BRPI1006908A2 - método para tratamento de um material de planta que contém lipídeo, composição e seu uso e produto alimentício - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UM MATERIAL DE PLANTA QUE CONTÉM LIPÍDEO, COMPOSIÇÃO E SEU USO E PRODUTO ALIMENTÍCIO. A presente invenção refere-se à modificação de lipídeios em material de planta que contém lipídeo, tal como farelo de cereal para a geração de lipídeos funcionais. A presente invenção refere-se ainda a preparação de composição que compreendem tais lipídeos funcionais assim como o uso dessas composições que compreendem tais lipídeos funcionais e outros compostos funcionais derivados da ação de enzimas que modificam lipídeos para a preparação de uma composição adequada para a preparação de bio-etanol, assim como produtos alimentícios, tal como o pão.

Description

e Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO

PARA TRATAMENTO DE UM MATERIAL DE PLANTA QUE CONTÉM : LIPÍDEO, COMPOSIÇÃO E SEU USO E PRODUTO ALIMENTÍCIO".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à modificação de lipídeos em material de planta que contém lipídeo, tal como farelo de cereal para a geração de lipídeos funcionais. A presente invenção refere-se ainda a preparação de composições que compreendem tais lipídeos funcionais assim como o uso dessas composições que compreendem os lipídeos funcionais e outros compostos funcionais derivados da ação de enzimas que modificam lipídeos para a preparação de uma composição adequada para a preparação de bioetanol, assim como produtos alimentícios, tal como o pão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A utilização de fluxos colaterais do processamento de resíduos de fermentação de materiais de planta, tais como farelo de cereal da moagem ou grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS) tem recebido pouca atenção além do uso em rações para animais.

O uso benéfico de enzimas lipolíticas (E.G. 3.1.1x) em aplicações na indústria alimentícia e/ou de ração para animais é conhecido hámuitotempo.

Entretanto, a maioria das técnicas anteriores descreve o uso de enzimas lipolíticas na farinha e na massa e não para produtos colaterais ou subprodutos de processos industriais. Por exemplo, na EP 0 585 988 é reivindicado que a adição de lipase a massa resultou no aperfeiçoamento do efeito antiendurecimento. WOS94/04035 ensina que a maciez melhorada do pão pode ser obtida pela adição de lipase à massa sem a adição de qualquer gordura/óleo adicional à massa.

O substrato para lipases em material de planta é uma mistura complexa de lipídeos polares e não polares. Os lipídeos polares podem ser divididos em glicolipídeos e fosfolipídeos. Esses lipídeos são constituídos por glicerol esteríificado com dois ácidos graxos e um grupo polar. O grupo polar contribui para a atividade de superfície desses lipídeos.

A clivagem enzimática de um dos ácidos graxos nesses lipídeos leva a lipídeos com atividade superficial muito maior. É bem conhecido que os emulsificantes, tais como DATEM, com atividade de superfície elevada são muito funcionais quando adicionados a massa.

As enzimas lipolíticas hidrolisam um ou mais ácidos graxos dos lipídeos presentes no material de planta o que pode resultar na formação de moléculas emulsificantes poderosas.

Na EP 1 193 314, os inventores descobriram que o uso de enzi- mas lipolíticas ativas sobre glicolipídeos era particularmente benéfico em aplicações na fabricação de pão. Morrison et al., J. Sci. Food Agric. 1981, 32, 5679-587 descrevem à distribuição de lipídeos da semente do trigo mácio nas frações de moídas de farinha. Há uma necessidade na técnica de uma melhor utilização de produtos colaterais do processamento de materíais de planta, tais como fare- lo de cereal da moagem, pastas de neutralização do refino de óleos vegê- tais, grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), na qual menos material de planta vá para aplicações de baixo preço como ração para o gado. Adi- cionalmente, há uma necessidade há muito sentida de ser capaz de utilizar a fraçãode farelo de cereais em produtos de cereais tradicionalmente já exis- tentes, sem impacto significativo sobre a aparência/estrutura, a cor ou o sa- bor do produto e para tomar possível aumentar o efeito sobre a saúde e nu- tricional de produtos já existentes.

