BRPI1006966B1 - método de detecção de reagentes sensíveis à umidade comprometidos pela umidade e método de medição de leucócitos em amostras de urina com tiras de teste - Google Patents
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Abstract
DISPOSITIVO E MÉTODO PARA DETECÇÃO DE TIRAS DE TESTE DE URINA COMPROMETIDAS PELA UNIDADE. A presente invenção refere-se à sincronização da reação de reagentes sensíveis à umidade para detecção da presença de analitos, por exemplo, leucócitos em amostras de urina, que é usada para detectar quando os reagentes foram comprometidos pela umidade em excesso. A proporção de refletância da luz em comprimentos de onda característicos dos produtos de reação entre os reagentes e o analito e um corante de referência infravermelho é medida em dois tempos preajustados após uma amostra de urina ter sido aplicada a uma tira de teste e usada para determinar se os reagentes foram comprometidos pela umidade excessiva. A presença de amostras excepcionalmente escuras é determinada a partir da luz refletida a 470 e 626 nm de forma a confirmar se as tiras de teste estão comprometidas pela umidade.
Description
[001] A presente invenção refere-se, de modo geral, aoaprimoramento do desempenho e confiabilidade de tiras de teste que empregam reagentes sensíveis à umidade, particularmente aqueles usados para determinar a presença de analitos em amostras de urina, tais como albumina, proteína, creatinina, nitrato, uristatina, esterase de leucócito (células sanguíneas brancas), sangue oculto (células sanguíneas vermelhas), cetonas, glicose, bilirrubina, urobilogênio e outros familiares para aqueles versados na técnica. Medição de proteases e inibidores de protease, tal como esterase de leucócito (elastase humana) ou inibidor de tripsina urinária (Bicunina, Uristatina) são especialmente importantes pelo fato de que eles podem indicar infecções dos rins ou trato urogenital. Essas tiras de protease e inibidor de protease contam com hidrólise de substratos proteolíticos por proteases para gerar sinais detectáveis. Uma vez que as reações bioquímicas requerem água para que hidrólise enzimática ocorra, elas tendem a ser sensíveis à umidade e podem interferir com os sinais detectáveis através de reações de base.
[002] A Patente U.S. N° 5.663.044 é incorporada neste documentopor referência. Essa patente descreve a técnica antecedente no campo de detecção de leucócito, esterase ou protease e ensina, em geral, o uso de uma composição incluindo um sal de diazônio, um de um grupo de ésteres submetidos à hidrólise na presença de leucócito, esterase ou protease e um metal alcalino terroso. A patente '044 ensina a medição de refletância da luz em torno de 570 nm para determinar a quantidade de leucócitos na amostra de urina. A refletância a 570 nm é comparada com uma medição padrão de refletância a 690 nm. A patente indica que a presença de metal alcalino terroso promove a estabilidade do sal de diazônio. Ela também sugere que o metal alcalinoterroso absorve a umidade a qual pode causar alteração de cor de base. A experiência mostrou que esse sistema de reagente é sensível à umidade e que as tiras de teste devem ser mantidas em um ambiente seco antes do uso. O teor de umidade de tiras de teste deverá ser mantido abaixo de 2% em peso para evitar degradação de desempenho. Contudo, medição de umidade em tiras de teste não é muito precisa. Há uma necessidade particular de medir o teor de umidade muito precisamente para assegurar que as tiras de teste sejam estáveis em um recipiente seco fechado durante vários anos.
[003] Outro exemplo do uso de reagentes sensíveis à umidade édiscutido nas Patentes U.S. N°s 6.770.764; 6.955.921 e 7.001.737 incorporadas neste documento por referência. Nas reações descritas, a presença de inibidores de tripsina em uma amostra de urina é detectada pela adição de uma amostra à tiras de teste contendo uma quantidade conhecida de tripsina, um substrato de tripsina, isto é, ésteres de arginina hidrolisados pela tripsina para produzir um álcool e um sal de diazônio. Quando inibidores de tripsina estão presentes, eles inibem a reação entre a tripsina e o substrato. Isso reduz a cor produzida pelo sal de diazônio a partir de sua reação com o fenol produzido quando o substrato de tripsina reage com a quantidade conhecida de tripsina. Medindo a cor produzida, a presença de inibidores de tripsina pode ser determinada.
