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BRPI1009138B1 - Promotor prematuro-tardio otimizado combinado com vacinação repetida favorece resposta de célula citotóxica contra antígenos em vacinas de vírus recombinante deficiente em replicação - Google Patents

Promotor prematuro-tardio otimizado combinado com vacinação repetida favorece resposta de célula citotóxica contra antígenos em vacinas de vírus recombinante deficiente em replicação Download PDF

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BRPI1009138B1
BRPI1009138B1 BRPI1009138-6A BRPI1009138A BRPI1009138B1 BR PI1009138 B1 BRPI1009138 B1 BR PI1009138B1 BR PI1009138 A BRPI1009138 A BR PI1009138A BR PI1009138 B1 BRPI1009138 B1 BR PI1009138B1
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BR
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mva
cell response
virus
promoter
Prior art date
Application number
BRPI1009138-6A
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English (en)
Inventor
Kay Brinkmann
Karen Baur
Jürgen Hausmann
Original Assignee
Bavarian Nordic A/S
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Publication date
Application filed by Bavarian Nordic A/S filed Critical Bavarian Nordic A/S
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Abstract

PROMOTOR PREMATUROTARDIO OTIMIZADO COMBINADO COM VACINAÇÃO REPETIDA FAVORECE REPOSTA DE CÉLULA CITOTÓXICA CONTRA ANTÍGENOS EM VACINAS DE VÍRUS RECOMBINANTE DEFICIENTE EM REPLICAÇÃO" A presente invenção refere-se a um vírus recombinante deficiente em replicação que codifica pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico, em que a expressão do antígeno e/ou epítopo antigênico é regulada por um elemento de controle de transcrição que compreende pelo menos dois elementos que acionam expressão prematura do antígeno e/ou epítopo antigênico e o uso do vírus recombinante deficiente em replicação como medicamento ou vacina.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um vírus recombinante deficiente em replicação que codifica pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico, em que a expressão do antígeno e/ou epítopo antigênico é regulada por um elemento de controle de transcrição compreendendo pelo menos dois elementos que acionam expressão prematura do antígeno e/ou epítopo antigênico e o uso do vírus recombinante deficiente em replicação como medicamento ou vacina.
Antecedentes da invenção
[0002] Vacinas de replicação atenuadas vivas, em vez de preparados inativados, forneceram a proteção mais eficaz contra infecção viral e doença. Essas vacinas eliciam imunidade de proteção de vida essencialmente longa. Ao contrário, imunidade induzida por vacinas de subunidade ou inativadas é genericamente de duração mais limitada. Um fator chave na busca das abordagens mencionadas por último é a segurança. Uma visão geral de vetores virais de replicação e não replicação para desenvolvimento de vacina é dada na publicação de Marjorie Robert-Guroff, Replicating and Non-replicating viral vectors for vaccine development, Curr. Opin. Biotechnol. 18:546-556, 2007.
[0003] Vírus recombinantes são amplamente utilizados para expressar antígenos estranhos em células infectadas. Especificamente, poxvirus recombinantes são atualmente testados como vacinas promissoras para induzir uma resposta imune contra um antígeno estranho expresso a partir do vetor poxvirus. São mais populares avipoxvirus por um lado e vírus de vacínia (VACV) por outro lado. US 5,736,368 e US 6,051,410 revelam cepa de vírus de vacina recombinante Wyeth que expressa antígenos HIV e proteínas. US 5,747,324 revela uma cepa de VACV recombinante NYCBH que expressa genes de lentivirus. EP 0 243 029 revela uma cepa VACV recombinante Western Reserve que expressa genes de retrovírus humano. Para a expressão de genes heterólogos em poxvirus vários promotores são conhecidos pela pessoa versada na técnica, como os promotores 30K e 40K (vide, por exemplo, US 5,747,324), um promotor prematuro/tardio sintético forte (vide, por exemplo, Sutter e outros, A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia vírus stimulates protective immunity in mice to influenza virus, Vaccine 12, 1032-40, 1994), o promotor p7.5 (vide, por exemplo, Endo e outros, Homotypic and heterotypic protection against influenza vírus infection in mice by recombinant vaccinia vírus expressing the haemagglutinin or nucleoprotein of influenza vírus, J. Gen. Virol. 72, 699-703, 1991) e o promotor derivado do gene de inclusão do tipo A (ATI) de vírus de vacínia (Li e outros, high-level expression of Amsacta moorei entomopoxvirus spheroidin depends on sequences within the gene, J. Gen. Virol. 79, 613, 1998). Todos esses promotores foram utilizados em VACV recombinante para expressar genes heterólogos e foram mostrados expressar os genes de forma muito eficiente resultando em quantidades relativamente elevadas da proteína codificada pelo gene heterólogo. Em geral, para muitas abordagens de vacinação é altamente desejável que o antígeno contra o qual uma resposta imune deve ser induzida seja expresso em quantidades elevadas.
[0004] A indução de uma resposta imune celular e humoral forte contra um produto de gene estranho expresso, por exemplo, por um vetor VACV é impedida pelo fato de que o produto de gene estranho tem de competir com todos os mais de 150 antígenos do vetor VACV para reconhecimento e indução de anticorpos específicos e células T. Imunodominância de epítopos de célula T CD8 de vetor evita indução de uma resposta de célula T CD8 forte contra o produto de gene estranho. (Smith e outros, Immunodominance of poxviral- specific CTL in a human trial of recombinant-modified vaccinia Ankara. J. Immunol. 175:8431-8437, 2005). Isso se aplica à replicação de vetores VACV como Dryvax, bem como a vetores deficientes em replicação como NYVAC e vírus de Vacínia modificada Ancara, MVA.
[0005] Para expressão de um antígeno recombinante por promotores específicos de poxvirus VACV porém não promotores eucarióticos comuns podem ser utilizados. O motivo para isso é a biologia específica de poxvirus que replicam no citoplasma e trazem sua própria maquinaria de transcrição autônoma de células com eles que não reconhece promotores eucarióticos típicos.
[0006] O ciclo de replicação viral é dividido em duas fases principais, uma fase inicial compreendendo as duas primeiras horas após infecção antes de replicação de DNA, e uma fase tardia começando no início de replicação de DNA viral em 2-4 horas após infecção. A fase tardia cobre o resto do ciclo de replicação viral a partir de ~2-20h após infecção até que o vírus de progênie seja liberado da célula infectada. Há diversos tipos de promotor poxviral que são distinguidos e nomeados pelo período de tempo no ciclo de replicação viral no qual são ativos, por exemplo, promotores prematuro e tardio. (vide, por exemplo, Davison e Moss, Structure of Vaccinia Virus Late Promotors, J. Mol. Biol. 210:771-784, 1989; Davison e Moss, Structure of Vaccinia Virus Early Promotors, J. Mol. Biol. 210:749-769, 1989; e Hirschmann e outros, Mutational Analysis of a Vaccinia Virus Intermediate Promotor in vitro and in vivo, Journal of Virology 64:6063-6069, 1990, todos os quais são pelo presente incorporados a título de referência).
[0007] Embora promotores prematuros também possam ser ativos posteriormente em infecção, a atividade de promotores tardios é confinada à fase posterior. Uma terceira classe de promotores, nomeados promotores intermediários, é ativa na transição de fase prematura para tardia e depende de replicação de DNA viral. O último também se aplica a promotores tardios, entretanto, a transcrição de promotores intermediários começa mais cedo do que de promotores tardios típicos e exige um conjunto diferente de fatores de transcrição.
[0008] Tornou-se cada vez mais claro durante os últimos anos que a escolha da classe temporal de promotor poxviral para expressão de antígeno tem efeitos profundos sobre a resistência e qualidade da resposta imune específica de antígeno. Foi mostrado que as respostas de célula T contra antígenos expressos sob o controle de um promotor tardio são mais fracas do que aquelas obtidas com o mesmo antígeno sob o controle de um promotor prematuro. (Bronte e outros, Antigen expression by dendritic cells correlates with the therapeutic effectiveness of a model recombinant poxvirus tumor vaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 94:3183-3188, 1997; Coupar e outros, Temporal regulation of influenza hemagglutinin expression in vaccinia virus recombinants and effects on the immune response. Eur. J. Immunol. 16:14791487, 1986).
[0009] Ainda mais surpreendente, foi mostrado que em imunizações autólogas repetidas com VACV bem como com o MVA de vetor VACV defeituoso em replicação, recordação de respostas de célula T CD8 contra antígenos sob o controle de um promotor exclusivamente tardio podem falhar totalmente. Essa falha resultou em uma resposta de célula T CD8 específica de antígeno quase não detectável após a segunda imunização (Kastenmuller e outros, Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. J. Exp. Med. 204:2187-2198, 2007.)
[0010] Desse modo, a expressão prematura de antígenos por vetores VACV parece ser crucial para respostas de célula T CD8 específicas de antígeno eficientes. Foi mostrado também que um antígeno de vetor VACV expresso prematuramente não somente compete com antígenos expressos tardiamente como também com outros antígenos prematuros para imunodominância na resposta de célula T CD8 (Kastenmuller e outros, Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. J. Exp. Med. 204:2187-2198, 2007). As propriedades específicas da porção prematura do promotor poxviral poderiam ser desse modo importantes para indução de uma resposta de célula T específica de antígeno. Além disso, é uma visão comumente tida e uma regra geral que quantidades mais elevadas de antígeno são benéficas para indução de respostas imunes específicas de antígeno mais fortes (para o campo de poxvirus, vide, por exemplo, Wyatt e outros, Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ancara HIV vaccines. Vaccine 26:486-493, 2008).
[0011] Um promotor que combina 4 elementos promotores prematuros e um elemento promotor tardio do gene ATI foi descrito anteriormente e foi mostrado como orientando expressão de antígeno prematuro aumentada (Funahashi e outros, Increased expression in vivo and in vitro of foreign genes directed by A-type inclusion body hybrid promotors in recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 65:5584-5588, 1991; Wyatt e outros, Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines. Vaccine 26:486-493, 2008). Respostas de célula T induzidas por um antígeno acionado por tal promotor em um vetor de vírus de vacínia competente de replicação recombinante foram analisadas após uma única imunização e verificou-se, entretanto, que eram somente levemente diferentes daquelas obtidas com o promotor p7.5 clássico nesse cenário. (Funahashi e outros, 1991).
[0012] Jin e outros (Constructions of vaccinia virus A-type inclusion body protein, tandemly repeated mutant 7.5 kDa protein, and hemagglutinin gene promotors support high levels of expression, Arch. Virol. 138:315-330, 1994) relataram a construção de promotores que abrigam VACV recombinante consistindo em um promotor ATI VACV combinado com repetições tandem (2 a 38 cópias) de um promotor p7.5 operativamente ligado ao gene CAT. Até 10-15 repetições do promotor p7.5 mudado pareciam ser eficazes em aumentar a expressão de gene prematuro. Entretanto, com todas as construções, a quantidade de proteína de CAT produzida na presença de arabinoside citosina (AraC) (isto é, quando o ciclo de replicação viral foi detido na fase prematura) era somente menos do que um décimo da quantidade produzida na ausência de AraC, indicando que embora expressão de gene prematura fosse aumentada, grande parte do antígeno expresso era obviamente produzida durante a fase tardia de infecção.
[0013] Por conseguinte, há necessidade de vetores virais aperfeiçoados que permitem expressão prematura de antígenos estranhos e indução de uma resposta imune específica de antígeno forte.
Sumário da invenção
[0014] A presente invenção refere-se a um vírus recombinante deficiente em replicação que codifica pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico, em que a expressão do antígeno e/ou epítopo antigênico é regulada por um elemento de controle de transcrição compreendendo pelo menos dois elementos que acionam a expressão prematura do antígeno e/ou epítopo antigênico.
[0015] A invenção refere-se ainda a vírus recombinante deficiente em replicação para uso como medicamento ou vacina e seu uso para a preparação de um medicamento ou vacina.
[0016] Em outro aspecto a presente invenção refere- se a uma composição farmacêutica ou vacina compreendendo o vírus recombinante deficiente em replicação e, opcionalmente, um veículo, diluente, adjuvante e/ou aditivo farmaceuticamente aceitável.
[0017] A invenção também se refere a vírus recombinante deficiente em replicação ou a composição farmacêutica ou vacina para induzir uma resposta de célula T em um hospedeiro para pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico.
[0018] Em um aspecto adicional refere-se ao uso do vírus recombinante deficiente em replicação ou composição farmacêutica ou vacina para a preparação de um medicamento para induzir uma resposta de célula T em um hospedeiro para pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico.
