Verfahren zur Herstellung eines bepaflflähnlichen Wirkstoffes
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines heparinähnlichen Wirkstoffes aus dem Duodenum, insbesondere von Schweinen, Ochsen, Pferden oder Schafen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist - dadurch gekennzeichnet, dass man das Darmrnaterial in angesäuertem Wasser bis zur Paste homogenisiert, das Homogenisat etwa 5 Minuten-auf etwa 100" erhitzt, neutralisiert, mit Essigsäure auf ein pH von etwa 5,0 bringt, filtriert, den Rückstand in Wasser bei einem pH von etwa 8,0 aufschlämmt, die Suspension etwa 15 Minuten bei 70-900 hydrolysiert, das Filtrat konzentriert, gegen Wasser dialysiert und aus dem Dialysat den Wirkstoff bei pH 5,0 mit Aceton ausfällt und mit einem Alkohol/Ather-Gemisch trocknet.
Der Gebrauch von Heparin in der Prophylaxe und Therapie von atherosclerotischen Störungen ist von seiner besonderen Wirkung auf den lypoprotide- mischen Zustand und auf das Verhältnis zwischen alpha- und beta-Globulin abhängig und weist auffallende Nachteile aus verschiedenen Gründen auf.
Da das Heparin eine Antigerinn-Wirkung besitzt, muss in erster Linie eine längere Behandlung mit dieser Droge unter ständiger Beobachtung der Gerinnungszeiten stattfinden, um dem Blutverlust vorzubeugen. Heparin kann nicht in befriedigender Weise durch intravenöse Injektion eingeführt werden, weil die Injektion breite Hämatome an der Injektionsstelle hervorruft, auch kann es nicht wegen seiner Unbeständigkeit per os zugeführt werden. Heparin wird auch von Verdauungsenzymen, besonders hepatischer Heparinase zerstört oder unwirksam gemacht.
Dadurch ist die Zuführung von Heparin auf intravenöse, subkutane und perlinguale Wege beschränkt und muss unter Kontrolle der -Koagulationszeit durchgeführt werden.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren wurde nun eine neue Verbindung isoliert, die Ateroid genannt werden soll, und die gewisse auffallende Vorteile Heparin gegenüber aufweist.
Während unter gewissen Gesichtspunkten Ateroid heparinähnlich ist, hat es doch keine wesentliche antikoagulierende Wirkung auf therapeutische Zuführungsdosen, ist gegen Lypoprotidemie bei oraler oder parenteraler Zuführung wirksam und besitzt eine starke hypocholesterolemische Aktivität. Es ist also unter anderem-in der Behandlung der Arteriosklerose und ähnlicher Störungen, bei denen eine Veränderung in dem Lipoid/Protein-Stoffwechsel vorgeht, verwendbar.
Nach unseren gegenwärtigen Erkenntnissen soll Ateroid ein heparinoidischer Faktor sein, vermutlich von -aminopolysaccharider (oder glycoproteischer) Natur, der eine metachromatische Reaktion mit Toluidin-Blau aufweist. Andere Eigenschaften des Ateroids werden nachträglich beschrieben. Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene rohe Ateroid kann - einer weiteren Reinigung durch geeignete Verfahren unterworfen werden. Beispielsweise kann die Reinigung durch weitere saure und/oder alkalische Extraktionen, Dialyse und ähnliche Verfahren durchgeführt werden, auch kann sie durch Behandlung mit Phenol, wie nachstehend beschrieben, vorgenommen werden.
Beispiel
Eine Menge (z. B. 50 kg) gewaschener und gemahlener Schweine-Zwölffingerdarm wird in Wasser aufgeschlämmt (z. B. in 150 Liter), 0, 5 /o HC1 enthaltend (ungefähr 750 ml HC1 für 150 Liter). Das Ganze wird dann beispielsweise in einer Kolloid Mühle homogenisiert, bis der gemahlene Zwölffingerdarm -vollkommen in eine Paste verwandelt ist.
Diese Substanz wird dann in einen Extraktor eingeführt, wobei sie unter Rühren zum Kochen gebracht wird, wobei die Temperatur einige Minuten lang (z. B. 5 Minuten) bei ungefähr 1000 C gehalten wird.
Nach Erkaltung wird das Gemisch z. B. mit NaOH zum pH von etwa 6,8-7,0 neutralisiert und ungefähr 2 Stunden lang stehengelassen. Das Gemisch wird dann z. B. mit Essigsäure zu einem pH Wert von ungefähr 5,0 angesäuert.