OBJETIVO DA INVENÇÃO É um objetivo da presente invenção fornecer métodos para a ge- ração de lipideos funcionais a partir de material de planta em geral e de pro- dutos colateraís industriais em particular. É um objetivo adicionál da presente invenção fornecer métodos adequados que possibilitem a utilização de com- posições que compreendam os lipídeos funcionais derivados de material de planta,talcomo o farelo em produtos alimentícios tradicionais, tais como no pão ou produtos de cereais, sem impacto significativo sobre a aparên- cia/estrutura, à cor ou o sabor do produto e para tomar possível aumentar o | efeito sobre a saúde é nutricional de produtos já existentes,

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Em um amplo aspecto, a presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de material de planta que contém lipídeos com enzimas que modificam os lipídeos, para à geração de lipídeos modificados, tais co- Mo lipídeos funcionais a partir de materiais de planta.

Em um primeiro aspecio, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de material de planta, o método compreendendo a etapa de tratar uma suspensão líquida de pelo menos um material de planta que contenha lipídeos parcialmente solubilizados com uma ou mais enzimas que modifiquem o lipideo, Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende lipídeos e/ou lipídeos modificados, tal como um lipídeo funcional produzido por um método para o tratamento de material de planta que contém lipídeo, o método compreendendo a etapa de tratar uma suspensão líquida de pelo menos um material de planta que contenha lipídeos parcialmente solubilizados com uma ou mais enzimas que modifi- quem o lipídeo.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição que compreenda lipídeos e/ou lipídeos modificados, tal como um lipídeo funcional produzido por um método para o tratamento de Material de planta que contém lipideo, o método compreendendo a etapa de tratar uma suspensão liquida de pelo menos um material de planta que con- tenha lipideos parcialmente solubilizados com uma ou mais enzimas que modifiquem o lipideo, o uso sendo para à produção de um produto alimentí- cio.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição que compreenda lipídeos e/ou lipídeos modificados, tal como um lipídeo funcional produzido por um método para o tratamento de material de planta que contém lipídeo, o método compreendendo a etapa de tratar uma suspensão liquida de pelo menos um material de planta que con- tenha lipídeos parcialmente solubilizados com uma ou mais enzimas que |

7 modifiquem o lipídeo, o uso sendo para a produção de biovetanol. Em um aspecto adiciónal, a presente invenção refere-se a um ] produto alimentício obtido pelo uso de uma composição que compreenda lipídeos e/ou lipideas modificados, tal como um lipídeos funcional produzido porum método para o tratamento de material de planta que contém lipídeo, o método compreendendo a etapa de tratar uma suspensão líquida de pelo menos um material de planta que contenha lipídeos parcialmente solubiliza- dos com uma ou mais enzimas que modifiquem o lipídeo. Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se ao bioe- tanol obtido pelo uso de uma composição que compreenda lipídeos e/ou li- pideos modificados, tal como um lipídeo funcional produzido por um método ' para o tratamento de material de planta que contém lipideo, o método com- preendendo a etapa de tratar uma suspensão líquida de pelo menos um ma- ' terial de planta que contenha lipídeos parcialmente solubilizados com uma ' 15 oumaisenzimas que modifiquem o lipídeo, Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um kit em partes compreendendo à) uma combinação de enzimas que compreende: umá ou mais enzimas que modificam o lipídeo; uma óu mais enzimas que modifiquem à parede celulare, opcionalmente, uma ou mais enzimas adicionais; b) instruções para uso em um método de acordo com a inven- ção; e €) opcionalmente, outros ingredientes para a preparação de um produio alimentício.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. Resultados do teste de cozedura. Vol. rel. dos pães versus branco (%). As colunas representam o volume do pão para os testes números 1-6 de acordo com as tabelas 56 6, Figura 2. Pães obtidos a partir da cozedura com frações obtidas defarelosolóvel. Os números referem-se aos números na tabela 5. Figura 3. Resultados do teste de cozedura. Vol. rel. dos pães vêrsus branco (%). As colunas représentam os experimentos do teste de | s78 r cozedura de acorde com a tabela 12. Figura 4, Pães obtidos a partir da cozedura com frações obtidas i de farelo solúvel. Os números referem-se aus números na tabela 12. Figura 5. Resultados do teste de cozedura. Vol. rel. dos pães versus branco (%). As colunas representam os experimentos do feste de cozedura de acordo com à tabela 17 e 18, Figura 6. Pães obtidos a partir da cozedura com frações obtidas de farelo solúvel. Os números referem-se aos números na tabela 18. Figura 7. Pães obtidos a partir da cozedura com frações obtidas defarelo modificado. Os números referem-se aos números na tabela 24. Figura 8. Pães obtidos a partir da cozedura com extratos de fare- ' lo de arroz modificado. Os números referem-se aos números na tabela 30. Figura 9. Pães obtidos a partir da cozedura com frações obtidas ' de farelo modificado. Os números referem-se aos números na tabela 36. “7 15 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Quantidades consideráveis de produtos colaterais do processa- mento de materiais de planta, tais como farelo de cereal da moagem, pastas de neutralização do refino de óleos vegetais, grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), etc., estão disponíveis como material bruto para gerar lipí- 70 deosfuncionaísque podem servir como emulsificantes em diferentes aplica- ções como aplicações em alimentos, aplicações em ração, amaciantes na produção de materiais plásticos, etc.

