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BRPI1003915A2 - semente manufaturada, e, mÉtodo para a germinaÇço de um embriço de planta - Google Patents

semente manufaturada, e, mÉtodo para a germinaÇço de um embriço de planta Download PDF

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Publication number
BRPI1003915A2
BRPI1003915A2 BRPI1003915-5A BRPI1003915A BRPI1003915A2 BR PI1003915 A2 BRPI1003915 A2 BR PI1003915A2 BR PI1003915 A BRPI1003915 A BR PI1003915A BR PI1003915 A2 BRPI1003915 A2 BR PI1003915A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
nutrient
medium
cavity
charcoal
treated
Prior art date
Application number
BRPI1003915-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey E Hartle
William C Carlson
Original Assignee
Weyerhaeuser Nr Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Weyerhaeuser Nr Co filed Critical Weyerhaeuser Nr Co
Publication of BRPI1003915A2 publication Critical patent/BRPI1003915A2/pt

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    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
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Abstract

SEMENTE MANUfATURADA, E, MÉTODO PARA A GERMINAÇçO DE UM EMBRIçO DE PLANTA invenção provê métodos para aperfeiçoar a germinação de sementes manufaturadas. A semente manufaturada da invenção compreendeum revestimento de semente, um meio nutritivo, que compreende um material adsorvente em uma concentração de cerca de 30 g/L a cerca de 100 gIL, e uma restrição de broto, que compreende uma cavidade. A semente manufaturada compreende ainda um embrião de planta. O material adsorvente pode ser carvão tratado com nutriente ou carvão tratado com não- nutriente. A semente manufaturada pode, opcionalmente, conter um material adsorvente na cavidade da restrição de broto.

Description

"semente manufaturada, ε, metodo para a germinagao de um embriao de planta"
fundamentos
A moderna silvicultura requer, com frequencia, ο plantio de grandes niimeros de plantas geneticamente identicas, que foram selecionadas de um modo a que possuam propriedades vantajosas. A produgao de novas plantas atraves de reprodu9ao sexual, que fornece sementes botanicas, nao e, de um modo usual, exequivel. Uma propagafao sexual, atraves da cultura de embrioes somaticos ou zigoticos, demonstrou, no caso de algumas especies, fornecer grandes mimeros de embrioes geneticamente identicos, cada qual tendo a capacidade de se desenvolver como uma planta normal. Os embrioes de planta criados atraves de culturas in vitro, no entanto, carecem de caracteristicas protetoras e nutritivas de sementes botanicas naturais. Foram efetuadas tentativas para prover as estruturas protetoras e nutritivas, encontradas nas sementes botanicas naturais, a embrioes de planta cultivados em um laboratorio, atraves do uso de sementes manufaturadas. As sementes manufaturadas sao descritas, por exemplo, nas patentes U. S. N0s. 5.564. 224; 5.687.504; 5.701. 699 e 6.119. 395. Permanecem, no entanto, problemas no que se refere as sementes manufaturadas. Tanto a taxa de germina9ao bem sucedida, como a qualidade dos germinantes produzidos a partir de sementes manufaturadas sao mais baixas do que a taxa e a qualidade obtidas a partir de sementes botanicas naturais. Portanto, existe uma necessidade de que seja aperfei9oada a taxa de germina9ao e a qualidade dos germinantes obtidos a partir de sementes manufaturadas. A presente inven^a。aborda estas e outras necessidades.
sumArio
Em um aspecto, a presente inven9ao prove uma semente manufaturada, que compreende (a) um revestimento de semente; (b) um meio
nutritivo, que compreende um material adsorvente, em que ο material adsorvente esta presente no meio em uma concentra9ao de cerca de 30g/L a cerca de 100 g/ L; e (c) uma restri9ao de broto, em que a restri9ao de broto compreende uma cavidade. Em uma modalidade, a semente manufaturada compreende ainda um embriao de planta, disposto na cavidade da restri?So de broto. Em uma modalidade, ο material adsorvente no meio nutritivo e ο carvao. Em uma modalidade, ο material adsorvente no meio nutritivo e carvao tratado com nutriente.
Em uma modalidade, a restrigSo de broto compreende ainda um material adsorvente, no interior da cavidade. Em uma modalidade, ο material adsorvente na cavidade e ο carvao. Em uma modalidade, ο material adsorvente no interior da cavidade e carvao tratado com nutriente.
Em um outro aspect。，a presente inver^a。prove metodos para aperfeigoar a germinafao de um embriao de planta a partir de uma semente manufaturada. Em uma modalidade, ο metodo compreende os estagios de: (a) conjuga9ao de uma semente manufaturada, que compreende um revestimento de semente e uma restripSo de broto, em que a restrigSo de broto compreende uma cavidade; (b) adiySo de um meio nutritivo, que compreende um material adsorvente, em que ο material adsorvente esta presente no meio em uma concentra9ao de cerca de 30 g/L a cerca de 100 g/L, ao revestimento de semente; (c) coloca9ao de um embriao de planta no interior da cavidade da restri^ao de broto; e (d) cultura da semente manufaturada sob condigSes adequadas para a germina9ao do embriao de planta.
Em uma modalidade, ο metodo compreende os estagios de (a) montagem de uma semente manufaturada, que compreende um revestimento de semente e uma restrifao, em que a restri9ao compreende uma cavidade; (b) adi9ao do meio nutritivo, que compreende um material adsorvente, em que ο material adsorvente esta presente no meio em uma concentragSo de cerca de g/L a cerca de 100 g/L, ao revestimento de semente; (c) colocagao de um embriao de planta no interior da cavidade da restrigSo; (d) adi9ao de um material adsorvente a cavidade; e (e) cultura da semente manufaturada sob condi^Ses adequadas para a germina9ao do embriao de planta.
Deve ser entendido que a ordem dos estagios no metodo pode ser alterada, sem que haja afastamento do escopo da invengSo. Por exemplo, um material adsorvente pode ser colocado no interior da cavidade da restrigao antes que ο embriao seja colocado no interior da restrigao.
DESCRigAo DOS DESENHOS Os aspectos precedentes e muitas das vantagens pertinentes desta inver^So serao mais prontamente apreciados, pois os mesmos se tornam melhor entendidos por referencia a descri9ao detalhada que se segue, quando tomada em conjun9ao com os desenhos anexos, nos quais:
A FIGURA 1 e uma vista planar em segSo transversal de uma semente manufaturada exemplar, que compreende um embriao para ο uso nos metodos da presente invengao;
A FIGURA 2 e um grafico, que ilustra as taxas de germina9ao de embrioes dispostos em uma semente manufaturada tendo quantidades crescentes de carvao no meio nutritivo. Foram efetuadas observa9oes 19 dias apos a semeadura;
A FIGURA 3 e um grafico, que ilustra as taxas de germina9ao de embrioes dispostos em uma semente manufaturada, tendo quantidades crescentes de carvao no meio nutritivo. Foram efetuadas observapSes 26 dias apos a semeadura;
A FIGURA 4 e um grafico, que ilustra comprimentos de orgao de embrides dispostos em uma semente manufaturada, tendo quantidades crescentes de carvao no meio nutritivo. Foram efetuadas observaQoes 35 dias apos a semeadura; e
A FIGURA 5 e um grafico, que ilustra a incidencia de embrioes dispostos em uma semente manufaturada, tendo quantidades crescentes de carvao no meio nutritivo. Foram efetuadas observa9oes 35 dias apos a semeadura. DESCRigAO DETALHADA A nao ser que aqui especificamente definido, todos os termos usados neste possuem ο mesmo significado que eles teriam para aquele versado na arte da presente inven9ao.
A nao ser que mencionado de um outro modo, todos os valores de concentra9ao, que sao expressos como percentuais, estao em percentuais de peso por volume.