[0019] A invenção também abrange um kit que compreende pelo menos dois frascos para imunização inicial/reforço compreendendo o vírus recombinante deficiente em replicação para uma primeira inoculação (“inoculação de sensibilização”) em um primeiro frasco/recipiente e para pelo menos uma segunda e/ou terceira inoculação e/ou inoculação adicional (“inoculação de reforço”) em um segundo frasco/recipiente e/ou frasco/recipiente adicional.
[0020] A invenção refere-se ainda a um método de induzir uma resposta de célula T, preferivelmente uma resposta de célula T CD8, em um hospedeiro, incluindo um ser humano, o método compreendendo pelo menos três ou pelo menos quatro administrações do vírus recombinante deficiente em replicação para o hospedeiro.
[0021] Também é abrangido pela presente invenção um promotor que compreende pelo menos 2 elementos de sequência de nucleotídeo de acordo com nt48-81 da SEQ ID NO: 1 e/ou pelo menos 2 elementos de sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade para nt 48-51 da SEQ ID NO: 1.
Descrição detalhada da invenção
[0022] A presente invenção refere-se a um vírus recombinante deficiente em replicação que codifica pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico, em que a expressão do antígeno e/ou epítopo antigênico é regulada por um elemento de controle de transcrição que compreende pelo menos dois elementos acionando expressão prematura do antígeno e/ou epítopo antigênico.
[0023] Verificou-se surpreendentemente que com vírus recombinantes deficientes em replicação a expressão de um antígeno regulado por um elemento de controle de transcrição compreendendo pelo menos dois elementos acionando expressão prematura ocorreu significativamente mais cedo no ciclo de replicação viral e foi também significativamente mais elevado em qualquer ponto de tempo dado após infecção do que expressão acionada por um elemento de controle de transcrição convencional. Adicionalmente, a vantagem em expressão de antígeno prematuro forte persiste mesmo até pelo menos 6 h após infecção.
[0024] Por conseguinte, em uma modalidade preferida da presente invenção, pelo menos dois elementos acionam expressão prematura imediata do antígeno e/ou epítopo antigênico, isto é, na primeira hora após infecção, preferivelmente nos 30 primeiros minutos após infecção.
[0025] A capacidade de um antígeno expresso muito cedo sob controle do elemento de controle de transcrição de acordo com a invenção em superar antígenos prematuros derivados de vetor durante recordação de respostas foi pesquisada por administrar o vírus recombinante deficiente em replicação e subsequente determinação de respostas de célula T. A imunização resultou inesperadamente em respostas de célula T específicas de antígeno altamente eficientes, em particular em respostas de célula T CD8. Ainda mais surpreendente, em alguns dos experimentos, essa abordagem foi até mesmo capaz de reverter hierarquia de imunodominância e converter um epítopo de célula T CD8 subdominante no epítopo imunodominante. Esse resultado não podia ser obtido com elementos de controle de transcrição convencionais mesmo após quatro imunizações consecutivas. Além disso, a reposta de célula T CD8 específica de antígeno após três ou mais cursos de imunização com os vírus de acordo com a presente invenção foi mais forte do que com um elemento de controle de transcrição convencionalmente utilizado.
[0026] Além desses resultados surpreendentes associados ao uso de vírus recombinante deficiente em replicação de acordo com a presente invenção, efeitos colaterais indesejáveis possíveis, como a indução de doença no hospedeiro são reduzidos a um mínimo, desse modo tornando o uso de vírus recombinante deficiente em replicação como descrito aqui altamente vantajoso, vis-à-vis o uso de vírus recombinante competente em replicação.
[0027] Como utilizado aqui, os termos “antígeno” ou “epítopo antigênico” são utilizados para se referir a uma sequência que é especificamente reconhecida ou especificamente ligada por um componente do sistema imune. Genericamente, um antígeno de proteína é altamente variável em tamanho e é reconhecido no contexto de uma molécula MHC/HLA à qual um fragmento do antígeno de proteína é ligada em uma célula que apresenta antígeno. Desse modo, normalmente, o termo “antígeno” se refere a uma sequência (mais longa), em particular uma sequência de aminoácidos (mais longa) ou sequência de proteína, ao passo que a frase “epítopo antigênico” abrange uma sequência (mais curta), em particular um trecho de aminoácido ou um peptídeo, respectivamente, que ainda elicia uma resposta imune.
[0028] Preferivelmente, o antígeno e/ou epítopo antigênico é um antígeno de câncer ou um antígeno e/ou epítopo antigênico de um agente infeccioso, preferivelmente selecionado de virus, fungos, organismos eucarióticos e procarióticos unicelulares patogênicos, e organismos parasíticos.
[0029] Exemplos particularmente preferidos de antígenos de virus apropriados para uso na presente invenção compreendem antígenos de retrovírus (incluindo HIV-1 e HTLV), vírus de herpes (incluindo citomegalovirus), flavivivurs (incluindo vírus da dengue), ortomixovirus, paramixovirus (incluindo virus de sarampo, vírus de caxumba, vírus sincicial respiratório), togavirus (incluindo vírus de rubéola), vírus de hepatite, hepadnavirus, vírus de influenza, picornavirus (incluindo como poliovirus), coronavirus, buniavirus, arenavirus, filovirus ou de outros vírus que causam febre hemorrágica.
[0030] Os exemplos de antígenos de câncer preferidos incluem antígeno específico de próstata (PSA), antígeno de fosfatase de ácido prostático (PAP) e antígenos Her-2/neu.
[0031] Antígenos bacterianos preferidos incluem antígenos de antrax.
[0032] Como utilizado aqui, o termo “vírus recombinante” se refere a qualquer vírus que compreende um acido nucléico heterólogo adicional que não faz parte naturalmente do genoma viral como, por exemplo, um promotor de acordo com a presente invenção. O promotor pode regular expressão de um antígeno próprio viral ou epítopo antigênico e/ou pode regular expressão de um gene heterólogo ou recombinante. Um gene recombinante ou heterólogo pode ser, por exemplo, um gene codificando um antígeno viral, bacteriano, fúngico ou de câncer, um gene terapêutico, um gene codificando para um peptídeo que compreende pelo menos um epítopo para induzir uma resposta imune. Exemplos adicionais para genes heterólogos compreendem um cassete de expressão de anti-sentido ou um gene de ribozima.
[0033] Como utilizado aqui, o termo “vírus deficiente em replicação” indica vírus que somente têm capacidade reduzida ou até mesmo perderam sua capacidade de replicar de forma reprodutiva em células hospedeiras. Preferivelmente, os vírus deficientes em replicação de acordo com a presente invenção compreendem vírus que não replicam nas células do hospedeiro, em particular em células humanas, e que são, desse modo incompetentes em replicação. Entretanto, também aqueles vírus estão compreendidos no escopo da presente invenção que mostram uma atividade de replicação residual menor que é controlada pelo sistema imune do hospedeiro.
[0034] Além disso, os vírus utilizados de acordo com a presente invenção são preferivelmente capazes de infectar a célula hospedeira, porém não são substancialmente capazes ou não são de modo algum capazes de produzir vírus de progênie infecciosa nas células infectadas.
[0035] Vírus que são “capazes de infectar células” são vírus que abrigam na superfície viral estruturas capazes de interagir com as células hospedeiras até tal ponto que o vírus ou pelo menos o genoma viral é absorvido na célula hospedeira.
[0036] No contexto da presente invenção o termo “vírus não capaz de produzir vírus de progênie infecciosa nas células” se refere a vírus cujo genoma é pelo menos parcialmente transcrito e traduzido em proteínas virais ou mesmo replicado, entretanto, não acondicionado em partículas virais infecciosas. Desse modo, os vírus utilizados de acordo com a presente invenção são vírus que levam a infecções abortivas no hospedeiro. Infecções abortivas podem ocorrer por dois motivos: de acordo com a primeira alternativa uma célula pode ser suscetível à infecção porém pode ser não permissiva para multiplicação do vírus, por exemplo, devido ao fato de que nem todos os genes virais são expressos em uma forma necessária para multiplicação do vírus na célula. Um exemplo para esse tipo de vírus de acordo com a presente invenção em células humanas é vírus de Vacínia modificada Ancara (MVA), que é explicado em mais detalhe abaixo. De acordo com a segunda alternativa uma infecção abortiva também pode resultar da infecção de células com vírus defeituosos, que não têm um complemento total de genes virais. Um exemplo para tal vírus de acordo com a presente invenção para células humanas é DISC-HSV1 (vírus de Herpes simplex de ciclo único incapacitado), isto é, um vírus de Herpes simplex que é restrito a um único ciclo de infecção (Dilloo e outros, A novel herpes vector for the hgih-efficiency transduction of normal and malignant human hematopoietic cells, Blood 89: 119-127, 1997). Esse vírus não tem o gene para a glicoproteína essencial H (gH), porém pode ser crescida a títulos elevados em uma linhagem de célula de complementação que expressa gH. Em linhagens de célula não de complementação que são permissivas para crescimento de vírus de herpes, é restrito a um único ciclo de replicação, levando à liberação de vírus não infeccioso.
[0037] Os vírus de acordo com a presente invenção são preferivelmente capazes de serem replicados pelo menos em um tipo de células de pelo menos uma espécie de animal. Desse modo, é possível amplificar o vírus antes da administração ao hospedeiro que deve ser vacinado e/ou tratado. Como exemplo, referência é feita a MVA que pode ser amplificado em células CEF porém que não é capaz de produzir vírus de progênie infecciosas em células humanas.
[0038] Modalidades preferidas de vírus deficientes em replicação apropriados para uso de acordo com a presente invenção incluem vírus de origem adenoviral, herpes viral e poxviral. Os exemplos para um adenovírus deficiente em replicação apropriados para uso na presente invenção incluem um adenovírus humano defeituoso em replicação deficiente em E1 como descrito em Sharpe et al., Single oral immunization with replication deficient recombinant adenovirus elicits long-lived transgene-specific cellular and humoral immune response, Virology 293, 210-216, 2002. Um exemplo para um Herpesvirus deficiente em replicação apropriado para uso no contexto da presente invenção inclui DISC-HSV1 que já foi mencionado acima.
[0039] Em uma modalidade preferida, o vírus recombinante deficiente em replicação é um poxvirus, como, por exemplo, um avipoxvirus ou ortopoxvirus, como vírus de vacínia.
[0040] Os exemplos para avipoxvirus apropriados para uso na presente invenção incluem quaisquer avipoxvirus como Fowlpoxvirus, Canarypoxvirus, Uncopoxvirus, Mynahpoxvirus, Pigeonpoxvirus, Psittacinepoxvirus, Quailpoxvirus, Peacockpoxvirus, Penguinpoxvirus, Sparrowpoxvirus, Starlingpoxvirus e Turkeypoxvirus. Avipoxviruses preferidos são Canarypoxvirus e Fowlpoxvirus. Avipoxviruses são naturalmente restritos em hospedeiro e replicam de forma produtiva somente em células e espécies de aves (Taylor e outros, Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabies recombinant, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species, Vaccine 13 :539-549, 1995). Se células humanas forem infectadas com um avipoxvirus, genes heterólogos são expressos a partir do genoma viral. Entretanto, o avipoxvirus não replica nas células humanas e desse modo, não há risco de que o ser humano seja prejudicado por replicação de vírus produtivo. Vários avipoxvirus recombinantes foram construídos que expressam, por exemplo, produtos de gene lentiviral (US 5,766,598), antígenos associados à citocinas e/ou tumor (US 5,833,975) ou glicoproteína de raiva G ((Taylor e outros, Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabies recombinant, ALVAC-RG (vCP65) in nonavian species, Vaccine 13: 539-549, 1995). Um canarypoxvirus recombinante que expressa os quatro genes HIV gag, pol, env e nef já foi utilizado em experimentos clínicos (Peters, B. S., The basis for HIV immunotherapeutic vaccines, Vaccine 20: 688-705, 2001). Uma vez que avipoxvirus replicam de forma produtiva somente em células de aves, essas células têm de ser utilizadas para a amplificação do vírus e para a geração de vírus recombinante.
[0041] Um exemplo para um canarypoxvirus é cepa Rentschler. Uma cepa de Canarypox de placa purificada denominada ALVAC (US 5,766,598) foi depositada de acordo com os termos do tratado de Budapeste com o American Type Culture Collection (ATCC), número de acessão VR-2547. Outra cepa de Canarypox é a cepa de vacina de canarypox comercial designada LF2 CEP 524 24 10 75, disponível do Institute Merieux, Inc.
