BRPI1015277A2 - manipulação de biossíntese de frutanos e melhoramentos em biomassa vegetal - Google Patents

Abstract

manipulação de biossíntese de frutanos e melhoramentos em biomassa vegetal. a presente invenção se refere a construções genéticas capazes de manipular a biossíntese de frutanos em células de fotossintese de uma planta, as referidas construções genéticas incluindo um promotor, ou fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica uma enzima bacteriana ft, ou um fragmento funcionalmente ativo ou suas variantes. a presente invenção também se refere à modificação da biossíntese de frutanos e, mais particularmente, a métodos de manipulação de biossíntese de frutanos em células fotossintéticas. a presente invenção também se relaciona com um aumento de biomassa vegetal e, mais particularmente, a métodos de produção de biomassa reforçada e 1 ou com estabilidade de produção, incluindo partes aéreas e 1 ou o crescimento da raiz em uma planta. a presente invenção também se refere a métodos para aumentar a produtividade das vias bioquímicas.

Description

1111111 II~111Wl~I 1 111 1~~ 1111111111 1/74 PI1015771-6

MANIPULAÇÃO DE BIOSSINTESE DE FRUTANOS E MELHORAMENTOS

EM BIOMASSA VEGETAL Campo da Invenção 5 A presente invenção refere-se à modificação da biossíntese de frutanos e, mais particularmente, a métodos de manipulação de biossíntese de frutanos em células fotossintéticas e aos ácidos nucleicos relacionados e construtos. A presente invenção também se relaciona com um 10 aumento de biomassa vegetal e, mais particularmente, a métodos de reforço na produção de biomassa e 1 ou estabilidade de sua produção, incluindo o crescimento da parte aérea e / ou da raiz em uma planta, e aos ácidos nucleicos relacionados e construtos.

15 Antecedentes da Invenção Frutanos invenção são um tipo de carboidrato solúvel em água cuja função principal é fornecer uma reserva de energia de fácil acesso para o crescimento das plantas. Frutanos são associados com vários aspectos vantajosos em gramíneas, tais como a tolerância ao frio e à 20 seca, uma sobrevivência de perfilhos aumentada, resistência melhorada, boa rebrota após o corte ou pastejo, recuperação melhorada de estresse, crescimento no início da primavera e aumento da qualidade nutricional. A síntese e o metabolismo de frutanos em gramíneas e cereais é complexa. Frutanos consistem de cadeias de frutose, 25 linear ou ramificada, ligadas à sacarose. O comprimento das cadeias de frutanos de plantas se dá numa faixa a partir de três até algumas centenas de unidades de frutose. Diferentes tipos de frutanos podem ser diferenciados com base nos tipos de ligação presentes. Em azevém perene (perennial ryegrass) três tipos de frutanos foram identificados: inulinas, neo-séries de inulina e neo- 30 séries de levava, com quatro enzimas fructosiltransferase (FT) envolvidas neste perfil de frutanos. A enzima 1-SST (sacarose: sacarose 1-

L a 2/74 frutosiltransferase) catalisa o primeiro passo na biossíntese de frutanos, enquanto as enzimas restantes alongam a cadeia de frutose crescente (1-FFT: frutano: frutano 1-frutosiltransferase, 6G-FFT: 6 glicose-frutosiltransferase, e 6- SFT: sacarose: frutose-6-frutosiltransferase). As enzimas 1-FEH ou 6-FEH 5 (fructoexohidrolase) reduzem o comprimento da cadeia de frutano, liberando moléculas de frutose.

Bactérias utilizam apenas uma enzima que contém ambas as atividades FT 1-SST e 1-FFT para sintetizar polímeros de alto peso molecular de frutanos. a maioria das fructosiltransferases bacterianas lo produzem frutanos do tipo levana (levansucrases), que são caracterizados por ligações 3-2, 6 das moléculas de frutose, embora inulosucrases que produzem frutanos do tipo inulina (com ligação j3-2) tenham sido isolados de algumas bactérias.

Pelo menos 3 levansucrases bacterianas têm sido 5 expressas em plantas transgênicas, incluindo, o gene SACB de Bacillus subtilis, o gene SACB de Bacillus amyloliquefaciens, e o gene FTF de Streptococcus mutans.

A expressão destas levansucrases bacterianas em plantas leva à síntese de frutanos de muito alto peso molecular com um DP de vários milhares (para revisão ver Cairns, 2003). 20 Frutanos representam os carboidratos não estruturais importantes em 15% das espécies de plantas e desempenham um papel fundamental na qualidade da forragem.

O pastoreio de gado ruminante com dietas ricas em frutano mostra o melhor desempenho dos animais.

Em gramíneas, o nível e a composição de frutanos 25 foi aumentado em caules e bainhas foliares através da expressão de genes FT engenheirados.

No entanto, a manipulação de vias bioquímicas através da manipulação da atividade de enzimas nas vias pode ser difícil por conta de diferentes maneiras com as quais as várias enzimas e seus 30 substratos podem interagir.

ir 3/74 Assim, é desejável ter-se melhores métodos de manipulação de vias bioquímicas, especialmente em plantas. Por exemplo, seria desejável dispor de métodos de manipulação da biossíntese de frutanos em plantas, incluindo espécies de plantas forrageiras, tais como Lolium, 5 Festuca e Brachiaha, gramíneas, cana e outros, e sorgo e outros cereais, como trigo e milho, facilitando assim a produção de, por exemplo: Gramíneas forrageiras com qualidade melhorada de forragem e / ou rendimento, levando à produção de pastagem melhorada, produção animal melhorado e 1 ou redução da poluição ambiental; lo Gramíneas bioenergéticas e culturas como switchgrass (Panicum virgatum), capim, sorgo (grão forrageiro e sorgo energético), cana de açúcar e cana energética com rendimento de biomassa melhorado, como para produção de bioetanol; e Cereais como trigo, arroz, milho e cevada com 15 aumento de grãos e 1 ou produção de biomassa.

Sequências de ácidos nucleicos que codificam algumas das enzimas envolvidas na via biossintética de frutanos têm sido isolados de determinadas espécies de plantas. Por exemplo, o documento PCTIAU01100705, de mesma titularidade da presente invenção, descreve 20 homólogos de frutosiltransferase de Lolium e Festuca. No entanto, continua a haver uma necessidade de materiais úteis para a modificação da biossíntese de frutanos, e também para se projetar o acúmulo de frutanos em diferentes partes da planta. O pedido de patente internacional 25 PCTIAU20091001211 descreve construções úteis para modificar a biossintese de frutanos. No entanto, essas construções de preferência, incluem um gene de fusão que codifica um fusor translacional de duas ou mais enzimas da biossíntese de frutanos, os genes que compõem o refereido fusor, de preferência, correspondente a genes de biossíntese de frutanos da planta. 30 É um objeto da presente invenção se superar, ou pelo menos aliviar, uma ou mais das dificuldades ou deficiências associadas com o estado da técnica.

Resumo da invenção Os titulares da presente invenção determinaram que 5 é possível melhorar plantas nutricionalmente, por exemplo, gramíneas forrageiras e 1 ou se aumentar a sua biomassa vegetal através da reprogramação espacial da via de biossíntese de frutanos em células fotossintéticas usando um construto incluindo um promotor ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, operativamente ligado a um gene lo que codifica uma enzima bacteriana FT, ou fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo. Utilizando-se este processo, é possível conduzir o acúmulo de frutanos em lâminas foliares, os órgãos de plantas que são principalmente oferecidos como pasto para gado, e que normalmente não acumulam frutanos. Assim, o acúmulo de frutanos, especialmente aqueles que apresentam um alto 15 grau de polimerização (frutanos de alto DP), proporciona uma nutrição mais acessível para os animais de pasto. Frutanos acumulam-se nos caules e bainhas foliares, com frutanos formando-se em folhas apenas durante os períodos em que a assimilação de CO2 supera o crescimento. Gramíneas forrageiras podem ser nutricionalmente avançadas se expressarem genes 20 frutano em células fotossintéticas, onde a sacarose é sintetizada, portanto, dirigindo a acumulação de frutanos, preferencialmente, em lâminas foliares e proporcionando mais energia para a alimentação de gado. Frutanos em gramíneas forrageiras contribuem significativamente para a energia prontamente disponível nos alimentos para 25 ruminantes em pastejo. Os processos de fermentação no rúmen necessitam de considerável energia prontamente disponível. A melhoria da energia prontamente disponível no rúmen pode aumentar a eficiência da digestão no rúmen. Uma maior eficiência na digestão ruminal leva a uma conversão melhorada da proteína de forragem nos animais ruminantes é refletida no leite 30 ou carne, e leva a uma redução de desperdícios de insumos nitrogenados.

Os titulares também determinaram que os métodos da presente invenção podem ser facilitados pela reprogramação de células de fotossíntese para uma vida prolongada, por exemplo, atrasando a senescência foliar, para ajudar a aumentar a biomassa vegetal. 5 Os titulares determinaram que um construto incluindo um gene que codifica um gene FT bacteriano, ou fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, podem gerar resultados superiores a uma construção incluindo um gene de fusão que codifica um fusor de translação de duas ou mais enzimas de biossíntese de frutanos.

O uso de um lo gene FT bacteriano, por exemplo, contendo ambas as atividades 1-SST e 1- FFT, pode ser tecnicamente menos difícil do que genes de fusão separados, e pode resultar em um construto que é mais facilmente introduzido em plantas e 1 ou executa suas funções melhor do que um construto incluindo genes fundidos.

Por exemplo, ao se expressar um gene FT 15 bacteriano, por exemplo, contendo atividades tanto 1-SST quanto 1-FFT, os problemas associados com as diferenças nos padrões de expressão destes genes independente integrados no genoma da planta podem ser aliviados, resultando na conversão de moléculas de sacarose diretamente para frutanos, que no caso apresentam um baixo grau de polimerização (frutanos de baixo 20 DP) e um alto grau de polimerização (frutanos de alto DP). Além disso, a proteína FT pode formar um canal metabólico para a biossíntese de frutanos eficiente.

A expressão de genes nas células fotossintéticas FT levando ao acúmulo de frutanos de baixa e alta DP em células fotossintéticas 25 pode levar a uma liberação de mecanismos de inibição da fotossíntese, facilitando a captação de energia solar e aumento da fixação de CO2 . Assim, os titulares determinaram que a reprogramação de células de fotossíntese para uma vida estendida e uma maior biossíntese de frutanos facilita a captação de energia solar e aumenta a 30 produção de biomassa vegetal, incluindo parte aérea e I ou o crescimento da raiz.

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Além disso, o referido acúmulo de frutanos de baixa e alta DP tem sido associado com a tolerância da planta ao estresse abiótico como o frio e seca, e uma vez que o crescimento da raiz melhorado e a senescência foliar atrasada também tem sido implicada na tolerância de 5 plantas de estresse hídrico, e uma reprogramação de células fotossintéticas para vida prolongada e uma maior biossíntese de frutanos pode facilitar a estabilidade de produção e da tolerância das plantas a estresses abióticos.

Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece um método de manipulação da biossíntese de frutanos em células de lo fotossíntese de uma planta, o referido método incluindo a introdução, na referida planta, de uma quantidade eficaz de uma construção genética, incluindo um promotor ou um fragmento funcionalmente ativo ou variantes do mesmo, operavelemente ligados a um ácido nucleico que codifica uma enzima bacteriana frutosiltransferase (FT), ou um fragmento funcionalmente ativo, ou 15 suas variantes.

Conforme aqui apresentado, o termo "manipulação de biossíntese de frutanos" é geralmente referente a um aumento da biossíntese de frutanos em uma planta transformada em relação a uma planta de controle não transformada.

No entanto, para algumas aplicações, pode ser 20 desejável se reduzir ou modificar a biossíntese de frutanos na planta transformada em relação ao controle de plantas não transformadas.

Por exemplo, pode ser desejável se aumentar ou diminuir a atividade de certas enzimas da via de biossíntese de frutanos, na planta transformada em relação ao controle de plantas não transformadas. 25 Conforme aqui apresentado, o termo "células fotossintéticas" deve ser entendido como células de uma planta em que ocorre a fotossíntese.

Estas células contêm, geralmente, o pigmento clorofila e são também conhecidas como células verdes.

A maioria das células fotossintéticas estão contidas nas folhas das plantas.

De preferência, a construção genética 30 da presente invenção é expressa nas células bainha do feixe, mais preferencialmente em mesófilos e 1 ou células parenquimatosas de bainha.

Conforme aqui apresentado, o termo "uma quantidade eficaz" significa uma quantidade suficiente para resultar em um traço de identificação fenotípica na referida planta, ou em uma planta, sementes de plantas ou partes da planta ou outros derivados.

Estes valores 5 podem ser prontamente determinados por uma pessoa devidamente qualificada, tendo em conta o tipo de planta, a via de administração e outros fatores relevantes.

Uma pessoa devidamente qualificada será prontamente capaz de determinar uma quantidade adequada e um modo de administração.

Ver, por exemplo, Maniatis et ai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold 10 Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, cuja divulgação é aqui incorporada em sua totalidade por referência.

Conforme aqui apresentado, o termo "construção genética" significa uma molécula de ácido nucleico recombinante.

Conforme aqui apresentado, o termo "promotor" 15 significa uma sequência de ácidos nucleicos suficiente para a transcrição direta de uma sequência de ácido nucleico ligada operacionalmente.

Conforme aqui apresentado, o termo "ligado operacionalmente" deve ser entendido numa situação em que o ácido nucleico e uma sequência de regulamentação, tal como um promotor, estão ligados de 20 tal forma a permitir a expressão de ácidos nucleicos em condições adequadas, por exemplo, quando moléculas adequadas, tais como proteínas ativadoras transcricionais estão vinculadas com a sequência de regulamentação.

De preferência, um promotor ligados operacionalmente se encontra na direção upstream do ácido nucleico associado. 25 Conforme aqui apresentado, o termo "upstream" se refere a uma direção 3'-> 5 'ao longo do ácido nucteico.

Conforme aqui apresentado, o termo "ácido nucléico" significa uma cadeia de nucleotídeos capaz de transportar a informação genética.

O termo geralmente se refere a genes ou fragmentos 30 funcionalmente ativos ou variantes dos mesmos e 1 ou outras sequências do genoma do organismo que influenciam o seu fenótipo.

Conforme aqui or 8/74 apresentado, o termo "ácido nucleico" inclui DNA (como o DNA genômico ou cDNA) e RNA (como mRNA ou microRNA), que é de fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleotídeos sintéticas, não-naturais ou alteradas, ácidos nucleicos sintéticos e combinações dos mesmos. 5 Conforme aqui apresentado, o termo "ácido nucleico que codifica uma enzima bacteriana frutosiltransferase (FT)" ou "gene bacteriano frutosiltransferase" deve ser entendido como um ácido nucleico que codifica uma enzima normalmente presente em uma bactéria que catalisa a síntese de oligo e I ou polifructanos transferindo porções frutosiltransferase de 10 sacarose contendo sacarídeos às moléculas de receptor.

A enzima bacteriana FT pode incluir atividade levansucrase e / ou produzir frutanos tipo levana.

A enzima bacteriana FT pode incluir atividade inulosucrase e 1 ou produzir frutanos tipo inulina.

A FT bacteriana preferida inclui atividades enzimáticas tanto de sacarose: sacarose 1-frutosiltransferase (1-SST) quanto de frutano: 15 frutano 1-frutosiltransferase (1-FFT). Um gene SACB, Lsc FTF ou pode ser usado.

Um gene SACB ou Lsc é particularmente preferido.

Conforme aqui apresentado, o termo "fragmento funcionalmente ativo" ou "variante em relação a um promotor" significa que o fragmento ou variante (como um análogo, derivado ou mutante) é capaz de 20 dirigir a transcrição de um ácido nucleico ligado operacionalmente.

Essas variantes incluem variantes alélicas de ocorrência natural e variantes não- naturais.

Adições, exclusões, substituições e derivatizações de um ou mais dos nucleotídeos são contempladas, desde que as modificações não resultem em perda de atividade funcional do fragmento ou variante.

Preferencialmente, o 25 fragmento funcionalmente ativo ou variante tem pelo menos uma identidade de cerca de 80% com a parte relevante da sequência acima mencionada para o fragmento ou variante correspondente, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade. 30 De preferência, o fragmento tem um tamanho de pelo menos 20 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 50 nucleotídeos, mais preferivelmente de

Ob 9/74 pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 200 nucleotídeos e mais preferivelmente de pelo menos 300 nucleotídeos.

Conforme aqui apresentado, o termo "funcionalmente ativo" significa atividade em relação ao ácido nucleico que 5 codifica uma enzima bacteriana FT e significa que o fragmento ou variante (como um análogo, derivado ou mutante) é capaz de manipular a biossíntese de frutanos em plantas pelo método da presente invenção, por exemplo, sendo traduzido em uma enzima que é capaz de participar da via de biossíntese de frutanos.

Estas variantes incluem variantes alélicas de ocorrência natural e lo variantes não-naturais.

Adições, exclusões, substituições e derivatizações de um ou mais dos nucleotídeos são contempladas, desde que as modificações não resultem em perda de atividade funcional do fragmento ou variante.

Preferencialmente, o fragmento funcionalmente ativo ou variante tem pelo menos uma identidade de cerca de 80% com a parte relevante da sequência 15 acima mencionada para o fragmento ou variante corresponde, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade, mais preferencialmente p elo menos cerca de 98% de identidade.

Tais variantes funcionalmente ativas e fragmentos incluem, por exemplo, aqueles que têm 20 mudanças de ácido nucleico conservadoras.

Conforme aqui apresentado, o termo "mudanças de ácido nucleico conservadoras" significa substituições de ácido nucleico que resultem na conservação do aminoácido na proteína codificada, devido à degeneração do código genético.