Aqui, mostrou-se que a modificação da fração de lipídeo em, por exemplo, farelo de trigo, é significativamente aumentada se o material for coiratado com outras enzimas como as enzimas que modificam a parede da célula e, em algumas modalidades, também com enzimas que modificam o amido. Pela combinação dessas classes de enzimas, observou-se a funcio- nalização dos lipideos que não podem ser obtidos usando apenas as lipa- ses.

Os lipídeos modificados gerados podem ser usados, por exem- plo, na panificação, pela adição da fração solúvel isolada ou pela adição da composição completa do farelo tratado com a enzima contendo os lipídeos |

' modificados que possuem propriedades emulsificantes. Portanto, as composições geradas pelos métodos de acordo Ú com a presente invenção podem ser usadas como solúveis isolados. Entre- tanto, as composições também podem ser usadas como uma mistura de solúveiseinsolíveis, isto é, material de planta em solução, ta) como material residual de farelo. Deve ser compreendido que parte da fração lipídica ainda pode estar presente nessa fração residual em solução.

A expressão "material de planta que contém lipídeo”, como usa- da aqui, refere-se a qualguer material que compreenda quantidades signifi- cativas de material derivado de uma planta que contenha quantidades endó- genas de lipídeos. Adequadamente, 9 material de planta pode ser obtido em 7 grandes quantidades, contém uma quantidade significativa de lipídeos e po- de ser usado em processos industriais. ' Em algumas modalidades, a material de planta que contém lipí- 7 15 deoé um produto colateral ou subprodutos dê processos industriais, Em al- gumas modalidades, o material de planta também pode conter um material de não planta, tal como um subproduto de uma fermentação, que pode con- ter células de levedura.

Em algumas modalidades particulares, o material de planta que contém lipídeo é um farelo de cereal, tal como, por exemplo, 6 farelo de trigo da moagem tradicional.

Em algumas modalidades, uma quantidade de pelo menos cerça de 100 mg, tal como pelo menos cerca de 200 mag, tal como pelo menos cer- ca de 300 mg por 100 q do peso seco do material que contém lipídeo é de fosfolipideo.

Em algumas modalidades, uma quantidade de pelo menos cerca de 10 mg, tal como pelo menos cerca de 20 mg, tal como pelo menos. cerca de 30 mag por 100 g do péso seco do material de planta que contém lipídeo é de fosfatidilinoósitol (PI).

A frase "material de planta que contém lipídeo parcialmente so- lubilizado”, como usada aqui, refere-se ao material de planta que contém lipídeos e que tenham sido solubilizados pelo menos parcialmente pela ação |