Die Flüssigkeit wird dann vom festen Rückstand in einem Hydroextraktor oder ähnlichen Apparat getrennt und beiseite gestellt. Es ist vorteilhaft, den festen Rückstand im Vakuum-Ofen zu trocknen.
Das Gewicht des getrockneten Materials aus 50 kg Zwölffingerdarm beträgt etwa 7-8 kg.
Das getrocknete Material wird dann gemahlen und, falls es sehr fett ist, entfettet. Es wird dann in Wasser bei pH 8 aufgeschlämmt, und die Suspension wird dann für ungefähr 15 Minuten bei einer Temperatur von 70-90 C erhitzt, um die Hydrolyse des Materials durchzuführen. Die Suspension wird dann in der Wärme filtriert und das Filtrat wird aufbewahrt. Der feste Rückstand kann zwecks besserer Ausbeute noch einmal mit Wasser wieder extrahiert und der Hydrolyse und Filtration unterworfen werden. Das erhaltene Filtrat wird mit dem Filtrat der 1. Extraktion zusammengebracht. Die vereinigten Filtrate können dann mit Proteasen, wie Trypsin, Papain u. ä. behandelt werden, um, falls gewünscht, die Proteolyse des Materials durchzuführen, die Flüssigkeit wird dann zu etwa 1, 4 ihres Anfangs- volumens konzentriert und dialysiert.
Man kann die Dialyse mit einem Behälter aus Zellglas durchführen, indem man 2 Liter Flüssigkeit alle 24 Stunden dialysiert. Das dialysierte Material wird dann gefiltert und der feste Rückstand wird entfernt. Dem Dialysat fügt man 11,4' seines Volumens Aceton unter starkem Rühren bei, wobei der pH-Wert des Gemisches auf pH 5 durch Zugabe von Essigsäure eingestellt wird. Der entstehende Niederschlag, der rohes Ateroid darstellt, wird mit Alkohol und Äther getrocknet. Die Ausbeute beträgt ungefähr 0,16 0/o des frischen Tierorgans.
Nachfolgend werden zwei Methoden zur weitern Reinigung von so erhaltenem rohem Ateroid beschrieben:
Methode I
Ungefähr 1 kg pulverisiertes, rohes Ateroid wird in etwa 20 Liter Natronlauge (pH = 8) gelöst und das Ganze wird im Wasserbad auf 700 C erhitzt. Man filtriert, und das klare Filtrat wird mit etwa 5 Volumen 95%igen Alkohols ausgefällt und bis zum pHwert = 5,5-6,0, beispielsweise mit cl angesäuert.
Nach 12 Stunden wird die Flüssigkeit abgegossen und der Niederschlag, der ungefähr 250 g wiegt, wird nochmals in Natronlauge gelöst. Die erhaltene Lösung ist goldgelb.
Die hinzugefügte Menge an Natronlauge hängt von der Lösbarkeit des Materials ab, die von Fall zu Fall variieren kann. Die Natronlauge wird langsam bis zur vollkommenen Auflösung zugesetzt.
Nach Ansäuerung zum pH-Wert = 5 wird eine 2,5 Q/o Cadmiumchlorid enthaltende Lösung zugesetzt.
Das Gemisch wird auf 700 C erhitzt und filtriert.
Die einen Überschuss an Cadmium enthaltende Flüssigkeit wird mit einem Schwefelwasserstoffstrom behandelt, um das Cadmium in Form seines Sulfids auszufällen. Der Überschuss an Schwefelwasserstoff wird durch Erhitzen entfernt. Man fügt 2 bis 3 Volumen Aceton zu der klaren Lösung hinzu und nach 12 Stunden wird die Flüssigkeit von dem gebildeten Rückstand getrennt. Der Niederschlag wird dann mit Alkohol und Ather getrocknet und abschliessend im Vakuum.
Die erhaltene Substanz, die ungefähr 50 g wiegt, stellt einen weissen oder elfenbeinfarben-weissen Staub gereinigten Ateroids dar.
Methode II
Ateroid kann auch durch Behandlung mit Phenol, wie beispielsweise nachfolgend beschrieben, gereinigt werden.