Tais variantes funcionalmente ativas e 25 fragmentos também incluem, por exemplo, aqueles que têm alterações de ácido nucleico que resultam na substituição conservadora de aminoácidos de um ou mais resíduos na sequência aminoácido correspondente.

Conforme aqui apresentado, o termo "substituição conservadora de aminoácidos" se refere a uma substituição de um aminoácido 30 por outro da mesma classe, sendo as classes organizadas da seguinte forma:

Apoiares: Ala, Leu, Vai, lie, Pro, Met Phe, Trp Polares sem carga: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin Ácidos: Asp, Glu Básicos: Lys, Arg, His 5 Outras substituições conservadoras de aminoácidos também podem ser feitas da seguinte forma: Aromáticos: Phe, Tyr, His Doadores de próton: Asn, Gin, Lys, Arg, His, Trp Aceptores de próton: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, 10 Gin Fragmentos particularmente preferidos e variantes incluem um ou mais domínios conservados de ligação / hidrólise de sacarose.

Exemplos de tais domínios são mostrados na Figura 1 e incluem LDVWDSWP, QEWSGSA, LRDPH e DEIER. 15 Fragmentos particularmente preferidos e variantes incluem um núcleo catalítico.

Conforme aqui apresentado, o termo "núcleo catalisador" deve ser entendido como uma região interna do peptídeo sinal de polipeptídeo excludente e regiões variáveis N- e C-terminal que contenham domínios conservados de ligação / hidrólise de sacarose.

Um exemplo de um 20 núcleo catalisador é mostrado na Figura 1 e inclui resíduos de aminoácidos da proteína 65-468 SacB de Bacillus subtilis.

Fragmentos particularmente preferidos e variantes incluem aqueles que não possuem um peptídeo sinal.

Conforme aqui apresentado, o termo "peptídeo sinal" deve ser entendido como uma sequência 25 sinal N-terminal.

Um exemplo de um peptídeo sinal é mostrado na Figura 1 e inclui aminoácidos da proteína 27101 SacB de Bacillus subtilis.

Fragmentos particularmente preferidos e variantes têm códons de uso adaptados para as plantas, incluindo o inicio da tradução de monocotiledôneas e dicotiledôneas. 30 Fragmentos particularmente preferidos e variantes têm sítios encriptados de splice e 1 ou elementos de sequência de RNA de desestabilização desativados ou removidos.

De preferência, o ácido nucleico que codifica uma FT bacteriana é isolado ou corresponde a um gene ou genes de uma espécie bacteriana selecionada do grupo consistindo de Lactobacillus, Bacillus e 5 Streptococcus, incluindo Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Lactobacillus johnsonii e Streptococcus mutans, Ainda mais preferencialmente, o ácido nucleico que codifica uma enzima bacteriana FT é isolado ou corresponde a um gene SacB de Bacillus subtilis ou Bacillus amyloliquefaciens, um gene Lsc de Lactobacillus johnsonii ou um gene FTF de Streptococcus 10 mutans.

Em uma modalidade particularmente preferida, o gene SacB inclui uma sequência selecionada do grupo que consiste da sequência mostrada na Figura 2 e as sequências de nucleotídeos codificando a sequência polipeptídica mostrada na Figura 3, e fragmentos funcionalmente 15 ativos e suas variantes.

Em uma modalidade particularmente preferida, o gene Lsc inclui uma sequência selecionada do grupo que consiste da sequência mostrada na Figura 4 e as sequências de ácidos nucleicos codificando a sequência polipeptídica mostrada na Figura 5, e fragmentos 20 funcionalmente ativos e suas variantes.

Plantas transgênicas expressando levansucrases bacterianas têm sido relatadas, em alguns casos, como mostrando fenótipos aberrantes de desenvolvimento.

Muito embora os titulares não queiram ser restringidos por nenhuma teoria, isto pode resultar de compartimentalização 25 inadequada das enzimas levansucrase e polímeros de frutanos.

A expressão citosólica de um gene SacB bacteriano em plantas transgênicas de tabaco e de batata mostrou-se particularmente perturbadora para o desenvolvimento da planta (Caimi et ai., 1997). Entretanto, as plantas expressando uma frutosiltransferase bacteriana fundida aos sinais direcionados a vacúolos 30 acumulam frutanos sem efeito perceptível sobre o desenvolvimento da planta (Ebskamp et al., 1994, Ye et al. 2001).

Para reduzir a possibilidade de fenótipos aberrantes de desenvolvimento, o gene FT bacteriano pode ser modificado para alterar a sua sequência de sinais de direcionamento para direcionar as proteínas FT bacterianas aos compartimentos onde existem altos níveis de frutanos. 5 Mais particularmente, uma sequência quimérica pode ser criada, pela qual o peptídeo N sinal do gene FT bacteriano pode ser removido e substituído por uma sequência sub-celular alvo, de preferência uma sequência vacuolar de segmentação.

Em uma modalidade preferida, a sequência vacuolar lo de segmentação pode ser de ou corresponde a um gene que codifica uma proteína preprosporamina, como SPOR531 de batata-doce.

Em uma modalidade particularmente preferida, a sequência vacuolar de segmentação pode incluir uma sequência selecionada do grupo que consiste da sequência mostrada em negrito sublinhado na Figura 15 6 e as sequências de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídio mostradas em negrito sublinhado na Figura 7, e fragmentos funcionalmente ativos e variantes do mesmo.

Em uma modalidade particularmente preferida, o ácido nucleico que codifica a enzima bacteriana FT pode ser uma SPOR: 20 sequência quimérica SacB.

De preferência, a SPOR: sequência quimérica SacB inclui uma sequência selecionada do grupo que consiste da sequência mostrada na Figura 8 e as sequências de ácidos nucleicos codificando a sequência polipeptídica mostrada na Figura 9, e fragmentos funcionalmente ativos e suas variantes. 25 Em uma modalidade particularmente preferida, o ácido nucleico que codifica a enzima bacteriana FT pode ser uma sequência SPOR ± sc quimérico.

De preferência, o SPOR ± sequência sc quimérica inclui uma sequência selecionado do grupo que consiste na sequência mostrada na Figura 9 e as sequências de ácidos nucleicos codificando a sequência 30 polipeptídica mostrado na Figura 12, e fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes.

Em uma modalidade particularmente preferida, a construção genética inclui uma sequência selecionada do grupo constituído das sequências mostradas nas Figuras 8 e 11 e as sequências de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos mostrados nas Figuras 9 e 12, e 5 fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes.

Em outra modalidade preferida, uma sequência pode ser quimérico é criado, através do qual o peptídeo N sinal do gene FT bacteriana pode ser removida e substituída por um domínio transmembrana de uma enzima frutosiltransferase como 1-SST. io Em uma modalidade particularmente preferida, o domínio transmembrana inclui uma sequência selecionado do grupo que consiste na sequência mostrada em negrito e itálico na Figura 15 e as sequências de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídio mostrado em negrito e itálico na Figura 16, e fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes . 15 Em uma modalidade particularmente preferida, a construção genética inclui uma sequência selecionada do grupo constituído das sequências mostradas nas Figuras 17 e 20 e as sequências de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos mostrados nas Figuras 18 e 21; e fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes. 20 Conforme aqui apresentado, o termo "sequência quimérica" refere-se a um híbrido produzido recombinantemente expressando um gene de fusão incluindo dois ou mais ligados ácidos nucleicos que originalmente codificados proteínas separadas, ou fragmentos funcionalmente ativas ou variantes do mesmo. 25 Conforme aqui apresentado, o termo "gene de fusão" significa que dois ou mais ácidos nucleicos estão ligados de tal forma a permitir a expressão da proteína de fusão, de preferência como uma fusão de translação.

Isso geralmente envolve a remoção do códon de parada a partir de uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma proteína em primeiro 30 lugar, em seguida, acrescentando a sequência de ácido nucleico de uma segunda proteína em frame.

O gene de fusão é então expresso por uma célula como uma única proteína.

A proteína pode ser projetada para incluir a sequência completa de ambas as proteínas original, ou um fragmento funcionalmente ativas ou variante de um ou de ambos. 5 A construção genética pode também incluir uma sequência de ácido nucleico que codifica uma vinculador entre os dois ligados ácidos nucleicos.

Um "linker" é qualquer produto químico, sintético, lipídios, carboidratos, polipeptídeo molécula (ou combinação) posicionado entre e se juntou a dois fragmentos adjacentes ativo em uma proteína de fusão.

O linker lo preferido da invenção é um linker flexível, como uma cadeia de polipeptídeo consiste de um ou mais resíduos de aminoácidos unidos por ligações de aminoácidos para os dois fragmentos ativos.

Por exemplo, a (Gly4 Ser) 3 linker pode ser posicionado entre os dois fragmentos ativos na proteína de fusão.

O promotor usado em construções e métodos da 15 presente invenção pode ser um tecido específico constitutivo, ou promotor induzível.

Em uma modalidade preferida, o promotor pode ser um promotor de luz regulada, mais preferivelmente um promotor fotossintético.

Por uma "luz regulada promoter 'entenda-se um promotor capaz de mediar a expressão gênica em resposta a estímulo luminoso.

Conforme aqui apresentado, o termo 20 "promotor de fotossíntese" significa um promotor capaz de mediar a expressão de um gene que codifica uma proteína envolvida em uma via fotossintética em plantas.

Frutanos se acumulam menos nas lâminas de folhas maduras do que em bainhas de folhas e caules.

Especificamente, a fim de 25 aumentar o nível de frutanos em lâminas foliares, uma abordagem estratégica que foi concebido coordenadamente expressa genes de biossíntese de frutanos em células fotossintéticas.

Enquanto os candidatos não querem ser restrito pela teoria, o uso de promotores de luz regulamentado ou fotossintética pode fornecer as seguintes vantagens: 30 • promotores fotossintéticos estão ativos em um grande grupo de células, incluindo lâminas foliares, a haste superior e exterior

(> 55% de células); • Eles são ativos em células produtoras de sacarose (mesofilo e células parenquimatosas bainha); • Seu padrão de expressão temporal e 5 espacialmente sobreposições com acúmulo de sacarose; • Atividade Frutosyltransferase irá remover sacarose da fonte impedindo supressão de feedback sobre a fotossintese, e pode facilitar o aumento da fixação de CO2. Particularmente preferido de luz regulada lo promotores incluem uma ribulose-1, 5 bifosfato carboxilase-/ oxygtenase pequena subunidade promotor (hemácias) e clorofila a 1 b proteína de ligação (CAB), promotor e fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes.

O promotor-luz pode ser regulado a partir de qualquer espécies de plantas adequada, incluindo monocotiledôneas [tais 15 como milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, cana, cana energética, gramíneas forrageiras (e.g.

Festuca, Lo//um, Brachiaha, Paspalum, Pennisetum), gramíneas de bioenergia (por exemplo, switchgrass, Miscanthus)], plantas dicotiledôneas (como Arabidopsis, soja, canola, algodão, alfafa e tabaco) e gimnospermas. 20 Para a transformação de monocotiledôneas, de preferência a luz promotor-regulada é isolado ou corresponde a um promotor de uma espécie monocotiledônea, mais particularmente, uma espécie Triticum, Lolium ou, até mesmo, mais particularmente Triticum aestivum ou Lo//um perenne. 25 Para a transformação de dicotiledôneas, de preferência a luz promotor-regulada é isolado ou corresponde a um promotor de uma espécie dicotiledônea, mais particularmente, uma espécie Arabidopsis, ainda mais particularmente de Arabidopsis thaliana.

Em uma modalidade particularmente preferida, o 30 promotor rbcS inclui uma sequência selecionado do grupo que consiste na sequência mostrada em itálico minúsculas em qualquer uma das Figuras 23 a

26, e fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes.

Em uma outra modalidade particularmente preferida, o promotor rbcS inclui uma sequência selecionado do grupo que consiste na sequência mostrada em itálico minúsculas em qualquer uma das Figuras 29-36 5 e fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes.

As construções genéticas da presente invenção podem ser introduzidos nas plantas através de uma técnica adequada.

Técnicas para incorporar as construções genéticas da presente invenção em células da planta (por exemplo, transdução, transfecção, transformação ou 10 segmentação de genes) são bem conhecidas por aqueles qualificados na técnica.

Tais técnicas incluem introdução mediada por Agrobacterium, eletroporação de tecidos, células e protoplastos, fusão de protoplastos, injeção em órgãos reprodutivos, a injeção em embriões imaturos e introdução de projéteis de alta velocidade para as células, tecidos , calos, embriões imaturos 15 e maduros, a transformação de biobalística, transformação Whiskers, e suas combinações.

A escolha da técnica vai depender muito do tipo de planta a ser transformado, e pode ser prontamente determinado por uma pessoa devidamente qualificada.

Células incorporando as construções genéticas da 20 presente invenção podem ser selecionados, conforme descrito abaixo, em seguida, cultivadas em um meio apropriado para regenerar plantas transformadas, utilizando técnicas bem conhecidas na arte.

As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, será evidente para a pessoa hábil na arte.

As plantas resultantes podem ser reproduzidos, seja sexualmente 25 ou assexuadamente, usando métodos conhecidos na arte, para produzir sucessivas gerações de plantas transformadas.

Os métodos da presente invenção pode ser aplicada a uma variedade de plantas, incluindo monocotiledôneas [como gramíneas (capins de forragem e bioenergia, por exemplo, incluindo azevém perene, 30 festuca, azevém italiano, festuca vermelha, canarygrass cana, bluestem grande, cordgrass, napier, wildrye, cana selvagem, Miscanthus, switchgrass),

milho ou arroz, milho, trigo, cevada, sorgo, centeio, cana, aveia) e culturas energéticas (por exemplo, cana energética, sorgo energético)], dicotiledôneas [como Arabidopsis, tabaco, soja , canola, alfafa, batata, mandioca, trevos (por exemplo, trevo branco, trevo vermelho, trevo subterrâneo), vegetais brássicas, s alface, espinafre] e gimnospermas.

Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma construção genética capaz de manipular a biossíntese de frutanos em células de fotossíntese de uma planta, disse genética construir incluindo um promotor de luz regulada, ou fragmento funcionalmente ativas ou 10 variante do mesmo, operativamente ligada a uma nucleicos ácido codifica uma enzima bacteriana FT, ou um fragmento funcionalmente ativo, ou suas variantes.

Em uma modalidade preferida, a genética construir de acordo com a presente invenção pode ser um vetor. 15 Conforme aqui apresentado, o termo "vetor" deve ser entendido como uma construção genética utilizada para transferir material genético para uma célula-alvo.

O vetor pode ser de qualquer tipo apropriado e pode ser viral ou não viral.

O vetor pode ser um vetor de expressão.

Tais vetores 20 incluem cromossômicas, não-cromossômicas e sintéticos sequências de ácido nucleico, por exemplo, derivados de vírus de plantas; plasmídeos bacterianos; derivados do plasmídeo Ti de Agrobacterium, Agrobactehum; derivados do plasmídeo Ri de rhizogenes Agrobacterium; DNA fago; cromossomos artificiais de levedura; cromossomos bacterianos artificiais; cromossomos bacterianos 25 artificiais binários; vetores resultantes da combinação de plasmídeos e DNA do fago.

No entanto, qualquer outro vetor pode ser usado, contanto que seja replicável ou integrativa ou viável na célula vegetal.

Em uma modalidade preferida deste aspecto da invenção, a construção genética pode ainda incluir um terminador; o referido 30 gene promotor e terminador sendo operavelmente ligados.

O promotor, o gene terminator, pode ser de qualquer tipo apropriado e pode ser endógena à célula vegetal-alvo ou pode ser exógena, desde que sejam funcionais na célula vegetal-alvo. O material é retirado de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural, se for natural). Por exemplo, uma ocorrência 5 natural ácido nucleico presente em uma planta viva, não é isolado, mas o mesmo ácido nucleico separado de alguns ou de todos os materiais que coexistem no sistema natural, é isolado. Tais ácidos nucleicos poderia ser parte de um vetor e I ou tais ácidos nucleicos poderia ser parte de uma composição, e ainda ser isolado em que tal vetor ou composição não faz parte do seu 10 ambiente natural.

Como uma alternativa ao uso de um gene marcador selecionável para fornecer uma característica fenotípica para a seleção de células hospedeiras transformadas, a presença da construção genética em células transformadas pode ser determinada por outras técnicas bem 15 conhecidas na arte, como a reação em cadeia PCR (polimerase), Southern blot hibridação análise, ensaios de histoquímica (por exemplo, ensaios GUS), cromatografia em camada fina (TLC), análises de hibridização do norte e western blot. Os titulares também determinaram que os métodos 20 da presente invenção pode resultar em biomassa maior na fábrica transformada em relação a uma planta de controle não transformadas. Esta biomassa reforçada por sua vez pode ser usado como uma ferramenta de seleção para a identificação de plantas transformadas. Isto tem a vantagem de que em algumas circunstâncias, pode não haver necessidade de incluir uma 25 resistência a antibióticos ou outro marcador para selecionar para transformantes, onde posterior remoção desses marcadores (e para a criação de marcadores livres de plantas) podem apresentar dificuldades. Por "biomassa melhorada" ou "biomassa reforçada" deve-se entender um aumento de, aumento ou a maior estabilidade de 30 produção de biomassa, incluindo parte aérea e 1 ou o crescimento das raízes, em uma planta transformada em relação a uma planta de controle não transformadas.

Por exemplo, uma ou mais características de crescimento selecionado do grupo consistindo de área foliar total, área foliar acumulada, a dinâmica de crescimento de folhas (número de folhas ou seja, ao longo do tempo), número de brotos, número de perfilhos, número de raízes, massa da 5 raiz ou peso de massa, atirar ou peso, comprimento da raiz, comprimento da parte aérea, comprimento estolões, número de tubérculos, peso do tubérculo, número de flores, número de frutos, número de sementes, peso das sementes, peso do fruto, porcentagem de plantas com flores e produção de sementes por flor ou por área semeada; pode ser melhorado, aumentado ou mais estável em 10 uma planta transformada em relação a uma planta de controle não transformadas.

