BRPI1106311A2 - uso de peptídeos miméticos de mycobacterium leprae para diagnóstico e vacinas - Google Patents

Abstract

uso de peptídeos miméticos de mycobacterium leprae para diagnóstico e vacinas. a presente invenção relata a identificação de mimotopos de antígenos de mycobacterium leprae. os mimotopos compreendem peptídeos que apresentam utilidade em método e kit de diagnóstico. os métodos de diagnóstico são baseados na interação de tais peptídeos com componentes de amostras biológicas e posterior detecção da resultante interação. o kit de diagnóstico compreende o uso de peptídeos e reagentes de detecção da reação entre peptídeos e componentes da amostras biológicas. a invenção também se refere a composições imunológicas que contenham peptídeos como princípio ativo.

Description

“USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mycobacterium leprae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS" Campo da Invenção A presente invenção trata da obtenção de novos antígenos para uso em diagnóstico, prognóstico (método e kit de diagnóstico) e em vacinas (composições imunológicas) como medida de controle da hanseníase a partir de peptídeos miméticos de Mycobacterium leprae utilizados isoladamente e/ou em associações.

Histórico da Invenção A hanseníase é uma doença infecciosa granulomatosa crônica, causada pelo Mycobacterium leprae, que acomete principalmente a pele e os nervos periféricos (Britton W. J., Lockwood D. N. J. Lancet, 363: 1209-1219, 2004). Em 2009 foram detectados 244.796 novos casos de hanseníase no mundo, números que se mantêm constantes durante os últimos anos (WHO. Wkly Epidemiol. Rec., 85: 337348, 2010), o que indica que a doença ainda permanecerá como um problema de saúde pública em muitos países. A hanseníase apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas. Dois sistemas são usados para a classificação da doença. O sistema de Ridley e Jopling é estabelecido fundamentalmente pelo exame histopatológico das biópsias de pele de paciente em associação com aspectos clínicos e bacteriológicos. De acordo com a classificação, nos extremos do espectro se encontram as formas chamadas hanseníase tuberculóide (TT) e a hanseníase lepromatosa (LL) e entre essas formas estão as formas clínicas borderline borderline (BB), borderline tuberculóide (BT) e borderline lepromatosa (BL). Para fins de tratamento, os pacientes são agrupados em paudibacilares (TT e BT) e multibacilares (BB, BL e LL) (Walker S., Lockwood D. N. J. Clin. DermatoL, 25:165-172, 2007). As diferentes formas clínicas da doença são determinadas pela resposta imunológica do indivíduo ao M. leprae Os pacientes com a hanseníase tuberculóide apresentam uma imunidade celular vigorosa ao bacilo, a qual limita a doença e é caracterizada pela presença de poucos bacilos nas lesões e baixos títulos de anticorpos circulantes. No outro pólo, a hanseníase lepromatosa é caracterizada pela ausência de resposta celular específica, havendo proliferação descontrolada de bacilos e altos títulos de anticorpos. As formas borderline caracterizam-se por uma progressiva redução da forma BT para BL na resposta celular associada ao aumento da carga bacilar e dos níveis de anticorpos (Britton W. J., Lockwood D. N. J. Lancet, 363: 1209-1219, 2004). .

Atualmente, o diagnóstico da hanseníase é baseado em sinais e sintomas clínicos acompanhados, ocasionalmente, por exame baciloscópico. Estudiosos do assunto defendem que, além da bacíloscopia, outros testes diagnósticos como a histopatologia, PCR e ensaios imunológicos (baseados, na resposta humoral e celular) deveríam ser empregados concomitantemente ao exame clínico (Aseffa A. et ai. Lepr. Rev., 76: 147-159, 2005). A avaliação da resposta imune celular do indivíduo ao M. leprae é realizada através do teste de Mitsuda (Godal T. Prog. Allergy, 25: 211-242, 1978). O teste consiste na aplicação intradérmica da mitsudina, também chamada de lepromina, na face anterior do antebraço (Tomimori-Yamashita J. et ai. An. Bras. Dermatol., 71: 343-349, 1996). A reação de Mitsuda positiva está associada à forma tuberculóide (resistência ao M. leprae), e a reação negativa à forma lepromatosa da doença (susceptibilidade ao M. leprae) (Opromolla D. V. A. Classificação. In: Opromolla D. V. A. Noções de hansenologia. Baurè: Centro de Estudos Dr. Reynaldo Quagliato, 2000. p. 47-50). A mitsudina é uma suspensão de bacilos inativados obtidos de pacientes que se encontram na forma clínica lepromatosa ou de tatus (Dasypus novemcinctus) infectados experimentalmente (Beiguelman B. C/en. Saúde Colet., 7: 117-128, 2002), uma vez que o At. leprae não é cultivável in vitro (Scollar D. M. et al. Clln. Microbiol. Rev., 19: 338-381, 2006). A mitsudina não é utilizada como diagnóstico, pois contêm muitos determinantes antigênicos comuns a outras espécies de micobactérias, o que resulta em inespecificidade (Geluk A. et al. Infect. Immun., 70: 2544-2548, 2000) e em resultados falso-positivos em indivíduos saudáveis (Brahmbhatt S. et al. Clin. Exp. Immunol., 128: 140148,2002). O único teste para o diagnóstico imunológico disponível no momento é baseado na detecção de anticorpos anti-PGL-l (glicolipídio fenólico I) através de ELISA, teste dipstick ou teste de fluxo lateral (ML Flow Test) (Oskam L., Slim E., Bührer-Sékula S. Lepr. Rev., 74: 196-205, 2003; Aseffa A. et al. Lepr. Rev., 76: 147-159, 2005). O ensaio pode detectar anticorpos na maioria dos pacientes multibacilares, mas tem valor limitado na identificação de pacientes paucibacilares e seus contatos (Geluk A. et al. Infect. Immun.,73: 5636-5644, 2005).

Portanto, o desenvolvimento de insumos que permitam o diagnóstico precoce da hanseníase é extremamente desejado, pois pacientes diagnosticados e tratados tardiamente podem apresentar incapacidades físicas e deformidades que podem levar a diminuição da capacidade de trabalho, limitação da vida social e problemas psicológicos; além disso, o diagnóstico precoce interrompe a transmissão, fazendo com que seja possível a eliminação da doença.

Estado da Arte Várias estratégias têm sido utilizadas na identificação de antíçfenos para uso no diagnóstico da hanseníase. Inicialmente, através do uso de soro de pacientes hansenianos ou anticorpos monoclonais produzidos contra proteínas de frações subcelulares foi possível identificar antígenos em M. íeprae (Gillis T. P., Buchanan T. M. Infect. Immun., 37: 172-178, 1982; Britton W. J. et al. J. Immunol., 135: 4171-4177, 1985). Com o surgimento da biologia molecular, Young et al. (1985) construíram uma biblioteca de DNA recombinante e com o emprego de anticorpos monoclonais foram isolados genes codificantes de antígenos em M. leprae (Young R. A. et ai. Nature, 316: 450-452, 1985).

Estudos subsequentes, como os citados abaixo, identificaram antígenos em M. leprae quanto à suas propriedades bioquímicas e/ou imunológicas. As proteínas foram estudas como moléculas totais ou na forma de peptídeos compreendendo parte das proteínas totais.

Mckenzie et al. (1991) demonstraram uma proteína de 70KDa, obtida pela tecnologia do DNA recombinante, que foi capaz de induzir resposta humoral e celular em indivíduos expostos a micobactérias (McKenzie K.R.efa/. J. Immunol., 147:312-319, 1991).

Estrada et al. (1992) sintetizaram peptídeos correspondentes a segmentos das proteínas 65kDa, 28kDa, 28kDa superóxido dismutase e 18kDa de M. leprae e avaliaram a habilidade dos mesmos em induzir resposta celular em animais. Entre os peptídeos testados, alguns foram capazes de induzir repostas específicas de hipersensibilidade do tipo tardio (Estrada I. C. et al. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis., 60: 18-27, 1992).

Rivoire et al. (1994) através da tecnologia do DNA recombinante e métodos bioquímicos identificaram uma proteína de lOKDa em M. leprae (Rivoire B. et al. Infect. Immun., 62: 2417-2425, 1994.) Chua-lntra et al. (1998) caracterizaram uma sequência pepldica do antígeno de lOKDa de M. leprae como um determinante estimulatório de células T em pacientes com hanseníase tuberculóide o que tornou o peptídeo um reagente interessante de teste cutâneo ou teste sanguíneo para hanseníase tuberculóide (Chua-lntra B. et oi. Infect. Immun., 66: 4903-4909), Wilkinson ei ai. (1999) avaliaram a resposta celular e humoral de quatro proteínas recombinantes, lOkDa, 28kDa, 36kDa e 65kDa. O antígeno de lOKDa estimulou uma resposta predominantemente celular, o antígeno de 65KDa foi o melhor indutor de resposta celular em pacientes tuberculóides, o antígeno 36kDa estimulou uma resposta humoral de título alto em pacientes lepromatosos e o antígeno de 28kDa foi um estimulador moderado de resposta de celular e humoral (Wilkinson K. A. et ai. J. infect. Dis., 179:1034-1037).

Macfarlane et ai. (2001) compararam a resposta celular induzida por diferentes proteínas recombinantes em pacientes e controles. Os dados mostram que a proteína 45KDa é um potente antígeno de célula T em pacientes com hanseníase e contatos, o que sugere seu uso como reagente de diagnóstico (Macfarlane A. et ai. Clin. Diagn. Lab. immunol., 8: 604-611,2001).

Spencer et ai. (2002) sintetizaram peptídeos sobrepostos abrangendo a proteína ESAT-6 de M. leprae e dois peptídeos de ESAT-ó de M. tuberculosis. Anticorpos policlonais e monoclonais anti-ESAT-ó de M. leprae permitiram a identificação de epítopos de células B e T (Spencer J. S. et. ai. Infect. immun., 70: 1010-1013, 2002).