[0042] Os exemplos de Fowlpoxvirus são cepas FP-1, FP-5 e TROVAC (US 5,766,598). FP-1 é uma cepa Duvette modificada para ser utilizada como uma vacina em galinhas com um dia de idade. A cepa é uma cepa de vacina de fowlpoxvirus comercial designada 0 DCEP 25/CEP67/2309 Outubro de 1980 e é disponível do Institute Merieux, Inc. FP-5 é uma cepa de vacina de fowlpoxvirus comercial de origem de embrião de galinha disponível da American Scientific Laboratories (Divisão da Schering Corp.) Madison, Wisconsin, Licença veterinária dos Estados Unidos número 165, número de série 30321.
[0043] Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, o vírus recombinante deficiente em replicação é um orthopoxvirus, como um vírus de vacínia. Os exemplos para vírus de vacínia apropriados para uso na presente invenção incluem a cepa de vírus de vacínia DIs, que cresce bem em células CEF porém é incapaz de crescer na maioria das células de mamíferos (Tagaya e outros, A new mutant of dermovaccinia virus, Nature Vol. 192, No. 4800, 381-383, 1961; Ishii e outros, Structural analysis of vaccinia virus DIs strain: Application as a new replication deficient viral vector, Virology 302, 433-444, 2002). Outro exemplo preferido de um vírus de vacínia apropriado é a cepa de vírus de vacínia altamente atenuado NYVAC, que foi derivado de um isolado clonado de placa da cepa de vacina de Copenhague por deleção de 18 ORFs a partir do genoma viral (Tartaglia et al., NYVAC: A highly attenuated strain of vaccinia virus, Virology 188, 217-232, 1992). NYVAC é caracterizado por uma capacidade dramaticamente reduzida de replicar em uma variedade de células de cultura de tecido humano, porém retém a capacidade de induzir respostas imunes fortes a antígenos extrínsecos.
[0044] Embora a invenção seja descrita em detalhe adicional com relação a vírus de vacínia recombinante, como MVA recombinante, todos os vírus acima mencionados são também igualmente apropriados para uso na presente invenção.
[0045] Em uma modalidade preferida da invenção, o vírus recombinante deficiente em replicação é um vírus de vacínia modificado recombinante Ancara (MVA).
[0046] MVA é relacionado a vírus de Vacínia, um membro do gênero Orthopoxvirus na família Poxviridae. MVA foi gerado por mais de 570 passagens seriais em fibroblastos de embrião de galinha da cepa de vacínia dermal Ancara (Chorioallantois vaccinia virus Ancara virus, CVA; para exame vide Mayr, A., e outros, Passage History: Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia- Stammes MVA, Infection 3, 6-14, 1975), que foi mantido no Vaccination Institute, Ancara, Turquia por muitos anos e utilizado como a base para vacinação de seres humanos. Entretanto, devido a complicações pós-vacinais graves frequentes associadas à virus de vacínia, houve várias tentativas para gerar uma vacina de varíola mais segura, mais atenuada. Durante o período de 1960 a 1974, Prof. Anton Mayr teve sucesso em atenuar CVA em mais de 570 passagens contínuas em células CEF (Mayr et. al, Passage History: Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA. Infection 3: 6-14, 1975). Foi mostrado em uma variedade de modelos de animais que o MVA resultante era avirulento (Mayr, A. & Danner, K. Vaccination against pox diseases under immunosuppressive conditions, Dev. Biol. Stand. 41: 225-34, 1978). Adicionalmente, essa cepa de MVA foi testada em experimentos clínicos como vacina para imunizar contra a doença de varíola humana (Mayr et. al, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl e outros, MVA vaccination against smallpox: clinical tests with an attenuated live vaccinia virus strain (MVA) (tradução do autor), Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392, 1974):
[0047] Como parte do desenvolvimento prematuro de MVA como uma vacina pré-varíola, houve experimentos clínicos utilizando MVA-517 (correspondendo a 517a passagem) em combinação com
[0048] Lister Elstree (Stickl, Smallpox vaccination and its consequences: first experiences with the highly attenuated smallpox vaccine "MVA". Prev.Med. 3(1): 97-101, 1974; Stickl e Hochstein-Mintzel, Intracutaneous smallpox vaccination with a weak pathogenic vaccinia virus ("MVA virus"). Munch Med Wochenschr. 113: 1149-1153, 1971) em sujeitos em risco para reações adversas de vacínia. Em 1976, MVA derivado do estoque de semente MVA-571 (correspondendo à 571a passagem) foi registrado na Alemanha como a vacina inicial em um programa de vacinação de varíola parenteral em dois estágios. Subsequentemente, MVA-572 foi utilizado em aproximadamente 120.000 indivíduos caucasianos, a maioria crianças entre 1 e 3 anos de idade, sem efeitos colaterais graves relatados, embora muitos dos sujeitos estavam entre a população com risco elevado de complicações associadas a vírus de vacínia convencional (Mayr et al., 1978, The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behaviour in organisms with a debilitated defence mechanism (tradução do autor). Zentralbl. Bacteriol. (B) 167: 375390). MVA-572 foi depositado na European Collection of Animal Cell Cultures como ECACC V94012707. MVA teve virulência diminuída enquanto manteve boa imunogenicidade.
[0049] Uma vez que muitas passagens foram utilizadas para atenuar MVA, há um número de cepas ou isolados diferentes, dependendo do número de passagem em células CEF. Todas as cepas MVA originam do Dr. Mayr e a maioria é derivada de MVA-572 que foi utilizado na Alemanha durante o programa de erradicação de smallpox, ou MVA-575 que foi extensamente utilizado como uma vacina veterinária. MVA-575 foi depositado em 7 de dezembro de 2000, na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) com o número de depósito V00120707. O produto MVA-BN® utilizado como exemplo para gerar MVA recombinante de acordo com a presente invenção é derivado MVA-584 (correspondendo a 584a passagem de MVA em células CEF). Uma amostra de MVA-BN® foi depositada em 30 de agosto de 2000, na European Collection of Cell Cultures (ECACC) sob o número V00083008.
[0050] Como consequência das passagens de longa duração do vírus de vacina chorioallantois Ancara (CVA) o genoma do vírus de MVA resultante mostrou deleções de aproximadamente 27 quilobases de sua sequência genômica e, portanto, foi descrito como célula altamente hospedeira restrita a células de aves (Meyer, H. et. al, Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991). As cepas atenuadas não têm aproximadamente 13% (aproximadamente 26.5 kb de seis sítios de deleção maiores e múltiplos sítios de deleção menores) da região de codificação do genoma em comparação com vírus CVA ancestral (Meisinger-Henschel e outros, Genomic sequence of chorioallantois vaccinia virus Ancara, the ancestor of modified vaccinia virus Ancara, J. Gen. Virol. 88, 32493259, 2007) . As deleções afetam um número de genes de faixa hospedeira e virulência, bem como um fragmento grande do gene codificando para proteína de inclusão tipo A (ATI) e um gene codificando para uma proteína estrutural dirigindo partículas de vírus maduras para os corpos de inclusão do tipo A.
[0051] A invenção, desse modo, abrange vírus de MVA recombinante deficiente em replicação gerados com todos e quaisquer vírus MVA. O depósito de cepa MVA VR-1508, depositado na American Type Culture collection (ATCC), Manassas, VA 20108, EUA, bem como as cepas de virus MVA mencionadas acima, a saber cepas MVA 572 e 575 depositadas na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) com o número de depósito ECACC V94012707 e ECACC V00120707, respectivamente, são preferidos de acordo com a presente invenção. Vírus de MVA particularmente preferidos são MVA cepas MVA-BN®, como, por exemplo, depositados no ECACC sob o número V00083008 e derivados ou variantes tendo as mesmas propriedades que MVA-BN.
[0052] MVA-BN® pode ser fixado a e entrar em células humanas onde genes codificados de modo viral são expressos de forma muito eficiente. Entretanto, a montagem e liberação de vírus de progênie não ocorrem. Os preparados de MVA-BN® e derivados foram administrados a muitos tipos de animais, e a mais de 2000 sujeitos humanos, incluindo indivíduos imunodeficientes. Todas as vacinações provaram ser genericamente seguras e bem toleradas.
[0053] A percepção de muitas publicações diferentes é que todas as cepas de MVA são iguais e representam um vetor viral vivo, seguro altamente atenuado. Entretanto, testes pré-clínicos revelaram que MVA-BN® demonstra atenuação e eficácia superiores em comparação com outras cepas de MVA (WO 02/42480): as cepas variantes de MVA MVA-BN® como, por exemplo, depositadas no ECACC sob o número V00083008 têm a capacidade de replicação reprodutiva in vitro em fibroblastos de embrião de galinha (CEF), porém nenhuma capacidade de replicação reprodutiva em células humanas nas quais MVA 575 ou MVA 572 podem replicar de forma reprodutiva. Por exemplo, MVA-BN® não tem capacidade de replicação reprodutiva na linhagem de células de ceratinócito humano HaCaT, a linhagem de células de rim de embrião humano 293, a linhagem de célula de osteossarcoma humano 143B, e a linhagem de célula de adenocarcinoma de colo humano HeLa. Além disso, cepas de MVA-BN® falham em replicar em um modelo de camundongo que é incapaz de produzir células T e B maduras, e como tal é severamente imuno-comprometido e altamente suscetível a um vírus de replicação. Uma propriedade adicional ou alternativa de cepas MVA-BN® é a capacidade de induzir pelo menos substancialmente o mesmo nível de imunidade em regimes de sensibilização de vírus prime/vacínia quando comparado com regimes de sensibilização de DNA de vírus prime/vacínia.
[0054] Desse modo, em uma modalidade preferida, o MVA de acordo com a invenção tem a capacidade de replicação reprodutiva in vitro em fibroblastos de embrião de galinha (CEF), porém sem capacidade de replicação reprodutiva em células humanas nas quais MVA 575 ou MVA 572 pode replicar reprodutivamente. Mais preferivelmente, o MVA não tem capacidade de replicação reprodutiva na linhagem de células de ceratinócito humano HaCaT, a linhagem de células de rim de embrião humano 293, a linhagem de células de osteossarcoma humano 143B, e a linhagem de células de adenocarcinoma de colo humano HeLa. Desse modo, em uma modalidade mais preferida, a cepa de MVA utilizada na presente invenção é MVA-BN® como depositado em ECACC sob o número V00083008 e derivados do mesmo e variantes que revelam as mesmas propriedades como descrito para MVA-BN, respectivamente.
[0055] As características de MVA-BN, a descrição de ensaios biológicos que permitem avaliar se uma cepa MVA é MVA-BN ou um derivado da mesma e métodos que permitem obter MVA-BN ou um MVA tendo as propriedades de MVA-BN são revelados em WO 02/42480. A referência também revela como MVA e outros vírus de vacínia podem ser propagados. Em resumo, células eucarióticas são infectadas com o vírus. As células eucarióticas são células que são suscetíveis à infecção com o respectivo poxvirus e permitem replicação e produção de vírus infecciosos. Para MVA um exemplo para esse tipo de células são fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e células BHK (Drexler e outros, Highly attenuated modified vaccinia Ancara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells, J. Gen. Virol. 79, 347352, 1998). Células CEF podem ser cultivadas sob condições conhecidas pela pessoa versada na técnica. Preferivelmente as células CEF são cultivadas em meio livre de soro em frascos estacionários ou garrafas cilíndricas. A incubação ocorre preferivelmente 48 a 96 horas a 37°C. Para a infecção MVA é preferivelmente utilizado em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,05 a 1 1 TCID50 e a incubação ocorre preferivelmente 48 a 72 horas a 37°C.
[0056] O termo “não capaz de replicação reprodutiva” é utilizado no presente pedido como definido em WO 02/42480 e patente US 6,761,893, que são pelo presente incorporados a título de referência. Desse modo, o termo se aplica a um vírus que tem uma razão de amplificação de vírus em 4 dias após infecção menor do que 1 utilizando os ensaios descritos na patente US 6,761,893, cujos ensaios são pelo presente incorporados a título de referência. A “razão de amplificação” de um vírus é a razão de vírus produzido de uma célula infectada (saída) para a quantidade originalmente utilizada para infectar as células no primeiro lugar (entrada). Uma razão de “1” entre Saída e entrada define um estado de amplificação em que a quantidade de vírus produzida a partir das células infectadas é igual à quantidade inicialmente utilizada para infectar as células.