Esta técnica é particularmente aplicável a plantas que são substancialmente geneticamente uniformes ou geneticamente idênticos ou apresentam diferenças pequenas no fenótipo biomassa antes da 15 transformação.

Assim, em um outro aspecto da presente invenção, é provido um método de aumentar a biomassa em uma usina, disse que o método incluindo a introdução, disse que planta uma quantidade eficaz de uma construção genética, incluindo um promotor ou um fragmento funcionalmente 20 ativo, ou suas variantes, operatório gostava de um ácido nucleico que codifica uma enzima bacteriana FT, ou um fragmento funcionalmente ativas ou variante do mesmo.

De preferência, o promotor é um promotor luz regulamentado.

Os métodos, ácidos nucleicos e construções genéticas da presente invenção pode ser usado em combinação com outros 25 métodos de manipulação genética, ou outros transferidos ácidos nucleicos ou construções genéticas, assim, traços de empilhamento.

Assim, plantas transgênicas, células de plantas, sementes de plantas ou de outras partes das plantas com genes empilhados (ou genes combinados) pode ser produzido.

Por exemplo, a tecnologia da presente invenção podem ser combinados com a 30 tecnologia de resistência a herbicidas (glufosinato por exemplo, o glifosato), tecnologia de resistência a insetos (ex.

Bacillus thuhngiensis) ou a tecnologia a senescência retardada.

Os ácidos nucleicos ou de construções genéticas podem ser introduzidos na planta através de uma técnica adequada, como acima descrito, e podem ser introduzidos simultaneamente, sequencialmente ou em separado. 5 Em um aspecto ainda mais da presente invenção, é provido um método de aumentar a biomassa em uma usina, disse que o método incluindo a introdução, disse que quantidade de plantas eficaz de: (a) uma construção genética capaz de manipular a biossíntese de frutanos em células de fotossintese da planta, disse genética lo construir incluindo um promotor ou um fragmento funcionalmente ativas ou variante do mesmo, operativamente ligada a um ácido nucleico que codifica uma enzima bacteriana FT, ou um ativo funcionalmente fragmento ou variante do mesmo, e (b) uma construção genética capaz de manipular a 15 senescência na planta.

As construções genéticas podem ser introduzidos na planta por qualquer técnica adequada, como acima descrito, e podem ser introduzidos simultaneamente, sequencialmente ou em separado.

De preferência a construção genética capaz de 20 manipular a biossíntese de frutanos é como acima descrito.

De preferência a construção genética capaz de manipular a senescência na planta é capaz de manipular a senescência em células fotossintéticas da planta.

De preferência a construção genética capaz de 25 manipular a senescência inclui um promotor do gene myb ou promotor do gene modificado myb, ou um fragmento funcionalmente ativo, ou suas variantes, operativamente ligada a um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de citocinina, ou um fragmento funcionalmente ativas ou variante do mesmo. 30 Construções genéticas ou vetores adequados são descritos no pedido de patente internacional PCTIAU01101092 e no pedido de patente US1 11789, 526, cujas divulgações são incorporadas em sua totalidade por referência.

O termo "manipulando a senescência" geralmente refere-se a senescência atrasada na planta transformada ou células ou órgãos 5 da planta transformada, por exemplo, células fotossintéticas, em relação ao controle de uma planta não-transformada.

No entanto, para algumas aplicações pode ser desejável para promover ou modificar a senescência na planta.

A senescência pode ser promovido ou modificada por exemplo, através da utilização de um gene antisense. 10 0 promotor do gene myb pode ser de qualquer tipo apropriado.

De preferência, o promotor do gene myb é um promotor do gene myb32. De preferência, o promotor do gene myb é de Arabidopsis, mais preferivelmente Arabidopsis thaliana.

Mais de preferência o promotor do gene myb inclui uma sequência de nucleotideos selecionada do grupo que consiste 15 na sequência mostrada em sequência sem ID: 1 de PCTIAU01101092 e funcionalmente ativa fragmentos e variantes do mesmo.

Um promotor adequado é descrito por Li et al, clonagem de três MYB-like genes de Arabidopsis (PGR 99-138) Plant Physiology 121:. 313 (1999), toda a divulgação é aqui incorporada por 20 referência.

Por um "promotor do gene modificado myb" entende-se um promotor normalmente associado a um gene myb, que o promotor é modificado para eliminar ou inativar um ou mais motivos específicos de raiz e 1 ou pólen motivos específicos, disse promotor. 25 De preferência, o promotor do gene modificado myb é um promotor do gene modificado myb32. De preferência, o promotor do gene modificado myb é modificado a partir do promotor do gene myb de Arabidopsis, ou mais de preferência de Arabidopsis (ha/lana.

Um promotor adequado que pode ser modificado de 30 acordo com a presente invenção é descrito por Li et al, clonagem de três MYB- like genes de Arabidposis (PGR 99-138) Plant Physiology 121:. 313 (1999),

cuja divulgação é aqui incorporada por referência.

Por um motivo "root específico" deve-se entender uma sequência de 3 a 7 nucleotídeos, de preferência 4-6 nucleotideos, de preferência mais cinco nucleótidos, que dirige a expressão de qualquer gene 5 associado nas raízes de uma planta.

Preferencialmente o motivo de raiz específico inclui uma sequência de consenso ou ATATT AATAT.

Por um "motivo de pólen específico" deve-se entender uma sequência de 3 a 7 nucleotídeos, de preferência 4-6 lo nucleotídeos, de preferência mais 4 ou 5 nucleotídeos, que dirige a expressão de um gene associado no pólen de uma planta.

Preferencialmente o motivo de pólen específico inclui uma sequência consenso selecionado do grupo consistindo de TTTCT, AGAAA, TTCT e AGAA. 15 A raiz ou motivo especifico pólen pode ser inativada por adicionar, excluir, substituindo ou derivatizando um ou mais nucleotídeos do tema, de modo que já não tem a sequência de consenso preferido.

De preferência, o promotor do gene modificado myb inclui uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo das 20 sequências mostradas em posições SEQ.

ID: 2, 3 e 4 do documento ÚS111789, 526 e fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes.

Por um "gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de citocinina" entende-se um gene que codifica uma enzima envolvida na síntese de citocininas cinetina tal, zeatina e benziladenina, por 25 exemplo, um gene que codifica isopentyl transferase (ipt), ou ipt-WKE gene, tais como o gene sho (por exemplo, a partir de petunia). De preferência, o gene é um isopentenil transferase (ipt) gene ou gene sho.

Em uma modalidade preferida, o gene de uma espécie é selecionado do grupo consistindo de Agrobacterium, mais preferivelmente Agrobacterium tumefaciens; Lotus, mais 30 preferivelmente Lotus japonicus, e Petúnia, mais preferivelmente Petunia hybrida.

Mais preferivelmente o gene inclui uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo constituído das sequências mostradas nas sequências SEQ ID: 5, 7 e 9 do documento US1 11789, 526, sequências de codificação os polipeptídeos mostrado nas sequências SEQ ID: 6, 8 e 10 do 5 documento US111789, 526 e fragmentos funcionalmente ativo e suas variantes. A presente invenção também fornece um método de selecção de plantas transformadas, disse método, incluindo a introdução, disse que as plantas uma quantidade efetiva de uma construção genética, incluindo um promotor ou um fragmento funcionalmente ativas ou variante do mesmo, lo operativamente gostava de um ácido nucleico que codifica uma FT bacteriana enzima, ou um fragmento funcionalmente ativo, ou suas variantes e selecionando plantas com biomassa reforçada. De preferência, o promotor é promotor luz regulamentado. Em um outro aspecto da presente invenção é 15 provido um celular de plantas transgênicas, de plantas, sementes de plantas ou parte de outras plantas com características modificadas biossintética frutano ou biomassa melhorada em relação a uma planta de controle não transformado; disse célula vegetal, planta, sementes de plantas ou de outras plantas peça incluindo uma construção genética ou vetor de acordo com a presente 20 invenção.

Por "características de biossíntese de frutanos modificadas" entende-se que as exposições de plantas transformadas maior biossíntese de frutanos e 1 ou contém níveis elevados de carboidratos solúveis em relação a uma planta de controle não transformadas. 25 Em uma modalidade preferida a uma célula transgênica vegetal, plantas, sementes de plantas, ou parte de outras plantas com maior biomassa tem um aumento na biomassa de pelo menos cerca de 15%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 25%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 35%, mais de preferência pelo menos cerca de 50% em 30 relação ao controle de uma planta não-transformada. Por exemplo, a biomassa pode ser aumentada por entre cerca de 15% e 500%, mais preferivelmente entre cerca de 25% e 300%, mais preferivelmente entre cerca de 35% e 200%, mais preferivelmente entre cerca de 50% e 100% em relação a um controle de planta não transformada.

Em uma modalidade preferida, a célula de plantas 5 transgênicas, de plantas, sementes de plantas ou parte de outras plantas com características biossintética de frutano modificadas tem um aumento de carboidratos solúveis, pelo menos cerca de 15%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 25%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 35% , mais preferivelmente pelo menos cerca de 50% em relação a uma planta de controle lo não transformada.

Por exemplo, carboidratos solúveis pode ser aumentada por entre cerca de 15% e 500%, mais preferivelmente entre cerca de 25% e 300%, mais preferivelmente entre cerca de 35% e 200%, mais preferivelmente entre cerca de 50% e 100% em relação a uma planta de 15 controle não transformada.

De preferência, as células de plantas transgênicas, de plantas, sementes de plantas ou parte outra planta é produzido por um método de acordo com a presente invenção.

A presente invenção também fornece uma planta 20 transgênica, sementes de plantas ou parte de outras plantas derivadas de uma célula vegetal da presente invenção e incluindo uma construção genética ou vetor da presente invenção.

A presente invenção também fornece uma planta transgênica, sementes de plantas ou parte de outras plantas derivado de uma 25 planta da presente invenção e incluindo uma construção genética ou vetor da presente invenção.

De preferência, a célula de plantas transgênicas, de plantas, sementes de plantas ou parte outra planta é uma espécie Lolium, mais preferivelmente Lolium perenne ou Lolium arundinaceum. 30 De preferência, a célula de plantas transgênicas, de plantas, sementes de plantas ou parte de outras plantas é um grão de cereal,

mais preferivelmente uma espécie Triticum, mais de preferência de trigo (Triticum aestivum). Por exemplo, a presente invenção permite a produção de plantas transgênicas de azevém perene com frutanos aumentou 5 em lâminas foliares, crescimento vigoroso e uma maior tolerância ao estresse abiótico, para melhorar a nutrição de animais de pasto.

A presente invenção também permite a produção de plantas de trigo transgênico com frutanos aumentou, o crescimento vigoroso, e tolerância a estresse abiótico, por aumento da massa de hidratos de carbono lo utilizável, por exemplo, para a produção de biocombustíveis ou de ração animal.

Por "células vegetais" entende-se qualquer célula auto-propagação delimitada por uma membrana semi-permeável e contendo um plastídeo.

Essa célula também requer uma parede celular se a propagação 15 ainda é desejada.

A célula vegetal, como aqui utilizado inclui, sem limitação, algas, cianobactérias, culturas em suspensão sementes, embriões, regiões meristemáticas de tecidos de calos, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microsporos.

Por "transgênico" entenda-se qualquer célula que 20 inclui uma sequência de DNA que é inserido pelo artifício em uma célula e torna-se parte do genoma do organismo que se desenvolve a partir dessa célula.

Como usado aqui, os organismos transgênicos são geralmente plantas transgênicas e o DNA (transgene) é inserido pelo artifício em qualquer genoma nuclear ou plastídica. 25

Descrição detalhada das modalidades A presente invenção agora será descrita mais detaihadamente com referência aos exemplos que acompanham e desenhos.

Deve ser entendido, no entanto, que o seguinte descrição é apenas ilustrativa e 30 não deve ser tomado de forma alguma como uma restrição à generalidade da invenção descrito acima.

Nas figuras: Figura 1: Representação esquemática da proteína SacB de Bacillus subtilis, membro da família GH68. As quatro diferentes regiões mostradas são: N-terminal sequência sinal; N-terminal região variável; 5 núcleo catalítico e C-terminal região variável.

Resíduos de ácido amino, incluindo a tríade catalítica (D86, D247 e E342) e encadernação de sacarose (W85, W163 e R246). Figura 2. Sequência de nucleotídeos do gene SacB de Bacillus subtilis {Levansucrase). Sequência de nucleotídeos que codifica o 10 peptídeo sinal N-terminal está em negrito.

Figura 3. Aminoácidos da proteína SacB sequência de Bacillus subtilis (Levansucrase). O peptídeo sinal N- terminal está em negrito.

Figura 4. Sequência de nucleotídeos do gene Lsc de Lactobacillus johnsonii NCC 533 (Inulosucrase). Sequência de nucleotídeos 15 que codifica o peptídeo sinal N-terminal está em negrito.

Figura 5. Sequência de aminoácidos da proteína de Lactobacillus Lsc johnsonii NCC 533 (Inulosucrase). O peptídeo sinal N- terminal está em negrito.

Figura 6. Sequência de nucleotídeos de SPOR531, 20 Preprosporamina a partir de proteína de batatas.

Sequência de sinal vacuolar segmentação é mostrada em negrito sublinhado.

Figura 7. Sequência de aminoácidos da SPOR531, Preprosporamina a partir de proteína de batatas.

Sequência de sinal vacuolar segmentação é mostrado em negrito sublinhado. 25 Figura 8. SPOR: SacB sequência de nucleotídeos quimérico.

A sequência sinal N-terminal da SacB foi substituído pelo sinal vacuolar direcionamento de SPOR (indicado pelo negrito sublinhado). Figura 9. SPOR: SacB sequência de proteína quimérica.

A sequência sinal N-terminal da SacB foi substituído pelo sinal 30 vacuolar direcionamento de SPOR (indicado pelo negrito sublinhado). Figura 10. Previsão de Estrutura Secundária de

SPOR-SACB proteína de fusão usando um programa Secondary Structira Prediction para proteínas de membrana de SOSUI http:/fbp.nuap.nagoya- u.ac.ip/sosuil Figura 11. SPOR: Lsc sequência d e nucleotídeos 5 quimérico. A sequência sinal N-terminal da Lsc foi substituído pelo sinal vacuolar direcionamento de SPOR (indicado pelo negrito sublinhado). Figura

12. SPOR ± sc sequência de proteína quimérica. A sequência sinal N-terminal da Lsc foi substituído pelo sinal vacuolar direcionamento de SPOR (indicado pelo negrito sublinhado). 10 Figura 13. Previsão de Estrutura Secundária de SPOR-Lsc proteína de fusão usando um programa Secondary Structira Prediction para proteínas de membrana de SOSUI http://bp.nuap.naoya- u.ac.jp/sosui/ Figura 14. Previsão de Estrutura Secundária da LPI- 15 SST usando um programa Secondary Structira Prediction para proteínas de membrana de SOSUI http:llbp.nuap.nagoya-u.ac,jplsosui1 Figura 15. LP1-SST sequência de nucleotídeos a partir de L perenne. A LPI-SST sequência domínio transmembrana de codificação é mostrado em negrito e itálico. 20 Figura 16. LPI-SST sequência de proteína de L perenne. O domínio transmembrana LPI-SST é mostrado em negrito e itálico. Figura 17. Lpl-SST-SACB sequência de nucleotídeos quimérico. A sequência sinal N-terminal de codificação de SACB foi substituído pela sequência de domínio LPI-SST transmembrana de 25 codificação (indicado pelo negrito e itálico). Figura 18. Lpl-SST-SACB sequência de proteína quimérica. A sequência sinal N-terminal de SACB foi substituído pelo domínio transmembrana LPI-SST (indicado pelo negrito e itálico). Figura 19. Previsão de Estrutura Secundária de Lp1- 3 o SST-SACB proteína de fusão usando um programa Secondary Structira Prediction para proteínas de membrana de SOSUI http://bp.nuap.nagoy_a-

u.ac.jp/sosuil Figura 20. Lpl-SST-Lsc sequência de nucleotídeos quimérico. A sequência sinal N-terminal de codificação de Lsc foi substituído pela sequência de domínio LPI-SST transmembrana de codificação (indicado 5 pelo negrito e itálico).

Figura 21. Lpl-SST-Lsc sequência de proteína quimérica. A sequência sinal N-terminal de Lsc foi substituído pelo domínio transmembrana LPI-SST (indicado pelo negrito e itálico). Figura 22. Previsão de Estrutura Secundária de Lp1- l0 SST-Lsc proteína de fusão usando um programa Secondary Structira Prediction para proteínas de membrana de SOSUI http:llbp.nuap.nagoya- u.ac.jplsosuil Figura 23. Sequências de nucleotídeos do AtRbcS:: SPOR-SACB:: NOS cassete de expressão is Figura 24. Sequências de nucleotídeos do AtRbcS:: SPOR-Lsc:: NOS Figura cassete de expressão Figura 25. Sequências de nucleotídeos do AtRbcS:: Lpl-SST-SACB:: NOS cassete de expressão Figura 26. Sequências de nucleotídeos do AtRbcS:: 20 Lp1-SST-Lsc:: NOS cassete de expressão Figura 27. Gateway vector PDestination Figura 28. Gateway de vetores PDestination para a transformação de dicotiledôneas: A. AtRbcS:: SPOR-SACB:: NOS; B. AtRbcS:: SPOR-Lsc:: NOS C. AtRbcS:: Lpl-SST-SACB:: NOS e D. AtRbcS LPI-SST- 25 Lsc NOS.

