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 2.5 <SEP> 5.0 <SEP> 6.25
<tb> Salm. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 5.0 <SEP> 12.5 <SEP> 6.25
<tb> Shigella <SEP> shigae <SEP> 1.25 <SEP> 5.0 <SEP> 5.0
<tb> Shigella <SEP> schmitzi <SEP> 2.5 <SEP> 5.0 <SEP> 6.25
<tb> Shigella <SEP> Bonnei <SEP> 6.25 <SEP> 25.0 <SEP> 50.0
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 2.5 <SEP> 5.0 <SEP> 5.0