Em um aspecto, a presente ΐηνεηςδο prove uma semente manufaturada, que compreende (a) um revestimento de semente; (b) um meio nutritivo, que compreende um material adsorvente, em que ο material adsorvente esta presente no meio em uma concentra9ao de cerca de 30g/L a cerca de 100 g/L (tal que, por exemplo, de cerca de 50 g/L a cerca de 100 g/L, de cerca de 60 g/ L a cerca de 100 g/L, ou de cerca de 75 g/L a cerca de 100 g/L); e uma restri^So de broto, em que a restri9ao de broto compreende uma cavidade. Em uma modalidade, a semente manufaturada compreende ainda um embriao de planta.
A FIGURA 1 e uma vista planar em segSo transversal de uma semente manufaturada exemplar 20, que compreende um embriao de planta 42，disposto no interior da mesma. Tal como mostrado na FIGURA 1, ο embriao 42 esta disposto no interior de uma cavidade 34, esta em contato funcional com ο meio nutritivo 26, e esta vedado na mesma, de um modo adequado, atraves de uma veda^So extrema viva 43. Sera entendido que a FIGURA 1 prove uma modalidade representativa de uma semente manufaturada 20; no entanto, ο metodo da ΐηνθηφδο nao esta limitado a modalidade particular da semente manufaturada apresentada na figura 1. Na modalidade exemplar apresentada na FIGURA 1, a semente manufaturada 20 compreende um revestimento de semente 24, ο meio nutritivo 26, uma
veda9ao extrema morta 28, e uma restrigao de broto opcional 22. Como aqui usado, um "revestimento de semente" refere-se a uma estrutura analoga a um revestimento de semente natural, que protege ο embriao da planta e outras estruturas internas da semente manufaturada contra ο dano mecanico, dessecagSo, contra ο ataque por microbios, fungos, insetos, nematodeos, passaros, e outros patogenos, herbivoros, e pestes, dentre outras fun^oes. O revestimento de semente 24 pode ser fabricado a partir de uma variedade de materials, que incluem, mas nao limitados a, materials celulosicos, vidro, plastico, plastico moldavel, resinas polimericas curadas, parafina, ceras, vernizes, e combinagSes dos mesmos, tais que um papel impregnado com cera. Os materials, a partir dos quais ο revestimento da semente e produzido, sao, de um modo geral, nao- toxicos, e fornecem um grau de rigidez. O revestimento da semente pode ser biodegradavel, embora, de um modo tipico, ο revestimento da semente permanega intacto e resistente a penetra^ao por patogenos da planta, ate apos a emergencia do embriao germinante. O revestimento da semente pode ser formado a partir de uma se9ao de material tubular. O revestimento da semente pode ser uma palha seccionada de material fibroso, tal que ο papel. As segoes de palha podem ser previamente tratadas em um material de revestimento adequado, tal que a cera. De um modo alternative), ο revestimento da semente pode ser formado a partir de uma seySo tubular de material plastico, biodegradavel. Um tal material e ο acido polilactico ("PLA") e e vendido por NAT-UR de Los Angeles, California. Um outro material adequado e uma mistura de policaprolactona ("PCL"), tal que CAPA 6800 (Perstorp Polyols Inc., Toledo, Oklahoma 43612), com ou sem um plastificante de 1 % de Tegomero H SI 6440 (Degussa Goldschmidt Chemical Corp., 914, East Randolph Road, Hopewell, Virginia 23860). Tais tubos plasticos biodegradaveis podem, ou nao, requerer um revestimento de cera, pois tais tubos ja sao resistentes a elementos ambientais. Aditivos, tais que antibioticos e reguladores do crescimento da planta, podem ser adicionados ao revestimento da semente, por exemplo, atraves da incorpora9ao no material, que forma uma ou mais das camadas do revestimento da semente ou atraves do revestimento, ou do tratamento, de um outro modo, da(s) camada (s) com ο aditivo, atraves de meios convencionais.
De acordo com as sementes manufaturadas e metodos da inven9ao, ο meio nutritivo 26 esta em contato funcional com ο embriao de planta disposto no interior da semente manufaturada 20. Como aqui usado, um "meio nutritivo" refere-se a uma fonte de nutrientes, refere-se a uma fonte de nutrientes, tais que vitaminas, minerals, carbono, e fontes de energia, e a outros compostos beneficos, usados pelo embriao durante a germina9ao. Deste modo, ο meio nutritivo 26 e analogo ao gametofito de uma semente natural. Um meio nutritivo 26 de acordo com a invengao pode incluir uma substancia, que causa com que ο meio seja um semi- solido ou que tenha uma consistencia congelada sob uma condigSo ambiental normal. De um modo tipico, ο meio nutritivo 26 esta sob a forma de um gel hidratado. Um "gel" e uma substancia, que e preparada como uma solu9ao coloidal e que ira, ou sera levada a, formar um material semi-solido. Uma tal conversao de uma solu9ao de gel liquido em um material semi- solido e aqui denominada "cura" e "endurecimento" do gel. Um "gel hidratado" refere-se a um gel contendo agua. Tais geis sao preparados primeiramente pela dissolu9ao em agua (em que a agua serve como ο solvente ou a "fase continua") de uma substancia polimerica hidrofilica (que serve como ο soluto ou como a "fase dispersa"), que, mediante a cura, e combinada com a fase continua, de um modo a formar ο material semi-solido. Deste modo, a agua e associada, de um modo homogeneo, com as moleculas do soluto, sem que experimente qualquer separa9ao substancial da fase aquosa a partir da fase dispersa. No entanto, as moleculas de agua podem ser livremente extraidas a partir de um gel hidratado curado, tal que atraves de evapora9ao ou embebimento por um embriao germinante. Quando curados, estes geis possuem as caracteristicas de solidos resilientes, tais que uma massa de gelatina, em que a resiliencia se trona progressivamente menor e em que ο gel se torna mais "solido" ao toque, a medida em que a quantidade relativa de agua no gel e diminuida.
Em adi9ao a ser soliivel em agua, os solutos de gel adequados nao sao nem citotoxicos, nem substancialmente fitotoxicos. Como aqui usada, uma substancia "substancialmente nao- fitotoxica" e uma substancia, que nao interfere, de um modo substancial, com ο desenvolvimento da planta normal, tal que atraves da extermina^ao de um numero substancial de celulas da planta, alterando, de um modo substancial, a diferenciagSo celular ou a matura9ao, causando muta90es, rompendo um mimero substancial de membranas celulares ou rompendo, de um modo substancial, ο metabolismo celular, ou rompendo, de um modo substancial, um outro processo.
Os solutos de gel candidatos incluem, mas nao estao limitados, aos seguintes: alginato de sodio, agar, agarose, amilose, pectina, dextrano, gelatina, amido, amilopectina, celulose modificadas, tais que metil celulose e hidroxietil celulose, e poliacrilamida. Outros solutos de gel hidrofilico podem ser tambem usados, desde que eles possuam propriedades de hidrata9ao e gela9ao similares e falta de toxicidade.
Os geis sao preparados, de um modo tipico, atraves da dissolu9ao de um soluto de gel, de um modo usual em forma de um material em particulas fino，em agua, de um modo a formar uma solufao de gel. Dependendo do soluto de gel particular, ο aquecimento e necessario, de um modo usual, algumas vezes ate a fervura, antes que ο soluto de gel seja dissolvido. O resfriamento subsequente ira causar com que muitas solugdes de gel sejam "endurecidas" ou "curadas" (sejam transformadas em gel), de um modo reversivel. Os exemplos incluem gelatina, agar, e agarose. Tais solutos de gel sao denominados "reversiveis" porque ο reaquecimento do gel curada ira novamente formar a solu9ao de gel. Sollies de outros solutos de gel requerem um agente de "complexa9ao", que serve para curar quimicamente ο gel atraves da reticulaySo de moleculas de soluto de gel. Por exemplo, ο alginato de sodio e curado atraves da adi9ao de nitrato de calcio (Ca(NC^)2) ou de sais de outros ions divalentes, tais que, mas nao limitados a, calcio, bario, chumbo, cobre, estroncio, cadmio, zinco, niquel, cobalto magnesio, e ferro a solu9ao do gel. Muitos dos solutos de gel requerem com que os agentes de complexagao se tornem curados de um modo irreversivel, em que ο reaquecimento nao ira estabelecer novamente a solu9ao do gel.
