BRPI1016273A2

BRPI1016273A2 - método para a detecção de polimavírus jc

Info

Publication number: BRPI1016273A2
Application number: BRPI1016273-9A
Authority: BR
Inventors: Leonid Gorelik; Alexey Lugovskoy
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc.
Priority date: 2009-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2020-12-01
Also published as: EP2394163A4; AU2010210979B2; SG2014009120A; AU2010210979A1; NZ594973A; US20150219651A1; SG173201A1; CA2751364C; CA2751364A1; US9696307B2; CN102369436A; US20120258443A1; CN102369436B; EP2394163A1; JP2012517017A; US20130101985A9; EP2394163B1; CN104316696A; WO2010090757A1; ES2842425T3

Abstract

MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE POLIOMAVÍRUS JC. A presente invenção refere-se a métodos e composições para determinar se um paciente está em risco de PML, incluindo pacientes que estão sendo tratados com imunossupressantes através da determinação de se os pacientes contêm uma variante de ICV com ligação reduzida para ácido siálico em relação a um ICV normal. Além disso, são proporcionadas combinações de variações de sequência de VP1 de JVC que são associadas à PML e que podem ser usadas como base de ensaio para identificar pacientes suscetíveis à PML, paciente com PML (por exemplo, com PML em estágio precoce), ou pacientes em risco de desenvolver PML em resposta a um tratamento imunossupressivo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO À PARA A DETECÇÃO DE POLIOMAVÍRUS JC". Este pedido reivindica o benefício da 35 U.S.C. $ 119(e) do Pedido de Patente Provisório US 61/150.310, intitulado “Métodos para Detecção de Poliomavírus JC", depositado em 5 de fevereiro de 2009, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência.

Campo da Invenção A invenção refere-se a métodos para a detecção do polioma- vírus JC humano, diagnóstico de leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML),e o desenvolvimento de produtos terapêuticos para PML.

Antecedentes da Invenção - Infecção com poliomavírus JC (JCV) em humanos pode causar . uma doença desmielinizante do sistema nervoso central, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML). Contudo, a infecção com JCV usualmente não resulta em PML em pacientes saudáveis.

A infecção com JCV é prevalente em muitas populações humanas sem causar alta disseminação de PML.

Tipicamente, PML se desenvolve somente em pacientes infectados com JCV que têm também o sistema imunológico enfraquecido.

Os pacientes que estão com a imunidade comprometida devido a uma doença ou tratamento —imunossupressor podem ser vulneráveis à PML associada à infecção por JCV.

Sumário da Invenção Os aspectos da invenção se referem a métodos e composições para determinar se um paciente é suscetível à PML.

Em particular, a inven- ção proporciona métodos e composições para determinar se um paciente corre o risco de desenvolver PML, se o sistema imunológico do paciente está comprometido ou suprimido.

Por exemplo, os aspectos da invenção estão direcionados a determinar se um paciente é adequado para um trata- mento inicial ou contínuo com um agente imunossupressor por determinação do perfil de risco do paciente em desenvolver PML causada por infecção com JCV.

O genoma humano é exposto a e pode adquirir muitos vírus durante a vida do indivíduo. Um exemplo de tal vírus é o poliomavírus JC É (JCV). A infecção com vírus JC é altamente prevalente em humanos. Infecção primária com JCV ocorre assintomaticamente durante a infância (Padgett & Walker, 1973). JCV é então disseminado pelo corpo todo, através de viremia (lIkegaya et al, 2004). Acredita-se que JCV persista prin- cipalmente no cérebro e no tecido renal. Embora a infecção com JCV seja assintomática na maioria dos pacientes, a infecção pode resultar em condi- ções sérias (como PML) e mesmo em morte em alguns pacientes. Pacientes mais suscetíveis à PML são pacientes que estão imunocomprometidos (por exemplo, pacientes com AIDS) ou pacientes que estão sendo submetidos a tratamentos com imunossupressores (por exemplo, após transplante de ec órgão ou para tratamento de condição relacionada à inflamação tal como esclerose múltipla). A presente invenção proporciona variantes de JCV, identifica um painel de variantes inclusive variantes novas que estão asso- ciadas ao risco de PML, e métodos relacionados às descobertas de cone- xões estruturais e funcionais entre variantes de JCV e PML.

Uma sequência de JCV do “tipo selvagem” é usada aqui para referir-se à sequência de qualquer um dos arquétipos de JCV encontrados em pacientes saudáveis que não têm PML, e/ou não estão correndo risco de PML. Em algumas modalidades, a sequência de referência do “tipo selva- gem” de consenso pode ser uma média de sequências encontradas em um grupo de indivíduos saudáveis. A discrepância entre prevalência viral alta e baixa incidência de PML sugere que, além da disfunção imunológica, pode- ria haver algumas características virais únicas que regulam a progressão assintomática para a PML. Em algumas modalidades, os aspectos da inven- ção estão relacionados à descoberta de que a parte da proteína de superfi- cie viral que é responsável pela interação viral com receptores celulares e a infecção de células hospedeiras adquirem mutações específicas de aminoácidos no paciente em algum ponto da via a partir do rim, o sítio de infecção assintomática, para o SNC, o sítio da PML. Além disso, em algu- mas modalidades, mutações específicas de PML alteram a capacidade do capsídeo viral de se ligar a vários ácidos siálicos e a uma variedade de tipos de células periféricas, mas retêm a capacidade de se ligarem às células : gliais do SNC.

Com base na análise matemática das sequências publicadas de VP1 de pacientes com PML e pacientes sem PML, proporciona-se uma seleção positiva de variantes de aminoácidos específicas durante a PML. Contudo, já que sequências de PML publicamente disponíveis foram obtidas de CSF ou de tecidos cerebrais de pacientes com PML enquanto sequências dos sem PML foram obtidas da urina de pacientes saudáveis, justamente com base na análise de amostras do Genbank, poder-se-ia não inequivoca- mente ser demonstrado se essas variantes de aminoácidos foram produ- zidas via mutação viral nos pacientes ou representaram mais variantes virais ... raras que ocorrem em todos os clados de JCV e são enriquecidos (por É exemplo, positivamente selecionados) em casos de PML como sendo mais Ô prováveis de causar PML. De acordo com os aspectos da invenção, subs- tituições de VP1 ocorrem dentro do paciente e podem levar à PML. Isso é suportado pela análise de amostras correspondentes de urina-CSF e urina- plasma do paciente, tiradas no mesmo ponto de tempo. Sequências de VP1 no CSF e no plasma proveniente de pacientes com PML continham substi- tuições ou deleções únicas de aminoácidos de vários aminoácidos relativas às sequências de VP1 isoladas da urina do paciente. Conforme mostrado aqui, tipos virais JC encontrados no CSF, plasma e urina do mesmo indi- víduo foram da mesma cepa viral, ao passo que pacientes diferentes conti- nham cepas diferentes. Portanto, sem desejar está ligado a qualquer teoria, a presença de substituições de aminoácidos na VP1 no CSF, mas não na urina, resulta do aparecimento de uma mutação dentro do paciente em vez de por infecção dual com duas variantes virais diferentes.

Algumas das substituições de aminoácidos detectadas no CSF e no plasma de pacientes com PML foram previamente descritas. Contudo, essas substituições não foram diretamente correlacionadas ao risco aumentado de PML e suas propriedades estruturais e funcionais não foram associadas aos aspectos do desenvolvimento e progressão de PML. Mutações e/ou deleções de VP1 do JCV associadas à PML são também proporcionadas aqui.

Ç De acordo com os aspectos da invenção, substituições na proteína VP1 podem ser mais importantes para determinar a progressão da doença precoce (por exemplo, ao permitir que o vírus migre da periferia do SNCeinfecte células do SNC) em vez de determinar diferentes resultados em diferentes contextos clínicos. Contudo, em algumas modalidades, houve uma associação entre o tipo de mutação presente em VP1 e certas medi- ções clínicas. Por exemplo, níveis de replicação de JCV no CSF menores foram observados em pacientes com vírus não mutado ou vírus carregando mutações/deleções nas posições 122-134. É também possível já que mutações afetam a resistência da interação viral com receptores celulares, a . liberação viral de células mortas possa ser também impedida por um vírus : que se liga àqueles receptores firmemente. Por conseguinte, pode ser verificado que vírus que tem avidez mais fraca por ligação a células é liberado no espaço extracelular mais abundantemente. Isso é consistente com a observação de que mutantes nas posições 55-61 e 265-271 perdem sua capacidade de se ligarem aos receptores de ácido siálico com relação ao vírus não mutado, e assim podem ter capacidade melhor de se desta- caram de fragmentos celulares (depois que o vírus mata a célula hospedei- ra)eencontram sua via para o CSF.

Por conseguinte, embora um paciente possa ser concorrente- mente infectado com várias versões diferentes de JCV (por exemplo, com variantes diferentes em tecidos ou órgãos diferentes), as mutações associa- das à PML são mais prováveis de surgirem a partir de uma população de vírus JCV existente em um indivíduo que está infectado com JCV do tipo selvagem.

Os aspectos da invenção são baseados, pelo menos em parte, na constatação de que certos tipos de mutações na proteína do capsídeo de JCV estão associados à conversão de uma forma assintomática de infecção —comJCVem uma forma de JCV associada à PML. De acordo com os aspec- tos da invenção, sem se comprometer a qualquer mecanismo particular, as mutações que rompem a capacidade de uma partícula de JCV de ligar a, ou interagir, com o ácido siálico podem resultar no vírus que não está mais É contido no compartimento periférico de um paciente e resultar em que o vírus obtenha passagem mais livre para o SNC, um sítio da doença de PML. Em algumas modalidades, essas mutações permitem que o vírus obtenha isso ao evitar “armadilha” em certas glicoproteínas e pseudorreceptores de glicolipídios expressos em órgãos e células periféricas, incluindo, mas sem limitação, células imunes e células vermelhas do sangue. Adicionalmente, já que alguns desses sítios são alvos na imunorresposta do hospedeiro normal (anticorpo e células T), essas mutações podem permitir que o vírus escape de ser reconhecido pelo sistema imunológico, particularmente em pacientes com sistemas imunológicos enfraquecidos.

.. Os aspectos da invenção proporcionam métodos e composições áS para avaliar o perfil de risco do paciente para PML. É Em algumas modalidades, os aspectos da invenção se referem adeterminar se um paciente foi exposto à infecção por qualquer variante de JCV. Em alguns aspectos, a infecção por uma variante de JCV do tipo selvagem pode aumentar o perfil de risco à PML, pois mutações associadas à PML podem surgir do JCV do tipo selvagem, embora estes possam ser eventos raros. Por conseguinte, um paciente pode ser testado quanto à presença de um ou mais indícios de infecção com JCV (por exemplo, detec- ção de proteínas virais ou de ácido nucleico, ou indiretamente via a detecção de uma imunorresposta à infecção por JCV, por exemplo, na forma de anticorpos séricos para proteínas virais do JCV.). Deve ser apreciado que indícios de qualquer infecção com JCV (por exemplo, do tipo selvagem ou variante) podem ser avaliados. Se o paciente já foi exposto à infecção com JCV, então o paciente pode ser identificado como tendo um perfil de risco maior que o paciente não infectado. Por conseguinte, o paciente infectado com JCV que está sendo tratado com agente imunossupressor pode ser avaliado quanto às mutações específicas de JCV ou pode ser monitorado maisfrequentemente que o paciente não infectado. Em algumas modalidades, o paciente que está sendo tratado com (ou está em vias de iniciar o tratamento com) um agente imunossu-

pressor é testado quanto a um ou mais indícios de infecção por JCV. Se um É ou mais indícios de infecção por JCV são detectados, o paciente pode ser avaliado quanto à presença de uma ou mais variantes de JCV associada à PML, conforme descrição aqui. Se indícios de JCV não são detectados, o paciente pode ser monitorado por um tempo, por exemplo, a cada 4 semanas, mensalmente, a cada três meses, a cada 4 meses, a cada 6 meses, ou a cada 12 meses, quanto à presença de quaisquer indícios de infecção com JCV. Se a infecção com JCV é detectada, o paciente pode ser ainda avaliado quanto à presença de uma ou mais variantes de JCV. Se uma variante de JCV associada ao risco aumentado de PML é detectada, o paciente pode ser ainda monitorado para detectar quaisquer sinais precoces É de PML e/ou o regime de tratamento pode ser alterado conforme descrito em . mais detalhes aqui. É Em um aspecto, a invenção proporciona um método que compreende interrogar uma amostra biológica de um paciente quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende uma substituição de resíduos de aminoácido 122, e em que é determinado que o paciente tem suscetibilidade aumentada à PML se a amostra compreender o pelo menos um indício.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método que compreende interrogar uma amostra biológica de um paciente quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende uma substituição de resíduo de aminoácido 2, e em que se determina que o paciente tem suscetibilidade aumentada à PML se a amostra compreender o pelo menos um indício.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método que com- preende interrogar uma amostra biológica de um paciente quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende uma substituição de resíduo de aminoácido 66, e em que se determina que o paciente tem suscetibilidade aumentada à PML se a amostra compreender o pelo menos um indício.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método que com-

preende interrogar uma amostra biológica de um paciente quanto a pelo ç menos um indício de uma proteina do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende uma substituição de resíduo de aminoácido 283, e em que se determina que o paciente tem suscetibilidade aumentada à PML se a amostra compreender o pelo menos um indício.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda interro- gar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende uma substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 2 e 66. Em algumas modalidades, o método compreende ainda interrogar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que o compreende uma substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoáci- E dos 122 e 66. Em algumas modalidades, o método compreende ainda inter- rogar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende uma substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 2 e 122. Em algumas modali- dades, a amostra é interrogada quanto ao uso de um ensaio capaz de detec- tar pelo menos um indício de cada uma das proteínas do capsídeo VP1 da variante de JCV tendo substituição de pelo menos um dos resíduos de ami- —noácidos 2,66, e 122,e em que se determina que o paciente tem susceti- bilidade aumentada à PML se a amostra compreender pelo menos um indício de pelo menos uma das proteínas do capsídeo VP1 da variante de JCV. Em algumas modalidades, a amostra é interrogada usando-se um ensaio capaz de detectar pelo menos um indício de cada uma das proteínas do capsídeo VP1 da variante de JCV tendo substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 2, 66, 122 e 283, e em que se determina que o paciente tem suscetibilidade aumentada à PML se a amostra compreender pelo menos um indício de pelo menos uma das proteínas do capsídeo VP1 da variante de JCV. Em algumas modalidades, o método compreende ainda interro- gar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende deleção de fragmento de aminoácidos 50-51. Em algumas modalidades, o método compreende ainda ' interrogar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende deleção de fragmento de aminoácidos 54-55. Em algumas modalidades, o método compreende ainda interrogar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compre- ende deleção de fragmento de aminoácidos 123 a 125. Em algumas modali- dades, o método compreende ainda interrogar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende deleção de fragmento de aminoácidos 125 a 134. Em al- gumas modalidades, o método compreende ainda interrogar a amostra bioló- e gica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da . variante de JCV que compreende deleção de fragmento de aminoácidos 125 a 136.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda interro- gar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende deleção de fragmentos de aminoácidos 50 a 51, 54 a 55 e 123 a 125. Em algumas modalidades, a amostra é interrogada usando-se um ensaio capaz de detectar pelo menos um indício de cada uma das proteínas do capsídeo VP1 da variante de JOV tendo deleção de pelo menos um dos fragmentos de aminoácidos 50 a 51, 54 a 55 e 123 a 123, e em que se determina que o paciente tem suscetibi- lidade aumentada à PML se a amostra compreender pelo menos um indício de pelo menos uma das proteínas do capsídeo VP1 da variante de JCV.

Em algumas modalidades, a método compreende ainda interro- gar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda interro- gara amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV que compreende uma substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 55, 60, 265, 267, e 269. Em algu-

mas modalidades, a amostra é interrogada quanto ao uso de um ensaio ' capaz de detectar pelo menos um indício de cada uma das proteínas do capsídeo VP1 da variante de JCV tendo uma substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 55, 60, 265, 267, e 269, e em que se deter- mina que o paciente tem suscetibilidade aumentada à PML se a amostra compreender pelo menos um indício de pelo menos uma das proteínas do capsídeo VP1 da variante de JCV.

Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra deCSF.Em algumas modalidades, a amostra biológica é amostra de urina.

Em algumas modalidades, é sabido que o paciente foi previa- E mente infectado com JVC do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma : nova amostra biológica do paciente é interrogada quanto a pelo menos um indício de pelo menos uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV, pelomenos duas vezes ao ano. Em algumas modalidades, uma nova amos- tra biológica do paciente é interrogada quanto a pelo menos um indício da proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV diariamente, semanalmente, mensalmente, bimensalmente, trimensalmente, duas vezes ao ano, anual- mente, a cada dois anos ou a cada cinco anos ou qualquer frequências entre estas.

Em algumas modalidades, a detecção de pelo menos um (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) indício de uma proteina do capsídeo VP1 da variante de JCV é usada para identificar o paciente como inapropriado para tratamento imunossupressor. Em algumas modalidades, a detecção de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou mais indícios de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV são usados para identificar o paciente como inapropriado para um tratamento imunossupressor.

Em algumas modalidades, a detecção de pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV é usada para reco- mendar modificação do tratamento imunossupressor ao paciente. Em algu-

mas modalidades, a detecção de pelo menos um, pelo menos dois, pelo ! menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou mais indícios de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV é usada para recomen- daramodificação do tratamento imunossupressor ao paciente.

Em algumas modalidades, a ausência de indícios de uma proteí- na do capsídeo VP1 da variante de JCV é usada para identificar o paciente como apropriado para tratamento imunossupressor.

Em algumas modalidades, a ausência de indícios de uma proteí- nado capsídeo VP1 da variante de JCV é usada para identificar o paciente como apropriado para tratamento imunossupressor contínuo. ro Em algumas modalidades, a amostra biológica é interrogada . quanto à presença de um anticorpo que é específico para uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV. Em algumas modalidades, a amostra biológica é interrogada quanto à presença de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV.

Em algumas modalidades, a amostra biológica é interrogada quanto à presença de uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV.

Em algumas modalidades, a amostra biológica é interrogada quanto à presença de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV.

Em algumas modalidades, a amostra biológica é interrogada usando-se análise baseada em ELISA; Por conseguinte, em algumas modalidades, os pacientes podem ser selecionados para determinar se eles correm risco de desenvolver PML. Em certas modalidades, os pacientes podem ser selecionados para detectar PML em estágio avançado antes que a doença progrida para uma condição Clínica séria. O paciente pode ser ensaiado quanto ao risco de PML ou PML em estágio precoce interrogando-se uma amostra biológica obtida do paciente para indícios de exposição a uma variante de JOCV associada à PML, por exemplo, uma variante de JCV que se prevê que tem ligação reduzida ao ácido siálico. A invenção proporciona posições específicas na proteína do capsídeo VP1 da variante de JCV principal (JCV-VP1) que estão | associadas ao risco de PML e/ou progressão da doença PML. Em algumas modalidades, o perfil de risco de um paciente ter PML é determinado com base no estado mutacional em uma ou mais posições selecionadas da proteina VP1 de um vírus JC ao qual o paciente foi exposto.

Os aspectos da invenção são úteis para detectar risco de PML ou a progressão da doença em estágio precoce em pacientes suscetíveis, por exemplo, em pacientes que estão imunocomprometidos e/ou estão sendo tratados com agentes imunossupressores.

Por conseguinte, em um aspecto, a invenção proporciona méto- dos para determinar se o paciente é suscetível à PML. Em algumas modali- e dades, o método compreende determinar que o paciente é suscetível à PML á se o paciente contiver uma variante de JCV suspeita de ter baixas proprie- dades de ligação com o ácido siálico (por exemplo, avidez ou afinidade).

Em algumas modalidades, o método compreende determinar que um paciente contém uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação com o ácido siálico, e identificar o paciente como sendo suscetível à PML se o paciente contiver uma variante de JCV. Em algumas modalidades, o método compreende testar um paciente quanto à presença de uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação com ácido siálico e identificar o paciente como suscetível à PML se a presença de uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico é detectada.

Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para determi- nar se um paciente é apropriado para tratamento imunossupressor. Em algumas modalidades, o método compreende determinar que o paciente é apropriado para um tratamento imunossupressor se o paciente não compre- ende uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação com o ácido siálico. Em algumas modalidades, o método compreende determinar que o paciente contém uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação com ácido siálico; e identificar o paciente como apropriado para um tratamento imunossupres- sor se o paciente não contém a variante de JCV, ou identificar o paciente como sendo inapropriado para o tratamento imunossupressor se o paciente contém a variante de JCV.

O Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para determi- nar se o paciente é inapropriado para o tratamento imunossupressor. Em algumas modalidades, o método compreende determinar que o paciente é inapropriado para tratamento imunossupressor se o paciente contém uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação com ácido siálico.

Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, a determinação compreende ensaiar uma amostra biológica do pacien- te quanto a um indício da variante JCV suspeita de ter baixa ligação com o ácido siálico. Em algumas modalidades dos métodos proporcionados aqui, a amostra biológica é uma amostra de urina, plasma, soro, esfregaço de mu- cosa, ou uma amostra de CSF. Em algumas das modalidades dos métodos É proporcionados aqui, o indício é a presença de um anticorpo que pode se ligar especificamente a uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação como ácido siálico. Em algumas das modalidades dos métodos proporcio- nados aqui, o indício é a presença de uma sequência de ácidos nucleicos associada a uma variante de polipeptídeo de JCV suspeita de ter baixa ligação com o ácido siálico, em que a sequência de ácidos nucleicos não está presente em um JCV do tipo selvagem.

Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o ensaio compreende contatar a amostra biológica com um anticorpo de JCV e avaliar a amostra quanto à presença de uma variante de JCV ou variante de peptídeo de JCV. Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o ensaio compreende contatar a amostra biológica com um peptídeo de JCV e avaliar a amostra quanto à presença de anticorpo de JCV. Em algumas modalidades dos métodos proporcionados aqui, o ensaio compreende realizar uma reação de PCR na amostra biológica e avaliar a amostra quanto à presença de uma variante de ácido nucleico de JCV.

Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o tratamento imunossupressor compreende administrar um fármaco imunossupressor. Em algumas das modalidades dos métodos proporciona- dos aqui, o tratamento imunossupressor compreende a administração de um anticorpo anti-VLA4. Em algumas das modalidades dos métodos proporcio- nados aqui, o fármaco imunossupressor é natalizumab.

Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, a variante de JCV suspeita de ter baixa ligação com o ácido siálico é uma variante de JCV que compreende uma ou mais mutações no sítio de ligação do ácido siálico do JCV. Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui a mutação no sítio do ácido siálico do JCV é L55F, K6OM, K60E, K6ON, N265D, N265T, S267L, S269F, S269Y ou S269C.

Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, abaixa ligação do ácido siálico da variante do JCV é mais baixa que a ligação do ácido siálico de WT JCV.

. Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados é aqui, o paciente necessita de tratamento com um fármaco imunossupressor : ou o paciente está sendo tratado com um fármaco imunossupressor.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método que com- preende obter uma amostra biológica de um paciente, ensaiar a amostra biológica quanto a um indício de uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação com o ácido siálico, em que o paciente é identificado como sendo suscetível à PML, se a amostra biológica contém um indício da variante de JCV.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método que com- preende obter uma amostra biológica de um paciente, ensaiar a amostra biológica quanto a um indício de uma variante de JCV suspeita de ter baixa de ligação ao ácido siálico, em que o paciente é identificado ou como i) apropriado para um tratamento imunossupressor se a amostra biológica não contém o indício da variante de JCB ou como ii) inapropriado para um trata- mento imunossupressor se a amostra biológica contém o indício da variante de JCV.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método que com- — preende monitorar um paciente que recebe um tratamento imunossupressor quanto a conter uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método que com- ] preende monitorar um paciente que está recebendo tratamento imunos- supressor quanto a um sinal de exposição ao JCV, e, se o sinal de expo- sição ao JCV é detectado, então o paciente é monitorado quanto a conter uma variantedeJCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico.

Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o monitoramento compreende periodicamente obter e ensaiar uma amostra biológica do paciente quanto a um indício da variante de JCV.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método compre- endendo obter uma amostra biológica de um paciente, ensaiar a amostra biológica quanto a um indício de JCV, em que se a amostra biológica contém e um indício de JCV, o paciente é periodicamente monitorado quanto à pre- à sença de uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico, é e em que se a amostra clínica não contém JCV, o paciente é periodicamente monitorado quanto à exposição ao JCV.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se um regime de tratamento para administrar um agente imunossu- pressor a um paciente deve ser determinado, em que o método compreende obter uma amostra biológica de um paciente, ensaiar a amostra biológica quanto a indício de uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico, em que o regime de tratamento deve ser modificado quanto ao paciente se a amostra biológica tem o indício da variante de JCV.

Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o regime de tratamento deve ser modificado por administração de uma dose menor do agente imunossupressor, substituir o agente imunossupres- sor com um agente imunossupressor diferente, ou interromper a adminis- tração do agente imunossupressor.

Em aspecto, a invenção proporciona um método que compre- ende administrar um primeiro fármaco imunossupressor a um paciente, e — monitorar se o paciente contém uma variante de JCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico. Em algumas das modalidades dos métodos propor- cionados aqui, a dosagem e/ou frequência de administração do primeiro fármaco imunossupressor são reduzidas se o paciente contém a variante de É JCV. Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o primeiro fármaco imunossupressor é substituído com um segundo fármaco imunossupressor se o paciente contém a variante de JOCV. Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o paciente é selecionado quanto a um sintoma de PML se o paciente contém a variante de JOCV. Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o paciente é tratado quanto à PML se o paciente contém a variante de JCV.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método de detectar um variante de JCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico, em que o método compreende interrogar uma amostra biológica de um paciente e usando um ensaio de alta sensibilidade específico para o indício de uma Ê variante de JCV suspeita de ter baixa ligação ao ácido siálico. Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o interrogatório com- —preende contatar a amostra biológica com um anticorpo que pode se ligar especificamente à variante de JCV. Em algumas das modalidades dos méto- dos proporcionados aqui o interrogatório compreende contatar a amostra biológica com um polipeptídeo da variante de JCV.

Em algumas das modalidades dos métodos proporcionados aqui, o interrogatório compreende contatar a amostra biológica com um ácido nucleico da variante de JCV.

Os aspectos da invenção incluem painéis de posições dos ami- noácidos VP1 do JCV em que as variações de sequências estão associadas ao risco de PML e/ou progressão da doença. Os métodos e composições são proporcionados para selecionar os pacientes para identificar indivíduos que tenham sido expostos a uma variante do vírus JC tendo variações de sequências associadas à PML, em uma ou mais posições de aminoácidos de VP1 em um painel.

Os aspectos da invenção podem ser usados para diagnosticar —PML, ou avaliar e/ou monitorar progressão, regressão, e/ou estado da doen- ça de PML em um paciente.

Certos aspectos da invenção se referem à avaliação dos trata-

mentos terapêuticos quanto à PML.

Outros aspectos da invenção se referem às vacinas contra va- riantes de vírus de JC associadas à PML.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minarse um paciente corre risco de ter leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC.

Em algumas modalidades, o ensaio interroga pelo menos uma posição de VP1 do JCV selecionada das posições 69, 74, 75, 113,117,128,134,158, 164, 223, 271, 321, 332, e 345 na tabela 1A quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é iden- oC tificado como estando em riso de, ou de ter, PML se uma variação de se- - quência está presente em uma ou mais das posições interrogadas. : Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minarse um paciente corre risco de, ou de ter, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC.

Em algumas modalidades, o ensaio interroga uma posição quanto à presença de uma variação de sequência.

Em algumas modalidades, a posição é a posição 164. Em algumas modalidades, o pa- ciente é identificado como estando em risco de, ou de ter, PML se a variação de sequência está presente na posição 164. Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se um paciente está em risco de, ou de ter, leucoencefalopatia muiti- focal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga nas oito posições VP1 de JCV selecionadas das posições na tabela 1A quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estandoem risco das posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para determinar se um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia muiltifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos posições VP1 do JCV selecionadas das posições na tabela 1A quanto à presença de uma variação de sequência, em que a variação de sequência é uma das seguintes: 55F, 60M, 60E, 61L, 66H, 66N, 69D, 748, 75R, 113L, 1178, 123C, 128A, 134G, 158L, 164K, 223A, 265D, 265T, 267F, 267L, 269F, 269Y, 271H, 321V, 332E ou 345K, e em que o paciente é identificado como estando correndo risco de, ou de ter, PML se uma variação de sequência está presente em um ou mais das posições interrogadas. Em algumas modalidades, mais que oito posições na tabela 1A - podem ser interrogadas. Em algumas modalidades 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, & 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 posições são interrogadas. é Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minarse um paciente está em risco de, ou ter, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos cinco posições VP1 do JCV selecionadas das posições na tabela 1B quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estando em risco de, ou ter, PML se uma variação de sequência está pre- sente em uma ou mais das posições interrogadas.

Em algumas modalidades, mais que cinco posições na tabela 1B podem ser interrogadas. Em algumas modalidades, seis ou sete posições sãointerrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se um paciente está em risco de, ou ter, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos quatro posições VP1 de JCV selecionadas das posições na tabela 1C quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estan-

do em risco de, ou ter, PML se uma variação de sequência está presente em ; uma ou mais posições interrogadas. Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos duas posições VP1 de JCV selecionadas das posições na tabela 1D quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estan- doemrisco de, ou ter, PML se uma variação de sequência está presente em uma ou mais das posições interrogadas.

a Em algumas modalidades, mais que duas posições na tabela 1D . podem ser interrogadas. Em algumas modalidades, 3, 4 ou 5 posições são é interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos duas posições VP1de JCV selecionadas das posições na tabela 1F quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estan- do em risco de, ou ter, PML se a variação de sequência está presente em uma ou mais das posições interrogadas.

Em algumas modalidades, mais que duas posições na tabela IF podem ser interrogadas. Em algumas modalidades, 3 ou 4 posições são interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende: ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos oito posições VP1 de JCV selecionadas das posições na tabela 1G, quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como esta : em risco de, ou tem, PML se a variação de sequência está presente em uma ou mais das posições interrogadas.

Em algumas modalidades, mais que oito posições na tabela IG podem ser interrogadas. Em algumas modalidades, 9, 10, 11, 12, 14, 14 ou 15 posições são interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológicade um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de um poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos uma posição "” VP1 de JCV selecionada das posições na tabela 1H quanto à presença de . uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estan- do em risco de, ou não tem, PML se a variação de sequência está presente emuma ou mais das posições interrogadas. Em algumas modalidades, duas posições na tabela 1H são interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra bio- lógicade um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos uma posição JCV- VP1 selecionada das posições na tabela 1H quanto à presença de uma variação de sequência, em que a variação de sequência é uma das seguin- tes 115E ou 277K, e em que o paciente é identificado em risco de, ou não tem, PML se a variação de sequência está presente em uma ou mais das posições interrogadas.

Em algumas modalidades, duas posições na tabela 1H são inter- rogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- —minarse um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia muitifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga posições em regiões sele- cionadas de VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estando em risco de, ou tem, PML se menos que um número selecionado de variações de sequências está presente nas posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelos menos as posições 55- 75 e 265-271 da VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de . sequência, em que o paciente é identificado como estando em risco baixo : de, ou não tem, PML se menos que duas variações de sequência estão presentes nas posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de um poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos as posições 55-75, 113-164,223,265-277 e 321-345 de VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estando em risco baixo de, ou tem, PML se menos que três variações de sequência estão presentes nas posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minarseo paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos as posições 55- 75, 113-164, 223, 265-277 e 321-345 de VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estan- do em risco baixo de, ou não tem, PML se menos que duas variações estão presentes nas posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- ' minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica do paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de — poliomavírus JC, em que o ensaio interroga a posição 164 e pelo menos outra posição no VP1 de JCV selecionada das posições na tabela 1A quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identi- ficado como estando em risco de, ou tem, PML se a variação de sequência está presente em uma ou mais das posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia muiltifocal : progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra ã biológica do paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga a posição 164 e pelo menos outra posição da VPI de JCV selecionada das posições na tabela 1A quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identi- ficado como estando em risco, ou tem, PML se a variação de sequência está presente em duas ou mais posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minarse um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica do paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga posições em regiões selecio- nadas de VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de sequência, e emqueo paciente é identificado como estando em risco de, ou tem, PML se o número de aminoácidos com uma característica específica presente nas posições interrogadas aumentou.

Em algumas modalidades, a característica especifica é não polaridade.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- —minarseo paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos as posições 55- À 75 e 265-271 da VP1 de JCV, quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estando em risco de, ou tem, PML se o número total de variantes de aminoácidos apolares (Gly, lle, ou Pro) ou variantes aromáticas (Phe, Tyr, ou Trp) nas posições interro- gadas aumentou.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica do paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos as posições 55-75, o 113-164, 223, 265-277 e 321-345 da VP1 de JCV quanto à presença de uma : variante, e em que o paciente é identificado como estando em risco de, o tem, PML se o número total de variantes de aminoácidos apolares ou variantes aromáticas nas posições interrogadas aumentou.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos as posições 55- 75 e 265-271 da VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de se- quência, e em que o paciente é identificado como estando em risco de, ou tem, PML se a uma ou mais variações de sequências nas posições interro- gadas resultam em aumento da área superficial apolar de 10 angstroms qua- —drados ou mais por variação de sequência.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a um polioma- vírusdeWVP1deJCV,em que o ensaio interroga posições em regiões sele- cionadas de VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estando em risco baixo de, ou não tem, PML se o número de aminoácidos com uma característica específica À presente nas posições interrogadas diminuiu. Em algumas modalidades, a característica específica é polaridade. Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minarseo paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos as posições 55- 75 e 265-271 da VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estando em risco de, ou tem, PML se o número total de variantes de aminoácidos polares (Ser, Thr, e Cys, Met, Asn, ou Gin), variantes positivamente carregadas (Lys, Arg, ou : His), ou variantes negativamente carregadas (Asp ou Glu) nas posições interrogadas diminuiu.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos as posições 55- 75,113-164,223,265-277 e 321-345 da VP1 de JCV quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estan- do em risco de, ou tem, PML se o número total de variantes de aminoácidos polares, variantes carregadas positivamente, ou variantes carregadas negati- vamente nas posições interrogadas diminuiu, Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que o ensaio interroga pelo menos as posições 55- 75 e265-2/71daWVP1 de JCV quanto à presença de uma variação de se- quência, e em que o paciente é identificado como estando em risco de, ou tem, PML se a uma ou mais das variações de sequência nas posições interrogadas resultam em decréscimo da área superficial polar de 10 É angstroms quadrados ou mais por variação de sequência. Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para interrogar posições da VP1 de JCV selecionadas quanto a variações de sequências emuma amostra biológica.

Em algumas modalidades, interrogar as posições da VP1 de JCV selecionadas quanto às variações de sequência compreende determi- nar a presença em uma amostra biológica de um ou mais anticorpos que se ligam especificamente a polipeptídeos compreendendo uma ou mais varia- ções de sequências de aminoácidos selecionadas do painel das tabelas 1A ou 1H. Em algumas modalidades, a presença de um ou mais anticorpos é o determinada por ligação específica aos polipeptídeos produzidos recombi- S nantemente, os quais compreendem a uma ou mais variações de sequên- f cias de aminoácidos. Em algumas modalidades, a presença de o um ou mais anticorpos é determinada por ligação específica a polipeptídeos produ- zidos sinteticamente, os quais compreendem a uma ou mais variações de sequências de aminoácidos. Em algumas modalidades, interrogar as posições da VP1 de JCV selecionadas quanto às variações de sequências compreende deter- minara presença na amostra biológica de um ou mais polipeptídeos compre- endendo a uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecio- nadas do painel das tabelas 1A ou 1H. Em algumas modalidades, a presen- ça de o um ou mais polipeptídeos é detectado por ligação específica dos polipeptídeos a um ou mais agentes de ligação de peptídeo. Em algumas modalidades, o agente de ligação de peptídeo é um anticorpo.