Brahmbhatt et ai. (2002) estudaram a resposta celular a um conjunto de peptídeos sobrepostos do antígeno de 45KDa de M. leprae em pacientes e controles. Alguns peptídeos foram reconhecidos por pacientes com hanseníase tuberculóide, porém também foram reconhecidos por pacientes com tuberculose (Brahmbhatt S. et ai. Clin. Exp. Immunol., 128: 140-148, 2002).

Geluk et aí. (2004) tentaram identificar peptídeos da proteína CFP-10 que deveríam ser somente reconhecidos por células T específicas a M. leprae uma vez que a proteína total fornece reações cruzadas. Nenhum dos peptídeos foi reconhecido somente por pacientes hansenianos (Geluk A. et ai, Scand J. Immunol., 59: 66-70, 2004).

Hussain et aí. (2004) avaliaram a resposta de células T e B a um conjunto de peptídeos sobrepostos da proteína GroES de M. leprae e os resultados mostraram que peptídeos indutores de resposta humoral são diferentes daqueles que induzem resposta celular. Também foi observado que as respostas foram direcionadas a epítopos compartilhados entre M. leprae e M. tuberculosis (Hussain R. et al., Immunology, 111:462-471,2004).

Spencer et al. (2004) produziram proteínas CFP-10 recombinantes de M. leprae e M. tuberculosis e seus peptídeos sobrepostos a fim de identificar antígenos específicos para a hanseníase. Peptídeos que diferenciam ambas infecções foram caracterizados (Spencer J. S. efal. Infect. Immun., 72: 3161-3170, 2004).

Com o sequenciamento do genoma de M. leprae como também de outras espécies de micobactérias, estudos recentes, como citados abaixo, utilizam essa informação para a identificação de novos antígenos para uso em diagnóstico.

Geluk et al. (2005) selecionaram vários antígenos candidatos em M. leprae que não possuem homo.logia em M. tuberculosis e outras micobactérias por análise de genômica comparativa. Proteínas potenciais foram produzidas pela tecnologia do DNA recombinante e avaliadas quanto sua habilidade de estimular célufc T em pacientes e controles. A maioria dos pacientes multibacilares não respondeu aos antígenos testados. Pacientes paucibacilares e multibacilares reacionais foram altamente responsivos a várias proteínas (Geluk A. et al. Infecf. Immun., 73: 5636-5644, 2005).

Spencer et al. (2005) identificaram genes específicos ao M. leprae por análise de genômica comparativa e testaram os mesmos na forma de proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos quanto à capacidade de estimular células T em pacientes e controles. Peptídeos se mostraram úteis no desenvolvimento de teste de diagnóstico (Spencer J. S. et al. J. Immunol., 175: 7930-7938, 2005; Fundação Oswaldo Cruz (Rio De Janeiro, RJ). Pessolani, M. C. V. et al. BR n. PI0605850-7 A2, 2006).

Aráoz et al. (2006) usaram a genômica comparativa para a identificação de antígenos potenciais restritos ao M. leprae. As proteínas recombinantes foram avaliadas quanto sua capacidade de reconhecimento frente a soro de pacientes e estimular células T. Duas proteínas (ML0308 e ML2498) foram capazes de induzir resposta celular e humoral, com consequente possibilidade de uso em diagnóstico (Aráoz R. et al. Infect. Immun., 74: 175-182, 2006), Reece et al. (2006) empregaram um método de serological expression clonning com um pool de soros de pacientes lepromatosos para a identificação de proteínas. Duas proteínas recombinantes (ML 0405 e ML 2331) apresentaram possibilidade de uso no diagnóstico sorológico de pacientes hansenianos multibacilares (Reece S. T. et al. Clin. Vaccine Immunol., 13: 333-340).

Aráoz et al. (2006) identificaram por estudos de genômica comparativa proteínas restritas ao M. leprae e as testaram como proteínas recombinantes. Resposta humoral e celular foi avaliada em pacientes e controles de duas distintas regiões. Nenhum dos antígenos induliu a mesma reposta nas populações estudadas, o que provavelmente reflete a heterogênea resposta imune relacionada as características genéticas de cada indivíduo. O peptídeo derivado de uma das proteínas não induziu resposta imune celular em animais sensibilizados com micobactérias ambientais, mostrando a especificidade da resposta imune ao peptídeo (Araóz R. ef al. Microbes Infect., 8: 2270-2276, 2006).

Groathouse et al. (2006) avaliaram padrões de resposta imune humoral de soro de pacientes com microarranjo de proteínas para definir perfis de proteínas que refletem as formas da doença. Os arrays foram construídos com proteínas isoladas de parede celular, de membrana e proteínas recombinante-s, que são únicas ou possuem seletividade ao M. leprae conforme análises de bioinformática comparativa. Os resultados indicaram que a triagem de soros de pacientes em microarranjo de proteínas pode discernir antígenos e padrões que são específicos a classificação da doença (Groathouse N. A. et al. Infect. Immun., 74: 6458-6466, 2006).

Duthie et al. (2007) avaliaram proteínas recombinantes, selecionadas por screening sorológico de bibliotecas genômicas de M. leprae, e uma proteína de fusão recombinante quanto à capacidade de detectar infecção por teste sorológico em pacientes de diferentes regiões. Foram observadas diferenças nas respostas em pacientes das diferentes regiões. A proteína de fusão permitiu o diagnóstico antes do aparecimento de sinais clínicos (Duthie M. S. et al. Clin. Vaccine Immunol., 14: 1400-1408, 2007).

Geluk ef al. (2008) identificaram peptídeos sintéticos compreendendo sequências de cinco proteínas de M. leprae, que foram previamente selecionadas por análise de genômica comparativa, e avaliaram os mesmos quanto a capacidade de induzir respdsta celular em pacientes e controles. A combinação de quatro peptídeos permitiu a detecção da doença em pacientes paucibacilares (Geluk A. et al., Clin Vaccine Immunol., 15: 522-533, 2008).

Geluk et aI. (2009) avaliaram antígenos, como proteínas recombinantes e peptídeos, anteriormente identificados, quanto sua capacidade de induzir resposta celular em pacientes e controles provenientes de diferentes regiões. Respostas de célula T específicas foram observadas entre os peptídeos estudados (Geluk A. et ai, Clin. Vaccine Immunol., 16: 352-359, 2009).

Duthie et al. (2010) analisaram peptídeos sintéticos derivados de proteínas de M. leprae, praviamente identificadas, quanfo à presença de sítios de ligação a anticorpos por ELISA. Uma proteína de fusão recombinanfe contendo os sítios ligantes de anticorpos foi construída. Anticorpos de soros de pacientes multibacilares reconheceram o novo antígeno, demonstrando sua utilidade em diagnóstico (Duthie M. S. et al. Clin Vaccine Immunol., 17:298-303, 2010).

Como mencionado, consideráveis esforços tem sido feitos para a identificação de antígenos para o diagnóstico da hanseníase. E a maior dificuldade que se apresenta na obtenção desses antígenos reside na busca da especificidade, ou seja, em se evitar reações cruzadas com antígenos de outras espécies de micobactérias.

Entre as medidas de controle está a vacinação com M. bovis BCG, uma vacina que confere proteção contra hanseníase e tuberculose. A vacinação BCG na hanseníase tem mostrado eficácia, porém o grau de proteção varia entre os estudos. Vacinas bacterianas vivas mostram algum grau de proteção, mas seu uso é limitado no que tange a segurança e produção. O uso de M. leprae ou de seus antígenos, os quais conferem proteção em animais, é limitado pela disponibilidade desses reagentes. Alguns antígenos recombinantes mostraram proteção em animais, porém muitos resultados são inconsistentes. Muitos desses antígenos não foram avaliados em pacientes e nem terão seu uso aprovado em humanos devido sua alta homologia com proteínas humanas. Com o sequenciamento do genoma de Λ4. leprae e de outras micobactérias, ferramentas de biologia molecular e de bioinformática têm permitido a identificação de antígeno em M. íeprae que podem ser úteis em vacinação (Raman V. S. et al. Infect. Immun., 77: 5623-5630, 2009).

Portanto, a descoberta de novos antígenos para uso em diagnóstico, prognóstico e em vacinas se faz necessária como medida de controle da hanseníase. .....

Descricão Resumida da Invenção A presente invenção é baseada na identificação de mimotopos específicos de antígenos micobacterianos através da técnica Phoge Display. O termo "mimotopo" se refere a um peptídeo selecionado de bibliotecas randômicas expressas em fagos que mimetiza a estrutura de um epítopo. Enquanto, o termo “antígeno" se refere a qualquer substância que induz uma resposta imune envolvendo células! ou B.

Desta maneira, a invenção fornece sequências de aminoácidos na forma de peptídeos que podem ser empregadas em diferentes apresentações como em método e kit de diagnóstico ou em composições imunológicas. A invenção fornece um método de diagnóstico para doenças infecciosas relacionadas à micobactérias, esse método compreende os seguintes passos: a) Coleta da amostra; b) Colocar a amostra, após processamento, em contato i com pelo menos um dos peptídeos identificados; c) Detecção da ligação entre peptídeos e componentes da amostra. A presente invenção também faz vistas ao desenvolvimento de kit de diagnóstico para doenças infecciosas causadas por micobactérias. Esse kit de diagnóstico compreende pelo menos um dos peptídeos identificados e reagentes de detecção da reação entre antígeno e componentes da amostra obtida de indivíduos. A presente invenção também se refere a composições imunológicas que tenham como princípio ativo pelo menos um dos peptídeos identificados associado a um ou mais veículos fisiologícamente aceitáveis ou adjuvantes.