Figura 29. Sequências de nucleotídeos do TaRbcSp:: SPOR-SACB:: cassete TaRbcst expressão Figura 30. Sequências de nucleotídeos do TaRbcSp SPOR-SacBaTaRbcst TaRbcst + AtMYB32:: IPT:: cassete de expressão 35S 30 Figura 31. Sequências de nucleotídeos do TaRbcSp:: SPOR-Lsc:: cassete TaRbcst expressão

Figura 32. Sequências de nucleotídeos do TaRbcSp:: SPOR-Lsc:: TaRbcst + AtMYB32:: IPT:: cassete de expressão 35S Figura 33. Sequências de nucleotideos do TaRbcSp:: Lp1-SST-SACB:: cassete de expressão TaRbcst 5 Figura 34. Sequências de nucleotideos do TaRbcSp:: Lpl-SST-SACB:: TaRbcst TaRbcst + AtMYB32:: IPT:: cassete de expressão 35S Figura 35. Sequências de nucleotideos do TaRbcSp:: Lp1-SST-Lsc:. Cassete TaRbcst expressão lo Figura 36. Sequências de nucleotídeos do TaRbcSp:: SPOR-Lsc:: TaRbcst + AtMYB32:: IPT:: cassete 35S expressão Figura 37. Gateway PDestination vector PBS: ubi:: bar:: NOS Figura 38. Gateway de vetores PDestination para a 15 transformação de monocotiledôneas: A. TaRbcS:: SPOR-SACB:: TaRbcS e B.

TaRbcS:: SPQR-SACB:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S Figura 39. Gateway de vetores PDestination para a transformação de monocotiledôneas: A. TaRbcS:: SPOR-Lsc:: TaRbcS e B. TaRbcS:: SPOR-Lsc:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S 20 Figura 40. Gateway de vetores PDestination para a transformação de monocotiledôneas: A. TaRbcS:: Lpl-SST-SACB:: TaRbcS e B. TaRbcS:: Lp 1-SST-SACB:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S Figura 41. Gateway de vetores PDestination para a transformação de monocotiledôneas: A. TaRbcS:: Lpl-SST-Lsc:: TaRbcS e B. 25 TaRbcS:: Lpl-SST-Lsc:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S Figura 42. Isolamento de protoplastos derivados de mesófilo de Nicotiana tabacum. A Dissecção)-B) de 4-6 semanas de idade in vitro material da folha; pré-enzimática digestão; C digestão) de 4-6 semanas de idade in vitro material da folha; E; 16 horas de incubação; D) A colheita de 30 suspensão de protoplastos ) Separação de protoplastos ricos interfuse; F)-G) Intact cloroplasto ricos, protoplastos.

Figura 43. Isolamento de protoplastos derivados de mesófilo de Nicotiana tabacum para análise de expressão transitória.

A)-B) cloroplasto ricos, Intact protoplastos; Cultivar C) de protoplastos em meio de enriquecimento líquido; D) de protoplastos viáveis, 48 horas após o isolamento. 5 Figura 44. Isolamento de protoplastos derivados de mesófilo de Nicotiana tabacum para transformações estáveis.

A)-B) cloroplasto ricos, Intact protoplastos; C) protoplastos-embedded placa mar agarose plug, dia 0; D) protoplastos viáveis, 6 dias após o isolamento e incorporação; E)-F) incorporado e liberado protoplastos derivados de micro- calos; quatro semanas lo após o isolamento e incorporação.

Figura 45. Regeneração de brotos a partir de protoplastos derivados de mesófilo micro-calos de Nicotiana tabacum.

A) Liberado micro-calos em meio líquido A, isolamento pós 6-7 semanas e incorporação; BC) Proliferação de calos em meio de cultura solidificado; D)-E) 15 indução Fotografe e regeneração de protoplastos derivados de mesófilo calos;

Root F) desenvolvimento de brotos regenerados; G)-H) Crescimento e desenvolvimento das plantas sob contenção estufa.

Figura 46. Avaliação da viabilidade de protoplastos untransformed, 48 horas após o isolamento. 20 Figura 47. Avaliação do PEG-transformado viabilidade de protoplastos, 48 horas após o isolamento e transfecção.

Figura 48. Agrobacterium-med \ transformação ated de discos de folhas de tabaco.

A) Co-cultivo de discos foliares transformados, dia 0; B} Fase 1 iniciação de brotos, 3 dias após co-cultivo. 25 Figura 49. Detecção de gfp expressão em discos de folhas de tabaco transformado.

A) disco de folha não transformadas, luz branca; B) disco de folha não transformadas, gfp2 filtro; C) untransformed disco de folha, gfp3 filtro; D) & G) Turbo gfp-transformado discos de folhas, a luz branca; E) & H) Turbo gfp-transformado folha discos, gfp2 filtro; F) & I) Turbo 30 gfp-transformado discos de folha, gfp3 filtro.

I

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Figura 50. Eletroforese de RT-PCR de amostras e controles.

Raias 1 e 13: 1kb DNA Ladder + Pista 2: Ampliação da transcrição SACB de 2 uL cDNA gerada por transcrição reversa do mRNA de protoplastos transfectadas 1 (amostra 9A) com primer gene específico Pista 3: Ampliação da 5 transcrição SACB cDNA a partir de 1 mL (amostra 9A) Faixa 4: reação controle realizada sem transcriptase reversa (amostra 9A) Faixa 5: reação controle realizada sem template (SACB primers) Faixa 6: Ampliação da transcrição SACB de 2 uL cDNA gerada por transcrição reversa de mRNA a partir de protoplastos transfectadas 1 (amostra 12A) com primer específico do gene; 10 Faixa 7: Amplificação da transcrição SACB a partir de 1 mL de cDNA (amostra

12A) Faixa 8: reação controle realizada sem transcriptase reversa (amostra 12A); Faixa 9: A amplificação de 18S transcrição de 2 uL cDNA gerada por transcrição reversa de mRNA a partir de Protoplastos untransfected com primer gene específico ;Faixa 10: Ampliação da transcrição 18S a partir de 1 gL cDNA 15 gerada por transcrição reversa de mRNA a partir de protoplastos untransfected com primer gene especifico; Faixa 11: reação controle realizada sem transcriptase reversa (protoplastos untransfected); Faixa 12: reação controle realizada sem template (primers 18S)

20 Exemplos Exemplo 1 - Isolamento de genes de biossíntese bacteriana frutano A Figura 1 apresenta uma representação esquemática da proteína SACB de Bacillus subtllis.

As quatro diferentes 25 regiões mostradas são: N-terminal sequência sinal; N-terminal região variável;

núcleo catalítico e C-terminal região variável.

Estruturalmente, a maioria das bactérias e inulosucrases levansucrases partes do peptídeo sinal N-terminal, uma tríade catalítica.

Esta sequência é removida durante a modificação 30 sequência.

Os resíduos envolvidos na ligação de sacarose estão localizados no interior do núcleo sequências catalítico e permanecem intocados durante a modificação.

A levansucrase bacteriana (SACB) e inulosucrase (Lsc> nucleotídeo e sequências de proteínas são fornecidos nas figuras 2-5, respectivamente No entanto, para transformação em plantas do levansucrase 5 bacteriana e sequências inulosucrase também são modificadas da seguinte maneira.: • A remoção do peptídeo N-sinal bacteriana; • Adaptação de uso de códon, incluindo o início da tradução de monocotiledôneas e dicotiledôneas; 10 • Remoção de sítios de splice enigmática e elementos de sequência de RNA de desestabilização, • A sequência de codificação é ainda mais modificado com supostos sub-celular, incluindo sequências alvo vacuolar sequências alvo de monocotiledôneas e dicotiledôneas, bem como incluindo a 15 planta 1-SST-específicos domínios transmembrana.

Contornos destas mudanças são indicadas no exemplo a seguir.

Exemplo 2 - Modificação de genes de biossíntese bacteriana frutano 20 Segmentação de genes FT bacteriana a determinados compartimentos celulares Para dirigir a FT genes de bactérias longe do citosol e ao compartimento onde ambos sacarose e frutanos acumular as sequências de codificação de SACB e Lsc são modificados com uma sequência de suposto 25 direcionamento vacuolar da proteína preprosporamin (SPOR531) de batata- doce (ipomoea batatas). O propeptideo de um precursor para sporamin é necessário para a segmentação de sporamin para o vacúolo (Hattori et ai., 1985). As informações vacuolar direcionamento de sporamin é codificado em uma propeptídeo amino-terminal e é indicado nas Figuras 5 e 6. 30 A modificação da sequência envolve a remoção do peptídeo N-sinal de ambos os genes e SACB biossíntese bacteriana Lsc fuctan ea adição de SPOR531 sinal vacuolar alvo (Figuras 7-8 e 10-11, respectivamente). Previsão da localização subcelular e topologia das proteínas modificadas usando a predição de estrutura secundária de proteínas 5 de membrana com software SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.iplsosui/ indica uma localização transmembrana acionado pelo sinal vacuolar alvo (Figuras 9 e 12). Além dos domínios transmembrana da LPI-SST proteína para genes de bactérias FT.

O software SOSUI também foi usado 10 para prever a estrutura secundária do Lolíum perenne 1 -SST gene.

Esta estrutura, indicando um domínio transmembrana no terminal N é indicado na Figura 13. A codificação transmembrana de domínio e sequências de proteínas são indicados nas figuras 14 e 15, respectivamente.

A modificação da sequência envolve a remoção do 15 peptídeo N-sinal de ambos os genes e SACB biossintese bacteriana Lsc fuctan e a adição do domínio transmembrana LPI-SST (Figuras 16-17 e 19-20, respectivamente). As sequências modificadas de SACB e Lsc foram avaliados utilizando a predição de estrutura secundária de Membrana Proteínas SOSUI software para localização subsellular e topologia de proteínas e suas estruturas 20 secundárias previstas são apresentados nas Figuras 18 e 21, respectivamente.

Exemplo 3 - Gerando vetores de transformação estável em dicotiledôneas Síntese de construções de expressão construções de expressão utilizando promotores 25 fotossinteeticos, genes modificados biossintese bacteriana frutano indicado no Exemplo 2 e NOS sequência de terminador para transformação em plantas dicotiledôneas é artificialmente sintetizadas.

O uso de um promotor fotossintética expressa os genes nos tecidos que se acumulam frutanos, enquanto as sequências 30 modificadas alvo a proteína para compartimentos celulares específicos da planta.

A subunidade ribulose-1 ,5-bisfosfato carboxilase / oxigenase Small (hemácias) é um bem caracterizados gene-luz regulada em plantas superiores.

Um fragmento de 1700 bp da Arabidopsis thaliana ribulose- 1 ,5-bisfosfato carboxilase 1 oxigenase Pequenas subunidade sequência 5 promotora (AtRbcS) já havia sido clonado.

Primers são desenhados para amplificar um fragmento menor contendo o sinal TATA do promotor AtRbcS para uso em vetores de expressão.

As sequências previstas para a recém-modificados genes de biossíntese bacteriana frutanos são sintetizados alterando ser 10 artificialmente de uso códon para expressão em plantas, bem como a remoção de sítios de splice enigmática e elementos de sequência de RNA de desestabilização, para otimizar o seu desempenho na célula vegetal.

As figuras 23-26 representam a expressão cassetes AtRbcS:: SPOR-SACB:: NOS, AtRbcS:: SPOR-Lsc:: NOS, AtRbcS:: Lpl-SST- 15 SACB:: NOS e AtRbcS:: LPI-SST-Lsc:: NOS, respectivamente, e ainda não tinha otimização códon ou remoção de elementos desestabilizadores.

Geração de construções contendo os genes modificados FT bacteriana conduzido por um promotor fotossintética Arabidopsis para a transformação de dicotiledôneas 20 Cada cassete de expressão sintetizada é colocado em um vetor pDONOR gateway habilitado para recombinação no vetor destino final para transformação em plantas.

Um Gateway habilitado vetor destino, contendo o 35Sp: hph: cassete marcador 35St selecionável foi gerado, 25 pPZP200_35Sp_hph_35St_R41R3 (Figura 27). Reações de recombinação LR gateway de produzir a seguinte destinação vetores para transformação em dicotiledôneas: AtRbcS:: SPOR-SACB:: NOS (Figura 28A); AtRbcS:: SPOR-Lsc:: NOS (Figura 28B); AtRbcS:: Lpl-SST-SACB:: NOS (Figura 28c) e AtRbcS:: Lp1-SST-Lsc:: NOS 30 (Figura 28d).

Exemplo 4 - Gerando vetores de transformação estável em monocotiledôneas Síntese de construções de expressão A expressão se constrói utilizando o promotor de 5 trigo pão photosyntheic (TaRbcsp), a modificação de genes de biossíntese bacteriana frutano, indicado no Exemplo 2, e o TaRbcS sequência de terminador para transformação em plantas monocotiledôneas são artificialmente sintetizadas.

O uso de um promotor fotossintética expressa os genes nos tecidos que se acumulam frutanos, enquanto as sequências 10 modificadas alvo a proteína para compartimentos celulares específicos da planta.

Sequiencias de trigo (Triticum aestivum) TaRbcS reguladoras (promotor e terminador) já foram clonados (Zeng, et ai, 1995;. Sasanuma, 2001). Um fragmento de 695 pb da sequência promotora 15 publicados anteriormente contendo o sinal do gene TATA TaRbcS (NCBI número de adesão AB042069) é amplificada para uso em vetores de expressão.

As sequências previstas para a recém-modificados genes de biossíntese bacteriana frutanos são sintetizados artificialmente de 20 uso alterar códon para expressão em plantas, bem como a remoção de sítios de splice enigmática e elementos de sequência de RNA de desestabilização, para otimizar o seu desempenho na célula vegetal.

Usando os métodos descritos acima cassetes de expressão são sintetizadas para gerar plantas transgênicas que contêm genes 25 de biossíntese de frutanos ea LXR TM.

LXR TM tecnologia é baseada em um cassete de expressão contendo um gene candidato (IPT) para atraso na senescência foliar sob o controle do promotor do gene AtMYB32. O AtMYB3p cassete de expressão:: IPT:: 35St é descrito no pedido de patente internacional PCTIAU01101092. O fenótipo de transgênicos LXR TM plantas inclui uma 30 diminuição na folha de amarelecimento e perda de clorofila associada com a idade da planta levando a um aumento da capacidade fotossintética,

resultando em melhor perfilhamento e biomassa vegetal. Integração das duas tecnologias leva a um aumento da expressão de frutanos por meio de uma extensão da ativação dos promotores fotossintética e podem ter impacto significativo sobre a eficácia de 5 uma variedade de aplicações, aumentando a gama de produtividade nas plantas. As Figuras 29-36 representam os cassetes de expressão, TaRbcS:: SPOR-SACB:: TaRbcS, TaRbcS:: SPOR-SACB:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S, TaRbcSxSPOR-Lsc-TaRbcS, TaRbcS:: SPOR-Lsc: : 10 TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S, TaRbcSiiLpi-SST-SacBiTaRbcS, TaRbcSiiLpi- SST-SacBiTaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 355, TaRbcS:: LPI-SST-Lsc:: TaRbcS e TaRbcS:: Lpl-SST- Lsc:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S, respectivamente, e ainda não tinha otimização códon ou remoção de elementos desestabilizadores. 15 Geração de construções contendo os genes modificados FT bacteriana conduzido por um promotor fotossintética Triticum para a transformação de monocotiledôneas Cada cassete de expressão sintetizada é colocado em um vetor pDONOR gateway habilitado para recombinação no vetor destino 20 final para transformação em plantas.

Um Gateway vetor destino habilitado, contendo a Ubi:: bar:: NOS cassete marcador selecionável foi gerado, PBS:: Ubi:: bar:: NOS_R41R3 (Figura 37). Reações de recombinação LR gateway de produzir a seguinte destinação vetores para transformação em monocotiledôneas para: 25 TaRbcS:: SPOR-SACB:: TaRbcS (Figura 38A); TaRbcS:: SPOR-SACB:: TaRbcS + AtMYB32:: 1PT:: 35S (Figura B); TaRbc S:: SPOR-Lsc:: TaRbcS (Figura 39A); TaRbcS:: SPOR-Lsc:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S (Figura 39B); TaRbcS:: Lpl-SST-SACB:: TaRbcS (Figura 40A); TaRbcS:: Lpl-SST- SACB:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S (FigureB); TaRbcS:: Lpl-SST-Lsc:: 30 TaRbcS (Figura 41A) e TaRbcS:: Lpl-SST-Lsc:: TaRbcS + AtMYB32:: IPT:: 35S (Figura 41 B)

Exemplo 5 - Construções para dicotoliledônias - protoplastos tabacum e N. A. thaliana As construções foram feitas em versões para entrega direta (expressão transitória em protoplastos) e versões em vetores de 5 transformação binária para entrega estável para Arabidopsis (A. thaliana) e fumo (N. tabacum)

1. AtRbcS: :1-SST-SACB *

2. AtRbcS:: SPOR-SACB *

3. AtRbcS::1-SST-Lsc * 10 4. AtRbcS:: SPOR-Lsc * * A levansucrase bacteriana e sequências inulosucrase são modificados da seguinte maneira: • remoção do peptídeo N-sinal bacteriana; • adaptação de uso de códon, incluindo o início da 15 tradução de monocotiledôneas e dicotiledôneas • remoção de sítios de splice enigmática e elementos de sequência de RNA de desestabilização • a sequência de codificação é ainda mais modificado com supostos sub-celular, incluindo sequências alvo vacuolar 20 sequências alvo de monocotiledôneas e dicotiledôneas, bem como incluindo a planta 1-SST e FFT específicos trans-membrana domínios. Exemplo 6 - TRANSFORMAÇÃO DE POLIETILENO GLICOL MEDIADA DE mesofilo-DERIVADOS DE TABACO protoplastos Este exemplo descreve a entrega dos cassetes de 25 expressão descrito para protoplastos de tabaco (ver Figuras 42-45). I. ISOLAMENTO DE DERIVADOS mesofilo- protoplastos de transmissão de genes DIRETO A. Digestão de culturas in vitro em Shoot to Yield derivados de mesofilo com solução enzimática de protoplastos 1,0% (p / v) 30 celulase "Onozuka" R10 e 1,0% (w 1 v) Macerozyme ® R10 dissolvidos em meio K4 [K3 meio com 0,4 M de sacarose, em vez de 0,3 M]. Spin down (Filho 1 centrífuga, SS rotor 34;. A 7.000 rpm por 10 min), a fim de peletizar contaminação de amido das preparações enzimáticas. Ajustar o pH 5,6 com KOH e filtersterilize (0,2 tamanho dos poros mm). Conservar a 4cc por não mais de 3-4 semanas. 5 Materiais • frascos de cultura de 400 ml contendo meio MS solidificado com culturas atirar de Nicotiana tabacum • 90 x 20 mm estéreis placas de Petri • Fórceps la • Bisturi • lâminas de bisturi estéril; # 11 ou # 22 Soluções • A solução enzimática; uma celulase% e 1% Macerozyme dissolvido em K4 médio 15 • Água estéril Procedimento

1. Estéril em 90 x 20 milímetros pratos Petri, um volume de decantar solução enzimática suficiente para cobrir generosamente placa base; 15 ml deve ser suficiente. 20 2. Transferência 2-4 saudável, folhas completamente expandidas de uma cultura de 4-6 semanas de idade atirar para um vazio 90 X 20 milímetros placa de Petri.