Rohes, wie oben beschrieben erhaltenes Ateroid, wird in 90 O/o Phenol (5 /o w/v) suspendiert, 48 Stunden lang geschüttelt und zentrifugiert. Es werden zwei Fraktionen getrennt, und zwar eine phenolunlösliche und eine phenollösliche Fraktion. Der phenolunlösliche Anteil wird mit 5 Raumteilen Alkohol gewaschen und in einem Mörser zerkleinert. Der phenolunlösliche Anteil wird dann mit Äther gewaschen, wobei man ein elfenbeinweisses Pulver erhält. Das Pulver wird dann in Wasser (1:10 Raumteile) gelöst, 36 Stunden dialysiert, mit Alkohol (3 Vol. 95 O/n) ausgefällt, zentrifugiert und mit Äther getrocknet. Das Produkt ist gereinigtes Ateroid mit 60-70 0/u reiner Substanz.
Der phenollösliche Anteil wird mit 50%igem Alkohol bei 900 C behandelt, zentrifugiert oder abgefüllt, mit Alkohol und Äther gewachen und getrocknet. Man erhält eine weitere Menge gereinigtes Ateroid.
Das aus dem Zwölffingerdarm mehrerer Tierarten isolierte Ateroid kann durch die nachfolgenden Reaktionen im Vergleich mit Heparin und ähnlichen Substanzen weiter charakterisiert werden.
Metachromatische Reaktion
Die spektrophotometrischen Eigenschaften von Heparin, Ateroid und Condroitin-Schwefelsäure (nachstehend mit C. S. A. bezeichnet), mit Toluidin-Blau (T. B.) bei Anwendung wässriger Lösungen in einer 1 cm Quarzzelle werden in Fig. 1 auf beigefügter Zeichnung dargestellt. Hierbei wurde ein Beckmann Spectrophotometer DU benutzt.
In der Zeichnung haben die verschiedenen Kurven nachstehende Bedeutung (T. B. 200 u Heparin
C.S.A. .....
Ateroid
Wie ersichtlich, sind die Transmissionskurven von C. S. A. und Ateroid einander ähnlich, aber ausgesprochen verschieden von derjenigen des Heparins.
Der kritische Myzellenpunkt, das heisst der Punkt, bei dem die Substanz mit einer Standard-Dosis Toluidin-Blau gesättigt ist, ist jeweils
Heparin Ateroid C. S. A.
0,400 0,455 0,450
Der kritische Myzellenpunkt wird als Gewichtsverhältnis zwischen der Substanzmenge und der T. B. Menge ausgedrückt.
Die photodensitometrischen Ablesungen der metachromatischen, auf elektrophoretischen Abschnitten erhaltenen Bänder mit gleichen Substanzmengen, weisen vergleichbare Flächen untereinander auf.
Wenn man vom Heparinwert, der in meta chromatischen Einheiten in g/mg ausgedrückt = 1000 ist, ausgeht, werden folgende Werte erhalten:
Heparin Ateroid C. S. A.
1000 424 250
Elektrophoresis
Elektrophoretische Prüfungen auf Papier bei pH 8,6 ergeben, dass die Geschwindigkeit der anodischen Wanderung von Heparin etwas grösser ist als diejenige von Ateroid. Diese Tatsache zeigt an, dass Ateroid ein geringeres Nettogewicht pro Masseinheit besitzt.
Bei pH = 8,6 wird für Borsäure-Pufferlösung (680 ml Borsäure-Pufferlösung 12,404 g Borsäure + 100 ml N NaOH mit Wasser bis 1000 mls aufgefüllt), der 320 ml 0,1 NHC1 zugefügt werden, die Wanderungs-Geschwindigkeit U des Ateroids und Heparins mit Hilfe folgender Formel errechnet: d t.F worin d den Abstand in cm von der Ausgangslinie be zeichnet,
F das Verhältnis zwischen der Potentialdifferenz in
Volts und der Länge des Abschnittes in cm, t die Fortbewegungszeit in Sekunden.
Gefundene Werte: Heparin: U =-6,67#10-5
Ateroid: : U=-4, 44-10-5
Bezieht man sich auf Plasma Proteine, so wandert Heparin schneller als albumin, während Ateroid eine Wanderungsgeschwindigkeit zwischen der des alpha1- und alpha2-Globulins besitzt.
Hexuronsäuregehalt
Ateroid gibt eine positive Reaktion mit Karbazol, was die Anwesenheit von Hexuronsäure im Molekül anzeigt (Dische, Z., J. Biol. Chem. 167,189 [1947]).
Diese Reaktion wurde mit Elektropherogramm Eluaten auf Papier eines Standard Ateroid-Präparates durchgeführt. Es wurden folgende Werte in g/mg erhalten:
Heparin Ateroid C. S. A.