A concentra9ao de soluto de gel varia, dependendo do soluto de gel particular. Por exemplo, uma concentra?So Ml de alginato de sodio esta dentro de uma faixa de cerca de 0,5% p/ ν a cerca de 2,5% p/ v, de um modo preferido de cerca de 0,9% p/v a 1,5% p/ v. Uma concentra9ao Ml de agar esta dentro de uma faixa de cerca de 0,8% p/v a cerca de 2,5% p/ v, de um modo preferido de cerca de 1,8% p/v. De um modo geral, os geis curados atraves de complexapSo requerem menos soluto de gel para formar um gel satisfatorio do que os geis "reversiveis".
O meio nutritivo 26 compreende, de um modo tipico, uma ou mais fontes de carbono, um material adsorvente, vitaminas e minerals. As fontes de carbono adequadas incluem, mas nao estao limitadas a, monossacarideos, dissacarideos, e/ ou amidos. Os materials adsorventes adequados incluem, mas nao estao limitados a, carvao, polivinil polipirrolidona, e geis de silica. O meio nutritivo 26 pode tambem compreende aminoacidos e uma suspensao de ftimaga. Aminoacidos adequados podem incluir os aminoacidos comumente encontrados incorporados em proteinas, assim como os aminoacidos nao comumente encontrados incorporados em proteinas, tais que ο succinato de arginina， citrulina, canavanina, ornitina e D- estereoisomeros. Uma suspensao de fUmaya adequada contem um ou mais compostos gerados atraves do processo de queima de materia organica, tal que madeira ou um outro material
celulosico. Soloes contendo estes subprodutos de queima de materia organica podem ser geradas atraves da queima de materia organica, lavagem do material calcinado com agua, e coleta da agua. As solu?5es podem ser tambem obtidas atraves do aquecimento da materia organica e condensa9ao e dilui9ao das substancias volateis liberadas a partir de um tal aquecimento.
Certos tipos de suspensoes de fuma9a podem ser adquiridas a partir de fornecedores comerciais, por exemplo Wright's Concentraded Hickory Seasoning Liquid Smoke ( B & G Fodds, Inc., Roseland, New Jersey 07068). A suspensao de espuma pode ser incorporada no meio nutritivo 26 em qualquer uma de varias formas. Por exemplo, a suspensao de espuma pode ser incorporada como um aerossol, um ρό, ou como argila ativada. Uma concentragao exemplar da suspensao de fUma^a liquida Wright's Concentraded Hickory Seasoning Liquid Smoke, se presente, esta entre 0,0001 ml e 1 ml de suspensao de fUmaga por litro de meio. O meio nutritivo 26 pode tambem incluir um ou mais compostos incluidos no metabolismo de nitrogenio, tais que ureia ou poliamina.
O meio nutritivo 26 pode ainda incluir substancias que portam oxigenio, de um modo a aumentar tanto a absor9ao de oxigenio, como a reten9ao de oxigenio pelo meio nutritivo, deste modo permitindo com que ο meio mantenha uma concentra^So de oxigenio, que e mais alta do que a que estaria presente de um outro modo no meio unicamente a partir da absor^o de oxigenio a partir da atmosfera. Substancias, que portam oxigenio exemplares, incluem perfluorocarbonos, tais que FC-77, e tensoativos, tais que Pluronic F- 68, disponivel de BASF Corp. Parsippany, N. J. As substancias que portam oxigenio exemplares estao descritas na Patente U. S. N0 5. 564. 224 (por exemplo, Col. 9, linha 44，a Col. 11，linha 67), incorporadas a este a titulo referencial.
O meio nutritivo 26 pode tambem conter hormonios. Os hormonios adequados incluem, mas nao estao limitados a, acido abscisico,
citoquininas, auxinas, e giberelinas. O acido abscisico e um hormonio de planta sequiterpenoide, que esta implicado em uma variedade de processos fisiologicos da planta (vide, por exemplo, Milborrow, J. Exp. Botany 52: 1145- 1164 (2001); Leung & Giraudat, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol Biol. 49: 199- 123 (1998)). As auxinas sao hormonios ο crescimento da planta, que promovem a divisao e ο crescimento celular. As auxinas exemplares para ο uso no meio de germina^So incluem, mas nao estao limitadas a, acido 2,4- diclorofenoxiacetico, acido indol-3- acetico, acido indol-3-butirico, acido naflaleno acetico e acido clorogenico. As citoquininas sao hormonios do crescimento da planta, que afetam a organizagSo de celulas que se dividem. As citoquininas exemplares, para ο uso no meio de germina9ao, incluem, mas nao estao limitadas a, por exemplo, 6- benzilaminopurina, 6- furfurilaminopurina, diidrozeatina, Zeatina5 quinetina e zeatina ribosideo. As giberelinas constituem uma classe de hormonios de planta diterpen0ides (vide, por exemplo, Krishnamoorthy, Gibberellins and Plant Growth, John Wiley & Sons (1975)). Exemplos representativos de giberelinas, iiteis na pratica da presente invengSo, incluem ο acido giberelico, giberelina 3, giberelina 4 e giberelina 7. Um exemplo de uma mistura iitil de giberelinas e uma mistura de giberelina 4 e de giberelina 7 (referida como a giberelina 4/ 7), tal que a giberelina 4/ 7, vendida por Abbott Laboratoires, Chicago, Illinois.
O meio nutritivo 26 pode tambem incluir agentes antimicrobianos. Os agentes antimicrobianos adequados estao disponiveis de Sigma- Aldrich, St. Louis, Missouri, vendidos como ο Produto # A 5955. Os agentes antimicrobianos podem ser usados, por exemplo, em uma concentra9ao de 1 ml/ L.
Quando ο acido abscisico esta presente no meio nutritivo modificado 26, ele e, de um modo tipico, usado em uma concentra9ao na faixa de a partir de cerca de 1 mg/L a cerca de 200 mg/ L. Quando presente no meio nutritivo 26, a concentra9ao de giberelina(s) esta, de um modo tipico, entre cerca de 0,1 mg/ L e cerca de 500 mg/ L. As auxinas podem ser usadas, por exemplo, em uma concentração de a partir de 0, 1 mg/ L a 200 mg/L. As citoquininas podem ser usadas, por exemplo, em uma concentração de a partir de 0,1 mg /L a 100 mg/L.
Meios nutritivos exemplares estão descritos na Patente U.S. N0 5. 687.504 (por exemplo, Col. 8, linha 63, a Col. 9, linha 41) e na Publicação de Patente U.S N0 2003/ 0167684, incorporada a este, a título referencial. Um meio nutritivo representativo 26 é KE64- 50, cuja composição é exposta na Tabela 1 abaixo.
Em uma modalidade da invenção, a concentração do material adsorvente no meio nutritivo 26 é de cerca de 30 g/ L a cerca de 100 g/ L. Em ainda uma outra modalidade, a concentração do material adsorvente no meio nutritivo 26 é de cerca de 50 g/L a cerca de 100 g/ L. Em uma outra modalidade, a concentração do material adsorvente no meio nutritivo 26 é de cerca de 60 g/L a cerca de 100 g/ L. Em ainda uma outra modalidade, a concentração do material adsorvente no meio nutritivo 26 é de cerca de 75 g/ L a cerca de 100 g/ L. Em uma modalidade, o material adsorvente é o carvão. Em uma modalidade, o material adsorvente é carvão tratado com nutriente. Como aqui usado, carvão "tratado com nutriente" refere-se a carvão que tenha sido tratado com um meio que contenha uma variedade de nutrientes, tais que uma fonte de carbono, vitaminas, minerais, e aminoácidos, de um modo tal que o carvão absorva e retenha os nutrientes a partir do meio. Um meio representativo, usado para preparar o carvão tratado com nutriente é o meio KE 64- 50. Um método representativo para preparar o carvão tratado com nutriente está descrito no Exemplo 2.