Cttacão das Flauras As figuras em anexo servirão para proporcionar um melhor entendimento do processo de identificação de peptídeos derivados de bibliotecas de peptídeos apresentados em fagos e seus usos. Deve-se ressaltar que o processo não é limitado a espécie M. leprae, mas é estendido as demais espécies de micobactérias, incluindo /vi. tuberculosis. A Fiaura 1 ilustra a reatividade das imunoglobulinas antígeno-específicas por ELISA. Uma placa de ELISA foi sensibilizada com 10 μρ/ιτιί de antígeno (Ai. leprae - A e B ou M. tuberculosis - C) e incubada com imunoglobulinas partindo-se de 25 μρ/mL para a total (barras escuras) e 5 pg/mL para a antígeno-específica (barras claras). A detecção da reação foi realizada com anticorpo anti-lgG humana Fc-específica conjugado à peroxidase e OPD como cromógeno. A Fiaura 2 ilustra a reatividade de clones de fagos por ELIS/Ί frente a amostras de soro de pacientes hansenianos paucibacilares e multibacilares, pacientes tuberculosos, contatos de pacientes hansenianos e indivíduos sadios. Os clones avaliados foram previamente selecionados e mostraram capacidade de ligação a anticorpos de pacientes hansenianos. Em A, clone IA, em B, clone 2A, em C, clone 3A, em D, clone 4A, em E, clone 5A, em F, clone 6A e em G, clone 1B. Placas de ELISA foram sensibilizadas com 50 μί de anticorpo anti-fago (1:800) e incubadas com 2x1010 fagos/mL seguido da adição de soro (1:100). A detecção da reação foi realizada com anticorpo anti-IgG humuna Fc-específica conjugado à peroxidase e OPD como cromógeno. MB, pacientes hansenianos multibacilares; PB, pacientes hansenianos paucibacilares; TB, pacientes tuberculosos; C, contatos; S, indivíduos sadios. Linha pontilhada representa o valor de cut-off (média da DO492 das amostras de indivíduos sadios mais duas vezes o desvio padrão, contudo a aceitação de cada amostra no grupo de sadios foi avaliada pelo z-score). Os pontos no gráfico representam os indivíduos. A Fiaura 3 ilustra a reatividade de peptídeos identificados como soro de pacientes hansenianos paucibacilares, pacientes hansenianos multibacilares, pacientes tuberculosos e indivíduos sadios. Placas de ELISA foram sensibilizadas com 100 μί de pool peptídeos a 1,5 μρ/mL e incubadas com soro (1:50). A detecção da reação foi realizada com anicorpo anti-lgG humana Fc-específica-biotina e estreptavidina conjugada à peroxidase e OPD como cromógeno. PB, pacientes hansenianos paucibacilares; MB, pacientes hansenianos multibacilares; TB, pacientes tuberculosos; C, contatos; S, indivíduos sadios. Linha pontilhada representa o valor de cuf-off (média da DO492 das amostras de indivíduos sadios mais três vezes o desvio padrão). Os pontos no gráfico representam os indivíduos. A Fiaura 4 ilustra a reatividade de antígenos micdbacterianos (antígeno bruto) frente aos soros hiperimunes produzidos em coelhos por ELISA. Placas de ELISA foram sensibilizadas com 50 μΙ. de antígeno bruto a 10 pg/mL e incubadas com soro diluído 1:4000. A detecção da reação foi realizada com anticorpo anti-lgG coelho molécula total conjugado à peroxidase e OPD como cromógeno. A Figura 5 ilustra a reatividade de anticorpos anti-peptídeos com o peptídeo respectivo, peptídeo respectivo conjugado com BSA, peptídeo irrelevante conjugado com BSA (l-BSA), peptídeo irrelevante conjugado com KLH (l-KLH) e soro não-imune. Uma placa de ELISA foi sensibilizada com 100 μΐ de peptídeo a 1,5 μρ/ιτιΐ. A detecção da reação foi realizada com anticorpo anti-lgG de camundongo γ-específica conjugada à peroxidase e OPD como cromógeno. A Fiaura 6 ilustra a reatividade de anticorpos anti-peptídeos com M. leprae por Western Bloffíng. (A) 40 pg de extrato total de M. leprae foram separados por eletroforese e reagidos com soro anti-peptídeo 1B-1: 12000 (linha 1), soro anti-peptídeo 6A-1:9000 (linha 2), soro anti-peptídeo 5A-1:4000 (linha 3) e.soro não-imune-1: 4000 (linha 4). (B) Western Blotting de um gel bidimensional com 200 μg de extrato bruto de M. leprae e reagido com soro anti-peptídeo 1 B-l :4000. Os dois outros soros anti-peptídeos apresentaram o mesmo perfil de reatividade apresentado com o soro anti-peptídeo 1B. A detecção da reação foi realizada com anticorpo anti-lgG de camundongo γ-específiica conjugado à peroxidade e por quimiluminescência. A Fiaura 7 ilustra a identificação de resíduos-chave em peptídeo 5A. Análogos de alanina da sequência 5A foram preparados por Spot Synthesis e avaliados quanto sua reatividade frente a um pool de soro de pacientes hansenianos multibacilares. A ligação de anticorpos de pacientes hansenianos (1:250) aos peptídeos sobre membrana foi detectada por anti-lgG humana Fc-específica conjugada à peroxidase (1:120000). (A) Padrão de reatividade dos peptídeos. O peptídeo 5A está na posição 1, um peptídeo não-relacionado (controle negativo-CN) está na posição 17 e os demais spots correspondem aos análogos de alanina do peptídeo 5A). (B) Intensidade da reatividade dos peptídeos, O resíduo substituído por alanina está indicado para cada análogo. Quando alanina estava presente na posição de geração do análogo, o resíduo de alanina foi substituído por serina, Descricão Detalhada da Invenção A presente invenção é baseada na identificação de mimotopos específicos de antígenos..-, micobacterianos através da técnica Phage Display, uma metodologia de apresentação de peptídeos ou proteínas, incluindo anticorpos, na superfície de fagos filamentosos. Essa técnica permite o estudo de interações proteína-ligante, pode ser usada no mapeamento de epítopos de anticorpos monoclonais e policlonais, como também, na identificação de ligantes para receptores e na seleção de substratos para enzimas (Azzazy H. M„ Highsmith W.E Jr„ Clin. Biochem., 35: 425-445, 2002). A técnica de Phage Display se apresenta com uma alternativa de identificação de antígenos micobacterianos seja para uso em diagnóstico, na imunoterapia, em vacinas, ou em imunizações, uma vez que os métodos até então utilizados, como descritos no estado da arte, esbarram na falta de especificidade e sensibilidade.

Além disso, os métodos utilizados até o momento se basearam no conhecimento prévio de antígenos para a caracterização de novos reagentes de diagnóstico. Uma vantagem da técnica de Phage Display é não requerer a identificação prévia do antígeno natural contra o qual uma resposta imune é dirigida (Azzazy H. M., tlghsmith W.E Jr., Clin. Biochem., 35: 425-445, 2002).

Deste modo, bibliotecas de peptídeos apresentadas em fagos foram rastreadas usando anticorpos e mais especificamente, anticorpos antígeno-específicos.

Dentre os anticorpos encontrados em pacientes hansenianos poucos são específicos para antígenos de M. leprae, No mesmo indivíduo, além dos anticorpos específicos ao M. leproe, são encontrados anticorpos direcionados aos mais variados antígenos, que o indivíduo veio a entrarem contato, incluindo outras micobactérias.

Os anticorpos antígeno-específicos podem ser obtidos não exclusivamente de amostras de indivíduos infectados, mas podem ser obtidos de amostras de animais experimentalmente infectados. O termo “amostra" se refere a uma variedade de tipos de amostra obtidos de indivíduos como, sangue, soro, plasma e outras amostras de origem biológica.

Amostras de sangue de origem humana ou animal podem ser processadas para. separação dos anticorpos por procedimentos já conhecidos do estado da técnica como centrifugação ou além processadas por procedimentos adicionais como precipitação e/ou cromatografia de afinidade para separação de subclasses específicas de imunoglobulinas. Mais além, anticorpos podem ser separados por ligação a uma coluna imobilizada com antígeno ou ainda anticorpos podem ser separados de immunoblots (Harlow E., Lane D. Antibodies: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. 726 p.).

Os anticorpos usados na presente invenção para a seleção de peptídeos de bibliotecas de fagos foram provenientes de um pool de amostras de soro de diferentes indivíduos infectados com M. lepràe. O uso do pool teve o objetivo de abranger uma maior diversidade de anticorpos. Os poo/s podem ser formados por amostras de pacientes apresentando diferentes formas clínicas como exemplificado nesta invenção, ou seja, pool de pacientes multibacilares e pool de pacientes paucibacilares. O pool de pacientes multibacilares compreende pacientes apresentando as formas clínicas borderline-borderline, border/íne-lepromatosa e hanseníase lepromatosa), enquanto o pool de pacientes paucibacilares compreende pacientes apresentando as formas clínicas hanseníase tuberculóide e borderline-tuberculóide. Porém, os pools também podem constituir pools forma-específica, ou seja, formado por amostras de pacientes apresentando uma determinada forma clínica. ...

Anticorpos antígeno-específicos denotam, na presente invenção, anticorpos obtidos de soro de pacientes que foram submetidos à precipitação com sulfato de amônio com subsequente purificação por cromatografia de afinidade em proteína-G e além purificados frente a antígenos de M. leprae após Immunoblottlng (Fig. I), Porém, a obtenção de anticorpos antígeno-específicos não está limitada a esse exemplo, mas pode , envolver o uso de um ou a combinação de dois ou mais procedimentos conhecidos do estado da técnica. Como também, os anticorpos obtidos não são limitados à classe IgG, mas podem compreender as demais classes e suas sublclasses. O emprego de tais anticorpos antígeno-específicos para seleção de pepfídeos em bibliotecas de fagos possibilita maior oportunidade de encontrar peptídeos miméticos (mimotopos) de antígenos micobacterianos.