[0057] MVA-BN® ou seus derivados são, de acordo com uma modalidade, caracterizados por induzir pelo menos substancialmente o mesmo nível de imunidade em regimes de sensibilização de vírus de vacínia prime/vacínia vírus quando comparado com regimes de sensibilização de DNA de vírus de prime/vacínia. Um vírus de vacínia é considerado como induzindo pelo menos substancialmente o mesmo nível de imunidade em regimes de sensibilização de vírus de vacínia prime/vacínia vírus quando comparado com regimes de sensibilização de DNA de vírus de prime/vacínia se a resposta CTL como medido em um dos “ensaio 1” e “ensaio 2” como revelado em WO 02/42480, preferivelmente nos dois ensaios, é pelo menos substancialmente igual em regimes de sensibilização de vírus de vacínia prime/vacínia vírus quando comparado com regimes de sensibilização de DNA de vírus de prime/vacínia. Mais preferivelmente, a resposta de CTL após administração de sensibilização de vírus de vacínia prime/vacínia vírus é mais elevada pelo menos em um dos ensaios, quando comparado com regimes de sensibilização de DNA de vírus de prime/vacínia. Mais preferivelmente, a resposta de CTL é mais elevada nos dois ensaios.
[0058] WO 02/42480 revela como os vírus de vacínia são obtidos tendo as propriedades de MVA-BN®. O vírus MVA- BN altamente atenuado pode ser derivado, por exemplo, pela passagem adicional de um vírus de vacínia modificado Ancara (MVA), como MVA-572 ou MVA-0575 e opcionalmente por etapa(s) de purificação de placa adicional(is).
[0059] Em resumo, mostrou-se que MVA-BN® tem o perfil de atenuação mais elevada em comparação com outras cepas de MVA e é seguro mesmo em animais severamente imunocomprometidos.
[0060] Embora MVA seja fortemente restrito em replicação em células de mamíferos, seus genes são eficientemente transcritos, com o bloco em replicação viral estando no nível de montagem e egresso de vírus. (Sutter and Moss, Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89: 1084710851, 1992; Carroll e Moss, Host range and cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia virus: propagation and generation of recombinant viruses in a nonhuman mammalian cell line. Virology 238: 198-211, 1997). Apesar de sua atenuação elevada e virulência reduzida, em estudos pré-clínicos mostrou-se que MVA-BN® elicia respostas imunes tanto humoral como celular a VACV e aos produtos de genes heterólogos clonados no genoma MVA (Harrer et.al, Therapeutic Vaccination of HIV-1-infected patients on HAART with recombinant HIV-1 nef-expressing MVA: safety, immunogenicity and influence on viral load during treatment interruption. Antiviral Therapy 10: 285-300, 2005; Cosma e outros, Therapeutic vaccination with MVA-HIV-1 nef elicits Nefspecific T-helper cell responses in chronically HIV-1 infected individuals. Vaccine 22(1): 21-29, 2003; Di Nicola e outros, Clinical protocol. Immunization of patients with malignant melanoma with autologous CD34(+) cell-derived dendritic cells transduced ex vivo with a recombinant replication-deficient vaccinia vector encoding the human tyrosinase gene: a phase I trial. Hum Gene Ther. 14(14): 1347-1 360, 2003; Di Nicola e outros, Boosting T cell- mediated immunity to tyrosinase by vaccinia virus- transduced, CD34(+)- derived dendritic cell vaccination: a phase I trial in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 10(16): 5381-5390, 2004).
[0061] MVA-BN® e vacinas baseadas em MVA-BN® recombinantes podem ser geradas, passadas, produzidas e fabricadas em células CEF cultivadas em meio livre de soro. Muitos variantes MVA-BN® recombinantes foram caracterizados para desenvolvimento pré-clínico e clínico. Nenhuma diferença em termos da atenuação (falta de replicação em linhagens de células humanas) ou segurança (estudos clínicos ou toxicidade pré-clínicos) foi observada entre MVA-BN®, a espinha dorsal de vetor viral, e as várias vacinas baseadas em MVA recombinante.
[0062] De acordo com a presente invenção, os vírus recombinantes deficientes em replicação compreendem um antígeno e/ou epítopo antigênico em que a expressão do antígeno e/ou epítopo antigênico, respectivamente é regulada por um elemento de controle de transcrição.
[0063] Como utilizado aqui, elementos de controle de transcrição ou sequências são sequências reguladoras de DNA, como sequências de promotor para ligar RNA polimerase, intensificadores, sequência de iniciação de tradução para ligação de ribossomo e/ou terminadores, e similares, que fornecem a expressão de um antígeno de interesse em uma célula hospedeira.
[0064] Em uma modalidade preferida, o vírus recombinante deficiente em replicação compreende como elemento de controle de transcrição que compreende pelo menos dois elementos acionando expressão prematura do antígeno e/ou epítopo antigênico de interesse. Pelo menos dois elementos podem ser elementos promotores, preferivelmente elementos promotores prematuros, mais preferivelmente pelo menos duas, mais preferivelmente pelo menos cinco cópias de um elemento promotor prematuro.
[0065] Como utilizado aqui, os termos “promotor prematuro” ou “elemento promotor prematuro” se referem a promotores que são ativos em células infectadas por vírus antes de ocorrer a replicação de DNA viral.
[0066] Métodos são conhecidos pela pessoa versada na técnica sobre como pode ser determinado se um promotor é um promotor prematuro. Em particular, o promotor de interesse pode ser inserido à montante de um gene repórter e a construção pode ser introduzida em um vetor viral, por exemplo, um vetor de vírus de vacínia que é então utilizado para infectar células. Para avaliar a atividade como promotor prematuro as células são incubadas com uma substância que inibe replicação de DNA viral como AraC. A replicação de DNA é um pré-requisito para a atividade de promotor tardio. Desse modo, qualquer atividade de promotor que é medida nesse sistema de ensaio é devido a elementos ativos como promotor prematuro. Consequentemente, o termo “promotor tardio” se refere a qualquer promotor que é ativo após ter ocorrido replicação de DNA. A atividade tardia pode ser também medida por métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica. Para fins de simplicidade o termo “promotor tardio” como utilizado no presente pedido se refere a um promotor que é somente ativo se nenhuma substância for adicionada que bloqueie a replicação de DNA.
[0067] Em uma modalidade preferida, o vírus recombinante deficiente em replicação compreende um promotor prematuro/tardio, preferivelmente um promotor prematuro/tardio de poxvirus. Um promotor prematuro/tardio aciona a expressão de uma sequência de ácido nucléico ligado nos tempos tanto prematuro como tardio do ciclo de vida viral.
[0068] Preferivelmente, o promotor prematuro/tardio compreende pelo menos um elemento de promotor tardio ligado a pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze ou mais cópias de um elemento promotor prematuro.
[0069] Ainda mais preferivelmente, o promotor prematuro/tardio compreende um elemento promotor tardio e pelo menos duas, preferivelmente pelo menos cinco cópias de um elemento promotor prematuro, preferivelmente cópias de um elemento de sequência de nucleotídeo de acordo com nucleotídeo (NT) 48-81 da SEQ ID NO:1.
[0070] Em outra modalidade preferida, pelo menos dois elementos do elemento de controle de transcrição, em particular pelo menos duas, preferivelmente pelo menos cinco cópias do elemento promotor prematuro são otimizadas em sequência.
[0071] Em uma modalidade preferida adicional, o promotor prematuro/tardio é um promotor híbrido prematuro/tardio compreendendo um elemento tardio derivado de um promotor diferente daquele do qual o elemento prematuro é derivado.
[0072] Os inventores da presente invenção verificaram surpreendentemente que um elemento de controle de transcrição que aciona expressão de um antígeno tão cedo e quanto forte quanto possível dota o antígeno de uma vantagem temporal e quantitativa em relação à maioria dos antígenos de vetor autóctone e desse modo é benéfico para indução de uma resposta de célula T específica de antígeno forte, em particular uma resposta de célula T CD8.
[0073] Um promotor prematuro forte foi projetado para MVA que foi utilizado como exemplo e como uma modalidade preferida de um vírus recombinante deficiente em replicação de acordo com a presente invenção. Para projetar um promotor prematuro forte, uma combinação de múltiplos elementos promotores prematuros em um modo tandem foi utilizada para aumentar a expressão especificamente na fase prematura do ciclo de replicação viral. Esse elemento promotor foi acoplado a um elemento promotor tardio curto derivado do promotor ATI de varíola bovinaque se supõe dirigir a expressão de gene na fase tardia e levar a um aumento adicional na quantidade de antígeno expresso.
[0074] A cinética de expressão foi deslocada em direção a pontos de tempo anteriores utilizando um promotor que pertence à classe recentemente definida de promotores prematuros imediatos. Genes prematuros imediatos são definidos como sendo expressos no período iniciando 0,5 a 1 hora após infecção. (Assarsson e outros, Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 105:2140-2145, 2008; Davison, A. J. e B. Moss, Structure of vaccinia virus early promotors. J. Mol. Biol. 210:749-769, 1989.). O elemento de controle de transcrição de acordo com a presente invenção é, mais preferivelmente, um elemento de controle de transcrição prematuro imediato projetado por combinar pelo menos dois, preferivelmente cinco ou mesmo um multímero de elementos de controle de transcrição prematuros, que são preferivelmente otimizados em sequência, em um modo tandem. O elemento de controle de transcrição prematuro é preferivelmente projetado por um elemento promotor prematuro, mais preferivelmente por um elemento promotor prematuro de poxvirus. Preferivelmente o elemento promotor prematuro é um elemento promotor prematuro p7.5, mais preferivelmente um elemento promotor prematuro p7.5 otimizado em sequência.
[0075] Preferivelmente o promotor prematuro/tardio de poxvirus compreende pelo menos um elemento promotor tardio ligado a pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze ou mais cópias de um elemento promotor prematuro.
[0076] Ainda mais preferivelmente, o promotor prematuro/tardio de poxvirus compreende um elemento promotor tardio e pelo menos dois, preferivelmente, pelo menos cinco cópias de um elemento promotor prematuro, preferivelmente cópias de um elemento de sequência de nucleotídeo de acordo com nt 48-81 da SEQ ID NO: 1.
[0077] É particularmente preferido um promotor prematuro/tardio de poxvirus que compreende pelo menos duas, preferivelmente pelo menos cinco cópias de um elemento promotor prematuro p7.5, mais preferivelmente cópias de um elemento promotor prematuro p7.5 otimizado em sequência.
[0078] Preferivelmente, o promotor prematuro/tardio de poxvirus é um promotor híbrido prematuro/tardio de poxvirus compreendendo um elemento tardio derivado de um promotor diferente daquele do qual o elemento prematuro é derivado.
[0079] De acordo com uma modalidade preferida adicional, o elemento tardio do promotor híbrido prematuro/tardio de poxvírus é ou compreende o promotor tardio ATI de varíola bovina.
[0080] Preferivelmente, o promotor híbrido prematuro/tardio de poxvírus compreende pelo menos um elemento promotor tardio, preferivelmente um elemento promotor ATI, ligado a pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze ou mais cópias de um elemento promotor prematuro, preferivelmente um elemento promotor prematuro p7.5 e mais preferivelmente um elemento promotor prematuro p7.5 otimizado em sequência.
[0081] É particularmente preferido um vírus recombinante deficiente em replicação como definido acima em que o promotor híbrido prematuro/tardio de poxvírus compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1.
[0082] A sequência do promotor do gene de proteína de inclusão do tipo vírus A de varíola bovina(promotor ATI) é conhecida pela pessoa versada na técnica. Nesse contexto, faz-se referência ao número de acessão de entrada em Genebank D00319. Uma sequência de promotor ATI preferido é como se segue:5'GTTTT GAATA AAATT TTTTT ATAAT AAAT 3' (SEQ ID NO:6).
[0083] De acordo com a presente invenção é possível uitlizar o promotor ATI como especificado acima ou utilizar um derivado do promotor ATI, que pode ser uma sub-sequência da sequência mostrada acima. O termo “sub-sequência“ se refere a fragmentos mais curtos da sequência mostrada acima que são ainda ativos coom promotor, em particular como promotor tardio de vírus de vacínia. Um fragmento típico da sequência do promotor ATI tem um comprimento de pelo menos 10 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 15 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente de pelo menos 20 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 25 nucleotídeos da sequência do promotor ATI. A sub-sequência pode compreender preferivelmente nucleotídeos 25 a 29 da sequência ATI, isto é, a sequência 5‘-TAAAT-3‘ localizada na extremidade 3‘ da sequência de promotor ATI. A sub-sequência pode compreender também nucleotídeos 22 a 29 da sequência de promotor ATI, isto é, a sequência 5-TAATAAAT-3‘ localizada na extremidade 3‘ da sequência de promotor ATI.