3. Com o lado abaxial para cima, remova cuidadosamente a costela meados de uma folha, assegurando uma lâmina 25 afiada, estéril é usada para minimizar a ruptura do tecido circundante da folha.

Repita para os restantes três folhas. Lidar com pequenas quantidades de material foliar (máximo 4) a qualquer momento para minimizar o efeito de dessecação de fluxo laminar. 30 4. Suavemente pilha metades da folha e, com uma lâmina afiada, estéril, cortar em tiras de 1-2 mm.

5. Transferir cuidadosamente segmentos folha em uma solução enzimática Placa de Petri contendo (Abaxial voltada para baixo). Seal prato com Parafilm ® e incubar durante a noite por 16-18 horas a 25 ° C no escuro, sem agitação. 5 B. Isolamento de Materiais mesofilo derivados Protoplastos • pipetas estéreis 5 ml • pipetas estéreis 10m1 • Pipetas macho lo • A unidade de filtração esterilizado de protoplastos: 100 mm em aço inoxidável peneira de malha descansando em um copo de vidro de 100 ml • Estéril 14 ml de fundo redondo de plástico tubos de centrífuga 15 • Clements Orbital 500 centrífuga de bancada • Banho de água Meios • 90 x 20 mm es Petri estéreis prato / contendo folhas de digerir de Nicofiana tabacum 20 • solidificados 1: 1 mistura de K3: medium H contendo Plaque Sea 0,6% agarose Solutions TM • Solução W5 autoclavado • Solução K3 autoclavado Procedimento 25 6. Agite suavemente a digerir durante a noite para liberação de protoplastos para a solução enzimática. Agitação deve ser suave, mas completo, e realizado em um lado-a-lado (horizontal) de movimento.

7. Placa ângulo ligeiramente para auxiliar a 30 transferência de digerir suspensão (solução enzimática e restos vegetais). Usando uma pipeta de 10 ml estéril, transferir a suspensão digere a uma unidade de filtração esterilizado de protoplastos de suspensão de protoplastos separada de resíduos vegetais.

8. Toque suavemente unidade de filtração para liberar o excesso de líquido preso em peneira. 5 9. Misture delicadamente a suspensão de protoplastos e distribuir em 14 ml estéril de plástico tubos de fundo redondo de centrifugação, enchendo a aproximadamente 8 ml (ml no máximo 9).

10. Redistribuir suspensão para obter uma distribuição uniforme de volumes (máx. 9 ml). 10 11. Cuidadosamente cada suspensão de sobreposição com 1,5 ml W5 solução. Para ajudar dispensa W5 solução, suspensão lugar cheio de tubo em um ângulo e permitir que a ponteira a tocar a superfície de parede perto de abertura da tuba antes de baixar lentamente a apenas acima 1s da superfície da suspensão. Lentamente dispensar W5 solução, adicionando gota a gota, garantindo para manter ponta da pipeta mais próximo à superfície suspensão possível. Agitação mínima de suspensão de protoplastos e, assim, a mistura com W5 solução resultará, se feita correctamente.

12. Recolocá tampas e tubos de centrífuga por 5 20 minutos a 70g (Clements Orbital centrífuga de bancada 500, swing-out rotor, 400 rpm). Protoplastos irá flutuar na interfase.

13. Mantendo-cheia de protoplastos tubo na posição vertical, cuidadosamente inferior uma pipeta estéril 5 ml a um ponto logo acima da camada de protoplastos e recolher os protoplastos na interfase, tendo o 25 mínimo possível da fase inferior. W5 solução serão coletados simultaneamente.

14.Coleta e transferência de protoplastos para um novo tubo de centrífuga 14 ml. Ao completar coleção de protoplastos, misture delicadamente a suspensão de protoplastos cuidado pipetando para cima e para baixo. 30 15. Determine o rendimento de protoplastos, removendo uma alíquota de 100 ml da suspensão de protoplastos e transferir

-, 41/74 para um tubo contendo 900 mL de solução W5. Contar os protoplastos em um hemocitómetro e determinar o número de protoplastos por ml.

16. Calcular o volume total necessário para obter cerca de 1 X 106 (máximo de 1,5 x 105) protoplastos por ml. Distribuir 5 suspensão de protoplastos em novos tubos de 14 ml de fundo redondo de centrífuga, garantindo volumes iguais são obtidos.

17. Usando uma pipeta de 10 ml, encha cada tubo contendo protoplastos com W5 solução até um volume total de 10 ml. Minimizar os inconvenientes para os protoplastos, spray solução W5 ao longo lo da parede do tubo durante o enchimento.

18. Substituir tampas e ressuspender o protoplastos invertendo suavemente o tubo tampado uma vez.

19. Peletizar os protoplastos [spin-7Og (Clements Orbital centrífuga de bancada 500, 400 rpm) por 5 min.] Antes de remover toda 15 a solução W5, deixando a suspensão de protoplastos puro.

20. Ressuspender suspensões de protoplastos agitando.

21. Encher cada protoplastos contendo tubo para um volume total de 5 ml com W5 solução e incubar à temperatura ambiente 20 durante um mínimo de uma hora e um máximo de 4.

22. Durante o tempo de incubação 1-4 horas, organize os seguintes componentes na preparação para a transferência de genes direta para protoplastos isolados: • Remova solução PEG 40% de armazenamento de 25 -20 OC e armazenar em temperatura ambiente. 30 minutos antes de prosseguir com a transferência direta de genes, a solução de PEG incubar num copo de água quente. • Derreta solidificou K3: H médio em microondas. Uma vez completamente derretido, coloque em um 40 ° C em banho-maria até 30 que esteja pronto para uso. li. TRANSFERÊNCIA DE GENE DIRETO PARA

USAR protoplastos POLIETILENO GLICOL DNA transformando DNA plasmideo é esterilizado por precipitação e lavagem em 100% (v 1 v) de etanol e secos em uma capela de fluxo laminar 5 [precipitação de DNA plasmidial em etanol 70% também é possível, mas o DNA pellet vai demorar mais tempo para secar]. DNA pellet é ressuspenso em 30 mL de água bidestilada estéril na concentração final de 0,7 mcg 1 mL para as transformações transitória.

A estrutura física do DNA deve ser superenrolado lo para transitória e linearizada do lado de fora do gene de interesse - para transformações estáveis.

Adição de DNA transportadora (por exemplo, peixes esperma-DNA) ao DNA transformando plasmídeo geralmente dá freqüências transformação melhor estável.

Para transformações estáveis 10 microgramas de DNA plasmídeo linearizado e 40 mcg de sheared DNA do esperma de peixe 15 são co-precipitado, conforme indicado acima, seco e dissolvido em 30 mL de água bidestilada estéril.

Tampão de transformação 15 mM MgCl2, 0,1% (p 1 v) morpholinoethanesulphonic ácido (MES) e 0,5 M manitol.

Após a dissolução 20 em água destilada, ajustar o pH 5,8 com KOH e autoclave.

Guarde-o em 4cc.

Solução PEG 40% (p / v) PEG 4000 em 0,4 M manitol e 0,1 M Ca (NO3) 2 - Dissolva PEG em 0,4 M manitol e 0,1 M Ca (NO3) 2 (a concentração final destas duas componentes será menor devido à volume de PEG). Ajustar o pH 8-9 e autoclave (o pH vai demorar várias horas, por 25 exemplo, durante a noite, para estabilizar nesta solução e cairá para pH 6-7 depois da autoclavagem). Materiais • Estéril 1 pipetas ml • Estéril 5 ml pipetas 30 • 10 pipetas estéreis ml • Pipeta macho

• Estéril 14 ml de fundo redondo de plástico tubos de centrífuga • Clements Orbital 500 centrífuga de bancada • Banho de água • 50 x 10 mm placas de Petri 5 Meios • 14 ml de fundo redondo de tubos de centrífuga contendo suspensão de protoplastos isolados, peletizadas • solidificados 1: 1 mistura de K3: medium H contendo Plaque Sea 0,6% agarose TM 10 Soluções • Solução W5 autoclavado • Solução K3 autoclavado • Solução autoclavado H • Solução PEG 40% 15 • Buffer de Transformação • 10 mg DNA Transformando dissolvido em 30 mL de água bidestilada estéril. Procedimento

1. Peletizar os protoplastos [spin-70g (Clements 20 Orbital centrífuga de bancada 500, 400 rpm) por 5 min.] Antes de remover toda a solução W5, deixando a suspensão de protoplastos puro.

2. Usando uma pipeta 1 ml, adicionar (gota a gota) 300 ml (aproximadamente 7 gotas) de tampão de transformação para cada tubo de centrifugação de 14 ml de fundo redondo contendo protoplastos 25 isolados.

3. Cuidadosamente ressuspender pellet batendo base do tubo.

4. Para cada suspensão de protoplastos, adicionar 10 mg (30 L) de DNA transformando antes de adicionar 300 ml 30 (aproximadamente 7 gotas ao usar uma pipeta 1 ml para distribuição) da pré- aquecido solução PEG. Mix de suspensão de protoplastos batendo base de tubo. Intervalo de tempo entre protoplastos ressuspensão em tampão de transformação e da adição de transformar DNA e PEG deve ser mantida a um mínimo. 5 5. Incubar mix de transformação por 15 minutos à temperatura ambiente sem agitação.

6. Usando uma pipeta 10 ml, adicionar gradualmente 10 ml W5 solução para cada tubo em intervalos de: • 1 ml (aproximadamente 12 gotas) gota a gota, a lo cada tubo. Inverter cuidadosamente todos os tubos para misturar. • 1 ml (aproximadamente 12 gotas) gota a gota, a cada tubo. Inverter cuidadosamente todos os tubos para misturar. • 1 ml (aproximadamente 12 gotas) gota a gota, a cada tubo. Inverter cuidadosamente todos os tubos para misturar. 15 • 2 ml como um fluxo suave para cada tubo. Inverter cuidadosamente todos os tubos para misturar. • 2 ml como um fluxo suave para cada tubo. Inverter cuidadosamente todos os tubos para misturar. • 3 ml como um fluxo suave para cada tubo. Inverter 20 cuidadosamente todos os tubos para misturar. Para auxiliar de distribuição, em uma pipeta 10 ml coletar o volume total exigido em cada intervalo para encher cada tubo com o volume necessário de solução W5, antes da dispensa. Repita a cada intervalo.

7. Pellet os protoplastos [spin-70g (Clements Orbital 25 centrífuga de bancada 500, 400 rpm) por 10 min.] Antes de remover toda a solução W5, deixando a suspensão de protoplastos puro. Toque em todas as bases do tubo uma vez antes de prosseguir. Para transformações TRANSIENTES

8. Ressuspender protoplastos sedimento em 30 volumes iguais de K3 médio e médio H até um volume total de 5 ml (2,5 ml de cada solução).

9. Lentamente transferir o K3 liquido: H + de protoplastos de suspensão mix para o centro de uma 50 10 mm x placa de Petri.

10. Selar todos os pratos com Parafilm ® e 5 protoplastos de cultura para 24-72 horas sob luz fraca a 24 ° C, antes de prosseguir com a análise de expressão transitória. Para transformações ESTÁVEIS

11. Continuar com a "Parte Ill. Cultura de mesofilo derivados Protoplastos e Regeneração de Plantas", abaixo. lo III. CULTURA DE DERIVADOS mesofilo- protoplastos e regeneração de plantas Para as etapas 1 e 2, cada tubo contendo protoplastos devem ser manuseados um tubo de cada vez. Materiais 15 • Estéril 1 pipetas ml • Estéril 5 ml pipetas • 10 pipetas estéreis ml • Pipeta macho • Clements Orbital 500 centrífuga de bancada 20 • Banho de água • 50 x 10 mm placas de Petri • espátula de aço inoxidável autoclavada Meios • 14 ml de fundo redondo de tubos de centrifuga contendo suspensão de protoplastos isolados, peletizadas 25 • solidificados 1: 1 mistura de K3: medium H contendo Plaque Sea 0,6% agarose TM; 40 OC • Solução K3 autoclavada • 250 ml frasco de cultura contendo 20 ml meio • 12 poços Costar ® placas contendo meio MS 30 solidificado Morpho • 250 ml vasos de cultura contendo meio MS solidificado Morpho • 250 ml vasos de cultura contendo meio MS solidificado Procedimento 5 1. Adicionar 0,5 ml perto médio K3 para o pellet de protoplastos para ressuspender as protoplastos.

2. Lentamente transferir o K3 + de protoplastos de suspensão mix para o centro de uma 50 10 mm x placa de Petri.

3. Repita as etapas 1 e 2 para todos os tubos lo contendo protoplastos antes de prosseguir.

4. Adicionar 5 ml pré-aquecido 1: 1 mistura de K3: medium H contendo Plaque Sea 0,6% agarose TM placa um de cada vez. Em um movimento rotativo suave, agitar prato apenas uma vez para distribuir uniformemente a suspensão de protoplastos em meio. Repita o procedimento 15 para todas as placas.

5. Deixar as placas em pé, intacta, até meio tem solidificado (10-30 minutos, dependendo da temperatura ambiente).

6. Selar todos os pratos com Parafilm ® e protoplastos cultura por 24 h em completa escuridão a 24 ° C, seguido por seis 20 dias sob luz fraca contínua (5 mmol nrr2 s1, Osram L36 W/21 tubos LUMILUX branco), onde primeiras divisões celulares e múltiplas ocorrer.

7. Usando uma espátula estéril, dividir o mar de protoplastos contendo plugues da placa de agarose em quadrantes e coloque em 250 ml vasos cultura de plástico contendo 20 ml de um meio suplementado 25 com antibiótico adequado (1 quadrante por 250 ml de navios). Incubar em um agitador rotativo a 80 rpm e 1,25 cm jogar em 240C com pouca luz contínua.

8. Substituir o líquido A média + antibiótico adequado a cada 2 semanas, acompanhamento do crescimento de protoplastos derivados de colônias. 30 9. Quando protoplastos derivados de colônias são aproximadamente 2-3 mm de diâmetro (5-6 semanas de incubação em meio de um líquido), transferência de colônias em poços individuais de um Costar 24 poços ® placa contendo meio MS solidificado Morpho.

10. Incubar placa 1 s por 1-2 semanas a 24 ° C sob luz fraca contínua (5 mmol m 2 s ~ — 1, Osram L36 W/21 tubos LUMILUX 5 branco), onde proliferam calos e chegar a um tamanho de 8-10 mm de diâmetro.

11. Quando protoplastos derivados de calos são aproximadamente 1-2 cm de diâmetro, a transferência de calos para cada 250 ml vasos de cultura contendo meio MS solidificado Morpho. Incubar 10 embarcações a 24 ° C com menos de 16 horas de luz 1 8 horas escuro (20 mmol m — 2 s, Osram L36 W121 tubos LUMILUX branco). Dentro de 1-2 semanas, atira múltiplos devem ser visíveis.

12. Transferência de brotos de comprimentos de 3-4 cm para 250 embarcações ml de cultura contendo meio MS solidificado para 15 incentivar a formação de raízes. Incubar embarcações a 24 ° C com menos de 16 horas de luz 1 8 horas escuro Ç'20 mmol rrr2 S 1, Osram L36 W/21 tubos LUMILUX branco). Dentro de 3 semanas, sinais de formação de raiz deve ser visível.

13. Plântulas com um sistema radicular estabelecido 20 deve ser mantida como em culturas de plantas in vitro como fontes de protoplastos do mesófilo de Tabaco. Exemplo 7 - Avaliação da viabilidade de protoplastos TABACO USANDO EVANS mancha azul Ver figuras 46 e 47. 25 INFORMAÇÃO GERAL • Evans mancha azul (EVB;. B.e '-P.S'-dimethylifi i'- biphenylH ^ '-diyObisCazoJbisp-amino-5-hidroxi-1 ,3-naphthalenedisulfonic ácido] tetrasodium sal). • Corante não-fluorescente. 30 • Método de ação: As células vivas mantêm a capacidade de excluir azul de Evans na membrana plasmática e continuam a sua cor natural. Células danificadas por estresse osmótico sal ou são incapazes de excluir azul de Evans, estão manchadas azul profundo, e são facilmente distinguíveis ao exame microscópico. • Método de preparação: 400 mg 1 I solução-mãe 5 (solvente: 0,65 M manitol) • Método de coloração: azul Evans solução estoque foi adicionado a igual volume de suspensão de protoplastos, delicadamente misturadas e incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos antes da visualização microscópica. lo • Método de detecção: Leica MZFL Luz Ill Dissecting Microscópio. Exemplo 8 - Análise de expressão gênica IN protoplastos Nicotiana tabacum Objetivo da experiência: A expressão do genes 15 clonados AtRbcS::1-SST-SACB e AtRbcS:: SPOR-SACB em protoplastos de tabaco transfectadas foi testada usando RT-PCR Materiais e métodos: 3 placas de protoplastos chamado i) Transfectados protoplastos (amostra 9A): AtRbcS: 20 :1-SST-SAC B ii) protoplastos Transfectados (amostra 12A): AtRbcS:: SPOR-SACB iii) protoplastos Untransfected Etapas envolvidas na análise de expressão: 25 1. Desenho de primers e otimização da PCR

2. Isolamento de RNA total de

3. Reação RT

4. qRT-PCR Desenho de primers PCR e identidade de produtos: 30 pares de primers foram desenhados para amplificar o gene de interesse usando software farol design (Biosoft Premier International) e as sequências de genes disponível no banco de genes.