310-335 318-382 297
Hexosamin
Die Bestimmung von Hexosamin durch die Methode Elson und Morgan, über Elektropherogramm-Eluate, gaben die folgenden Werte in u g/mg:
Heparin Ateroid C, S. A.
320 243 160 Neben den Angaben physikalisch-chemischer Natur, wie jene der metachromatischen Karbazol- und Hexosamin-Reaktion, hat man auch biologische Daten erhalten, indem man stets vom Heparin ausging. Auch diese biologischen Angaben unterscheiden Ateroid von anderen bekannten, sehr heparinähnlichen Substanzen.
Antilypemische Wirkung
Die antilypemische Wirkung auf verschiedene Stadien von Lypemie wurde mit Bezug auf Heparin, von dem ausgegangen wurde, geprüft, und zwar
0. D. Plasma zu 600 ma
In weisse Ratten oder 300 g Long-Evans spots wird Triton W. R. 1339 (p-isooctylpolyoxyäthylenphenol) intravenös in einer Dosis von 200 mg/kg eingeführt und gleichzeitig findet unter Kontrolle eine introperitonale Einführung der Substanz in einer Dosis von 100 mg/kg statt.
Nach 8 Stunden werden den Tieren 8-10 ml saures Blut durch intercardiale Punktion entnommen.
Die optische Dichte bei 600 m wird im Plasma mit dem Beckmann D. U. Spektrophotometer in einer 1-cm-Zelle bestimmt.
Der Fall in O. D. wird durch folgende Formel errechnet: %=100- X100
T-C wobei: 0 den Fall in Prozenten angibt,
E den Durchschnittswert der mit Triton und Ateroid (100 mg/kg) behandelten Menge,
C den Durchschnittswert der Kontrollmenge,
T den Durchschnittswert der nur mit Triton behan delten Menge.
Die Ergebnisse sind die folgenden: Triton Heparin Ateroid
Kontrollen 200 mg/kg 100 mg/kg 100 mg/kg O.D. 600 m, 0,163 0,546 0,262 0,172 O. D. O/o 100,000 335,000 161,000 106,000 /o Fall bezüglich Kontrolle 0,000 0,000 74,200 97,600
Totale Lypemie
Die Lypemie wurde durch das modifizierte Bloor Verfahren bestimmt. Der lypemische Fall wurde mit Hilfe obiger Formel errechnet.
Die Werte der totalen Lypemie, ausgedrückt in mg/100 ml Plasma für Dosen von 100 mg sind die folgenden:
Kontrollen Triton Heparin Ateroid Total-Lipid, mg/100 ml 460 1900 800 655 o/o Total-Lipid 100 413 174 142 /o Lipiden-Fall mit Bezug auf Kontrolle - 0 76,4 86,4 A nticholesterole Wirkung
Das in das Bauchfell von weissen Ratten unter den oben beschriebenen Bedingungen eingeführte Ateroid rief neben dem Lipid-Fall eine wesentliche Verminderung von totalem und esterifiziertem Cholesterin hervor, die mit der Liebermann- und Bouchard-Methode bestimmt wurde.
Die Errechnung des Fall-Prozentes geschieht wie für die Lipide mit Hilfe der oben angeführten Formel.
Es wurde ein wesentlicher Wechsel des sowohl freien als auch esterifizierten Cholesterinspiegels beobachtet:
Triton Heparin Ateroid Kontro en 200 mg/kg 100 mglkg 100 mg/kg Total Cholesterin, mg/100 ml 45 150 91 74 Total Cholesterin, O/o 100 333 202 164 Total Cholesterin Fall bezüglich Kontrolle - 0 56,2 72,4 Esterifiziertes Cholesterin mg/100 ml 32 105 58 61 o/o Esterifiziertes Cholesterin 100 328 181 191 Esterifiziertes Cholesterin Fall bezüglich Kontrolle - 0 64,4 60,2 Freies Cholesterin, mg/100 ml 13 45 33 13 O/o Freies Cholesterin 100 346 254 100 Freies Cholesterin Fall bezüglich Kontrolle - 0 37,5 100
Klärwirkung
Ein Beweis,
der für die Darstellung der biologischen Wirkung einer besonderen Zusammensetzung, der Klärwirkung zugeschrieben wird, für wesentlich erachtet wird, ist die herbeigeführte Klärung in Tier Plasma, das unter Kontrolle mit der Substanz in geeignetem Substrat behandelt wurde, im Vergleich mit dem Plasma von Kontroll-Tieren.