[0084] O elemento prematuro do promotor p7.5 foi otimizado por substituição de nucleotídeo único, que é descrito em detalhe adicional abaixo. A otimização resultou em um promotor com expressão mais elevada na presença de AraC do que na ausência de AraC em células heLa. Além disso, a expressão de GFP intensificado (eGFP) acionada por um promotor compreendendo cinco cópias do elemento promotor prematuro p7.5 otimizado ligado a uma cópia de um promotor tardio ATI (a seguir indicado como “promotor pHyb“) não ocorreu somente significativamente mais cedo, como foi também significativamente mais elevado do que a expressão acionada pelo promotor sintético bem definido pS e o promotor p7.5 nos tempos entre 30 e 120 min. após infecção. Quantidades significativas de eGFP foram detectadas já em 30 min. após infecção. Isso foi duas a três vezes mais rápido do que com os promotores p7.5 ou pS prematuro/tardio estabelecidos. A combinação de pelo menos três cursos de imunização com tal promotor prematuro-imediato para expressão de um antígeno resultou em uma resposta aumentada de célula T CD8 específica de antígeno em comparação com o promotor pS e p7.5 poxviral convencional. A vantagem em expressão de antígeno prematuro forte persistiu até pelo menos 6 h após infecção. Desse modo, a expressão de gene prematuro foi excessivamente elevada a partir desse promotor.
[0085] Em modaliades preferidas, o MVA recombinante expressa níveis elevados do antígeno e/ou epítopo antigênico codificado durante a fase prematura imediata de replicação viral. Em algumas modalidades, MVA recombinante expressa em células heLa um nível do antígeno codificado na presença de 40 ug/ml AraC que está compreendido em 10%, 20%, ou 50% ou que é pel omenos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% do nível do antígeno codificado na ausência de AraC. Em modalidades preferidas, MVA recombinante expressa em células HeLa um nível do antígeno codificado na presença de 40 ug/ml AraC que é mais elevado do que o nível do antígeno codificado na ausência de AraC. Em várias modalidades, o MVA recombinante expressa níveis duas vezes, três vezes, ou quatro vezes mais elevados do antígeno codificado do que um vetor MVA com o promotor pS acionando expressão em células HeLa e/ou CEF na presença de 40ug/ml AraC.
[0086] Em uma modalidade preferida, o promotor híbrido prematuro/tardio compreende a seguinte sequência: 5 ' acgcgtgtttaaacgt11tgaaaa tttttttataataaa tatccggtaaaaattgaa aaactattctaatttattg cacggtccggtaaaaattgaaaaactattctaatttattgcacggtccggtaaaaattga aaaactattctaat ttattgcacggtccggtaaaaattgaaaaactattctaatttattgcacggtccggtaaa aattgaaaaactatt ctaatttattgcacggtccgga 3' (SEQ ID NO:1) .
[0087] A sequência do promotor tardio ATI está em itálico; enquanto as 5 cópias do promotor prematuro p7.5 otimizado estão sublinhadas. A otimização do promotor prematuro p7.5 foi realizada de acordo com Davison & Moss, Structure of Vaccinia Virus Early Promotors, J. Mol. Biol.210, 749-769, 1989.
[0088] Os elementos do ID NO: 1) são como a seguir: 5'acgcgtgtttaaac (nt 1-14 of SEQ ID NO:1) gttttgaaaatttttttataataaata (nt 15-41 of SEQ ID NO:1) tccggt (nt42-47 of SEQ ID NO:1) aaaaattgaaaaactattctaatttattgcacgg (nt48-81 of SEQ ID NO:1) tccggt (nt82-87 of SEQ ID NO:1) aaaaattgaaaaactattctaatttattgcacgg (nt 88-121 of SEQ ID NO:1) tccggt (nt122-127 of SEQ ID NO:1) aaaaattgaaaaactattctaatttattgcacgg P7.5 otimizador prematuro (nt 128-161 of SEQ ID NO:1) Ligador (nt162-167 of SEQ ID NO:1) aaaaattgaaaaactattctaatttattgcacgg P7.5 otimizador prematuro (nt 168-201 of SEQ ID NO:1) Ligador (nt202-207 of SEQ ID NO:1) aaaaattgaaaaactattctaatttattgcacgg P7.5 otimizador prematuro (nt208-241 of SEQ ID NO:1) BspEI sítio de restrição (nt 242-247 of SEQ ID NO:1).
[0089] Em modalidades adicionais, o promotor híbrido prematuro/tardio compreende uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% homóloga ou idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou a nt 15-41 ou nt 48-81, nt 48-87 ou nt 48-247 da SEQ ID NO: 1. Com base no conhecimento das sequências de consenso de promotores prematuro e tardio, bem como conhecimento em relação aos efeitos de várias substituições de nucleotídeo sobre atividade de promotor prematuro e tardio (Davison and Moss, Structure of Vaccinia Virus Early Promotors, J. Mol. Biol. 210, 749-769, 1989.), muitas alterações na sequência de promotor da SEQ ID NO:1 podem ser previstos que não afetariam negativamente a atividade do promotor. Sequências de nucleotídeo que diferem da SEQ ID NO:1 em uma ou mais posições, porém têm substancialmente a atividade de promotor prematuro e tardio igual (isto é, compreendida em uma faixa de aproximadamente +/- 20%) que aquela do promotor SEQ ID NO: 1 são abrangidas pela presente invenção.
[0090] Em uma modalidade preferida adicional, a invenção refere-se a um promotor que compreende pelo menos 2 elementos de sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mesmo 100% de homologia ou identidade com nt 48-81 da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade particularmente preferida, o promotor compreende pelo menos 2, preferivelmente pelo menos 5 elementos de sequência de nucleotídeo de acordo com nt 48-81 da SEQ ID NO: 1. Preferivelmente, o promotor compreende pelo menos um elemento promotor tardio, preferivelmente um elemento promotor tardio ATI de vacínia.
[0091] A percentagem de identidade de sequência pode ser determinada por inspeção visual e cálculo matemático. alternativamente, a percentagem de identidade de duas sequências de ácido nucléico pode ser determinada por comparar informações de sequência utilizando o programa de computador GAP, versão 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) e disponível da University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Os parâmetros default preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) para nucleotídeos, e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pág. 353-358, 1979; (2) uma penalidade de 3.0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0.10 para cada símbolo em cada lacuna; e (3) sem penalidade para lacunas finais. Outros programas utilizados por uma pessoa versada na técnica de comparação de sequência também podem ser utilizados.
[0092] A presente invenção também se refere ao vírus recombinante deficiente em replicação como definido acima para uso como medicamento ou vacina e o uso do vírus recombinante deficiente em replicação como definido acima para a preparação de um medicamento ou vacina.
[0093] O vírus recombinante deficiente em replicação de acordo com a presente invenção é administrado em uma faixa de concentração de 102 a 109, ou 104 a 109 TCID (dose infecciosa de cultura de tecido)50/ml, preferivelmente em uma faixa de concentração, por exemplo, de 105 a 5 x 108 TCID50/ml, mais preferivelmente em uma faixa de concentração, por exemplo, de 106 a 108 TCID50/ml, mais preferivelmente em uma faixa de concentração, por exemplo, de 107 a 108 TCID50/ml, ou pelo menos 2-5 x 107 a 108 ou 2-5 x 108 a 109, especialmente 108 TCID50/ml. A concentração efetiva depende do tipo de virus utilizado e da espécie de animal a ser vacinado. Uma dose de vacinação preferida para humanos compreende 106 a 109 TCID50, mais preferivelmente uma dose de 107 ou 108 TCID50, mais preferivelmente uma dose de 108 TCID50 ou mais, em particular 2 ou 2.5-5 x 108 ou 109. para MVA-BN uma dose de vacinação típica para seres humanos compreende 5 x 107 TCID50 a 5 x 108 TCID50, como aproximadamente 1, 2, ou 2.5 x 108 TCID50, administrado por via subcutânea.
[0094] É possível induzir uma resposta imune com uma administração única do vírus recombinante deficiente em replicação como definido acima, por exemplo, com MVA, em particular com cepa MVA-BN e seus derivados. Normalmente pode-se utilizar o vírus recombinante deficiente em replicação de acordo com a presente invenção, por exemplo, MVA, em particular MVA-BN e seus derivados em regimes de sensibilização de reforço homólogos, isto é, é possível utilizar um vírus recombinante para uma primeira vacinação e reforçar a resposta imune gerada na primeira vacinação por administração do vírus recombinante igual ou relacionado do que aquele utilizado para a primeira vacinação. A administração de sensibilização/reforço homóloga também é uma modalidade preferida da presente invenção.
[0095] O vírus recombinante deficiente em replicação de acordo com a presente invenção, por exemplo, MVA, em particular MVA-BN e seus derivados também pode ser utilizado em regimes de reforço-sensibilização heteróloga nos quais uma ou mais das vacinações é feita com outro tipo de vacina, por exemplo, outra vacina de vírus, uma proteína ou uma vacina de ácido nucléico.
[0096] O modo de administração pode ser por via intravenosa, intramuscular, intradérmica, intranasal ou subcutânea. É preferida a administração intravenosa, intramuscular ou em particular subcutânea. Entretanto, qualquer outro modo de administração pode ser utilizado como escarificação.
[0097] A invenção também se refere a uma composição farmacêutica ou vacina compreendendo o vírus recombinante deficiente em replicação como definido acima e, opcionalmente, um veículo, diluente, adjuvante e/ou aditivo farmaceuticamente aceitável.
[0098] Inúmeros modos para preparar formulações virais são conhecidos pelo técnico especializado bem como modos de armazenagem. Nesse contexto e em particular para a preparação de formulações poxvirais faz-se referência a WO 03053463.
[0099] Exemplos não limitadores de substâncias auxiliares são água, solução salina, glicerol, etanol, agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias de tamponamento de pH, preservativos, estabilizadores ou similares. Veículos apropriados são tipicamente selecionados do grupo que compreende moléculas lentamente metabolizadas grandes como, por exemplo, proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicolíticos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, agregados de lipídeo ou similar.
[0100] Para a preparação de vacinas, o vírus MVA recombinante de acordo com a invenção é convertido em uma forma fisiologicamente aceitável. Preparados apropriados dependem do tipo de vírus e são conhecidos pela pessoa versada. Para vacinas de poxvirus isso pode ser feito baseado na experiência na preparação de vacinas de varíola (como descrito por Stickl, H. e outros. Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Por exemplo, o virus purificado é armazenado a -80°C com um título de 5x108 TCID50/ml formulado em 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7.4.
[0101] Em uma modalidade, o vírus recombinante deficiente em replicação de acordo com a invenção é utilizado para a preparação de doses de vacina. Por exemplo, aproximadamente 102 a aproximadamente 108 partículas do vírus são liofilizadas em 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na presença de 2% de peptona e 1% de albumina humana em uma ampola, preferivelmente uma ampola de vidro. Em outro exemplo não limitador, as doses de vacina são produzidas por liofilização em etapas do vírus em uma formulação. Em certas modalidades, essa formulação pode conter aditivos adicionais como manitol, dextrano, açúcar, glicina, lactose ou polivinil pirrolidona ou outros meios auxiliares, como antioxidantes ou gás inerte, estabilizadores ou proteínas recombinantes (por exemplo, albumina de soro humano) apropriadas para administração in vivo. A ampola de vidro é então vedada e pode ser armazenada entre 4°C e temperatura ambiente por vários meses. Entretanto, desde que não exista necessidade imediata, a ampola é armazenada preferivelmente em temperaturas abaixo de -20°C.
[0102] Para vacinação ou terapia, o liofilizado pode ser dissolvido em 0,1 a 0,5 ml de uma solução aquosa, preferivelmente solução salina fisiológica ou tampão Tris, e administrada sistemicamente ou localmente, isto por via parenteral, subcutânea, intramuscular, por escarificação ou qualquer outra via de administração conhecida pelo técnico especializado. O modo de administração, a dose e o número de administrações podem ser otimizados por aqueles versados na técnica em um modo conhecido. Entretanto, mais comumente, um paciente é vacinado com uma segunda dose aproximadamente um mês a seis semanas após a primeira dose de vacinação. Uma terceira, uma quarta e doses subsequentes podem ser dadas normalmente 4-12 semanas, preferivelmente 4-6 semanas após a administração anterior.
[0103] Em uma modalidade, um mamífero sujeito, que incluiu ratos, coelhos, camundongos e seres humanos é imunizado compreendendo administrar uma dosagem do vírus deficiente em replicação recombinante, em particular MVA, ao sujeito, preferivelmente um ser humano. Em uma modalidade, a primeira dosagem, bem como a segunda dosagem e dosagens adicionais (isto é, terceira, quarta, quinta, etc.) especialmente de uma MVA recombinante compreendem preferivelmente 108 TCID50 do vírus recombinante.