Os primers gene específico foram escolhidos de modo que o tamanho do produto, resultando PCR variou de 200 a 250 pb.

Os produtos de PCR foram identificados pela análise da curva de derreter e tamanho baseados em eletroforese em gel. 5 Isolamento de RNA total: RNA total foi isolado por SV sistema de isolamento total por PROMEGA RNA a partir de 1 * 106 protoplastos por tratamento. http:/1www.promega.comltbsltm048/tm048.pdf Rendimento de RNA total: Reação reversa Transcriptase 10 RT reação foi realizada por meio QIAGEN RT kit.

Quatro reações foram realizadas RT (9, 12, e controle do tabaco WT RNA) utilizando a mistura de iniciadores (QIAGEN). http:/1wwwl .giaqen.com/products/per/QuantiTectPcr Svstems/QuantiTectRevTranscripti onKit.aspx # Tabs = t2 15 A replicar de cada uma das amostras acima foi submetido a RT reação usando gene de primers específicos.

Especificamente, 9A e 12A amostras foram transcritas usando o primer SACB inversa, eo controle (untransfected) amostra com o primer 18S inversa.

PCR - Reações foram constituídas da seguinte 20 forma: 2x GoTaq ® Green MasterMix (Promega) 10 mL modelo de cDNA 2,0 cartilha Encaminhar mL (10 mM) 0,5 mL de primer reverso (10 mM) 0,5 mL Água livre de nuclease 7,0 mL 25 As reações foram pedalada: Passo i: 95 min 2 OC Passo 2: 95 OC 30 sec Passo 3: 55 OC 30 seg Passo 4: 72 OC 60 seg 25 ciclos a partir da Etapa 2 (18S) ou 35 ciclos a 30 partir da Etapa 2 (SACs) Passo 5: 4 segurar OC

Produtos da reação foram visualizados sob luz UV após eletroforese através de 1% (w 1 v) de agarose em tampão TBE lx, coloração com SYBR (50 pl_ / L). Detecção da transcrição SACB foi mostrado em 5 ambas as amostras de protoplastos transfectadas cDNA (9 e 12), enquanto que o método utilizado foi validado pela amplificação do 18S a partir da amostra de protoplastos untransfected cDNA (Figura 50). Expressão de genes quiméricos SACB sob o controle de luz promotores regulados foi observada em protoplastos 10 transfectadas, Nenhum produto foi observado para não-RT controles e nenhum controle Template. SACB expressão do gene pode ser detectado em protoplastos transfectadas com vetores usados em amostras 9A e 12A. Exemplo 9 - Agrobacterium tumefaciens-MED 1

TRANSFORMAÇÃO DISC ATED FOLHA DE TABACO 15 Este exemplo descreve a transformação estável de discos de folhas de tabaco usando Agrobacterium vetores binários carregando projetado com os cassetes de expressão hereinbefore descrito (ver Figuras 48 e 49).

INTRODUÇÃO 20 Utilizando transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens em disco foliar é um método eficiente de produção de plantas transgênicas. A. tumefaciens é um patógeno naturais dicotiledõnea que contém a maquinaria genética para infectar a planta e incorporar o DNA bacteriano no genoma vegetal. Como resultado dessa capacidade, A. 25 tumefaciens pode ser adotado como um veículo de clonagem para incorporar DNA de interesse específico para o tabaco, por exemplo. O método pode ser usado para gerar um sistema modelo no tabaco, para avaliar a função dos clones de cDNA heterólogo para o gene de interesse. 30 Materiais e produtos químicos Equipamentos e instrumentos

Capa de fluxo laminar com fluxo horizontal (série HWS180, CLYDE-APAC, uma divisão da Evans Deakin Pty.

Ltd., Woodville do Norte, Austrália do Sul 5012, Austrália), rotativo shaker (Infors tipo RC-406, Infors AG, CH-4103 Bottmingen , Suíça), centrífuga de bancada com rotor 5 swing-out (Clements Orbital 500), fórceps (bend, gato não. 2108/160, Crown Científico, Rowville, Victoria 3178, Austrália), bisturi puxadores (n ° 3, o gato não.

SHN3, Crown Científico, Rowville Victoria 3178, Austrália) com lâminas de bisturi cirúrgico estéril (tamanho 11, sem gato. 1838, Laboratório de Abastecimento Pty.

Ltd., Milperra DC, New South Wales 1891, Austrália) foram 10 usados.

Soluções estoque Os elementos macro-, micro-elementos e vitaminas necessários para todos os meios de cultura devem ser preparados como estoques concentrados (macro-elementos estoque: 10 vezes concentrada; 15 micro-elementos e ações vitaminas: 100 vezes concentrado) para ajudar na sua adição.

Todas as ações, exceto que contém os elementos micro-são preparados à temperatura ambiente.

Preparação do material micro-elementos requer o aquecimento de componentes antes da mistura.

Na2-EDTA e FeSO4 x 7 H2O deve ser dissolvido em cada 400 mL de água destilada (para um 20 volume total de 1000 mL) antes da mixagem.

Mix de soluções dissolvido e calor em ca. 600C até que a solução se transforma na cor amarela.

Deixar arrefecer antes de acrescentar componentes restantes.

Fazer a solução até 1000 mL com água destilada.

Armazenar todo o estoque a 4 ° C.

Dissolver hormônios [2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e cinetina] em 1 M KOH e diluir com 25 água destilada para preparar 100 mg / litro ações concentradas.

Meios de Cultura A composição dos meios de comunicação utilizados nas concentrações finais de seus componentes individuais é dada no Apêndice 1: MS micro, macro MS, vitaminas B5, Lauria Bertani mídia, lavagem de mídia, 30 media PC, SEL mídia, media RM e SEM mídia.

Produtos químicos

2,4-D: ácido 2,4-diclorofenoxiacético, carvão ativado, Timentin (pode ser substituído por cefotaxima em concentrações iguais), BAP (6-benzilaminopurina), zeatina, AgNO3, Rifampicina, Agar (Difco, Bacto Agar- cat, . não: 0140-01) é usado como agente gelificante. Outros produtos químicos 5 (PEG 4000, Tween 80, KOH, NH4OH, NaCI, KCI, Ca (NO3) 2, MgCl2 e CaCl2) foram adquiridos da BDH; MES (2 - [N -morfolino] ácido ethanesulfuric) da Sigma (Cat. Não . N-8250), sulfato de canamicina foram da Sigma; higromicina B foi comprado de Calbiochem; Ca (OCI) 2 (-65%) e fosfinotricina eram de Roth e de Riedel Haen, respectivamente. Sacarose foi comprado de Fluka (cat. n °: 10 84.100). Parafilm ® "M" (American National Can TM, Greenwich, CT 06836, EUA) foi usado como fita de vedação. Frascos de filtros descartáveis estéreis (0,2 m vacucap 90; gato não 4622, Gelman Sciences ® Pty. Ltd., Cheltenham, Victoria 3192, Austrália..) E descartáveis unidades de filtro (0,2 mm;.. Cat não 16534, Sartorius AG, 37070 Gottingen, Alemanha) foram usados para filtro- 15 esterilização. Estéril pipetas descartáveis: 1 ml_ (.. TRP Q, gato não 94.001) 5 ml_ (.. TRP ®; gato não 94.005) e 10 ml_ (TRP ®; gato não 94.010..), Todos da Life Technologies Pty. Ltd. , Mulgrave, 3170 na Austrália, estéril de plástico tubos de centrífuga com tampa de rosca (14 mL, TRP 0; gato no.91016, Life Technologies Pty. Ltd., Mulgrave, 3170 na Austrália.); pratos de plástico estéril 20 petri (90 x 14 mm; gato . 82.9923.484 não, e 60 x 14 mm, o gato não

83.1801.011, Sarstedt ® Australia Pty. Ltd., Technology Park, South Australia 5095, na Austrália e 90 x 20 mm;..... cat não 664.160, Greiner Labortechnik GmbH, 72636 Frickenhausen, Alemanha);.. e vasos cultura autoclavável (250 mL, gato não 75.9922.519, Sarstedt Australia Pty. Ltd, Technology Park, South 25 Australia 5095, Austrália) foram utilizados. Material vegetal A) estéril culturas atirar de N. tabacum cv. Petit Havana SRI pode ser utilizado. Eles são estabelecidos a partir de sementes correspondente superfície esterilizados em solução de hipoclorito [1,4% (w 1 v) 30 Ca (OCI) 2, 0,05% (v 1 v) Tween 80] por 15 min. E, depois de lavagens 3-4 em destilada estéril água, banhados para a germinação de metade da força-MS médio (Apêndice 1) solidificado com 0,8% (w 1 v) de ágar. Tiros com 2-3 folhas são cortadas e cultivadas em 250 embarcações cultura ml_ em 0,8% (w / v) de ágar solidificado meio MS a 25 ° C em 16h 1 d luz (20 mmol m'2 s ~ \ Osram L36 W 1 21 LUMILUX tubos brancos). Brotos enraizados são repicadas em 5 intervalos de 6 semanas, como estacas, várias vezes antes de usar. B) Glasshouse tobacum N. crescido também pode ser utilizado, mas requer a esterilização da superfície da folha, conforme descrito abaixo [I. B)]. Plantar sementes no solo estéril assegurando que eles não são plantadas muito profundamente e que permaneçam úmidos. Crescer lo sob 16h 1 d luz (20 umol m "2 s" 1, Osram L36 W/21 tubos LUMILUX branco) condições de 25 ° C, a fertilização com Osmocote fertilizante de liberação lenta. C) A cepa de Agrobacterium tumefaciens utilizada para transformações folha disco é AGL1. 15 I. Elaboração de Agrobacterium tumefac 1 ens de Transformação de discos de folhas de tabaco com o vetor pS 11 ihph200 Início da cultura pré-tumefaciens transformado Agrobacterium estirpe AGL1 dois dias antes da data de transformação do tabaco garantir condições estéreis são mantidas, (ver apêndice 2 para o cartão 20 de identificação para pBinhph200)

1. Arranhar a superfície do estoque de glicerol-700C congelados bacteriana com um loop de inoculação e inocular 2 ml_ de LB (contendo 20 mg 1 mL rifampicina, além de 10 mg 1 L espectinomicina) em um tubo estéril. Incubar por 24 horas a 28 ° C em 150rpm. 25 2. Inocular 4 mL de LB acrescido de antibióticos (em um tubo de 12 mL estéril) com 0,25 mL da 24 horas de pré-cultura. Incubar por 6-7 horas a 28 0 C.

3. LB inocular 25 ml sem antibióticos (em um frasco estéril ml_ 150) com 0.025m1 de 6-7 cultura pré-hora e incubar durante a 28 3o rpme150°C.

4. Adicionar 25mí de LB para a noite 25mí pré-

cultura e continuar a crescer a 280C por mais 90 minutos a 150 rpm.

5. Transferência de 50m1 cultura pré-para tubos de centrífuga e girar por 12 minutos a 2.000 rpm à temperatura ambiente em uma centrífuga de bancada Clements. 5 6. Remover o sobrenadante e gentilmente ressuspender o sedimento em 20 mL de WM. Medida 0D600-Adicionar WM ainda mais a suspensão bacteriana para fornecer uma OD60o final de 0,45. Esta preparação é para uso na etapa 111) 1. li. Preparação dos discos de folha 10 A) Preparação dos discos de folha utilizando culturas de tabaco tiro

1. Em um fluxo laminar, a colheita 4-6 folhas de plantas de tabaco cultivadas em meio MS. Coloque as folhas em 1,5 x 9 centímetros pratos de petri contendo WM. Usando um bisturi, remove o mid-rib 15 e cortar o tecido foliar em quadrados ~ lcm2. Os discos de tecido ou folha está agora pronto para a transformação com Agrobacterium tumefaciens (AGL1). Os discos devem ser transformados em uma hora. B) Preparação dos discos de folha com não-tecido estéril do Tabaco 20 1. Colheita 4 folhas jovens (~ 8 centímetros de comprimento) de uma planta de tabaco estufa cresceu.

2. Coloque as folhas em um copo estéril contendo etanol 70%, cubra com papel alumínio e agite bem em um agitador orbital (Bio- Line Shaker Orbital, Instrumento Edwards Empresa) por 1 minuto. 25 3. Remover o etanol 70% e substituir com 1% Ca (OCI) 2. Tecido redemoinho por 8 minutos. Lave as folhas em água estéril pelo menos 3 vezes.

4. Em um fluxo laminar, retire a nervura central e cortar o tecido foliar remanescente em quadrados ~ lcm2. Coloque o 30 preparado em discos de 1,5 9 cm x placa de petri contendo WM. Os discos estão agora prontos para transformação com Agrobacterium tumefaciens

(AGLI). III. Incubação e Co-cultivo de discos de folha com Agrobacterium tumefaciens

1. Substituir WM (do último passo na preparação do 5 disco folha) com a cultura Agrobacterium e incubar durante 1-2 minutos.

2. Anular a suspensão bacteriana e enxaguar explantes brevemente com WM. Blot explantes em guardanapos estéril antes do plaqueamento em meios PC. Lugar na sala de crescimento (16h I d luz (20 mmol m "2 s \ Osram L36 W/21 LUMILUX branco tubos) condições de 25 ° C) lo por 3 dias co-cultivo. IV. Pré-regeneração de discos de folhas Após Agrobacterium-med'iated Transformação

1. Explantes de transferência (5/plate) para SEL mídia e voltar para sala de crescimento por mais 7 dias. 15 V. Regeneração

1. Explantes de transferência (5/plate) para RM e retornar à sala de crescimento. Formação de brotos deve ocorrer dentro de 3-6 semanas. Transferência de explantes para RM fresco depois de 4 semanas.

2. Se calos se torna muito grande, e particularmente 20 se não todos os tiros estão em contato com a mídia, divide calos utilizando um bisturi. Expor como muitos dos brotos à seleção possível. VI. Atire Alongamento e Desenvolvimento Root

1. Após oito semanas na seleção, ou quando os explantes controle untransformed na seleção estão mortos, a transferência de 25 rebentos verdes (5/plate) para SEM media (incluem IBA (1 mg / L)) em 9 x 2 centímetros pratos de petri. Raízes deve aparecer em 4-5 semanas. VII. Desenvolvimento de plântulas in vitro

1. Quando as raízes aparecem, a transferência de plântulas enraizado SEM media em vasos de cultura de tecidos. 30 Referências Caimi PG, McCole LM, Klein TM, Hershey HP. 1997.

Cytosolic expression of the Bacillus amyloliquefaciens SacB protein inhibits tissue development in transgenic tobacco and potato. New Phytologist 136, 19- 28 Caimi PG, McCole LM, Klein TM, Kerr PS. 1996. 5 Fructan accumulation and sucrose metabolism in transgenic maize endosperm expressing a Bacillus amyloliquefaciens sacB gene. Plant Physiology 110, 355- 363 Cairns AJ. Fructan biosynthesis in transgenic plants.

2003. J Expt Biol 54: 549-67 10 Clough, S. J. and Bent, A. F., 1998. Floral dip: a simplified method for Agrobactehum-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 16: 735-743. Ebskamp MJM, van der Meer IM, Spronk BA, Weisbeek PJ, Smeekens SCM. 1994. Accumulation of fructose polymers in 15 transgenic tobacco. BiolTechnology 12, 272-275 Hattori T, Nakagawa T, Maeshima M, Nakamura K, Asahi T (1985) Molecular cloning and nucleotide sequence of cDNA for sporamin, the major soluble protein of sweet potato tuberous roots. Plant Mol Biol 5: 313-320 20 Klimyuk, V. I., Carroll, B. J. Thomas, C. M. and Jones, J. D. (1993) The Plant Journal 3(3):493-494 Sasanuma, T. (2001). Characterization of the rbcS multigene family in wheat: subfamily classification, determination of chromosomal location and evolutionary analysis. Mol Genetics Genomics 25 265(1): 161-171. Ye XD, Wu XL, Zhao H, Frehner M, Noesberger J, Potrykus I, Spangenberg G. 2001. Altered fructan accumulation in transgenic Lolium multiflorum plants expressing a Bacillus subtilis sacB gene. Plant Cell Reports 20, 205-212 Zeng, W. K., et al. (1995). PCR Amplification and 30 Sequencing of a Wheat rbcS Gene Promoter. Acta Bot Sinica 37, 496-500.