Em algumas modalidades, interrogar posições da VP1 de JCV selecionadas quanto a variações de sequências compreende determinar a presença em uma amostra biológica de ácidos nucleicos que codificam a uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecionadas do —paineldas tabelas 1A ou 1H. Em algumas modalidades, interrogar as posições da VP1 de JCV quanto às variações de sequências é realizado em uma amostra de sangue, fluido cerebroespinhal, soro, urina, esputo, medula óssea, cérebro, baço ou rim, ou outro tecido.

Em algumas modalidades, o método para determinar se um paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus JC, em que a exposição à variante de JOV compreende uma infecção corrente com uma variante de JCV. Em algumas modalidades, o método para determinar se o pa- ciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a e um indício de exposição a uma variante de um poliomavírus JC, a exposição : à variante de JCV compreende uma infecção anterior, ou a variante de JOV . não é detectável no sangue ou na urina do paciente.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minar se o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a uma variante de poliomavírus de JC, em que o ensaio interroga pelo menos duas posições daVWVP1dedJC selecionadas das posições na tabela IF quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estan- do em risco baixo, ou não tem, PML se nenhuma variação de sequência está presente em uma das posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para deter- minarse o paciente está em risco de, ou tem, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), em que o método compreende ensaiar uma amostra biológica de um paciente quanto a um indício de exposição a um polioma- vírus de JC, em que o ensaio interroga pelo menos duas posições da VP1 de JCV selecionadas das posições na tabela 1G quanto à presença de uma variação de sequência, e em que o paciente é identificado como estando em risco de, ou não tem, PML se nenhuma variação de sequência está presente em uma das posições interrogadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona kits para diagnosticar se o paciente está em risco de PML.

Em algumas modalidades, o kit para diagnosticar se o paciente está em risco de PML compreende um ou mais recipientes, em que cada recipiente contém um polipeptídeo que compreende uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecionadas do painel da tabela 1A, Tabela 17 e/ou Tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui, e o kit compreende ainda instruções para uso do polipeptídeo para determinar a presença de anticorpos que se ligam especificamente a estes polipeptídeos. Em algumas modalidades, o kit para diagnosticar se o paciente está em risco quanto à PML compreende um ou mais recipientes, em que ão cada recipiente contém um polipeptídeo que compreende uma ou mais va- . riações de sequências de aminoácidos selecionadas do painel da tabela 1B, ' e o kit ainda compreende instruções para usar o polipeptídeo para determi- nara presença de anticorpos que especificamente se ligam a estes polipep- tídeos.

Em algumas modalidades, o kit para diagnosticar se o paciente está em risco quanto à PML compreende um ou mais recipientes, em que cada recipiente compreende um polipeptídeo que compreende uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecionadas do painel da tabela 1C, e o kit compreende ainda instruções para usar o polipeptídeo para de- terminar a presença de anticorpos que se ligam especificamente a estes polipeptídeos.

Em algumas modalidades, o kit para diagnosticar se o paciente está em risco quanto à PML compreende um ou mais recipientes, em que cada recipiente contém um polipeptídeo que compreende uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecionadas do painel da tabela 1D, e o Kit compreende ainda instruções para usar o polipeptídeo para deter- minar a presença de anticorpos que se ligam especificamente a estes — polipeptídeos.

Em algumas modalidades, o kit para diagnosticar se o paciente está em risco quanto à PML compreende um ou mais recipientes, em que cada recipiente contém um polipeptídeo que compreende uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecionadas do painel da tabela 1F, e o kit compreende ainda instruções para usar o polipeptídeo para deter- minar a presença de anticorpos que se ligam especificamente a estes po- lipeptídeos.

Em algumas modalidades, o kit para diagnosticar se o paciente está em risco quanto à PML compreende um ou mais recipientes, em que cada recipiente contém um polipeptídeo que compreende uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecionadas do painel da tabela 1G,e o kit compreende ainda instruções para uso do polipeptídeo para determinar a presença de anticorpos que se ligam especificamente a estes o polipeptídeos. Em algumas modalidades, o kit para diagnosticar se o paciente ã está em risco quanto à PML compreende um ou mais recipientes, em que cada recipiente contém um polipeptídeo que compreende uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecionadas do painel da tabela 1H, e o kit compreende ainda instruções para usar o polipeptídeo para deter- minar a presença de anticorpos que se ligam especificamente a estes polipeptídeos.

Em algumas modalidades, o kit para diagnosticar se o paciente está em risco quanto à PML compreende um ou mais recipientes, em que cada recipiente contém um polipeptídeo que compreende uma variação de sequência de aminoácidos na posição 164, e o kit compreende ainda instru- ções para usar o polipeptídeo para determinar a presença de anticorpos que seligam especificamente a estes polipeptídeos.

Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para determi- nar o início, progressão ou regressão de PML em um paciente.

Em uma modalidade do método para determinar o início, pro- gressão ou regressão da PML em um paciente, o método compreende deter- minaronúmero de variações de sequências de aminoácidos em uma varian- te de VP1 de JCV em uma primeira amostra biológica obtida do paciente, determinar o número de variações de sequências de aminoácidos em uma variante da VP1 de JCV em uma segunda amostra biológica obtida do paciente em um momento depois que a primeira amostra foi obtida, com- parar o número de variações de sequências na primeira amostra com o número de variações de sequências na segunda amostra, em que um núme- romais baixo de variações de sequências na primeira amostra em compa- ração com o número de variações de sequências na segunda amostra indica o início ou progressão da PML no paciente, e em que o número mais alto de variações de sequências na primeira amostra em comparação com o número de variações de sequências na segunda amostra indica regressão daPML no paciente.

Em uma modalidade do método para determinar o início, pro- o gressão ou regressão da PML em um paciente, as variações de sequências S são selecionadas das posições na tabela 1A. f Em uma modalidade do método para determinar o início, prôy —gressão ou regressão da PML em um paciente, as variações de sequências são selecionadas das posições na tabela 1B.

Em uma modalidade do método para determinar o início, pro- gressão ou regressão da PML em um paciente, as variações de sequências são selecionadas das posições na tabela 1C.

Em uma modalidade do método para determinar o início, pro- gressão ou regressão da PML em um paciente, as variações de sequências são selecionadas das posições na tabela 1D.

Em uma modalidade do método para determinar o início, pro- gressão ou regressão da PML em um paciente, as variações de sequências são selecionadas das posições na tabela 1F.

Em uma modalidade do método para determinar o início, pro- gressão ou regressão da PML em um paciente, as variações de sequências são selecionadas das posições na tabela 1G.

Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão ou regressão da PML em um paciente, as variações de sequên- cias são determinadas comparando-se a variante da VP1 da JCV a uma VP1 da JCV do tipo selvagem.

Em uma modalidade do método para determinar o início, ' progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar se uma variação de sequência está presente na posição 164 em uma variante de VP1 de JCV em uma primeira amostra biológica obtida do paciente, determinar se a variação de sequência está presente na posição 164 na variante de VPi de JCV em uma segunda amostra biológica obtida do paciente em um momento depois de a primeira amostra ter sido obtida, em que ausência da variação de sequência na primeira amostra e a presença da variação de sequência na segunda amostra indica o início ou a progressão a PML no paciente, e em que a presença da variação de sequência na primeira amostra e ausência da variação de sequência na e segunda amostra indica a regressão da PML no paciente. É Em algumas modalidades do método para determinar o início, : progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende ainda monitoramento adicional do início, progressão, ou regressão da PML em um paciente por obtenção de variações de sequências de aminoácidos em VP1 de JCV nestas amostras, e comparar o número de variações de sequências nestas amostradas com o número de variações de sequências em um ou mais amostras.

Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o paciente é monitorado enquanto está sendo submetido a tratamento com um imunossupressor. Em algumas modalidades, o imunossupressor é natalizumab.

Em uma modalidade do método para determinar o início, pro- gressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV em uma primeira amostra biológica obtida do paciente, determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV em uma segunda amostra biológica obtida do paciente em um momento depois que a primeira amostra foi obtida, com- parara carga viral da primeira amostra com a carga viral da segunda amos- tra, em que uma carga viral inferior na primeira amostra comparada com a carga viral na segunda amostra indica o início ou progressão da PML no paciente, em que uma carga viral mais alta na primeira amostra em compa- d ração com a carga viral na segunda amostra indica regressão da PML no paciente.

Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, a variante de VPI de JCV compreende uma ou mais variações de sequências selecionadas das posições na tabela 1A. Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, a variante de VP1 e de JCV compreende uma ou mais variações de sequências selecionadas : das posições na tabela 1B. é Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, a variante de VP1 de JCV compreende uma ou mais variações de sequências selecionadas das posições na tabela 1C. Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, a variante de VP1 de JCV compreende uma ou mais variações de sequências selecionadas das posições na tabela 1D. Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, a variante de VP1 de JCV compreende uma ou mais variações de sequências selecionadas das posições na tabela 1D. Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, a variante de VP1 de JCV compreende uma ou mais variações de sequências selecionadas das posições na tabela 1F.

Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, a variante de VP1 deJCV compreende uma ou mais variações de sequências selecionadas das posições na tabela 1G.

Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, a variante de VP1 deJCV compreende uma variação na posição 164.

Em algumas modalidades do método para determinar o início, " progressão ou regressão da PML em um paciente, a carga viral da variante Ss de VP1 de JCV é comparada com a carga viral da VP1 de JCV do tipo . selvagem.

Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, em que o método compreende ainda o monitoramento adicional do início, progressão, ou regressão da PML em um paciente por obtenção de amostras adicionais do paciente em momentos mais tarde, determinar a carga viral da variante de VP1 de JCV nestas amostras, e comparar a carga viral nestas amostras com a carga viral em um ou mais amostras anteriores.

Em algumas modalidades do método para determinar o início, progressão, ou regressão da PML em um paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de VP1 de JCV, o paciente é moni- torado enquanto está sendo submetido a tratamento com imunossupressor. Em algumas modalidades, o imunossupressor é natalizumab.

Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para monitorar a resposta ao tratamento de PML no paciente.

Em algumas modalidades do método para monitorar a resposta ao tratamento de PML no paciente, o método compreende determinar o número de variações de sequências de aminoácidos em VP1 de JCV em uma primeira amostra biológica obtida do paciente, administrar o tratamento É de PML ao paciente, determinar o número de variações de sequências de aminoácidos na VP1 de JCV em uma segunda amostra, em que a segunda amostra é obtida do paciente depois do tratamento e em um tempo mais tardequea primeira amostra, e comparar o número de variações de sequên- cias de aminoácidos na primeira amostra com o número de variações de sequências de aminoácidos na segunda amostra, em que um número inte- rior das variações de sequências de aminoácidos na segunda amostra que na primeira amostra indica que o paciente está respondendo ao tratamento dePML Em algumas modalidades do método para monitorar a resposta . ao tratamento de PML no paciente, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de JCV em uma primeira amostra biológica Á obtida do paciente, administrar o tratamento de PML ao paciente, determinar a carga viral de uma variante de JCOV em uma segunda amostra, em que a segunda amostra é obtida do paciente depois do tratamento e em um tempo mais tarde que a primeira amostra, e comparar a carga viral da primeira amostra com a carga viral da segunda amostra, em que a carga viral inferior da segunda amostra que na primeira amostra indica que o paciente está respondendo ao tratamento de PML.

Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para selecio- nar um curso de tratamento de um paciente que tem ou é suspeito de ter PML.

Em algumas modalidades, o método para selecionar um curso de tratamento de um paciente que tem ou é suspeito de ter PML, o método compreende determinar o número de variações de sequências de aminoáci- dos em VP1 de JCV em uma amostra biológica obtida do paciente, comparar o número de variações de sequências com um número de controle de varia- ções de sequências, determinar o estágio da PML com base pelo menos em parte na diferença no número de variações de sequências na amostra em comparação com o número de controle das variações de sequências, e selecionar um curso de tratamento para o paciente, apropriado para o estágio de PML do paciente.

Em algumas modalidades do método para selecionar um curso de tratamento de um paciente que tem ou é suspeito de ter PML, o método compreende determinar a carga viral de uma variante de JCOV em uma amostra biológica obtida do paciente, comparar a carga viral com a carga viral de uma amostra de controle, determinar o estágio da PML com base pelo menos em parte na diferença da carga viral da amostra comparada com a amostra de controle, e selecionar um curso de tratamento para o paciente, apropriado para o estágio da PML do paciente.

Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para decidir ou auxiliar na decisão de interromper o tratamento do paciente com um ou mais o imunossupressores. : Em algumas modalidades do método para decidir ou auxiliar na É decisão de interromper o tratamento do paciente com um ou mais imunos- —supressores compreende determinar o número de variações de sequências de aminoácidos em VP1 de JCV em uma amostra biológica obtida do paciente, comparar o número de variações de sequências com um número de controle de variações de sequências, determinar a decisão de interrom- per o tratamento de um paciente com um ou mais imunossupressores com base pelo menos em parte na diferença no número de variações de sequências na amostra comparado com o número de controle de variações de sequências.

Em algumas modalidades do método para decidir ou auxiliar na decisão de interromper o tratamento de um paciente com um ou mais —imunossupressores compreende determinar a carga viral de uma variante de JCV em uma amostra biológica obtida do paciente, comparar a carga viral com uma carga viral em uma amostra de controle, determinar a decisão de interromper o tratamento de um paciente com um ou mais imunossupresso- res com base pelo menos em parte na diferença da carga viral na amostra em comparação com a amostra de controle. Em algumas modalidades do método para decidir ou auxiliar na decisão de interromper o tratamento de um paciente com um ou mais imu-

nossupressores, o imunossupressor é natalizumab. ] Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para identificar compostos terapêuticos candidatos.

Em algumas modalidades do método para identificar um com- posto terapêutico candidato, o método compreende contatar um polipeptídeo isolado que compreende uma ou mais variações de sequências de aminoáci- dos selecionadas do paciente da tabela 1A, tabela 17, e/ou Tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui, com um composto para deter- minar se o composto se liga ao polipeptídeo isolado, em que se o composto se liga ao polipeptídeo isolado, o composto é um composto terapêutico candidato. e Em um aspecto, a invenção proporciona também compostos : terapêuticos candidatos identificados por contatar um polipeptídeo isolado, : que compreende uma ou mais variações de sequências de aminoácidos selecionadas do paciente da tabela 1A, Tabela 17, e/ou Tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui.

Em algumas modalidades do método para identificar um com- posto terapêutico candidato, o método compreende determinar um número de variações de sequências de aminoácidos em VP1 de JCV em uma pri- meira amostra biológica obtida do paciente, administrar um composto, deter- minar o número de variações de sequências de aminoácidos em VP1 de JCV em uma segunda amostra biológica obtida do paciente em um tempo depois da administração do composto, em que se o número de variações de sequências de aminoácidos em VP1 em JCV na segunda amostra é menor quena primeira amostra o composto é um composto terapêutico candidato.

Em um aspecto, a invenção proporciona também compostos terapêuticos candidatos identificados por determinar um número de varia- ções de sequências de aminoácidos em VP1 de JCV em uma primeira amostra obtida do paciente, administrar um composto, e determinar o núme- rode variações de sequências de aminoácidos em VP1 de JCV em uma segunda amostra biológica obtida do paciente em um tempo depois da administração do composto.

Em algumas modalidades do método para identificar um com- É posto terapêutico candidato, o método compreende determinar uma carga viral de variante de JCV em uma primeira amostra biológica obtida do paciente, administrar um composto, determinar a carga viral de uma variante deJCVemuma segunda amostra biológica obtida do paciente em um tempo depois da administração do composto, em que se a carga viral na segunda amostra é menor que na primeira amostra, o composto é um composto candidato terapêutico. Em um aspecto, a invenção proporciona também compostos terapêuticos candidatos identificados por determinação da carga viral de uma variante de JCV em uma primeira amostra biológica obtida do paciente, e administração de um composto e determinação da carga viral de uma í variante de JCV em uma segunda amostra biológica obtida do paciente em : um tempo depois da administração do composto.

Em um aspecto, a invenção proporciona também vacinas que compreendem um polipeptídeo tendo uma variação de sequência em uma ou mais posições da VP1 de JCV selecionadas das posições na tabela 1A, Tabela 17, e/ou Tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui. Em algumas modalidades, a vacina compreende dois ou mais —polipeptídeos tendo uma variação de sequência em uma ou mais posições de VP1 de JCV selecionadas das posições na tabela 1h. Em algumas modalidades, a vacina compreende ainda um adjuvante.

Em um aspecto, a invenção proporciona também métodos para imunizar um paciente contra PML, em que o método compreende adminis- traruma vacina que compreende um ou mais polipeptídeos tendo uma varia- ção de sequência em uma ou mais posições de VP1 de JCV, selecionadas das posições na tabela 1A, Tabela 17, e/ou Tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui, Em um aspecto, a invenção proporciona também um anticorpo isolado que se liga especificamente a um polipeptídeo que tem uma variação de sequência em uma ou mais posições de VP1 de JCV selecionadas das posições na tabela 1A. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem 2, 3, 4,

5, ou mais variações de sequências nas posições de VP1 de JCV sele- i cionadas das posições na tabela 1A, Tabela 17, e/ou Tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui. Em algumas modalidades, o anticor- po é um anticorpo monocional. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo policlonal.

Em certas modalidades, o anticorpo se liga especificamente a uma partícula de VP1 que compreende pelo menos um polipeptídeo de VP1 que contém uma variação de sequência descrita aqui. Uma partícula útil de VP1 útil na invenção pode ser produzida usando-se métodos conhecidos da técnica, em geral por expressão de um polipeptídeo de VP1 recombinante, que compreende uma variante descrita aqui. Uma partícula de VP1 contém : pelo menos 2, 4, 10, 20, 30, 40 ou 50 polipeptídeos de VP1. Em algumas . modalidades, a partícula de VP1 compreende somente polipeptídeos de VP1 õ carregando uma variante. Em outras modalidades, a partícula de VP1 é uma partícula heterogênea que contém mais que uma sequência de polipeptídeos de VP1; por exemplo, mais que um polipeptídeo da variante ou pelo menos uma polipeptídeo da variante e pelo menos um polipeptídeo do tipo selva- gem.

A invenção engloba também uma sequência de ácidos nucleicos isolada, que codifica uma variante de polipeptíideo de VP1 (por exemplo, carregando uma ou mais variantes descritas nas Tabelas 1A-1H, Tabela 17 e/ou Tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui) ou um peptídeo de tal polipeptídeo, o polipeptídeo ou peptídeo inclui a região de ligação de ácido siálico de um polipeptídeo de Vp1. Em alguns casos, a invenção inclui tal sequência de ácidos nucleicos isolada, operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão heteróloga. A invenção inclui também vetores e células hospedeiras, transitórias ou estavelmente transfectadas contendo tais sequências de ácidos nucleicos. Métodos para produzir tais sequências, vetores, e células hospedeiras são conhecidos da técnica.

Cada uma das limitações da invenção pode englobar várias modalidades da invenção. É, portanto, antecipado que cada uma das limitações da invenção envolvendo qualquer um elemento ou combinações : de elementos pode ser incluída em cada aspecto da invenção. Esta inven- ção não está limitada em sua aplicação aos detalhes de construção e ao arranjo dos componentes estabelecidos na descrição a seguir ou ilustrados —nosdesenhos.A invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou de ser realizada em vários outros modos. Também, a fraseologia e a terminologia usadas aqui são para fins de descrição e não devem ser interpretados como limitativos. O uso de “incluir”, “compreender”, ou “ter”, “conter”, “envolver”, e suas variações aqui tem o significado de englobar os itens listados a seguir e seus equivalentes, bem como itens adicionais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS oC A figura 1 mostra a comparação de uma sequência de referência ' de VP1 de JCV com a sequência COA de SV40; Ô A figura 2 mostra um modelo de VP1 de JCV; A figura 3 mostra sequências de peptídeos de VP1; A figura 4 mostra uma distribuição filogenética de vírus associados à PML; A figura 5 mostra um modelo estrutural do complexo VP1 de JCV/ NeuNAc-(a2,3)Gal(b1,3)T(a2,6)-NeuNAc]-Glc-NAc tetrassacarídeo; A figura 6 mostra a qualidade das partículas similares a vírus; A figura 7 mostra que WT JCV se liga a alguns glicanos; A figura 8 mostra a estrutura de gangliosídeos selecionados e Sua capacidade de ligação ao WT JCV; A figura 9 mostra que as mutações F55 e F269 não são capazes deseligarem às NeuSAca(2-3) e a(2-6) glicanas; A figura 10 mostra a estrutura de gangliosídeos selecionados e a capacidade deles de se ligarem ao JCV mutante; A figura 11 compara a capacidade de WT e mutante para JCV de se ligarem a gangliosídeos; A figura 12 mostra que o JCV mutante é ainda capaz de se ligar às linhagens celulares gliais; A figura 13 mostra que os anticorpos de JCV mutante especí-

ficos podem ser distinguidos de um anticorpo de WT JCV; A figura 14 mostra um ensaio para distinguir anticorpos mutantes do WT; A figura 15 compara os anticorpos de JCV mutante e WT JCV quanto à capacidade deles de se ligarem a uma VLP de JCV mutante; A figura 16 compara anticorpos de JCV mutante e WT JCV quanto à capacidade deles de se ligarem uma VLP de JCV mutante. A figura 17 mostra que o paciente que tem o vírus mutante F269 desenvolve resposta de anticorpo contra o vírus WT, mas não contra o vírus mutante F269; A figura 18 mostra que o coelho (no topo) imunizado com VLP e não mutante leva o anticorpo para o sítio (S269, neste caso) que poderia ser . mutado; * A figura 19 mostra que níveis DNA do JCV no CSF mais altos foram encontrados em pacientes com mutação nas alças BC e HI que naqueles com mutações da alça DE ou sem mutações; A figura 20 mostra um modelo estrutural de complexo de VP1 de JCV/ NeuNAc—(a2,3)Galt(b1,3)—[(a2,6)-NeuNAc]-Glc-NAc tetrassacarídeo; e A figura 21 mostra que mutações específicas na PML da VP1 anula ou altera drasticamente a especificidade da proteína VP1 do capsídeo viral para gangliosídeos sialados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Os aspectos da invenção se referem a identificar e administrar a assistência médica de pacientes que estão em risco aumentado de leucoen- cefalopatia multifocal progressiva (PML). A PML pode ser causada por infecção com poliomavírus de JC (JCV) em humanos, particularmente em pacientes que estão com o sistema imunológico enfraquecido. Contudo, a PML não se desenvolve em todos os pacientes infectados com JCV tendo sistemas imunológicos enfraquecidos. De acordo com a invenção, somente certas variantes de JCV causam a PML. Em algumas modalidades, as variantes de JCV que têm ligação ao ácido siálico reduzida são particular-

mente prováveis de causarem a PML. Por conseguinte, os aspectos da É invenção se referem a métodos e composições para detectar a presença de variantes de JCV, as quais foram previstas como tendo ligação reduzida ao ácido siálico.

De acordo com os aspectos da invenção, e sem desejar estar ligado a qualquer teoria, uma variante de JCV que tem baixa ligação ao ácido siálico, em relação à ligação siálica de um JCV do tipo selvagem, tem ligação reduzida aos sítios periféricos (por exemplo, ácido siálico nas células periféricas, proteínas, açúcares, ou outras moléculas). Portanto, em algumas modalidades, essas variantes apresentam maior probabilidade de se disse- minarem para outras partes do corpo, por exemplo, para o SNC. Além disso, o de acordo com os aspectos da invenção, os pacientes com sistemas imuno- . lógicos saudáveis controlam a disseminação de certas variantes de JCOV com ' ligação ao ácido siálico reduzida. Contudo, em pacientes com sistemas imu- nológicos comprometidos, essas variantes são mais prováveis de evadirem o sistema imunológico e progredirem para PML.

Por conseguinte, os aspectos da invenção se referem a compo- sições e métodos para detectar a presença de variantes de JCV que são previstas como tendo baixa ligação ao ácido siálico (por exemplo, baixa ligação ou avidez) em relação à ligação do JCV normal ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, as variantes de JOV com uma ou mais mutações no domínio de ligação de ácido siálico de uma proteína do capsídeo de JCV são previstas como tendo propriedades de baixa ligação ao ácido siálico. Em algumas modalidades, as variantes específicas descritas aqui são previstas comotendo propriedades de baixa ligação ao ácido siálico.

De acordo com os aspectos da invenção, os pacientes que con- têm variantes de JCV com uma ou mais mutações que são previstas como reduzindo a ligação ao ácido siálico são identificados como tendo suscetibili- dade aumentada à PML (por exemplo, em comparação com um paciente — que não contém JCV ou tal variante de JCV), particularmente se seu sistema imunológico está comprometido. Por conseguinte, os pacientes que contêm uma variante de JCV de ligação ao ácido siálico reduzida estão correndo

.: risco de desenvolverem PML se eles foram tratados com fármaco imunossu- pressor (por exemplo, natalizumab ou outro fármaco imunossupressor). Em algumas modalidades, as mutações de JCV que estão associadas à suscetibiidade à PML em um paciente são as mutações nas posições 122,2,e66e deleções de aminoácidos 50-51, 123-125 e 126-134 na proteína VP1 do capsídeo de JCV.

Em algumas modalidades, as muta- ções de JCV que estão associadas à suscetibilidade à PML em um paciente são H122R, A2V, e D66G.

Em algumas modalidades, as mutações de JCV que estão associadas à suscetibilidade à PML em um paciente são H122R, A2V,ebD66G e 283]. Em algumas modalidades, um paciente é suscetível à PML se a proteína VP1 do capsídeo de JCV compreender uma substituição e de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 122, 2, 66, 55, 60, 265, : 267, e 269, ou uma ou mais deleções de aminoácidos 50-51, 123-125 e 126- ] 134. Os aspectos da invenção são úteis para auxiliar e/ou monitorar uma terapia para um paciente que necessita de tratamento imunossupressor (por exemplo, um paciente com esclerose múltipla, ou qualquer outra con- dição que possa ser tratada com um ou mais fármacos imunossupressores). Em algumas modalidades, os aspectos da invenção podem ser usados para identificar pacientes que são suscetíveis à PML antes de iniciar o tratamento imunossupressor.

Em algumas modalidades, os pacientes que estão rece- bendo o tratamento imunossupressor podem ser monitorados quando ao aparecimento de variantes de JCV que estão associadas ao risco aumen- tado de PML.

Em algumas modalidades, se um paciente é identificado com tendo uma variante de JCV com ligação reduzida ao ácido siálico, então o paciente i) não é tratado com fármaco imunossupressor, ii) é tratado com dosagem ou frequência baixa de administração do fármaco, e/ou iii) é moni- torado regularmente quanto a sintomas precoces da PML.

Se os sintomas da PML aparecerem durante o tratamento, o tratamento pode ser interrom- pidooua quantidade ou frequência da administração de fármaco pode ser reduzida.

Em algumas modalidades, um primeiro fármaco pode ser substituí- do pelo fármaco imunossupressor alternativo se um ou mais sintomas de

PML estão presentes.

Os aspectos da invenção podem ser usados para implementar os procedimentos de monitoramento dos pacientes. Em algumas modalida- des, os pacientes são primeiramente ensaiados para determinar se eles foram expostos ao JCV (por exemplo, por ensaio do soro do paciente quanto à presença de um anticorpo de JCV). Os pacientes que não foram expostos ao JCV são identificados como tendo risco baixo para PML. Contudo, em algumas modalidades, tais pacientes são monitorados periodicamente para determinar se ou quando eles são expostos ao JCV. Se sinais de exposição aoJCV são identificados em um paciente antes do tratamento ou durante o tratamento, então o paciente pode ser avaliado quanto à presença de uma e ou mais variantes de JCV associadas ao risco de PML (por exemplo, uma ou : mais variantes previstas como tendo ligação ao ácido siálico reduzida em : relação à forma normal ou do tipo selvagem de JCV). Os pacientes podem ser monitorados periodicamente quanto à presença de variantes de JCV associadas à PML. Caso de descubra que um paciente carrega uma ou mais variantes de JCV associadas à PML, então o paciente pode ser monitorado cuidadosamente quanto a sinais de PML, o tratamento do paciente é inter- rompido ou alterado, e/ou o paciente pode ser tratado com um ou mais fár- —macos profiláticos ou terapêuticos para ajudar a proteger o paciente da PML.

Em algumas modalidades, um paciente ou indivíduo é monito- rado diariamente, semanalmente, bissemanalmente, mensalmente, bimen- salmente, trimestralmente, duas vezes ao ano, anualmente ou a cada dois anos. Em algumas modalidades, o paciente ou indivíduo é monitorado quan- doo paciente ou indivíduo está se submetendo a tratamento com imunossu- pressores.

De acordo com os aspectos da invenção, uma variante de JCV pode ser prevista como tendo baixa ligação de ácido siálico (por exemplo, afinidade ou avidez) se a variante tiver uma ou mais mutações no pocket de ligação siálica da proteina VP1 do JVC. Em algumas modalidades, as mutações em qualquer uma ou mais dos aminoácidos que estão dentro dos 12 angstroms de uma molécula ligada na porção de ligação do ácido siálico pode ser prevista como afetando a ligação do ácido siálico. Uma lista de aminoácidos da VP1 dentro dos 12 angstroms de uma molécula ligada no pocket de ligação de ácido siálico é proporcionada na tabela 16 do exemplo

12. Por conseguinte, uma variante de JOV com uma mutação em um ou maisdestes aminoácidos podem ser identificados como sendo um candidato à ligação reduzida ao ácido siálico e, portanto, risco aumentado de causar PML.

De acordo com os aspectos da invenção, as diferentes sequên- cias de VP1 do JCV que ocorrem naturalmente podem ser usadas como sequências de referência normais ou do tipo selvagem se elas são prove- nientes de variantes de JCV que não estão associadas ao risco de PML, conforme descrição aqui. Exemplos de tais sequências de referência são .: descritos em mais detalhes aqui e, por exemplo, por Cubitt et al., Predicted É amino acid sequences for 100 JCV strains, Journal of NeuroVirology, 7: 339- 344, 2001, cujas sequências reveladas são aqui incorporadas a título de referência, na íntegra.

De acordo com os aspectos da invenção, as propriedades de ligação ao ácido siálico (por exemplo, afinidade ou avidez) de uma variante de JCV podem ser mensuradas usando-se qualquer ensaio adequado. Por exemplo, ligação de JCV e/ou de VP1 de JCV ao ácido siálico pode ser medida usando-se ensaios de hemaglutinação, ligação direta às moléculas imobilizadas (por exemplo, gangliosídeos, açúcares, glicoproteínas, etc.), ensaios de ligação com base em células (por exemplo, quando a ligação é detectada com anticorpos marcados usando-se citometria de fluxo), etc., ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a baixa ligação é mais que uma redução de 5 vezes na ligação (por exemplo, avidez ou afinidade) em relação à ligação de uma referência de JCV normal ou do tipo selvagem, conforme descrição aqui. Contudo, em algumas modalidades, a baixa ligação é mais que cerca de 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 ve- zes, 500 vezes, 1,000 vezes, 5,000 vezes, 10,000 vezes ou redução maior na ligação em relação a uma referência de JCV normal ou do tipo selvagem.

Por conseguinte, os aspectos da invenção se referem a determi-

nar se um paciente é suscetível de ter PML, devido à presença de uma variante de JCV associada à PML. Em algumas modalidades, essa informação pode ser usada para determinar se o paciente é adequado para o tratamento com um agente imunossupressor. Em algumas modalidades, essa informação pode ser usada para determinar se um paciente que está sendo tratado com um agente imunossupressor deve continuar o tratamento ou deve ser alterado para uma dosagem, regime, e/ou tipo de fármaco imunossupressor diferente. Em certas modalidades, a detecção de uma variante de JCV associada à PML em um paciente que está sendo tratado comum agente imunossupressor proporciona uma base para descontinuar o tratamento, pelo menos por um determinado período de tempo. í Os pacientes que estão sendo tratados com um agente imunos- " supressor podem ser monitorados periodicamente quanto à presença de É infecção por JCV. Em algumas modalidades, se é sabido ou identificado que o paciente tem infecção por JCV, o paciente pode ser periodicamente moni- torado quanto à presença de uma variante de JCV que é prevista como ten- do ligação reduzida ao ácido siálico.

Por conseguinte, a invenção proporciona métodos e composi- ções para determinar se um paciente está em risco de contrair leucoencefa- lopatia multifocal progressiva (PML) ou tem PML (por exemplo, PML no está- gio precoce). Em uma modalidade, uma amostra biológica de um paciente é interrogada quanto à exposição a uma variante do vírus JC tendo uma ou mais variações de sequências associadas à PML, por exemplo, uma ou mais variantes de sequências previstas como resultando em ligação ao ácido —siálico reduzida. Em algumas modalidades, uma pluralidade de posições de VP-1, pré-determinadas, específicas, é interrogada quanto ao seu estado mutacional. O padrão destas variações de sequências encontradas nas posi- ções específicas proporciona perfil de risco do paciente com respeito à PML. Em algumas modalidades, a invenção proporciona painéis de — posições de aminoácidos da VP1 de JCV em que as variações de sequên- cias estão associadas ao risco de PML e/ou progressão da doença de PML. Os métodos e composições são proporcionados para ensaio de amostras biológicas quanto a indícios de risco de PML.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos do vírus JC podem ser isolados e analisados para determinar se eles têm variações de sequências em uma ou mais posições pré-determinadas de VP-1. Contudo, em certas circunstân- cias,ovírusJC pode ser difícil de ser isolado de certas amostras biológicas obtidas de pacientes que têm baixas cargas do vírus JC, mesmo que elas tenham sido expostas ao vírus JC e possam ter uma infecção por vírus JC corrente.

No entanto, a exposição de um paciente a uma variante de vírus JC associada à PML pode ser inferida da presença, em uma amostra biológi- caobtidado paciente, de anticorpos (por exemplo, anticorpos séricos) contra um ou mais polipeptídeos da variante de VP1 de JCV associados à PML.

As sequências de JCV no cérebro de pacientes com PML são . tão variáveis que sequências de JCV idênticas nunca foram detectadas em À pacientes diferentes com PML (Yogo & Sugimoto, 2001). Contudo, os aspectos da invenção são baseados em uma análise de sequências de JCV de pacientes saudáveis e com PML e a identificação de um subconjunto de posições na sequência de VP1 nas quais as substituições de aminoácidos estão fortemente correlacionadas à PML.

Em um aspecto, a invenção proporciona diretrizes quanto a que posições na VP1 de JCV precisam ser interrogadas para se chegar a um perfil de risco para PML.

Em um aspecto, a invenção proporciona novos painéis de posições de aminoácidos da VP1, nas quais as variações de sequências são preditivas de risco de PML em um paciente infectado com a variante de JCV correspondente.

Os aspectos da invenção se referem a selecionar pacientes quanto à presença de sinais ou indícios de variantes de JCV com ligação reduzida ao ácido siálico.

Em algu- mas modalidades, os painéis de variações de sequências de JCV associa- das aos diferentes perfis de risco de PML são proporcionados nas Tabelas

1A-H e descritos em mais detalhes aqui.

JCV e VP1

Em algumas modalidades, as variações de sequências de JCV associadas à PML são encontradas em posições selecionadas na principal proteína (VP1) do capsídeo do JCV.

As sequências de muitas proteínas de

VP1 descritas na literatura foram analisadas para identificar um subconjunto de posições de VP1, em que as variações de sequências estão fortemente associadas à PML.