[0104] Em outro aspecto a presente invenção refere- se ao vírus recombinante deficiente em replicação ou a composição farmacêutica ou vacina como definido acima para induzir uma resposta de célula T em um hospedeiro a pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico.
[0105] Além disso, a presente invenção refere-se ao uso do vírus recombinante deficiente em replicação ou a composição farmacêutica ou vacina como definido acima para a preparação de um medicamento para induzir uma resposta de célula T em um hospedeiro a pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico.
[0106] Em uma modalidade preferida à resposta de célula T é uma resposta de célula T CD8.
[0107] Imunizações com o vírus recombinante deficiente em replicação da invenção, em particular com a MVA recombinante, podem afetar respostas de célula T CD8 robustas. Em modalidades preferidas, após a primeira administração de sensibilização e pelo menos duas administrações de reforço, em que a administração ocorre em intervalos de pelo menos uma semana, a MVA recombinante afeta uma resposta de célula T CD8 no hospedeiro contra o antígeno codificado que é maior do que a resposta de célula T CD8 contra um epítopo de célula T CD8 imunodominante codificado pelo vetor MVA da espinha dorsal. Preferivelmente, a resposta de célula T CD8 contra o antígeno acionado por um promotor prematuro/tardio híbrido otimizado de acordo com a presente invenção é aumentada em comparação com a resposta contra o mesmo antígeno acionado por um promotor PS forte sintético ou promotores prematuro/tardio similares. Preferivelmente, após a terceira, quarta, quinta, etc. administração, uma resposta de célula T imunodominante é exercida no hospedeiro contra o antígeno codificado, isto é, um epítopo de célula T CD8 derivado do antígeno recombinante é convertido no epítopo imunodominante. Mais preferivelmente, após a terceira, quarta, quinta, etc., administração, a MVA recombinante induz uma resposta de célula T CD8 no hospedeiro contra o antígeno codificado que é pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou 35% de células T CD8 totais.
[0108] Em uma modalidade preferida, a reposta de célula T CD8 contra o antígeno recombinante induzido após a terceira, quarta, quinta, etc., administração da MVA recombinante compreendendo um promotor prematuro/tardio híbrido otimizado de acordo com a presente invenção é pelo menos 20% mais elevado do que a resposta de célula T CD8 afetada após administração de uma MVA recombinante compreendendo o promotor PS. Em modalidades preferidas adicionais, a resposta de célula T CD8 afetada após a terceira, quarta, quinta, etc., administração é 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% mais elevada. Na modalidade mais preferida, a resposta de célula T CD8 afetada é 100% mais elevada.
[0109] Como utilizado aqui, o termo “afetando uma resposta de célula T” deve ser entendido que uma resposta de célula T é induzida, criada e/ou intensificada.
[0110] O vírus recombinante deficiente em replicação de acordo com a invenção pode ser utilizado para o tratamento de uma ampla gama de mamíferos incluindo seres humanos e mesmo humanos imunocomprometidos.
[0111] Em modalidades preferidas, o tratamento compreende pelo menos três, quatro, cinco ou mesmo mais administrações (correspondendo a uma primeira sensibilização seguida por pelo menos duas, três, quatro, cinco ou mesmo mais administrações de reforço) de um vírus recombinante deficiente em replicação, preferivelmente uma MVA recombinante, ao hospedeiro. A administração do vírus recombinante é realizada como administração de sensibilização-reforço, isto é, pelo menos três administrações compreendem uma primeira inoculação (imunização/inoculação de sensibilização) seguida por uma terceira e terceira inoculação (imunizações/inoculações de reforço).
[0112] No contexto da presente invenção o termo “hospedeiro” abrange qualquer espécie de animal apropriada, em particular um animal vertebrado. São preferidos mamíferos incluindo seres humanos. Exemplos específicos adicionais para animais são animais domésticos como cães, gatos, animais economicamente importantes como vitelos, gado, carneiros, cabras, cavalos, porcos e outros animais como camundongos, ratos. Para essas espécies de animais e para seres humanos MVA e DISC-HSV são vírus particularmente preferidos. A invenção também pode ser utilizada para aves economicamente importantes como perus, patos, gansos e galinhas se vírus forem utilizados que são capazes de infectar as células da ave porém não capazes de produzir vírus de progênie infecciosa nas células.
[0113] A resposta de célula T a pelo menos um antígeno e/ou epítopo antigênico pode ser induzida por regimes de sensibilização-reforço heterólogo nos quais uma ou mais das vacinações é feita com um vírus como definido acima e em que uma ou mais das vacinações é feita com outro tipo de vacina, por exemplo, outra vacina de vírus, uma vacina de ácido nucléico ou proteína. Entretanto, preferivelmente a resposta de célula T é induzida por regimes de sensibilização/reforço homólogo nos quais vírus recombinante deficiente em replicação igual ou relacionado é utilizado para vacinações tanto de sensibilização como de reforço.
[0114] Por conseguinte, em outra modalidade preferida a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo administrações de sensibilização/reforço homólogo.
[0115] Em modalidades adicionais, a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo pelo menos três ou pelo menos quatro administrações do vírus recombinante deficiente em replicação ou a vacina ou composição farmacêutica como definido acima.
[0116] A presente invenção também abrange um kit compreendendo pelo menos dois frascos para a imunização de sensibilização/reforço compreendendo o vírus recombinante deficiente em replicação para uma primeira inoculação (“inoculação de sensibilização”) em um primeiro frasco/recipiente e para pelo menos segunda e/ou terceira inoculação e/ou inoculação adicional (“inoculação de reforço”) em um segundo frasco/recipiente e/ou frasco/recipiente adicional.
[0117] O kit pode compreender pelo menos um dois, três, quatro ou mais recipientes ou frascos do vírus recombinante, juntamente com instruções para a administração do vírus a um sujeito. Em uma modalidade preferida, o sujeito é um ser humano. As instruções podem indicar que o vírus recombinante é administrado ao sujeito em múltiplas dosagens (isto é, 2, 3, 4, 5, 6, etc.) em pontos de tempo específicos (por exemplo, pelo menos 4 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 8 semanas após a administração anterior). Preferivelmente, as instruções indicam que o vírus recombinante deve ser administrado pelo menos em 3 ou pelo menos 4 dosagens.
[0118] Se a vacina for um vetor MVA-BN ou derivado da mesma compreendendo um DNA de acordo com a presente invenção uma modalidade específica da presente invenção se refere a um kit para vacinação compreendendo um vetor de vírus MVA-BN de acordo com a presente invenção para a primeira vacinação (“sensibilização”) em um primeiro frasco/recipiente e para pelo menos segunda vacinação e terceira vacinação (“reforço”) em um segundo/terceiro frasco/recipiente.
Breve descrição das figuras
[0119] Figura 1: sequência e representação esquemática do arranjo de elementos promotores tardio e prematuro em pHyb, p7.5 e pS.
[0120] Representação esquemática de promotores p7.5, PS e pHyb. Elementos promotores prematuro e tardio não são traçados em escala.
[0121] Sequência de nucleotídeos dos promotores p7.5 (SEQ ID NO:5), pS (SEQ ID NO:2) e pHyb (SEQ ID NO:1). A região onde o elemento promotor prematuro p7.5 foi otimizada é encaixado na sequência p7.5 e a sequência otimizada é mostrada abaixo. Linha sólida única: elemento de promotor tardio. Linha dupla: elemento promotor prematuro.
[0122] Figura 2: expressão de eGFP dirigida por MVAs recombinantes
[0123] MVAs recombinante contendo o quadro de leitura aberta eGFP sob controle dos promotores indicados foram utilizados para infectar células HeLa (A, C) e CEF (B) em uma multiplicidade de infecção (MOI ou m.o.i.) de 5. As células foram tratadas com citosina arabinoside (+AraC) ou foram deixadas não tratadas (-AraC) durante infecção (A, B). as células foram colhidas 16h p.i. (A, B) e analisadas por citometria de fluxo para expressão de eGFP. C) as células HeLa foram infectadas com MVA-p7.5-eGFP (“p7.5”), MVA-pS- eGFP (“PS”), e MVA-pHyb-eGFP (“pHyb”), ou incubadas com meio (“simulado”). Nos tempos indicados após infecção, as células foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo para expressão de eGFP. Os experimentos foram independentemente repetidos pelo menos duas vezes.
[0124] Figura 3: análise de respostas de célula T CD8 específicas de MVA e ovalbumina de galinha (OVA) induzidas por MVAs recombinantes.
[0125] MVA-p7.5-OVA, MVA-pS-OVA (“pS”), e MVA-pHyb- OVA (“pHyb”) foram utilizados para imunizar grupos de 5-6 camundongos BALB/c de modo intraperitoneal (i.p.) em uma dose de 108 TCID50 por camundongo (A). Os camundongos foram reforçados com uma segunda (B), e terceira (C) injeção i.p. 4 e 8 semanas após a primeira imunização, respectivamente. Leucócitos do sangue foram analisados 6-8 dias após os 1° e 6° dias após a 2a e 3a imunização para indução de respostas de célula T CD8 específicas de OVA (“OVA”) e específicas de vetor (“B8R”). A quantificação de células T CD8 específicas de antígeno foi feita por coloração de citocina intracelular para IFN-y após um período de reestimulação de 6 h e propagação em linfócitos CD8* CD19- ou CD8* CD4-. Os leucócitos de animais imunizados incubados sem peptídeo serviram como controles “no pept.”). São indicadas as percentagens de células específicas de B8R e OVA entre as células T CD8 totais (A-C). As percentagens de células T CD8 específicas de B8R (CD*B8R) e OVA (CD8OVA) foram utilizadas para calcular as razões de CD8ova para células cd8B8R (d). O log10 das razões foi utilizado para calcular o erro padrão e teste t de Student. São mostrados os resultados combinados de dois experimentos independentes (A-D).
[0126] Figura 4: cinética de respostas de célula T CD8 específicas de MVA e OVA após três imunizações com MVAs recombinantes.
[0127] MVA-p7.5-OVA, MVA-pS-OVA (“pS”), e MVA-pHyb- OVA (“pHyb”) foram utilizados para imunizar grupos de 5-6 camundongos BALB/c de modo intraperitoneal (i.p.) em uma dose de 108 TCID50 por camundongo. (A) os camundongos foram reforçados com uma segunda (B), e terceira (C) injeção i.p. 4 e 8 semanas após a primeira imunização, respectivamente. Leucócitos do sangue foram analisados 4, 6 e 8 dias após a 3a imunização para indução de respostas de célula T CD8 específicas de OVA (“OVA”) e específicas de vetor (“B8R”). A quantificação de células T CD8 específicas de antígeno foi feita por coloração de citocina intracelular para IFN-y após um período de reestimulação de 6 h e propagação em linfócitos CD8* CD19- (painéis superiores) ou por coloração de dextrâmero classe I MHC (painéis inferiores). Os leucócitos de animais imunizados incubados sem peptídeo serviram como controles “no pept.”). São indicadas as percentagens de células específicas de B8R e OVA entre as células T CD8 totais.
[0128] Figura 5: células T CD8 de memória específicas de MVA e OVA
[0129] Leucócitos de camundongos BALB/c imunizados com MVA-p7.5-OVA, MVA-pS-OVA, e MVA-pHyb-OVA foram preparados e analisados 28 dias (A) e 92 dias (B) após a terceira imunização por ICCS para IFN-y para quantificar células T CD8 específicas de B8R e OVA. Os animais eram de um dos dois experimentos mostrados na figura 3. Três dos cinco camundongos imunizados três vezes com MVA-pHyb-OVA e cinco camundongos imunizados três vezes com MVA-p7.5-OVA e MVA-pS-OVA foram vacinados uma quarta vez com os respectivos recombinantes MVA que expressam OVA 14 semanas após a terceira imunização. Os camundongos foram analisados por IFN-y-ICCS para células T CD8 específicas de B8R e OVA em sangue (C) e baço (D) 6 dias após a imunização de reforço. Leucócitos dos animais imunizados incubados sem peptídeo serviram como controles (“sem pept.”)
Exemplos
[0130] Os seguintes exemplos ilustrarão adicionalmente a presente invenção. Será bem entendido por uma pessoa versada na técnica que os exemplos fornecidos de modo algum podem ser interpretados em um modo que limite a aplicabilidade da tecnologia fornecida pela presente invenção para esse exemplo.
[0131] A análise estatística de dados foi feita utilizando um teste ANOVA de medições repetidas em duas vias se não indicado de outro modo.