[004] Na Patente U.S. N° 6.316.264, um corante infravermelho (IV) éadicionado a um local predeterminado sobre tiras reagentes de forma a assegurar que as tiras são apropriadamente alinhadas no instrumento usado para detectar e/ou medir a presença de analitos em uma amostra aplicada à tira. A faixa de IV para os corantes estava amplamente entre 700 e 2500 nm, mas corantes tendo forte absorbância na faixa de 825 a 855 nm são mencionados como sendo preferidos, com a absorbância na faixa visível (400 a 700 nm) menor do que 20%.
[005] Conforme sugerido acima, seria vantajoso se tiras de teste deurina que são comprometidas pela umidade pudessem ser identificadas com precisão aprimorada para prevenir uso não seguro e corrigir os resultados afetados pela umidade. Uma vez que reagentes os quais envolvem hidrólise de substratos proteolíticos são especialmente sensíveis à umidade, se os reagentes em si pudessem ser usados para indicar a presença de umidade indesejável, aprimoramento significativo seria obtido. A presente invenção provê tal método, o qual será descrito em detalhes abaixo.
[006] A invenção tem aplicação a tiras de teste sensíveis à umidadeque são usadas para medir a hidrólise de substratos proteolíticos usados para detectar protease ou inibidores de protease. Um exemplo é encontrado na detecção de leucócitos, esterase ou protease, conforme descrito na Patente U.S. N° 5.663.044. Outro exemplo é encontrado na detecção de inibidores de tripsina urinária descritos nas Patentes U.S. N°s 6.770.764; 6.955.921; e 7.001.737.
[007] Em geral, a invenção é um método de detecção de umidadeexcessiva em tiras de teste empregando reagentes sensíveis à umidade. Medindo a cor ou outra resposta desenvolvida por reagentes sensíveis à umidade logo após aplicação de uma amostra e comparando o resultado com um corante de referência infravermelho conhecido, reagentes comprometidos pela umidade são identificados e o resultado pode, então, ser sinalizado ou descartado.
[008] Quando a cor desenvolvida é medida pela refletância da luz, ovalor da proporção de refletância (isto é, a proporção da refletância dos reagentes para a refletância do corante de referência) imediatamente após a aplicação de uma amostra é comparado com o valor da proporção de refletância tomada um breve momento depois e usada para determinar o efeito de umidade excessiva e rejeitar os reagentes se eles estão comprometidos pela umidade. Uma segunda proporção de refletância pode ser medida para determinar se a amostra está excepcionalmente colorida e pode estar afetando os resultados. Em uma modalidade preferida, para detecção de reagentes de leucócito comprometidos pela umidade, os reagentes incluem um sal de diazônio, por exemplo, DNS A (ácido 1-diazo-2-naftol-4-sulfônico), que reage com um éster hidrolisável, por exemplo, PPTA (éster de 2-hidróxi-5-fenil-pirrol- N-tosil-L-alanina). Quando esterase de leucócito está presente na amostra de urina, é produzida uma cor em proporção à quantidade de leucócitos presentes. Nessa modalidade, a refletância no comprimento de onda da luz de 520 a 570 nm é comparada com a refletância de cerca de 825 nm característica do corante de referência.
[009] A única figura é um fluxograma para determinação do teor deleucócito de uma amostra ou rejeição do resultado como comprometido pela umidade.
[0010] A invenção inclui um método aprimorado de medição dehidrólise de substratos proteolíticos em amostras de urina aplicadas a tiras de teste. Em geral, reagentes baseados em substratos proteolíticos podem ser usados para detectar qualquer protease. A sequência de aminoácido dos reagentes corresponde ao tipo preferido pela protease que está sendo detectada e a sequência de aminoácido é presa a uma porção de geração de sinal que, quando de hidrólise, forma o sinal. Um exemplo desse princípio é a detecção de esterase de leucócito, a qual é usada para detectar a presença de leucócitos em uma amostra, conforme descrito na Patente U.S. N° 5.663.044. A presença de leucócitos está correlacionada com a refletância da luz no comprimento de onda característico dos reagentes com referência à refletância da luz em um comprimento de onda característico de um corante de referência infravermelho. A comparação de refletância medida é correlacionada com a presença de leucócitos após um tempo de incubação de cerca de 20 segundos a 3 minutos após aplicação de uma amostra de urina aos reagentes. Tais tiras de teste podem estar comprometidas pela umidade em excesso, a qual pode reduzir a atividade do reagente e mostrar falsamente um desenvolvimento de cor indicativo da presença de leucócitos em uma amostra de urina. Medindo proporção de refletância a partir dos reagentes para o corante de referência infra-vermelho durante o primeiro minuto após uma amostra de urina ter sido aplicada aos reagentes, o método da invenção determina se os reagentes foram comprometidos pela umidade em excesso.