A restrição de broto 22 de uma semente manufaturada é, de um modo adequado, manufaturada a partir de um material poroso, tendo uma dureza suficientemente forte para resistir à perfuração ou fratura por um embrião germinante, tal que uma cerâmica ou material de porcelana, e inclui uma porção de vedação terminal 30 e uma porção de restrição de cotiledôneo 32. A porção de restrição 32 possui uma superfície interior para o contato e que circunda pelo menos a extremidade do broto de um embrião de planta e resiste à penetração pela extremidade do broto durante a germinação. A restrição de broto evita com que a extremidade do broto do embrião, tais que os cotiledôneos, possam crescer ao interior de e ser retidos no meio nutritivo (também referido como ao meio nutritivo). A porção de restrição do cotiledôneo 32 está, de um modo adequado, formada integralmente ou unitariamente com a porção de vedação extrema 30. A restrição de broto 22 também inclui uma cavidade que se estende longitudinalmente 34, que se estende através da porção de vedação extrema 30 e parcialmente através de uma extremidade da porção de restrição do cotiledôneo 32. A extremidade aberta da cavidade 34 é conhecida como a abertura de restrição do cotiledôneo 36. A cavidade 34 é dimensionada de um modo a receber um embrião de planta 42 na mesma. Como mostrado na FIGURA 1, a restrição de broto 22 compreende uma pluralidade de poros 27, em que os poros 27 permitem com que o meio nutritivo 26 acesse o interior da cavidade 34, que compreende o embrião 42 e, portanto, permite com que o meio nutritivo 26 entre em contato funcional com o embrião 42, sob condições suficientes para gerar um embrião condicionado, como aqui descrito.
A restrição é porosa, de um modo a permitir o acesso do embrião à água, nutrientes, e oxigênio. A restrição do broto pode ser fabricada a partir de qualquer material adequado, incluindo, mas não limitado a, materiais vítreos, metálicos, elastoméricos, cerâmicos, argilosos, adesivos, cimento, amido, tipo argamassa, poliméricos sintéticos, poliméricos naturais, e materiais adesivos. As restrições de broto exemplares estão descritas na Patente U. S. N0 5. 687. 504 ( por exemplo, Col. 3, linha 61, a Col. 4, linha 13; Col. 18, linha 7, a Col. 22, linha 2) incorporadas a este, a título referencial. Todo, ou apenas parte, do embrião de planta 42 pode ser inserido no interior da restrição de broto 22. De um modo típico, pelo menos a extremidade de broto do embrião é inserida no interior da restrição de broto 22. A área superficial de absorção de nutriente em uma semente manufaturada 20 está limitada à área do embrião da planta 42, que está em contato direto com a superfície interior da restrição de broto 22. Durante a germinação dos embriões de planta, foi verificado que os cotiledôneos são os órgão primários para a absorção de nutriente (Brown & Gifford, Plant Physiol. 33: 57- 64 (1958)).
Ou a superfície interior da restrição de broto 22 ou do embrião
de planta 42, ou ambos, podem ser contatados com um gel hidratado, seja antes ou após a inserção do embrião de planta 42 ao interior da restrição de broto 22. Modalidades exemplares de géis hidratados são tais que acima descritas para o meio nutritivo 26. O gel hidratado pode compreender apenas solutos de gel e água, ou ele pode compreender nutrientes de planta e outras substâncias, tal como descrito para o meio nutritivo 26.
A superfície interior da restrição do broto pode ser colocada em contato com uma solução de gel hidratada, que será curada de um modo a formar um gel hidratado. Uma cavidade 34 pode ser então produzida no gel hidratado na restrição de broto 22 e o embrião de planta 42 pode ser inserido no interior da cavidade 34 no gel hidratado na restrição de broto 22. De um modo adicional, ou alternativo, pelo menos uma porção do embrião de planta 42 ( tais que os cotiledôneos) pode ser colocada em contato com uma solução de gel hidratado, que será curada de um modo a formar um gel hidratado, antes da inserção do embrião de planta 42 no interior da restrição de broto 22.
Tal como ainda mostrado na FIGURA 1, em uma modalidade da invenção, o material adsorvente 80 circunda, de um modo completo ou parcial, o embrião 42 na cavidade 34 e aumenta a área superficial do embrião 42 em contato funcional com o meio nutritivo 26, deste modo provendo múltiplas vias para que os nutrientes a partir do meio nutritivo 26 passem para o embrião 42. Materiais adsorventes adequados incluem carvão ativado, resinas Dowex, zeólitos, alumina, argila, terra diatomácea, sílica gel, e Kieselguhr. Durante a montagem da semente manufaturada 20, o material adsorvente 80 é depositado no interior da cavidade 34, de qualquer modo conhecido na arte, incluindo manualmente. O material adsorvente 80 é, de um modo preferido, mas não necessariamente, depositado no interior da cavidade 34, de um modo tal que ele centralize, substancialmente, o embrião de planta 42 no interior da cavidade 34. Embora seja preferido que o material adsorvente 80 centralize, de um modo substancial, o embrião 42 no interior da cavidade 34, o embrião de planta 42 não precisa estar posicionado deste modo. O material adsorvente 80 precisa apenas posicionar o embrião de planta 42 no interior da cavidade 34, de qualquer modo, para colocar o embrião de planta 42 em contato funcional com o meio nutritivo 26. Além disso, não é necessário que o material adsorvente 80 "circunde" o embrião de planta 42. Como tal, o material adsorvente 80 pode circunda, de um modo completo ou parcial, o embrião de planta 42. Em outras modalidades dentro do escopo das reivindicações apensas, o material adsorvente 80 precisa apenas encher, de um modo completo ou parcial, um ou dois lados do espaço entre o embrião de planta 42 e as paredes da cavidade.
Em uma modalidade, o material adsorvente 80 na cavidade 34 é o carvão. De um modo preferido, o carvão está sob a forma de um pó e é ativado através de tratamento prévio com um ácido, tal que HCl ou ácido fosfórico. O carvão ativado está disponível comercialmente. Por exemplo, carvão ativado NORIT® CNSP ou DARCO® KB- G estão disponíveis de Norit Américas Inc., Marshall, Texas. Em uma outra modalidade, o material adsorvente 80 na cavidade 34 é carvão tratado com nutriente. Um método exemplar para preparar carvão tratado com nutriente para a inserção no interior da cavidade 34 é descrito no Exemplo 2. Como aqui usado, um "embrião de planta" refere-se ou a embrião de planta zigótico ou a um embrião de planta somático. Um embrião de planta zigótico é um embrião encontrado no interior de uma semente botânica, produzido através de reprodução sexual. Os embriões somáticos podem ser produzidos através da cultura de tecido embriogênico, através de métodos convencionais, sob condições laboratoriais, nas quais as células compreendendo o tecido são separadas, uma a partir da outra, e pressionadas para que desenvolvam dentro de minutos, embriões completos.
Como aqui usado, "um embrião somático de planta" refere-se a um embrião produzido através do cultivo de células de planta totipotentes, tais que o tecido meristemático, sob condições laboratoriais, nas quais as células que compreendem o tecido, são separadas, uma da outra, e são pressionadas para desenvolverem, dentro de minutos, embriões completos. De um modo alternativo, os embriões somáticos podem ser produzidos através de "poliembriogenia por clivagem" de embriões zigóticos. Os métodos para a produção de embriões somáticos de planta, adequados para o uso nos métodos da invenção, são convencionais na arte e foram previamente descritos (vide, por exemplo, as Patentes U.S. N0 s 4. 957. 866; 5.034. 326; 5.036.007; 5.041.382; 5.236. 841; 5.294. 549; 5.482. 857; 5.563.061; e 5.821. 126). Por exemplo, o tecido da planta pode ser cultivado em um meio de iniciação, que inclui hormônios, de um modo a iniciar a formação de células embriogênicas, tais que as massas de suspensão embriônicas, que são capazes de se desenvolverem como embriões somáticos. As células embriogênicas podem ser então adicionalmente cultivadas em um meio de manutenção, que promove o estabelecimento e a multiplicação de células embriogênicas. Subseqüentemente, as células embriogênicas multiplicadas podem ser cultivadas em um meio de desenvolvimento, que promove o desenvolvimento de embriões somáticos, que podem ser adicionalmente submetidos a tratamentos pós- desenvolvimento, tais que tratamentos frios. Os embriões somáticos, usados nos métodos da invenção, completaram o estágio de desenvolvimento do processo de embriogênese somática. Eles podem ser também submetidos a um ou mais tratamentos pós-desenvolvimento.