Exemplo 1: geração de recombinantes MVA-BN
[0132] Um promotor híbrido tardio/prematuro designado pHyb contendo um elemento tardio a partir do promotor ATI de vírus de vacínia e cinco elementos promotores prematuros dispostos de modo tandem foi construído (figura 1). Os elementos promotores prematuros foram baseados no promotor p7.5 e otimizados adicionalmente utilizando dados publicados (Broyles, S. S. 2003. Vaccinia virus transcription. J. Gen. Virol. 84:2293-2303; Chakrabarti, S., J. R. Sisler, e B. Moss. 1997. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. Biotechniques 23:1094-1097; Davison, A. J. e B. Moss. 1989. Structure of vaccinia virus early promoters. J. Mol. Biol. 210:749-769). O promotor pHyb foi comparado com o promotor pS sintético amplamente utilizado que dirige expressão de gene de nível elevado e com o promotor p7.5 natural (Cochran, M. A., C. Puckett, e B. Moss. 1985. In vitro mutagenesis of the promoter region for a vaccinia virus gene: evidence for tandem early and late regulatory signals. J. Virol. 54:3037) (Fig. 1). Essas construções de promotor foram clonadas à montante dos quadros de leitura aberta para ovalbumina de galinha (OVA) ou eGFP e introduzidas nos genomas de virus MVA por recombinação homóloga.
[0133] O promotor pHyb foi montado utilizando um elemento tardio a partir do promotor que dirige a expressão da proteína de inclusão do tipo A (ATI) em vírus de vacínia (Funahashi, S., T. Sato, e H. Shida. 1988. Cloning and characterization of the gene encoding the major protein of the A-type inclusion body of cowpox virus. J. Gen. Virol. 69 (Pt 1):35-47; Patel, D. D., C. A. Ray, R. P. Drucker, e D. J. Pickup. 1988. A poxvirus-derived vector that directs high levels of expression of cloned genes in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85:9431-9435). Os cinco elementos prematuros dispostos de forma em tandem foram derivados do promotor p7.5 e foram modificados em 4 posições de nucleotídeos na região de núcleo crítica rica em A de 16 nucleotídeos como descrito (Davison, A. J. e B. Moss. 1989. Structure of vaccinia virus early promoters. J. Mol. Biol. 210:749-769). O promotor p7.5 natural utilizado aqui consistiu em um fragmento de DNA com 104 pares base de comprimento contendo o elemento promotor tardio e o prematuro. A sequência do promotor pS prematuro/tardio sintético forte compreendia 40 nucleotídeos casando exatamente com a sequência que foi anteriormente descrita (Chakrabarti, S., J. R. Sisler, e B. Moss. 1997. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. Biotechniques 23:1094-1097). MVAs recombinantes foram gerados utilizando uma versão clonada do genoma MVA- BN em um cromossomo artificial de bactéria (BAC). Em resumo, as construções de promotor pHyb e pS foram clonadas à montante dos quadros de leitura aberta para ovalbumina de galinha (OVA) ou proteína fluorescente verde intensificada (eGFP). Esses cassetes de expressão foram flanqueados com braços de homologia de aproximadamente 45 nucleotídeos por PCR e introduzidos na região intergênica entre genes MVA136 e MVA137 por recombinação homóloga para obter MVA-BACs recombinantes. Vírus infecciosos foram reconstituídos de BACs por transfectar DNA BAC em células BHK-21 e superinfectar com vírus de fibroma shope como vírus auxiliar. Após três passagens em células CEF, vírus livres de auxiliar (confirmado por PCR) MVA-pHyb-eGFP e MVA-pHyb-OVA expressando eGFP ou OVA sob controle do promotor pHyb e MVA- pS-eGFP e MVA-pS-OVA expressando eGFP ou OVA sob controle do promotor pS foram obtidos.
Exemplo 2: cultura de células e arresto de ciclo de células por AraC
[0134] Células de fibroblasto de embrião de galinha primárias (CEF) foram preparadas de embriões com 11 dias de idade e cultivadas em VP-SFM (meio livre de soro; Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). As células HeLa foram cultivadas em DMEM/10% FCS (Invitrogen). As células foram infectadas com 10 TCID50 por célula dos recombinantes de MVA expressando eGFP sob controle dos promotores indicados. Após os pontos de tempo indicados, as células infectadas foram colhidas por tripsinização e analisadas por citometria de fluxo para níveis de expressão eGFP utilizando um analisador de citometria de fluxo LSR II (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Onde indicado, citosina arabinosídea (AraC) foi adicionada ao meio durante toda a infecção em uma concentração final de 40 ug/ml para deter a replicação de MVA na fase prematura.
Exemplo 3: imunização de camundongos
[0135] Camundongos fêmeas C57BL/6 com 6 a 8 semanas de idade foram adquiridos de Harlan Winkelmann, Alemanha. Os grupos de 5 camundongos foram imunizados através da via intraperitoneal com um inoculo de 200 ul contendo 108 TCID50 dos recombinantes MVA respectivos nas semanas 0, 4, 8 e semanas 12 ou 22 para análise de células T e semanas 0, 2 e 4 para análise de anticorpos anti-OVA e anti-MVA. O sangue foi tirado através da veia da cauda nos pontos de tempo indicados e processado como descrito abaixo para análise de respostas de célula T CD8. onde indicado, os baços foram colhidos 7 dias após a última imunização para análise de respostas de célula T CD8.
Exemplo 4: coloração de citocina intracelular (ICCS)
[0136] Animais imunizados foram sangrados da veia da cauda e 100-120 ul de sangue por camundongo foram suspensos novamente em 2 ml de PBS (pH 7,4) contendo 4% de soro de vitelo fetal (FCS), 2 mM de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) e 2.5 U/ml de heparina. Amostras de sangue foram divididas em três alíquotas e hemácias foram lisadas utilizando Tampão de lisar de Hemácias (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha). Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram finalmente resuspensas novamente em 2 ml de RPMI/10% de FCS contendo e 0.05 mM B-mercaptoetanol, 1 ul/ml Golgi/Plug™ (BD Biosciences) bloqueando secreção de citocinas através da via exocitótica, e 1 ug/ml de peptídeos OVA257-268 SIINFEKL (SEQ ID NO:3; “OVA”), B8R20-27 TSYKFESV (SEQ ID NO:4; “B8R”), ou sem peptídeo (“no pept.”). Peptídeos foram adquiridos de Prolmmune (Oxford, UK). Frequências de células T CD8 para o epítopo TSYKFESV restrito a H-2Kb imunodominante derivado de aminoácidos 20-27 da proteína prematura B8R viral (Tscharke, D. C., G. Karupiah, J. Zhou, T. Palmore, K. R. Irvine, S. M. Haeryfar, S. Williams, J. Sidney, A. Sette, J. R. Bennink, and J. W. Yewdell. 2005. Identification of poxvirus CD8+ T cell determinants to enable rational design and characterization of smallpox vaccines. J. Exp. Med. 201:95-104) foram determinadas como uma medida representativa de respostas de célula T CD8 específicas de vetor. PBMC foram incubados por 5 h a 37°C em 5% CO2, colhidos por centrifugação, suspensos novamente em 3 ml de PBS frio/10% FCS/2 mM EDTA pH 7,4 e armazenados durante a noite a 4°C. No dia seguinte, PBMC foram corados com anticorpos anti-CD8α-Pac-Blue, anti-CD4-PerCP-Cy5.5, anti-CD62L-PE- Cy7, e em alguns experimentos com anti-CD127-APC (todos os anticorpos da BD Biosciences). PBMC foram incubados com diluições apropriadas dos anticorpos indicados por 30 min. a 4°C no escuro. Após lavagem, as células foram fixadas e permeabilizadas utilizando o Cytofix/CytopermTM Plus kit (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Após lavagem, PBMC foram corados para interferon-y intracelular (IFN-y) e fator-α de necrose de tumor (TNF- α) utilizando anticorpo anti-IFN-y conjugado com FITC e anticorpo anti- TNF-α conjugado com PE (BD Biosciences). Os anticorpos foram diluídos em tampão de lavagem/perm (BD Biosciences) e os PBMC foram corados por 20 min. a 4°C no escuro. Após lavagem, as células coradas foram analisadas por citometria de fluxo em um sistema BD Biosciences LSR II.
Exemplo 5: coloração de dextrâmero e pentâmero MHC classe I
[0137] Animais imunizados foram sangrados da veia da cauda e 100-120 ul de sangue por camundongo foram suspensos novamente em 2 ml de PBS (pH 7,4) contendo 4% de soro de vitelo fetal (FCS), 2 mM de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) e 2.5 U/ml de heparina. A amostra integral ou uma alíquota não utilizada para ICCS foram imediatamente submetidas à coloração de células T CD8 específicas de OVA e B8R por anti-CD8α-Pac-Blue e pentâmeros MHC classe I (Prolmmune) ou por dextrâmeros MHC classe I (IUmmudex, Copenhague, Dinamarca) complexados com os respectivos peptídeos de ligação H-2Db SIINFEKL e TSYKFESV. Pentâmeros MHC classe I específicos de B8R e OVA foram ambos rotulados com APC e as respectivas populações de células T CD8 foram coradas em duas reações separadas. Dextrâmeros de MHC classe I foram rotulados com PE (SIINFEKL-dextrâmero) ou APC (TSYKFESV-dextrâmero) e foram combinados em uma reação de coloração juntamente com anti-CD8α-Pac-Blue. Após lavagem, células coloridas foram analisadas por citometria de fluxo em um sistema BD Biosciences LSR II.
Exemplo 6: ELISA para detecção de anticorpos específicos de MVA em soro de camundongo.
[0138] Placas com 96 cavidades foram revestidas com extrato bruto de células CEF infectadas com MVA-BN®. Diluições seriais em duas vezes de soro foram incubadas por 1 hora em RT. Se necessário, pré-diluições de soros de camundongos foram preparadas. Para detecção, as placas foram incubadas com um anticorpo de detecção IgG-HRP de carneiro- anti-camundongo (Serotec) por 1 h em RT. TMB (Sigma-Aldrich) foi utilizado como substrato e a reação foi parada por adicionar 1M H2SO4 (Merck). OD foi medido em 450 nm com uma Leitora de Absorvência Tecan F039300 Sunrise (Maennedorf, Suíça).
Exemplo 7: ELISA para detecção de anticorpos específicos de OVA em soro de camundongo
[0139] Placas com 96 cavidades foram revestidas com 0,25 ug/cavidade de ovalbumina de galinha (Sigma-Aldrich). Diluições seriais em duas vezes de soro foram incubadas durante a noite a 4°C. Se necessário, pré-diluições de soros de camundongos foram preparadas. Anticorpo H+L IgG de burro- anti-camundongo biotinilado (Dianova) foi adicionado às placas por 2 horas em temperatura ambiente. Para a detecção de anticorpo secundário biotinilado, Streptavidina-HRP (Amersham Biosciences) foi adicionado às placas e incubado por 2 horas em temperatura ambiente. ABTS (Sigma/Aldrich)/0,03% de H2O2/0.1M de ácido cítrico foi utilizado para revelar o ensaio. OD foi medido em 405 nm, comprimento de onda de referência 492 nm, com uma Leitora de Absorvência Tecan F039300 Sunrise.
Exemplo 8: expressão de eGFP dirigido por MVAs recombinantes
[0140] A expressão de eGFP em células HeLa não tratadas, que são não permissivas para MVA foi permissiva para MVA, os promotores PS e p7.5 dirigiram expressão eGFP total mais elevada do que o promotor pHyb (figura 2B). Para analisar a expressão de gene prematura separadamente, o ciclo de infecção de MVA foi detido em sua fase prematura por tratamento com AraC por 16 h. Sob essas condições, o promotor de pHyb dirigiu expressão de eGFP muito mais elevada do que os promotores pS e p7.5 (figuras 2A, B). Na realidade, os níveis de eGFP em células infectadas com MVA-pHyb-eGFP não foram influenciados por AraC. Isso mostrou que o arranjo em tandem dos cinco elementos prematuros em pHyb (figura 1) era responsável pelo aumento observado em expressão de antígeno prematura.
[0141] Uma análise sintética de expressão de eGFP em células HeLa mostrou que o promotor pHyb dirigiu expressão de proteína nos 30 primeiros minutos de infecção, ao passo que expressão de eGFP significativa do promotor PS não se tornou detectável antes de 90 min. (figura 2C). Além disso, o promotor pHyb dirigiu níveis mais elevados de expressão eGFP durante todas as 6 primeiras horas de infecção (figura 2C). Os níveis de expressão do promotor p7.5 e pS atingiram aqueles induzidos pelo promotor pHyb somente tarde em infecção após mais de 6 horas. Consequentemente, em todos os pontos de tempo entre 0,5 e 6 h após infecção, a expressão de eGFP com o promotor pHyb foi significativamente mais elevada do que aquela obtida com o promotor p7.5 e pS. Igualmente importante, a atividade do promotor pHyb foi detectável muito cedo em 30 min. de infecção, ao passo que p7.5 e pS exigiram três vezes mais tempo para induzir expressão eGFP detectável.