[0011] Reagentes baseados em substratos proteolíticos tambémpodem ser usados para detectar um inibidor de protease. Novamente, a sequência de aminoácido corresponde ao tipo preferido pelo inibidor de protease, a sequência sendo presa a uma porção de geração de sinal que, quando de hidrólise, forma o sinal. A protease é adicionada ao reagente e, portanto, gera um sinal quando o inibidor não está presente na amostra. A ausência de um sinal é usada para determinar a presença de inibidor de protease em uma amostra. Um exemplo desse princípio é detecção de inibidor de tripsina urinária, conforme descrito nas Patentes U.S. N°s 6.770.764; 6.955.921; e 7.001.737.
[0012] Hidrólise de um substrato proteolítico não atinge o ponto final dareação no curto período de tempo de menos de uns poucos minutos necessários para as tiras usadas em aplicações laboratoriais remotas. As reações de hidrólise continuam a criar um sinal com o tempo e são, tipicamente, medidas cineticamente para permitir leituras que não são dependentes de sincronização pelo operador. Por exemplo, a cor desenvolvida pela reação para leucócitos na urina pode ser medida de 20 a60 segundos e a proporção dos sinais em ambos os momentos usada como um resultado cinético, isto é, mostrando a taxa de alteração da cor. Isso evita que o usuário tenha de esperar 3 minutos completos para obter um resultado.
[0013] A invenção é aplicável a muitos formatos nos quais osreagentes são sensíveis à umidade. Isto é, os reagentes podem reagir na presença de umidade e indicar falsamente a presença de um analito, o qual na verdade não está presente na amostra que está sendo medida. Exemplos de tais reagentes sensíveis à umidade foram mencionados acima. De importância particular para os presentes inventores foi a sensibilidade à umidade de reagentes usados para detectar leucócitos em amostras de urina pela esterase nos leucócitos, conforme discutido abaixo com referência a uma modalidade preferida. Contudo, será evidente que os métodos da invenção têm aplicação a outros reagentes sensíveis à umidade incluindo, mas não limitado a outros reagentes que podem ser usados para medir a presença de leucócitos. Entende-se que tiras de teste podem ter muitos formatos incluindo, mas não limitado a fitas de imersão e cartuchos de fluxo lateral.
[0014] Reagentes de leucócito úteis na invenção que podemproporcionar um método de medição do teor de leucócito de amostras de urina são discutidos na Patente U.S. N° 5.663.044 mencionada acima. Uma composição preferida da invenção foi descrita na tabela 4 da patente '044. Um composto de alanina (PPT; éster de 2-hidróxi-5-fenil-pirrol-N-tosil- L-alanina) serviu como um substrato para esterase de leucócito, a qual hidrolisa o PPTA, após o que o produto hidrolisado reage com o indicador de diazônio (DNSA; ácido 1-diazo-2-naftol-4-sulfônico) para produzir cor. A cor foi medida pelo grau de refletância quando examinada em um comprimento de onda de luz de 520 a 570 nm (570 nm na patente '044). A refletância de 520 a 570 nm foi relacionada a um comprimento de onda padrão a 690 nm. Essa comparação foi usada para compensar as diferenças na cor de base branca do substrato da tira, o qual era celulose branca sobre um poliestireno branco tendo uma refletância > 60% e se aproximando do incolor em comprimentos de onda > ~690 nm. A cor de base branca é particularmente sensível à umidade e uma pequena quantidade pode causar uma grande alteração na proporção de refletância. A base branca é também sensível à cor da urina e pequenas quantidades podem causar grandes alterações na proporção de refletância. Como um resultado, tal proporção de refletância não pode ser usada para medir precisamente a umidade após imersão da tira na urina.