Bibliotecas de fagos foram rastreadas usando anticorpos antígeno-específicos de M. leprae como também as mesmas bibliotecas foram rastreadas usando anticorpos antígeno-específicos de M. tuberculosis. Nesse último caso, os fagos não ligados aos anticorpos de pacientes com tuberculose foram subsequentemente usados com os anticorpos antígeno-específicos de M. leprae, a fim de prevenir a seleção de mimotopos inespecíficos.

Através da tecnologia Phage Display clones de fagos/peptfdeos foram selecionados por reconhecer anticorpos de pacientes hansenianos.

Os peptídeos identificados compreendem mimotopos ou também chamados mimotipos, pois não são epítopos naturais, mas são epítopos que mimetizam parte do epítopo natural. O mimetismo se deve a similaridade na sequência ou a similaridade em propriedades físico-químicas e na organização especial (Moreau V. et a/., Bioinformatics, 22: 1088-1095, 2006).

Dentre os objetivos da presente invenção foi avaliar se os peptídeos identificados, que foram, por sua vez, selecionados de bibliotecas de peptídeos expressa em fagos, possuíam a capacidade de reagir com anticorpos do soro de pacientes com hanseníase. A capacidade dos peptídeos de reagir com anticorpos de pacientes hansenianos foi demonstrada na presente invenção. A análise compreende a incubação da amostra, preferencialmente soro, proveniente de indivíduos com hanseníase na presença de um ou mais peptídeos. A ligação do anticorpo da amostra com o(s) peptídeo(s) é então detectada. Subentende-se que além do soro, outras amostras de origem biológica que contenham anticorpos podem ser empregadas na análise. .

Os peptídeos podem ser empregados individualmente ou combinados. O termo “combinados" se refere a uma composição formada por duas ou mais sequências listadas na tabela 1. Portanto, uma^ composição poderia ser constituída da sequência No. 1 e sequência No. 3 e outra composição poderia ser constituída pelas sequências No. 5, sequência No. 6 e sequência No. 7. O termo "combinados” também se refere a polímero de peptídeos, que por sua vez, trata-se de um peptídeo mais longo formado pela repetição de uma sequência peptídica podendo ou não ser separada por espaçadores ou línkers. Quando presentes os espaçadores ou linkers podem estar localizados entre algumas sequências ou entre todas as sequências de peptídeos. O polímero pode ser constituído de qualquer sequência peptídica e ainda o polímero pode compreender diferentes combinações de sequência de peptídeos. Portanto, um polímero pode ser formado por uma ou mais repetições-da primeira sequência, seguido por uma ou mais repetições da segunda sequência de peptídeos.

As sequências de peptídeos que trata a presente inveção podem sofrer modificações originando variantes, desde que essas formas variantes mantenham as características antigênicas e/ou imunogênicas das sequências originais das quais derivaram. O termo anfigênico se refere a capacidade do antígeno de reconhecer o anticorpo ou receptor de célula T, enquanto, o termo imunogênico refere-se a capacidade de induzir uma resposta imune humoral e/ou celular.

As modificações incluem, porém não limitadas a essas, acetilação, amidação, formilação, biotinilação, fosforilação, succinilação, sulfurilação, adição de um ou mais ácidos graxos, adição de um ou mais corantes como AMC (7-amino-4-metil-cumarina), Cy3, Cy5, Dabcyl, Dansyl, DNP (2,4-dinitrofenil), DNP-lisina, EDANS (5-2((2-aminoetil)amino)naftaleno-l-ácido sulfônico), fluoresceína, NBD (7-nitrobenzeno-2-oxa-l,3-diazol), p-nitro-anilina, rodamina B e Tmra, substituição de um ou mais aminoácidos por outro de ocorrência natutal, substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos não naturais ou especiais como, citrulina, ornitina, ε-acetil-lisina, β-alanina, ácido aminobenzóico, ácido ó-aminocapróico, ácido aminobutírico, dimetil-lisina, hidroxiprolina, ácido mercaptopropiônico, metil-lisina, 3-nitro-tirosina, norleucina, ácido piroglutâmico, carbobenzoxil e muitos outros, adição de um ou mais aminoácidos de ocorrência natural, adição de um ou mais aminoácidos não naturais ou especiais, substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos pesados, adição de um ou mais aminoácidos pesados, substituição de um ou mais aminoácidos por D-aminoácidos, adição de um ou mais D-aminoácidos, ciclização, adição de espaçadores ou llnkers, adição de uma ou mais pontes dissulfeto, adição de polietilenoglicol (PEG), marcação com isótopos radioativos, substituição de um ou mais aminoácidos por N-metil aminoácidos, adição de um ou mais N-metil aminoácidos e deleção de um ou mais aminoácidos.

Outra modificação é a conjugação dos peptídeos a proteínas carreadores como albumina soro bovina (BSA), ovaibumina, KLH (keyhole limpei hemocyanin),. toxóide difitérico, toxóide tetãnico, etc. Vários métodos são disponíveis para a conjugação de peptídeos a proteína como, por exemplo, conjugação via EDC, conjugação via MBS e conjugação via glutaraldeído.

Outra modificação que podem ser encontrada em peptídeos é a formação de MAPs (Mu/tip/e Antigen Peptides), que se caracterizam por utilizar a e β-amino grupos de lisina para formar um esqueleto ao qual múltiplas cadeias de peptídeos podem ser fixadas. Os MAPs são uma alternativa a conjugação de antígenos a proteínas carreadoras.

Ressalta-se que quando as sequências peptídicas são usadas individualmente ou combinadas refere-se ao emprego tanto das sequências originais como das sequências variantes.

Os peptídeos (sequências originais ou variantes) podem ser produzidos pela tecnologia do DNA recombinante ou por síntese química e ambos os métodos são conhecidos do estado da técnica.

Um objetivo da presente invenção é fornecer um método de diagnóstico de infecção por ΛΊ. leprae. Para tanto, pelo menos um dos peptídeos (isolado ou combinado) é imobilizado em um suporte sólido e após colocar em contato a amostra contendo anticorpos obtida de indivíduos com o(s) peptídeo(s) a ligação entre anticorpo e peptídeo(s) é detectada. O antígeno, que corresponde a pelo menos um dos peptídeos, é colocado em contato com um suporte sólido para que possa se ligar e ficar adsorvido a esse suporte. Os suportes sólidos incluem microplacas de 96 poços de poliestireno ou polivinil cloreto (PVC), membranas de nitrocelulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou nylon, esferas de poliestireno ou agarose, vidro, entre outros. O antígeno imobilizado é colocado em contato com a amostra contendo anticorpos para interação. Moléculas que não especificamente interagiram com o antígeno ligado ao suporte sólido são removidas por lavagens com soluções tampão adequadas. Para a detecção da interação entre antígeno e anticorpo um segundo anticorpo (anticorpo secundário) marcado é adicionado. O suporte sólido pode ser novamente lavado para a remoção de anticorpos não ligados. A reação entre antígeno e anticorpo é revelada por um método, que depende da marcação empregada, de modo a produzir um sinal detectável ou mensurável. A intensidade do sinal indica a quantidade de anticorpo na amostra. O anticorpo que reconhece o antígeno é chamado de antidorpo primário. Se esse anticorpo é marcado, a detecção direta do antígeno é possível. Geralmente, o anticorpo secundário é marcado, logo o antígeno é detectado indiretamente. O anticorpo secundário pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal que por sua vez é produzido em animais hospedeiros como, camundongos, coelhos, cabras ou ovelhas, O anticorpo secundário é um anticorpo espécie-específica do anticorpo primário, ou seja, se o anticorpo primário é um anticorpo monoclonal de camundongo, o anticorpo secundário deve ser um anticorpo anti-camundongo produzido em outro animal hospedeiro que não camundongo. Os anticorpos secundários são disponíveis com especificidade para molécula total de anticorpo ou para fragmentos de anticorpo como regiões Fc ou Fab bem como para diferentes classes e subclasses.

As marcações usadas em anticorpos secundários podem ser isótopos radioativos, enzimas ou fluoróforos. Geralmente, marcações com enzimas ou fluoróforos são utilizadas. Enzimas fornecem um sinal detectável através da reação com um substrato específico que gera um produto colorido ou fluorescente ou liberação de luz. As enzimas mais usadas são fosfatase alcalina e peroxidase (HRP). Os fluoróforos mais utilizados para marcação são fluoresceína e rodamina.

Anticorpos secundários também podem ser marcados com biotina. A presença da biotina permite eficiente detecção com avidina ou estreptavidina marcadas com enzimas ou fluoróforos. Sistemas com biotina apresentam a característica de amplificação do sinal, aumentando assim a sensibilidade. Anticorpos secundários também podem ser conjugados com agarose ou ouro coloidal.

Proteínas ligantes de anticorpos como Proteína A, Protáína G, Proteína A/G e Proteína L também podem ser úteis na detecção de anticorpos. A detecção e quantificação de substâncias como peptídeos, proteínas e anticorpos pode ser realizada pela técnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assays) também chamada de EIA (Enzyme Immunoassoy). A técnica de ELISA é realizada em placas de poliestireno ou PVC de 96 ou 384 poços nas quais proteínas, peptídeos ou anticorpos são passivamente ligados. Moléculas pequenas, como peptídeos podem ser imobilizados com maior eficiência a placas através de biotinilação de peptídeos e emprego de placas revestidas com estreptavidina. O formato da técnica pode ser direto, indireto, sanduíche ou de competição. Mais-»comumente, a detecção da reação entre antígeno e anticorpo é feita usando marcações fluorescentes ou enzimáticas. O sinal emitido após a adição dos substratos enzimáticos pode ser colorimétrico, quimiluminescente ou fluorescente. Entre os substratos colorimétricos estão PNPP, ABST, OPD e TMB. A técnica de ELISA também permite a detecção de citocinas como interferon gama (IFN-γ). O IFN-γ é uma citocina produzida principalmente por células T em resposta a antígenos e sua detecção tem mostrado utilidade no diagnóstico da hanseníase (Geluk A. et al., Clin Vaccine Immunol., 15: 522-533, 2008). A análise de IFN-γ é baseado no princípio que células T de indivíduos sensibilizados com antígenos de M. leprae produzem IFN-γ quando reencontram antígenos micobacterianos. Logo, níveis aumentados de IFN-γ é indicativo de infecção. Na análise de IFN-γ, sangue total (diluído ou não diluído) ou células mononucleares do sangue periférico, separadas por gradiente de densidade em Ficoll™, são cultivadas na presença de antígenos, tal como peptídeos e quando presentes, células T sensibilizadas secretam IFN-γΙ O sobrenadante da cultura de células contendo a citocina pode ser então detectado por teste de ELISA sanduíche. A quantificação de IFN-γ também pode ser feita utilizando ELISPOT (Enzyme-Linked Immunospot Assay).