Da der Klärungsvorgang die Folge der Aktivierung wässriger Lipasen ist und genauer noch die Folge der Aktivierung von Triglyzeridasen durch die Wirkung von Heparin, ist die Bestimmung der Lypasemie ein Massstab für die heparinähnliche Wirkung einer solchen Substanz.
Wir führten daher die folgenden beiden Experimente durch: das erste mit intravenöser Einführung und das zweite unter Magen-Einführung mit Hilfe einer Ampulle mit einer Dosis von 10 mg/Ratte.
Es wurden gefütterte weisse Ratten mit einem Gewicht von 200 g benutzt.
Als Gundlage wurde Ediol in einer Verdünnung von 0,25%, 1 ml verwandt, dem 2 ml. Plasma zugesetzt wurden.
Die erhaltenen Data sind nachstehend aufgeführt: Intravenöse Einführung 10 mg/Ratte (Blutentnahme 10 Minuten nach der Einführung):
Kontrollen Heparin Ateroid Zeit
O.D. m % O.D. % O.D. %
30" 565 100 605 100 555 100
15' 570 101 280 46 168 30
30' 560 99 192 32 115 21
45' 560 99 170 28 102 18
60' 560 99 160 26 95 17
Orale Einführung 10 mg/Ratte (Blutentnahme 30 Minuten nach der Einführung):
Kontrollen Heparin Ateroid
O.D.m % OD. % O. D. %
30" 600 100 597 100 597 100
60' 600 100 560 94 430 72
120' 580 97 520 87 308 52
240' 530 88 465 78 182 31
Im Gegensatz zu Heparin ist oral eingeführtes Ateroid klärungsbewirkend.
Wirkung auf Plasma-Lipoproteine
Ausser einer auffallenden lypemischen und cholesterinen Wirkung wurde auch ein Normalisierungsprozess bei Lipoproteidemie festgestellt, beides unter Mengen- und Qualitäts-Aspekten.
Es findet somit ausser einer wesentlichen Reduktion von totalen Lipoproteinen eine Vergrösserung der elektrophoretischen Geschwindigkeit des beta Globulins und eine normalisierende Veränderung im alpha/beta-Globulin-Verhältnis statt.
Die elektrophoretischen Bewegungen werden auf Papier verfolgt, unter Beigabe festgesetzter Mengen von Plasma der wie oben beschrieben behandelten Tiere und anschliessender Prüfung der Proben für Lipoproteine.
Antikoagulante Wirkung
Die antikoagulante Wirkung wurde wie gewöhnlich durch Versuche mit Heparin an 2 kg schweren Kaninchen festgestellt.
Die Ateroid-Dosis betrug 12 mg/kg, während die Heparin-Dosis 5-10-20 mg/kg ausmachte. Die Prothrombin-Zeit wurde vom Augenblick der Einführung an bestimmt. Die nachstehend angeführten Werte geben die Prothrombin-Anfangszeit in Prozenten an, und zwar vor der Einführung des Präparates.
Heparin Heparin Heparin Ateroid Zeit Kontrollen
5 mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg 12 mg/kg
0 100 100 100 100 100
30' 102 135 203 300 150
60' 102 130 181 280 141
120' 98 122 152 200 115
240' 101 81 111 156 102
Es ist somit ersichtlich, dass 12 mg Ateroid die gleiche antikoagulante Wirkung wie 5-6 mg Heparin haben.
Process for the production of an active substance similar to a treatment surface
The present invention relates to a method for obtaining a heparin-like active ingredient from the duodenum, in particular from pigs, oxen, horses or sheep.
The method according to the invention is characterized in that the intestinal material is homogenized in acidified water to a paste, the homogenate is heated to about 100 "for about 5 minutes, neutralized, brought to a pH of about 5.0 with acetic acid, filtered and the residue slurried in water at a pH of about 8.0, the suspension hydrolyzed for about 15 minutes at 70-900, the filtrate concentrated, dialyzed against water and the active ingredient precipitated from the dialysate at pH 5.0 with acetone and with an alcohol / ether -Mixture dries.
The use of heparin in the prophylaxis and therapy of atherosclerotic disorders is dependent on its special effect on the lypoprotidemic state and on the relationship between alpha- and beta-globulin and has striking disadvantages for various reasons.
Since the heparin has an anticoagulant effect, a longer treatment with this drug must take place with constant observation of the clotting times in order to prevent blood loss. Heparin cannot be satisfactorily introduced by intravenous injection because the injection produces wide bruises at the injection site, nor can it be administered orally because of its instability. Heparin is also destroyed or rendered ineffective by digestive enzymes, particularly hepatic heparinase.