[0015] Na presente invenção, um corante de referência infravermelhoé adicionado tendo uma resposta característica à luz em um comprimento de onda pelo menos 120 nm maior do que a faixa de 520 a 570 nm. Descobriu-se que o comprimento de onda do corante IV e a quantidade usada afetam a precisão de medições ao reduzir a interferência de base. A adição de um corante IV aos reagentes de leucócito proporciona uma menor cor de base de <60% da refletância a >700 e 2500 nm. Essa menor base reduz o efeito da cor da urina sobre a proporção de refletância, mas não o efeito da umidade. Assim, a proporção de refletância pode ser usada para medir precisamente a umidade após imersão de uma amostra em urina.
[0016] Contudo, essa menor cor de base de <60% da refletância a >700 e 2500 nm pode reduzir a capacidade dos reagentes de detectar a hidrólise de substratos proteolíticos. Esse efeito é mostrado na tabela a seguir, onde o efeito da cor de base do substrato reagente é reduzido à medida que a quantidade do corante IV é aumentada. A quantidade de corante IV que um reagente pode tolerar depende do comprimento de onda de referência usado para medir a base, do comprimento de onda de sinal dos substratos, da sensibilidade do substrato à umidade e da sensibilidade do substrato à hidrólise de protease e da quantidade de sinal de corante de base < 700 nm. A tolerância de qualquer dado substrato de hidrólise pode ser determinada conforme mostrado na tabela 1, onde a redução desejada de interferência de base com relação à cor na amostra ocorre em mais de 0,2 mg/dL ou cerca de 0,5% em peso com relação ao corante de referência. Contudo, quando a quantidade de corante é elevada para tão alto quanto 20 mg/dL, a proporção de refletância é aumentada para 1,6 e o sinal é reduzido para o sinal esperado de ~1,0. Assim, a quantidade de corante usada deverá estar limitada àquela necessária para minimizar a interferência de base.
(1) DTO 141, o qual é o corante 3 na tabela 2 do documentoU.S. 6.316.264 e tem o nome químico 3-(5-carboxipentil)-2-[2-[3-[[3-(5- carboxipentil)-1,3-di-hidro-1,1-dimentil-2H-benz[e]indol-2-ilideno]etilideno)-2-(n-hexiltio)-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-1H- benz[e]indólio, sal interno. (2) Reação a 42 células/uL de leucócitos em urina com gravidade específica média e medida usando o instrumento CLINITEK Status® (Siemens Healthcare Diagnositics). (3) Diferença entre urina clínica de cor altamente marrom e uma urina tipicamente de cor amarela. Ambas as urinas careciam de leucócitos e foram medidas usando o instrumento CLINITEK Status®.
[0017] No experimento acima, o reagente de leucócito foi feito a partirde duas saturações sequenciais de papel filtro. A primeira saturação foi com uma mistura aquosa contendo ácido bórico, Bio-Terge AS40, polímero de PVP e NaCl para controlar a resistência iônica. O pH da mistura foi ajustado para 8,8 a 9,3 usando hidróxido de sódio ou ácido clorídrico. A segunda saturação foi uma mistura de solvente de acetona/DMSO contendo DNSA, PPTA, decanol e ácido bórico. Cada uma dentre função dos ingredientes, concentração preferida e faixa permissível é fornecida na tabela abaixo. As soluções de mistura foram usadas para saturar o papel filtro, nesse caso, papel filtro Ahlstrom grau 205 C e o papel seco a 121°C durante 9 minutos após a primeira saturação e a 100°C durante 7 minutos após a segunda saturação. O reagente seco resultante foi processado em tiras reagentes, as quais foram testadas usando o instrumento CLINITEK Status®. TABELA 2
DNSA = ácido 1-diazo-2-naftol-4-sulfônico PPTA = éster de 2-hidróxi-5-fenil-pirrol-N-tosil-L-alanina
[0018] Vários corantes puderam ser usados, incluindo aquelesdescritos na Patente U.S. N° 6.316.264 incorporada neste documento por referência e tendo absorbância característica na região de infravermelho de cerca de 700 a cerca de 2500 nm. Exemplos incluem compostos de ftalocianina e naftalocianina, corantes de complexo de metal (por exemplo, corantes de complexo de metal de ditioleno) e corantes de polimetina, incluindo corantes de cianina. Outros corantes incluem corantes de di e trifenilmetano, corantes de quinona, corantes azo e corantes de transferência de carga e ressonância de carga. Sua característica em comum, sendo que a refletância da luz em um comprimento de onda único é medida pelo menos 120 nm acima daquela do comprimento de onda do reagente. Com relação aos reagentes de leucócito discutidos acima, o corante deverá ter uma refletância característica de pelo menos 700 nm, de preferência acima de 700 e menos de 2500 nm.