Outras citocinas, além de IFN-γ, podem ser avaliadas frente a antígenos com objetivo de diagnóstico ou prognóstico da hanseníase (Aseffa A. etal. Lepr. Rev., 76: 147-159, 2005).

Portanto, além de amostras contendo anticorpos, sobrenadantes de cultura de células obtidas de indivíduos também podem ser utilizados como amostras.

Além da técnica de ELISA, outras técnicas podem ser utilizadas para a detecção de antígenos micobacterianos ou anticorpos específicos para antígenos micobacterianos. Entre as técnicas estão, Western Blofting/immunoblofting, imunoprecipitação, aglutinação, imunofluorescência, radioimuensaio, Spot Synthesis, microarranjo, dipstick (análise imunocromatográfica), ΜΑΡΙΑ {Multiantigen Prínt Immunoassay).

Em Western Blotting ou também chamado immunoblotting, antígenos, tal como peptídeos, por exemplo na forma de conjugados, polímeros ou MAPs, poderíam ser transferidos a membranas, geralmente, de nitrocelulose ou fluoreto de polivinilideno após eletroforese em gel de poliacrilamida. Após bloqueio da membrana para prevenir ligações não específicas, a membrana é incubada com anticorpos de amostras de indivíduos. Anticorpos anti-M. leprae se presentes na amostra se ligarão ao antígeno fixado na membrana e poderão ser detectados por adição de um anticorpo secundário marcado. Um substrato adequado é então adicionado para produzir um sinal detectável como um precipitado cromogênico, quimiluminescência ou fluorescência. Vários méfodos podem ser utilizádos para a transferência de antígenos para membranas como, difusão simples, transferência a vácuo ou eletrotransferência.

Comumente, α eletrotransferência também chamada de eluição eletroforética é o método mais utilizado e pode ser realizada pelo sistema úmido ou semi-seco. Geralmente, anticorpos secundários são marcados a enzimas ou fluoróforos. O sinal obtido de substratos quimiluminescentes pode ser detectado usando filme de raios-X ou equipamento de imagem digital.

Outras técnicas como imunodifusão e aglutinação poderíam ser empregadas para detecção de antígenos micobacterianos ou anticorpos anti-micobactérias. São técnicas de baixa sensibilidade, mas se apresentam como alternativas para aplicações a campo e em países menos desenvolvidos. A imunodifusão se baseia na precipitação que ocorre quando antígeno e anticorpo de difundem em ágar e o complexo antígeno-anticorpo formado se apresenta sob a forma de linha ou arco de precipitação. Enquanto, a reação de aglutinação se caracteriza pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície. A aglutinação pode ocorrer com partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, betonita, sepharose, etc.) ou com células antigênicas não relacionadas como hemácias as quais se adsorvem ou se fixam antígenos solúveis. A técnica de imunofluorescência é utilizada para pesquisa de anticorpos e antígenos. Na imunofluorescência direta, um anticorpo específico marcado com fluoróforo se liga ao antígeno em células ou tecidos formando um imunocomplexo que é observado em microscópio de fluorescência. A imunofluorescência indireta, antígenos em células ou tecidos são detectados inicialmente, por incubação com antidorpo específico direcionado contra o antígeno que se quer pesquisar seguido da incubação com um anticorpo anti-anticorpo primário marcado com fluoróforos. A imunofluorescência indireta, para a pesquisa de anticorpos, antígenos fixados a lâminas de vidro são incubados com anticorpos de amostras para formação do complexo antígeno-anticorpo. Após, o anticorpo secundário marcado com fluoróforo é adicionado a preparação e se houver anticorpo na amostra ocorrerá a formação da fluorescência. Para amplificação da reação fluoróforos podem ser conjugados a estreptadina. Sendo assim, a biotina marcada com o anticorpo secundário reage com a estreptavidina conjugada a um fluoróforo.

No radioimunoensaio reagentes, como antígeno ou anticorpo, são marcados com radioisótopos para detectar antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra. Um antígeno (ou anticorpo) não marcado é ligado a um suporte sólido, tal como uma superfície plástica ou matrizes particuladas, e a fração do anticorpo (ou antígeno) retido na superfície é então determinada. O ensaio pode ser competitivo ou com excesso de reagente. Vários, radioisótopos podem ser utilizados, entre eles os mais empregados são 125l e ,3,l. Além do sistema de fase sólida outros métodos como imunoprecipitação, separação química e técnicas com adsorventes podem ser utilizadas na separação das frações livre e ligada da substância marcada.

Na técnica de Spot Synthesis, peptídeos são sintetizados em posições definidas (spot) em uma membrana de celulose usando a estratégia química Fmoc/fBu. A membrana de celulose com peptídeos ligados pode ser usada para a detecção de anticorpos micobacterianos em amostras seguindo os mesmos passos já descritos para o Western Blotfing.

Microarranjo de proteínas ou peptídeos é uma outra tecrrblogia que apresenta utilidade na detecção de anticorpos em amostras. Nessa técnica, lâminas de vidro adequadas contendo antígenos são incubadas com amostras contendo anticorpos. Anticorpos específicos ligados ao antígeno são detectados por adição do anticorpo secundário marcado com fluoróforos. O método imunocromatografia também se mostra uma ferramenta na detecção de anticorpos em amostras. Neste teste, a amostra contendo anticorpos é depositada sobre uma tira de membrana de nitrocelulose. Anticorpos na amostra se ligam ao anticorpo de detecção marcado com esferas de látex ou ouro coloidal fixado na membrana. O complexo formado - anticorpos da amostra e anticorpo de detecção - se move até encontrar o antígeno imobilizado na membrana de nitrocelulose e se na amostra houver anticorpos específicos para o antígeno a fita mudará de cor. A análise pode ser qualitativa ou quantitativa e nesse caso o método é combinado a um sistema de detecção capaz de quantificar a reação de ligação. ΜΑΡΙΑ (Multiantigen Prínting Immunoassay) é um outro método de detecção de anticorpos e se baseia na aplicação direta de antígenos por impressão sobre membranas de nitrocelulose seguido por métodos de detecção de anticorpos clássicos, tal como anticorpos conjugado a enzimas e substratos cromogênicos. ΜΑΡΙΑ permite a detecção de anticorpos a vários antígenos em uma única análise.

Além dos métodos de detecção de anticorpos micobacterianos em amostras outros métodos como análise de linfoproliferação também permitem avaliar a exposição a agentes infecciosos. O teste de linfoproliferação avalia, em cultura celular, as respostas de linfócifos em contato com antígenos específicos e mitógenos (geralmente, concanavalina A ou fitohemaglutinina). Culturas de células incluem células mononucleares separadas do sangèe periférico ou culturas de sangue total. A ativação da resposta imune promove a proliferação celular da cultura e essa ativação pode ser identificação pela contagem celular em microscopia, pela incorporação de material radioativo ao DNA (por exemplo, timidina tritiada), pela redução do azul de tetrazólio (MTT), pela incorporação lisossomal de corante vermelho neutro e por citometria de fluxo. A detecção de resposta humoral ou celular frente a antígenos, tal como proteínas e peptídeos, pode ser realizada por diferentes métodos que foram aqui acima apresentados, porém não são limitados a esses. A presente invenção também faz vistas ao desenvolvimento de kit de diagnóstico*, para hanseníase. O kit pode incluir qualquer configuração e composição para realizar os vários métodos de análise descritos aqui. O kit será apresentado em uma forma comercialmente acondicionada contendo os elementos essenciais requeridos para conduzir uma análise de acordo com os métodos expostos. Portanto, o kit compreende um ou mais peptídeos (isolado ou combinados/formas variantes), dispositivos, reagentes e instruções escritas para a realização do ensaio.

Por exemplo, um kit para detectar a presença de anticorpos anti-M. leprae pode conter um ou mais peptídeos para imobilização ou já imobilizados em um suporte sólido e reagentes de detecção da ligação entre anticorpos da amostra e peptídeos como anticorpo anti-lgG humana conjugado a biotina e estreptavidina conjugada à peroxidase. Ou, outro kit podería constituir de um dispositivo constituído de tiras imunocromatográfica impregnadas com peptídeos e anticorpo de detecção e podendo ainda conter pipetas capilar e solução tampão.

Os exemplos abaixo demonstram que peptídeos são capázes de induzir a produção de anticorpos e, além disso, esses anticorpos anti-peptídeos são reconhecidos por antígenos naturais de M. leproe. Além de incitar uma resposta humoral, os peptídeos apresentam potencialidade em induzir uma resposta celular como mostrado no exemplo de estudo de hipersensibilidade do tipo tardio. A reação de hipersensibilidade do tipo tardio (DTH) permite avaliar a exposição prévia do indivíduo ao antígeno bem como avaliar a resposta imune celular de indivíduos frente a um antígeno. Testes de DTH empregando reagentes específicos são extremamente desejados devido a sua simplicidade de execução e leitura permitindo, desde modo, sua aplicação a campo. O teste de DTH consiste na aplicação intradérmica do antígeno, geralmente, na face anterior do antebraço e após 48-72 h faz-se a leitura do tamanho da induração. A quantidade de antígeno aplicada irá depender principalmente da constituição da composição e deverá ser determinada após extensa experimentação.