* enzimática ou mecânica. A expressão "cereal" como usada aqui refere-se aos frutos de ' uma planta da família Poaceae, tal semente contendo pelo menos o farelo que compreende a aleurona e o endosperma rico em amido, com ou sem a presença adicional do perícarpo, revestimento da semente (alternativamente chamado de noz) e/ou germe. A expressão inclui, mas não está limitada a espécies tais como o trigo, cevada, aveia, espelta, centeio, sorgo, milho e arroz, A expressão “farelo”, como usada aqui, refere-se a uma fração do cereal derivada da moagem enriquecida com qualquer um ou todos os tecidos a serem selecionados entre a aleurona, pericarpo e revestimento da M semente, quando comparada com a semente intacta correspondente, A expressão "solubilização" como usada aqui refere-se à solubi- i lização de material de planta, tal como farelo de cereal, nos métodos de a- ' 15 cordocoma invenção e é pretendido incluir qualguer grau de solubilização. Consequentemente, a "solubilização" pode ser para óbter um material 100% solúvel ou elá pode ser para obter um grau de solubilização menor do que 100%, tal como menos do que 70%, tal como na faixa de 30%-60%. Em at- gumas modalidades, e grau de solubilização é determinado sobre à massa secaversusmassa seca de farelo, A expressão "pelo menos parcialmente solubilizado”, como usa- da aqui, refere-se a um grau de solubilização que é maior do que 1%, tal como tão alto quanto 5%, tal como tão alto quanto 10%. Deve ficar compre- endido que a ação das enzimas que modificam o lipideo pode não funcionar otimamente de acordo com à invenção, se o material de planta não for solu- bilizado até um certo grau. Nos aspectos específicos de acordo com a pre- sente invenção, nos quais as enzimas que modificam lipideo são adiciona- das para funcionar simultaneamente com o tratamento para obter a solubili- zação, tal como um tratamento com uma ou mais enzimas que modificam a parede celular, a solubilização e a ação das enzimas que modificam lipídeo ocorrerão ao mesmo tempo.

A expressão "fração de moagem”, como usada aqui, refere-se a |

- todas ou parte das frações que resultam da redução mecânica do tamanho dos grãos através de, por exemplo, mas não limitado ao corte, esmagameêén- Í to, trituração, quebra ou moagem, com ou sem o fracionamento através de, por exemplo, mas não limitado a peneiramento, seleção, filtração, assopra- mento, aspiração, filtração centrífuga, filtração por ar, separação eletrostáti- ca ou Separação por campo elétrico.

No contexto da presente invenção, "lipídeos funcionais" referem- se a lipídeos que possuem um efeito sobre o produto, no qual o lipídeo fun- cional é usado, Em algumas modalidades particulares, os lipídeos funcionais sãoemulsificadores ou outros beneficiadores de alimento.

No contexto da presente invenção, "enzima que modifica à pare- 7 de celular”, refere-se a qualquer enzima capaz de hidrolisar ou modificar o complexo da matriz de polissacarídeos da parede celular da planta, tal como ] qualquer enzima que possua atividade no "ensaio de solubilização da pare- : 15 de celular incluído aqui, Dentro dessa definição de "enzima que modifica a parede celular" estão incluídas as celulases, tais como a celobiohidrolase | e celobio-hidrolase |1l, endoglicanases e beta-glicosidases e as enzimas hemi- celulolíticas, tais como as xilanases.

A expressão "celulases" ou "enzimas celulolíticas"” como usada aquiêentendida como compreendendo as celobio-hidrolases (EC 3,2.1.91), "— por exemplo, a celobiohidrolase | e celabiohidrolase 1, assim como as endo- glicánases (EC 3.2.1 4) e beta-glicosidases (EC 3.2.1.21).

Estão incluídas dentro da definição de celulases: endoglicanases (EC 3.2.1.4) que cortam as cadeias de celulose ao acaso; celobio-hidrolases (EC32.1.91) que clivam as unidades de celobiosil das terminações da ca- deja de celulose e as beta-glicosídases (EC 3.2,1.21) que convertem a celo- biose e às celodextrinas solúveis em glicose. Entre essas três categorias de enzimas envolvidas na biodegradação da celulose, as celobio-hidrolases são as enzimas principais para a degradação da celulose cristalina nativa. À ex- pressão "celobiohidrolase 1" é definida aqui como uma atividade de celulose 1,4-beta-cebiosidase (também referida como exoglicanase, exo-celobio- hidrolase ou 1,4-beta-celobio-hidrólase), como defínida na classe de enzi- | gI78 « mas EC 3.2.1.91, que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas na celulose e na celotetraose, pela liberação de celobiose das extremidades Ú não reduzidas das cadeias, A definição da expressão "atividade de celobio- hidrolase |I" é idêntica, exceto que a celobio-hidrolase || ataca as extremida- desreduzidasdas cadeias.