[0019] Embora inclusão do corante de referência com os reagentesde leucócito seja uma modalidade preferida, também é possível colocar o corante de referência em outro local, conforme foi feito para fins de alinhamento de uma tira de teste (documento U.S. 6.316.264). As alterações em virtude da umidade que ocorre quando o corante contata a amostra podem diferir daquelas que ocorrem quando o corante está dentro dos reagentes. Contudo, tais diferenças podem ser acomodadas por aqueles versados na técnica.
[0020] Conforme discutido acima, a umidade faz com que osreagentes de leucócito degradem e produzam uma falsa alteração de cor. As enzimas nos leucócitos não são necessárias para hidrolisar o substrato proteolítico, por exemplo, PPTA. Descobriu-se que os reagentes são sensíveis a tão pouco quanto 0,1% de umidade sobre uma tira reagente de leucócito. A taxa de alteração de cor é essencialmente proporcional diretamente à quantidade de água presente. A importância do controle de umidade é evidente quando, após 10 minutos de exposição à Umidade Relativa > 60%, o teste fornece falsos resultados positivos.
[0021] Essa sensibilidade à umidade é usada na invenção paradeterminar se uma tira reagente foi contaminada com umidade. A alteração de cor é determinada primeiro em torno de 20 segundos após uma amostra de urina ter sido aplicada. Se a cor é detectada após 20 segundos, então, se suspeita de contaminação pela umidade. Isso é confirmado se a cor não aumentou significativamente após 60 segundos, isto é, a atividade dos reagentes foi reduzida. Esse método foi confirmado em um experimento no qual tiras de teste foram expostas a 30°C a 80% de umidade durante 10 minutos, condições conhecidas por causar falha dos reagentes. Descobriu-se que vinte e três de vinte e quatro tiras falharam quando a proporção da refletância a 520 nm para a refletância a 820 nm foi usada. A quantidade de corante DTO 141 aplicada foi de 0,2 mg/dL, com relação a 42 mg/dL de PPTA dos reagentes de leucócito. Um experimento paralelo no qual apenas a refletância a 520 nm foi medida, isto é, sem corante presente, falhou em detectar as tiras contaminadas pela umidade em 42% das tiras, isso também sendo verdadeiro quando uma proporção de refletância de 520 nm/870 nm foi usada, mas sem corante presente.
[0022] A influência da cor na amostra de urina também é levada emconta no método da invenção. A mesma cor é medida pela absorbância da luz em torno de 460 nm (dentro da faixa visível). De forma a realizar a medição de cor desenvolvida pelos reagentes de leucócito, uma nova proporção é determinada, isto é, a refletância em torno de 460 nm (para a cor da amostra) dividida pela refletância em torno de 625 nm. Essa proporção impede que amostras de urina escuras sejam consideradas como comprometidas pela umidade. Se a proporção (vezes 100) está acima de 600, a cor da amostra é clara e a refletância é alta. Se for desta forma, então, a tira que está sendo testada será confirmada como comprometida pela umidade se a proporção de refletância a 20 e 60 segundos indicarem que a tira está respondendo de uma maneira anormal. Se a proporção está abaixo de 600, a amostra tem uma cor escura, a qual pode ter afetado os resultados e a tira não é rejeitada se os resultados a 20 e 60 segundos foram satisfatórios.
[0023] A diferença entre a proporção de refletância a 525 nm para arefletância a 825 nm tomada a 20 e 60 segundos após aplicação de uma amostra é usada para determinar se os reagentes foram degradados pela umidade. Em geral, se a primeira leitura (20 s) fornece uma proporção de menos de cerca de 700 (proporção x 1000), então, a umidade em excesso é indicada, uma vez que a refletância a 525 indica que cor significativa já tinha se desenvolvido. Se a segunda leitura é tomada a 60 segundos e comparada com a primeira leitura e a diferença nas leituras é menos de cerca de 50 (proporção x 1000), então, a presença de umidade em excesso é confirmada, uma vez que os reagentes perderam sua atividade normal.