Os embriões de planta, adequados para o uso nos métodos da invenção, podem ser embriões a partir de qualquer espécie de planta, tais que plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas ou gimnoespermas, etc. Os embriões de conífera, adequados para o uso nos métodos da invenção, podem ser de espécies de conífera, que incluem, ma não estão limitadas a, embriões de pinheiro teda e embriões de conífera norte-americana. Para o uso em sementes manufaturadas de acordo com a presente invenção, o embrião da planta 42 é, de um modo típico, suficientemente desenvolvido, de um modo a que apresente uma extremidade de broto e uma extremidade de radícula. Em certas espécies de plantas, a extremidade do broto inclui um ou mais cotiledôneos em algum estágio de desenvolvimento. Em outros tipos de plantas, o(s) cotiledôneo(s) está(ão) situados em outros locais, que não a extremidade de broto.
Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos para aperfeiçoar a germinação de um embrião de planta a partir de uma semente manufaturada. Em uma modalidade, o método compreende os estágios de: (a) conjugar uma semente manufaturada, que compreende um revestimento de semente uma restrição, em que a restrição compreende uma cavidade; (b) adicionar um meio nutritivo, que compreende um material adsorvente, em que o material adsorvente está presente no meio, em uma concentração de a partir de cerca de 30 g/ L a cerca de 100 g/L, ao revestimento de semente; (c) colocar um embrião de planta no interior da cavidade da restrição; e (d) cultivar a semente manufaturada sob condições adequadas para a germinação do embrião de planta. Em uma modalidade, o método compreende os estágios de (a) conjugar uma semente manufaturada, que compreende um revestimento de semente e uma restrição, em que a restrição compreende uma cavidade; (b) adicionar um meio nutritivo, que compreende um material adsorvente, em que o material adsorvente está presente no meio em uma concentração de cerca de 30g/L a cerca de 100 g/L, ao revestimento de semente; (c) colocar um embrião de planta no interior da cavidade da restrição; (d) adicionar um material adsorvente à cavidade; e (e) cultivar a semente manufaturada sob condições adequadas para a germinação do embrião de planta.
As condições adequadas para a germinação de sementes manufaturadas são convencionais na arte e incluem as condições adequadas para a germinação de sementes naturais. Por exemplo, as sementes manufaturadas podem ser semeadas em qualquer uma de uma variedade de ambientes, tais que em areia, vermiculita, solo estéril, e/ ou no campo ( solo natural). Por exemplo a areia lavada estéril Coles™, que está disponível a partir de uma variedade de fornecedores de suprimento de jardinagem, pode ser usada.
Um método exemplar para a montagem de um embrião de
planta 42 no interior de uma semente manufaturada 20 é descrito no Exemplo 3.
Os métodos da invenção melhoram a germinação de um embrião de planta a partir de uma semente manufaturada, tal como mostrado nos Exemplos 4, 5 e 6.
Os exemplos que se seguem são providos com o propósito de ilustrar, e não de limitar, a invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
Este exemplo provê um método de preparação representativo
de um meio nutritivo adequado para o uso na invenção.
O Meio Nutritivo (KE 64-50) é produzido pela combinação do Meio Básico KE64 (Tabela 1) com os componentes da Tabela 2, tal como descrito. KE 64-50 é também preparado a partir de materiais pré- fabricados. A quantidade requerida de cada solução de material (que não é termicamente instável) é adicionada à água. Substâncias químicas não- material (tais que carvão e ágar) são pesadas e diretamente adicionadas ao meio. Após todas as substâncias químicas não termicamente instáveis e os compostos serem adicionados, o meio é conduzido a um volume apropriado e o pH é ajustado para 5,7. O meio é então esterilizado através de autoclavagem, durante 25 minutos.
TABELA 1 : Formulação de Meio Básico KE64
Componente do Meio Concentração Final (mg/l) NH4NO3 301,1 H3BO3 10,0 (NH4)2Mo04 0,06 CaCl2-2H20 299,2 KH2PO4 1800,0 MgS04-7H20 1000,0 MnCl2,4H20 6,0 ZnS04-7H20 0,8 CuCl2-2H20 0,5 Citrato Férrico 60 Pluronic F-68 10 g/l Agar 18 g/l
Os componentes termicamente instáveis esterilizados em filtro (Tabela 2) são adicionados após o meio ter sido resfriado a 40°C.
TABELA 2
Componente do Meio Concentração Final nM Concentração Final (mg/l) Mio- inositol 0,5549 100,0 Tiamina- HCi 0,0030 1,0 Piridoxina- HCl 0,0012 0,25 Ácido Nicotínico 0,0081 1,0 Riboflavina 0,0021 0,125 Pantotenato de Ca 0,50 Biotina 0,0003 0,0010 Ácido Fólico 0,8077 0,1250 L-asparagina 1,8255 106,7 L-glutamina 0,3646 266,7 L-Iisina -2HC1 0,7612 53,3 DL-serina 0,4631 80 L-prolina 1,5310 53,3 L-arginina- HCl 0,4552 266,7 Ureia 13,3200 800 L- valina 0,5983 53,3 L-alanina 0,2203 53,3 L-Ieucina 0,2448 80 L-treonina 0,3226 26,7 Componente do Meio Concentração Final nM Concentração Final (mg/l) L-fenilalanina 0,1720 53,3 L-histidina 0,1308 26,7 L-triptofano 0,2035 26,7 L-isoleucina 1,2930 26,7 L-metionina 0,7100 26,7 L- glicina 0,0003 53,3 L-tirosina 0,2242 53,3 L-cisteína 0,6098 26,7 Sacarose 50 g/l Ácido Giberílico (GA4/7) 0,1 Agentes Antimicrobianos 1,0 ml/l
EXEMPLO 2
Este Exemplo é um método representativo de preparação de
carvão tratado com nutriente, adequado para o uso na invenção. O Meio Básico KE64 ( Tabela 1) é preparado como descrito no Exemplo 1, sem Pluronic F-68 e sem ágar. O carvão tratado com nutriente é preparado como se segue : 23,3 gramas de carvão de malha 100 são adicionados a 1 litro do Meio Básico KE64. Os componentes são autoclavados e deixados resfriar a 40°C. Os componentes da Tabela 2, tal como descritos no Exemplo 1, são adicionados, de um modo estéril, ao Meio Básico KE64, e o meio é agitado para que os componentes sejam misturados. O meio é filtrado através de um filtro de papel Whatman #1 em um funil de Buchner, de um modo a coletar o carvão. Um equilíbrio de umidade é usado para determinar o conteúdo de umidade da torta de carvão e o peso seco do carvão é calculado. Se o carvão carregado com nutriente tiver que ser adicionado à cavidade da semente manufaturada, ele é primeiramente secado, até que ele se torne uma matéria escoável.
EXEMPLO 3
Este exemplo é um método representativo de conjugação de embriões de planta no interior de sementes manufaturadas e de germinação de sementes manufaturadas. Em um método exemplar para a preparação de uma semente manufaturada para o uso na invenção, a semente manufaturada é preparada através do seccionamento de uma tubulação de policaprolactona ao comprimento apropriado. As restrições de broto cerâmicas são produzidas através da injeção de uma aba de porcelana ao interior de um molde previamente formado, com um pino no centro, de um modo a criar a cavidade de aceitação de broto. A aba é deixada secar em uma consistência que permita a remoção da restrição previamente formada. A restrição é subseqüentemente aquecida a uma temperatura, que permita com que a porcelana forme uma estrutura porosa, mas fundida. A restrição pode ser lavada com ácido, de um modo a remover as impurezas, se desejado. As tampas são produzidas por Parafilm™ previamente estirado (Pechiney Plastic Packaging5 Chicago, Illinois 60 631).