De acordo com a invenção, um aminoácido é identificado como mutante ou variante em uma posição específica na VP-1 se ele difere do aminoácido naquela posição em uma sequência de consenso ou outra sequência de referência (por exemplo, a sequência de um vírus arquétipo do tipo selvagem). Em algumas modalidades, a sequência de consenso quanto à proteína de VP1 de JCV de pacientes saudáveis é proporcionada por GenBank Nº % 37050849 (AAQ88264 mostrada como a sequência da VP1 da figura 1) A VP1 de JCV é conservada quando comparada com SV40 conforme mostrada na figura 1. Vários arquétipos diferentes de JCV foram e identificados.

Como usado aqui, um arquétipo é um JCV encontrado na urina s de indivíduos saudáveis.

Em algumas modalidades, a sequência da VP1 da É figura 1 é uma sequência de referência.

Em algumas modalidades, uma sequência de referência é um ou mais arquétipos de Zheng et al. (2005). Os três principais arquétipos são determinados pela região (arquétipo EU é encontrados nos povos de ancestrais europeus e os arquétipos CY e MY são encontrados nos povos de ancestrais asiáticos). Embora as variações de sequências associadas à PML tenham sido identificadas em compara- ções com uma sequência de “consenso”, vários arquétipos têm os mesmos aminoácidos nas posições identificadas como associadas à PML, e a inven- ção pode ser, portanto, praticada com base em comparações de sequências para quaisquer das sequências de arquétipos.

Em outras modalidades, os ensaios podem ser baseados na determinação de se um JCV tem um ou mais aminoácidos em certas posições sem realizar uma comparação com a sequência de referência.

Deve ser apreciado que os métodos para deter- minar a presença de certas sequências da variante de VP1 do JCV podem ser baseados na caracterização direta de ácidos nucleicos ou polipeptídeos de JCV isolados de um paciente.

Alternativamente, a presença de uma variante de JCV em um paciente (ou antes da exposição do paciente à variante de JCV) pode ser inferida por detecção de anticorpos de pacientes (por exemplo, anticorpos séricos) que são específicos para uma ou mais das sequências da VP1 de JCV. Deve ser apreciado que os aspectos da inven- ção também proporcionam comparar uma sequência de VP1 do JCV com outras sequências de referência. Contudo, mesmo que outras sequências de referência sejam usadas, uma análise pode envolver determinar a identidade deumaminoácidoem uma ou mais das posições de VP1 associadas à PML descritas aqui.

De acordo com a invenção, a análise das sequências das varian- tes da VP1 identificou várias regiões de “ponto quente” de variações de sequências associadas ao risco de PML. Em algumas modalidades, as variações de sequências que são indicativas de risco para PML estão loca- lizadas nas alças da superfície da proteina VP1. Essas posições podem ser o encontradas nas tabelas 1B-1D. Em algumas modalidades, o número total de variações de sequências em uma área específica da proteina VP1 pode ' ser indicativo de risco de PML (vide tabela 2). Em algumas modalidades, a presença de aminoácidos da variante em 2 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10 ou mais) das posições descritas aqui pode ser indicativa do risco de PML. A polaridade destas regiões pode ser indicativa de risco de PML e o risco de PML pode aumentar se os aminoácidos polares foram substituídos com aminoácidos apolares. Em algumas modalidades, uma perda de um aminoácido polar em qualquer uma ou mais das posições identificadas na tabela 1A ou tabelas 1B-1D resulta em um vírus JCV tendo associada aumentada à PML. Em algumas modalidades, a perda de aminoácido polar em qualquer uma das posições dentro de uma das regiões estruturais mos- tradas na figura 2 (por exemplo, dentro da região definida pelas posições 55- 750u265-271 das sequências de polipeptídeos da VP1 de JCV) resulta em um vírus JC tendo associação aumentada à PML. Similarmente, em certas modalidades, um ganho de aminoácido apolar em qualquer uma ou mais das posições identificadas na tabela 1A ou tabelas 1B-1D resulta em um vírus JCV tendo associação aumentada à PML. Também, em certas modalidades, um ganho de um aminoácido apolar em qualquer uma ou mais posições dentro de uma das regiões estruturais mostradas na figura 2 (por exemplo, dentro de uma região definida pelas posições 55-75 ou 265-271 da sequência de polipeptídeos da VP1 do JCV) resulta em um vírus JC tendo associação aumentada à PML.

A figura 2 mostra uma estrutura prevista de VP1 de JCV destacando as regiões onde certas posições de aminoácidos identificadas com sendo associadas à PML foram mapeadas para a estru- tura.

A estrutura prevista da proteina VP1 de JOCV é baseada na estrutura de cristal de proteína de revestimento SV40 e a similaridade de sequência entre as proteínas de JCV e de SV40. Análise das variações de sequências mostrou que um decréscimo do número de aminoácidos polares e/ou um aumento do número de aminoácidos apolares na área superficial da proteína VP1 resultaram em risco aumentado à PML (vide Exemplo 3). Em uma modalidade, um paciente está em risco de contrair PML, se uma variação de CG sequência em uma ou mais alças da superfície resultar em aumento da área á. superfície apolar de 10 angstroms quadrados ou mais por variação de sequência, ou um decréscimo na área superficial polar de 10 angstroms — quadrados ou mais por variação de sequência.

Embora a presente invenção não esteja limitada a um mecanismo específico, acredita-se que alterações na alça de superfície podem impedir que anticorpos se liguem à VP1 do JOV e/ou facilitem a interação de VP1 do JCV com seus receptores tais como carboidrato e/ou um receptor de proteína, tal como 5HT2A.

Alterações na alçade superfície da VP1 (por exemplo, aumento dos aminoácidos apolares ou área superficial e/ou aumento dos aminoácidos polares ou da área superficial) podem aumentar a afinidade da VP1 pelo receptor de células e facilitar a entrada viral e/ou infecção de uma célula hospedeira, ou certas células hospedeiras específicas importantes para a progressão de PML.

Painéis de variações de sequências Deve ser apreciado que interrogar uma posição pode compre- ender tanto determinar o aminoácido naquela posição como comparar aquele aminoácido com um aminoácido de referência (por exemplo, o aminoácido encontrado na variante do tipo selvagem/controle, por exemplo, —na sequência de consenso ou uma sequência de arquétipo). Deve ser apreciado que qualquer variação simples ou combina- ção de variantes pode ser indicativa de risco de contrair PML.

Deve ser apreciado que o número total de variantes presentes em certa região ou em um grupo selecionado de variantes interrogadas pode indicar risco de PML. Os aspectos da invenção se referem a proporcionar uma ou mais posições em uma sequência de aminoácidos de VP1 de JCV que correspondam às variantes de JCV que estão associadas ao risco de PML. Por exemplo, cada uma das posições mostradas na tabela 1A está associada ao risco de PML e qualquer ensaio adequado pode ser usado para detectar a presença de, ou indicadores (indícios) de exposição passada a, uma variante de JCV tendo uma variante de aminoácido em uma ou mais das posições selecionadas. Em algumas modalidades, um ensaio pode ser usado para detectar a presença de, ou exposição a, uma variante de JOV - tendo uma variante de aminoácido em duas ou mais posições selecionadas . das posições listadas na tabela 1A, em que a presença de a variante/va- riantes é indicativa da PML.

Em algumas modalidades, as mutações de JCV que estão as- sociadas à suscetibilidade à PML em um paciente são mutações nas posi- ções 122, 2, e 66, e deleções de aminoácidos 50-51, 123-125 e 126-134 na proteina VP1 do capsídeo do JCV. Em algumas modalidades, as mutações de JCV que estão associadas à suscetibilidade à PML em um paciente são H122R,A2V,e D66G. Em algumas modalidades, um paciente é suscetível à PML se a proteína do capsídeo VP1 do JCV compreender uma substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 122, 2, 66, 55, 60, 265, 267, e 269, ou uma ou mais deleções de aminoácidos 50-51, 123-125 e 125-

134.

Em algumas modalidades, as posições selecionadas são interro- gadas comparando-se o aminoácido presente naquela posição com o ami- noácido presente em uma referência. Se o aminoácido presente em uma posição selecionada difere do amincácido encontrado na referência, a posição é dita ser mutada. Por conseguinte, em alguns aspectos, a invenção — proporciona tabelas (por exemplo, bases de dados) contendo listas de va- riantes que estão relacionadas ao risco de PML. As bases de dados também proporcionam variantes e variantes que são protetoras de PML. Em algumas modalidades, qualquer variante encontrada em uma posição selecionada é indicativa de risco de PML. Em outras modalidades, as tabelas proporcionam grupos de variantes associadas à PML que podem ser interrogados como um grupo para chegar a um perfil de risco para PML, para um paciente, Deve ser apreciado que muitas das variantes identificadas na base de dados de referência não são muito comuns. Por exemplo, uma variante indicativa de risco de PML pode ser encontrada somente em 10% das amostras de uma pessoa conhecida como estando em risco de PML. Para se chegar a um perfil de risco para um paciente, pode haver necessidade de se inter- rogar mais que uma posição. Por conseguinte, em um aspecto, a invenção proporciona tabelas de grupos de posições e número de posições dentro E daquele grupo que necessita ser identificado para chegar a um perfil de risco : de PML. Em algumas modalidades, pelo menos 8 (por exemplo, 8, 9, 10 ou mais, ou todas) posições na tabela 1A precisam ser interrogadas para se chegara um perfil de risco de PML. Similarmente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10 ou mais ou todas as posições em qualquer uma das tabelas podem ser interro- gadas.

Os aminoácidos encontrados nas posições indicadas nas tabe- las podem ser indicativos de risco de PML por comparação do aminoácido comum aminoácido encontrado em uma referência. Por exemplo, na tabela 1A, o aminoácido do tipo selvagem (por exemplo, referência/consenso) na posição 55 é leucina (L). Em algumas modalidades, qualquer aminoácido encontrado na posição 55 que não seja a leucina é indicativo de risco de PML. Em algumas modalidades, uma variante particular está associada ao risco de PML. Por exemplo, a presença de fenilalanina (F) na posição 55 pode ser indicativa de risco de PML. Por conseguinte, o aparecimento de uma variante de aminoácido (por exemplo, Phe) na posição 55 pode ser indicativo do início ou progressão de PML. Similarmente, o aparecimento de uma ou mais outras variantes de aminoácidos descritas aqui para posições associadas à PML na VP1 pode ser indicativo do início ou progressão de PML. Em algumas modalidades, a presença de um aminoácido com uma característica particular pode ser indicativa do risco de PML. Por exemplo, a presença na variante de JCV de um aminoácido que é menos polar que o aminoácido encontrado na sequência de referência é indicativa de risco de PML. Além de ser indicativa de risco de PML, a variante encontrada em posições específicas podem ser usadas para determinar o início, progressão ou regressão em um paciente. Em algumas modalidades, as variantes encontradas em posições específicas permitem o monitoramento do trata- mento de um paciente, para PML. Em algumas modalidades, as variantes encontradas em posições específicas permitem a seleção de um tratamento de um paciente tendo ou suspeito de ter PML. Em algumas modalidades, os aminoácidos encontrados em posições amino específicas podem ser indicativos de serem protetores para = PML, por exemplo, identificando a pessoa como sendo de baixo risco para Ê desenvolver PML.

ás Deve ser apreciado que em algumas modalidades, o risco de contrair PML pode ser determinado sem comparar o aminoácido determi- nado em uma posição particular a uma sequência de referência. Por exem- plo, se em uma amostra a posição 55 é interrogada e o aminoácido encon- trado naquela posição é fenilalanina, então é determinado que o paciente está em risco de PML. Essa determinação pode ser feita sem comparar o aminoácido encontrado na posição 55 com uma referência do tipo selvagem. Deve ser apreciado que a invenção proporciona métodos para determinar tanto a existência atual como passada dos variantes de JCV. Um paciente que foi exposto a uma variante de JCV, mas que correntemente não pode ser identificado como estando infectado com aquela variante de JCV, pode ser determinado como estando exposto àquela variante de JCV por determinação da presença de indicadores para aquela variante de JCV. Um paciente pode desenvolver anticorpos contra qualquer agente estranho, inclusive vírus e bactérias, ao qual o paciente é exposto. A presença de um vírus, ou variante do vírus, em um paciente pode ser, portanto, diagnosti- cado pela detecção de qualquer anticorpo específico para aquele vírus ou variante de vírus. Se o vírus se replica e sofre mutação (e assim cria uma variante nova), o corpo desenvolverá novos anticorpos específicos para a versão mutada do vírus. Mesmo se uma variante de vírus específica não está mais presente no corpo, a exposição passada à variante pode ainda ser determinada pela presença do anticorpo. Por conseguinte, em uma modalidade, o status mutacional das variantes de JCV (tanto a exposição corrente como a passada) é determinado pela detecção da presença de anticorpos contra uma ou mais variantes específicas. Em uma modalidade, a presença de um anticorpo contra VP1 é determinada por ligação específica do anticorpo a um ou mais polipeptídeos compreendendo uma ou mais das variantes. Deve ser apreciado que os anticorpos podem ser determinados qualitativa e quantitativamente. Portanto, um ensaio de detecção de anticor- po da invenção facilita a determinação de todas as variantes virais às quais o paciente tenha alguma vez sido exposto e uma estimativa da carga viral S das variantes correntemente presentes no corpo através da quantificação : dos anticorpos específicos.

Em uma modalidade, as variantes de aminoácidos são detecta- das diretamente, por exemplo, a presença de variantes de vírus em um pa- ciente é determinada por determinação da presença de polipeptídeos com- preendendo uma ou mais variantes das variantes. Agentes são desenvolvi dos os quais podem ser ligar especificamente a um polipeptídeo particular.

Em algumas modalidades, esses agentes são anticorpos. Em algumas modalidades, as variantes são determinadas por determinação da sequência dos ácidos nucleicos que codificam as variantes. Uma amostra é obtida de um paciente e analisada quanto à presença de uma variante de vírus particular. Deve ser apreciado que as variantes de JCV específicas podem estar somente presente no cérebro e no fluido espinhal, ao passo que as variantes do “tipo selvagem” podem estar presentes em outros tecidos no mesmo paciente. A presença de polipeptídeos pode ser determinada por anticorpos específicos para estes polipeptídeos. O ensaio permitirá a deter- minação tanto da presença de variantes específicas como a quantificação destas variantes (a carga viral), além da razão da variante para tipo selva- gem pode ser determinada.

Deve ser apreciado que um agente imunossupressor pode aumentar a suscetibilidade de um paciente à progressão ou acesso de uma infecção microbiana latente ou à contração de uma nova infecção microbia- na. Em algumas modalidades, a infecção microbiana é infecção por JCV, que causou a PML. Por conseguinte, o risco de PML pode ser avaliado antes de iniciaro tratamento com um agente imunossupressor, durante a admi- nistração de um agente imunossupressor, ou avaliado depois da adminis- tração de um agente imunossupressor ou depois do tratamento imunossu- pressor ter terminado.

Em algumas modalidades, o risco de PML conforme determi- nado pelos métodos da invenção auxiliarão a decidir sobre tratamento com imunossupressores ou agentes imunossupressores. Em algumas modalida- des, o risco aumentado de PML, diagnosticado durante o tratamento com : imunossupressores pode sugerir uma modificação ou finalização do regime * de tratamento com imunossupressores.

2khL zu tt rTeEeovEo E Ss Neg a mm $ += 8 s E E o nl. Ss * als & 5 8 &| E + & 8 2 8 É. o mamas

Ê o E s -” — dao - vm ê sr o NONO NOR ON * o õ Ss & 56556 = a - — E Ss T Es) o =) e - o 2 3 es) E) õ E E & 2 6 E sm o e [NS] = E a« o PIO DIO Oo mm ; : Ea - Ss o ssnos À g sm o e a me nom 4º 2? 2 RP R22 2 s = els is o AE a co o a ACO o no: EFESSUPv ESC TREO OSS o” o 22 av

E OA - Se * el o 5 E E Ss 8 | 23 o o = & 8 2. | .- o NOS NO O 8 o - o => = s o E = os - mos e voo 8 > o 8 > É 8 8 8 BB 8SRA o Ss 2 - F- = S E s = o - = o £ = * o o DS ooo o = 8 a w = [E ES. x = 9 << sv 3) E = e: & E BlÊ o o o o ooo o = 2 o CÁ 2 &a $ 2 20220 ” &ã & SS N NéN QN AT = o x OD ZoN > =] o O à&| à - o = o o = S >) a 8 s 5 ee osrrP = o ”< > UU e... E 20 EU E Rn x 8 &S5S3 88 Ss 25 &ERNNS º eo q o o - mr o 8evo None Om O o dd = RS os e = E AEia e aNoSTtãÊô- o o EF rd ão BR Ro ma o * e RN Sm mm mm mm mm O o MOO NON IN o x o =) Ss ME u : ES =? ? - - = Tas o W W o So . et ok ek o SS De - O NS o o o : PN Soro + - ONO Ooo om = = = PP 2222 PRTFHEH TT = To too o x = Cos ravsaePpbrtu sun > 3Sox MS sy 6 vw se = -s= ss... o as Ss o & = o Sm emos o NS à SS SN W e ss o vo vsT S- 3 + PO -&R&oo 22000 oesr Pp a NO SSSbSbSB| E 8 8888 o uu Fo << x 83 8 - às 6 as o r e o N ob SO ro o o so S SO e <<: So - o mNN oOono o & e o dN N o TFT rosa q N Cm ON NOS NOS ON NOS NS T No NS SS TS Era > EP > o WO or mM AQ O TF o e o BD TEL = RESETAR E Ss SS RSS = FSLN E W NO ms

E 4 = UuU Sr 2AOvVxX Ss NT Ev fev v É co + - <s Bos SE SS 3) E & 8 8 8X o = ne 3

E FE o oo o AD ee FAO | = o ss . Wo mn õ Sõ SS Ss &e.no - Es & 1 2 DE 2 - * 2 as õ a TE o o o . e = 8 ss o OS O pio s Ff : = o - O o oe oo 2 = s EE 2? e a eos. o Eus e E are O no a E6s NT Er vê rios - vv o O = ov&S o FE SS E . DB 8 go 2 * > õ S sl & Õ e Ss e + ax o NS UN O 6 Ss Ss = = E a = o = = a x ço > S EA o O (O oO O o O É 8 s $$ && 8 oo 2 E E s Ss E Ss - > Ss o £ — RX o o 9 O oo Oo E &

FP s ge o 3 o [E E Sl. O = 8) e Ts: fa = OR o o oO o ooo o o = a o q s o a mam - * a ao NON N NT E. x O A er 3 E 8, s o = o 8 53) as8 8 sv 8 8EER

=

E ND f NT o OO TS f x o É St àaE 3 e 38 É o S q. 2 2 8X o o Ss = E = É o - = Fa & o 2 RO o O E SE E ” o = o SC Tv 2 5 3 SE - o 2 : : ás + a* nr mio

É * F - E Ç- - o = o = & E = = = 2 - = Rs ESFs ASAE oO o vp 8 ks) E e oO > 3 ES ãs 8 3 838 HR nº " A o + + EN) o N o -

TZ Ê z > É + T 1 ao

ES ”P z o a o Fx No 2 É 5 s 8 Ss e. Ss 5 õ E > o Ss z & A s o o o . o o o a 8 o 2 o ses , 3 al E Ss = sl F o o sc o o Ss PN SS à o

É ST SS

E zZ0z o o o De aa" ” Di Ao S SE SS Q Ns Ss

HO US E S&S Tó o 8 = IA: | = Ed 3 ss S 8 3) E rr o o Sô 2 8X 8". Trõs ã

E CNS = 3

SNENER

BEBES Ss A ” ES RR =Z

DA gs 3 Ss) PE 1222 . & 8 2 aF FP oRERo = E - : So NO Oo f W o $ enero Poe coyrn, Fr 2 Ss 2 E SST TS ao Ss SET fS e 3 = o 2 8 3 - & s Es o é o 2» 5) 8 ow momm -. o = = É — o o + Nr NO > 8 cs BRE ? * 8 8 88 o à 5 Ss Es É Ss e o É = Nr oosro o Ss FS ê : = Sl. O Ss 2 E = £ fga nm ocor.o o o = a

R STS SAS ê TT FR Eos err > la o ooo aj o — cole abeêes s 2 E su srrooxa *N NWA E SN O

BA e - É E RR o E - se 2 Ss & gg &à8ê = 2 o o É ol Fo o no É To S

E E o É es o” ra — 8 mm z ERES ns NONO NON ON ON sS õ ss SS S5ESB5 Ss u = — E Ss <ç E "o E E E 8 E 3 = Ss S 8 E S 8 6 E o : n = x SS o €$ So ooo Ss

E - NEMO us O O OD O O : = g = O oO o DO AO DA a =— 2 ? 2? e ee oeeeere 8 = a Ru Eu z o IZ2ZoOro 8 ESSE Ec Feesgo O o o o 2 = os o SRS SS Ss . B é ce eg * 8 3 S 2? É > S 3 3| E o 2 s O É 8 e. 4 so o NS a = bs os Ss io 2 E. o z * T AD am A A o g S É 8 8 8 8 8888 o 2 = = = = s ef ? Ss o > = o £ o = lo 5 Oo 6 2 a o & CN (S SS o o 2 Sl. ão > Bs ui 3 sl. õ is e = ol É O O OD O o OS O nen, Ss o > o o E É Qd E NR N NS NS

E R x PO wz2 yyv > — E nf O o o 5 e DO READ e 8 53 8: 8 s 8 8RXRTE x O 4 E dn > EX «38. CNE CE = o - o EF 5 o o RR ns F - NT Ss o o E cr ENO o O O NR mm A Ss 8 88 x o E or un u Ss SEE E * o me : SOR tr So o : No. - - oco no -. ee.

T To Te x OTIS ALrt uau a hÀ >xX xy TE So rTrs 25 hã s o F mw o SS o RS as e a = - DS o o o Ss Ss a 8 88 8 s 8 58 x Es + ce otFt o o 6 oo BO o o > DO SD a N NS TR TF SF eo FS > > o o Ou Neo à s 8 TES SE Se sã Q SN mM

SO > s

ES SS z | o = 2 É E o E Ss + els 8 &$&8& 853 ÉS, 8S8 Õõ 4 = os ese º os = £ ENtoQmRn o E Mm" NS o o = v o P É 5 SNS & w/o x 8 E o SS > z ft e o- õ o o E 8 õ 2 E o El - ed RE. Ss o 8 3 E E - & eos ess RrrSS . & - = = o ff . = E sms e Or qo . c e o s goes ” 2 So

E Z O xr wu S 2 8$28 = NON CQA Ss 2 2 = .e.388B8 o $$ A Oo 0 so é o 2 2 E: > S 5 ES) E E 8 = = 2 6 8 O. om assess o - ke) S — E Nec meo o FS STS QN &N >= = & $ SO o qa Oy é 8 88 2 NO O LA Es Rr 1 Ss E N 5 AN Ss - - => o E = * FT = oo Ss go o o ES 3 o = ss

E É a E E Neo RR Ss 8 g e * TST Sxr-o > TT TA al. 8 538 a? e ss

” E = uy) SS TzZzounro S NS o 8S- ev = e 45 Sã o o 2 o E set cóã. % Ss 3 S$) 3 S$ “5 &eSs : 8 0. o 2 RW o MA a A co an 2 - e 5 a Ea a 0 o cova s = = 8 Ss mm A A e oo ã * o o Dom GOD o - FR = o 8 ES z Q

E o 2 6 28 o E a Sa o Ss E * SI o e ol & . 3 e... É lx ss o PS ooo. : $ ã

E E - S WO à sol O OO DIO s o Z o go o mo mom moon 8 2? 2 Dee õ Fu EseuvuzZz o IZooXo = E SN = e Ss Ff e rd o o 2 e 2 =e0o388 - 5 & à S 5 & 8 eg? E > ss 8 sj SE o e o o o er * - o Nr (NO O mM PB” o = 8 E o a - ros eo oo o Z "o es o OD ONO O 1 O o s s BO à O O o o = s É o 3 í Ss * o o o oe ocooco - o o Ss > a. Ta. S <a: = e > o E dE o > SO O o ooo Ko = É s o o DADOS Sê * a & & & &&ãT Ss sz DO o ur E OO) sal sa mn ô &| 9 so = m >| à. E w 8 SR e

2 4< E o LR > x x >= Ss SO TS = o o Tt. o o Ss ns T—- o o E O sm o E o we DN o o o o Mw ON ar u u o. = = o . oo E nm nn o... e e o E - - oo o = z T = ez z a o SC nen oa XxX wo me SS e SS o o o o o e CENSS a —— — 7 TZ -.. SN o o a as o is s o o o so o. o o o seo e .o o o o eo o a ss a E NS as T T 7 SS ii Zz o o ox 8 QR& 8 Ss SOS Pa QN ES E ao s

E Dl É o E E 3 Ss) * 8 88: [E2:) 2 0X o 0o =

E

RR O O = 3 8 3

E >= S 8 8 = É É ee s 3 E 2 El: o E E) 8 x ; o & 8 E ff Roo - 3 o x: s = E + * O Oo . = v g 5 os . We .-.. o e "o =>

E E Bs à Ss 8 2 E o à a f Sra ss o 3 = g 22: > 8 s| E ÕO E SS. UNOS 9 o s -— E a Fo. & g o v e mn o 2 s Cc E UU XxX Ss 2 = s o Ss ko É ao vv £ 8 Ss o é ai o 2 : 3 3

SÊ T < a — —

[1] 8 a Soa

C É TT ” E>:+ Pl vir oj o E Ss aro

Tabela 2B: Amostras de PML Beans — — — Emegeenao | eq fmut tregião mento — Variantes AABB62680 gilz246607IgblAA = |5 1 347 128 A 134 G 164 K 321 V 332 E AATOSSIS giá7o7a33Bigbla —=j5 3 347 [1131 134 G 164 K265T32 E AATOSS25 gia7O7a3A4sigblA 1 1 37 b67TF AATOSS31 gita7O78352/9bjA — (1 T 347 55 F AATOSS37 gila7o7B3salabiA 4 347 jo N IBAEO2848 gi6s445541|dbll 4 3 246 [1131 134 G 164 K265 D IBAEO2849 gis445643/dbjl — 13 2 246 |55 F1MGIAMK IBAEO2850 gi6s445645)dbl — 4 3 246 f13L 134 G 164 K 265 D IBAED2851 gil68445647]dbjl 4 3 246 113 L 123 C 134 G 184 K IBAEO2852 gies445649/dbil — |3 2 246 134 G 164 K 269 F [BAEO2853 giss445651/dbil ja 3 246 113L 123 C 13 G1MK [BAEO2854 gi6s445653dbil —|3 2 246 55 F 134 G16K IBAEO2855 gilss445655Idbil 2 = 246 134 G164K IBAEO2856 gi6s445657Idbl 3 2 246 [134 G 164 K265 D AAB6OSSS gil1161322/9bjAAB o 134 fIV32E Parc AABSOSSA gi1161319/9bjAAB 2 o 1389 RI VE Pará - —jAMB62687 giza4esiIS|golaAB 6 2 347 |55 F 128 A 134 G 164 K 321 VIR E - AAB94036 gila735083|GbjAAB 4 q 37 BS F1IMGI3XAVI3RE IBAAD1965 gil425208dbjBAA 6 2 S47 128.4 1346 1469 K/ 269 FF 3217 V 32 E . —BAADIOGS gia25207kdbjiBAA jo 5 347 66 H75 R117S 134 G158L 164 K 32] V332 E 35 . IBAAD1967 gil425208dbi|BAA |8 4 347 117 S 134 G 158 L 164 K 267 L 321 V 332 E 345 K BAA01968 giá25208kdbilBAa lB 3 347 74 S 117 S 128 A 134 G 164 K 321 V 332 E 345 K IBAAO1969 gil425210ldbilBAA 6 =—3 347 [113L 134 G 164 K 269 F 321 VIR E IBAAD1970 gil425211)dbiiBAA |5 2 347 f113L 134 G 164 K 31 V3R E IBAAOSG36 gil5s8231JdbilBAA 5 = 2 347 f113L 134 G 164 K 3] V3R E BAAOS637 gis3s234kdbiBAA dB 3 347 f113L 134 G 164 K 269 F 321 V 32 E BAAOSE38 gilSs8238dbilBAA |5 2 347 [134 G 164 K 269 Y 321 V 32 E BAB11728 gilTaS436doiBA 8 3 347 [1131 134 G 164 K 269 F 31 VIE [BAB11734 gil9796443dbjiBA |5 2 347 [134 G 164 K 269 Y 321 V 332 E IBAEOO111 gils7oss154/dbjlB 8 3 347 4 S 117 S 128 A 134 G 164 K 321 V 332 E 35 K IBAEDO117 gil6/7968161IdbjlB j9 4 Sa7 [74 S 117 S 128 A 134 G 164 K 269 F 321 V 332 E 337 IBAEDO123 gile7ass1SSIdbilB jo 4 347 74 S 117 S 128 A 134 G 164 K 269 F 321 V 332 E 337 IBAEOO129 gil67968175/dbjlB ja 1 347 [134 G 164 K 321 V3R E IBAEDO135 gis7osS1S2kdbilB |5 2 347 61 L 134 G 164 K31 V3HXE IBAEOO141 gi67esS18SIdbjB | 4 1 347 [134 G 164 K 321 V 382 E IBAEO0147 gil67968204/dbjlB 5 2 347 [113L 134 G 164 K 31 V3XR E [BAEO0153 gi7a6s211)dbjB 6 3 347 f113L 134 G 164 K 269 Y 321 V3R E |BAEDO159 gils7968218/dbjlB —=6 3 347 60 M 113 L 134 G 164 K 321 V3R E |BAEOO0165 gile7968225 dbjlB 6 3 347 113 L 123 C 134 G 164 K 321 V3X2 E IBAEO0171 gils7ass232kdbjlB | 3 347 105 L 1238 C 134 G 164 K 321 V3R E [BAEO2837 gilss445619dbilB | = 246 134 G16MK IBAEO2838 gilss445621/dbilB |3 2 246 66 H 134 G1IMK [BAEO2839 gilss445623IdbjlB |3 2 246 |j66 H 134 GI164K IBAEO2840 gilss445625/dbilB = a 3 246 |j6O E 66 H134 G1I6MK IBAEO2841 gilss445627/dbilB la 3 246 [13L 134 G1I4 K267 F BAEO2842 gils445629dbilB la 3 246 60 M 134 G164K270H BAEO2843 gies445631 dbiB 3 2 246 66 H 13 G16MK IBAEO2844 gilss445633/dbilB ja 3 246 f13L 134 G 164 K 269 F IBAEO2845 gilss445635/dbilB ja 3 246 f13L 134 G 164 K267F [BAEO2846 gilss445637dbilB j3 1 246 3 GIMK2ZA IBAEO2847 gilss445639 dbjlB la = 3 246 69 D 134 G164K269F IPO3089 gi116626IsplPO308S9 8 = 37 js R 117 S 134 G 158 L 164 K 321 V 332 E 345 K IBAB11710 gil9796415|dblBAB j8 4 347 75 R 117 S 134 G 158 LL 164 K 321 V 332 E 345 K MAD Nelore medios 17 2a SR aaa area eee] Diagnósticos Por conseguinte, os métodos da invenção são úteis no aspecto de determinar se o paciente em está em risco de, ou tem, PML com base nos painéis e grupos de variante/variantes da invenção. O ensaio de uma amostra biológica de um paciente para verificar indício de exposição a uma variante de JCV permitirá determinar se a pessoa está em risco de, ou tem, PML, ou está infectado por uma variante de JCV associada à PML. A deter- minação de se o paciente foi exposto a, ou está infectado com, uma variante de JCV tendo uma variação de sequência em uma ou mais posições da VP1 descritas aqui permite a avaliação de se o paciente está em risco de PML (variantes nas posições de uma variante de JCV associada à PML são também referidas como variantes da invenção). Em um aspecto, a invenção proporciona correlações entre o status mutacional em posições pré-deter- minadas de uma variante de JCV e risco de PML. Em algumas modalidades, ' as variantes estão localizadas na proteína VP1 de JCV.

- Como usados aqui “diagnosticar” e “identificar” PML significam reconhecer se a pessoa correr risco de contrair PML, ou tem PML. O diagnóstico de se estar em risco de PML não está limitado à determinação das variantes nas posições indicativas da exposição a uma variante de JOV e pode ser combinado com métodos de diagnóstico rotineiros da técnica. Esses ensaios diagnósticos incluem, mas sem limitação, histopatologia, cito- metria de fluxo, citologia, ensaios patofisiológicos, incluindo MRI e tomo- grafia, ensaios neurológicos e ensaios bioquímicos. Detecção de DNA de JCV por PCR no CSF é o diagnóstico de teste de PML mais largamente aceito. Ele tem 99% de especificidade e 70% de seletividade. Na ausência de um resultado de PCR de JCV para CSF, pode ser realizada biópsia do cérebro. A detecção de DNA de JCV em tecido cerebral pode ser usada como diagnóstico positivo para PML. Ensaios bioquímicos incluem, mas sem limitação, análise de variantes que não nas posições predeterminadas, análise de genoma viral, análise de ELISA de proteínas específicas, conta- gem de plaquetas, etc. Aquele com conhecimento ordinário da técnica estará ciente de numerosos protocolos para diagnóstico e parâmetros que são rotineiramente usados na técnica. O diagnóstico cobre também a determinação da quantidade de variante de JCV (carga viral) e a razão da variante de JCV versus tipo selvagem de JCV em uma amostra e/ou paciente.

Métodos e/ou kits da invenção podem ser usados para selecio- nar paciente quanto a terem PML e estarem em risco de ter PML conforme indicado pela presença de variantes em posições predeterminadas indicati- vas da exposição a uma variante de JCV (as variantes da invenção), em que a presença de uma ou mais variantes da invenção está associada com estar em risco de PML.

Métodos da invenção podem ser usados para diagnosticar o risco quanto à PML ao avaliar as variantes da invenção em uma amostra de um paciente que foi exposto ou é suspeito de ter sido exposto a uma variante de JCV associada à PML. o A invenção, em alguns aspectos, inclui vários ensaios para . determinar se o paciente foi exposto a uma variante de JCV tendo uma ou mais variantes em posições específicas na proteina VP1. Métodos e ensaios da invenção podem ser usados para monitorar as alterações no status das variantes da invenção em uma amostra e/ou em um paciente com o tempo.

Além disso, os métodos da invenção podem ser usados para monitorar a quantidade de variante de JCV presente em um paciente com o tempo, através da obtenção de amostra múltipla do paciente em pontos de tempo diferentes.

Assim, os métodos da invenção podem ser usados para examinar alterações nas variantes da invenção ou/ou na quantidade da variante de JCV em um paciente ou amostra, com o tempo.

Isso permite monitorar o status mutacional em um paciente que é suspeito de correr o risco de desenvolver PML e também permite o monitoramento quantitativo em um paciente que se sabe que foi exposto a uma variante de JCV.

Detecção de ácidos nucleeicos, polipeptídeos e anticorpos de variantes de VP1 de JCV Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para a detec- ção de polipeptídeos e/ou anticorpos de variantes de VP1 de JCV que po- dem se ligar especificamente aos polipeptídeos de variante de JOV em uma amostra biológica (também referidos como polipeptídeos e anticorpos da invenção, respectivamente). Métodos para detectar polipeptídeos e anticor-

pos são bem conhecidos da técnica e a invenção não está limitada a qualquer método de detecção especifico. Além disso, os polipeptídeos e anticorpos podem ser detectados indiretamente, através da detecção de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos ou anticorpos da invenção. Métodos para a detecção de ácidos nucleicos são bem conhecidos da técnica e exemplos não limitativos são PCR, sequenciamento, análise de hibridização, análise com sonda e análise de microarray, que são todas abrangidas pela presente invenção. Exemplos não limitativos de métodos para a detecção de polipeptídeos e/ou anticorpos incluem sequenciamento de peptídeos, espectrometria de massa e ensaios imunossorventes (por exemplo, ligação do polipeptídeo a um anticorpo) e disposição de proteínas.

Ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISAs) são en- : saios bem conhecidos usados para a detecção de vários antígenos incluindo polipeptídeos. A invenção abrange qualquer ELISA que possa detectar a presença de polipeptídeos da invenção e qualquer ELISA que possa detec- tar a presença de anticorpos da invenção em uma amostra; Em uma modalidade, uma primeira etapa de ELISA compreende proporcionar um anticorpo primário específico para um polipeptídeo de VP1 de JCV ligado a uma placa de multipoços. A invenção não se limita às —placasde multipoços e os anticorpos podem ser imobilizados sobre qualquer superfície, inclusive contas e lâminas de vidro. A invenção também não se limita a anticorpos e qualquer fração de ligação a peptídeos, incluindo aptã- meros, fragmentos de anticorpos e pequenas moléculas são abrangidos pela invenção. A invenção abrange a determinação tanto qualitativa como quanti- tativa da presença de polipeptídeos da invenção. Em uma modalidade, os poços podem ser bloqueados usando-se um tampão que contém alta con- centração de proteína irrelevante tal como albumina sérica ou caseína. À etapa de bloqueio assegura que quaisquer áreas não revestidas da super- fície serão ocupadas com proteína não reativa, se necessário. Agente de — bloqueio em excesso é então removido por uma ou mais lavagens. Em algumas modalidades, ELISA é um ensaio multiplex e cada poço de uma placa de multipoços compreende um anticorpo específico para uma variante de polipeptídeo de VP1 de JVC específico.

Uma vez que a superfície foi bloqueada, a amostra contendo polipeptídeo de VP1 de JCV, ou a amostra a ser testada quanto à presença de um polipeptídeo de VP1 de JCV, pode ser contatada com o anticorpo primário e deixada incubar sob condições ou tempo adequados para permitir a ligação específica do polipeptídeo de VP1 de JCV ao anticorpo primário.

Tais condições e quantidade de tempo podem ser, por exemplo, temperatura ambiente por 3 a 4 horas, a 4ºC por 10 a 16 horas.

Amostra em excesso é então removida por uma ou mais lavagens.

Como etapa seguinte, um anticorpo secundário, também específico para o —polipeptideo de VP1 de JCV, é contatado com o complexo de anticorpo primário-polipeptídeo e deixado incubar sob condições e tempo adequados e para permitir ligação específica do polipeptíideo de VP1 de JCV pelo à: anticorpo secundário.

Tais condições e tempo podem ser, por exemplo, anticorpo em 1-10 microgramas/mL, temperatura ambiente, por 1 a 4 horas, e4ºCpor10a16 horas.

Em algumas modalidades, o anticorpo secundário é conectado a um marcador florescente ou a uma enzima metabolizante, permitindo a detecção de polipeptídeo de VP1 de JCV ligado.

Alternativa- mente, o polipeptídeo de VP1 de JCV ligado pode ser determinado conta- tando-se o anticorpo secundário com um anticorpo terciário marcado.

ELISA descrito acima é referido como ELISA sanduíche porque o polipeptídeo de VP1 de JCV é sanduichado entre os dois anticorpos (o anticorpo primário e o anticorpo secundário). Em algumas modalidades, a presença de anticorpos específicos para polipeptídeos de VP1 de JCV é determinada.

A invenção engloba tanto a determinação qualitativa como quantitativa da presença dos anticorpos da invenção.

A determinação da presença de anticorpos pode permitir a determinação tanto da infecção atual como passada.

Em alguns casos, o corpo humano desenvolverá um anticorpo contra um polipeptídeo estranho, tais como proteínas de JCV.

Mesmo se o próprio vírus (por exemplo, ácido —nucleico viral) não é mais detectado no corpo, os anticorpos contra o vírus podem ainda estar presentes, sendo, assim, um indicador da exposição ao vírus.

Em uma modalidade de um método para detectar anticorpos específicos para polipeptídeos de VP1 da variante de JCV, uma ou mais superfícies sólidas (por exemplo, placa de multipoços, conta ou lâmina) são proporcionadas, em que cada superfície tem uma variante única de VP1 de JCV imobilizada. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de VP1 de JCV são imobilizadas como partículas de JCV (por exemplo, proteínas de VP1 recombinantes que contêm uma ou mais variantes e que são automontadas para formar partículas que são imobilizadas, por exemplo, sobre a superfície de ensaio). Essas partículas podem conter uma ou mais das variantes descritas aqui (vide, por exemplo, as tabelas 1A-1H, tabela 17 e/ou tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui. ” Cada variante de polipeptídeo compreende uma ou mais das ó variantes das tabelas 1A-1H, tabela 17 e/ou tabela 18 e/ou uma ou mais ' outras variantes descritas aqui. Peptídeos múltiplos podem cobrir a dita uma ou mais variantes. Em uma modalidade, as combinações de variantes de polipeptídeo são ligadas à superfície sólida. Em algumas modalidades, a superfície sólida de uma placa de multipoços é proporcionada, em que cada poço compreende uma ou mais variantes. Em algumas modalidades, uma placa de multipoços compreende poços com peptídeos que cobrem todas as variantes aqui que são indicativas de risco de contrair PML. Uma amostra que compreende ou é suspeita de compreender um ou mais anticorpos que podem se ligar a uma variante de polipeptídeo de VP1 de JCV descrita aqui é contatada com os peptídeos imobilizados sob condições adequadas para que os anticorpos se liguem ao polipeptídeos de VP1 de JCV imobilizado. À presença dos polipeptídeos ligados é, subsequentemente, detectada através da ligação de um anticorpo secundário.

ELISAs da invenção não estão limitados às modalidades descritas acima, mas também englobam ELISAs competitivos e qualquer forma de ELISA que possibilite a detecção dos polipeptídeos e anticorpos da invenção. Início, Progressão, Regressão Métodos e/ou kits da invenção podem ser usados para obtenção de informação de prognóstico útil por proporcionar um indicador precoce do início, progressão, e/ou regressão da PML e/ou infecção com variante de JCV em um paciente, por exemplo, por obtenção de amostras em tempos sequenciais de um paciente e ensaiar tais amostras quanto à exposição às variantes de JCV da invenção.

Um paciente pode ser suspeito de ter PML ou pode se acreditar que não tem PML e no último caso, a amostra pode servir como linha de base para comparação com amostras subsequentes.

O início de uma condição é a iniciação das alterações com a condição em um paciente.

Tais alterações podem ser evidenciadas por sintomas fisiológicos.

Contudo, um paciente pode estar clinicamente assinto- mático.

Por exemplo, o início da PML e/ou infecção com JCV podem ser ” acompanhadas por um período no qual alterações patogênicas associadas à É PML podem ocorrer no paciente, embora sintomas clínicos possam não ser É evidentes neste momento.

A progressão da PML segue o início e é o avanço dos elementos patogênicos (por exemplo, fisiológicos) da condição, que po- dem ser ou não marcados por aumento dos sintomas clínicos.

Em contraste, a regressão da PML e/ou infecção com JCV podem incluir um decréscimo das características fisiológicas da condição, talvez com redução em paralelo dos sintomas, e podem resultar de um tratamento ou podem ser uma reversão natural da condição.

O início da PML e/ou infecção com JCV po- dem ser indicados por alteração das variantes nas posições interrogadas em amostras obtidas do paciente.

Por exemplo, se o número de variantes nas posições interrogadas for menor na primeira amostra de um paciente que em uma segunda ou amostra subsequente do paciente, isto pode indicar o início oua progressão da PML e/ou a infecção com JCV.

Em algumas modali- dades, a presença de somente uma variante pode ser indicativa do início ou da progressão da PML.

Em algumas modalidades, a variante está na posi- ção 164. Em uma modalidade particular, o aparecimento de uma variante de aminoácido (por exemplo, Lys) na posição 4 é indicativo do início ou da pro- gressãoda PML.

Em algumas modalidades, o início da PML e/ou da infec- ção com JCV é indicada por uma alteração na carga viral da variante de JOV e/ou razão da variante de JCV para tipo selvagem de JCV.

Em algumas modalidades, um aumento da carga viral é acompanhado por aumento do número de variantes.

A progressão e a regressão da PML e/ou infecção com JCV podem ser geralmente indicadas pelo aumento ou diminuição do número de variantes nas posições interrogadas na amostra do paciente, com o tempo.

Por exemplo, se o número de variantes é baixo em uma primeira amostra do paciente e níveis aumentados de variantes são determinados estarem presentes em uma segunda ou amostra subsequente do paciente, isto pode indicar a progressão da PML e/ou infecção com JCV, respectivamente.

Por exemplo, o número de variantes em certas posições pode aumentar, enquanto o número de variantes em outras posições pode diminuir, em que o ambas as variações são indicativas da PML e/ou da infecção com JCV.

Sã A progressão da PML e/ou infecção com JCV pode ser indicada também pelo aumento da carga viral de uma variante de JCV ou um aumen- to na razão da variante de JCV para o tipo selvagem de JCV, enquanto a regressão pode ser indicada por um decréscimo da carga viral de uma variante de JCV ou um decréscimo da razão da variante de JCV para o tipo selvagem de JCV.

O início, a progressão e a regressão podem ser determinados —porensaio de múltiplas amostras que são obtidas de um paciente em pontos de tempo diferentes.

Por exemplo, mesmo se um primeiro grupo de amostras retiradas em pontos de tempo diferentes não mostrar início, progressão ou regressão da PML, uma amostra adicional pode ser obtida e ensaiada quanto às variantes da invenção e comparada com amostras mais antigas para determinar se o início, progressão ou regressão está ocorrendo.

Em algumas modalidades, amostras adicionais são ensaiadas quando os regimes de administração de um ou mais imunossupressores é modificado.

Ensaios para o Tratamento da PML Os métodos da invenção podem ser também usados para ava- liara eficácia de um tratamento terapêutico de PML por interrogação sobre exposição a uma variante de vírus JC em um paciente, em vários pontos de tempo.

Por exemplo, o número de variantes indicativas da exposição a uma variante do vírus JC pode ser obtido antes do início de um regime terapêu- tico (ou profilático ou como tratamento de câncer ou condição pré-cance- rosa), durante o regime de tratamento, e/ou depois de um regime de trata- mento, proporcionando, assim, informação sobre a eficácia do regime no pa- ciente, Além disso, a abundância das variantes de JCV indicativas do risco de PML pode ser também monitorada com o tempo. Em algumas modali- dades, a quantidade da variante de JCV (carga viral) ou razão da variante de JCV para JCV do tipo selvagem pode proporcionar informação sobre a eficá- cia do regime no paciente. Os métodos da invenção podem ser usados para comparar as posições mutadas em duas ou mais amostras obtidas de um paciente em tempo diferentes. Em algumas modalidades, a amostra é obtida : de um paciente, um tratamento para PML é administrado ao paciente, e uma R amostra subsequente é obtida do paciente. Uma comparação das variantes f do paciente da invenção ou carga viral da variante de JC ou a razão da variante de JC para JCV do tipo selvagem é realizada em amostras obtidas em tempos diferentes e/ou em dias diferentes, proporcionando, assim, uma medição do status da PML do paciente, que pode ser usada para determinar a eficácia de qualquer tratamento para PML e/ou infecção com JCV, no paciente.

Como usado aqui, tratamento de PML engloba ambos os trata- mentos profiláticos e terapêuticos, e engloba tanto a prevenção como o tratamento da PML. Um paciente pode receber o tratamento de PML porque foi determinado que o paciente está em risco de PML ou alternativamente, o paciente pode ter PML. Assim, um tratamento pode reduzir ou eliminar totalmente a PML e/ou a infecção com JCV ou impedir que piore. “Avaliação de tratamento”, como usado aqui, significa a comparação de níveis de variantes de um paciente indicativas da exposição a uma variante de JCV ou a carga viral da variante de JCV em amostras obtidas do pacientes em diferentes tempos de amostra, por exemplo, pelo menos um dia de sepa- ração. Em algumas modalidades, o tempo para se obter a segunda amostra do paciente é de pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50 minutos depois de se obter a primeira amostra do paciente. Em certas modalidades, o tempo para

A+ 74/1161 se obter a segunda amostra do paciente é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48, 72, 96, 120 horas ou mais, depois de se obter a primeira amostra do paciente.

Em algumas modalidades, o tempo para se obter a segunda amostra do paciente é de pelo menos 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 41, 49, 56, 90, 120, 150, 180, 230 dias ou mais depois de se obter a primeira amostra do paciente.

Tratamento de PML Em uma modalidade, um agente terapêutico para o tratamento de PML é um agente anti-infeccioso.

Um agente terapêutico pode ser um agente anti-infeccioso que trata infecção microbiana, por exemplo, um e agente terapêutico que é eficaz para tratar infecção do SNC.

Em algumas modalidades, o agente anti-infeccioso pode ser um siRNA.

Contudo, outros : agentes anti-infecciosos podem ser usados.

Os agentes anti-infecciosos po- dem ser agentes antimicrobianos tais como agentes antivirais.

Os agentes antivirais podem ser combinados com agentes anti-infecciosos adicionais, tais como agentes antifúngicos ou agentes antibacterianos.

Os agentes tera- pêuticos da invenção podem ser naturais ou moléculas ou compostos sinté- ticos.

Um agente terapêutico útil nos métodos e composições da invenção pode ser um polipeptídeo, um produto químico, uma molécula pequena, lipídio, ácido nucleico, ou outro composto.

Exemplos de ácidos nucleicos, que podem ser usados como agentes terapêuticos (por exemplo, agentes anti-infecciosos) nos métodos e composições da invenção são pequenas moléculas de RNA de interferência (siRNA), DNA antissentido, RNA antissentido, ou aptâmeros que podem ser usados para prevenir e/ou tratar uma doença ou distúrbio do SNC, inclusive PML.

Um “pequeno RNA de interferência” ou “siRNA”, como usado aqui, se refere a uma molécula de RNA que pode ser derivada da clivagem sucessiva de um RNA de fita dupla (dsRNA) dentro de uma célula para produzir uma — molécula de RNA.

Um siRNA eficaz tem, geralmente, comprimento de entre 15 e 30 nucleotídeos, e, mais frequentemente, entre 20 e 25 nucleotídeos.

Os siRNAs funcionam para direcionar a destruição dos alvos do MRNA

E 75/161 correspondente durante a interferência do RNA nos animais.

Os métodos da invenção incluem, em parte, a administração das moléculas de siRNA para tratar doença ou distúrbio do SNC (por exemplo, infecção do SNC) em associação com uma variante do vírus JC.

Em alguns aspectos, os métodos da invenção podem incluir administrar a um paciente uma composição terapêutica que inclui um siRNA e/ou um siRNA precursor como tratamento para doença ou condição do SNC.

Uma molécula de siRNA precursor é uma molécula de RNA de fita dupla que, depois da administração, pode ter seu tamanho reduzido, por exemplo, pela enzima Dicer, para formar o sSIRNA pretendido, este então se tornando funcional para tratamento com RNAi de uma doença ou condição do SNC.

Assim, os métodos da invenção podem e incluir a administração de um siRNA ou uma molécula de siRNA precursor | para tratar uma doença ou condição do SNC.

R Seleção de Tratamento Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para auxiliar a selecionar o tratamento para um paciente com PML ou em risco e PML.

A seleção do tratamento para PML pode se basear na determinação das variantes indicativas da exposição a uma variante de JCV.

A seleção do tratamento pode ser também baseada na quantidade de variante de JCV em uma amostra (carga viral) ou na razão de variante de JCV para JCV do tipo selvagem.

Os métodos para selecionar o tratamento podem ser úteis para avaliar e/ou ajustar o tratamento dos pacientes que já estão recebendo um fármaco ou terapia para PML.

Com base nas variantes encontradas que são indicativas da exposição a uma variante de JCV, pode ser apropriado alterar um regime terapêutico para um paciente.

Por exemplo, a detecção de uma alteração em uma ou mais das posições indicativas da exposição a uma variante de JCV no paciente, que tem recebido ou está recebendo tratamento para PML ou para JCV, pode indicar que o regime de tratamento deve ser ajustado (por exemplo, a dose ou frequência de dosa- gem aumentada, novo tratamento iniciado, etc.). Em algumas modalidades, a alteração da carga viral de uma variante de JCV ou razão de variante de JCV para JCV do tipo selvagem pode indicar que o regime de tratamento hu 76/161 deve ser ajustado.

Em algumas modalidades, o paciente pode estar livre de qualquer tratamento presente para PML e/ou para infecção com JCV e o monitoramento das variantes nas posições indicativas de exposição à variante de JCV e/ou carga viral da variante de JCV e/ou a razão da variante de JCV para o tipo selvagem de JCV pode identificar o paciente como candidato para o tratamento para PML e/ou para infecção com JCV.

Assim, os pacientes podem ser selecionados e tratados com níveis elevados dos mesmos fármacos ou com terapias diferentes como resultado dos ensaios para indícios de exposição a uma variante de JCV e/ou uma carga viral da variante de JCV e/ou uma razão de variante de JCV para o tipo selvagem de JCV. . De acordo com a presente invenção, alguns pacientes podem é. estar livres de sintomas que de outro modo exigiriam o tratamento com uma terapia particular, e a detecção de indícios de exposição a uma variante de JCV e/ou a uma carga viral de uma variante de JCV e/ou uma razão de variante de JCV para o tipo selvagem de JCV pode identificar o paciente como necessitando de tratamento.

Isso significa que a ausência do uso dos métodos da invenção para identificar indícios de exposição a uma variante de JCV e/ou uma carga viral de uma variante de JCV e/ou uma razão de variante de JCV para o tipo selvagem de JCV, o paciente não teria, de acordo com a convenção, a partir da data do depósito do presente pedido, sintomas que exigissem o tratamento com uma terapia particular para PML e/ou para infecção com JCV.

Em um aspecto a invenção proporciona métodos para a decisão sobre regimes de tratamento para PML.

O clínico pode decidir sobre as opções de tratamento pelo menos em parte baseado nos ensaios de diag- nóstico da invenção.

Tratamento relacionado a imunossupressores Os métodos para selecionar tratamento podem ser úteis para pessoas que estão sendo submetidas a tratamento não direcionado à PML ou à infecção com JCV, mas direcionado a uma condição diferente.

Em uma modalidade, o tratamento é um tratamento que compreende imunossupres-

sores. Em algumas modalidades, uma pessoa suspeita de estar em risco de desenvolver PML é uma pessoa que está se submetendo a tratamento com imunossupressores. Em algumas modalidades, a detecção de uma alteração em um oumais indícios de exposição a uma variante de JCV em um paciente que tenha recebido ou está recebendo tratamento não direcionado à PML pode indicar que o regime de tratamento deve ser ajustado. Em algumas moda- lidades, a detecção de uma alteração em um ou mais indícios de exposição a uma variante de JOV em paciente que tem recebido ou está recebendo tratamento com imunossupressores pode indiciar que o regime de tratamen- to deve ser ajustado. Em algumas modalidades, a detecção de alteração na e. carga viral de uma variante de JCV ou na razão da variante de JCV para o . tipo selvagem, em um paciente que recebeu ou está recebendo tratamento , com imunossupressores, pode indicar que o regime de tratamento deve ser ajustado. Em algumas modalidades, a detecção de uma alteração de sequência em uma ou mais posições da VP1 predeterminadas de um JCV em um paciente, que tenha recebido ou que está recebendo tratamento com imunossupressores, pode indicar que o regime de tratamento deve ser finalizado ou interrompido. Em algumas modalidades, o imunossupressor é natalizumab. Em algumas modalidades, a detecção de um aumento da carga viral de uma variante de JCV e/ou a razão da variante de JCV para o tipo selvagem de JCV em um paciente que tenha recebido ou que está recebendo tratamento com imunossupressores pode indicar que o regime de tratamento deve ser terminado ou interrompido.

Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para decidir sobre regimes de tratamento. O clínico pode tomar decisões sobre opções de tratamento, pelo menos em parte, com base nos ensaios de diagnóstico da presente invenção. Em algumas modalidades, os métodos da invenção proporcionam um ensaio de diagnóstico para que sejam tomadas decisões sobre o tratamento adequado com agentes imunossupressores. Em algumas modalidades, o clínico pode decidir se termina ou interrompe o tratamento com agentes imunossupressores com base no resultado de um ou mais ensaios de diagnósticos para VP1 de JCV da invenção.

Em algumas modalidades, os métodos da invenção proporcionam um ensaio de diagnós- tico para o tratamento de um paciente, em que o paciente está imunocom- prometido.

Em algumas modalidades, o clínico pode decidir se termina ou interrompe o tratamento do paciente imunocomprometido com base no resultado de ensaios de diagnóstico para VP1 de JCV da invenção.

Pacientes imunocomprometidos ou pacientes que estão sendo submetidos a tratamento com imunossupressores Os ensaios da invenção podem ser particularmente úteis para pacientes imunocomprometidos e/ou paciente que estão sendo tratados com um ou mais imunossupressores. e Os pacientes podem receber o tratamento com um ou mais . agentes imunossupressores (também denominados de imunossupressantes) , direcionados a doenças ou condições diferentes, incluindo um ou mais dos seguintes exemplos não limitativos: câncer, transplante dos órgãos ou de tecido, condições ou doenças inflamatórias, esclerose múltipla (MS), artrite, etc., ou qualquer combinação destes.

Os pacientes podem ser também imunocomprometidos.

Exem- plos não limitativos de pacientes imunocomprometidos são pacientes positivos para HIV ou têm AIDS ou linfoma ou qualquer outra condição que resulta na supressão da imunorresposta.

O termo “agente imunossupressor”, como usado aqui, refere-se a substâncias que agem para suprimir ou mascarar o sistema imunológico do paciente que está sendo tratado aqui.

Os agentes imunossupressores — podem ser substâncias que suprimem a produção de citocinas, infrarregulam ou suprimem a expressão autoantigênica, ou mascaram os antígenos MHC.

Exemplos de tais agentes incluem pirimidina 2-amino-6-aril-5-substituídas (vide a Patente US 4.665.077); fármacos anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs); ganciclovir, tacrolimus, glicocorticoides tais como cortisol ou —aldosterona, agentes anti-inflamatórios tais como inibidor de ciclooxigenase, inibidor de 5-lipoxigenase, ou antagonista de receptor de leucotrieno; anta- gonistas de purina tal como azatioprina ou micofenolato mofetil (MMF);

agentes alquilantes tais como ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapso- na. Glutaraldeído (que mascara os antígenos MCH, conforme descrição na Patente US 4.120.649); anticorpos anti-idiotípicos para antígenos MHC e fragmentos de MHC; ciclosporina A; esteroides tais como corticosteroides ou glicocorticosteroides ou análogos de glicocorticoides, por exemplo, predniso- na, metilprednisolona, e dexametasona; inibidores de di-hidrofolato redutase tal como metotrexato (oral ou subcutâneo); hidroxicloroquina; sulfasalazina; leflunomida; citocina ou antagonistas de receptor de citocina incluindo anticorpos anti-interferon-alfa, beta ou gama, anticorpos anti-fator alfa de necrose tumoral (infliimabe ou adalimumabe), imuno-ahesina anti-TNF alfa (etanercepte), anticorpos anti-fator beta de necrose tumoral, anticorpos anti- o interleucina-2 e anticorpos receptores de anti-IL-2; anticorpos anti-LFA-1, À incluindo anticorpos anti-CD11a e anti-CD18, anticorpos anti-CD20 (por " exemplo, rituximabe, por exemplo, disponível sob a marca RITUXAN); anticorpos anti-L3T4; anticorpos anti-VLA-4 (por exemplo, natalizumab, por exemplo, disponível sob a marca TYSABRI), globulina anti-linfócito heteró- loga; anticorpos pan-T, por exemplo, anticorpos anti-CD3 ou anticorpos anti- CDA4/CD4a; peptídeo solúvel contendo domínio de ligação de LFA-3 (WO 90/08187 publicado em 26 de julho de 1990); estreptoquinase; TGF-beta; estreptodomase; RNA ou DNA do hospedeiro; RS-61443; desoxispergalina; rapamicina; receptor de células T (Cohen et al, Patente US 5.114.721); fragmentos de receptor de células T (Offner et al., Science, 251: 430432 (1991): WO 90/11294; laneway, Nature, 341: 482 (1989); e WO 91/01133); e anticorpos de receptores de células T (EP 340.109) tal como T10B9. Contudo, os pacientes que estão recebendo outros agentes imunossupres- sores podem ser selecionados para ensaios de diagnóstico e/ou tratados, já que a invenção não está limitada a este respeito.

Seleção de agentes terapêuticos candidatos A invenção engloba também métodos para selecionar agentes terapêuticos candidatos ou estratégias para prevenir e/ou tratar PML e/ou infecção com JCV. A avaliação de eficácia dos agentes terapêuticos candidatos e as estratégias podem ser feitas usando-se ensaios da invenção em pacientes (por exemplo, animais não humanos) e em células de cultura. Em algumas modalidades, um agente terapêutico candidato pode ser um composto ou molécula que pode interagir com um polipeptídeo que compre- ende uma ou mais variantes de VP1 de JCV associadas à PML. Em algumas — modalidades, um agente terapêutico candidato pode ser um composto ou molécula que pode alterar o padrão e o número de variantes de VP1 de JOV em um paciente tendo infecção com JVC. Em algumas modalidades, um candidato terapêutico é um agente que pode reduzir a quantidade de variante de JCV (carga viral) em uma amostra ou paciente. Em algumas modalidades, um agente terapêutico candidato é um agente que pode reduzir a razão de variante de JCV para JCV do tipo selvagem. Em algumas . modalidades, o agente terapêutico candidato é um agente (por exemplo, À molécula pequena) que mimetiza o receptor de JCV e pode competir para a f ligação de JCV. Em algumas modalidades, a administração ao paciente de um agente, ou exposição de uma amostra ao agente candidato ou trata- mento candidato, resultará em alteração do padrão das variantes de VP1 de JCV associadas à infecção com JCV de um paciente. Em algumas modali- dades, administrar ao paciente um agente, ou expor uma amostra ao agente candidato ou ao tratamento candidato, resultará na alteração do número de variantes de VP1 de JCV associadas à PML na infecção por JCV. Em algumas modalidades, administrar ao paciente um agente, ou expor uma amostra ao agente candidato ou ao tratamento candidato, resultará na redu- ção da carga viral de JCV e/ou da razão de variante de JCV para JCV do tipo selvagem.

Em uma modalidade, uma amostra que compreende células que expressam uma variante de JCV é exposta a um agente terapêutico ou tratamento candidato. Uma amostra compreendendo células expostas ao candidato, que não expressam a variante de JCV, funcionará como controle. O nível de expressão da variante de JCV (carga viral) é monitorado mediante administração do agente terapêutico ou tratamento candidato, e a alteração da expressão da variante de JCV é comparada com as amostras não foram tratadas com o agente terapêutico candidato. Se o nível de carga viral da variante de JCV da invenção na amostra que foi exposta ao agente foi alterado em comparação com a amostra de controle, o agente é um agente terapêutico candidato ou tratamento candidato.

Em algumas modali- dades, as variantes de JCV são expressas e secretadas de células e subme- tidas ao contato com o agente candidato.

Qualquer agente candidato que se ligar à variante de JCV é um agente terapêutico candidato.

Em algumas modalidades, o agente terapêutico candidato se liga a um polipeptídeo da VP1 da variante de JCV.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para identificar agentes terapêuticos candidatos que suprimem o número ou nível de variantes de VP1 associadas à PML em infecção com JCV, que supri- . mem o risco de contrair PML.

Em algumas modalidades, os agentes tera- : pêuticos candidatos são direcionados a uma doença ou condição que não é PML nem a infecção com JCV.

Em algumas modalidades, os agentes tera- —pêuticos candidatos são imunossupressores.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos candidatos são agentes que estão sendo prescritos na terapia imunossupressora.

Métodos para selecionar agentes ou tratamentos que modulam os níveis de expressão das variantes de JCV são englobados pela invenção.

Os métodos de seleção podem incluir misturar o agente candidato com células ou tecidos ou em um paciente ou expor células ou tecidos ou um paciente ao tratamento candidato e usar os métodos de ensaio de carga viral das variantes de JCV para determinar o nível de expressão antes e depois do contato com o agente ou tratamento candidato.

Um decréscimo da quan- tidade de expressão da variante em comparação com um controle é indica- tivo de que o agente ou tratamento candidato é capaz de tratar PML e/ou infecção com JCV em uma célula, tecido e/ou paciente.

Em algumas modalidades, uma mistura de ensaio para testar um agente candidato compreende um agente candidato.

O agente candidato po- —deserum anticorpo, um composto orgânico pequeno, ou um polipeptídeo, e, por conseguinte, ele pode ser selecionado de bibliotecas de anticorpos com- binatórias, bibliotecas de proteínas combinatórias, ou bibliotecas de molé-

culas orgânicas pequenas. Tipicamente, pluralidade de misturas reacionais é efetuada em paralelo com diferentes concentrações de agentes para obter resposta diferente para as várias concentrações. Tipicamente, uma dessas concentrações serve como controle negativo, por exemplo, na concentração zeroouem uma concentração de agente abaixo dos limites de detecção de ensaio.

Qualquer molécula ou composto pode ser um agente terapêutico candidato. Exemplos não limitativos de agentes terapêuticos candidatos são moléculas pequenas, RNA incluindo siRNAs, DNA incluindo aptâmeros, e proteínas incluindo anticorpos e fragmentos de anticorpos. A invenção tam- bém engloba agente terapêutico candidato com diferentes modo de ação. : Os agentes candidatos englobam numerosas classes químicas, À embora sejam tipicamente compostos orgânicos, proteínas ou anticorpos (e íõ fragmentos destes que se ligam a antígeno). Em algumas modalidades, os agentes candidatos são compostos orgânicos pequenos, por exemplo, aqueles tendo peso molecular que mais que 50 e ainda menor que cerca de

2.500, por exemplo, menos que cerca de 1.000 e, em certas modalidades, menos que cerca de 500. Os agentes candidatos compreendem grupos químicos funcionais necessários para interações estruturais com polipepti- deos e/ou ácidos nucleicos e podem incluir pelo menos um grupo amina, carbonila, ou carboxila, opcionalmente pelo menos dois dos grupos químicos funcionais ou pelo menos três dos grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos podem compreender estrutura de carbono cíclica ou heterocíclica e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais identificados acima. Os agentes candidatos podem ser também biomoléculas tais como ácidos nucleicos, polipeptídeos, sacarí- deos, ácidos graxos, esteróis, isoprenoides, purinas, pirimidinas, derivados, ou análogos estruturais dos acima, ou combinações destes e similares.

Os agentes candidatos são obtidos de uma grande variedade de fontes, incluindo bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exem- plo, meios numerosos estão disponíveis para síntese aleatória e direcionada de uma grande variedade de compostos orgânicos ou biomoléculas, incluin-

do a expressão de oligonucleotídeos aleatorizados, bibliotecas combina- tórias orgânicas sintéticas, bibliotecas de display phage de polipeptídeos aleatórios ou não aleatórios, bibliotecas combinatórias de proteínas ou de anticorpos, e similares.

Alternativamente, as bibliotecas de compostos natu- rais na forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais estão disponíveis ou são prontamente produzidos.

Adicionalmente, bibliotecas naturais e produzidas sinteticamente e compostos podem ser prontamente modificados por meios químicos, físicos e bioquímicos, convencionais.

Ainda, agentes conhecidos podem ser submetidos a modificações direciona- das ou aleatórias, tais como acilação, alquilação, esterificação, amidificação, etc., para produzir análogos estruturais dos agentes.

O Uma variedade de outros reagentes pode ser também incluída e na mistura.

Esses incluem reagentes tais como sais, tampões, proteínas 7 neutras (por exemplo, albumina), detergentes, etc., que podem ser usados para facilitar a ligação ótima de proteina-proteina e/ou proteína-agente.

Tal reagente pode também reduzir a interações não específicas ou residuais dos componentes reacionais.

Outros reagentes que aperfeiçoam a eficácia do ensaio, tais como inibidores de protease, inibidores de nuclease, agentes antimicrobianos, e similares podem ser também usados.

Kits Em alguns aspectos da invenção, são proporcionados kits.

Os kits da invenção podem conter ácidos nucleicos, polipeptídeos, anticorpos ou outras moléculas da invenção para uso em diagnóstico in vitro, prognóstico, monitoramento da PML e/ou da infecção com JCV, exposição às variantes deJCV&eouteste de agentes terapêuticos candidatos.

Os componentes dos kits podem ser embalados tanto em meio aquoso como na forma liofilizada.

Os reagentes para uso em ensaios de PCR e ELISA podem ser também incluídos nos kits da invenção tal como podem ser agentes marcadores detectáveis na forma de intermediários ou como frações separadas para serem conjugadas como parte dos procedimentos para ensaio do risco de PML, infecção com JCV ou exposição a uma variante de JCV.

Em algumas modalidades de um kit da invenção, o kit pode incluir instruções para deter-

minar a presença das variantes da invenção e/ou para determinar a carga viral da uma variante de JCV. O kit pode incluir também valores de controle (por exemplo, números de referências) que podem ser usados para interpre- tação dos resultados dos métodos da invenção.

Um kit da invenção pode incluir ácido nucleico, anticorpos ou polipeptídeos que podem ser usados para identificar um ou mais índices de exposição às variantes de JCV tendo uma ou mais variantes de VP1 associadas à PML. Em algumas modalidades, os kits incluem materiais para uso em técnicas padrão de ELISA para identificação dos anticorpos que podem ligar um ou mais polipeptídeos que compreendem ou mais variantes indicativos de exposição a uma variante de JCV. Em algumas modalidades, e um kit da invenção pode incluir componentes de ácido nucleico para ligação . e detecção de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais variantes ou . combinações de variantes descritas aqui conforme associadas com a PML. Em algumas modalidades, um kit pode incluir um ou mais anticorpos diferen- tes que se ligam especificamente a um ou mais polipeptídeos compreen- dendo uma ou mais variantes ou combinações de variantes da invenção. Um kit pode incluir também componentes para uso com anticorpos para determinar expressão de variantes de JCV ou exposição às variantes de JCVem uma célula, tecido ou paciente.

Um kit pode compreender um veículo que é compartimentado para receber em próximo confinamento nele um ou mais meios de recipientes ou série de meios de recipientes, tais como tubos de ensaio, ampolas, frascos, seringas, ou similares. O kit pode conter também uma amostra de controle. Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para interpretar resultados de teste tais como instruções para determinar se um teste indica se o nível de um agente detectado no ensaio se correlaciona com a exposição a uma infecção de JCV (por exemplo, por um JCV do tipo selvagem ou variante deste).

Amostras Biológicas Métodos para ensaiar para exposição a uma variante de JOV podem ser efetuados sobre qualquer amostra biológica adequada. Em algumas modalidades, uma amostra pode ser obtida de um paciente e diretamente processada e ensaiada para indícios de JCV, conforme descri- ção aqui.

Em algumas modalidades, as células podem ser isoladas de uma amostra biológica e crescidas em cultura antes da análise.

Com usado aqui, um paciente pode ser um humano ou um animal não humano, incluindo, sem limitação, um primata não humano, vaca, cavalo, porco, carneiro cabra, cachorro, gato ou roedor.

Os métodos da invenção podem ser usados para ensaiar a exposição a uma variante de JCV em pacientes não ainda diagnosticados com PML.

Os métodos da invenção podem ser usados para ensaiar a exposição a uma variante de JOCOV em pacientes não ainda diagnosticados como estando infectados com JCV.