As celulases podem compreender um módulo de ligação a car- boidrato (CBM) que intensifica a ligação da enzima com uma fibra que con- tém celulose e aumenta a eficácia da parte ativa catalítica da enzima. Um CBM é definido como uma sequência de aminoácidos contígua dentro de uma enzima ativa em carboidrato com um enovelamento diferente que pos- sui atividade de ligação ao carboidrato. Para informações adicionais de 7 CBMs veja o servidor da internet CAZy (Supra) ou Tomme et al. (1995) em Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler and Penner, ' eds.), Cellulose- binding domains: classification ánd properties, pp. 142-163, ] 15 American Chemical Society, Washington. Em uma modalidade preferida, as celulases ou enzimas celuloliticas podem ser uma preparação celulolítica como definida no pedido U.S. nº 60/941.251, que está incorporado aqui por referencia. Em uma modalidade preferida, à preparação celulolítica compre- ende um polipeptíideo que possui atividade de intensificação celulolítica (GH61A), preferivelmente aquele descrito no WO2005/074656. A enzima que modifica a parede celular pode ser adicionalmente uma beta glicosidase, tal como uma beta-glicosidase derivada de uma cepa do gênero Trichoderma, Aspergillus ou Penicillium, incluindo a proteina de fusão que possui atividade de beta-glicosidase descrita no pedido U.S. nº 60/832.511 (Novozymes) Em algumas modalidades, a enzima que modifica a parede celular é uma CBH Il, tal como à celobiohidrolase 11 de Thielavia ferrestris (CEL6A), Em algumas modalidades, a enzima que modifica a parede celular é uma enzima celulase, tal como aquela derivada de Trichoderma reesei. A atividade celulolitfica pode, em algumas modalidades, ser deri- vadade uma fonte fúngica; tal como uma cepa do gênero de Trichoderma, tal como uma cepa de Trichoderma reesei; ou uma cepa do gênero Humico- 1a, tal como uma cepa de Humicola insolens, |

- Em algumas modalidades, a enzima que modifica a parede celu- lar é um polipeptídeo que tem aátividade de intensificação celulolitica (GH61A) descrita no WO 2005/074656; uma celobio-hidralase, tal como uma celobio-hidrolase 11 de Thielavia terrestris (CELGA), uma beta-glicosidase (porexemplo,a proteina de fusão descrita no pedido U.S. nº 60/832.511) e enzimas celulolíticas, por exemplo, derivadas de Trichoderma reesei, Em algumas modalidades, a enzima que modifica a parede celu- lar é um polipeptídeo que possui atividade de intensificação celulolítica (GH61A) descrita no WO 2005/074656; uma beta-glicosidase (por exemplo, a proteina de fusão descrita no pedido U.S: no. 60/832.511) e enzimas celu- lolíticas, por exemplo, derivadas de Trichoderma reesei. Em algumas moda- 7 lidades, a enzima que modifica a parede celular é um produto comercialmen- te disponível, tal como GC220 disponibilizado pela Genencor, A Danisco Di- Ú vision, US ou CELLUCLAST? 1,5L ou CELLUZYME" disponibilizadas por ' 15 Novozymes A/S, Dinamatca.

As endoglicanases (EC 3.2.1.4) catalisam a endo-hidrólise de fi- | gações 1,4-beta-D-glicosidicas na celulose, derivados de celulose (tais coma carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose), liquenina, ligações beta-14 em beta-1,3 glicanos mistos, tais como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal oude outro material de planta que contenha partes celulósicas. O nome au- torizado é endo-1,4-beta-D-glican 4-glicano hidrolase, mas a expressão a- breviada endoglicanase é usada no presente pedido. A atividade de endogli- canase pode ser determinada de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem, 59:;257-258, Em algumas modalidades, as endoglicanases podem ser deriva- das de uma cepa do gênero Trichodierma, tal como uma cepa de Trichoder- ma reesêi; ou uma cepa do gênero Humicola, tal como uma cepa de Hurmi- cola insolens; ou uma cepa de Chrysosporium, preferivelmente uma cepa de Ghrysosporium lucknowense.