Os embriões zigóticos são preparados a partir de sementes botânicas. As sementes são esterilizadas superficialmente através de métodos similares àqueles previamente descritos (Cyr et ai., Seed Sei. Res. 1: 91 - 97 ( 1991)). As sementes são abertas por rompimento e os embriões zigóticos são dissecados a partir do megagametófito com escalpo e fórceps em uma coifa de fluxo laminar.
Os embriões somáticos são produzidos de acordo com métodos convencionais previamente descritos (vide, por exemplo, as Patentes U.S. N°s. 4. 957. 866, 5.034.326, 5.036. 007; 5.041.382; 5.236. 841; 5.294.549; 5.482. 857; 5. 563;061; e 5. 821.126). Por exemplo, o tecido da planta pode ser cultivado em um meio de iniciação, que inclui hormônios, de um modo a iniciar a formação de células embriogênicas, tais que as massas de suspensão embriônicas, que são capazes de se desenvolver sob a forma de embriões somáticos. As células embriogênicas podem então ser adicionalmente cultivadas em um meio de manutenção, que promove o estabelecimento e a multiplicação das células embriogênicas. Subseqüentemente, as células embriogênicas multiplicadas podem ser cultivadas em um meio de desenvolvimento, que promove o desenvolvimento de embriões somáticos, que podem ser adicionalmente submetidos a tratamentos de pós- desenvolvimento, tais que os tratamentos a frio. Os embriões somáticos, usados nos métodos da invenção, completaram o estágio de desenvolvimento do processo de embriogênese somático. Eles podem também ter sido submetidos a um ou mais tratamentos de pós- desenvolvimento.
As sementes manufaturadas são conjugadas através da termoligação da restrição de broto 22 ao revestimento de semente 24. O revestimento de semente 24 é então enchido com o meio nutritivo 26 e um embrião é inserido no interior da cavidade 34, na restrição de cotiledôneo 22, primeira extremidade do cotiledôneo. O material de enchimento de carvão seco 80 (seja tratado com nutriente ou tratado com não- nutriente) pode ser carregado ao interior da restrição de cotiledôneo, após o embrião ter sido inserido no interior da cavidade 34. Após o carvão ter sido adicionado, as sementes são então vedadas com uma vedação extrema secundária através de sua deposição sobre a extremidade aberta da semente e fusão das tampas à superfície com calor. As vedações extremas primárias são imersas em uma mistura de cera azul, antes da ligação à vedação extrema secundária. Isto promove uma boa ligação entre as vedações extremas primária e secundária. As sementes são então impregnadas com agentes antimicrobianos.
Uma quantidade adequada de areia estéril é preparada através do cozimento de 2 litros de areia, em uma temperatura de 375°F (190 °C) durante 24 horas. A areia é então adicionada a bandejas previamente esterilizadas e 285 ml de água são adicionados. Os sulcos são então formados e a caixa é vedada. A caixa contendo a areia é então autoclavada durante 1 hora a 1210C e sob pressão atmosférica 1.
As sementes manufaturadas são semeadas na areia e deixadas germinar. De um modo típico, as sementes manufaturadas são cultivadas sob luz contínua, em temperatura ambiente (230C) durante de quatro a cinco semanas.
EXEMPLO 4 Este exemplo mostra um método representativo da invenção para aperfeiçoar a germinação de um embrião de planta a partir de uma semente manufaturada. As sementes manufaturadas foram conjugadas como descrito no Exemplo 3, submetidas às variações abaixo descritas, e embriões de pinheiro teda foram inseridos no interior das sementes ( um embrião por semente). Em cada experimento abaixo, carvão foi adicionado ao meio básico KE64, preparado como descrito no Exemplo 1, antes da autoclavagem. A concentração de carvão no meio foi de 2,5 g/ L; 60 g/ L; ou de 100 g/L. Em alguns tratamentos, o carvão foi tratado com nutriente, tal como descrito no Exemplo 2. Em alguns tratamentos, o carvão foi tratado com não- nutriente. Após a autoclavagem, o restante dos componentes foi adicionado para preparar o Meio Completo KE64.
Duas diferentes restrições de broto, Tipo A e Tipo B, foram usadas nos tratamentos. Em alguns tratamentos, o carvão foi também adicionado à cavidade da restrição de broto. Em alguns tratamentos, o carvão adicionado à cavidade foi tratado com nutriente. Em alguns tratamentos, o carvão adicionado à cavidade não foi tratado com nutriente. Em alguns tratamentos, o carvão não foi adicionado à cavidade. As sementes foram então deixadas germinar, tal como descrito no Exemplo 3. Os tratamentos são descritos abaixo.
Restrição de broto Tipo A
Tratamento 1: Meio Completo KE64 + 2,5 g/L de carvão tratado com não- nutriente
Tratamento 2: Meio Completo KE64 + 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente
Tratamento 3: Meio Completo KE64 + 60 g/L de carvão tratado com nutriente
Tratamento 4: Meio Completo KE64 + 2,5 g/L de carvão tratado com não- nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade. Tratamento 5: Meio Completo KE64 + 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade.
Tratamento 6: Meio Completo KE64 + 60 g/L de carvão tratado com nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade.
Tratamento 7: Meio Completo KE64 + 2,5 g/L de carvão tratado com não- nutriente; e carvão tratado com não- nutriente na cavidade.
Restrição de broto Tipo B
Tratamento 8: Meio Completo KE64 + 2,5 g/L de carvão tratado com não- nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade.
Tratamento 9: Meio Completo KE64 + 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade.
Tratamento 10: Meio Completo KE64 + 60 g/L de carvão tratado com nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade.
RESULTADOS
Os dados foram coletados 28 dias após a semeadura. Vários parâmetros foram medidos de um modo a determinar os efeitos do aumento da quantidade de carvão no meio nutritivo e/ ou adicionar carvão à cavidade da restrição de broto. Os comprimentos do radículo, hipocotilo, cotiledôneos, e epicotilo foram medidos. O termo "radículo" refere-se à parte de um embrião de planta, que se desenvolve como a raiz primária da planta resultante. O termo " cotiledôneo " refere-se, de um modo genérico, ao primeiro, primeiro par, ou primeira espira (dependendo do tipo de planta ) de estruturas similares a folha sobre o embrião de planta, que funciona primariamente de um modo a produzir os compostos alimentícios na semente disponíveis para o embrião de planta, mas, em alguns casos, age como uma estrutura fotossintética ou de armazenamento de alimento. O termo " hipocotilo" refere-se à porção de um embrião de planta ou muda, localizada abaixo dos cotiledôneos, mas acima do radículo. O termo " epicotilo" refere- se à porção da haste da muda que está acima dos cotiledôneos. Os comprimentos dos órgão foram medidos em centímetros e são apresentados na Tabela 3.
A taxa de germinação foi medida e é apresentada na Tabela 4. A normalidade dos germinantes foi também determinada e é apresentada na Tabela 5. Os embriões foram examinados e classificados como normais; seria normal se inteiramente extraído a partir da cavidade; não normal; inteiramente extraído a partir da cavidade, mas não normal;e inalterado. O termo "germinante normal" ou " normalidade" denota a presença de todas as partes esperadas de uma planta no momento da avaliação. No caso de gimnoespermas, a normalidade é caracterizada pelo fato de que o radículo possua um comprimento mais do que 3mm e nenhuma má - formação visivelmente discernível, comparado à aparência de embriões germinados a partir de sementes naturais. " Não normal " significa que o tecido sobre pelo menos um órgão está intumescido e que a raiz e os cotiledôneos estão mortos. " Não- normal inteiramente extraído" significa que o germinante emergiu completamente a partir da cavidade, mas que não é normal. " Inalterado" significa que o embrião não foi alterado a partir do dia um do experimento.