Além disso, os métodos - da invenção podem ser aplicados a pacientes que foram diagnosticados com d PML e/ou infecção por uma variante de JCV.

A amostra pode compreender f uma ou mais células.

A amostra pode se originar diretamente de um paciente ou de uma cultura de células.

A amostra pode ser processada (por exemplo, para preparar um lisado de células) ou parcialmente processada antes do uso em métodos da invenção.

Em algumas modalidades, a amostra de um paciente ou cultura pode ser processada para obter ácidos nucleicos ou polipeptídeos para uso em ensaios para detectar exposição a uma va- riante do vírus JC conforme descrição aqui.

Assim uma etapa inicial de um ensaio pode incluir isolamento de amostra de ácido nucleico genômico e/ou outros ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos de uma célula, tecido, e/ou outra amostra.

A extração de ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos pode ser por qualquer meio adequado, incluindo métodos de rotina usados por aqueles de — conhecimento ordinário da técnica, tais como métodos que incluem o uso de lisados detergentes, sonicação, e/ou turbilhonamento com contas de vidro,

etc.

Como usado aqui, o termo “amostra” significa qualquer material animal contendo DNA ou RNA ou proteína, tal como, por exemplo, tecido ou fluido isolado de um indivíduo (incluindo, mas sem limitação, plasma, soro, fluido cerebroespinhal, urina, linfa, lágrimas, saliva e seções teciduais) ou de constituintes de cultura de células in vitro.

Uma amostra que contém ácidos nucleicos pode conter ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos ribonuclei- cos (RNA), ou copolímeros de ácidos desoxirribonucleicos e ácidos ribonu- cleicos ou combinações destes. Uma amostra contendo polipeptídeos pode conter peptídeos e/ou proteínas. Em algumas modalidades, a amostra con- tém anticorpos. A amostra pode ter sido submetida à purificação (por exemplo, extração) e/ou outro tratamento. O termo “amostra” pode se referir também a uma “amostra biológica”.

Como usado aqui, o termo “amostra biológica” pode ser referir a tecido, células ou partes de componentes (por exemplo, fluidos corporais, incluindo, mas sem limitação, sangue, muco, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cerebroespinhal, saliva, fluido amniótico, sangue do cordão amniótico, . urina, fezes, fluido vaginal, e sêmen, etc.) de um paciente. Uma “amostra : biológica” pode também se referir a um homogeneizado, lisado, ou extrato * preparado de tecidos, células ou partes de componentes, ou uma fração ou porção destes, incluindo, mas sem limitação, por exemplo, plasma, soro, fluido espinhal, fluido linfático, urina, secções externas da pele, tratos respi- ratórios, intestinais e geniturinários, lágrimas, saliva, fezes, leite, células do sangue, tumores, ou órgãos, biópsias do SNC, etc. Fontes de amostras podem incluir tecidos, incluindo, mas sem limitação, tecidos linfáticos; fluidos corpóreos (por exemplo, sangue, fluido linfático, etc.), células cultivadas; linhagens celulares; lâminas histológicas; tecido embutido em parafina, etc. O termo “tecido”, como usado aqui, se refere a ambas as populações de células localizadas e disseminadas, inclu- indo, mas sem limitação, cérebro, coração, soro, mama, cólon, bexiga, epi- derme, pele, útero, próstata, estômago, testículos, ovário, pâncreas, gandula pituitária, glândula adrenal, glândula da tireóide, glândula salivar, glândula mamária, rim, fígado, intestino, baço, timo, medula óssea, traqueia, e pul- mão. Fluidos biológicos incluem, mas sem limitação, sangue, fluido linfático, fluido cerebroespinhal, lágrimas, saliva, urina, fezes, etc. Técnicas invasivas e não invasivas podem ser usadas para obter tais amostras e são bem documentadas na técnica. Uma amostra de controle pode incluir um fluido corporal, célula, tecido, ou lisado destes. Em algumas modalidades, uma amostra de controle pode ser uma amostra de uma célula ou paciente que está livre de PML e/ou infecção por, ou exposição a, uma variante de JCV. Em algumas modalidades, uma amostra de controle pode ser uma amostra que é de uma célula ou paciente que tem PML e/ou foi exposto a uma variante de JCV. Em algumas modalidades, uma amostra de controle é uma amostra compreendendo vírus JC do tipo selvagem.

Vacinas A presente invenção se refere ainda a uma vacina para imunizar um mamífero contra PML ou infecção por uma variante de JCV associada à PML, Uma vacina pode compreender pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de variantes de JCV da invenção. Em a algumas modalidades, uma vacina pode incluir um ou mais peptídeos de * variante de JCV ou de JCV descritos aqui conforme previstos para reduzir a . ligação de ácido siálico. Em algumas modalidades, uma vacina pode incluir uma pluralidade de peptídeos diferentes (por exemplo, 2, 3, 4, 5,6,7,8,9, 10, 1-15, 15-20, 20-50, ou mais) para proporcionar uma faixa ampla de epítopos diferentes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipep- tídeo de variante de VP1 de JCV de comprimento natural. Ainda em outra modalidade, o polipeptídeo é um polipeptídeo de VPI de JCV de compri- mento natural selecionado do grupo que consiste nos polipeptídeos descritos aqui (por exemplo, na figura 3 ou na tabela 1 ou 2B, tabela 17 e/ou tabela 18, e/ou uma ou mais outras variantes descritas aqui), ou qualquer fragmen- to destes (por exemplo, um polipeptídeo longo de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 100-150, 150-200 aminoácidos, ou um polipeptídeo mais longo, mais curto ou tamanho intermediário) tendo pelo menos aminoácidos de uma variante (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos de variante) em uma ou mais das posições predeterminadas aqui. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um fragmento de uma proteina VP1 de JCV compreendendo uma ou mais aminoácidos da variante. Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compre- ende pelo menos um polipeptídeo da variante de JCV e um excipiente, diluente ou veículo adequado. Em algumas modalidades, um polipeptídeo na vacina tem o comprimento de cerca de 5, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, ou cerca de 50 aminoácidos, ou compreende o compri- mento total da proteina VP1 do JCV.

Essas composições são adequadas para prevenir ou tratar PML e/ou uma infecção por variante de JCV associada à PML.

Uma composição farmacêutica pode ser administrada a um paciente em quantidade eficaz para estimular a produção do anticorpo protetor o resposta à célula T protetora.

Em algumas modalidades, a vacina é uma vacina de ácido nucleico compreendendo ácidos nucleicos que codi- ficam um ou mais polipeptídeos da variante de JCV da invenção.

O termo “imunizar” se refere à capacidade de uma substância causar resposta humoral e/ou celular em um paciente, se sozinha ou quando a ligada a um veículo, em presença ou na ausência de um adjuvante, e o. também ser refere a uma imunorresposta que bloqueia a infecciosidade, seja f parcialmente seja inteiramente, de um agente infeccioso.

Uma “vacina” con- tra PML é uma composição imunogênica capaz de produzir proteção contra PML, se parcial ou completa.

A vacina pode ser também útil para tratar um paciente tendo PML.

Regimes de administração para vacinas são conheci- das daquele com conhecimento ordinário da técnica.

Em algumas modali- dades, faixas de quantidades de vacinas de polipeptídeos para profilaxia de PML são de 0,01a100 microgramas/dose, por exemplo, 0,1 a 50 microgra- mas/dose.

Várias doses podem ser necessárias por paciente para obter uma imunorresposta suficiente e subsequente proteção contra PML ou contra infecção por uma variante de JCV associada à PML.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer veículo que não induz ele mesmo a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que este recebendo a composição.

Veículos adequados são tipicamente ma- cromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polis- sacarídeos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poli- méricos, copolímeros de aminoácidos; e partículas de vírus inativos.

Tais veículos são bem conhecidos daqueles com conhecimento ordinário de técnica.

Adjuvantes para intensificar a eficácia das vacinas de polipep-

tídeos da invenção incluem, mas se limitação: hidróxido de alumínio (alum), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) conforme visto na Patente US 4.606.918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor- MPD), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1"-2"-dipalmitoill- —s-n-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina (MTP-PE) e RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, monofosforil lipídio A, dimicolato de trealose, e esqueleto da parede celular (MPL+TDM+CWS) em emulsão a 2% de esqualeno/Tween 80. Qualquer um dos três componentes MPL, TOM ou CWS pode ser usado também sozinho ou em combinações de dois. Em algumas modalidades, um ou mais peptídeos da invenção podem ser usados para imunização usando-se uma ou mais técnicas descritas por a Goldmann et al., 1999, Journal of Virology, Vol. 73, No. 5, pp. 4465-4469, .“ cuja exposição é aqui incorporada a título de referência.

- Em algumas modalidades, a vacina pode ser administrada ao paciente antes ou junto com o início da terapia imunossupressora, ou qualquer outro tratamento que possa afetar (por exemplo, enfraquecer) o sistema imunológico.

Anticorpos Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes às variantes de JCV são também englobados pela invenção. Os anticorpos podem ser usados em ensaios de detecção descritos aqui (por exemplo, ensaios ELISA). Os anticorpos podem ser usados em terapia para tratar pacientes com PML e/ou para prevenir ou reduzir infecção com variantes de JCV. Anticorpos adequados ou fragmen- tosdestes podem ser selecionados quanto à capacidade de se ligarem a um ou mais polipeptídeos da variante de JCV descritos aqui. O anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste podem ser um de IgG1, IgG2, 19G3, 1IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE ou pode ter um domínio constante e/ou variável de imunoglobulina de uma I9G1, I9G2, 19G3, IgGA4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD ou IgE. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou multiespecífico. Em outras modalidades, o anticor- po é um anticorpo recombinante, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico, ou uma mistura destes. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, por exemplo, um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal ou uma mistura de anticorpos monoclonais e policlonais.Fragmentos de ligação de antígeno podem incluir um fragmento Fab, um fragmento F(ab'),, e/ou um fragmento F, CDr3.

Os anticorpos podem ser provocados com uma variante da proteína VP1 de JCV de tamanho natural ou contra variantes de polipep- tídeos que compreende uma sequências parcial da variante da proteína VP1 de JCV. Os anticorpos podem ser gerados injetando-se um animal, por exemplo, coelho ou cabra ou camundongo, com o anticorpo (por exemplo, he um polipeptídeo de uma variante de VP1 de JCV).

O - Para preparar anticorpos policlonais, proteínas de fusão conten- - do uma variante de VP1 de JCV podem ser sintetizadas em bactérias por expressão das sequências de DNA correspondentes em um veículo de clo- nagem adequado. A proteína pode ser purificada, acoplada a uma proteína veículo e misturada com adjuvante de Freund (para ajudar a resposta antigênica pelos ratos) e injetada em coelhos ou outros animais de labo- ratório. Alternativamente, os polipeptídeos podem ser isolados de células cultivadas que expressam a proteína. Seguinte às injeções de reforço em intervalos bissemanais, os coelhos ou outros animais de laboratório são en- tão sangrados e os soros isolados. Os soros podem ser usados diretamente ou purificados antes do uso, por exemplo, por métodos tais como croma- tografia por afinidade, Proteína A-Sefarose, Antígeno Sefarose, lg Antica- —mundongo-Sefarose. Os soros podem ser então usados para sondas de extratos de proteínas corridas em um gel de poliacrilamida para identificar os polipeptídeos da variante de JCV. Alternativamente, os polipeptídeos da variante de JCV sintéticos podem ser feitos e usados para inocular animais.

Para produzir anticorpos monocionais de variante de JCV, os — camundongos são injetados muitas vezes (vide acima), os baços dos ca- mundongos são removidos e ressuspensos em uma solução salina tampo- nada com fosfato (PBS). As células do baço servem como fonte de linfócitos,

em que algumas destas produzem anticorpos de especificidade apropriada. Essas são então fundidas com uma célula parceira de mieloma de crescimento permanente, e os produtos da fusão são plaqueados em vários poços de cultura de tecido em presença de agente seletivo tal como HAT. Os poços são então selecionados por Elisa para identificar aqueles contendo células que expressam anticorpo útil. Essas são então novamente plaquea- das. Depois de um período de crescimento, essas células são novamente selecionadas para identificar células produtoras de anticorpos. Vários proce- dimentos de clonagem são efetuados até que mais que 90% dos poços contenham clones simples que são positivos para a produção de anticorpos. A partir deste procedimento, é estabelecida uma linhagem estável de clones o para produção do anticorpo. O anticorpo monoclonal pode ser então puri- to ficado por cromatografia por afinidade usando-se Proteína A-Sefarose, cro- ” matografia de troca iônica, bem como variações e combinações destas técnicas (vide, por exemplo, a Patente US 6.998.467).

Em algumas modalidades, anticorpos “humanizados” são usa- dos em terapia para humanos. A humanização dos anticorpos envolve repo- sição de sequências nativas de camundongos com sequências humanas para reduzir a chance de uma imunorresposta uma vez que o anticorpo terapêutico é introduzido em humanos.

Infecções do SNC O poliomavírus JC é um vírus que infecta o cérebro e o SNC (Sistema Nervoso Central. Os pacientes que sofrem de infecções microbianas do SNC podem ser suscetíveis à infecção com a variante do vírusJC e/ou proliferação no SNC. As infecções microbianas do SNC podem incluir, mas sem limitação, infecções bacterianas, fúngicas, por protozoários, similares a vírus e virais. As infecções incluem tanto as condições agudas como as crônicas. Infecções microbianas do SNC exemplares podem resul- tar em abscesso no cérebro, meningite, encefalite, vasculite, ou leucoen- —cefalopatia multifocal progressiva (PML). A maior parte das infecções forma- doras de abscesso do SNC é disseminada pelo sangue e são relacionadas à septicemia e à endocardite, embora possa existir infecção direta que surge da infecção do seio ou do ouvido médio/mastóide.

As infecções bacterianas do SNC podem incluir, mas sem limitação, infecção por Streptococcus pneumonia, Streptococcus — pyogenes, Staphylococcus —epidermitis, Enterobacteriace, Propionibacterium, Pseudomonoas aeruginosa, Neisseria meningitis, Haemophilus influenzae ou Listeria moncytogenes.

Infecções fúngicas do SNC são menos comuns que infecções bacterianas, mas podem aparecer em indivíduos com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) e em outros indivíduos imunocomprometidos, tais como aqueles que estão sendo submetidos à quimioterapia ou terapia imunossupressora.

Um exem- plo de infecção por protozoário do SNC é tripanossomíase, ou doença do : sono que é causada por infecção do SNC por protozoários de tripanossomo.

O Infecções virais do SNC podem incluir, mas sem limitação, me- - ningite asséptica, encefalite, e leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML). Síndromes neurológicas agudas com infecção viral incluem, por exemplo, encefalite viral aguda, paralisia flácida, meningite asséptica, e encefalomielite.

Encefalite viral aguda pode ser causada, por exemplo, por vírus do herpes simples, citomegalovírus, varicela, raiva ou um arbovírus.

Agentes virais comuns para meningite asséptica incluem, por exemplo, enterovírus, vírus da caxumba e vírus da coriomeningite linfocítica.

Encefalo- mielite infecciosa é uma complicação de infecção com sarampo, caxumba, rubéola e infecção com vírus varicela-zóster primário, por exemplo.

A síndrome de Guillain-barre é também uma síndrome neurológica aguda associada à infecção viral.

Outras doenças neurológicas crônicas atribuíveis à infecção viral incluem panencefalite esclerosante subaguda (causada por infecção de sarampo persistente), encefalopatias espongiformes (doenças de príon) (por exemplo, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), Síndrome de Gerstmann- Streussler), e doenças retrovirais (por exemplo, HIV-1 e HIV-2) caracteriza- das por paralisia, definhamento, e ataxia.

Por conseguinte, os aspectos da invenção podem ser usados para avaliar o risco de PML em pacientes tendo um ou mais sintomas de infecção microbiana do SNC.

Estudos de Variantes de JCV Ambas as genéticas de hospedeiros e vírus podem contribuir para PML.

Estudos anteriores com foco nos fatores genéticos virais identifi- caram duplicações e rearranjos na região reguladora do genoma viral genome |[Pfister LA, Letvin NL, Koralnik IJ (2001) JC virus regulatory region tandem repeats in plasma and central nervous system isolates correlate with poor clinical outcome in patients with progressive multifocal leukoencephalopathy.

J Virol 75: 5672-5676; Major EO, Amemiya K, Tornatore CS, Houff SA, Berger JR (1992) Pathogenesis and molecular biology of progressive multifocal leukoencephalopathy, the JC virus-induced : dempyelinating disease of the human brain.

Clin Microbiol Rev 5: 49-73; É Loeber G, Dorries K (1988) DNA rearrangements in organ-specific variants of . polyomavirus JC strain GS.

J Virol 62: 1730-1735; Martin JD, King DM, Slauch JM, Frisque RJ (1985) Differences in regulatory sequences of —naturally occurring JC virus variants.

J Virol 53: 306-311; and Zheng HY, Takasaka T, Noda K, Kanazawa A, Mori H, et al. (2005) New sequence polymorphisms in the outer loops of the JC polyomavirus major capsid protein (VP1) possibly associated with progressive —multifocal leukoencephalopathy.

J Gen Virol 86: 2035-2045]. Vários estudos com número muito de limitado de amostras de indivíduos com PML e indivíduos saudáveis reportaram também resultados conflitantes sobre possível associação de várias mutações na proteina VP1 com PML [Zheng HY, Takasaka T, Noda K, Kanazawa A, Mori H, et al. (2005) New sequence polymorphisms in the outer loops of the JC polyomavirus major capsid protein (VP1) possibly associated with progressive —multifocal leukoencephalopathy.

J Gen Virol 86: 2035-2045; Zheng HY, lkegaya H, Takasaka T, Matsushima-Ohno T, Sakurai M, et al. (2005) Characterization of the VP1 loop mutations widespread among JC polyomavirus isolates associated with progressive multifocal leukoencephalopathy.

Biochem Biophys Res Commun 333: 996-1002; Kato A, Sugimoto C, Zheng HY, Kitamura T, Yogo Y (2000) Lack of disease-specific amino acid changes in the viral proteins of JC virus isolates from the brain with progressive multifocal leukoencephalopathy. Arch Virol 145: 2173-2182]. Nenhuma análise compreensiva de uma associação de alterações nos genes de codificação de proteína de JOV com PML foi reportada. Patogenicidade de vírus variando a partir do vírus da influenza [Srinivasan A, Viswanathan K, Raman R, Chandrasekaran A, Raguram S, et al. (2008) Quantitative biochemical rationale for differences in transmissibility of 1918 pandemic influenza A viruses. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 2800-2805; e Chandrasekaran A, Srinivasan A, Raman R, Viswanathan K, Raguram S, et al. (2008) A topologia de glicana determina a adaptação humana de hemaglutinina do vírus aviários HSN. Nat Biotechnol 26: 107-113] para o poliomavírus do camundongo [Bauer PH, Bronson RT, Fung SC, Freund R, O Stehle T, et al. (1995) Genetic and structural analysis of a virulence - determinant in polyomavirus VP1. J Virol 69: 7925-7931; e Bauer PH, Cui C, Liu WR, Stehle T, Harrison SC, et al. (1999) Discrimination between sialic acid-containing receptors and pseudoreceptors regulates polyomavirus spread in the mouse. J Virol 73: 5826-5832], um close relativo do JCV humano foi mostrado como sendo determinado por sequências de aminoáci- dos envolvidas na ligação de uma proteína do capsídeo viral aos receptores de glicana sialada. Alterações na afinidade e especificidade do vírus quanto aseusreceptor(es) celular(es) afetam a infecciosidade viral e transmissão, e assim desempenham um papel crucial na virulência. Por exemplo, um estudo do poliomavírus de camundongos mostrou que as alterações nos aminoácidos da VP1 preferencialmente às alterações na região reguladora de não codificação são responsáveis pela patogenicidade aumentada do vírus.

Os aspectos da invenção são ilustrados por experimentos que se relacionam à proteína VP1 e sua relação com a PML. Métodos de evolução molecular foram usados para determinar a presença de alterações adaptativas putativas na sequência de aminoácidos da VP1 associada à —PML. A vantagem dessa abordagem sobre associação estatística simples de variantes de sequências com a doença é que ela leva em conta a relação filogenética das cepas virais e também permite a identificação de posições de aminoácidos funcionalmente significantes por exame da taxa de evolução das sequências.

De acordo com os aspectos da invenção, um vírus contendo substituições é adequadamente infeccioso se ele for suficientemente abundante no SNC de pacientes com PML para ser isolado.

Em algumas modalidades, alterações na especificidade das glicanas são previstas para permitir que o JCV perca a sua especificidade para glicanas sialadas expressas fora do SNC (por exemplo, RBCs). Assim, tal vírus evitaria ser preso nos “pseudorreceptores” na periferia e percorreria sem impedimento dos sítios de derramamento viral para entrar no cérebro.

Vírus mutado deve ainda manter sua especificidade para glicanas expressas sobre oligodendró- citos.

Isso é consistente com a observação do modelo de poliomavírus de : camundongo onde a mutação em uma posição ortóloga à posição 269 do JCV afetou a capacidade viral de se ligar às RBCs e também leva ao aumento dramático da disseminação viral através do animal com resultado letal [Dubensky TW, Freund R, Dawe CJ, Benjamin TL (1991) Polyomavirus replication in mice: influences of VP1 type and route of inoculation.

J Viro! 65: 342-349; e Freund R, Garcea RL, Sahli R, Benjamin TL (1991) A single- amino-acid substitution in polyomavirus VP1 correlates with plaque size and hemagglutination behavior.

J Virol 65: 350-355]. Além disso, existem vários relatos de detecção de JCV em amídalas de muitos indivíduos infectados assintomaticamente [Kato A, Kitamura T, Takasaka T, Tominaga T, Ishikawa A, et al. (2004) Detection of the archetypal regulatory region of JC virus from the tonsil tissue of patients with tonsillitis and tonsilar hypertrophy.

J Neurovirol 10: 244-249; e Monaco MC, Jensen PN, Hou J, Durham LC, Major EO (1998) Detection of JC virus DNA in human tonsil tissue: evidence for site of initial viral infection.

J Virol 72: 9918-9923]. Embora essa observação tenha sido feita como suporte para a infecção com JCV de células de amídalas, pode ser também explicado pela captura viral em tecidos linfoides.

Isso é consistente com a ligação de JCV ao ácido siálico no tecido das amídalas [Eash S, Tavares R, Stopa EG, Robbins SH, Brossay L, et al. (2004) Differential distribution of the JC virus receptor-type sialic acid in normal human tissues. Am J Pathol 164: 419-428].

De acordo com a invenção, dado o grande número de mutações que são específicas para PML, é provável que mais que um mecanismo único (por exemplo, dois ou mais mecanismos) possa desempenhar um papel na etiologia de PML em casos diferentes de PML. De acordo com alguns aspectos da invenção, as mutações da VP1 associadas à PML podem aumentar o tropismo do JCV para as células da massa encefálica branca levando à infecciosidade viral aumentada e replicação em oligoden- drócitos. De acordo com outros aspectos da invenção, as mutações em PML podem permitir o escape imune do vírus. Fora da imunorresposta policlonal : direcionada contra a molécula de VP1, somente um número limitado de anticorpos direcionados contra o sítio de ligação de receptor de células (ácido siálico) pode proporcionar proteção contra a disseminação da infecção viral. A mutação de um aminoácido dentro de epítopo crucial para a imunidade protetora pode permitir que o vírus se ligue às suas células-alvo e se espalhe sem inibição.

Os experimentos descritos aqui mostram como certas mutações ocorrem na PML e porque, apesar de uma prevalência muito alta do JCV, somente uma proporção pequena de pacientes imunodeficientes desen- volvema PML. De acordo com os aspectos da invenção, a ausência de clustering das mutações na árvore filogenética viral sugere que elas surgem, independentemente, em pacientes individuais em vez de persistirem nas populações gerais como variantes virais patogênicas. De acordo com os aspectos da invenção, e com base nos experimentos descritos aqui, as mutações de VP1 desempenham um papel significante no mecanismo do aparecimento da PML. Uma vez que uma mutação específica que afeta a ligação do ácido siálico ocorre ela permite que o vírus se espalhe para o cérebro e infecte os oligodendrócitos. O fato de que vírus mutante não é detectado no rim sugere que alteração particular na ligação da glicana não oferece nenhuma vantagem seletiva para o vírus mutado no rim. As mutações podem ter ocorrido e, logo, permitiram que o vírus estabelecesse residência no cérebro sob as condições de imunossupressão imediatamente

AAA oso———————————————22-s «Os ««.« 0220 c——ssp— 97/161 ou bem antes da PML. Já que nenhuma replicação viral foi detectada nos cérebros de indivíduos assintomáticos é improvável que evolução compartimentada (por exemplo, intra SNC) antes do desenvolvimento da PML possa se responsável pela presença de VP1 mutada no SNC dos pacientes com PML. Contudo, a questão de latência do JCV no cérebro normal permanece controversa de modo que é ainda formalmente possível que o vírus não mutado tenha entrado no cérebro e mutações surgem no cérebro e não na periferia, por exemplo, rim. De acordo com os aspectos da invenção, o sistema imunológico — saudável controla de modo eficaz a ativação no cérebro. Contudo, tão logo o sistema imunológico falhe em certos indivíduos contendo tal vírus mutado, o vírus começa a se proliferar ativamente nos oligodendrócitos, causando a PML. É possível também que um sistema imunológico saudável possa suprimir eficazmente mutantes recentemente desenvolvidos em seu sítio periférico (por exemplo, rim) e prevenir que eles se espalhem e infectem novas células-alvo. Assim, o momento do desenvolvimento da PML pode ser mutação limitada e a influência recíproca com os fatores ambientais ou genéticos do hospedeiro pode contribuir para o desenvolvimento não deter- minístico da PML. Além disso, o desenvolvimento da PML pode ser contro- lado por interações das mutações de VP1 com alterações genéticas adicio- nais do vírus inclusive rearranjo da região reguladora viral conforme ele possa dar ao vírus vantagem seletiva adicional em aumentar a replicação viral nos oligodendrócitos.

De acordo com os aspectos da invenção, e conforme ilustrado pelos Exemplos descritos aqui, as mutações da VP1 do JCV que afetam a sua especificidade de receptor podem ser responsáveis pela patologia da PML. Esses resultados proporcionam oportunidades para a descoberta de novos produtos terapêuticos antipoliomavírus e diagnósticos de doenças causadas por esses vírus. O papel preciso que essas mutações dssermipo: nham na etiologia da PML, bem como o modo e onde elas surgem requer In- vestigação mais extensiva que envolveria a análise da sequência da VP1 de amostras longitudinais e de tempo correspondentes de órgãos diferentes

(por exemplo, urina, sangue, CSF) e de uma variedade da pacientes com PML. O estudo das sequências da VP1 provenientes de amostras sequenciais, conforme descrição aqui mostrou a persistência das mesmas cepas virais no curso da doença. Já que o vírus mutado apresentou a população prevalente e única e foi mantida através do tempo, ele parece ser necessário e suficiente para a propagação da infecção. Notavelmente, substituições adicionais foram obtidas em caso de recaída em um paciente que sobreviveu ao primeiro episódio da PML. Primeiramente, essa obser- vação sugere que o vírus antigo mutado sobrevive eficazmente, tanto no Ê SNC como na periferia, e, em segundo lugar, que o aparecimento de uma nova substituição pode desencadear um novo episódio de PML. Em algumas - modalidades, um vírus recentemente mutado pode surgir em um contexto de ativação de vírus sob controle imunológico subótimo e uma vez que ele apareceu, não pode ser prontamente reconhecido pelo sistema imunológico. Em algumas modalidades, os aspectos da invenção se relacio- nam à identidade do CSF e das sequências da VP1 plasmática em paciente com PML. Parece que ambos os vírus isolados do plasma e do CSF são igualmente distintos do vírus isolados da urina, mesmo se a mutação foi excluída da análise. Isso indica que populações do CSF e populações plasmáticas não surgiram independentemente da urina mas sim uma dessas populações se originou da mesma fonte que a população da urina e a outra se originou da primeira. Embora as sequências de VP1 contendo mutações PML-gênicas não tenham sido observadas na urina dos pacientes com PML, é possível que uma mutação que foi originalmente adquirida durante a re- plicação viral no rim não tenha recebido qualquer vantagem sobre o vírus não mutante residente para se tornar uma população dominante ou mesmo detectável no sítio do rim. Isso é consistente com a observação que VLPs preparadas da maioria das moléculas de VPI mutante perdeu a capacidade dese ligaràs células epiteliais tubulares renais, o sítio da infecção viral no rim.

De acordo com os aspectos da invenção, sem se desejar estar limitado por teoria, quando uma mutação faz com que um vírus perca a sua especificidade por um ou mais receptores contendo ácido siálico que ocor- rem amplamente, o vírus mutante (na circulação sanguínea) é mais provável de escapar que um vírus do tipo selvagem que está sendo capturado por uma multidão de pseudorreceptores de oligossacarídeos contendo sialo expressos em uma grande parte de células na periferia. Por conseguinte, o vírus mutante pode ser mais provável de alcançar o cérebro, ou pelo menos uma barreira cerebral de sangue (BBB). Uma vez que o vírus consiga se desviar dos obstáculos e alcança a BBB ele tem que cruzar ainda a camada de células epiteliais para chegar ao SNC. Em algumas modalidades, a ocorrência extremamente rara, mesmo em paciente com imunossupressão significante, pode ser devida à constelação temporal requerida de eventos : independentemente raros tais como o aparecimento de certas partículas de vírus mutante e a presença de uma abertura na BBB.

A hipótese de que mutações na proteina de VP1 contribuem para a progressão da PML aumentando as chances virais de escaparem da circulação periférica para entrarem no SNC é consistente com a observação de que -10% de todos os casos de PML continham vírus não mutado. Assim, mesmo os vírus não mutantes podem também entrar no SNC dado o alto nível de viremia, que poderia pesar sobre a defesa periférica dos pseu- dorreceptores virais e também dada a abertura temporalmente coincidente em BBB. Contudo, uma vez que o vírus tenha entrado no cérebro, não have- rá diferença entre o mutante e o não mutante em sua capacidade de infectar os oligodendrócitos e se disseminar no SNC, o que seria consistente com a capacidade retida de VLPs mutantes de se ligarem a astrócitos derivados do SNC, outro alvo do JCV durante a infecção cerebral contínua. Alternativa- mente, a mutação da VP1 pode ter surgido durante a replicação viral no SNC na medida em que se tornou dominante no CSF porque ele propor- cionou alguma vantagem competitiva para o vírus se espalhar através do cérebro. Já que a maior parte das amostras analisadas tinha todos ou >90% de todos os clones isolados contendo mutações, de modo que para a última hipótese ser verdadeira, as mutações devem ocorrer muito precocemente na replicação viral no cérebro.

Já que o vírus sem as mutações na VP1 pode infectar as células do SNC com bastante sucesso, as mutações não proporcionariam vantagem competitiva via ganho de tropismo viral em direção às células do SNC embora pudessem ter melhorado isso.

Ainda, não pode formalmente ser excluída a possibilidade de que pelo menos em alguns casos o vírus entra no cérebro na forma não mutada e adquire a mutação durante sua ativação dentro do SNC sob a condição de imunossu-

pressão em um paciente.

Independentemente do sítio de seleção, as substituições na VPq doJCV parecem ser a chave para o potencial PML-gênico viral.

O capsídeo viral e proteínas envelope são críticos para mediar a fixação viral às células- alvo virais e a infecciosidade.

Assim, as mutações na proteína HA da influen- - za permitem que o vírus altere sua especificidade sutil para a ligação de ácido siálico e capacidade do vírus de mudar de infecciosidade zootrópica para humana.

Similarmente, algumas dessas mutações foram mostradas como estando associadas à virulência aumentada da influenza na população humana conforme mostrado pelo exemplo da influenza de 1918, por alteração da especificidade do ácido siálico preferencialmente expressa nas células na parte superior dos lobos pulmonares para aquela expressa na porção inferior do pulmão.

Outro mecanismo pelo qual um vírus poderia ganhar um aumento da virulência é provavelmente via a perda de sua ampla especificidade de receptor que faz com que os vírus sejam retidos nas célu- las que ele não infecta produtivamente.

Um dos melhores exemplos estu- dados de tal mecanismo vem dos estudos de outro poliomavírus, infecção por poliomavírus murino em camundongos.

Foi demonstrado nesse modelo que uma mutação na posição 296, que é estruturalmente ortóloga à posição 269 PML-gênica crítica do JCV, alterou dramaticamente a especificidade viral para os ácidos siálicos e afetou a capacidade viral de se ligar às células alvos e RBCs e pode levar ao aumento dramático da disseminação viral através do animal, levando a um resultado letal.

Assim, parece que uma alteração na proteína de revestimento viral que afeta a ligação viral a seu receptor é um mecanismo extremamente comum que desempenha um papel crucial na alteração da patogênese viral e virulência, em que os poliomavírus humanos não são exceção.

Em alguns aspectos, as mutações nas posições 55 e 269 para fenilalanina são detectadas em uma amostra do paciente.

Em outros aspec- tos, pelo menos essas mutações são detectadas e indicam que o paciente pareceu ser mais comum, sugerindo que esses dois sítios estão sob forte pressão seletiva e proporcionam o vírus JC com mais vantagem para causar PML.

Essa observação se correlaciona fortemente com a capacidade das mutações nesses dois sítios de anularem a ligação viral às células periféri- case oligossacarídeos contendo ácido siálico, sugerindo assim que aquela À perda particular de função é mais vantajosa para o vírus a ser positivamente selecionado com mais frequência que outras mutações.

Conforme descrição ” mais detalhada em outro ponto aqui, cada um desses sítios respondem por 25% de todas as mutações no presente estudo, em que as posições 267, 265a60 estão perto das mais altas em frequência, cada uma com 7,5% de todos os casos.

Interessantemente, as amostras de CSF provenientes de vários pacientes continham duas ou mais populações virais diferentes, em que cada uma carregava a sua própria mutação específica para PML com nenhum vírus, em que nenhum vírus continha duas de tais mutações simul- taneamente.

Por conseguinte, alguns aspectos desta invenção mostram que várias mutações diferentes podem surgir independentemente durante a replicação viral normal e todos podem ser selecionados se cada um propor- cionar ao vírus a vantagem competitiva sobre o vírus não mutado.

Em três casos, ou -10% de todos os casos a partir deste estudo, nenhuma das substituições associadas à PML pode ser encontrada na CSF e/ou plasma.

Hipóteses podem ser formuladas com respeito a outras alterações genéticas de genoma de JCV, por exemplo, envolvendo mutações em proteínas do capsídeo viral, menores, VP2 ou VP3, para explicar a presença destes vírus em associação com a PML.

A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados, de modo nenhum, como limitativos.

O inteiro teor de todas as referências (incluindo referências da literatura,

patentes expedidas, pedidos de patente publicado, e pedidos de patente copendentes) citadas ao longo deste relatório descritivo é aqui expressa- mente incorporado a título de referência.

Exemplos Exemplo 1: Detecção de variantes de JCV por PCR Ácidos nucleicos são isolados de uma amostra biológica usando- se protocolos estabelecidos (por exemplo, lise das células). Devido ao fato de o DNA poder ter integrado o DNA genômico ou poder estar ainda presen- te como uma entidade menor, ambas as sequências de DNA genômico e DNA mais curto são isolados e submetidos à análise por PCR.

Mediante : isolamento, os ácidos nucleicos são ressuspensos em um tampão que facili- tará a análise por PCR.

Tampões que facilitam a análise por PCT são : conhecidos daquele versado na técnica (por exemplo, Maniatis) e estão tam- bém comercialmente disponibilizados pelos fabricantes de enzimas para PCR (por exemplo, New England Biolabs, Beverly, MA). Iniciadores de nucleotídeos são projetados para resultarem na amplificação do gene de VP1 do JCV.