A expressão "celobiohidrolase" significa uma 1,4-beta-D-glican celobio-hidrotase (EC 3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta- D-glicosídicas na celulose, celooligossacarídeos ou qualquer polímero que |

: contenha glicose beta-1,4 ligada, liberando a celobiose das extremidades reduzidas ou não reduzidas da cadeia, Ú Exemplos de celobio-hidrolases estão mencionados acima inclu- indo CBH | e CBH Il de Trichoderima reesei; Humiceola insolens e CBH Il de celobio-hidrolase de Thielavia terrestris (CELL6A). A atividade de celobiohidrolase pode ser determinada de acordo com os procedimentos descritos pór Lever et al., 1972, Anal.

Biochem. 47: 273-279 e por van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Leiters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288. O método de Leveretal, é adequado para avaliar a hidrólise da celulose na palha do mi- lho e o método de van Tilbeurgh et al, é adequado para determinar à ativida- 7 de de celóbio-hidrolase em um derivado de dissaçarideo fluorescente.

A expressão "beta-glicosidase” significa uma beta-D-glicosideo ] glicuidralase (E.C. 3,2.1.21), que catalisa a hidrólise de residuos de beta-D- ] 15 glicose terminais não reduzidos com à liberação de beta-D-glicose.

Para os propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glicosidase é determi- | nada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al., 2002, J, Basic.

Microbiol. 42:55-66, exceto por condições diferentes que foram em- pregadas come aqui descrito, Uma unidade de atividade de beta-glicosidase é definidacomo 1,0 umol de p-nitrofenol produzido por minuto a 500C, pH 5 a partir de p-nitrofenol-beta-D-glicopiranosídeo 4 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM, TWEENº 20 0,01%. Em algumas modalidades, a beta-glicosidase é de origem fúngi- ca, tal como uma cepa do gênero Trichoderma, Aspergíllus ou Penicillium.

Em algumas modalidades, a beta-glicosidase é derivada de Trichoderma reesei, tal como a beta-glicosidase codificada pelo gene bgal1 (veja EP 562003). Em outra modalidade, a beta-glicosidase é derivada de Aspergillus oryzãe (produzida recombinantemente em Aspergíllus oryzae de acordo com o WO 02/095014), Aspergillus furmigatus (produzida recombinantemente em Aspergillus oryzae de acordo com o Exemplo 22 do WO 02/095014) ou As- pergíllus niger (1981, J.

Appl. 3:157-162), As expressões "enzimas hemicelulolíticas" ou "hemicelulases", |

- como usadas aqui, referem-se a enzimas que podem quebrar a hemicélulo- se, Qualquer hemicelulase adequada para uso na hidrólise da hemi- celulose, preferivelmente, em oligossacarídeos de arabinoxilano, pode ser usada As hemicelulases preferidas incluem as xilanases, arabinofuranosi- dases, acetil xilano esterase, feruloil ésterase, glicuronidases, galactanase, endo-galactanase, manases, éndo ou exo arabinases, exo-galactanases, pecíinase, xiloglivanase ou misturas de duas ou mais dessas.

Um exemplo de hemicelulase adequada para uso na presente invenção inclui Grindamy| Powerbake 930 (disponibilizada por Danisco A/S, Dinamarca) ou VISCOZYM E? (disponibilizada por Novozymes A/S, Dinamarca). Em uma modalidade, a " hemicelulase é a xilanase.

Em uma modalidade, a xilanase é de origem mi- crobiana, tal como de origem fúngica (por exemplo, Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium) ou de uma bactéria (pór exemplo, Bacillus), ' 15 Em algumas modalidades, a xilanase é derivada de um fungo filamentoso, : preferivelmente derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus; ou de uma cepa de Humicola, preferivelmente Humícola lanugi- nosãa.

A xilanase pode ser, preferivelmente, uma endo-1,4-beta-xilanase, mais preferivelmente uma endo-1,4-beta-xilanase de GH 10 ou GH 11. E- xemplos de xilanases comerciais incluem Grindamyl H121 ou Grindamyl Powerbake 930 da Danisco A/S, Dinamarca ou SHEARZYMES e BIOFEED WHEAT" da Novezymes A/S, Dinamarca.

A arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) catalisa a hidrólise de resi- duos de alfa-L-arabinofuranosideo terminais não reduzidos em alfa-L-arabi- nosídeos, À galactanase (EC 3,2.1.89), arabinogalactana endo-1,4-beta- galactosidase, catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-D-galactosídicas em arabinogalactanos.

A pectinase (EC 3.2.1.15) catalisa a hidrólise de ligações 1,4- alfa-D-galactossídurônicas em pectato e outros galacturonanos.

A xiloglicanase catalisa a hidrólise de xiloglicano.

A expressão "xilanase", como usada aqui, refere-se a uma en- zima que é capaz de hidrolísar a ligação beta-1 4-glicosila em unidades não |

7 terminais de beta-D-xilanopiranosil-1,4-beta-Dxilanopiranosil de xilano ou arabinoxilano.

Outros nomes incluem 1,4-beta-D-xilan xilano hidrolase, 1,4- i beta-xilan xilano hidrolase, beta-1,4- xilan xilano hidrólase, (1-4)-beta-xilan 4- xilano hidrolase, endo-1,4-betaxilanase, endo-(1-4)-beta-xilanase, endo- beta14xilanase, endo-1,4-beta-D-xilanase, endo- 1,4-xilanase, xilanase, beta-1,4-xilanase, beta-xilanase, beta-D-xilanase.

As xilanases podem ser derivadas de uma variedade de organismos, incluindo plantas, fungos (por exemplo, espécies de Aspergillus, Penicillium, Disporoirichum, Neurospora, Fusarium, Hurmicola, Trichoderma) ou espécies bacterianas (por exemplo, espécies de Bacillus, Aeromonas, Streptomyces, Nocardiopsis, Thermomy- ces) (veja, por exemplo, WOS2/17573, WO9S2/01793, WOS9S1/19782, ' WOSA4/21785). Em um aspecto da invenção, a xilanase usada nos métodos da ] invenção é uma enzima classificada coma EC 3.2.1.8. O nome oficial é en- ' 15 do1,4-beta-xilanase.

O nome sistemático é 1,4-beta-D-xilano xilano hidrola- ' se.

Outros nomes podem ser usados, tais como endo-(1-4)-beta-xilanase; (1- 4)-beta-xilan- 4-xilano hidrolase; endo-1,4-xilanase; xilanase; befa-1,4- xilanase; endo-14xilanase; endo-beta-1,4-xilanase; endo1,4-beta-D- xilanase; 1 4-beta-xilano xilano hidrelase; beta-xilanase; beta-1,4-xilano xila- no hidrolase; endo-1,4-beta-xilanase; beta-D-xilanase, A reação catalisada é a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas nos xilanos.

Em um aspecto da invenção, a xilanase da invenção é uma xila- nase da Família 11 de Glicosideo Hidrolase (GH). A expressão "da Família 11 de Glicosídeo Hidrolase (GH)" signífica que a xilanase em questão é ou —podesetclassificada na família 11 de GH.

Em um aspecto da invenção, a xilanase usada de acordo com a invenção é uma xilanase que possui atividade de xilanase como medida no "ensaio da Xilanase” como aqui descrito.

De acordo com o site CAZy (ModO), a Família 11 das glicosideo 230 hidrolases pode ser caracterizada como à seguir; Atividades Conhecidas: xilanase (EC 3.2.1.8) Mecanismo: Retenção |

- Nucleófilo/Base Catalítico: Glu (experimental) Doador de Próton Catalítico: Glu (experimental) i Estado da Estrutura 3D: Enovelada: E-superenrolada Clã: GH-C Como usada aqui, "Clã C" refere-se a agrupamentos de famílias que partilham um enovelamento tridimensional comum e um maquinário ca- talitico idêntico (veja, por exemplo, Henrissat, B. e Bairoch, A., (1996) Bio- chem. d,, 316, 65695-696), Como usado aqui, "Família 11" refere-se a uma família de enzi- mas como estabelecido por Henrissat, B. e Bairoch, A., (1993) Biochem. J., 293, 781-788 (veja também Henrissat e Davies (1997) Current Opinion in , Structural Biol. 1997, 8637-644). Os aspectos em comum para os membros da família 11 incluem elevada homologia genética, um tamanho de cerca de kDa e um mecanismo de deslocamento catalítico duplo (veja Tenkanen et ' 15 al, 1992; Wakarchuk et al., 1994). A estrutura das xilanases da família 11 ' inclui duas folhas B grandes feitas de fitas B é hélices a.