As a result, the supply of heparin is restricted to intravenous, subcutaneous and perlingual routes and must be carried out under control of the coagulation time.
With the method according to the invention, a new compound has now been isolated which is to be called ateroid and which has certain striking advantages over heparin.
While ateroid is heparin-like in certain respects, it has no substantial anticoagulant effect on therapeutic delivery doses, is effective against lipoprotidemic when administered orally or parenterally, and has potent hypocholesterolemic activity. It can therefore be used, inter alia, in the treatment of arteriosclerosis and similar disorders in which there is a change in the lipoid / protein metabolism.
According to our current knowledge, ateroid is said to be a heparinoidic factor, presumably of an aminopolysaccharid (or glycoprotein) nature, which has a metachromatic reaction with toluidine blue. Other properties of the ateroid are described below. The raw ateroid obtained by the process according to the invention can be subjected to further purification by suitable processes. For example, the purification can be carried out by further acidic and / or alkaline extractions, dialysis and similar processes, and it can also be carried out by treatment with phenol, as described below.
example
A quantity (e.g. 50 kg) of washed and ground pig duodenum is slurried in water (e.g. in 150 liters) containing 0.5 / o HC1 (approximately 750 ml HC1 for 150 liters). The whole thing is then homogenized, for example in a colloid mill, until the ground duodenum is completely transformed into a paste.
This substance is then introduced into an extractor, bringing it to a boil with stirring, the temperature being held at approximately 1000 ° C. for a few minutes (e.g. 5 minutes).
After cooling, the mixture is z. B. neutralized with NaOH to pH about 6.8-7.0 and allowed to stand for about 2 hours. The mixture is then z. B. acidified with acetic acid to a pH of about 5.0.
The liquid is then separated from the solid residue in a hydro-extractor or similar apparatus and set aside. It is advantageous to dry the solid residue in a vacuum oven.
The weight of the dried material from 50 kg of duodenum is about 7-8 kg.
The dried material is then ground and, if it is very fatty, degreased. It is then slurried in water at pH 8, and the suspension is then heated for about 15 minutes at a temperature of 70-90 ° C to carry out hydrolysis of the material. The suspension is then filtered while warm and the filtrate saved. The solid residue can be extracted again with water for a better yield and subjected to hydrolysis and filtration. The filtrate obtained is brought together with the filtrate from the 1st extraction. The combined filtrates can then u with proteases such as trypsin, papain. Ä. Treated in order, if desired, to carry out the proteolysis of the material, the liquid is then concentrated to about 1.4 of its initial volume and dialyzed.
Dialysis can be carried out with a cell glass container by dialyzing 2 liters of liquid every 24 hours. The dialyzed material is then filtered and the solid residue is removed. 11.4 'of its volume of acetone is added to the dialysate with vigorous stirring, the pH of the mixture being adjusted to pH 5 by adding acetic acid. The resulting precipitate, which is crude ateroid, is dried with alcohol and ether. The yield is approximately 0.16% of the fresh animal organ.
Two methods for further purification of raw ateroid obtained in this way are described below:
Method I.
About 1 kg of powdered, raw ateroid is dissolved in about 20 liters of sodium hydroxide solution (pH = 8) and the whole thing is heated to 700 ° C. in a water bath. It is filtered, and the clear filtrate is precipitated with about 5 volumes of 95% alcohol and acidified to pH = 5.5-6.0, for example with cl.
After 12 hours, the liquid is poured off and the precipitate, which weighs approximately 250 g, is again dissolved in sodium hydroxide solution. The solution obtained is golden yellow.
The amount of caustic soda added depends on the solubility of the material, which can vary from case to case. The sodium hydroxide solution is slowly added until it is completely dissolved.
After acidification to pH = 5, a solution containing 2.5% cadmium chloride is added.
The mixture is heated to 700 ° C. and filtered.
The liquid containing an excess of cadmium is treated with a stream of hydrogen sulfide in order to precipitate the cadmium in the form of its sulfide. The excess hydrogen sulphide is removed by heating. 2 to 3 volumes of acetone are added to the clear solution and after 12 hours the liquid is separated from the residue formed. The precipitate is then dried with alcohol and ether and finally in vacuo.
The substance obtained, which weighs about 50 g, is a white or ivory-white dust of purified ateroid.
Method II
Ateroid can also be purified by treatment with phenol, for example as described below.