A amplificação por PCR é uma técnica de laboratório estabelecida e compreende a adição de iniciadores de nucleotídeos, uma polimerase, nucleotídeos únicos, e tampão de polimerase e submissão desta mistura a ciclos de anelamento, amplificação e dissociação resultando na amplificação de uma sequência de DNA desejada.

Mediante amplificação, o gene de VP1 do JCV é separado do DNA residual e nucleotídeos únicos em excesso.

O DNA de VP1 de JCV amplificado é sequenciado e a sequência de nucleotídeos resultantes é traduzido em uma sequência de peptídeos.

Essa sequência de peptídeos é subsequentemente comparada com os painéis das variantes para determinar quais variantes de polipeptídeos de VP1 do JCV estão presentes na amostra biológica.

Exemplo 2: Detecção de variantes de JCV usando ELISA Proteínas e peptídeos são isolados de uma amostra biológica usando técnicas de laboratório padrão (por exemplo, Maniatis). Ambos os componentes de proteínas celulares e proteinas não celulares são submetidos à análise.

Em um ensaio, a amostra é interrogada quanto à presença de polipeptídeos de VP1 do JCV compreendendo uma ou mais variantes da invenção. Os polipeptídeos são detectados usando-se ELISA sanduíche compreendendo anticorpos específicos para polipeptídeos de VP1 do JCV da invenção. Os anticorpos são gerados por inoculação de animais (por exemplo, coelhos) com os polipeptíideos da VP1 do JCV da invenção resultando em anticorpos policlonais. Se assim desejado, as células podem ser colhidas do animal inoculado para gerar anticorpos mo- noclonais. Os métodos para geração de ambos os anticorpos policlonais e monocionais são rotineiros na técnica. Os anticorpos contra variantes de —polipeptídeos da VP1 do JCV são imobilizadas em uma superfície sólida (por Ê exemplo, uma placa de 96 poços), com um tipo de anticorpo por poço ou área superficial. As amostras biológicas compreendendo os polipeptídeos - são adicionadas aos poços e incubadas com os anticorpos imobilizados. Quaisquer variantes de polipeptídeos da VP1 de JCV presentes na amostra se ligarão a um anticorpo específico para o polipeptídeo. Depois da incu- bação, a amostra é removida e as superfícies sólidas são lavadas para remover qualquer material não ligado. Como próxima etapa, uma solução contendo anticorpos adicionais específicos para peptídeos de VP1 do JCV é adicionada aos poços. Essa segunda alíquota de anticorpos criará o “san- duíche” (por exemplo, anticorpo imobilizado: polipeptídeo de VP1 de JCV: segundo anticorpo). Esse segundo anticorpo pode ser detectado usando-se, por exemplo, um anticorpo terciário marcado, permitindo a detecção dos polipeptídeos da variante de VP1 do JCV. Alternativamente, o próprio anticorpo secundário pode ser marcado.

Em um segundo ensaio ELISA, as amostras biológicas são ensaiadas quanto à presença de anticorpos contra um ou mais dos polipep- tídeos de variante de VP1 de JCV. Esse ensaio pode ser usado para deter- minar se um paciente está correntemente infectado com, ou foi previamente exposto a, uma variante de VP1 d JCV. Mesmo que a variante de VP1 do JCV não esteja mais presente, os anticorpos contra as variantes podem estar ainda presentes na amostra biológica e podem ser detectados. Nesse ensaio ELISA, os polipeptídeos de VP1 do JCV são fixados a uma superfície sólida e as amostras biológicas são incubadas com estes peptídeos.

Se os anticorpos específicos para esses polipeptídeos estão presentes nas amostras biológicas, eles se ligarão aos polipeptídeos.

Qualquer material não ligado é novamente removido.

A presença de anticorpo ligado é detec- tada usando-se um anticorpo secundário marcado.

Exemplo 3: Determinação da composição da área superficial accessível a solvente da proteína VP1

Cálculos de área superficial acessível requerem conhecimento das coordenadas tridimensionais da biomolécula.

Um modelo de homologia de partícula similar a vírus de VP1 do JCV foi construído usando-se a é estrutura de CoAq da partícula similar ao vírus SV40 como um modelo (PBD ID: 1SVA). MODELER (A.

Sali & T.L.

Blundell.

Comparative protein . modelling by satisfaction of spatial restraints.

J.

Mol.

Biol. 234, 779-815, 1993) algorithm was used for model building and the SCWRL3 (A.

A.

Canutescu, A.

A.

Shelenkov, and R.

L.

Dunbrack, Jr.

A graph theory algorithm for protein side-chain prediction.

Protein Science 12, 2001-2014 (2003)), a abordagem foi usada para refinamento da posição da cadeia lateral.

As áreas superficiais acessíveis a solventes polares e não polares foram calculadas usando-se o método de Lee e Richards (B.

Lee B & F.M.

Richards.

The Interpretation of Protein Structures: Estimation of Static Accessibility.

J.

Mol.

Biol 55, 379-400 (1971)). Subsequentemente, modelos tridimensionais de partículas similares a vírus das variantes da VP1 do JCV foram construídos, e áreas superficiais acessíveis a solventes polares e apolares de suas cadeias laterais foram subsequentemente calculadas.

À diferença na área superficial polar na variante foi calculada subtraindo-se as áreas superficiais acessíveis a solventes polares da sequência de consenso das áreas superficiais acessíveis a solventes polares da variante por base de cadeia lateral de aminoácido.

A diferença da área de superfície apolar na variante foi calculada subtraindo-se as áreas de superfície de solventes —apolares da sequência de consenso das áreas de superfícies de solventes apolares da variante na base da cadeia lateral do aminoácido.

Os resultados dos cálculos estão apresentados na tabela 3.

Tabela 3 Ganho em AS Variante Ganjo em AS polar Polar L55->F55 14,12 o K60->M60 27,35 13,22 K60->N60 -10,18 -3,54 K60->E60 -5,55 -2,1 S61->L61 49,72 -9,78 D66->H66 25,86 -7,95 D66->N66 15,35 23,4 - E69->D69 -6,01 27,12 N74->S74 -0,12 -30,62 K75->R75 1,43 11,83 N265->D265 -4,55 8,23 N265->T265 11,51 12,15 S$267->F267 92,2 -33,04 S8267->L267 85,2 -31,3 S269->F269 75,44 -15,91 S$269->Y 269 52,69 21 0271->H271 6,96 6,11 Exemplo 4: Análise de sequências das sequências de JCV A PML é uma doença desmielinizante, progressiva e geralmente fatal causada por infecção com o vírus JC e destruição de oligodendrócitos emfocos múltiplos no cérebro de indivíduos suscetíveis.

Embora o vírus JC seja altamente prevalente na população humana, a PML é uma doença rara que aflige exclusivamente somente uma percentagem pequena de indiví- duos imunocomprometidos, incluindo aqueles afetados por HIV (AIDS) ou fármacos imunossupressores.

Fatores virais específicos e/ou fatores espe- cíficos de hospedeiros, e não simplesmente o status imunológico, devem estar em jogo para se responsabilizarem pela discrepância bastante grande entre prevalência viral e baixa incidência da doença.

De acordo com a invenção, vários aminoácidos na superfície da proteína VP1 do capsídeo do vírus JC mostram evolução acelerada em sequências virais isoladas de pacientes com PML, mas não em sequências isoladas de pacientes saudáveis. Os exemplos descritos aqui proporcionam forte evidência de que pelo menos parte dessas mutações está envolvida na ligação ao ácido siálico, um receptor conhecido para o vírus JC. Métodos estatísticos de evolução molecular foram usados para realizar uma análise compreensiva das sequências da VP1 do vírus JC isoladas de 55 pacientes com PML e 253 sequências isoladas da urina de indivíduos saudáveis e foi verificado que um subconjunto de aminoácidos encontrados exclusivamente entre as sequências da VP1 de PML é adquirido via evolução adaptativa. A mode- : lagem da estrutura tridimensional do capsídeo do vírus JC mostrou que esses resíduos estão localizados dentro do sitio de ligação ao ácido siálico, - um receptor para vírus JC para infecção celular. O envolvimento de alguns desses sítios na ligação do receptor foi demonstrado ao mostrar uma redu- ção profunda das propriedades da hemaglutinação das partículas similares a vírus da proteina VP1 contendo essas mutações. Ao todo, esses resultados indicam que um fenótipo causador de PML mais virulenta do vírus JC é adquirido via evolução adaptativa que altera a especificidade viral para seu(s) receptor(es) celular(es).

Métodos: Trinta e cinco sequências de VP1 de tamanho natural de vírus JC isoladas de pacientes com PML e 253 sequências de VP1 de tamanho natural de vírus JC isoladas de pacientes saudáveis foram baixadas do GenBank. Além disso, 20 sequências de VP1 parciais eram disponíveis do GenBank possibilitando a análise total das 55 sequências para as posições 43-287. Além dessas 55 sequências da VP1 isoladas de pacientes com PML, a tabela 4 contém também informação de mais doze sequências par- ciais disponíveis de uma publicação por Sala e al. [Sala M, Vartanian JP, Kousignian P, Delfraissy JF, Taoufik Y, et al. (2001) Progressive multifocal —leukoencephalopathy in human immunodeficiency virus type 1-infected patients: absence of correlation between JC virus neurovirulence and polymorphisms in the transcriptional control region and the major capsid protein loci.

J Gen Virol 82: 899-907.]. Deve ser observado nesses exemplos que todas as amostras virais isoladas de pacientes com PML se originaram de tecidos do cérebro e do CSF, exceto por uma amostra isolada do rim (tabela 4). Todas as amostras virais isoladas de pacientes saudáveis se originaram da urina.

Alinhamentos múltiplos de sequências foram construí- dos usando-se TCoffee [Notredame C, Higgins DG, Heringa J (2000) T- Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.

J Mol Biol 302: 205-217]. Várias sequências de PML foram isoladas do mesmo indivíduo.

Ao se estudar a evolução das sequências virais, as mesmas sequências isoladas do paciente foram aceitas para análise desde que elas diferissem uma da outra em > 1 nucleotídeo.

Contudo, as sequências Ê “clonais” idênticas foram excluídas da análise.

Isso resultou no conjunto final - de 20 sequências de tamanho natural da VP1 e 42 sequências parciais da VP1 isoladas de pacientes com PML.

Todas as informações sobre a origem e clonalidade das sequências estão contidas na tabela 4. Árvores filogené- ticas foram construídas usando-se o método de probabilidade PhyMLmaximum [Guindon S, Gascuel O (2003) A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood.

Syst Biol 52: 696-704] com o modelo de substituição F84 [Kishino H, Hasegawa M (1989) Evaluation of the maximum likelihood estimate of the evolutionary tree topologies from DNA sequence data, and the branching order in hominoidea.

J Mol Evol 29: 170-179 and Felsenstein J, Churchill GA (1996) A Hidden Markov Model approach to variation among sites in rate of evolution.

Mol Biol Evol 13: 93-104.] e usando vários métodos incluídos no pacote PHYLIP (Felsensteinn J. 2005. PHYLIP version 3.6. Distributed by the author.

Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle). VP1 sequences isolated from PML patients and random subset of sequences isolated from healthy subsects were further analysed using PAML [Yang Z (1997) PAML: a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood.

Comput Appl Biosci 13: 555-556]. Múltiplos modelos de evolução de sequências (MO-M8) foram estudadas.

Teste de razão de probabilidade foi usado para avaliar a diferença entre os modelos M1 e M2 pare testar seleção positiva. Resíduos com probabilidades posteriores Bayes Empirical Bayes excedendo 0,5 na análise ou do conjunto de tamanho natural ou parcial estão reportados na tabela 5. Spidermonkey [Poon AF, Lewis FI, Frost SD, Kosakovsky Pond SL (2008) Spidermonkey: rapid detection of co- evolving sites using Bayesian graphical models. Bioinformatics 24: 1949- 1950] foi usado para analisar interação epistática. Spidermonkey foi corrido através do servidor da web Datamonkey server [Pond SL, Frost SD (2005) Datamonkey: rapid detection of selective pressure on individual sites of codon alignments. Bioinformatics 21: 2531-2533].

Tabela4 Sequências da VP1 de JCV de pacientes sem PML: BAC66394, BAC66418, BAC66382, BAB11716, BAB11722, AAK28466, - AAK28460, AAK28478, BAC66400, BAC66388, BADO6126, BACG66406, AAK97970, AAK97964, BAC81952, BAC81958, AAMBS9309, AAM8S9303, BAC81922, BAC81916, BAC81910, BAC81904, AAM89297, BAD11896, BAC81946, BAE45426, BAE45360, BADO6120, BAE45432, BAAO01962, BAE45420, BAE45414, BAE45384, BAE45378, BAE45372, AAK98036, BAE45402, BAE45408, BAE45396, BAE45444, BADO6024, BAE75838, BAE75832, BAE75826, BAE75820, BAE75814, AAK98030, AAK98024, AAK98018, AAK98010, AAK98006, AAK98000, BAE45438, BAE45390, BADO6108, BADO6102, BADO6096, BADO6090, BADO6O84, BADO6SO48, BADO6030, BADO6018, BADO6O54, BADO6042, BADO6036, AAG30857, BAE45366, AAN8SS455, BADO6150, AANSS449, AAK98042, BADO6174, BADO6156, BADO6072, BADO6O6O, AAN8S473, BAC81840, BAF40841, BAF40835, BAF40829, BAF40823, BAF40811, BAF40847, BAF40781, BAF40817, BAF40799, BAF40793, BAF40787, BAF40745, AAN85467, AANSS461, BAC81834, BAF40751, BAF40805, BAAO1961, BADS98972, BAD98966, BADO06227, BAC66430, BAC66412, BAD91887, BAD21235, BAD27118, BAC66424, BAAO1958, BAB11710, BAD21265, BAD21259, BAD21253, BAD21241, BAD21229, BAD21247, BAD21283, BAD21271, BAD21295, BAD21289, BAA01959, BAAO1960, BAD11848, BAD11842, AAMB89339, AAM89327, BAD11836, BAC81852, BAC81858, BADO6144,

AAG37198, AAM89315, BADO6138, BAD11890, BAD11884, BAD11878, BAD11872, BAD11866, AAK97994, BAB11698, BAC81940, BAC81964, AAK97946, BADO6O66, BAF40769, BAC81870, BAC81864, BAC81934, BAC66376, BAC81874, BAC81846, AAK97940, BAC81898, BAC81892, AAKS9S7922, AAK97916, AAK97910, AAK97982, BAF40763, BADO6078, AAK97958, BAD11860, BAF40757, BADO6162, AAMB9321, BAD11854, AAK97928, BAD11830, BAF40775, BAB11704, BAC81928, AAK97988, BAD11902, BAD11824, BADO6233, BAC81886, BAC81880, AAMB9345, BADO6168, AAM89333, BADO6132, BAC82365, AAK97952, BAAO1964, BAAO1963, AAK97934, BADO6114, AAK97976, BAD21277, AAR13077, BAEO02908, AAR12957, AARO2463, AARO2457, BAEO3058, AAR8S9235, : BAEO2896, AAR89241, BAEOZ2890, BAEOSO64, BAEO3O70, BAEO3082, - AAG34673, AAG34667, AARB9205, AARBS9217, AAR1I3659, BAEO3088, BAEO3160, AAQ88264, AAR8S9187, AAR8S9283, AAK28472, AAROG6G661, AARBS9253, AAR89247, AARS9199, AAR8S9193, AAR89229, AAR89223, AARB8S9265, AAR32743, AAR8S9277, BAEO3S166, BAEO2920, BAEO2914, BAEO3112, BAEO3106, BAEO3100, BAEO3094, BAEO3SO76, BAE02944, BAEO02998, BAE02992, BAEO2986, BAEO2980, BAEO2974, BAE02968, BAEO02962, BAEOSO16, BAEO2902, BAEO3SO40, AAR8S9211, AAR8B9271, BAFEO02956, BAEO2938, BAEO2932, BAEO3148, BAEO2950, BAEO3004, BAEO3154, BAEO3S142, BAEO3S136, BAEO3S130, BAEO3S124, BAEO3118, BAE02926.

T AB183544 BAEOO141 cérebro 23 354 1 3 8 |AB1I90449 BAEOO0147 cérebro 31 354 1 4 9 AB190453 BAEOO0171 cérebro 35 354 1 4 | AB190452 BAEOO0165 cérebro 34 354 1 4 11 | AB190451 BAEO0159 cérebro 3-3 354 1 4 12 | AB190450 BAEOO0153 cérebro 3-2 354 | 4 13 | AY536239 AATO9819 CcSF SA21. 01 354 q 5 14 | AB2120952 BAE94726 cérebro ac1 354 1 6 | AB212953 BAE94732 cérebro ac2 354 1 T 16 | D26589 BAAOS636 cérebro Aic-1a 354 1 8 17 | AFO04349 AAB62680 rim GS/K 354 1 9 18 | AFOO4350 AAB62687 cérebro GS/B 354 1 9 - 19 | D11365 BAAO1967 cérebro Her1-Br 354 1 10 | AB214923 BAE02848 CcsF JVL-10 245 39 1 21 | AB214924 BAE02849 CcsF JVL-11 245 39 112 22 | AB214925 BAE02850 CcSF JVL-12 245 39 13 23 | AB214926 BAE02851 CcsF JVL-13 245 39 14 24 | AB214927 BAE02852 CSF JVL-16 245 39 15 | AB214928 BAE02853 CcSF JVL-1A7 245 39 16 26 | AB214929 BAE02854 csF JVL-18 245 so 7 27 | AB214930 BAE0O2855 CSF JVL-19 245 39 18 28 | AB214912 BAE02837 cérebro JVL-1a 245 39 19 29 | AB214913 BAE02838 cérebro JVL-1b 245 39 19 | AB214914 BAE02839 cérebro JVL-1c 245 39 19 31 | AB214915 BAE0O2840 cérebro JVL-1d 245 39 19 32 | AB214916 BAE02841 cérebro JVL-2 245 39 20 33 | AB214931 BAEO2856 CcsF JVL-20 245 39 21 34 | AB214917 BAE02842 cérebro JVL-3 245 39 22 | BAEN2843 BAE02843 cérebro JVLA4 245 3o 23 36 | AB214919 BAE02844 cérebro JVL-5 245 39 24 37 | AB214920 BAE02845 cérebro JVL-7 245 39 25 38 | AB214921 BAE0O2846 cérebro JVL-8 245 39 26

As sequências de gene de VP1 de JCV foram baixadas do GenBank (tabela 4) e usadas para construir uma árvore filogenética para um subconjunto aleatório de sequências isoladas de indivíduo saudável e sequências de comprimento natural isoladas pacientes com PML, distintos (figura 4a). A figura 4 é uma distribuição filogenética de vírus associados à PML. (A) Distribuição filogenética ampla de vírus JC causador da PML. São indicadas de árvore ramificações (rotuladas por números de Gl) corres- pondentes a vírus causadores de PML e vírus isolados de paciente saudá- vel. A árvore é construída com base nas sequências de DNA de gene de PV1 usando o método de probabilidade máxima. Somente uma sequência : por paciente foi incluída. (B) Distribuição filogenética de mutações no códon

269. A árvore representa genes de VP1 (rotulados por números Gl) de vírus - isolados de pacientes com PML. As mutações nos códons de Ser269 são indicadas por inserções de textos. Os círculos nas ramificações refletem um suporte LRT. A posição 269 foi mascarada antes de construção da árvore para evitar atração de ramificações com mutações de seu códon. O método de probabilidade máxima PhyML [Guindon S, Gascuel O (2003) A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst Biol 52: 696-704.] foi usado com o modelo de substituição —F84 [Kishino H, Hasegawa M (1989) Evaluation of the maximum likelihood estimate of the evolutionary tree topologies from DNA sequence data, and the branching order in hominoidea. J Mol Evol 29: 170-179 e Felsenstein J, Churchill GA (1996) A Hidden Markov Model approach to variation among sites in rate of evolution. Mol Biol Evol 13: 93-104]. A aplicação de vários métodos incorporados ao método de probabilidade máxima do pacote PHYLIP, métodos com base em distância e com base em parcimônia de reconstrução filogenética produziu resultados similares. Sequências virais isoladas de pacientes com PML não se agruparam na árvore filogenética e estão amplamente distribuídas entre vários tipos virais e origens geográficas das amostras (figura 4a). Isso é ainda suportado por medição de estratificação de população muito baixa Fsr [Slatkin M, Maddison WP (1990) Detecting isolation by distance using phylogenies of genes. Genetics 126:

249-260] (1,8 %). Em concordância com estudos anteriores [Zheng HY, Takasaka T, Noda K, Kanazawa A, Mori H, et al. (2005) New sequence polymorphisms in the outer loops of the JC polyomavirus major capsid protein —(VP1) possibly associated With progressive — multifocal leukoencephalopathy. J Gen Virol 86: 2035-2045, Jobes DV, Chima SC, Ryschkewitsch CF, Stoner GL (1998) Phylogenetic analysis of 22 complete genomes of the human polyomavirus JC virus. J Gen Virol 79 ( Pt 10): 2491- 2498, and Agostini HT, Deckhut A, Jobes DV, Girones R, Schlunck G, et al. (2001) Genotypes of JC virus in East, Central and Southwest Europe. J Gen Virol 82: 1221-1331], os vírus causadores de PML não estão limitados a um : tipo filogenético viral específico.

Sequências de vírus isolados de pacientes com PML foram . usados, bem como aqueles de pacientes saudáveis com o objetivo de determinar se a pressão seletiva evolucionária associada à PML está agindo sobre o gene de VP1 viral. Essa análise utilizou o pacote PML [Yang Z (1997) PAML: a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood. Comput Appl Biosci 13: 555-556] desenhado para identificar a presença de códons desenvolvendo-se sob seleção positiva. PMAL avalia múltiplos modelos evolucionários usando o teste de probabilidade paramé- trico. Vários modelos foram testados incluindo um modelo de evolução neutra, um modelo quase neutro que permite purificar a seleção (por exemplo, negativa), e um modelo heterogêneo que permite que alguns códons se desenvolvam sob seleção positiva e que outras posições de códons se desenvolvam sob seleção negativa (tabela 5). Vários modelos —maiscomplexos foram também testados.

No caso de sequências de VP1 de JCV isolado de pacientes saudáveis, o modelo evolucionário quase neutro envolvendo uma mistura de códons que se desenvolvem de modo neutro e códons sob seleção de purificação superou claramente em desempenho o modelo puramente neutro (valor p 7,0x10º). Contudo, não foi encontrado suporte estatístico para modelos mais complexos incluindo modelos com seleção positiva. Em contraste, para sequências de VP1 isoladas de pacientes com PML, permi-

tindo que códons se desenvolvam sob seleção positiva, resultou em um aumento altamente significante na probabilidade dos modelos (tabela 5). O modelo com três categorias de sítios incluindo sítios que se desenvolveram sob seleção purificadora, sítios neutros e sítios sob seleção positiva explicou os dadosde modo significantemente melhor que o modelo quase neutro limitado aos sítios neutros e os sítios sob seleção purificadora (valor p 2,5x107). Modelos mais complexos não mostraram aperfeiçoamento signifi- cante sobre o modelo mais simples com três categorias de códons.

Quatro posições de códons (correspondente aos aminoácidos 55,60,267 e 269) foram identificadas como se desenvolvendo sob seleção : positiva na amostragem de PML de sequências de comprimento natural (tabela 5). Probabilidades a posteriori Bayesianos quanto à seleção positiva : computadas por PML estavam acima de 0,5 para essas posições de códons.

A probabilidade posterior para seleção positiva no códon 269 estava próxima de1. Para aumentar o poder de análise, sequências parciais de VP1 foram adicionadas do vírus JC isolados de pacientes com PML.

A adição de sequências parciais revelou sinal de seleção positiva no códon 265 (tabela 5). Tabela 5. Códons sob seleção positiva na amostra de PML.

Conjunto de sequências Conjunto de sequência de SS Mutações códons 43-287 (n=42 — EEE | Posição Twr mute | Propabiidade Empírica Byes e a posteriori Bayes — | [55 A ba a TR leo dk men Jos ha | [as AN RR er O oo A e eee a TA Neste exemplo, não foram observadas duas mutações de VP1 no mesmo isolado.

A análise por método de Spidermonkey [Poon AF, Lewis FI, Frost SD, Kosakovsky Pond SL (2008) Spidermonkey: rapid detection of co-evolving sites using Bayesian graphical models.

Bioinformatics 24: 1949- 1950] revelou interações epistáticas entre as posições 55 e 269 e entre as posições 69 e 269 (com probabilidades a posteriori 0,88 e 0,70, respecti- vamente). Isso pode refletir interações epistáticas de “diminuição de retorno”, por exemplo, mutações subsequentes não são benéficas e possivelmente prejudiciais no resíduo de uma mutação única.

Todas as substituições nesses cinco códons estão claramente associadas à PML.

Pelo menos 52% de vírus JC (ou 36 de 69 sequências, inclusive sequências parciais) isolado de paciente com PML têm pelo menos uma dessas mutações, ao passo que nenhuma dessas substituições foi : observada nas sequências virais de tamanho natural de pacientes saudáveis (tabela 6). Tabela6. Variabilidade dos aminoácidos de sequências de VP1 de JOV

Pos | mst. | semencescom | none — | ue | semen [ns [us ção | rência eso comeutet | (589) | ções, (Total) ore ea 8 47253) 02 Tim TE] mM 55 Pa EAEEoli253 Ea EO TEE FE SEE TRE EEE ON6A ENT MEN SuEica Fc TORA REDES PERCO RR E E O AIR Oo 61 Ss 0 (253) 0 se tt | 5164) = Bs 1L4P, 66 ado ola o Oo Bo seara Do ato o: oHANO 69 E | 5 (253) 2 55 | 2(64) 3 2D 7O s 2 (253) 1 26 | 0 (64) o 7a N 6 (253) 2 6s 12(64) 19 128 ES RI ale ot o eR Asa a nan | nn0R Laet casa o CE TIETE FABI To ANOS 13 | | 59 (253) 23 so 18 (64) 28 18L ns) gy 1(253) o 1E 0 (64) o IL | 232889 | o AS A Sn a ada cn [tas 235 O (asso o o o oo (BM 50 fe Seo E a o astsa Mo oa | tea o TRA 129 HO EC ops TE TO SUECT 1 6a DEUE E ECAROO 1 N 1(253) o 1K | 0 (64) º É 134 | A 186 (253) Ta 186G 59(64) 2 596 153 | E | 1(253) o 1K 0(52) o 158 | v | 5 (253) 2 5sL 362) 6 3L 164) T 177 (253) 7o 176K 1M) 48(52) 92 A48K à: 167 | D 1(253) o 1H 0(52) o | EF 1(253) o " 0 (52) o 185 | E 1(253) o 10 0(52) o -. 192 | ED des o o SA nn E no na ARA anda sea dv [Ola do cao od Io coa fa EAN ENC E 5 Er ms O mc cTE cm 265 E NE o a 0253) Ro cao 00 E oo mealBE Ns 4 (DO) a Eãe 1 do o ECSDRU SBT NEAS AAA ES Aol05SI/5S 3 EapNOEA TE be | RO ACE AE de SA E. TR Sl TALE ANTES ao 6) dis 24 = GS 2n- o | 02530 To oo ooo ABB o 02 27 | R 1(253) o 1K 0 (56) o 287 | R 1(253) o 1K 0 (56) o 310 | D 1(253) o 0 0 (56) o 30 | Q 1(253) o 1H | 0 (56) o 321 ! 134 (253) 53 1340 3234) 88 332 | q | 184(253) 73 184E 33 (34) on 245 R 4 20 (253 8 20K 8 (34 8 OK Os resíduos destacados com sombreamento mais escuro são distintos grupos sem PML e com PML e têm probabilidade Empírica Bayes e a posteriori Bayes para seleção positiva >0,5 (tabela 5). Os resíduos destacados com sombreamento mais claro são distintos entre grupos com PMLesemPML.

O sinal mais forte de seleção positiva na amostra de PML foi detectado para o códon que codifica o aminoácido na posição 269. A figura 4b mostra que as mutações independentes múltiplas de Ser269 para resíduos aromáticos de fenilalanina e tirosina foram observadas na VP1 de vírus associados à PML. A existência de mutações independentes múltiplas não é um artefato da construção filogenética porque as linhagens com variantes mutantes são separadas por ramificações múltiplas com mais de

90% de suporte por análise de Bootstrap e suporte para o teste de razão de probabilidade implementado por PhyML [Guindon S, Gascuel O (2003) À simple, fast, and accurate algoritim to estimate large phylogenies by maximum likelihood.

Syst Biol 52: 696-704]. Essas linhagens correspondem atipos filogenéticos de vírus JC, diferentes, identificados previamente e são de localizações geográficas diversas [Jobes DV, Chima SC, Ryschkewitsch CF, Stoner GL (1998) Phylogenetic analysis of 22 complete genomes of the human polyomavirus JC virus.

J Gen Virol 79 ( Pt 10): 2491-2498 and Agostini HT, Deckhut A, Jobes DV, Girones R, Schlunck G, et al. (2001) Genotypes of JC virus in East, Central and Southwest Europe.

J Gen Virol 82: 1221-1331]. As sequências de VP1 isoladas de pacientes com PML e : subconjuntos aleatórios de sequências isoladas de pacientes saudáveis foram ainda analisadas usando-se PAML [Yang Z (1997) PAML: a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood.

Comput Appl Biosci 13: 555-556]. Múltiplos modelos de evolução de sequências incorporados em PMAL foram examinados incluindo o modelo puramente neutro (MO), modelo quase neutro (M1), modelo com seleção positiva (M2) e outros modelos mais complexos (M3-M8). O teste de razão de probabilidade (LRT) foi usado para comparar a diferença entre os modelos M1 e M2 para testar quanto à seleção positiva.

Valores P para seleção positiva em três conjuntos de dados com probabilidades a posteriori bayesianas para cada posição de códon.

Os resíduos com probabilidades empíricas Bayes a posteriori Bayes excedendo 0,5sãomostrados.

Exemplo 5: Mutações identificadas se enquadram no sítio de ligação de ácido siálico Métodos: Um modelo de homologia da unidade pentamérica de proteina de VP1doJCV com MODELER [Sali A, Blundel! TL (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints.

J Mol Biol 234: 779-815] usando a estrutura de VP1 MPY V (Banco de Dados de Proteína ID: 1 VPS

[Stehle T, Harrison SC (1997) High-resolution structure of a polyomavirus VP1-oligosaccharide complex: implications for assembly and receptor binding. Embo J 16: 5139-5148] como um modelo. O modelo de NeuNAc- (a2,3)-Gal(b1,3)—t[(a2,6)-NeuNAc| Glc-NAc tetrassacarídeo foi construído com base na estrutura de NeuNAc-—(a2,3)-Gal-(b1,3)t[(a2,6)-NeuNAc]-Glc- Nac ligado a VP1 MPY V [Stehle T, Harrison SC (1997) High-resolution structure of a polyomavirus VP1-oligosaccharide complex: implications for assembly and receptor binding. Embo J 16: 5139-5148]. O modelo da VP1 de JCV/NeuNAc-(a2,3)Gal-(b1,3)t(a2,6)-NeuNAcC]l-Glc-NAc tetrassaca- rídeo foi extensivamente refinado em CHARMM [Brooks BR, Bruccoleri RE, Olafson BD, States DJ, Swaminathan S, et al. (1983) CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations. Journal . of Computational Chemistry 4: 187-217] e foi analisado usando software de visualização PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System (2002) DeLano Scientific, Palo Alto, CA, USA. www.pymol.org).

Resultados: De acordo com os aspectos da invenção, o papel funcional das cinco posições de aminoácidos identificadas pode ser avaliado construindo- se um modelo molecular tridimensional da VP1 do vírus JC ligada ao NeuNAc-(a2,3)Galt(b1,3)t[(a2,6)-NeuNAc|-Glc-NAc tetrassacarídeo com base na estrutura de cristal do complexo de VP1 MPy V/oligossacarídeo [Stehle T, Harrison SC (1997) High-resolution structure of a polyomavirus VP1-oligosaccharide complex: implications for assembly and receptor binding. Embo J 16: 5139-5148]. O modelo estrutural mostrado na figura 5a sugere que todos os aminoácidos identificados por PAML são agrupados na superfície da proteina VP1 no sítio de ligação ao ácido siálico e são prováveis de estarem envolvidos na ligação de ácido siálico, A figura 5 é um modelo estrutural do complexo de VP1 de JCV/ NeuNAc-(a2,3)-Gal(b1,3)— [(a2,6)-NeuNAc]-Glc-NAc tetrasaccharide complex. Tetrassacarídeo. (A) Um —modelo do pentâmero básico da PV1 de JCV no complexo com NeuNAc- (a2,3) Gal(b1,3)—(a2,6)-NeuNAc]-Glc-Nac tetrassacarídeo. Superfícies das cinco cadeias de VP1 do JCV são mostradas. O motivo RG essencial para o ácido siálico do núcleo é mostrado.

Resíduos mutados associados à PML confirmados por PAML são indicados (L55, K60, S265, S267, S269). Mutações adicionais únicas para amostras isoladas de PML são também mostradas (S62, D66, S123, H129, V223 e 0271). (B) Uma vista em close do complexo de NeuNAc-(a2,3)Gal(b1,3)T(a2,6)-NeuNAc| Glc-NAc tetrassacarídeo/VP1 de JCV.

A localização de V296 da VP1 MpyV, que é prevista como sendo equivalente a S269 da VP1 de JCV é mostrada em rede.

Adicionalmente, em algumas modalidades, as substituições L55F, K6O0M, S267F, e S269F podem induzir conflitos estéricos com o sacarídeo modelado levando a uma diminuição da afinidade da interação.

A afinidade ã por ácido siálico foi relacionada com a patogenicidade viral de estudos múltiplos de vírus da flu, poliomavírus de camundongo, e vírus minuto de - camundongo [Srinivasan A, Viswanathan K, Raman R, Chandrasekaran A, Raguram S, et al. (2008) Quantitative biochemical rationale for differences in transmissibility of 1918 pandemic influenza A viruses.

Proc Natl Acad Sci USA 105: 2800-2805, Bauer PH, Cui C, Liu WR, Stehle T., Harrison SC, et al. (1999) Discrimination between sialic acid-containing receptors and pseudoreceptors regulates polyomavirus spread in the mouse.

J Virol 73: 5826-5832 e Nam HJ, Gurda-Whitaker B, Gan WY, llaria S, McKenna R, et al (2006) Identification of the sialic acid structures recognized by minute virus of mice and the role of binding affinity in virulence adaptation.

J Biol Chem 281: 25670-25677. Particularmente, a patogenicidade do poliomavírus de camundongo, um parente próximo do vírus JC, foi mapeado para uma substituição de aminoácidos de VP1 na posição 296 [Bauer PH, Bronson RT, FungSC,FreundR, Stehle T, et al. (1995) Genetic and structural analysis of a virulence determinant in polyomavirus VP1. J Virol 69: 7925-7931], uma posição ortóloga à posição 269 em vírus JC humano que mostrou o sinal mais forte da seleção positiva de isolados virais causadores de PML, neste estudo.

Foi mostrado na figura 5b que serina 269 do vírus JC humano e —valina296 do poliomavírus de camundongo ocupam localizações idênticas no pocket de ligação ao ácido siálico.

As posições 61, 66, 123, 129, 223 e 271 são todas limitadas à amostra de PML (tabela 6) e também alinhadas com o pocket de ligação de ácido siálico (figura 5b). É possível que aqueles resíduos não tenham sido detectados por análise PAML devido ao pequeno tamanho da amostra e que o desenvolvimento de PML é acompanhado por seleção positiva por aminoácidos envolvidos na ligação de ácido siálico em uma maioridade de casos.