Composições imunológicas para uso em testes de DTH compreendem um ou mais peptídeos (isolado ou combinados/formas variantes) associado a um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis. Um exemplo de veículos fisiologicamente aceitáveis constitui solução salina acrescida de agentes preservantes como fenol.

Uma vez que peptídeos são capazes de induzir uma reposta humoral e/ou resposta celular, a presente invenção inclui composições imunológicas para uso como vacinas, desde que, vacinas são designadas para aumentar a imunidade e prevenir a infecção em indivíduos. .

Composições imunológicas para uso como vacinas compreendem um ou mais peptídeos (isolados ou combinados/formas variantes), preservativos, veículos fisiologicamente aceitáveis e agentes adicionais como adjuvantes, que podem estimular a resposta imune do indivíduo ao componente imunogênico. Entre exemplos de adjuvantes, encontram-se, adjuvante de Freund completo ou incompleto, hidróxido de alumínio, lipossomas, complexos imunoestimulantes (ISCOMS), etc. A composição da formulação bem como via de imunização e o número de doses a ser administrado para induzir uma efetiva resposta humoral e/ou celular deverão ser determinados experimentalmente.

Exemplo 1: Biosselacão de Bibliotecas Apresentadas em Faqos Pacientes e controles Amostras de sangue foram obtidas de pacientes com hanseníase, portadores de diferentes formas da doença, tratados e não tratados, provenientes do Hospital de Dermatologia Sanitária do Paraná (Piraquara-PR), do Centro Regional de Especialidades-Barão (Curitiba-PR), da Fundação Pró-Hansen (Curitiba-PR) e da Sociedade Filantrópica Humanitas (São Jerônimo da Serra-PR). Foram coletadas amostras de sangue de pacientes com tuberculose pulmonar, tratados e não tratados, atendidos no Centro Regional de Especialidades-Barão (Curitiba-PR) e Hospital Regional .da Lapa São Sebastião (Lapa-PR). Foram também coletadas amostras . de sangue de contatos de pacientes hansenianos e amostras de sangue de indivíduos saudáveis (grupos controle). Todos os indivíduos autorizaram a coleta de sangue por meio do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. O estudo, descrito na presente invenção, foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Paraná como também pelo Comitê de Ética em Pesquisa Conselhos Humanos da Secretária de Estado de Saúde do Paraná. .

Bibliotecas de peptídeos apresentados em fagos Quatro bibliotecas de peptídeos apresentadas em fagos foram utilizadas para identificação de mimotopos de antígenos micdbacterianos. As bibliotecas foram obtidas de J. Scott, Simon Fraser University, Burnaby BC, Canada (Bonnycastle L.L. et ol. J. Mol. Biol., 258: 747-762, 1996). Duas das bibliotecas apresentaram sequências peptídicas lineares (XI5 e X8CX8) enquanto outras duas apresentaram sequências peptídicas flanqueadas por resíduos de cisteína (XCX4CX e XCX8CX) fusionadas a porção N-terminal da proteína pVIII do fago f88.4. Biosseleção As bibliotecas de fagos foram ínicialmente depletadas de fagos reativos a imunoglobulinas de pacientes tuberculosos por incubação dos fagos das bibliotecas com imunoglobulinas anti-M. tuberculosis imobilizadas em imunotubos. Os fagos não ligados foram usados no primeiro ciclo de seleção... com imunoglobulinas anti-AA leprae. Em outra biosseleção, os fagos das bibliotecas foram usados diretamente no primeiro ciclo de seleção com imunoglobulinas anti-AA leprae. A biosseleção foi realizada como descrito (Ferrières G. et al. Eur. J. Biochem., 267: 1819-1829, 2000). Resumidamente, um imunotubo foi revestido com imunoglobulinas anti-AA leprae em 100 mM NaHCCb, pH 8.6 a 5μρ/1,5 mL no primeiro ciclo, Ιμρ/1,5 mL no segundo ciclo e 0,5pg/1,5 mL para o terceiro e quarto ciclos, overnight a 4°C. Para o primeiro ciclo de seleção, fagos de cada uma das bibliotecas, em título correspondente a 100 vezes a complexidade da biblioteca em TBS-0,05% Tween-20 foram incubados com os anticorpos imobilizados. Nos demais ciclos 2x1011 fagos foram utilizados. Fagos não ligados foram removidos por lavagens com TBS-0,5% Tween-20 seguido por lavagens com TBS-0,05% Tween-20. Os fagos ligados foram eluídos por adição de glicina 0,1 M, pH 2.2, BSA 1 mg/ml e imediatamente neutralizados. Os fagos foram amplificados em Esccheríchia coli K91, precipitados do sobrenadante da cultura bacteriana com polietilenoglicol e usados no próximo ciclo de seleção ou armazenados a -20°C.

Seleção de clones de fagos Após o quarto ciclo de seleção, clones de fagos foram isolados e avaliados quanto a capacidade de ligação a imunoglobulinas IgG anti-M. leproe. Para tanto, placas de ELISA foram revestidas com 50 μΐ de anticorpo anti-bacteriófago fd (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) diluído 1:800 em NaHCC>3 100 mM, pH 8.6, overnighf a 4°C. As placas foram lavadas com PBS-0,05% Tween-20 e em seguida bloqueadas com PBS-0,05% Tween 20-leite em pó desnatado 2% por uma hora a 37°C. O sobrenadante (50 μΙ) da cultura de cada um dos clones isolados foi adicionado a um diferente poço da placa e incubado por 2 h a 37°C. A placa foi lavada e incubada com 100 pg/mL de imunoglobulinas IgG total de pacientes hansenianos por uma hora a 37°C. A detecção da reação foi realizada com anticorpo anti-lgG humana Fc-específiica conjugado à peroxidade (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) e OPD (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) como cromógeno. Os clones mais reativos foram selecionados para o sequenciamento do DNA. .

Sequenciamento do DNA O DNA de cada clone de fago foi extraído usando o kit QIAprep Spin M13 (Qiagen, Hilden, Alemanha). As reações de sequenciamento foram realizadas com o kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA) e sequenciador automático ABI PRISM 377 (Applied Biosystems Carlsbad, Califórnia, EUA. O primer 5’-TCG GCA AGC TCT TTT AGG-31 foi usado para anelamento. Avaliação dos clones de fagos com soros de pacientes e controles Os clones de fagos selecionados foram avaliados quanto sua reatividade frente aos soros dos grupos de pacientes e controles por ELISA. Placas de ELISA foram sensibilizadas com 50 μί de anticorpo anti-fago&fd( 1:800) em ΝαΗΟΟβ 100 mM, pH 8.6, overnight a 4°C. As placas foram lavadas com PBS-0,05% Tween-20 e em seguida bloqueadas com PBS-0,05% Tween 20-leite em pó desnatado 2%, Fagos foram adicionados em uma concentração de 2x1010 fagos/mL em solução de bloqueio. Após lavagem, soros humanos dos grupos de pacientes hansenianos, pacientes tuberculosos, contatos de pacientes hansenianos e indivíduos sadios diluídos 1:100 em solução de bloqueio foram adicionados. A detecção da reação foi realizada com anticorpo anti-lgG Fc-específica conjugado à peroxidase e OPD como cromógeno (Fig. 2), Os clones de fagos mais reativos foram selecionados para estudos posteriores. Síntese de peptídeos solúveis Peptídeos solúveis foram sintetizados por PepTron (Daejon, Korea) usando a estratégia química 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc) de fase sólida. Peptídeos foram sintetizados como peptídeos não modificados, como também foram sintetizados com adição da sequência KKG a porção N-terminal a fim de conferir hidrofilicidade. Os peptídeos foram fornecidos liofilizados e com 70% de pureza.

Exemplo 2: Reatividade de Peptídeos Amostras de soro Pacientes e controles Amostras de soro de pacientes hansenianos, pacientes tuberculosos, contatos de pacientes hansenianos e indivíduos sadios foram incluídas no estudo (ver Exemplo 1).

Soro anti-micobactérias Anti-soros de dez espécies de micobactérias (Tabela 2) foram produzidos em animais para avaliar a especificidade dos peptídeos. As micobactérias foram cultivadas em meio Middlebrook 7H9 e Middlebrook 7H10 (Belisle J. T., Sonnenberg M. G. Isolation of genomic DNA%om mycobacteria. In: Parish T., Stoker N. G. Methods in molecular biology: mycobacteria protocols. Totowa: Humana Press, 1998. p. 31-44).

As células foram coletadas por centrifugação a 4500 rpm por 25 min. O pélete foi lavado três vezes com NaCI 0,9%, e ressuspendido em 10 mL de NaCI 0,9%. A suspensão foi inativa a 100°C por 15 min. A suspensão celular, contendo 100 μρ/ιτιί fluoreto de fenilmetanosulfonil (PMSF) e 2 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), foi submetida a sonicação (Sonopuls HD 2200, Bandelin, Berlim, Alemanha) por quatro ciclos de 15 min em banho de gelo (Pessolani M. C., Brennan P. J. Infect. Immun., 60:4452-4459, 1992). A concentração de proteínas do extrato solúvel, obtido por centrifugação a lOOOOxg por 20 minutos a 4°C, foi determinada por fluorescência usando-, o kit Quant-iT™ Protein Assay (Invitrogen™, Carlsbad, Califórnia, EUA). Para a imunização foram usados coelhos fêmeas de 2,5 a 3,0 Kg da raça Nova Zelândia albinos, sendo dois coelhos para cada espécie de micobactéria. Os animais receberam 100-250 μρ de proteína em adjuvante incompleto de Freund por via subcutãnea. Três doses de reforço foram feitas com intervalo de 14 dias. Como controle, dois animais receberam adjuvante incompleto de Freund em NaCI 0,9%. Soro pré-imune foi coletado antes da imunização e o soro imune foi coletado uma semana após a última dose.