Crude ateroid obtained as described above is suspended in 90% phenol (5 / o w / v), shaken for 48 hours and centrifuged. Two fractions are separated, namely a phenol-insoluble and a phenol-soluble fraction. The phenol-insoluble fraction is washed with 5 parts by volume of alcohol and ground in a mortar. The phenol-insoluble fraction is then washed with ether, an ivory-white powder being obtained. The powder is then dissolved in water (1:10 parts by volume), dialyzed for 36 hours, precipitated with alcohol (3 vol. 95 O / n), centrifuged and dried with ether. The product is purified ateroid with 60-70% pure substance.
The phenol-soluble fraction is treated with 50% alcohol at 900 C, centrifuged or bottled, waxed with alcohol and ether and dried. Another amount of purified ateroid is obtained.
The ateroid isolated from the duodenum of several animal species can be further characterized by the subsequent reactions in comparison with heparin and similar substances.
Metachromatic reaction
The spectrophotometric properties of heparin, ateroid and condroitin sulfuric acid (hereinafter referred to as C. S. A.), with toluidine blue (T. B.) when using aqueous solutions in a 1 cm quartz cell are shown in FIG. 1 on the accompanying drawing. A Beckmann Spectrophotometer DU was used here.
In the drawing, the various curves have the following meanings (T. B. 200 u heparin
C.S.A. .....
Ateroid
As can be seen, the transmission curves of C.S.A. and ateroid are similar to one another but markedly different from that of heparin.
The critical mycell point, i.e. the point at which the substance is saturated with a standard dose of toluidine blue, is in each case
Heparin Ateroid C. S. A.
0.400 0.455 0.450
The critical mycellular point is expressed as the weight ratio between the amount of substance and the amount of T. B.
The photodensitometric readings of the metachromatic tapes obtained on electrophoretic sections with equal amounts of substance show areas that are comparable to one another.
If one starts from the heparin value, which is expressed in meta-chromatic units in g / mg = 1000, the following values are obtained:
Heparin Ateroid C. S. A.
1000 424 250
Electrophoresis
Electrophoretic tests on paper at pH 8.6 show that the rate of anodic migration of heparin is somewhat greater than that of ateroid. This fact indicates that ateroid has a lower net weight per unit of measure.
For boric acid buffer solution (680 ml boric acid buffer solution, 12.404 g boric acid + 100 ml N NaOH with water up to 1000 mls), to which 320 ml 0.1 NHC1 are added, the migration speed U of the ateroid is added at pH = 8.6 and heparins are calculated using the following formula: d tF where d denotes the distance in cm from the starting line,
F is the ratio between the potential difference in
Volts and the length of the section in cm, t the travel time in seconds.
Values found: heparin: U = -6.67 # 10-5
Ateroid:: U = -4, 44-10-5
When referring to plasma proteins, heparin migrates faster than albumin, while ateroid has a migration speed between that of alpha1- and alpha2-globulin.
Hexuronic acid content
Ateroid gives a positive reaction with carbazole, which indicates the presence of hexuronic acid in the molecule (Dische, Z., J. Biol. Chem. 167, 189 [1947]).
This reaction was carried out using electropherogram eluates on paper from a standard ateroid preparation. The following values in g / mg were obtained:
Heparin Ateroid C. S. A.
310-335 318-382 297
Hexosamine
The determination of hexosamine by the Elson and Morgan method, using electropherogram eluates, gave the following values in u g / mg:
Heparin Ateroid C, S.A.
320 243 160 In addition to the data of a physical-chemical nature, such as those of the metachromatic carbazole and hexosamine reaction, biological data were also obtained by always starting from heparin. This biological information also distinguishes Ateroid from other known, very heparin-like substances.
Antilypemic effect
The anti-hypemic effect on various stages of lymphoma was examined with reference to the assumed heparin, namely
0. D. Plasma at 600 ma
Triton W.R. 1339 (p-isooctylpolyoxyethylene phenol) is introduced intravenously in a dose of 200 mg / kg into white rats or 300 g Long-Evans spots, and at the same time the substance is introduced introperitoneally under control at a dose of 100 mg / kg.
After 8 hours, 8-10 ml of acidic blood are removed from the animals by intercardiac puncture.
The optical density at 600 m is determined in the plasma with the Beckmann D. U. spectrophotometer in a 1 cm cell.
The case in O. D. is calculated by the following formula:% = 100- X100
T-C where: 0 indicates the case in percent,
E is the mean value of the amount treated with Triton and ateroid (100 mg / kg),
C is the average value of the control quantity,
T is the average of the amount treated with Triton only.