O comprimento da árvore filogenética na análise é curto, limitando, assim, o poder para detectar a seleção positiva [Anisimova M, Bielawski JP, Yang Z (2001) Accuracy and power of the likelihood ratio test in detecting adaptive molecular evolution.

Mol Biol Evol 18: 1585-1592 e Anisimova M, Bielawski JP, Yang Z (2002) Accuracy and power of Bayes prediction of amino acid sites under positive selection.

Mol Biol Evol 19: 950-958]. Teste de razão de probabilidade para seleção positiva usando uma árvore curta é : conservado [Anisimova M, Bielawski JP, Yang Z (2001) Accuracy and power of the likelihood ratio test in detecting adaptive molecular evolution.

Mol Biol É 15 Evol 18: 1585-1592], e análise Bayes Empírica Bayes é de poder limitado : [Anisimova M, Bielawski JP, Yang Z (2002) Accuracy and power of bayes prediction of amino acid sites under positive selection.

Mol Biol Evol 19: 950- 958]. Assim, mutações VP1 específicas para PML adicionais podem ser também positivamente selecionadas.

As mutações no resíduo 107 são tam- bém encontradas exclusivamente na amostra de PML.

Contudo, não mos- trou evidência de seleção positiva de acordo com PML e não está localizada no pocket de ligação de ácido siálico.

Exemplo 6: Mutantes de JCV e ligação ao ácido siálico Métodos: Ensaio de hemaglutinação e partículas similares a vírus Ensaio de hemaglutinação foi realizado como previamente descrito [ Chapagain ML, Nguyen T, Bui T, Verma S, Nerurkar VR (2006) Comparison of real-time PCR and hemagaglutination assay for quantitation of human polyomavirus JC.

Virol J 3: 3 and Padgett BL, Walker DL (1973) Prevalence of antibodies in human sera against JC virus, an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy.

J Infect Dis 127: 467- 470]. Em resumo, sangue humano tipo O foi lavado duas vezes e suspenso em tampão de Alsever (citrato de sódio 20 mM, NaCl 72 mM, glicose 100 mM, pH 6,5 ajustado com ácido acético) em uma concentração final de 0,5%. Diluições de duas vezes em série de VLPs foram preparadas no tampão de Alsever e um volume igual de RBCs foi adicionado em cada poço de uma placa de microtítulo de fundo em “U” de 96 poços e incubação a 4ºC por3a6 horas.

A concentração mínima de HA é a concentração mais baixa de proteína VLP que ainda aglutinou as RBCs.

Genes que codificam a proteína de VP1 das cepas do vírus JC BAEOO0117, AATO9831 e AAQ88264 foram criados sinteticamente e clonados em um vetor de transporte Gateway pDEST8 (Invitrogen) para transferência no sistema de expressão do baculovírus pFASTBAC para expressão de baculovirus nas células SF9. A purificação de VLPs foi realizada a partir de : cerca de 100 gramas de precipitados de células congelados provenientes de - 5 litros de cultura.

As células foram ressuspensas em 500 ml de PBS contendo 0,1 mM de CaCbh.

As células foram rompidas passando-se a suspensão de células duas vezes através de um Microfluidizador de . Microfluidos.

O fragmento celular foi removido por precipitação em 8000 X G por 15 minutos.

O volume de sobrenadante foi ajustado para 720 mL com PBS/CaCl,; e carregado sobre chumaços com 5 mL de sacarose a 40%. Partículas similares a vírus foram duas vezes precipitadas através dos — chumaços de sacarose em um rotor SW28, em 1000.000 X G, por 5 horas.

Os precipitados de VLP foram ressuspensos em PBS/CaCl, e então tratados com desoxicolato a 0,25%, por 1 horas, a 37ºC, seguido pela adição de NaCl A4M/CaClz 0,1MM, por 1 hora, a 4ºC.

O material precipitado foi removido por centrifugação em 8.000 X G, por 15 minutos.

O sobrenadante resultante foi concentrado e tampão trocado por ultrafiltração através de uma membrana Pelicon-2 500,00 MWCO (Millipore). As VLPs concentradas foram aplicadas ao centro de um gradiente por etapa de 25-40% de Optiprep (Sigma) e tiras formadas a 190.000 g, por 17 horas em um rotor do tipo 50.2. As tiras de VLP foram coletadas e então concentradas e o tampão trocado em uma — célula agitada Amicon com uma membrana 300,000 MWCO.

A qualidade da VLP foi determinada por eletroforese de gel e microscopia eletrônica (figura 6). A concentração de proteínas foi determinada pelo ensaio Micro BCA

(Pierce). A microscopia eletrônica foi realizada no Department fo Cell Biology em Harvard Medical School. Amostras de VLP foram colocadas em grades de carbono, lavadas brevemente em água e coloridas negativamente com acetato de uranila e deixada secar. As grades foram inspecionadas e imageadas em Technai G2 Spirit BioTWIN TEM.

Resultados: Para verificar experimentalmente o papel que essas substitui- ções desempenha na ligação ao ácido siálico pelo capsídeo de VP1, as partículas similares a vírus (VLP) foram produzidas recombinantemente a partir da proteina VP1 codificada por vários vírus, de ocorrência natural, diferentes. As VLPs foram geradas a partir de sequências de VP1 viral codificando substituições com um dos sinais mais fortes da seleção positiva ã identificada por PAML, uma com fenilalanina na posição 269 (F269) e a outra com fenilalanina na posição 55 (F55). Dois genes de VP1 diferentes " 15 que foram usados como controles não continham nenhuma das mutações À associadas à PML identificadas, uma de um indivíduo saudável (WT) e outra de um paciente com PML (Mad-1) (tabela 7).

Tabela 7. Variabilidade dos aminoácidos de sequências de VP1 de JCV entre as VLPs.

[| ss 74 175 [117 [126 [134 [166 [164 [260 [321 [332 [345] Mel o rr Pre AAQ88264 Es FE AATO9831

EEEF AFF 1)P03089 BAEOO117 Hemaglutinação viral de células vermelhas do sangue (RBCs) mostrou que é uma medição confiável da ligação ao ácido siálico por poliomavírus [Freund R, Garcea RL, Sahli R, Benjamin TL (1991) A single-

amino-acid substitution in polyomavirus VP1 correlates with plaque size and hemagglutination behavior.

J Virol 65: 350-355 and Liu CK, Wei G, Atwood WJ (1998) Infection of glial cells by the human polyomavirus JC is mediated by an N-linked glycoprotein containing terminal alpha(2-6)-linked sialic acids.

JVirol72: 4643-4649]. Todas as quatro VLPs foram testadas em um ensaio de hemaglutinação.

Interessantemente, ambas as variantes F55 e F269 mostraram mais que 8000 vezes menos atividade de HA que qualquer VLP de controle (tabela 7a). Especificamente, a variante F55 falhou completa- mente em aglutinar RBCs humanas do tipo O mesmo em 200 ug/mL, a concentração mais alta testada, e a variante F269 mostrou atividade de HA muito baixa já que ele causou hemaglutinação somente em concentrações acima de 25 pg/ml.

Ao mesmo tempo ambos os L55 e S29 contendo : variantes (WT e Mad-1) causaram hemaglutinação das RBCs em concen- trações abaixo de 0,375 ng/ml e 6,25 ng/mL, correspondentemente.

Neste ' 15 exemplo, o mutante F55 tem a diferença de aminoácidos única com sua : variante do tipo selvagem (WT) correspondente.

Portanto, a mudança na hemaglutinação pode ser especificamente atribuída a essa reposição de aminoácido.

Além da alteração na posição 269, a variante do mutante F269 tem duas posições de aminoácidos adicionais que são diferentes de sua variante de controle correspondente (Mad-1). Ambas dessas alterações de aminoácidos não são específicas para PML e são improváveis de explicar a diferença na hemaglutinação.

Embora o isolado Mad-1 tivesse se originado de um paciente com PML patient [Padgett BL, Walker DL, ZuRhein GM, Eckroade RJ, Dessel BH (1971) Cultivation of papova-like virus from human brainwith progressive multifocal leucoencephalopathy.

Lancet 1: 1257-1260], ele não contém nenhuma mutação específica de PML que se correlaciona bem com sua capacidade de hemaglutinar RBCs.

A falta de mutações PML- gênicas nesse isolado de MPL sugere que as mutações da VP1 não são um mecanismo exclusivo que leva ao desenvolvimento da PML.

Tabela 7A.

Resíduos 55 e 269 na proteína VP1 desempenham um papel muito importante na hemaglutinação das RBCs por Partículas similares a vírus (VLPs).

A hemaglutinação foi conduzida conforme descrita em Materiais e Métodos usando diluições em série das VLPs, começando de 200 ug/mL. As VLPs foram adicionadas às RBCs tipo O e incubadas a 4ºC, por 3 horas.

À 5 A aglutinação é visualizada pela falta de um precipitado redondo formado pela decantação das RBCs da suspensão. E55 é uma variante da VP1 com - fenilalanina na posição 55 (AAT09831), F269 é uma variante da VP1 com fenilalanina na posição 269 (BAEO011). WT (AAQ88264) e Mad-1 (PO3089) : são variantes de VP1 com leucina e serina nas posições 55 e 269, respecti- : 10 vamente.

As sequências de proteína foram alinhadas usando-se Clustal W, aminoácidos diferentes em pelo menos uma sequência do resto das sequências são mostrados com suas posições indicadas.

Exemplo 7: JCVs mutantes têm ligação prejudicada a gangliosídeos Gangliosídeo ELISA: Os seguintes gangliosídeos foram preparados em 1 mg/ml em metanol: asialo GM1 (humano), monosialo GM1 (humano), GM2 (humano), GM3 (bovino), GM4 (humano), disialo GD1a (bovino), GD1b (humano), GD2 (humano), GD3 (bovino), trisialo GT1b (bovino). Todos os gangliosídeos foram adquiridos da Calbiochem, exceto o GM2 que foi adquirido da Americam RadioChemicals.

Os gangliosídeos foram diluídos para 0,1 ng/mL e adicionado 0,1 mlL/poço de uma placa ELISA (Corning 9018); o metanol foi deixado evaporar durante a noite. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas com 0,25 ml/poço de 1X de PBS com Ca” e Mg?*, 1% de BSA (Fraction V), 0,1% de Tween-20, por 1 hora. As placas foram então transferidas sobre gelo — todas as incubações sequenciais foram realizadas a +4ºC.

As VLPs foram preparadas a 0,03 mg/ml em tampão de bloqueio; o tampão foi removido da placa e as VLPs adicionadas 0,1 mL/poço. A placa foi removida por 60 a 90 minutos. Anti-Vp1 de JCV (clone —PABS597) foi preparada em 0,002 mg/ml em tampão de bloco. As placas foram lavadas com 0,25 mL/poço de tampão de bloco; anti-VP1 foi adicio- nado 0,1 mL/poço. A placa foi incubada em gelo por 45 a 60 minutos. IgG anticamundongo de cabra conjugada com HRO (H + L) (Jackson ImmunoResearch) foi preparada em 1:5.000 em tampão de bloco. A placa foi lavada; 0,1 ml/poço do HRP-anticamundongo foi adicionado. A placa foi incubada em gel, por 30 minutos. A placa foi lavada e desenvolvida com 0,1 : mL de 1-Step Turbo TMB (Thermo Scientific Pierce). A revelação da cor foi . monitorada e a reação interrompida com adição de 0,1 mL de H;PO, 2N. As placas foram então lidas em 450 nm em espectrofotômetro (Molecular É 15 Devices).

õ Cada gangliosídeo tinha poços de controle (HRP-IgG antica- mundongo, somente, PAB597 e HRP-IgG anticamundongo). O controle de resíduo foi designado como somente HRP-IgG anticamundongo. Cada poço experimental foi calculado usando-se a fórmula (Experimental-Resíduo/Re- síduo).

A ligação de WT JCV foi avaliada versus uma variedade de gangliosídeos. A figura 7 mostra que o WT JCV se liga às algumas glicanas, mas não a todas. A estrutura dos gangliosídeos selecionados é mostrada na figura 8 e sua capacidade de se ligar ao WT JCV é indicada.

A figura 9 mostra que as mutações F55 e F269 não são capazes de se ligarem às Neu5Aca(2-3) e a(2-6) glicanas. A estrutura dos gan- gliosídeos selecionados é mostrada na figura 10 e sua capacidade de se ligar ao JCV mutante é indicada.

A figura 11 compara a capacidade do WT e mutante para JOV — seligarem aos gangliosídeos selecionados.

Exemplo 8. O JCV mutante se liga às linhagens de células gliais, mas não aos linfócitos.

Análise por citometria de fluxo de coloração da VLP: As seguintes células foram usadas: SVG-A (presente de Walter Atwood), células mononucleares periféricas isoladas provenientes de doadores.

As células aderentes foram destacadas usando-se Accutase, coletadas, e lavadas.

O sangue venoso foi retirado de doadores saudáveis; as PMBCs foram isoladas usando-se um protocolo padrão envolvendo centrifugação sobre Ficoll-Hypaque Plus (Amersham Biosciences). Todas as colorações foram realizadas em gelo em tampão de PBS contendo cálcio e magnésio, Albumina sérica bovina a 1% (fração V), azidade sódio 2mMM.

As células (1 — 5 x 10º células/amostra) foram incubadas com 10 ng/ml de VLP diluídas em tampão de FACs, em um volume total de 0,05 &: mL, em gelo por 60 a 90 minutos em placas de fundo em V de 96 poços.

As células foram lavadas com 0,15 mL de tampão de FACS e centrifugadas em f 15 2000 rpm (-800 x g), por 5 minutos.

A ligação de VLP foi detectada por õ coloração das células com VP1 anti-JCV (clone PAB597) em 0,002 mg/ml em 0,05 mL por 45 a 60 minutos, seguido por uma etapa de lavagem e detecção com IgG anticamundongo Alexa Fluor 488 (H+L) (linvitrogen) diluída em 1:100 em 0,05 mL/amostra, por mais 30 a 45 minutos.

As amostras foram analisadas em ACS Calibur.

O JCV mutante (269F) não se liga a linfócitos.

Contudo, o JOV mutante é ainda capaz de se ligar ás linhagens de células gliais (figura 12). WT JCV e um controle negativo são também ilustrados.

Exemplo 9: Geração de anticorpos anti-JCV específico contra mutantes Para a imunização de coelhos para gerar soros anti-VP1 de JCV, 0,5 mg da proteína VP1 na forma de partículas similares a vírus (VLPs) em tampão de PBS foi injetado subcutaneamente em 10 pontos nas costas dos coelhos (0,05 mg/ponto). A imunização primária foi seguida por 2 reforços em intervalos de 2 semanas, depois do que os soros foram coletados e ensaiados quanto à atividade anti-VP1. Detecção de anticorpo anti-mutante de JCV por ELISA de competição: A: Antissoro de coelho imunizado com VLP de 269F ou soro anticoelho imunizado com VLP de WT-MAD1 foram pré-incubados com ou sem 100 ug/mL de VLP de WT-MAD1 , e foram então incubados com uma placa revestida com VLP de 269F. Os anticorpos ligados foram revelados com um anticoelho conjugado com peroxidase.

B: Antissoro de coelho imunizado com VLP de 55F ou soro de anticoelho imunizado com WT-VLP, e foram então incubados com uma placa revestida com VLP de 55F. Os anticorpos ligados foram revelados com —anticoelho conjugado com peroxidase.

Os coelhos foram injetados com VLP de VP1 de mutante de JCV F269 e F55 resultando na geração de anticorpos para mutantes de JCVs.

.: Um ELISA de competição mostrou que os anticorpos contra JCV específicos para mutantes podem ser distinguidos de um anticorpo contra WT JCV É 15 (figura 13) A configuração do ensaio está ilustrada na figura 14. Os ' anticorpos se ligam à VLP de mutante (ou F55 ou F269) capturada sobre a placa. A competição é feita com VLP de não mutante para absorver todos os anticorpos direcionados à “espinha dorsal” da molécula, deixando somente os anticorpos contra epítopos de mutantes (se tais estão presentes na amostra) para ligação à placa e ser detectados.

Os anticorpos contra JOV mutante ou WT JCV foram também comparados quanto à sua capacidade de se ligarem a uma VLP de JCV mutante. As placas ELISA foram revestidas com polipeptídeos dos mutantes F269 e F55 do JCV e anticorpos contra WT JCV e JCV mutante foram adicionados às placas (figuras 15 e 16). Ambos os mutantes e os anticorpos contra WT JCV se ligaram à placa ELISA revestida. A adição de WT JCV (JCV471 e JOV-MAD1) resultou no desaparecimento da ligação do anticor- po contra WT JCV enquanto os anticorpos contra mutantes permanecem ligados à placa ELISA. Além disso, a adição do vírus JCV resultou no desa- — parecimento do anticorpo contra WT ligado, enquanto o anticorpo contra mutante permanece ligado à placa.

Exemplo 10: mutações da VP1 do JCV como mecanismo de imuno-escape viral em alguns pacientes O soro de um paciente que contém a mutação 269F na proteina VP1 de soro anticoelho imunizado com VLP de WT-MAD1 (como controle positivo) foi pré-incubado com ou sem 100 ug/mL de VLP de WT-MADI1, e foram então incubados com uma placa revestida com VLP de 269F.

Os anticorpos ligados foram revelados com anticorpos anti-humano ou de coelho conjugados com peroxidase para detectar a ligação dos anticorpos à VLP do mutante 269 revestida.

A figura 17 mostra que um paciente que tem o vírus do mutante F269 desenvolveu resposta aos anticorpos contra o vírus WT, mas não contra o vírus do mutante F269. : A figura 18 mostra que coelho (em cima) imunizado com VLP de : não mutante produz anticorpo para sítio (S269, neste caso) que poderia ser mutado.

Nesse caso, o experimento foi feito de modo similar ao esquema- : 15 tizado na lâmina 16 (inserção acima) com várias diferenças, em vez de a : VLP de mutante, uma VLP de não mutante foi revestida sobre a placa e a ligação de anticorpos nos soros competiu com o mutante (ou F55 ou F269), assim somente o anticorpo para o epítopo AA não mutado seria deixado se ligar à placa.

Na parte inferior é mostrado o mesmo experimento com amostra de voluntários saudáveis.

Os resultados na tabela 8 são baseados em experimento similar com várias amostras de voluntários diferentes.

À tabela 8 mostra que pessoas que não estão sofrendo de PML podem ter anticorpos contra mutantes de PML.

Isso mostra que algumas pessoas carregam anticorpos específicos para vários resíduos no sítio de ligação do ácido siálico (por exemplo, o paciente 29 tem anticorpos para L55 e S269), enquanto outros têm cada um dos anticorpos somente para um sítio, L55 ou S269, e outros ainda para nenhum sítio.

De acordo com os aspectos da invenção, os indivíduos que não têm anticorpos para os resíduos no sítio de ligação ao ácido siálico ou tem somente para um destes resíduos podem ser mais vulneráveis aos mutantes de escape de JCV já que eles teriam menos proteção a partir dos anticorpos neutralizantes.

Tabela 8 Ba aage o JN E EB a le asa | [O 3 eae o | | O RR Teresa o ds [E a a aa Ea E

E AMU : E esa OO BR eagga O IO : E EEE e ea

PERSIA LE O Exemplo 11: VP1 do vírus JC (JCV) do Fluido Cerebroespinhal - (CSF) e Plasma de Pacientes com Leucoencefalopatia Multifocal Progres- siva (PML) Contêm Mutações Específicas de Resíduos de Aminoácidos Envolvidos na Ligação de Ácido Siálico Conforme descrito aqui, a PML é atualmente a segunda causa mais frequente de mortes relacionadas à AIDS. Diferente de outras infecções oportunistas, ela também ocorre em pacientes tratados com HAART, seja logo após o início seja durante o tratamento crônico bem sucedido. Seguinte à infecção primária, o agente causador, JCV, estabelece uma infecção benigna persistente no trato urinário e é excretado na urina de 30% das pessoas saudáveis. Os mecanismos que levam à reativação do JCV e PML não são claros, mas se sabe que a principal proteína do cap- sídeo do JCV, VP1, está envolvida na entrada de células, através d ligação com resíduos de ácido siálico na célula, e, recentemente, substituições nos aminoácidos da VP1 foram reportadas na PML. A inteira região da VP1 do JCV foi amplificada, clonada (2 a 48 clones, média 23) e sequenciadas do CSF de 26 pacientes com PML (20 com infecção por HIV), e 11 amostras de urina em pares e 6 amostras de urina em pares.

Dos 9 pacientes, amostras sequenciais de CSF (n=7) ou amostras de plasma (n=2) foram também analisadas.

DNA do JCV foi medido por PCR em tempo real.

A modelagem tridimensional foi usada para mapear as mutações na estrutura da VP1. Extração de DNA e amplificação de VP1; DNA foi extraído com 200 uL de CSF, plasma ou urina usando o Kit QIAmp Blood (Qiagen) e eluído em um volume final de 50 ul.

A região inteira da VP1 do JCV foi amplificada por PCR nested usando-se os seguintes iniciadores: Externos (2027 bp) VP1-LF GCAGCCAGCTATGGCTTTAC (SEQ ID nº 55) VP1-LR GCTGCCATTCATGAGAGGAT (SEQ ID nº 56) : Internos (1233 bp) VP1-SF COCETCAATGGATGTTGCCTTT (SEQ ID nº 57) VP1-SR ASAACCAAAGACCCCT (SEQ ID nº 58) . As misturas reacionais de PCR consistiram em 5 ul de 10C de tampão de PCR, 4mM de cada dNTP, 0,7 uM dos iniciadores VP1-LF e VP1- LR na primeira rodada e os iniciadores VP1-SF e VP1-SR na segunda rodada, 1,25 unidades de Platinum Taq HF (Invitrogen) e 1 ul de DNA extraído em um volume total de 50 ul.

Os parâmetros para os ciclos foram (para ambas a primeira rodada e a segunda rodada) 30 ciclos a 94ºC por 20 segundos, a 58ºC por 30 segundos e a 68ºC por 30 segundos e a 68ºC por 90 segundos, em uma termociclador automatizado (Applied Biosystems). Depois de a primeira amplificação com os iniciadores externos, 2,5uLdo produto amplificado foram transferidos da primeira para a segunda mistura reacional.

Seguinte à amplificação com os iniciadores internos, 10 nL do produto amplificado da segunda mistura foi submetida à eletroforese em um gel de agarose a 2% contendo 0,5 ug/mL de brometo de etídio.

Os resultados foram fotografados sob iluminação UV e considerados positivos — quando uma banda correspondente ao fragmento de DNA, esperado, de bp longo, estava presente.

Clonagem da PCR da VP1:

O produto de amplificação foi purificado pelo kit de purificação da Qiagen. Letra A foi adicionada à extremidade do produto de PCT limo por Taq polimerase (reação pendente-A) e a clonagem foi efetuada pelo kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen), DNA Mini-pre foi preparado (Qiagen) a partirde colônias contendo o produto de PCR da VPI clonado.

Sequenciamento da VP1: Dois dos 48 clones foram sequenciados para cada amostra (média de 23). Seguinte à transdução das sequências de VP1, as mutações de aminoácidos foram marcadas por comparação com a grande seleção de sequências de VP1 a partir de casos de PML e de não PML. Somente as mutações presentes em mais que um clone para a amostra foram conside- À radas. . PCR em Tempo Real para quantificação de DNA de JCV: DNA de JCV foi quantificado em amostras de CSF, plasma e f 15 urinapor PCR em tempo real, conforme anteriormente descrito (Bossolasco : S, Calori G, Moretti F, Boschini A, Bertelli D, Mena M, Gerevini S, Bestetti A, Pedale R, Sala S, Sala S, Lazzarin A, Cinque P. Prognostic significance of JC virus DNA levels in cerebrospinal fluid of patients with HIV-associated progressive multifocal leukoencephalopathy. Clin Infect Dis. 2005 Mar 1;40(5):73844.) Pacientes: Pacientes com PML foram selecionados com base na disponibi- lidade de tanto a) amostras em par de CSF, plasma ou urina como b) amos- tras de CSF sequencias, todas com DNA de JCV detectável por PCT em temporeal. As amostras haviam sido coletadas de pacientes acompanhados no Clinic of Infectious Diseases, San Raffaele Hospital, Milano, entre 1993 e

2008. As alíquotas das amostras foram armazenadas a -80ºC até as análi- ses retrospectivas para o presente estudo. VP1 de JCV foi amplificada com Sucesso a partir de uma total de 26 amostras de CSF, 11 de plasma e 6 de urinade um total de 30 pacientes com PML.

Análise de Amostras Clínicas — Projeto do Estudo: 1- Análises de sequências de CSF:

Sequências de CSF foram examinadas a partir de 26 pacientes (tabela 9) e tanto o tipo como a frequência de mutações, bem como suas correlações com variáveis de pacientes foram analisadas.

2. Análise de sequências de amostras em pares dos mesmos pacientes: Amostras em pares de CSF/plasma/urina (“tripletos”) foram exa- minadas em 2 pacientes. Pares de CSF/plasma, CSF/urina e plasma/urina foram examinadas de respectivamente, 6, 1, e 3 pacientes. As sequências obtidas de tripletos e pares foram comparadas.

3. Análise de sequências de amostras sequenciais: Amostras sequenciais de CSF ou amostra estavam disponíveis õ de 5 e 2 pacientes, respectivamente. Essas amostras foram coletadas perto . do diagnóstico de PML (linha de base) e em tempos diferentes, posterior- mente. Cinco desses pacientes apresentaram um curso progressivo de PML. f 15 Um paciente sofreu resposta virológica depois do começo de HAART. Um : paciente sofreu remissão clínica e virológica depois do tratamento com citarabina, mas teve relapso de PML após 6 meses e seguinte remoção de citarabina.

Tabela 9. Características dos 26 Pacientes com PML com —análisedeVP1deJCV | HART em andamento (número de pacientesy fe | * Refere-se somente a pacientes com PML relacionada a HIV Análise de Amostras Clínicas — Resultados:

1. Análises de sequências de CSF: Mutações específicas de MPL com VP1 foram definidas como mutações que não estão normalmente presentes na urina de pacientes sem

PML. Essas mutações ou deleções não envolvem mutações nas posições determinadoras de genótipos de VP1 — que distinguem as sequências de VP1 de acordo com sua distribuição geográfica. Uma de 8 mutações ou deleções específicas de PML, diferentes, foi identificada no CSF de 24 dos 26 pacientes (92%). Essas envolveram substituições de aminoácidos em uma das alças externas da VP1 do JCV (tabela 10). Em todos os casos quase que todos os clones da mesma amostra continham a mutação ou deleção. Em 5 pacientes, duas mutações ou deleções diferentes foram identificadas, ou nos mesmos clones (n=2) ou em clones diferentes (n=3). É Tabela 10. Mutações da VP1 de JCV no CSF de pacientes com : PML É VP1 VP1 (aa : Be aaa aa Be IB O

DO a oo lensssaer — ja |] DE

A Lo a o [a estereo ON o a e eae e a a E A IB Bos O Ni a o eee A OO As alças BC, DE e HI da VP1 do JCV são definidas pela simi- —laridade de suas sequências de aa para as alças de VP1 do SV40 (Chang D,

Liou ZM, Ou WC, Wang KZ, Wang M, Fung CY, Tsai RT. Production of the antigen and the antibody of the JC virus major capsid protein VP1. J Virol Methods 1996 May;59(1-2):177-87), que foram anteriormente determinadas por cristalográfica com raios-X (Liddington RC, Yan Y, Moulai J, Sahli R, Benjamin TL, Harrison SC. Structure of simian virus 40 at 3.8-A resolution. Nature 1991 Nov 28;354(6351):278-84). * Uma de mutação/deleção estava presente em clones diferen- tes (55F+271H em 15 e 4 clones; 611L+55 del en 18 e 4 clones; 267F+11L em 15 e 4 clones) ** Ambas deleções/mutações estavam presentes em cada clone Níveis mais altos de DNA de JCV no CSF foram encontrados em paciente com mutações das alças BC e HI que naqueles com mutações da : alça DE ou nenhuma mutação (figura 19). Não foi observada correlação em pacientes com PML associada ao HIV entre o tipo de mutação e a contagem E 15 de células CDA, nível de RNA do HIV-1 no plasma ou tempo de sobrevi- ã vência.

2. Análise de sequências de amostras em pares: A análise dos 2 tripletos CSF/plasma/urina mostraram a mesma mutação específica para PML da VP1 no SF e plasma, ao passo que nenhu- ma mutação de PML estava presente nas sequências de urina correspon- dentes (Tabela 11). Similarmente, mutações específicas de PML idênticas foram encontradas nas sequências de CSF e plasma de 6 pacientes com pares de CSF/plasma (Tabela 12), mas somente em um de CSF ou plasma, mas não nas sequências de urina de 1 paciente com pares de CSF/urina ou 3 pacientescom pares de plasma/urina (tabela 13). Tabela 11. Mutações da VP1 do JCV em amostras em pares de CSF/plasma/urina de pacientes com PML [PTLabIk — [mipodeamesta | = [mutação daPmL — | Ms EE A LL ROB Lo feras ae | | a amina a UA

3. Análise das sequências das amostras sequenciais: A análise de amostras de CSF ou plasmas sequenciais descre- veram a persistência das mutações específicas para PML em 7 pacientes com doença progressiva e estável ou aumentando o DNA do JCV no CSF

(tabelas 14 e 15).

No paciente sofrendo de resposta virológica, a mutação de PML presente na primeira amostra de CSF não foi mais encontrada em uma segunda amostra de CSF mostrando um decréscimo do nível de DNA do JCV; nesta última amostra, foi observado o aparecimento de uma mutação menos importante representada previamente.

No paciente sofrendo de recaída de PML uns poucos meses depois da remissão clínica e virológica de um primeiro episódio de PML, duas mutações diferentes estavam presentes nas amostras de CSF retira- das durante os dois episódios. Tabela 14. Mutações de PML em Pacientes com Amostras de CSF Sequenciais : PT Lab Id Dias depois da Mutação da PML primeira amostra A e B9F | : Ra ese ln Ea de 1690 A uaaaraave | E dar o O rea soçe TO ole | — etsgd near BE GiL+53SSAeM | = | Tabela 15. Mutações de PML em Pacientes com Amostras de Plasma Sequenciais

| eaticaa a M primeira amostra ssa Em moda 26re =———&À Lo ha e | a | Lo ds o Bo o

Tabelas 14 e 15, notas:

* Uma de mutação/deleção estava presente em clones diferen- tes (55F+271H em 15 e 4 clones; 611+55 del em 18 e 4 clones; 267F+61L em 15 e 4 clones)

: 5 ** Ambas as mutações/deleções estavam presentes em cada clone

Modelagem molecular da VP1 do JCV

Modelagem molecular de complexo de VP1 de JCV/tetrassaca- rídeo:

Um modelo de homologia da unidade pentamérica da proteína de VP1 do JCV foi construído com MODELER usando a estrutura da VP1 MPyV (Banco de Dados de Proteínas ID: 1VPS como modelo.

O modelo de NeuNAc-(a2,3)-Gal(B1,3)-[(02,6)-NeuNAc]l-Glce-NAc tetrassacaríideo foi construído com base na estrutura do NeuNAc-(a2,3)Gal(B1,3)-[(02,6)-

— NeuNAc]-Glc-NAc ligado à VP1 MPyV.

O modelo da PV1 de JCV/ NeuNAc- (02,3) Gal(B1,3)—[(02,6)-NeuNAc| Glc-NAc tetrassacarídeo foi refinado extensivamente em CHARMM e foi analisado usando-se o software de visualização PyYMOL (The PyMOL Molecular Graphics System (2002) Delano Scientific, Palo Alto, CA, USA. http://www. pymol.orqd)

Por conseguinte, em comparação com o vírus tipo selvagem (que está presente na urina de pessoas saudáveis) uma de 8 mutações ou deleções únicas foi identificada em quase todos os clones de CSF de cada um dos 24/26 pacientes (92%). Essas conferiram substituições ou deleções em um das três alças externas da VP1, envolvendo, mais frequentemente,

resíduos 55 (55F, 7 pacientes, 27%) e 269 (269F, 6 pacientes, 23%). Plasma em par mostrou sempre a mesma mutação do CSF, mas nenhuma mutação foi identificada nas urinas.

As mutações foram mantidas em amostras sequenciais provenientes de 7 pacientes com doença progressiva e estável ou DNA de JCV crescente no CSF.

Elas foram perdidas em 2 pacientes: 1 sofrendo de remissão e recaída de PML, com início de uma nova mutação; e 1 com bDNA de JCV no CSF decrescente, com aparecimento de uma va- riante de mutante, diferente, anteriormente menos importante.

Por modela- gem tridimensional, todos os resíduos mutados se agruparam dentro ou na proximidade imediata ao sítio de ligação de receptor de células de ácido siálico na VP1. Portanto, com base nesses dados, em pacientes com PML, o JCV encontrado em JCV e plasma, mas não em urina, contém substituições na VP1 especificas para PML.

Essas substituições são mantidas durante a progressão da doença.

Elas envolvem os laços externos de BC, DE ou HI da VP1, em sítios críticos para ligação de receptor de célula de ácido siálico.

Por conseguinte, na PML, o JCV proveniente do CSF e do plasma, mas não da urinam carrega substituições da VP1 em sítios críticos para ligação de célula, que são mantidas durante a doença.

Esses achados suportam um modelo, pelo qual JCV adquire alterações adaptativas durante a transição dos sítios de persistência ao cérebro, eventualmente levando à PML.

[em [1906

GLU : : | :

é 143/161 lms lag — | Exemplo 13:JCV de CSF e plasma, mas não de urina, de paciente com PML contêm mutações da VP-1 associadas à PML. Para investigar se as mutações associadas à PML são especi- é ficamente selecionadas no CSF de pacientes com PML, inicialmente sequências de CSF e urina em par de 7 pacientes foram analisadas (Tabela * 17). Em cada paciente, a VP1 de JCV do CSF continha uma substituição de aminoácido que não estava presente na sequência derivada de urina. é Sequências de CSF e de urina eram, de outro modo, idênticas dentro de ê: pacientes individuais e caracterizados por polimorfismos idênticos em com- paração com a cepa de referência (mesmo subtipo de vírus). As mutações no CSF associadas à PML envolveram os códons 55, 60, 267, 269, e tam- bém o códon 122. As sequências da VP1 do plasma, disponível de 13 pa- cientes (tabela 17), foram, em todos os casos, idênticas à sequência deri- vada de CSF correspondente, contendo a mesma substituição associadas à

PML Tabela 17. Substituições de aminoácidos na VP1 do JCV em sequências derivadas de amostras em pares de urina, CSF e plasma de pacientes com PML. Tabela 17. s Urina 1B nenhuma CcSF 1B L55F Plasma na. na. CcSF Mad-1 H122R; A2V

: 144/161 4 Urina 1A nenhuma csF 1A H122R Plasma 1A H122R Urina Mad-1 nenhuma csF Mad-1 S269F Plasma Mad-1 S269F 6 Urina ND. nenhuma CSF CONS S8267Y - Plasma ND.

S267Y 7 Urina 1B nenhuma : CsSF 1B S269F S Plasma 1B S269F 8 Urina 1A nenhuma CcsF 1A S269F Plasma 1A S269F 9 Urina na. na.

CcsF ND.

S269F Plasma ND.

S269F Urina na. na.

CcsF 2B S269F Plasma 2B S269F 11 Urina na. na.

CSF 4v164K nenhuma Plasma 4v164K nenhuma 12 Urina na. na. csF 1A L55F Plasma 1A L55F 13 Urina na. na. csF 4vV128A3A5K L55F Plasma 4v128A345K L55F tt

14 Urina na. na. cSF 1Bv117T S269F Plasma 1BvV117T S269F 16 Urina 4v164K nenhuma CcsF na. na.

Plasma 4v164K L55F U, urina; CSF, fluido cerebroespinhal; P, plasma. *quando nenhuma subs- tituição identificada, então o valor na coluna ser refere ao número de clones - sem substituição/número de clones examinados.