[0024] Por exemplo, três valores são medidos quando os reagentesincluem PPTA e DNSA e o corante de referência é DTO 141. TABELA 3
[0025] Ao aplicar esses valores às leituras de acordo com o procedimento mostrado na figura 1 fornece a rejeição dos resultados como comprometidos pela umidade ou relato dos leucócitos medidos na amostra. Em um exemplo, um instrumento CLINITEK Status® é usado para analisar a amostra de urina quanto à presença de leucócitos. Uma tira absorvente (por exemplo, papel filtro) saturada com soluções reagentes, conforme descrito na tabela 2 acima, tem uma amostra de urina aplicada à mesma e as alterações de cor resultantes são medidas pela refletância da luz no instrumento CLINITEK Status®, de acordo com o procedimento da invenção.
[0026] Se o valor medido de L20-L60 é menos de 50, é possível queumidade em excesso tenha reduzido a atividade reagente de leucócito. Se acima de 50, então, o valor de L20-L60 pode ser usado no cálculo da concentração de leucócito na amostra. Contudo, se o valor está abaixo de 50, a proporção 525/845 nm ainda pode ser capaz de fornecer a concentração de leucócitos. O valor inicial da proporção 525/845 nm (L20) é considerado. Se o valor está abaixo de 700 (proporção x 1000), então, alta absorção de luz a 525 nm é indicada, sugerindo que umidade em excesso estava presente na tira de teste. Combinado com o resultado de L20-L60, então, é provável que os reagentes de leucócito tenham sido comprometidos pela umidade em excesso. Mas, uma vez que os resultados podem ter sido influenciados por uma amostra excepcionalmente escura, a proporção H, 470/625 nm, é medida. Se o resultado está acima de 600 (proporção x 1000), alta refletância é indicada, significando que a amostra não é altamente colorida. Se for desta forma, então, os reagentes de leucócito são considerados como tendo sido comprometidos pela alta umidade. Se a amostra é escura, isto é, a proporção crítica H está abaixo de 600, mas os valores previamente determinados de L20-L60 e L20 eram aceitáveis, então, a amostra é considerada como não estando comprometida e o teor de leucócitos é calculado.
[0027] Deverá ser entendido que os comprimentos de onda de luzespecíficos e tempos de medição descritos são úteis para determinação da presença de leucócitos em amostras de urina com as quantidades dos reagentes descritos. O método, contudo, tem aplicação mais geralmente a muitos outros reagentes que são sensíveis à umidade e ainda são usados para detectar amostras que contêm água. Protocolos de detecção apropriados serão prontamente estabelecidos por aqueles versados no campo após terem revisto a invenção divulgada pelos presentes inventores.
[0028] Conforme ilustrado acima, o instrumento Clinitek Status® é útilna realização do método da invenção. Aspectos desse instrumento são descritos nas Patentes U.S. N°s 6.239.445; 5.877.863; 5.477.326 e 5.408.535, as quais são incorporadas aqui por referência. O instrumento Clinitek Status® é um espectroscópio de refletância no qual uma tira de teste trazendo uma amostra é iluminada por uma fonte de luz e a luz refletida a partir da tira de teste é detectada e usada para determinar a presença e quantidade do analito na amostra. A operação de espectrofotômetros é também discutida na Patente U.S. N° 6.316.264, mencionada acima. Conforme observado aqui, um instrumento do tipo câmera, o qual cria uma imagem multipixel, também pode ser usado para realizar o método da invenção.