APÊNDICES

Apêndice 1: Soluções de Valores e Midia MS Media 1 Litro MS pó 4,74 g 3% de sacarose 30 g 5 CIH2O Até 1 L Ajustar o pH a 5,8-6,0 com NaOH 1M Autoclave MS Macro (10 x) 1 Litro 2 Litros lo NH4NO3 16,5 g 33.0 g

19.0 g KN 03 38.0 g CaCl2 x 2 H2O 4,4 g 8,8 g MgSO4 x 7 H2O 3,7 g 7,4 g KH2PO4 1,7 g 3,4 g MS Micro (100 x) 15 1 Litro 2 Litros KI 0,083 g 0,166 g H3B03 0,62 g 1,24 g MnSO4 x H2O 1,69 g 3,38 g ZnSO4 x 7 H2O 0,86 g 1,72 g Na2MoO4 x 2 H2O 0,025 g 0,05 g 0,005 g CuSO4x5H2O 0,0025 g 20 COCl2 x 6 H2O 0,0025 g 0,005 g Na2-EDTA 3,73 g 7,46 g FeSO4 x 7 H2O 2,78 g 5,56 g Dissolver Na2-EDTA e FeSO4 x 7 H2O em 400 ml ddH2O, respectivamente, misture e calor (não ferver). Deixe esfriar e adicione os outros sais Micro no volume restante. 25 As vitaminas MS (100 x) 1 Litro 2 Litros Inositol 10g 20 ácido nicotínico g 0,05 g 0,1 g de piridoxina HCI 0,05 g 0,1 g de tiamina 0,01 g 0,02 g Glicina 0,2 g 0,4 g Vitaminas B5 (100 x) 30 1 Litro 2 Litros Inositol 10g 20 ácido nicotínico g 0,1 g 0,2 g de piridoxina HCI 0,1 g 0,2 g 1,0 g Tiamina 2.0 g Mídia RM: Regeneração media estoque / 1 litro MS Macro 10x 100 ml MS Micro 100 x 10 m! 5 Vitaminas B5 100 x 10 ml MES 500 mg de sacarose 30 g Ajustar o pH 5,80 com KOH (1 M)

8.0 g Agar Autoclave Quando esfriar acrescentar: stock / 1 litro 10 BAP 2 mg / ml 2 ml Zeatina 1 mg 1 ml 2 ml AgNO3 5 mg 1 ml 1 ml Timentin 250 mg 1 ml 1 ml Higromicina 25 mg 1 ml 0,4 mi 15 Para preparar BAP e zeatina pesar pó em um recipiente pequeno e começar a dissolver com 0,5 ml -1 de 1 M KOH. Transferir a solução para ddH26 e encher-se ao volume final. SEL media: media de seleção ações 1 litro 20 MS Macro 10 x 100 ml MS Micro 100 x 10 ml B5 Vitaminas 100 x 10 ml MES 500 mg de sacarose 30 g Ajustar o pH 5,80 com KOH (1M)

8.0 g Agar Autoclave Quando esfriar acrescentar: stock 1 litro 25 2,4-D 1 mg / ml 1 ml Timentin 250 mg / ml 1 ml Higromicina 25 mg 1 ml - 0 ml 0,4 Para preparar 2,4-D pesar o pó em um recipiente pequeno e começar a dissolver com 0,5 - 1 ml de 1 M KOH. Transferir a 30 solução para ddH2O e encher-se ao volume final. SEM Mídia ações 1 litro MS Macro 10 x 50m1 MS Micro 100 x 5 vitaminas B5 ml 100 x 5 ml MES 500 1Og Sacarose mg Ajustar o pH 5,8 com KOH (1 M) 5 8.0 g Agar Carvão ativado 0,5 g Autoclave Quando esfriar acrescentar: stock 1 litro Timentin 250mg/ml 1 ml WM médio: media lavar ações 1 litro MS Macro 10 x 100m1 MS Micro 100X vitaminas B5 100 x 10m1 10 ml MES 500 mg de sacarose 30 g Ajustar o pH 5,8 com KOH (1 M) Autoclave Exemplo 10 TRANSFORMAÇÃO DE ARABIDPOSIS ESTÁVEL USANDO Agrobacterium tumefaciens TRANSPORTE vetores binários projetado com os cassetes de expressão MESMA VIA DO MÉTODO "DIP FLORAL". Preparação de Electrocompetent Células Agrobacterium tumefaciens Procedimento Experimental

1. Expelido Agrobacterium tumefaciens (estirpe AGL1) de um estoque de glicerol frozen-800C em ágar MGL contendo 20 mg 1 L rifampicina e 100 mg 1 L ampicilina, e incubar a 27 ° C por dois dias.

2. Medida 5 MGL ml em um tubo Falcon 50 ml e adicionar rifampicina para uma concentração final de 20 mg 1 L e ampicilina 100 mg / L. Inocular com uma única colõnia de Agrobacterium tumefaciens AGL1.

3. Incubar a 27 ° C por 24 h em um agitador orbital a 150 rpm em um rack inclinado (cerca de 30 graus).

4. Inocular no final da tarde 100 ml MGL contendo

20 mg 1 L rifampicina e 100 mg 1 L amplicillin (em um balão de 500 ml) com a 500 mL de uma cultura durante a noite.

5. Incubar a 27 ° C durante a noite em um agitador orbital a 150 rpm, até uma leitura OD600 entre 0,4-0,6 (máx. 0,6) é obtido. Veja 5 comentários abaixo se houve super-crescimento.

6. Transferência de células para um tubo de centrífuga JA10 autoclavado e frio no gelo durante 10 min.

7. Centrifugar por 10 min, 9000 rpm, a 40C usando o rotor JA10. 10 8. Elimine o sobrenadante cuidadosamente (pellet não é muito estável), derramando para o balão de 500 ml usado para a cultura.

9. Adicionar 20 ml de gelo frio glicerol 10% para o pellet no tubo de ensaio JA10 e pellet ressuspender em vortex.

10. Despeje a suspensão para um tubo de centrífuga 15 JA20 e girar por 10 min, 10.000 rpm, a 4 ° C usando o rotor JA20.

11. Elimine o sobrenadante por verter para o frasco de 500 ml.

12. Adicionar 15 ml de glicerol gelo frio de 10% ao sedimento e ressuspender por pipetagem. Centrifugar por 10 min, 10000 rpm, 20 a 4° C no rotor JA20.

13. Repita os passos 11 e 12 duas vezes.

14. Ressuspender o sedimento em 1 ml de glicerol 10% gelado (pipeta ou vortex) e transferir para um tubo de microcentrífuga estéril. 25 15. Rodada por 3 min, 13.000 rpm, a 40C em microcentrífuga.

16. Finalmente ressuspender sedimento em 1 ml de glicerol 10% de gelo frio.

17. Alíquota de 50 mL em lotes rotulados 1,7 ml 30 microtubos, snap congelamento em nitrogênio líquido.

18. Remova os tubos de nitrogênio líquido e armazenamento de células-800C competente. Comentários Use luvas de látex, enquanto A. tumefaciens manipulação de culturas bacterianas. Coletar todos os resíduos de bactérias 5 em 500 ml frasco e autoclave. Se a A. tumefaciens 100 overgrows cultura ml, diluir 1 1 3 - 1 1 4 com o meio MGL fresco contendo 20 mg / L rifampicina, e incubar por mais 1 - 2 h. Transformação de Agrobacterium tumefaciens via Eletroporação 10 Procedimento Experimental 1. Pré-chill Gene pulser titular cubeta no gelo.

2. Remover alíquotas de Agrobacterium competente (AGL1) a partir de células-800C e descongelar no gelo.

3. Ligue a chave principal na parte traseira do 15 pulsador Gene. Ajustar a tensão de 2,5 kV (use o 'levantar a tecla até que apareça '2 .5 'registra no visor), pFD capacitância 25 e 600 0 de resistência.

4. Adicionar 0,1 g de DNA em um volume não inferior a 50 ul de células descongeladas.

5. Mix por pipetagem e transferência da mistura de 20 células / DNA para um pré-refrigerados 0,2 centímetros lacuna Gene Pulser cuvete.

6. Cuidadosamente torneira ou agitar as células para o fundo da cuvete para que as células tocar nos dois eletrodos.

7. Seque a parte externa da cubeta com um lenço de 25 papel e coloque-o no porta-cubeta. Um entalhe na cuvete garante orientação correta. Deslize o suporte cuvete da câmara até que a cuvete está sentado entre os contatos na base da câmara.

8. Pulso as células pressionando ambos os botões vermelho até que um sinal sonoro. A máquina irá mostrar CHG durante o 30 carregamento e soará como descargas. Coloque as células de volta em gelo por 1 min para ajudar a recuperação.

9. Adicionar 1 ml meio LB para as células na tina com uma pipeta de vidro.

10. Misture a suspensão cima e para baixo, em seguida, transferir para um tubo estéril ml 15. 5 11. Incubar a 27 ° C num agitador orbital a 150 rpm por 1 a 2 horas, utilizando um rack inclinada (30 graus ca.).

12. Adicionar 9 ml de LB para a mistura de suspensão de células completamente e placa de 100 I para fora desta cultura em uma placa LB contendo 20 mg 1 L rifampicina eo antibiótico adequado (Por l0 exemplo 100 espectinomicina mg 1 L para pPZP série de vetores). Transferência de 100 ul desta suspensão em um microtubo 1,7 ml contendo 900 mL de caldo LB, misturar bem e placa out 100 I noutra placa LB contendo os antibióticos apropriados. Remova 100 ul da suspensão acima e coloque em um microtubo 1,7 ml fresca e adicionar 900 mL de caldo LB. Misturar bem e 15 placa out 100 1 noutra placa LB contendo os antibióticos apropriados.

13. Seal placas com Parafilm e incubar a 27 ° C por 2 - 3 dias até única grandes colônias tornam-se visíveis. Armazenamento de Agrobacterium Transformado Procedimento Experimental 20 1. Em um tubo de 50 ml estéril inocular uma única colônia em 5 ml de caldo LB contendo 20 mg 1 L antibiótico rifampicina e seleção adequada (ie espectinomicina 100 mg 1 L para PZP série e 50mg / L de canamicina para pBin série). Este é o melhor feito de manhã cedo para que você possa acompanhar de perto o grau de crescimento no dia seguinte. 25 2. Incubar os tubos no escuro a 27 OC por 24 - 36 horas agitando em 250 rpm. Regularmente observar o crescimento da cultura após as primeiras 24 horas de incubação. Remover da incubação, uma vez as células estão crescendo ativamente (altamente visível). O rápido crescimento vai ocorrer logo após os primeiros sinais de turbidez. Tempo de crescimento 30 depende de cepas individuais e transformantes.

3. Cada cultura deve ser verificado para verificar se

AGL1 contém o vetor binário desejado. Isso é feito usando o protocolo estabelecido na seção 5.2.

4. Alíquota de 500 mL da cultura numa cuvete. Medida OD600 leitura, com 500 mL de obturação de caldo LB, contendo os 5 antibióticos apropriados, entre cada leitura.

5. Permitir que as culturas a crescer até que os intervalos de leitura OD600 entre 0,8 a 1,0.

6. Em um tubo estéril 15 ml adicionar 5,0 ml de cultura e 5,0 ml de ações de conservação. Misture bem antes de prosseguir 10 paraaetapa7.

7. Alíquota de 500 mL em plena rotulados cyrotubes estéril. Inverter todos os tubos antes do congelamento em nitrogênio líquido estalo. Conservar a-800C até serem necessárias. Descartar todo o estoque se mostrado ser PCR negativo. 15 PCR Análise de Agrobacterium 1. Adicionar 1 ml de cultura Agrobacterium a 9 mL de H2O estéril MQ em um tubo de PCR estéril.

2. Incubar as células a 98 ° C por 5 minutos. Transferência de tubos para o gelo.

3. Adicionar 10 ml de 2 x preparado PCR master 20 mix. 10 ml de 2 x PCR Master Mix contém o seguinte: 10 x Dynazyme buffer 21 10 mM dNTPs 1,0 mL 10 mM de primer para a frente (1 ONM) 1,0 mL 10 mM de primer reverse (10pM) 1,0 mL 25 Dynazyme II polimeriza 1 ml MQ água 3 mL

4. Incluem um controlo positivo (50 ng do DNA original plasmídeo) e um controle negativo (sem DNA template). Realizar um total de 35 ciclos de PCR utilizando condições padrão 1. 95 ° C por 3 minutos 30 2. 94 ° C por30vê 3. 55 ° C por30vê4.. 72 ° C por 1 min 5. 72 ° C 10 minutos; Repita os passos 2-4, um total de 35 vezes.

5. Analisar o produto da PCR em gel de agarose 1%. • Comentários Usar luvas ao manusear Agrobacterium. Coletar e autoclave todos os resíduos de bactérias e DNA. Cubetas Gene pulser são 5 reutilizáveis: Soak tampas em EtOH 70% e tinas autoclave em um recipiente fechado com água para remover Agrobacterium. Cubetas podem então ser armazenados em EtOH 70% e ser reutilizada após a secagem. Na planta de transformação de Arabidopsis thaliana Procedimento experimental lo Preparação de material vegetal

1. Preencha punnets mudas com semente elevar mistura, para formar um monte. Cubra com duas camadas de anti-pássaro de compensação e seguro com faixas de borracha em cada extremidade. Saturar o solo, sentado punnets em uma bandeja de água. Semear suficiente para 15 obter a 40 plantas por punnet.

2. Vernalise a semente, colocando o punnets a 4° C por 2-3 dias. Punnets transferência para uma câmara de crescimento a 22 ° C sob luz fluorescente (iluminação constante, 55 mmol m'Vl) e alimentar com Miracle-Gro ou Aquasol uma vez por semana. 20 3. Remova os parafusos primário quando eles aparecem e permitir que os parafusos secundário a crescer até cerca de 20-10 cm de altura (isso deve levar cerca de 4-6 dias, as plantas devem ter fechado vários botões florais e siliques alguns). Utilizando uma pinça retire cuidadosamente qualquer siliques ou flores abertas. Plantas aquáticas bem no 25 dia anterior a infiltração de modo que os estornas estarão abertos. Antes de infiltração saturar o solo com água para minimizar a absorção de solução de bactérias no solo.

4. Digite os detalhes em LWS para gerar códigos de barras. Punnets etiqueta com código de barras detalhes LWS. 30 Preparação de Agrobacterium tumefaciens

1. Na parte da manhã inocular 200 ml de mídia LB contendo o antibiótico apropriado de seleção (ou seja, 100 mg 1 ml de espectinomicina para pPZP vector) com uma única de 500 mL de cultura de arranque de Agrobacterium ações de conservação (seção 5.1). Incubar por 24 horas a 27 ° C em agitador orbital a 250 rpm. Uma cultura de 200 ml é 5 suficiente para se infiltrar cerca de 2 punnets de plantas.

2. Centrifugar culturas durante a noite em garrafas de 500 ml em centrífuga 5500g em temperatura ambiente por 15 minutos para as células da pelota. Desprezar o sobrenadante remover o máximo de líquido possível. Ressuspender o sedimento em media de infiltração (ver anexo 1) lo para uma leitura de aproximadamente ODÔOo 0,7-,9 Agroinfiltration

1. Coloque metade da solução de Agrobacterium para um recipiente de 250 ml.

2. Inverter a punnet imersão a planta inteira, 15 incluindo as folhas de roseta na solução bacteriana e agitar suavemente para expulsar bolhas de ar. Co-cultivar as plantas por 2 minutos.

3. Remover o punnet e brevemente de drenagem, no entanto, a fina camada de película em torno das plantas devem ser mantidas. Cobrir as plantas com filme plástico para manter a humidade e retornar para a 20 sala de crescimento longe da luz direta. Autoclave solução para o lixo e descarte em um tambor de resíduos químicos para descarte correto.

4. Repita os passos 1-3 para todos os punnets de A thaliana a ser transformado.

5. Digite os detalhes em LWS para gerar códigos de 25 barras. Punnets etiqueta individual com detalhes de código de barras LWS.

6. No dia seguinte, descobrir as panelas e coloque de volta para a luz direta. Regue as plantas até que as plantas tenham se desenvolvido totalmente siliques. Coleta de sementes 30 1. Depois que as plantas secaram, retire os talos do rolamento silique e colocá-los em um saco de papel e deixar secar por uma

I 66/74 semana a 37 ° C. Sacos de etiquetas com código de barras LWS. Esmagar o siliques secas no saco de papel. Isso vai quebrar o siliques e liberar a semente.

2. Coloque uma peneira 200 mícrons em uma folha de papel A4 e ponta da semente e siliques esmagados dentro dele. Toque 5 suavemente a peneira permitindo que a semente caia na debaixo de papel. Descartar o material vegetal que permanece na peneira. Repita esse processo até que a maioria do material vegetal foi removido (material vegetal nota pode ser uma fonte de contaminação nas etapas subseqüentes). Sementes colocar em um tubo de microcentrífuga 1,7 ml e rótulo com informações de código de lo barras LWS. Colocar o tubo em um envelope pardo pequeno e etiqueta com código de barras LWS. Note que este código de barras vai relacionar de volta para o evento de transformação original.

3. Sementes armazenar a-200C por 24 horas antes de transferir as sementes para 40C para armazenamento. 15 Seleção de positivo T1 plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana Esterilização superficial de sementes

1. Trabalhando em uma capela de fluxo laminar de sementes local, a ser esterilizado (40 mg 2000 = sementes por placa de 20 150x15 milímetros) em um microtubo 2,0 ml.

2. Adicionar 1000 mL de etanol 70% e deixe por dois minutos.

3. Remover o etanol e adicionar 1,000 ml de solução de esterilização de sementes (4% de cloro: a água: 5% SDS em uma 25 proporção de 08:15:01, respectivamente) e misture bem em vortex.

4. Coloque os tubos em wheell ferris o Ratek 'para assegurar a mistura das sementes e solução, deixe por dez minutos.

5. No fluxo laminar, remover a solução de esterilização e substituir com água estéril. Tubo de vórtice do (s) e girar por 30 30 segundos em uma centrífuga de bancada para sedimentar as sementes. Retire a água e substitua-o por outro de 1 ml de água estéril. A semente de lavar etapas devem ser repetidas até que não haja bolhas visíveis são evidentes (pelo menos 4 vezes). Após a última lavagem, deixar cerca de 200 mL de água cobrindo as sementes. A seleção dos transformantes T1 5 1. Prepare 150 x 15 mm com placas de médio seleção de germinação (SGM), contendo o antibiótico apropriado de seleção (por exemplo, em Higromicina 8mg 1 L para PZP200 série). Incluem Timentin (250 mg / L) para inibir o crescimento de Agrobacterium. Aproximadamente 125 ml de SGM é necessário para cada prato. lo 2. Trabalhando em uma capela de fluxo laminar, executar um bisturi estéril em toda a superfície da placa de agar SGM em paralelo (ver Figura 4). Isso ajudará a espalhar as sementes.