Tabela 2: Espécies de micobactérias usadas no estudo ESPÉCIE CÓDIGO M. kansasii ATCC 12478 M. scrofulaceum ATCC 19981 M.avium ATCC 25291 M. fortuitum subsp. fortuitum ATCC 6841 M. szulgai ATCC 35799 M. gordonae ATCC 14470 M. terrae ATCC 15755 M. phlei ATCC 11758 M. smegmatis ATCC 607 M. bovis______________________________BCG-MORAEU____________________________ ELISA com peptídeos e soro humanos ^ Placas de ELISA (Cornig 2592, Lowell, Massachusetts, EUA) foram sensibilizadas com 100 μί de um pool de peptídeo (5A, 6A e 1B) a 1,5 pg/mL em tampão carbonato 0,05 M pH 9.6 overnight a 4°C. Após lavagem (NaCI 0,9%-Tween-20 0,05%) as placas foram bloqueadas (tampão bloqueio livre de proteínas em PBS pH 7.4 com 0,05% Tween-20, Thermo Fisher Scientific, Rockford, Illinois, EUA) por uma hora a 37°C. Em seguida, as placas foram lavadas e incubadas durante uma hora a 37°C com soros diluídos 1:50 em PBS pH 7.4 com 0,1% (p/v) de BSA. As placas foram lavadas e incubadas com anticorpo anti-lgG humana Fc-específica conjugado à biotina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) diluído 1:2500 em PBS com 0,1% de BSA durante uma hora a 37°C. As placas foram lavadas e incubadas com estreptavidina conjugada à peroxidase (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) diluída 1:2500 em PBS com 0,1% de BSA por uma hora a 37°C. Após lavagem, a reação foi detectada por adição do substrato cromogênico OPD.

Das amostras analisadas, os peptídeos detectaram 12 pacientes hansenianos multibacilares (52,2%) e cinco pacientes tuberculosos (16,7%). Como esperado, não foram detectados pacientes hansenianos tuberculosos, pois esse. grupo se caracteriza por uma resposta predominantemente celular. Nenhuma das amostras de contatos e indivíduos sadios foi considerada positiva pelo ensaio (Fig. 3). ELISA com peptídeos e soro anti-micobactérias A produção de anticorpos anti-micobactérias em animais foi avaliada pela técnica de ELISA. Para tanto, placas de ELISA (Falcon 353912, BD Biosciences, San Jose, Califórnia, EUA) foram sensibilizadas com 50 μί de antígeno a 10 μ9/ιτιί em tampão carbonato 0,05 M pH 9.6 overnight a 4°C. Após lavagem (NaCI 0,9%-Tween-20 0,05%) as placas foram bloqueadas (caseína 2% em PBS pH 7.4) por uma hora a 37°C. Em seguida, as placas foram lavadas e incubadas por uma hora a 37°C conl soros dos animais imunizados diluídos 1:4000 em tampão de incubação (0,25% de caseína em PBS pH 7.4-Tween 20 0,05%). As placas foram lavadas e incubadas com anticorpo anti-lgG de coelho conjugado à peroxidase (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) diluído 1:4000 em tampão de incubação por uma hora a 37°C. Seguindo-se lavagens a reação foi revelada utilizando OPD como cromógeno (Fig. 4).

Para avaliar a reatividade dos peptídeos com soros anti-micobactérias produzido em animais, placas de ELISA (Cornig 2592, Lowell, Massachusetfs, EUA) foram sensibilizadas com 100 pL de um pool de peptídeo (5A, 6A e 1B) a 1,5 pg/ml em tampão carbonato 0,05 M pH 9.6 overnight a 4°C. As etapas seguintes foram as mesmas daquelas descritas acima. Os peptídeos não mostraram reatividade frente aos soros anti-micobactérias. Três diluições de soro de coelhos foram testadas, 1:4000, 1:400 e 1:40 e nenhuma das diluições apresentou reatividade com os peptídeos.

Exemplo 3: Avaliação da Imunoaenicidade de Peptídeos Conjugação de peptídeos a proteína carreadora Os peptídeos, 5A, 6A e 1B acrescidos da sequência KKG foram conjugados a proteína carreadora albumina sérica bovina via glutaraldeído, conforme descrito (Harlow, E.; Lane, D. Antibodies: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. 726 p). Glutaraldeído é um reagente de acoplamento bifuncional que liga dois componentes principalmente através de grupos amina primários, incluindo grupos ε-amino em lisína e grupos a-amino livres. A proteína carreadora (0,03 pmoL) dissolvida em PBS foi adicionada, a solução de peptídeo (0,6 pmoL) também preparada em PBS. Igual volume de 0,2% de glutaraldeído (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) em PBS foi lentamente adicionado a solução proteína carreadora/peptídeo que permaneceu sob constante agitação por uma hora a temperatura ambiente. A mistura foi incubada por uma hora sob agitação após adição de glicina 1M em PBS (pH 7.2) para uma concentração final de 200 mM.

Produção de anticorpos anti-peptídeos Grupos de cinco camundongos Swiss fêmeas de oito semanas foram imunizados com quatro doses de 20 μg de peptídeo-BSA em adjuvante incompleto de Freund (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA). A primeira e segunda doses foram adminisfradas por via subcutânea e a terceira a quinta doses foram feitas via intraperitoneal. As injeções foram realizadas em intervalos de duas semanas. Soro não-imune foi utilizado como controle negativo e o sangue imune foi coletado uma semana após a última imunização.

Para avaliar a produção de anticorpos anti-peptídeos em camundongos, uma placa de ELISA (Cornig 2592, Lowell, Massachusetts, EUA) foram sensibilizadas com 100 μΐ de peptídeo a 1,5 μρ/ηιί em tampão carbonato 0,05 M pH 9.6 overnight a 4°C. Após lavagem (NaCI 0,9%-Tween-20 0,05%) a placa foi bloqueada (caseína 2% em PBS pH 7.4) por uma hora a 37°C. Em seguida, a placa foi lavada e incubada por uma hora a 37°C com soros dos animais imunizados diluídos em tampão de incubação (0,25% de caseína em PBS pH 7.4-Tween 20 0,05%). Após lavagem, a detecção da reação foi realizada com anticorpo anti-lgG de camundongo γ-específica conjugado à peroxidade (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) (1:2500) e OPD como cromógeno (Fig. 5).

Exempio 4: Pesquisa do Antíaeno Original em M. leprae SDS-PAGE e Western Blotting Células totais liofilizadas de M. leprae foram fornecidas por Dr. J. S. Spencer da Universidade do Colorado, Fort Collins, EUA, através do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas/lnstituto Nacibnal de Saúde sob contrato N01-AI-25469. As células foram ressuspendidas em NaCI 0,9% contendo 100 pg/mL de PMSF e 2 mM EDTA e submetidas a sonicação como descrito no Exemplo 2. Quarenta microgramas de proteína foram separadas em gel de poliacrilamida a 15% sob condições redutoras (Laemmli U.K, Nature, 227:680-685, 1970). Após eletroforese as proteínas foram transferidas a uma membrana de PVDF (lmmobiIon-PSQ, Millipore, Billerica, Massachusetts, EUA) em tampão composto de 25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 10% de metanol e 0,025% de SDS por 16 h a 24 V seguido de uma hora a 48 V. Após transferência, a membrana foi bloqueada com 0,3% de Tween-20 em PBS e, em seguida, lavada com 0,05% de Tween-20 em PBS (PBST-0,05%) e incubada com soro anti-peptídeo em PBST-0,05%. A membrana foi lavada e incubada com anticorpo anti-lgG de camundongo γ-específica diluído 1:5000 em PBS-T 0,05%. O substrato quimiluminescente ECL Plus™ (GE Healthcare, Litfle Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) combinado com filme autoradiográfico Hyperfilm™ ECL™ (GE Healthcare) foi usado para a detecção da reação (Fig. 6A).

Eletroforese bidimensional .

Um total de 200 pg de proteína de M. leprae foram purificadas por precipitação usando o kit 2-D Clean-Up (GE Healthcare). As proteínas precipitadas foram ressuspendidas em 250 μί de solução de reidratação (uréia 8M, CHAPS 2%, DTT 20 mM, IPG buffer0,5%, azul de bromofenol 0,002%), a qual foi aplicada a tira de IPG (Immobiline™ DryStrip gel, GE Healthcare), pH 4-7 de 13 cm. A tira IPG foi reidratada por reidratação passiva de 4 h seguida de reidratação ativa a 50V por 12 h a 20°C em Ettan IPGphor II (GE Healthcare). A focalização isoelétrica das proteínas foi realizada usando o seguinte programa: 500 V até acumular 550 Vh, 500-1000 V até acumular 880 Vh, 1000-8000 V até acumular 12440 Vh e 8000 V até acumular 5940 Vh, totalizando 2140è Vh. A tira IPG foi equilibrada em tampão A (uréia 6M, Tris-HCI 50 mM, pH 8.0, glicerol 30%, SDS 2%, azul de bromofenol 0,002% e DTT 0,065 M) por 15 min seguido por equilibraçõo em tampão B (uréia 6M, Tris-HCI 50 mM, pH 8.0, glicerol 30%, SDS 2%, azul de bromofenol 0,002% e iodoacetamida 0,14M) por 15 min. A separação em segunda dimensão foi realizada em gel de poliacrilamida a 15% usando o sistema de eletroforese vertical SE 600 Ruby (GE Healthcare). A eletroforese foi realizada a 15 mA/gel por 15 min e a 25 mA/gel até o azul de bromofenol atingir o final do gel.