Exemplo 14: JCVno CSF de pacientes com PML contém, consis- ' 5 tentemente, uma de várias mutações ou deleções localizadas em sítios críti- cos para ligação de células.

Para definir o tipo e a frequência das substituições in vivo asso- - ciadas à PML de VP1, as sequências da VP1 derivadas de CSF em um grupo maior de pacientes foram analisadas.

Uma mutação ou deleção, principal, associada à PML foi identificada em 37 de 40 pacientes (90%) (Tabela 18). O gene de VP1 foi clonado e sequenciado para vários conforme descrição de Materiais e Métodos.

As mutações foram identificadas por comparação com as sequências para cada uma das sequências da VP1 de amostras de urina emparelhadas (quando disponíveis) e para 460 sequên- cias isoladas dos indivíduos sem PML (n=460) conforme reportadas no GeneBank.

Em alguns pacientes, a mutação H122R foi identificada.

Em alguns pacientes, a mutação 2831 foi identificada.

Em alguns pacientes, a mutação A2V foi identificada.

Em alguns pacientes, a deleção 50-51 foi identificada.

Em algum paciente, a deleção 50-51 foi identificada.

Em alguns pacientes, a deleção 54-55 foi identificada.

Em alguns pacientes, a deleção 123-125 foi identificada.

Em alguns pacientes, a deleção 125-134 foi identificada.

Em alguns pacientes, a deleção 126-134 foi identificada.

As alterações mais frequentes envolveram os códons 55 e 269, cada um identificado em 25% do pacientes.

Além das substituições repor-

: 146/161 tadas, nos códons 55, 60, 61 e 265, 267, 269, várias outras mutações ou deleções associadas à PML foram novamente identificadas, envolvendo códons de VP1 não polimórficos conforme evidenciados por comparação com as sequências derivadas de usina do GenBank.

Todas essas mutações recentemente identificadas estão também localizadas em sítios de ligação de VP1 (Tabela 18). A figura 20 é um modelo estrutural do complexo de VP1 de JCV/NeuNAc-(a2,3) Gal(b1,3)T(a2,6)-NeuNAc]l-Glc-NAc tetrassaca- rídeo. (A). As superfícies de quatro cadeias de VP1 do JCV são mostradas.

O motivo RG essencial para ligação do ácido siálico do núcleo é mostrado.

Resíduos mutados associados à PML são também mostrados (L55, K60, S265, S269). Mutações adicionais únicas para amostras isoladas de PML : são também indicadas (S61m D66m Q271) e (P51, D52, H122, S123, N124, . G125, Q126, A127). Um vista em close-up da figura 20A.

A localização de V296 da VP1 de MPyV, que é prevista como sendo equivalente à S269 da É 15 VP1doJCV é mostrada na tela. . Tabela 18. Substituições e deleções associadas à PML por VP1 de JCV no CSF de pacientes com PML Subtipo de VP1 do JOV Deleção ou substituição asso- ciada à PML [1 fais Jnemama 50-51del 4 2B D66G N124S je ds ieae E o Y 3 Q0271H e e de

Subtipo de VP1 do JOV Deleção ou substituição asso- [meras seen

E O e EE 54-55 del de er | A2V : : N26sD ec . 23 Sse1L Q0271H 188 Ro o BR a ND, não determinado; Cons., consenso; v, variante a sequência disponível até a posição 291 Exemplo 15: Relação entre o vírus JC isolados de compartimentos diferentes Investigar na relação entre as populações virais nos três com-

É 148/161 partimentos (rim, plasma de CSF), a variação de população das sequências da VP1 representadas por clones individualmente sequenciados a partir de todos os três componentes nos três pacientes foram analisado.

Com exce- ção de trocas de aminoácidos presumivelmente associadas ao desenvol- vimento da PML, genótipos de VP1 dominantes em todos os três compar- timentos eram sempre idênticos.

Toda variação de sequência observada foi devida à variantes de nucleotídeos únicas de frequência baixa.

Isso sugere que o vírus causador da PML se originou da população residente pré- existente no rim.

A relação entre as populações virais nos três compartimentos pode ser caracterizada pelo grau de polimorfismo de frequência baixa : compartilhado.

Variantes de nucleotídeos únicas observadas em dois ou : mais clones foram analisadas.

Em todos os três pacientes, a maior parte da variação genética estava confinada aos compartimentos individuais na f 15 medida em que variantes alélicas presentes em mais que uma sequência foram observadas em um compartimento único.

Portanto, a população viral é altamente estruturada.

Em dois dos três pacientes, várias variantes alélicas foram com- partilhadas entre as populações no CSF e no plasma e nenhuma variante foi compartilhada entre as populações do CSF e dos rins ou populações do plasma e dos rins.

Em cada um desses dois pacientes, a mesma mutação associada à PML foi observada em clones de CSF e plasma.

Esses dados são consistentes com uma origem única das populações do CSF e plasma.

Presumiveimente isto se deve ao escape de uma vez de evento renal.

Nesse cenário, a variação de sequências compartilhada entre as populações de CSF e plasma se originou depois da fixação da mutação associada à PML fora do rim (assumindo que mutações múltiplas independentes no mesmo sítio não são prováveis).. A variação na sequência da VP1 compartilhada e entre populações de CSF e de plasma pode indicar a presença de migração viral entre os compartimentos.

É também consistente com um cenário de infecção por etapas, em que uma população viral residente fora do rim inicialmente se estabelece em um compartimento (ou CSF ou plasma),

é 149/161 acumula variação genética e então infecta o segundo compartimento. Um terceiro paciente apresenta um quadro diferente de polimor- fismo compartilhado entre os compartimentos. Duas variantes foram compar- tilhadas entre o CSF e o rim, três variantes foram compartilhadas entre o plasmaeco rim, e uma variante foi compartilhada entre os três comparti- mentos. Todos os clones isolados do CSF e a maior parte dos clones isolados do plasma continham a mesma mutação (S269F) associada à PML. Contudo, três clones isolados do plasma tinham mutação (S267F) associada à PML diferente. Esses clones careciam da mutação dominante associada à

PML Embora não possa ser excluída a possibilidade de infecções : sucessivas e múltiplas do CSF e plasma do Paciente 3, essas observações . não estão necessariamente inconsistentes com o cenário de uma origem única das populações do CSF e dos rins depois de um escape de uma vez dorim. Os dados para o paciente 3 podem ser um exemplo de uma varre- dura seletiva branda. A varredura seletiva branda diferente da varredura Í seletiva forte não elimina completamente a variação genética pré-existente. O cenário da varredura branda é muito similar se o produto de tamanho de população eficaz de taca de mutação (Ne x um) ultrapassa um. Nesse caso, casos múltiplos de mutação benéfica (ou várias mutações benéficas de vantagem seletiva igual ou comparável) provavelmente existiram na popu- lação original em diferentes planos haplotípicos. Depois de uma varredura branda, todas as sequências conteriam uma mutação benéfica, mas a popu- lação permanece polimórfica. É possível que casos múltiplos de mutação S269F e mutação S267 existissem na população do rim antes do escape e da fixação ocorridas seguinte ao cenário de varredura branda levando à coexistência de variantes S269F e S267F da VP1 na população do plasma e variação compartilhada entre todos os três compartimentos. Exemplo 16: Correlação de várias mutações com o resultado clínico. Para avaliar se as substituições individuais de VP1 associadas à PML poderiam ser clinicamente significantes, por exemplo, sendo selecio- aeee

É 150/161 nadas diferentemente de acordo com o paciente e o contexto clínico ou associadas ao resultado doentio diferente, sua presença foi correlacionada a muitas variáveis.

Foi observado que o vírus JC sem substituições da VP1 ou — substituições envolvendo as posições 122-134 estava presente no nível de DNA significantemente mais baixo no CSF em comparação com o vírus com substituições envolvendo outras posições (p=0,013, teste de Mann-Whitney, por exemplo, com substituições tanto na posição 50-61 (p=0,02) como na posição 265-29 (p=0,036) contendo substituições da VP1 diferentes.

Exemplo 17: Capacidade de diminuir a mutação associada à PML da VP1 de hemaglutinar RBCs.

Í Para entender o papel que as mutações associadas à PML . desempenham na patogênese da doença, o efeito de algumas dessas muta- ções na ligação de receptor viral foi investigado.

Já que o JCV é conhecido por se ligar às estruturas do ácido siálico (Liu), a capacidade viral que provoca a hemaglutinação das RBCs que expressam aquelas estruturas foi : largamente usada como modelo para interação viral com seu receptor.

Partículas similares a vírus (VLPs) preparadas da principal VP1 proteína do capsídeo do JCV foram usadas amplamente como um bom modelo para investigação das interações de poliomavírus com seus recep- tores celulares.

Similar ao capsídeo viral, as VLPs formam a estrutura do capsídeo viral como evidenciado por microscopia eletrônica (dados não mostrados). A seguir, foi investigada a ligação das VLPs preparadas a partir de um “tipo selvagem” ou de várias moléculas de VP1 mutantes.

Várias mutações associadas à PML que mostraram ser selecionadas positivamente durante a PML foram introduzidas com mutações de ponto em na espinha dorsal de uma molécula de VP1 a partir de um resíduo viral único (JCV tipo 3) e comparada sua capacidade de hemaglutinar (por exemplo, ligar) as células vermelhas do sangue (RBCs). As VLPs preparadas de molécula de —VP1 do virus tipo 3 justo como para VLPs preparadas do vírus tipo 1A (por exemplo, Mad-1) podem causar a hemaglutinação das RBCs, e fazem isso na concentração tão baixa quando 760 pg/mL.

Contudo, VLPs contendo uma

' 151/161 das mutações 55F, 267F que ocorrem com mais frequência e mutações na posição 269 (F ou Y) não causaram hemaglutinação mesmo na concen- tração mais alta testada de 100 ug/mL, que corresponde a mais que um decréscimo de 100,000 vezes de atividade.

A hemaglutinação foi ainda aparente com VLPs dos mutantes 60E, 265D e 271H, mas somente em concentrações muito altas que correspondiam as perdas de 200 a 25.000 vezes de atividade.

Somente a ligação do mutante 66H não foi fortemente afetada e mostrou somente um decréscimo de 3 vezes de atividade da hemaglutinação (3000 pg/ml. como a concentração mais baixa de hema- glutinação) Nem mutações 66H nem mutações 271H foram observadas entre as sequências analisadas neste exemplo, mas estas mutações são identificadas como estão associadas à PML, com base em análise de . sequências do Genebank.

Esse efeito das mutações na capacidade das VLPs de causarem hemaglutinação sugere que as mutações podem alterar õ 15 a especificidade do receptor viral ao anular a capacidade do vírus de se ligar ao(s) receptor(es). Exemplo 18: Mutações associadas à PML perdem a capacidade de hema- glutinar RBCs de diferentes grupos sanguíneos VLPS contendo mutações associadas à PML perdem a capacidade de hemaglutinar as RBCs de diferentes grupos sanguíneos.

Para o ensaio de hemaglutinação, células vermelhas do sangue (RBCs) foram incubadas com diluições de duas vezes em série de várias VLPs começando de 100 ug/ml.

A concentração de HA mínima é a menor concentração da proteína da VLP que ainda aglutinou as RBCs.

A hema- — glutinação foi examinada por inspeção visual conforme descrição anterior.

Todas as reações de hemaglutinação foram conduzidas em duplicata.

Médio +/- DP para a concentração mínima de HA é calculado com base nos resultados de hemaglutinação de quatro doadores com diferentes grupos sanguíneos A, B, O e AB.

VLPs que exibem a menor concentração de —hemaglutinação de 100 ug/mL não causou hemaglutinação na concentração mais alta VLP testada (por exemplo, 100 ug/mL). Exemplo 19: Mutações associadas à PML alteram a especificidade dos gangliosídeos da VP1. Para ainda dissecar a especificidade do receptor da VP1 do JCV, foi investigada a ligação de várias VLPs mutantes para diferentes gangliosídeos.

Gangliosídeos são um grupo de glicoesfingolipídios comple- xos, nos quais cadeias de oligossacarídeos contendo um ou mais ácidos siálicos (ácido N-acetilneuramínico, NeuNAc) são ligadas a ceramida, que ancora a estrutura à membrana celular.

A ligação de VLO a esses gangliosídeos foi medida no formato similar à ELISA, em que os gangliosí- deos foram revestidos em placas ELISA similares a antígeno e então as VLPs foram adicionadas, cuja ligação foi detectada com anticorpos monoclo- nais específicos para VP1. Usando-se uma VLP de JCV do “tipo selvagem”, a ligação mais forte foi observada para GD1b, GD2 e GTl1a, com mais de 8 a 12 vezes de aumento de sinal em comparação com o resido produzido por ligação da VLP ao poço sem gangliosídeo (figura 21). Mutações específicas de PML da VP1 abolem ou alteram drasticamente a especificidade da proteína VP1 do capsídeo viral para gangliosídeos sialados.

A ligação das VLPs a uma disposição de gangliosídeos revestidos sobre uma placa de 96 poços foi detectadas com um processo de duas etapas envolvendo a detecção das VLPs ligadas a um gangliosídeo com anticorpos de murino específicos da VP1 e anticorpos marcados com HRP da IgG seguido por desenvolvimento com solução de TMB.

A ligação de VLP a um gangliosídeo específico foi calculada com aumento de percentagem na densidade óptica obtida com VLP específica presente relativa àquela obtida sem VLO e anticorpos sozinhos em presença do mesmo gangliosídeo 100*ODas(mais VLP)-ODaso(menos VLP))/ODaso(menos VLP). É visto que a estrutura esquemática do gangliosídeo revela estrutura de ligação de núcleo ligada a várias VLPs.

Um experimento representativo de quatro experimentos conduzidos é mostrado.

Essa especificidade de gangliosídeo é consistente com o que foi previamente descrito para o vírus Mad-1 do “tipo selvagem” do tipol1A.Aligaçãodas VLPs a asiallo-GM1 e GDla era muito mais fraca mas ainda significante ao residual, em enquanto a ligação a outros gangliosídeos era desprezível em relação ao residual não gangliosídeo.

Com base no

Petição 870200132054, de 29/5/2020 PÁGS sr eLaTO RIO n2sTe8TOvm

' 153/161 padrão de ligação, parece que a principal estrutura de “núcleo” ligada pelo vírus do tipo selvagem com consiste na estrutura do tetrassacarídeo GalNAc(B1-4)[NeuSAc(a2-8)-NeuSAc(a2-3)] Gal(B1-4)GIc, com o motivo de ácido dissiálico de NeuS5Ac(B 2-8)-NeuS5Ac(a2-3) sendo crucial para a ligação.

Contudo, a ligação de todas as VLPs mutantes era drastica- mente diferente da molécula do “tipo selvagem”. Especificamente, como visto na figura 21, os mutantes de VLP 55, 60E, 267F, 269F ou 269Y perderam completamente a ligação para todos os gangliosídeos sialados embora ainda mostrassem ligação não alterada para a estrutura GM1 asialada (por exemplo, asialto-GM1). Ainda, outros, tais como 66H, 265H e 271H mostraram uma faixa muito mais ampla de ligação de gangliosídeos . que a molécula de VLP, não mutada, original.

Exemplo 20: Ligação das VLPs a várias células-alvo.

' 15 Os resultados da hemaglutinação e ensaios de ligação direta de gangliosídeo sugerem, conjuntamente, que as mutações associadas à PML i alteram a especificidade do receptor viral e especialmente a capacidade viral de se ligar às estruturas de oligossacarídeos sialadas. Portanto, foi a seguir investigado como essas alterações conferidas às mutações na ligação de receptor específico afetaram a capacidade do JCV de ligar às suas células- alvo pretendidas. Foi medida a ligação das VLPs do tipo selvagem e mutan- tes, acima, aos três tipos principais de células relatadas como importantes para o ciclo celular viral: células epiteliais do rim, linfócitos e células do SNC.

As células epiteliais, tubulares, renais, proximais, humanas (HRPTECs) foram escolhidas como células do sítio de persistência assintomática viral de vírus não mutado. Linfócitos B humanos primários foram escolhidos também como o tipo de células sugerido como crítico para a disseminação viral do sítio periférico para o SNC, bem como outras células linfoides, por exemplo, linfócitos T primários e a linhagem células linfocítica Jurkat. Embora a infecção produtiva de células linfoides não tendo sido demonstrada de modo inequívoco, foi demonstrado que os linfócitos se ligam ao JCV via suas estruturas de ácido siálico (Atwood et al.) e, assim, poderiam conter,

É 154/161 potencialmente, o vírus in vivo. Astrócitos fetais humanos primários e a linhagem celular glial humana SVG-A foram também empregados como tipo de célula modelo para a infecção do SNC durante a PML. A infecção dos astrócitos foi bem documentada em pacientes com PML e ambos esses tiposde células gliais podem ser infectado por JCV in vitro.

Mutantes PML-ogênicos da VP1 perdem a capacidade de liga- rem às células do rim e do sangue às células gliais. Linhagem celular glial SVG-A(A), astrócitos humanos primários (B), células endoteliais microvas- culares cerebrais humanas (C), células epiteliais tubulares do rim (D), ou células mononucleares periféricas do sangue (E e F) foram inicialmente incubadas com VLPs diferentes (conforme indicado no eixo x) e depois : incubadas com anticorpos anti-VP1 seguido por coloração com anticorpos . marcados fluorescentemente. A ligação das VLPs aos linfócitos T (E) e B(E) foi avaliada depois da coloração das PBMCs com anticorpos específicos para os marcadores CD3 e CD20 humanos e “gating” a população corres- pondente. A razão da intensidade fluorescente média (MFI) das células : coloridas com anticorpos anti-VP1 em presença das VLPs relativas à MFI residual de células coloridas com os anticorpos de detecção na ausência da VLP é plotada para cada VLP. Razão de MFI média+/- DP é calculado com base nos resultados de vários experimentos independentes (N é indicador no gráfico). As VLPs feitas da VP1 do “tipo selvagem” se ligaram fortemente a todos os tipos de células acima com MFI de mais que 2 vezes acima da coloração residual. Contudo, a ligação das VLPs mutantes era dependente de ambos o tipo de célula e a posição do aminoácido mutado. Especi- ficamente, as mutações 55F, 267F, 269F e 269Y, mais frequentemente associadas à PML anularam a libação das VLPs às células epiteliais tubu- lares do rim e todas as células linfocíticas, mas não aos astrócitos primários ou às linhagem celular glial SVG-A. Ambos os tipos de células do SNC ainda se ligaram fortemente às VLPs contendo essas mutações (exceto a 55F que seligaàs células SVG-A, mas não aos astrócitos primários). VLPs contendo 60, 66H, e 271H ainda se ligaram a todos os tipos de células, inclusive células epiteliais do rima e linfócitos, embora a ligação da 271H tenha sido fortemente diminuída. Exemplos 21: VLPs contendo mutações que ligam a células gliais no modo independente de ácido siálico Já que a ligação do vírus às células tenha sido previamente — demonstrada como sendo dependente de ácido siálico (por exemplo, Atwood et al.), mas os dados demonstram que a maioria das mutações associadas à PML anulam a ligação das VLPs aos gangliosídeos contendo ácido siálico, foi testado, a seguir, se a ligação de VLPs mutantes a células é ainda dependente do ácido siálico. Para fazer isso, tanto as células De SVG-A como dJurkat foram tratadas com Neuroaminidase para remover ácido siálico da superfície celular. A coloração das células com lectinas específicas para várias conformações de ácidos neuramínicos (por exemplo, Sambucus Nigra . Lectin (SNA) e lectina da Maackia amurensis (MAA) mostrou que o trata- mento com neuraminidase é eficaz na remoção do ácido siálico. A ligação 7 15 dosmutantes PML-ogênicos da VP1 a células gliais é independente de ácido siálico. As células das linhas celular glial SVG-A ou linhas de células i linfoides Jurkats foram primeiramente pré-tratadas com a2-3,6 neuramini- dase, por 60 minutos, a 37ºC ou tratadas de modo similar, e então incuba- ção a 4ºC com a VLP indicada e coloração com os anticorpos de detecção, conforme descritos aqui.

A ligação das VLPs do tipo selvagem do tipo 3 a ambas as células SVG-A e Jurkat é dependente do ácido siálico, confirmando o que foi previamente mostrado para o vírus Mad-1 (por exemplo, tipo selvagem do tipo 1A). Contudo, a ligação de todas as VLPs testadas exceto as do mutante K60E para as células SVG-S não foi afetada pelo tratamento com neuraminidase, sugerindo que a ligação desses mutantes às essas células é independente do ácido siálico. Interessantemente, aqueles mutantes que não foram capazes de se ligarem às células Jurkat (por exemplo, K60E, D66H, N265D e Q27 1H) se ligaram de um modo dependente de ácido siálico — conforme evidenciado por ligação diminuída às células Jurkat tratadas com a neuraminidase.

Como visto do sumário da tabela 19, a ligação das VLPs às

À 156/161 células Jurkat parece ser altamente mediada pelo ácido siálico, se modo que as VLPs mutantes que não mostram qualquer ligação aos gangliosídeos sialados não se ligam às células Jurkat e àquelas que também não se ligam às células Jurkat em um modo dependente do ácido siálico. Uma exceção — notável àquela observação é o mutante N265D, que, com base na ligação direta aos gangliosídeos, pareceu ter ganhado uma ligação de ácido siálico muito ampla, mas ainda perdeu sua ligação à célula Jrukat. Com base nos resultados acima, parece que os resultados da ligação das VLPs estão em acordo com a ligação das VLPs às BBCs, conforme julgado a partir dos resultados da hemaglutinação. Em resumo, parece que as mutações associadas à PML aboli- í ram largamente a ligação dependente de ácido siálico do vírus aos muitos DU tipos de células periféricas diferentes, inclusive RBCs, células do rim, células epiteliais tubulares e células linfoides. A ligação do vírus mutante para ' 15 células gliais específicas para SNC parece que não é largamente afetada e independente do ácido siálico.

Tabela 19. Correlação da ligação das VLPs entre os vários ensaios SAE Er

' 157/161 plos 13-21: Pacientes e amostras Presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Institui- ção.

Para investigar a presença e a evolução das mutações in vivo associa- dasãà bPML, de um grande coorte de pacientes com PML, seguido no Department of Infeccious Diseases of San Raffaele Hospital entre 1992 e 2009, 40 pacientes foram inicialmente selecionados dos quais amostra em pares de CSF, plasma e urina estavam disponíveis e continham DNA do JCV por PCR em tempo real (Bossolasco). A VP1 foi eventualmente amplifi- cadade pelomenos dois tipos diferentes de amostra em 14 destes pacien- tes.

Ê Mais quarenta e três pacientes com PML foram subsequen- E temente selecionados com somente CSF disponível e DNA de JCV detectado no CSF por PCR em tempo real.

A VP1 do JCV foi amplificada : 15 com sucesso a partir de 28 desses pacientes.

Assim, as amostras em pares de 14 pacientes e sequências derivadas de CSF de um total de 40 pacientes puderam ser estudadas.

PCR da VP1 do JCV Extração de DNA e amplificação da VP1 O DNA foi extraído de 200 ul de CSF, plasma ou urina usando o Kit QIAmp Blood (Qiagen) e eluído em um volume final de 50 ul.

A VP1 foi amplificada usando iniciadores flanqueando o gene de VP1 inteira (PCR da VP1 completa), ou, quando a amplificação com este método não foi bem sucedida, por um ensaio de PCR semi-nested que amplificou regiões mais curtasdaVWVP1 separadamente (PCR da VP1 do fragmento curto). A PCR da VP1 inteira de um ensaio nested que usou os inicia- dores primários de VP1-LF e VP1-LR, amplificando um fragmento de 2027 bp; e os iniciadores primários VP1-SF e VP1-SR amplificando um fragmento de 1233 bp de comprimento.

A mistura reacional de PCR consistia de 5 ul de tampão de PCR, 4 mM de cada dNTP, 0,7 uM de iniciadores VP1-LF e VP1-LR na primeira rodada e os iniciadores VP1-SF e VP1-SR na segunda rodada, 1,25 unidades de Platinum Taq HF (Invitrogen) no total e 1 ul de

O 158/161 DNA extraído (primeira rodada) ou 2,5 ul do produto amplificado (segunda rodada) em um volume total de 50 ul. Os parâmetros do ciclo (para ambas a primeira rodada e a segunda rodada) foram 30 ciclos a 94ºC por 20 segundos, a 58ºC por 30 segundos, e a 68ºC por 90 segundos, em um termociclador automatizado (Applied Biosystems).

A PCR de fragmento curto consistia em PCR semi-nested que usou iniciadores VP1-1 e VP1i4a na primeira rodada, amplificando um fragmento de 797 bp, seguido por dois ensaios semi-nested com VP1-1 e VP1-2a, amplificando um fragmento de comprimento de 481 bp, ou com iniciadores VP1-1.5 e VP1-4a, amplificando um fragmento de 490 bp de comprimento (Zheng) (tabela 20). A mistura reacional da PCR consistia em À 2,5 ul de 10X tampão de PCR, 200 uM de cada dNTP, 1,5 mM de MgCb, 0,5 uM de iniciadores e 1,25 unidades de DNA Polimerase AmpliTtaq Gold (Applied Biosystems). Na primeira rodada, 4 ul de DNA extraído foram . 15 adicionados em um volume total de 25 ul e os parâmetros de ciclagem from ciclos a 94ºC, por 20 segundos, a 55ºC por 30 segundos e a 68ºC por 90 segundos em um termociclador automatizado (Applied Biosystems). Esse produto da primeira etapa de PCR foi purificada com Kit de Limpeza para PCR ExoSAP, em que o protocolo consistem em uma etapa única de 20 pipetagem (adição de mistura enzimática), incubação por 30 minutos a 37ºC, seguida por inativação das enzimas a 80ºC, por mais 15 minutos. Na segunda rodada da PCR semi-nested, 4 ul. do produto de PCT limpo foram adicionados em um volume total de 25 ul e os parâmetros de ciclagem foram 40 ciclos a 94ºC por 20 segundos, a 62ºC por 30 segundo e a 68ºC —por90 segundos em uma termociclador automatizado (Applied Biosystems). Com ambos os ensaios, a seguinte amplificação com os inicia- dores internos, 10 ul do produto amplificado proveniente da segunda mistu- ra foram submetidos à eletroforese sobre gel de agarose a 2% contendo 0,5 ug/mL de brometo de etídio. Os resultados foram fotografados sob ilumina- ção UVe considerados como positivos quando uma banda correspondendo ao fragmento de DNA de comprimento em bp esperado estava presente.

Tabela 20. Sequências de nucleotídeos dos iniciadores usados em PCR

' 159/161 nested de comprimento natural e PCR semi-nested de fragmento curto para VP1 de JCV Nome Sequência Número Nt * VP1-LFE GCAGCCAGCTATGGCTTTAC (SEQ1ID nº 55) VP1-LR GCTGCCATTCATGAGAGGAT (SEQ ID nº 56) VP1-SF CCTCAATGGATGTTGCCTTITT (SEQ1ID nº 57) VP1-SR AAAACCAAAGACCCCT (SEQ ID nº 58) VP1-1/ TTGACTCAATTACAGAGGTAGAAT (SEQIDnº59) VP1-4a AGAAATTGGGTAGGGGTTITTAAC .(SEQID nº60) VP1-2a AGGTACGCCTTGTGCTCTGTGTTC (SEQIDnº61) VP1-1.5. GTGCAGGGCACCAGCTTTCATT (SEQ ID nº 62) * de acordo com a cepa Mad-1 (ref.) BR Clonagem de sequenciamento da PCR de VP1 O produto de amplificação foi purificado com o kit de purificação ' 15 Qiagen.

Letras A foram adicionadas às extremidades do produto de PCR limpo por Taq polimerase (reação pendente A) e a clonagem foi efetuada com o kit de clonagem TOPO T (Invitrogen). DNA mini-prep foi preparado (Qiagen) de colônias contendo o produto de PCR da VPI clonado.

Dois a 48 clones foram sequenciados para cada amostra (23 na média). Seguinte à tradução das sequências, a mutações de aminoácidos foram marcadas por comparação com a seleção grande de sequências de VP1 de casos de PML e de não PML.

Somente mutações presentes em mais que um clone, por amostra, foram consideradas.

PCR em tempo real para quantificação de DNA de JVC DNA de JVC foi quantificado em amostras de CSF, plasma e urina por PCR em tempo real, conforme descrição anterior (Bossolasco S. et al. 2005). Ensaio de Hemaglutinação Células vermelhas do sangue (RBCs) de doadores do tipo O+ foram lavadas duas vezes e suspensas em tampão de Alsever (citrato de sódio 20mM, NaCl 72mM, glicose 100mM, pH 6,5 ajustado com ácido acético em uma concentração final de -0,5%. Diluições em série de duas

O 160/161 vezes, começando a partir de 100 ug/ml. de VLPs foram preparadas em tampão de Alserver e uma volume igual de RBCs foi adicionado a cada poço de uma placa de microtítulo com fundo em “U"de 96 poços e incubadas a 4ºC por 3 a 6 h (foram realizadas 24 diluições de duas vezes). Concentração mínimade HA é a menor concentração da proteina da VLP que ainda aglutinou RBCs.

ELISA de Gangliosídeos Gangliosídeos específicos (ressuspensos em metanol) foram revestidos sobre uma placa de microtítulo (10 ug) durante a noite.

As placas foram bloqueadas (1% de BSA (Fração V), 0,1% de Tween-20, PBS com C++, Mg++). As VLPs foram preparadas em 30 ug/ml em tampão de : bloqueio e adicionadas (100 ul/poço). Todas as incubações foram realiza- S das sobre gelo.

Depois de 90 minutos, as placas foram lavadas com tampão de bloqueio.

A ligação das VLPs foi detectada com um processo de duas ' 15 etapas envolvendo ligação anti-VP1 (PAB597 em 2 ug/mLO e anti-mlgG de HRP (1:100). As placas foram lavadas e reveladas com solução TMB Turbo ELISA.

A reação foi interrompida com ácido e a placa lida em um espectro- fotômetro em 450 nm.

Análise de Citometria de Fluxo da Ligação das VLPs às Células As células foram destacadas e coletadas (SVG-A, Jurkat, Astrócitos Humano, Epiteliais Tubulares Proximais Renais Humanas). Uma amostra (1 a 5 x 10º células) foi inicialmente incubadas com VLP (10 — 30 ng/mL) em Tampão de FACS (1% de BSA [Fração V]J, azida sódica 2 mM, PBS com Ca++, Mg++) em um volume de 50 ul, por 60 a 90 minutos sobre gelo As células foram lavadas com Tampão FACS e ainda incubadas com anti-VP1 (PABS597 2 ugmL), por 60 minutos, seguido por lavagem e incubação com AlexaFluor 488-anti-mIlgG (1:100), por mais 30 a 45 minutos.

As células foram lavadas e fixadas em Cytofix/Cytoperm, por 20 minutos, seguido por lavagem final e ressuspensão em tampão FACS.

As células foram analisadas em BD FACSCAlibur.

Controles apropriados e coloração com outros anticorpos (controle de isótipo, GM1, asialo GM1, GD1a, GT1b) e lectinas (Aglutinina de Amendoim (PNA), Lectina de Sambucus Nigra í 161/161 (SNA), Lectina Il de Maackia Amurensis (Mal |), se necessário. Em alguns casos, as células foram pré-tratadas com «2-3 neuraminidase, a2-3,6 neura- minidase, ou PNGaseF para alterar as suas estruturas de açúcar na superfi- cie celular.

O relatório descritivo acima é considerado como suficiente para permitir que aquele versado na técnica realize a invenção. A presente inven- ção não está limitada em escopo pelos exemplos proporcionados, pois que os exemplos pretendem ilustrar unicamente um aspecto da invenção e ou- tras modalidades funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica a partir de descrição acima e estão dentro do escopo das reivindicações apen- . sas. As vantagens e objetivos da invenção não estão necessariamente en- globados por cada modalidade da invenção. f 15 O conteúdo de todas as referências, patentes e pedidos de pa- tentes publicados citados ao longo deste relatório descritivo é aqui incorpo- Á rado a título de referência na íntegra.

Claims

o 13 REIVINDICAÇÕES

1. Método que compreende: interrogar uma amostra biológica de um paciente quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante, que compreende uma substituição do resíduo de aminoácido 122, e em que é determinado que tem suscetibilidade aumentada à PML se a amostra compreender o pelo menos um indício.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda, interrogar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante que compreende uma subs- tituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 2, e 66. É

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a amostra é : interrogada usando um ensaio capaz de detectar pelo menos um indício de cada uma das proteínas do capsídeo VP1 de JCV variantes tendo uma ' 15 substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 2, 66, e 122, e em que se determina que o paciente tem suscetibilidade aumentada à PML ! se a amostra compreender pelo menos um indício de pelo menos uma das proteínas do capsídeo VP1 de JCV variantes.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende, ainda, interrogar a amostra biológica quanto a pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante que compreende deleção de um ou mais de fragmentos de aminoácidos 50- 51, 54-55, e 123-125.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que a amostra é interrogada usando um ensaio capaz de detectar pelo menos um indício de cada uma das proteínas do capsídeo VP1 de JCV variantes tendo deleção de pelo menos um dos fragmentos de aminoácidos 50-51, 54-55 e 12-125,e em que se determina que o paciente tem suscetibilidade aumentada à PML se a amostra compreender pelo menos um indício de pelo menos uma das proteínasdo capsídeo VP1 de JCV variantes.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende ainda, interrogar a amostra biológica quando a

A 2/3 pelo menos um indício de uma proteina do capsídeo VP1 de JCV variante suspeita de ter ligação de ácido siálico baixa.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo, ainda, interrogar a amostra biológica quanto a pelomenos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante, que compreende uma substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 55, 60, 265, 267, e 269.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a amostra é interrogada usando um ensaio capaz de detectar pelo menos um indício de cada uma das proteínas do capsídeo VP1 de JCV variantes tendo uma substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 55, 60, 265, À 267, e 269, em que se determina que o paciente tem suscetibilidade aumen- : tada à PML se a amostra compreender pelo menos um indício de pelo menos uma das proteínas do capsídeo VP1 de JCV variantes.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a amostra biológica é uma amostra de sangue.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a amostra biológica é uma amostra de CSF.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a amostra biológica é uma amostra de urina.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que é sabido que o paciente foi previamente infectado com um JCV do tipo selvagem.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a nova amostra biológica do paciente é interrogada quanto a pelo menos um indício de pelo menos uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante, pelo menos duas vezes ao ano.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a detecção de pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante é usada para identificar o paciente como —- inapropriado para tratamento imunossupressivo.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

E 3/3 anteriores, em que a detecção de pelo menos um indício de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante é usada para recomendar uma modificação no tratamento imunossupressivo do paciente.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a ausência de indícios de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante é usada para identificar o paciente como apropriado para tratamento imunossupressivo.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a ausência de indícios de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante é usada para identificar o paciente como apropriado para tratamento imunossupressivo contínuo.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações : anteriores, em que a amostra biológica é interrogada quanto à presença de um anticorpo que é específico para proteína do capsídeo VP1 de JCV É 15 variante.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações : anteriores, em que a amostra biológica é interrogada quanto à presença de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a amostra biológica é interrogada quanto à presença de uma proteína do capsídeo VP1 de JCV variante.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a amostra biológica é interrogada quanto à presença de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína do capsídeo VP1deJCV variante.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que a amostra biológica é interrogada usando uma análise com base em ELISA.