Exemplo 9: análise de respostas de célula T CD8
[0142] Respostas de célula T CD8 contra OVA expressa de forma recombinante sob o controle dos promotores p7.5, PS e pHyb foram determinadas em camundongos C57BL/6 após uma, duas, três e quatro imunizações com 108 TCID50 de MVA recombinante por camundongo. A resposta de célula T CD8 específica de OVA foi determinada por ICCS para IFN-y após estimulação com o peptídeo derivado de OVA restrito a Kb SIINFEKL. Para monitorar a resposta de célula T CD8 para o vetor MVA, células T CD8 reconhecendo o epítopo de células T CD8 imunodominante a partir da proteína prematura B8R poxviral foram quantificadas por ICCS. Uma semana após a primeira imunização, proporções similares de células T CD8 específicas de OVA foram observadas independente do tipo de promotor utilizado (figura 3A). Os números levemente mais elevados de células T CD8 específicas de OVA observados após a segunda imunização com MVA-pHyb-OVA comparados com MVA-pS- OVA e MVA p7.5-OVA (figura 3b) não foram estatisticamente significativos (p=0,27 e 0,62, respectivamente). Respostas de célula T CD8 específicas de B8R também não diferiram significativamente após a primeira e segunda imunização (p>0,5, figura 3A, B). Após a terceira imunização com MVA- pHyb-OVA, respostas de célula T CD8 específicas de OVA significativamente mais fortes foram observadas em comparação com imunização tripla com MVA-pS-OVA (p<0,01) e com MVA-p7.5-OVA (p<0,001) (figura 3C). Ao contrário, não houve diferença significativa nas proporções de células T CD8 específicas de B8R de camundongos imunizados com MVA- pHyb-OVA em comparação com camundongos tratados com as duas outras construções MVA (p>0,19).
[0143] Digno de nota, esses resultados demonstram que foi possível aumentar significativamente o número de células T CD8 específicas de OVA mesmo após duas imunizações prévias com a construção de vírus MVA homóloga. A capacidade do vetor MVA reforçar respostas de célula T CD8 específicas de antígeno foi independente do promotor (p<0,001 para células T CD8 específicas de OVA após 3 vs. 2 imunizações homólogas com cada das três construções MVA recombinantes). A proporção de células T CD8 específicas de OVA atingiu números excepcionalmente elevados após três imunizações com MVA-pHyb-OVA. Até 20% de todas as células T CD8 foram específicas de OVA 6 dias após a terceira imunização com essa construção (figura 3C). Proporções quase iguais de células T CD8 específicas de OVA comparadas com células T CD8 específicas de B8R foram detectadas no dia 6 após a terceira imunização com MVA-pHyb-OVA utilizando ICCS (figura 3C). Isso foi devido parcialmente à diminuição em números relativos de células T CD8 específicas de B8R, sugerindo que expansão de células T CD8 específicas de OVA sensibilizadas foi estimulada com eficiência mais elevada (figura 3C). A razão de células T CD8 específicas de OVA para específicas de B8R foi significativamente diferente após 3 imunizações com MVA-pHyb-OVA em comparação com os dois outros promotores (figura 3D). Ao contrário, essa razão era muito similar para todas as três construções após a primeira imunização. O efeito de intensificação de pHyb estava se tornando evidente após 2 imunizações porém não foi estatisticamente significativo nesse ponto de tempo (figura 3D). Tomadas juntas, as razões CD8OVA:CD8B8R indicam que o promotor pHyb exerce sua vantagem em imunizações de reforço e particularmente após o segundo reforço. Notadamente, as razões CD8OVA:CD8B8R também sugerem que o promotor pS foi realmente menos eficiente do que o promotor pHyb porém teve uma vantagem em relação ao promotor p7.5 (figura 3D).
[0144] Quando respostas de célula T CD8 específicas de OVA foram analisadas em pontos de tempo diferentes após a terceira imunização, verificou-se que células T CD8 específicas de OVA eram imunodominantes em pontos de tempo específicos após o reforço como determinado por ICCS (figura 4). A reversão de imunodominância foi observada em 4 ou 6 dias após a terceira imunização dependendo do experimento (figura 4 e dados não mostrados). Em alguns experimentos, quatro imunizações com MVA-pHyb-OVA foram necessárias para obter uma razão de OVA para células T CD8 específicas de B8R de >1 (dados não mostrados). Ao contrário, após três ou quatro imunizações com MVA-pS-OVA, células T CD8 específicas de B8R sempre permaneceram imunodominantes (figura 4 e dados não mostrados). Esses resultados foram confirmados por empregar o método de coloração de dextramer™ MHC classe I, uma modificação da técnica de coloração de tetrâmero MHC classe I bem descrita. Utilizando essa abordagem, células T CD8 específicas de OVA mais elevadas do que específicas de B8R foram observadas em todos os pontos de tempo após a terceira imunização com MVA-pHyb-OVA, porém nunca com o promotor p7.5 ou pS (figura 4). Desse modo, somente o promotor pHyb foi capaz de reverter imunodominância de células T CD8 em favor do antígeno acionado por pHyb.
Exemplo 10: memória de células T CD8
[0145] Na fase de memória inicial, em 28 dias após a terceira imunização com MVA-pHyb, células T CD8 específicas de OVA ainda excederam em número células T CD8 específicas de B8R e foram significativamente mais elevadas em comparação com camundongos imunizados três vezes com MVA-pS-OVA (figura 5A, p=0,0035). A análise de memória de célula T CD8 de longo prazo em sangue de camundongos 13 semanas após a terceira imunização demonstrou que células T CD8 específicas de OVA ainda eram significativamente mais elevadas para MVA-pHyb- OVA em comparação com MVA-pS-OVA (figura 5B, p<0,001 utilizando teste t de Student) e MVA-p7.5-OVA (p=0,03). Esse resultado foi confirmado por coloração com pentâmeros MHC classe I detectando células T CD8 específicas de B8R e OVA (dados não mostrados). Independente do tipo de promotor, aproximadamente 70-80% de todas as células T CD8 específicas de OVA detectadas por coloração de pentâmero MHC classe I foram do fenótipo de memória efetora (CD62L-/CD127+) em 12 semanas após a terceira imunização (dados não mostrados). Em conclusão, pHyb foi capaz de induzir uma resposta de célula T CD8 de duração longa e forte contra o antígeno e as proporções de células específicas de B8R e OVA encontradas na fase prematura após a terceira imunização com as três construções de MVA foram essencialmente conservadas na fase de memória.
Exemplo 11: efeito de quatro imunizações
[0146] Quatorze semanas após a terceira imunização os camundongos foram novamente reforçados com as mesmas construções de MVA para determinar se as proporções de células T CD8 específicas de OVA no sangue de camundongos imunizados com MVA-pS-OVA ou MVA-p7.5-OVA alcançariam e atingiriam níveis similares daqueles de animais imunizados com MVA-pHyb-OVA. Entretanto, MVA-pHyb-OVA foi novamente mais eficiente e induziu o número mais elevado de células T CD8 específicas de OVA em sangue (figura 5C). Ao contrário de pHyb, pS e p7.5 não foram capazes de deslocar o padrão de imunodominância em favor de células T CD8 específicas de OVA mesmo após quatro imunizações. A análise de esplenócitos a partir dos mesmos camundongos mostrou uma razão muito similar de células T CD8 específicas de OVA para específicas de B8R em comparação com as razões das duas especificidades de células T CD8 em sangue (figura 5C, D) indicando que os números relativos de células T CD8 específicas de OVA e B8R obtidas por análise de sangue periférico foram representativas para o compartimento de célula T CD8 integral.

Claims (28)

1. Vírus vacínia Ancara modificado (MVA) recombinante que codifica pelo menos um antígeno, pelo menos um epítopo antigênico ou pelo menos um antígeno e pelo menos um epítopo antigênico caracterizado pelo fato de que a expressão do referido antígeno e/ou epítopo antigênico é regulada por um elemento de controle de transcrição compreendendo um promotor prematuro/tardio que aciona a expressão prematura do referido pelo menos um antígeno, pelo menos um epítopo antigênico ou pelo menos um antígeno e pelo menos um epítopo antigênico, e em que o promotor prematuro/tardio compreende pelo menos uma cópia de um elemento promotor tardio ATI de cowpox, e pelo menos cinco cópias de um elemento promotor prematuro de acordo com os nucleotídeos 48 a 81 da SEQ ID NO: 1, em que o MVA recombinante expressa em células Hela um nível do antígeno codificado na presença de 40 μg/mL de AraC que é de pelo menos 50% do nível do antígeno codificado na ausência de AraC.
2. Vírus MVA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido MVA tem a capacidade de replicação reprodutiva in vitro em células de fibroblasto de embrião de galinha (CEF), porém não possui capacidade de replicação reprodutiva na linhagem de células de queratinócito humano HaCaT, na linhagem de células de rim de embrião humano 293, na linhagem de células de osteossarcoma humano 143B, e na linhagem de células de adenocarcinoma de colo humano HeLa.
3. Vírus MVA recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido MVA é MVA-BN como depositado no ECACC sob o número V00083008.
4. Vírus MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido promotor prematuro/tardio que aciona a expressão prematura é de sequência otimizada.
5. Vírus MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o promotor prematuro/tardio compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.
6. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o vírus MVA recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e (i) um veículo, (ii) diluente, (iii) adjuvante e/ou (iv) aditivo farmaceuticamente aceitável, ou (v) pelo menos dois dentre (i) a (iv).
7. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende o vírus MVA recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e (i) um veículo, (ii) diluente, (iii) adjuvante e/ou (iv) aditivo farmaceuticamente aceitável, ou (v) pelo menos dois dentre (i) a (iv).
8. Vírus MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de induzir uma resposta de célula T em um hospedeiro a pelo menos um antígeno, a pelo menos epítopo antigênico ou a pelo menos um antígeno e pelo menos um epítopo antigênico.
9. Vírus MVA recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é uma resposta de célula T CD8.
10. Vírus MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo administrações de sensibilização/reforço homólogas.
11. Vírus MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo pelo menos três ou pelo menos quatro administrações.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser para induzir uma resposta de célula T em um hospedeiro a pelo menos um antígeno, a pelo menos epítopo antigênico ou a pelo menos um antígeno e pelo menos um epítopo antigênico.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é uma resposta de célula T CD8.
14. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo administrações de sensibilização/reforço homólogas.
15. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo pelo menos três ou pelo menos quatro administrações.
16. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser para induzir uma resposta de célula T em um hospedeiro a pelo menos um antígeno, a pelo menos epítopo antigênico ou a pelo menos um antígeno e pelo menos um epítopo antigênico.
17. Vacina, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é uma resposta de célula T CD8.
18. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 17, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo administrações de sensibilização/reforço homólogas.
19. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo pelo menos três ou pelo menos quatro administrações.
20. Uso do vírus MVA recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 6 ou da vacina conforme definida na reivindicação 7 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para induzir uma resposta de célula T em um hospedeiro a pelo menos um antígeno, a pelo menos epítopo antigênico ou a pelo menos um antígeno e pelo menos um epítopo antigênico.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é uma resposta de célula T CD8.
22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 0 a 21, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo administrações de sensibilização/reforço homólogas.
23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 0 a 22, caracterizado pelo fato de que a resposta de célula T é induzida por um regime de imunização compreendendo pelo menos três ou pelo menos quatro administrações.
24. Kit caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos dois frascos para imunização de sensibilização/reforço compreendendo o vírus MVA recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 8 a 11 para uma primeira inoculação (“inoculação de sensibilização”) em um primeiro frasco/recipiente e para pelo menos uma segunda em um segundo frasco/recipiente.
25. Kit, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o vírus MVA recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 8 a 11 para uma terceira inoculação em um terceiro frasco/recipiente.
26. Kit, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o vírus MVA recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 8 a 11 para uma inoculação adicional em um frasco/recipiente adicional.
27. Promotor caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 5 elementos de sequência de nucleotídeo de acordo com nt 48 a 81 da SEQ ID NO: 1.
28. Promotor, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um elemento promotor tardio ATI de cowpox.
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