Após eletroforese as proteínas foram transferidas a uma membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada com 0,3% de Tween-20 em PBS, lavada com PBST-0,05% e incubada com soro anti-peptídeo em PBST-0,05%. Após lavagem, a membrana foi incubada com anticorpo anti-lgG de camundongo γ-específica diluído 1:5000 em PBS-T 0,05%. O substrato quimiluminescente ECL Plus™ combinado com Hyperfilm™ ECL™ foi usado para a detecção da reação (Fig. 6B). Para reutilização da membrana com diferentes anticorpos, a membrana foi incubada com solução de strippíng (glicina 0,1 M, NaCI 0,15 M, pH 2.8) por uma hora a temperatura ambiente.

Exemplo 5: Identificação de Resíduos Liaantes de Anticorpos em Peptídeos Síntese de peptídeos em membrana de celulose O peptídeo 5A e seus análogos de alanina foram preparados por Spot Synfhesis. A síntese de peptídeos foi realizada em membranas de celulose contendo grupos amino livres e espaçadores de polietilenoglicol (membranas amino-PEG, Intavis, Bioanalytical Instruments AG, Nattermannallee, Kõln, Alemanha) usando um sintetizador de peptídeos automático MultiPep RS (Intavis Bioanalytical Instruments AG). A síntese foi conduzida segundo o protocolo recofnendado pelo fabricante e empregando aminoácidos Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila). Resumidamente, aminoácidos Fmoc foram ativados para acoplamento com DIC (Ν,Ν’-díisopropilcarbodiimida) e HOBt (t-hidroxibenzotriazol). Após o acoplamento, os grupos amino livres foram bloqueados por acetilação. O grupo Fmoc foi removido por tratamento com piperidina 20% em DMF (Ν,Ν-dimetilformamida) para preparar a membrana para o próximo ciclo de acoplamento. Um passo final de acetilação foi realizado após o último ciclo da síntese. A remoção dos grupos de proteção de cadeia lateral foi realizada por tratamento da membrana com uma solução composta de 92% ácido trifluoroacético, 4% de triisopropilsilano e 4% de água por três horas seguido de lavagens com diclorometano (DCM), DMF e etanol. Após secagem, a membrana foi armazenada a -20°C.

Imunoensaio com peptídeos em membrana A membrana, após três lavagens com metanol e três lavagens com PBS, foi incubada overnight com solução de bloqueio (PBS-Tween 20-0,05%, BSA 3%). A membrana foi lavada por três vezes de 10 min com PBS-Tween 20-0,05% (PBS-T) e incubada com um pool de soros de pacientes hansenianos multibacilares diluído 1: 250 em PBS-T por uma hora a temperatura ambiente. Após lavagem, a membrana foi incubada com anticorpo anti-lgG humana Fc-específica diluído 1:120000 em PBS-T por uma hora. A membrana foi lavada e a detecção da reação foi realizada usando o substrato quimiluminescente ECL Plus™ e Hyperfilm™ ECL™. A intensidade dos spots foi obtida com o software ImageJ (v. 1.43, National Institutes of Health, EUA) (Fig. 7). Para reutilização da membrana, a mesma foi lavada por três vezes de 10 min com o reagente de regeneração A (uréia 8M, SDS 1%, β-mercaptoetanol 0,1%), seguido de três lavagens de 10 min com o reagente de regeneração B (etanol 50%, água ultrapura 40%, ácido acétfco 10%). Após três lavagens de 10 min com metanol a membrana foi seca e armazenada a -20°C.

Exemplo 6: Reação de Hipersensibilidade do Tido Tardio Animais Três grupos de cinco cobaias (Cavia porcellus) fêmeas de 250300 g foram utilizados no teste cutâneo. O experimento foi conduzido em conformidade com o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Paraná e com o Comitê de Ética em Pesquisa Conselhos Humanos da Secretária de Estado de Saúde do Paraná.

Antígenos Antígeno de M. leprae foi preparado conforme Exemplo 2. Os peptídeos 5A, 6A e 1B foram os«,peptídeos avaliados quanto a indução de resposta celular. Os antígenos administrados via intradérmica foram diluídos em solução salina (NaCI 0,9%). Como controle positivo foi empregado o antígeno de Mitsuda (4x107 bacilos/mL) que foi fornecido pelo Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos, Piraquara, Paraná e como controle negativo, utilizou-se solução salina. .

Teste de hipersensibilidade do tipo tardio Cinco animais (grupo I) foram sensibilização através da inoculação de 200 pg de antígeno de M. leprae em adjuvante incompleto de Freund via subcutânea. Em cinco animais do grupo II foi administrado solução salina (NaCI 0,9%) em adjuvante incompleto de Freund por via subcutânea. O grupo III foi constituído de animais não sensibilizados. Após 30 dias, cada animal recebeu por via intradérmica 0,1 ml dos seguintes antígenos: peptídeo 5A (10 e 2 pg), peptídeo 6A (10 e 2 pg), peptídeo 1B (10 e 2 pg), pool dos três peptídeos (10 e 2 μρ), mitsudina (controle positivo), extrato solúvel de /4. leprae (10 pg, controle positivo) solução salina (controle negativo), O diâmetro da reaçfeo cutânea foi mediado após 24h, 48h, 72h, 21 dias e 28 dias. A resposfa imune máxima foi observada em 48h. Não foi detectada qualquer reação em animais imunizados com adjuvante (grupo II) como também em animais não sensibilizados (grupo III). No grupo sensibilizado com M. leprae, observou-se reação com o peptídeo 5A (2/5), peptídeo 1B (1/5), mitsudina (2/5) e com M. leprae (4/5). Para o peptídeo 1B a reação cutânea foi observada nas doses de 2 e 10 μρ, enquanto para o peptídeo 5A , apenas a dose de 10 pg gerou resposta.

REIVINDICAÇÕES

Claims (16)

1. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS compreende um método de identificação de antfgenos micobacterianos, caracterizado pelas seguintes etapas: a) coletar amostras; b) obtenção de anticorpos antígeno-específicos a partir de amostras coletadas em (a); c) seleção de peptídeos miméticos de antígenos micobacterianos a partir de bibliotecas de peptídeos expressos em fagos (tecnologia Phage Display).

2. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com a reivindicação ), caracterizado oor conter anticorpos, podendo ser obtida de indivíduos infectados com micobactérias em qualquer fase, incluindo a fase-específica da doença, aind.a podendo ser obtida de animais experimentalmente infectados com micobactérias.

3. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com a reivindicação ), caracterizado por anticorpos purificados de amostras por métodos de precipitação, incluindo o método de cromatografia de afinidade, immunoblotting.

4. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com a.reivindicação ), caracterizado pela utilização de anticorpos antígeno-específios de M. leprae (anti-ΛΊ. leprae) podendo conter depleção de fagos reativos a anticorpos antígeno-específicos de doenças micobacterianas, incluindo as cáusadas por/VI. tuberculosis.

5. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉT1COS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS compreende peptídeos identificados pelo método da reivindicação 1, caracterizado pelas sequências SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 12.

6. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉT1COS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS dispõe de peptídeos, caracterizado por consistir em: a) um peptídeo correspondente a qualquer sequência SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 12 ou; b) uma variante de qualquer peptídeo de (a) ou; c) uma combinação de um ou mais peptídeos de (a) ou variante de (b).

7. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com a reivindicação 6(b), caracterizado por conservar as propriedades antigências e/ou imunogências da sequência que trata a reivindicação 6(a).

8. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com a reivindicação 6(c), caracterizado por compreender uma mistura de pelo menos duas sequências de que tratam as reivindicações 6(a) e ó(b), podendo ainda compreender a formação de polímeros constituídos da repetição de uma sequência peptídica da qual tratam as reivindicações ó(a) e ó(b) podendo ser separadas por qualquer método de separação como espaçadores e linkers. .

9. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com as reivindicações 6 a 8, caracterizado por serem produzidos pela tecnologia do DNA recombinante, podendo ser produzidos também por síntese química.

10. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leproe PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS compreende um método de defecção de infecção por M. leproe, caracterizado pelas seguintes etapas: a) coletar a amostra; b) colocar a amostra em contato, após processamento, como pelo menos um dos peptídeos referidos nas reivindicações 6 a 8; c) detecção da reação entre componentes da amostra e peptídeo(s) (b) por técnicas adequadas.

11. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com a reivindicação 10 {a), caracterizado por ser qualquer amostra que contenha anticorpos, incluindo sangue.

12. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com a reivindicação 10 (b), caracterizado pelo fato de anticorpos e células mononucleares, não necessariamente juntas, serem separadas das amostras e por possibilitar a interação entre antígeno e anticorpo, possibilitando também a indução da proliferação de células e a indução da produção de citocinas frente a antígenos.

13. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leorae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com a reivindicação 10 (cj, caracterizado por serem técnicas de ELISA, Western Blotting, imunoprecipitação, aglutinação, radioimunoensaio, imunofluorescência e demais técnicas que possibilitam a detecção de imunocomplexos, proliferação celular e produção de citocinas.

14. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacterium leoràe PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS compreende um kit de diagnóstico de infecção por M. leprae, caracterizado por consistir de peptídeos conforme apresentado nas reivindicações 6 a 8, reagentes, dispositivos e instruções escritas necessários para a execução do ensaio.

15. USO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS DE Mvcobacteríum leprae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS compreende composições imunológicas, caracterizado por conter peptídeos conforme apresentado nas reivindicações 6 a 8 associados a um veículo(s) tisiologicamente aceitável(is), preservativo(s) e quando necessário, adjuvante(s).

16. USO DE PEPTÍDEOS -MIMÉTICOS DE A/lvcobacferium leprae PARA DIAGNÓSTICO E VACINAS, de acordo com as reivindicações 6 a 8, caracterizado oor ser na preparação de composições imunológicas para induzir uma resposta imunogênica, podendo ser protetora in vivo, permitir a avaliação da exposição de indivíduos ao M. leprae, contribuir na avaliação da resposta imune e classificação da doença em indivíduos infectados porM. leprae.