Tabela 3: Comprimentos de Órgãos (medido em cm)
Tratamento Radical aO.OOOl1 Hipocotilo a=0.2788 Cotiledôneo a=0.1174 Epicotilo a=0.2074 Restrição Tipo A 1 Meio: 2,5 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade : Sem carvão 1.03b 2.02 1.16 0.43 2 Meio: 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Sem carvão 1.35b 3.81 1.26 0.43 3 Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade: Sem carvão 1.46bd 2.21 1.3 0.43 4 Meio: 2, 5 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade : Carvão tratado com nutriente 1.14b,c 1.91 1.21 Meio: 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade : Carvão tratado com nutriente 134b,c,d 2.46 1.32 0.13 6 Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade : carvão tratado com nutriente 154a,b,c,d 2.71 1.41 0.52 Tratamento Radical aO.OOOl1 Hipocotilo a=0.2788 Cotiledôneo a=0.1174 Epicotilo a=0.2074 7 Meio: 2,5 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: carvão tratado com não- nutriente Ii94AAD 2.63 1.77 0.28 Restrição Tipo B 8 Meio: 2, 5 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: carvão tratado com nutriente 1.89a3·0 2.52 1.42 0.42 9 Meio: 60 g/ L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: carvão tratado com nutriente 2.20a·0 2.88 1.47 0.16 Meio: 60 g/ L de carvão tratado com nutriente Cavidade: carvão tratado com nutriente 2.32a 2.62 1.55 0.16
1 significa seguido pela mesma letra não significativamente diferente
Tabela 4: Taxa de Germinação
Tratamento Acima1 a=0,1310 Parcial2 a=0,6100 Abaixo3 a=0,0022 Invertida4 a=0,3457 Restrição Tipo A 1 Meio: 2,5 g/ L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Sem carvão 13,9% 19,4% 55,6% 8,3% 2 Meio: 60 g/ L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Sem carvão 41,7% 22,2% 27,8% 5,6% 3 Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade: Sem carvão 36,1% 11,1% 44,4% 2,8% 4 Meio: 2, 5 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 11,1% 8,3% 77,8% 0% Meio: 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 22,2% 16,7% 55,6% 5,6% 6 Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade: carvão tratado com nutriente 19,4% 16,7% 61,1% 0% 7 Meio: 2,5 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: carvão tratado com não nutriente 30,6% 33,3% 30,6% 2,8% Restrição Tipo B 8 Meio: 2,5 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade : carvão tratado com nutriente 38,9% 27,8% 30,6% 0% 9 Meio: 60 g/L de carvão tratado com não- nutri entes Cavidade : Carvão tratado com nutriente 36,1% 25% 36,1% 2,8% Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade : Carvão tratado com nutriente 33,3% 25% 36,1% 2,8%
1 "Acima" significa cotiledôneos e hipocotilo acima do solo
2 "Parcial" significa algum tecido verde aparecendo acima do solo
3 "Abaixo" significa nada aparecendo acima do solo
4 "Invertido" significa que a raiz morreu e que o hipocotilo está voltado para cima ao interior do ar.
Tabela 5: Normalidade
Tratamento Normal a=0,0206 Seria normal se inteirament e extraído a=0,1325 Não normal a=0,6576 Inteiramente extraído, não normal a=0,4540 Inalterado a=0,1064 Restrição Tipo A Seria normal se Inteiramente inteirament Não extraído, não Tratamento Normal e extraído normal normal Inalterado <x=0,0206 a=0,1325 a=0,6576 a=0,4540 a=0,1064 2,5 g/L de carvão tratado 1 com não- nutriente Cavidade: Sem carvão 13,9% 5,6% 27,8% 5,6% 44,4% Meio: 60 g/ L de carvão 2 trado com não- nutriente Cavidade: Sem carvão 36,1% 19,4% 25% 0% 19,4% Meio: 60 g/L de carvão 3 tratado com nutriente Cavidade: Sem carvão 36,1% 5,6% 25% 0% 27,8% Meio: 2,5 g/ L de carvão 4 tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 8,3% 8,3% 25% 0% 58,3% Meio: 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 16,7% 8,3% 36,1% 0% 36,1% Meio: 60 g/L de carvão 6 tratado com nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 16,7% 13,9% 16,7% 0% 50% Meio: 2, 5 g/L de carvão 7 tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com não- nutriente 33,3% 22,2% 19,4% 2,8% 22,2% Restrição Tipo B Meio: 2,5 g/L de carvão 8 tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado 36,1% 16,7% 13,9% 0% 27,8% com nutriente Meio: 60 g/ L de carvão 9 tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 41,7% 8,3% 13,9% 2,8% 33,3% Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 27,8% 30,6% 16,7% 0% 25%
Os dados nas Tabelas 3, 4 e 5 mostram, de um modo geral,
um aumento no comprimento do órgão, taxa de germinação e normalidade em embriões germinados a partir de uma semente manufaturada, na qual o meio nutritivo inclui um alto nível de carvão (60 g/L contra 2,5 g/L).
EXEMPLO 5
Este exemplo mostra um método representativo da invenção para aperfeiçoar a germinação de um embrião de planta a partir de uma semente manufaturada. As sementes manufaturadas são montadas tal como descrito no Exemplo 3, submetidas às variações abaixo descritas, e embriões de pinheiro teda zigóticos são inseridos no interior das sementes (um embrião por semente). Em cada tratamento abaixo, carvão foi adicionado ao Meio Básico KE64, preparado como descrito no Exemplo 1, antes da autoclavagem. A concentração de carvão no meio foi de 0 g/L; 60 g/L ou de 100 g/L. Em alguns tratamentos, o carvão foi tratado com nutriente, preparado como descrito no Exemplo 2. Em alguns tratamentos, o carvão não foi tratado com nutriente. Após a autoclavagem, o restante dos componentes foi adicionado, de um modo a preparar o Meio Completo KE64.
Apenas as restrições de broto Tipo B foram usadas nos tratamentos. Em todos os tratamentos, o carvão tratado com nutriente foi adicionado à cavidade na restrição de broto. As sementes foram então deixadas germinar, tal como descrito no Exemplo 3. Os tratamentos são descritos abaixo.
Tratamento 1: Meio Completo KE64; e
Carvão tratado com nutriente na cavidade
Tratamento 2: Meio Completo KE64 + 60 g/L de carvão tratado com não nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade.
Tratamento 3: Meio Completo KE64 + 60 g/L de carvão tratado com nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade.
Tratamento 4: Meio Completo KE64 + 100 g/L de carvão tratado com não- nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade.
Tratamento 5: Meio Completo KE64 + 100 g/L de carvão tratado com nutriente; e carvão tratado com nutriente na cavidade. RESULTADOS
Os dados foram coletados em 41 dias após a semeadura. Vários parâmetros foram medidos de um modo a determinar os efeitos do aumento da quantidade de carvão no meio nutritivo e da adição de carvão à cavidade da restrição de broto. Os comprimentos do órgão foram medidos e a taxa de germinação e a normalidade foram determinados. Os termos são definidos como no Exemplo 4. Os comprimentos de órgão são apresentados na Tabela 6, a taxa de germinação é apresentada na Tabela 7, e a normalidade é apresentada na Tabela 8.