3. Usando um estéril 1 ml dicas, com a sua extremidade removida, pipetar as sementes esterilizadas em um prato. 15 Distribuir as sementes com um espalhador estéril e descartável.

4. Frio tratar as sementes a 4 ° C por dois dias, e depois crescer sob luz fluorescente contínua (55 mmol m "2s" 1) a 22 ° C.

5. Quando transformantes putativos estão em fase de folhas 08106 eles podem ser transferidos para o solo. Com um par de pinças 20 retire cuidadosamente as plantas a partir da mídia de cultura de tecidos assegurar as raízes permanecem intactas. Transplante para o solo úmido mix in-vitro usando o ARASYSTEM (ver Figura 5 do Apêndice 2) Cubra com um tubo de plástico. Criar novos códigos de barras e tubos LWS rótulo. Tampa superior de tubos com filme plástico por alguns dias para ajudar a recuperação. 25 Verificação de integração de transgene: álcali- tratados tecido foliar como fonte de DNA genômico. Três dias depois de transformantes putativos foram transferidos para o solo, plantas individuais podem ser caracterizadas molecularmente a presença do transgene usando o protocolo a seguir. 30 1. Prepare uma mistura tampão 1x PCR para cada tecido foliar álcali-tratados a serem testadas (veja abaixo para detalhes).

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2. Em um microtubo 1,7 ml, adicionar 200 mL. de 0,25 M NaOH a uma pequena folha jovem (retirada de uma planta de Ti).

3. Mergulhe o tubo em água fervente por 2 min. Note, para evitar que a tampa popping durante a ebulição, segura a tampa com 5 uma tampa de bloqueio ou furar a tampa do microtubo com uma agulha fina.

4. Após a fervura, retire o tubo da água e adicionar 200 mL de 0,25 M HCI e 100 I de 0,25% (v 1 v) igepal [0.5 M Tris pH 8,0 HCI]. Mergulhe o tubo em água fervente por mais 4 minutos.

5. Remover uma pequena porção da folha de álcali- lo tratados (— 2 mm2) e coloque na mistura da PCR pré-preparados: 10 x tampão de reação de PCR (incluindo Mg (SO4) .7 H2O) 5,0 ml 10 mM dNTP1S 1,0 mL 10 mM de primer para a frente 1,0 mL 15 10 mM de primer reverse 1,0 mL PWO DNA polimerase 1,0 mL MQ H2O 41,5 mL 6. Realizar 35 ciclos utilizando condições padrão PCR;

1. 95 0 C por 3 minutos 20 2. 94 ° C por 30 seg

3.55°C por 30 seg

4. 72 ° C por 1 min

5. 72° C 10 minutos Repita os passos 2-4, um total de 35 vezes. 25 7. Analisar o produto da PCR em gel de agarose 1%. Nota se uma inserção não é amplificada usando álcali-tratados tecido foliar pela primeira vez, re-ferver o tecido por mais 2 minutos e repita a amplificação por PCR do transgene. Se esta segunda PCR falhar, extrair uma pequena quantidade de DNA genômico de tecido foliar de 30 plantas usando Qiagen kit de extração de DNA genômico. Atualização LWS. Coleta de sementes f 69/74

1. Depois que as plantas secaram, retire os talos do rolamento silique e coloque-os num saco de papel e deixar secar por uma semana à temperatura ambiente. Sacos de etiquetas com código de barras LWS. Esmagar o siliques secas no saco de papel. Isso vai quebrar o siliques e 5 liberar a semente.

2. Coloque uma peneira 200 mícrons em uma folha de papel A4 e ponta da semente e siliques esmagados dentro dele. Toque suavemente a peneira permitindo que a semente caia na debaixo de papel. Descartar o material vegetal que permanece na peneira. Repita esse processo lo até que a maioria do material vegetal foi removido (material vegetal nota pode ser uma fonte de contaminação nas etapas subseqüentes). Coloque as sementes em um tubo de microcentrifuga 1.7m1 e rótulo com informações de código de barras LWS. Colocar o tubo em um envelope pardo pequeno e etiqueta com código de barras LWS. Note que este código de barras vai 15 relacionar de volta para o evento de transformação original.

3. Armazenar as sementes em T2-200C por 24 horas (ajuda a reduzir as chances de contaminação por fungos durante a seleção para o positivo plantas transgênicas T2) antes de guardar as sementes a 4 ° C. 20 Comentários Todos os contêineres que entram em contato com Agrobacterium, incluindo as bandejas ARASYSTEM, suportes, etc devem ser cuidadosamente limpos com água sanitária comercial e etanol 70%. Dependendo do experimento, as plantas Ti pode ser 25 usado para a caracterização fenotípica, ou seja, análise de gene repórter, e ele pode não ser necessário continuar a estas linhas para além da fase Ti. Geração de homozigotos sementes T3 A introdução de protocolos detalhados a seguir descrevem os métodos empregados para selecionar para as plantas 30 homozigotas com uma cópia de um transgene. Integração do transgene em Arabidopsis thaliana utilizando o método de infiltração ocorre no gineceu antes da fecundação do ovário. Portanto, as sementes produzidas pela infiltração que carregam o transgene são consideradas Ti. Sementes germinam Ti Ti para produzir plantas, que por sua vez produzem as sementes T2. O objetivo é a obtenção de pelo menos cinco independente plantas transgênicas por 5 construção que têm uma inserção única e estão expressando o transgene. Cada código de barras gerado LWS para Ti sementes representa um evento de transformação distintas, Como cada planta é colhida para Ti sementes T2 eles recebem um número de código de barras novas LWS. Este código de barras LWS se relacionará de volta para o evento de transformação original. lo Seleção de transformantes T2 para gerar sementes T3

1. Trabalhando em uma superfície capa de fluxo laminar esterilizar cerca de 100 sementes T2 (ver secção 7.1)

2. Placa com aproximadamente 25 sementes por 15 placa (4 no total) em mídia seleção SGM contendo 250mg 1 L timetin e 8mg 1 L higromicina (agente de seleção para pPZP200-35-HPH-35st).

3. Frio tratar as sementes a 4 ° C por dois dias depois transferir para sala de crescimento com iluminação constante (55 pmol.m "2.s" 1) a 22 ° C. 20 4. Depois de duas semanas, a análise de segregação de plantas resistentes ou sensíveis à higromicina é executada.

5. Quando o transformantes putativos estão em fase de folhas 8-6, a transferência, pelo menos, 10 plantas individuais em solo usando o Arasystem. Gerar novos códigos de barras LWS (remete para a 25 transformação original) e rotular cada planta individualmente com o código de barras. Cubra com filme plástico tubos por alguns dias para ajudar na recuperação.

6. Para confirmar que cada planta tem o transgene integrado, use o método tecido alcalinos tratados folha (seção 7.3). Atualização 30 LWS.

7. Depois que as plantas secaram, retire os talos do rolamento sulque e colocá-los em um saco de papel e deixar secar por uma semana a 37 ° C. Sacos de etiquetas com código de barras LWS. Esmagar o siliques secas no saco de papel. Isso vai quebrar o siliques e liberar as sementes. 5 8. Coloque uma peneira 200 microns em uma folha de papel A4 e ponta da semente e siliques esmagados dentro dele. Toque suavemente a peneira permitindo que a semente caia na debaixo de papel. Descartar o material vegetal que permanece na peneira. Repita esse processo até que a maioria do material vegetal foi removido (material vegetal nota pode lo ser uma fonte de contaminação nas etapas subseqüentes). Sementes colocar em um tubo de microcentrífuga 1,7 ml e rótulo com informações de código de barras LWS. Colocar o tubo em um envelope pardo pequeno e etiqueta com código de barras LWS. Note que este código de barras vai relacionar de volta para o evento de transformação original. 15 9. Armazenar as sementes a -20 ° C por 24 horas (ajuda a reduzir as chances de contaminação por fungos durante a seleção de plantas transgênicas positiva 13) antes de transferir as sementes a 4 ° C para armazenamento. Análise de segregação 20 1. Marcar o número total de plantas de cada linha T2 que seja resistente ou sensível à higromicina.

2. Se o T-DNA é inserida em um locus, a proporção de plantas resistentes ao sensível deve ser 3:1. Se o locus T-DNA é inserida em dois loci, a proporção de plantas resistentes ao sensíveis devem ser 15:1. 25 Se o T -DNA é inserida em mais de dois loci, a proporção de plantas resistentes ao sensíveis devem ser> 15:1.

3. Use o teste Qui-quadrado (X2) estatística para determinar o quão bem os dados de segregação se encaixa uma hipótese particular. 30 4. Continuar crescendo linhagens transgênicas que qui-quadrado análise indicou continha uma única cópia do transgene.

5. Atualização LWS Verificação de Integração de Transgene: Alkali tratados com tecido foliar como fonte de DNA genõmico

1. Colheita uma pequena folha para cada planta T2. 5 2. Siga álcali-tratados protocolo folha (seção 7.3) para determinar a presença de um transgene.

3. Atualização LWS. Seleção para homozigotos linhas T3

1. Continuar crescendo T2 linhagens transgênicas lo que indicam que eles contêm uma única inserção do transgene.

2. Coletar sementes T2 (seção 8.2), e atualizar e gerar códigos de barras LWS novo.

3. Germinar - 40 sementes T3 na SGM

4. Depois de duas semanas marcar o número total 15 de plantas de cada linha T3 que seja resistente ou sensível à higromicina.

5. Homozigotos linhas T3 será indicado pela ausência de plantas sensíveis.

6. Quando o transformantes putativos estão em fase de folhas 8-6, a transferência de pelo menos 20 plantas individuais no solo 20 usando a Arasystem. Gerar código de barras LWS novo e etiquetar cada planta individualmente com o código de barras. Cubra com filme plástico tubos por alguns dias para ajudar na recuperação.

7. Para validar ainda mais que uma linha é homozigoto para uma única inserção usar o método tecido alcalinos tratados 25 folha (seção 7.3) para confirmar que todas as plantas contêm um transgene.

Atualização LWS.

8. Material de colheita suficiente da suposta linhas homozigotas para executar uma hibridação do Sul para confirmar o número integrada transgene. Atualização LWS. 30 9. Colheita de sementes T3 linhas homozigotas seguindo o protocolo indicado na seção 8.2.

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Amplificação por PCR e sequenciamento de um promotor do gene do trigo rbcS.

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Claims (23)

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1. Método de manipulação de biossintese de frutanos em células de fotossíntese de uma planta, o referido método 5 caracterizado por incluir a introdução, na referidas pIanta, de uma quantidade eficaz de uma construção genética, incluindo um promotor regulado por luz ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica uma enzima frutosiltransferase bacteriana (FT), ou um fragmento funcionalmente ativo, ou suas variantes, em 10 que o referido ácido nucleico que codifica uma enzima frutosiltransferase bacteriana (FT) inclui uma sequência que codifica um peptídeo N-sinalisador que é removido e recolocado por uma sequência alvo sub-celular ou uma sequência que codifica um domínio de membrana de uma enzima frutosiltransferase. 15

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida sequência que codifica um peptldeo N-sinalisador ser removida por uma sequência alvo sub-celular e em que a referida sequência alvo sub-celular incluir uma sequência alvo vacuolar.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, 20 caracterizado pela referida sequência alvo vacuolar ser de ou corresponder a um gene que cod ifica uma proteína preprosporamina.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida sequência que codifica um peptídeo N-sinalisador ser recolocada por uma sequência que codifica um domínio de membrana de 25 uma enzima frutosiltransferase.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela referida enzima frutosiltransferase ser sacarose:sacarose 1- frutosiltransferase (I-SST).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, 30 caracterizado pela referida enzima frutosiltransferase bacteriana (FT) incluir ambas as atividades enzimáticas I-SST e frutana:frutana 1- frutosiltransferase

S:' "" " ' ' """"" "" " " ' W \ 2/5 (I-FFT).

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela referida sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima frutosiltransferase bacteriana (FT) ser selecionada do grupo consistindo 5 dos genes Sac8, Lsc e FTF.

8. Método para melhorar a produtividade de uma via bioquímica em uma planta, o referido método caracterizado pelo fato de incluir a introdução, na referida planta, de uma quantidade eficaz de uma construção genética, incluindo um promotor regulado por luz ou um fragmento 10 funcionalmente ativas ou variante do mesmo, operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica uma enzima FT bacteriana, ou um fragmento funcionalmente ativo ou suas variantes, em que o referido ácido nucleico que codifica uma enzima frutosiltransferase bacteriana (FT) inclui uma sequência que codifica um peptídeo N-sinalisador que é removido e recolocado por uma 15 sequência alvo sub-celular ou uma sequência que codifica um domínio de membrana de uma enzima frutosiltransferase.

9. Método para aumentar a biomassa em uma planta, o referido método caracterizado pelo fato de incluir a introdução, na referida planta, de uma quantidade eficaz de uma construção genética, 20 incluindo um promotor regulado por luz ou um fragmento funcionaimente ativo ou variante do mesmo, operativamente ligado a ácidos nucleicos que codificam uma enzima FT bacteriana ou fragmentos funcionalmente ativos ou variantes do mesmo, e em que o referido ácido nucleico que codifica uma enzima frutosiltransferase bacteriana (FT) inclui uma sequência que codifica um 25 peptídeo N-sinalisador que é removido e recolocado por uma sequência alvo sub-celular ou uma sequência que codifica um domínio de membrana de uma enzima frutosiltransferase.

10. Método para seleção de plantas transformadas caracterizado pelo fato de incluir a introdução, na referida planta, de uma 30 quantidade efetiva de uma construção genética, incluindo um promotor regulado por luz ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo,

.. .> YEH?+~''± "' " :" ' "'". ' '" " ' ""'" ' ' ' "' '"'"" í t 3 /5 operativamente ligado a ácidos nucleicos ligado a ácidos nucleicos que

W codificam uma enzima FT bacteriana ou fragmentos funcionalmente ativos ou variantes do mesmo, e selecionar plantas com biomassa aumentada, em que o referido ácido nucleico que codifica uma enzima frutosiltransferase bacteriana 5 (FT) inclui uma sequência que codifica um peptídeo N-sinalisador que é removido e recolocado por uma sequência alvo sub-celular ou uma sequência que codifica um domínio de membrana de uma enzima frutosiltransferase.

11. Construção genética capaz de manipular a biossíntese de frutanos em células de fotossíntese de uma planta, 10 caracterizada pelo fato de incluir um promotor regulado por Iuz, ou fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica uma enzima bacteriana FT, ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, em que o referido ácido nucleico que cod ifica uma enzima frutosiltransferase bacteriana (FT) inclui uma 15 sequência que codifica um peptídeo N-sinalisador que é removido e recdocado por uma sequência alvo sub-celular ou uma sequência que codifica um domínio de membrana de uma enzima frutosiitransferase.

12. Construção genética, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela referida sequência que codifica um 20 peptídeo N-sinalisador ser removida por uma sequência alvo sub-celular e em que a referida sequência alvo sub-celular incluir uma sequência alvo vacuolar.

13. Construção genética, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela referida sequência alvo vacuolar ser de ou corresponder a um gene que codifica uma proteína preprosporamina.

25 14. Construção genética, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela referida sequência que codifica um peptídeo N-sinalisador ser recolocada por uma sequência que codifica um domínio de membrana de uma enzima frutosiltransferase.

15. Construção genética, de acordo com a 30 reivindicação 14, caracterizada pela referida enzima frutosiltransferase ser uma sacarose:sacarose 1- frutosiltransferase (I-SST).

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b ' 4/5 promotor ser selecionado do grupo consistindo de " tecido especlfico constitutiva, induzlvel e promotores.

16. Construção genética, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela referida enzima frutosiltransferase 5 bacteriana (FT) incluir ambas as atividades enzimáticas I-SST e frutana:frutana 1- frutosiltransferase (I-FFT).

17. Construção genética, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pela referida sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima frutosiltransferase bacteriana (FT) ser selecionada do 10 grupo consistindo dos genes SacB, Lsc e FTF.

18. Método para aumentar a biomassa em uma planta, caracterizado pelo fato de incluir a introdução, na referida pIanta, de quantidades eficazes de (a) uma construção genética capaz de manipular a 15 biossintese de frutanos em células de fotossíntese da planta, a referida construção genética incluindo um promotor ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica uma enzima bacteriana FT, ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, e 20 (b) uma construção genética capaz de manipular a senescência na planta.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo promotor ser um promotor regulado por luz.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, 25 caracterizado pela construção genética capaz de manipular a senescência incluir um promotor do gene myb ou promotor do gene modificado myb, ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, operativamente ligado a um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de citocinina, ou um fragmento funcionalmente ativo, ou suas variantes. 30 21. Célula de planta transgênica, planta, semente de planta ou outras partes de plantas caracterizadas pelo fato de compreender

.4, . · , , .. . &,, " : N .- ":" · , . ,. . d~ , " ·' ' * . "C .- - —-.·.- · - .. . .. — -.

+ » 5/5 características biossintéticas ou biomassa melhorada em relação a uma planta de controle não transformada; a referida célula vegetal, planta, semente de planta ou parte de planta incluindo uma construção genética conforme definida na reivindicação 11. 5 22. Célula de planta transgênica, planta, semente de planta ou outras partes de pIanta, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadas pela sua biomassa ser aumentada em pelo menos aproximadamente 50% em relação a uma planta de controle não transformada.

23. Célula de planta transgênica, planta, semente de 10 planta ou outras partes de planta, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadas por seus carboidratos soIúveis serem aumentados em pelo menos aproximadamente 50% em relação a uma planta de controle não transformada.