The results are as follows: Triton Heparin Ateroid
Controls 200 mg / kg 100 mg / kg 100 mg / kg O.D. 600 m, 0.163 0.546 0.262 0.172 O.D. O / o 100.000 335.000 161.000 106.000 / o Case related to control 0.000 0.000 74.200 97.600
Total lypemia
Lypemia was determined by the modified Bloor method. The lypemic case was calculated using the above formula.
The values of total lypemia expressed in mg / 100 ml plasma for doses of 100 mg are as follows:
Controls Triton Heparin Ateroid Total Lipid, mg / 100 ml 460 1900 800 655 o / o Total Lipid 100 413 174 142 / o Lipid case with reference to control - 0 76.4 86.4 Anticholesterol effect
The ateroid introduced into the peritoneum of white rats under the conditions described above caused, in addition to the lipid drop, a significant reduction in total and esterified cholesterol, which was determined using the Liebermann and Bouchard method.
The calculation of the fall percentage is done as for the lipids with the help of the above formula.
A significant change in both free and esterified cholesterol levels was observed:
Triton Heparin Ateroid Control 200 mg / kg 100 mglkg 100 mg / kg Total Cholesterol, mg / 100 ml 45 150 91 74 Total Cholesterol, O / o 100 333 202 164 Total Cholesterol Case related to control - 0 56.2 72.4 Esterified Cholesterol mg / 100 ml 32 105 58 61 o / o Esterified cholesterol 100 328 181 191 Esterified cholesterol Case in relation to control - 0 64.4 60.2 Free cholesterol, mg / 100 ml 13 45 33 13 O / o Free cholesterol 100 346 254 100 Free Cholesterol Case Relative to Control - 0 37.5 100
Clarifying effect
A proof,
which is considered essential for the representation of the biological effect of a particular composition, which is attributed to the clarification effect, is the clarification brought about in animal plasma which has been treated under control with the substance in a suitable substrate, in comparison with the plasma of control animals .
Since the clearing process is the result of the activation of aqueous lipases and, more precisely, the result of the activation of triglyceridases by the action of heparin, the determination of lypasemia is a measure of the heparin-like effect of such a substance.
We therefore carried out the following two experiments: the first with intravenous introduction and the second with gastric introduction using an ampoule at a dose of 10 mg / rat.
Fed white rats weighing 200 g were used.
Ediol in a dilution of 0.25%, 1 ml, to which 2 ml of plasma was added, was used as the basis.
The data obtained are shown below: Intravenous introduction 10 mg / rat (blood drawn 10 minutes after introduction):
Controls heparin ateroid time
O.D. m% O.D. % O.D. %
30 "565 100 605 100 555 100
15 '570 101 280 46 168 30
30 '560 99 192 32 115 21
45 '560 99 170 28 102 18
60 '560 99 160 26 95 17
Oral introduction 10 mg / rat (blood drawn 30 minutes after introduction):
Controls heparin ateroid
O.D.m% OD. % O. D.%
30 "600 100 597 100 597 100
60 '600 100 560 94 430 72
120 '580 97 520 87 308 52
240 '530 88 465 78 182 31
In contrast to heparin, orally introduced ateroid has a clearing effect.
Effect on plasma lipoproteins
In addition to a conspicuous lypemic and cholesterol effect, a normalization process in the case of lipoprotidemic was also determined, both in terms of quantity and quality.
In addition to a substantial reduction in total lipoproteins, there is an increase in the electrophoretic speed of the beta globulin and a normalizing change in the alpha / beta globulin ratio.
The electrophoretic movements are followed on paper, with the addition of fixed amounts of plasma from the animals treated as described above and subsequent testing of the samples for lipoproteins.
Anticoagulant effect
The anticoagulant effect was determined as usual by tests with heparin on rabbits weighing 2 kg.
The ateroid dose was 12 mg / kg, while the heparin dose was 5-10-20 mg / kg. The prothrombin time was determined from the moment of introduction. The values given below indicate the prothrombin start time as a percentage, before the introduction of the preparation.
Heparin Heparin Heparin Ateroid Time Controls
5 mg / kg 10 mg / kg 20 mg / kg 12 mg / kg
0 100 100 100 100 100
30 '102 135 203 300 150
60 '102 130 181 280 141
120 '98 122 152 200 115
240 '101 81 111 156 102
It can thus be seen that 12 mg of ateroid have the same anticoagulant effect as 5-6 mg of heparin.