r
Tabela 6: Comprimentos de Órgão (medidos em cm)
Tratamento Radical a=0,0200 Hipocotilo a=0,0192 Cotiledôneo a=0,1183 Epicotilo a=0,0415 1 Meio: Sem carvão Cavidade : Carvão tratado com nutriente 1,95b 2,41® 1,44 0,37® 2 Meio: 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: carvão tratado com nutriente 2,57a® 2,62a® 1,55 0,43a® 3 Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade : Carvão tratado com nutriente 2,74a® 2,98a 1,69 0,41a® 4 Meio: 100 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade : Carvão tratado com nutriente 2,56a® 2,78a® 1,75 0,62a Meio: 100 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade : Carvão tratado com nutriente 2,99a 2,70a® 1,61 0,50a®
Tabela 7: Taxa de Germinação
Tratamento Acima a=0,0345 Parcial a=0,0192 Abaixo a=0,1183 Invertido a=0,0415 1 Meio: Sem carvão Cavidade: Carvão tratado com nutriente 57,4%® 22,4% 10% 10,2%A 2 Meio: 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 57,1%® 31,4% 10% 1,4%b 3 Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 77,6%a 15,7%A 5,2% 1,4%® 4 Meio: 100 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: carvão tratado com nutriente 58,6%^ 34,3% 4,3% 2,9%B Meio: 100 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade: carvão tratado com nutriente 12,5%m 20,3% 4,3% 2,9%®
Tabela 8: Normalidade
Tratamento Normal a=0,0345 Seria normal se inteiramente extraído a=0,0192 Não normal a=0,1183 Inalterado a=0,0415 1 Meio: Sem carvão Cavidade: Carvão tratado com nutriente 65,9%® 8,3% 20,8% 5,6% 2 Meio: 60 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 72,9%^ 8,6% 12,9% 5,7% 3 Meio: 60 g/L de carvão tratado com nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 80.5%ab 10,0%A 6,7% 2,9% 4 Meio: 100 g/L de carvão tratado com não- nutriente Cavidade: Carvão tratado com nutriente 72,9%ab 17,1% 8,6% 0,0% Meio: 100 g/ L de carvão tratado com nutriente 84,3%a 7,1% 4,3% 4,3% Tratamento Normal a=0,0345 Seria normal se inteiramente extraído a=0,0192 Não normal α=0,1183 Inalterado a=0,0415 Cavidade: Carvão tratado com nutriente
Os dados nas Tabelas 6, 7 e 8 mostram um aumento no
comprimento do órgão, taxa de germinação e normalidade em embriões germinados a partir de uma semente manufaturada, na qual o meio nutritivo inclui um alto nível de carvão (60 g/L contra 0 g/L). Os dados na Tabela 7 também mostram uma taxa diminuída de germinantes "invertidos" à medida em que a quantidade de carvão no meio é aumentada.
EXEMPLO 6
Este exemplo mostra um método representativo da invenção para aperfeiçoar a germinação de um embrião de planta a partir de uma semente manufaturada. As sementes manufaturadas foram montadas como descrito no Exemplo 3, submetidas às variações abaixo descritas, e embriões de pinheiro teda zigóticos foram inseridos no interior das sementes (um embrião por semente). Em cada experimento abaixo, carvão foi adicionado ao Meio Básico KE64, preparado como descrito no Exemplo 1, antes da autoclavagem. O meio Básico foi conduzido ao volume antes da adição do carvão. A concentração de carvão no meio foi de 0 g/ L; 3 g/L; 30 g/L; 50 g/L; 60 g/L; 75 g/L; ou de 100 g/L. Em todos os experimentos, o carvão foi tratado com nutriente, preparado como descrito no Exemplo 2, com a exceção de que não foi adicionada sacarose ao Meio Básico KE64 quando da preparação do carvão tratado com nutriente para este experimento. Após a autoclavagem, o restante dos componentes foi adicionado, de um modo a preparar o Meio Completo (II), que difere do Meio Completo KE64 pelo fato de que a concentração de sacarose é de 63,5 g/ L.
Apenas as restrições de broto do Tipo A foram usadas nos experimentos. Em todos os tratamentos, o carvão tratado com nutriente foi adicionado à cavidade na restrição de broto. As sementes foram então deixadas germinar, tal como descrito no Exemplo 3. Os tratamentos são descritos abaixo. Cada tratamento foi executado, em média, com 60 sementes por tratamento.
Tratamento 1: Meio Completo KE64 (II) + 100 g/ L de carvão tratado com nutriente
Tratamento 2: Meio Completo KE64 (II) + 75 g/L de carvão tratado com nutriente
Tratamento 3: Meio Completo KE64 (II) + 60 g/L de carvão tratado com nutriente
Tratamento 4: Meio Completo KE64 (II) + 50 g/L de carvão tratado com nutriente
Tratamento 5: Meio Completo KE64 (II) + 30 g/ L de carvão tratado com nutriente
Tratamento 6: Meio Completo KE64 (II) + 3 g/L de carvão tratado com nutriente
Tratamento 7: Meio Completo KE64 (II) + 0 g/L de carvão tratado com nutriente
RESULTADOS
Os dados foram coletados em 19, 26, e 35 dias após a semeadura. Vários parâmetros foram medidos de um modo a determinar os efeitos do aumento da quantidade de carvão no meio nutritivo e da adição de carvão à cavidade da restrição de broto. Os comprimentos do órgão foram medidos e a taxa de germinação e a normalidade foram determinadas. Os termos são definidos como no Exemplo 4. A taxa de germinação é apresentada nas FIGURAS 2 e 3; os comprimentos dos órgão são apresentados na FIGURA 4; e a incidência de normalidade é apresentada na FIGURA 5.
No dia 19, os embriões nas sementes com um conteúdo de carvão mais alto no meio nutritivo apresentaram uma germinação mais rápida do que as sementes com carvão mais baixo (FIGURA 2). No dia 26, as sementes com um conteúdo de carvão mais alto mantiveram uma taxa de germinação mais rápida
(FIGURA 3). Em adição, os comprimentos do órgão foram, de um modo geral, maiores nos embriões nas sementes com carvão maior no meio nutritivo (FIGURA 4). Finalmente, os dados de normalidade apresentaram uma maior incidência de germinantes normais a partir dos embriões nas sementes com carvão mais alto no meio nutritivo (FIGURA 5). De um modo inverso, os embriões inativos e os germinantes que seriam normais se inteiramente extraídos, aumentaram com a diminuição de carvão. Estes dados sugerem que o carvão aumentado no meio nutritivo provê um desempenho aperfeiçoado para os embriões na semente manufaturada.
Embora a modalidade preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, será apreciado que várias alterações podem ser introduzidas nesta, sem que haja afastamento do espírito e do escopo da invenção.

Claims (20)

1. Semente manufaturada, caracterizada pelo fato de compreender: (a) um revestimento de semente; (b) um meio nutritivo, que compreende um material adsorvente, em que o material adsorvente está presente no meio em uma concentração de cerca de 30 g/L a cerca de 100 g/L; e (c) uma restrição de broto, em que a restrição de broto compreende uma cavidade.
2. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o material adsorvente é o carvão, polivinil polipirrolidona, ou géis de sílica.
3. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o material adsorvente é o carvão.
4. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o carvão está presente no meio em uma concentração de cerca de 50g/L a cerca de lOOg/L.
5. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o carvão é tratado com nutriente.
6. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o carvão é tratado com não- nutriente.
7. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda um embrião de planta disposto na cavidade da restrição de broto.
8. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender ainda um material adsorvente no interior da cavidade da restrição de broto.
9. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o material adsorvente no interior da cavidade é o carvão.
10. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o carvão é tratado com nutriente.
11. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o carvão é tratado com não- nutriente.
12. Método para a germinação de um embrião de planta a partir de uma semente manufaturada, caracterizado pelo fato de compreender: (a) montagem de uma semente manufaturada, que compreende um revestimento de semente e uma restrição de broto, em que a restrição de broto compreende uma cavidade; (b) adição de um meio nutritivo, que compreende um material adsorvente, em que o material adsorvente está presente no meio em uma concentração de a partir de cerca de 30 g/L a cerca de 100 g/L, ao revestimento de semente; (c) colocação de um embrião de planta no interior da cavidade da restrição de broto; e (d) cultura da semente manufaturada, sob condições adequadas para a germinação do embrião de planta.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o material adsorvente é o carvão, polivinil pirrolidona, ou géis de sílica.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o material adsorvente é o carvão.
15. Método de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato de que o carvão é tratado com nutriente.
16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o carvão é tratado com não- nutriente.
17. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de compreender ainda a adição de um material adsorvente à cavidade da restrição de broto.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o material adsorvente, adicionado à cavidade, é carvão, polivinil polipirrolidona, ou géis de sílica.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o material adsorvente adicionado à cavidade é o carvão.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o carvão adicionado à cavidade é tratado com nutriente.
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