Claims (20)
1. Método de detecção de reagentes sensíveis à umidade comprometidos pela umidade, os referidos reagentes sendo contatados com uma amostra contendo água e detectando a presença de um analito na amostra por sua reação com os referidos reagentes sensíveis à umidade, o método compreendendo (a) medir a refletância de luz no comprimento de onda dos produtos da referida reação dos referidos reagentes sensíveis à umidade com o referido analito em dois tempos predeterminados após contato dos referidos reagentes com a referida amostra; (b) medir, nos mesmos dois tempos predeterminados, a refletância de luz no comprimento de onda de um corante de referência infravermelho, o referido corante tendo um comprimento de onda característico separado do comprimento de onda medido em (a) em pelo menos 120 nm; (c) calcular a proporção dos comprimentos de onda medidos em (a) e (b) e concluir que os reagentes têm atividade menor do que a esperada a partir da alteração na referida proporção entre os dois tempos predeterminados, caracterizado pelo fato de que os referidos reagentes sensíveis à umidade são baseados em substratos proteolíticos usados para detectar enzimas protease, sendo que a referida amostra é urina e o referido analito é leucócitos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proporção de comprimentos de onda medida em (a) e (b) no primeiro dos referidos dois tempos predeterminados é usada para indicar reagentes sensíveis à umidade potencialmente comprometidos pela umidade.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que, em combinação, a proporção de comprimentos de onda medida no primeiro dos referidos dois tempos predeterminados e a alteração na proporção entre os primeiro e segundo tempos predeterminados são usadas para determinar se os reagentes sensíveis à umidade estão comprometidos pela umidade.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de medição da refletância da luz em dois comprimentos de onda predeterminados para indicar o potencial de interferência de cor da amostra com os resultados determinados.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos reagentes sensíveis à umidade incluem um sal de diazônio e um éster sujeito à hidrólise na presença de leucócitos.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido corante de referência é combinado com os referidos reagentes sensíveis à umidade.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido corante de referência está localizado separadamente dos referidos reagentes sensíveis à umidade.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende rejeição de reagentes sensíveis à umidade comprometidos pela umidade.
9. Método de medição de leucócitos em amostras de urina com tiras de teste, as referidas tiras de teste contendo reagentes incluindo um sal de diazônio e um éster sujeito à hidrólise na presença de leucócitos, o referido método caracterizado pelo fato de calcular a quantidade de leucócitos em uma amostra de urina como uma função da reflexão de luz em um comprimento de onda característico do produto de reação do referido sal de diazônio com éster hidrolisado e com referência à reflexão de luz em um comprimento de onda de referência pré- selecionado, a referida luz refletida sendo medida de 1 a 3 minutos após aplicação de uma amostra de urina aos referidos reagentes, o aprimoramento compreendendo a detecção de reagentes comprometidos pela umidade por (a) adicionar um corante de referência infravermelho às referidas tiras de teste, o referido corante de referência tendo um comprimento de onda de refletância característico separado do comprimento de onda característico do referido produto da reação em pelo menos 120 nm; (b) medir a refletância de luz no comprimento de onda do referido produto de reação e o comprimento de onda característico do corante de referência de 20 segundos e de 60 segundos após aplicação da referida amostra de urina aos referidos reagentes; (c) calcular a proporção da refletância medida no comprimento de onda do referido produto de reação para o comprimento de onda medido do referido corante de referência determinado em (b) para cada um dos referidos tempos de 20 e 60 segundos e designação das referidas proporções como L20 e LSO; (d) quando L20-L60 é menor do que um primeiro valor predeterminado e L20está abaixo de um segundo valor predeterminado, concluir que o substrato contendo composição foi comprometido pela umidade; (e) medir a refletância de luz em comprimentos de onda de 470 nm e de 625 nm e calcular a proporção 470/625 nm; (f) se a proporção 470/625 nm está acima de um terceiro valor predeterminado, concluir que a amostra de urina não é suficientemente colorida para afetar a conclusão obtida na etapa (d); e (g) rejeitar o valor calculado para concentração de leucócitos.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a refletância da luz do referido produto de reação é de 520 nm a 570 nm.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a refletância da luz do referido corante de referência é de 825 nm.
12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proporção do referido corante de referência para o referido éster hidrolisável é maior do que 0,5%, desse modo, reduzindo a interferência de base da cor da referida amostra e da referida tira de teste.
13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido corante de referência é selecionado do grupo consistindo em compostos de ftalocianina e naftalocianina, corantes de complexo de metal, corantes de polimetina, corantes de di e trifenilmetano, corantes de quinina, corantes azo, corantes de transferência de carga e corantes de ressonância de carga.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido corante é DTO 141.
15. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido éster hidrolisável é PPTA e o referido sal de diazônio é DSNA.
16. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro valor predeterminado é 700 quando a primeira proporção é multiplicada por 1000.
17. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o segundo valor predeterminado é 600 quando a primeira proporção é multiplicada por 1000.
18. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que ainda compreendendo a etapa de (h) relatar a etapa de rejeição de (g) ao usuário do referido método.
19. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido corante de referência é combinado com os referidos reagentes.
20. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido corante de referência está localizado separadamente dos referidos reagentes.
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