A família 11 das xilanases inclui as seguintes: XynA de Aspergil- lus níger, XynC de Aspergillus kawachii, XynA de Aspergíllus tubiensis, XynA de Bacillus circulans, XynA de Bacilluspunzilus, XAynA de Bacíllus subtílis, 20 XynA de Neocalliniastix patriciarum, XynB de Streptomyces lividans, XynC de Streptomyces lividanis, Xynll de Streptomyces therinoviolateus, XynAÃ de Thermomoanospora fusca, Xyn de Trichoderma harzianum, Xynl de Tricho- derma reesei, Xynll de Trichoderma reesei, Xyn de Trichodermaviride.

No contexto da presente invenção, "enzima que modifica o ami- do" refere-se a qualquer enzima que catalise a hidrólise de ligações a-1,3 e/ou 0-1,6 glicosidicas em glicusídeos. Estão incluídas dentro dessa expres- são as glicosídeo hidrolases, nomeadas tipicamente depois do substrato so- bre o qual! elas atuam. Em algumas modalidades de acordo com a invenção, a "enzima que modifica o amido" é selecionada entre lactase, amilase, pulu- lanase, isoamílase, quitinase, sucrase, maltase, neuraminidase, invertase, hialaronidase e lisozima.

Em algumas modalidades, a enzima que modifica o amido é | uma enzima que desramífica o amido.

Em um aspecto da invenção, a enzima que modifica e amido, usada de acordo com a invenção, é uma enzima que possui atividade de desramíficação do amido como medida no "ensaio de atividade de desrami- ficaçãodo amido" como aqui descrito.

As enzimas que desramificam o amido incluem a pululanase (EC

3.2.1,41) e a isoamilase (EC 3,2.1.68). Elas hidrolisam as ligações a-1,6-D- glicosidicas, dextrinas B-limite e pululanas. As isoamilases podem ser distin- guidas das pululanases (EC 3.2,1.41) pela inabilidade da isoamilase em ata- cara pululanae pela ação limitada sobre dextrinas a-limite.

Por "amilase" pretende-se incluir qualquer amilase, tal Omo as ' glicoamilases, a-amilase, B-amilases e a-amilases de tipo selvagem de Ba- cillus sp., tal como de B. subtilis e B. licheniformes. "Amilase" deve significar Ú uma enzima que seja, entre outras coisas, capaz de catalisar a degradação ' 15 doamido, As amilases são hidrolases que clivam as ligações o-D-(|->4) O- : dlicosídicas do amido, Geralmente, as a-amilases (EC 3,2,1,1; (X-D4) —4)- glicano glicanohidrolase) são definidas como enzimas endo-atuantes que clivam as ligações a-D(l— »4) O-glicosidicas dentro da molécula de amido de uma maneira aleatória. As enzimas amilolíticas exo-atuantes, tais como as familases (EC 321.2; 0-D-(| +4)-glucano malto-hidrolase) e algumas amilases específicas para um produto, como a a-amilase maltogênica (EC

3.2.1.133) clivam a molécula de amido da terminação não reduzida do subs- trato, B- Amilases, a-glicosidases (EC 3.2.1.20; a-D-glicosideo glucohidrola- se), glicoamilase (EC 3,2.1,3; a-D-(l-—4)-glicano glicohidrolase), e amiláses específicas para um produto podem produzir glicose à partir do amido.

Por "a-amilase variante", "polipeptideo de c-amilase variante" e "enzima variante" entende-se uma a-amilase que tenha sido modificada pela substituição de resíduos de aminoácidos na terminação amino da proteína o- amilase madura. Como usado aqui, "enzimas parentais”, "sequência paren- tal”, “polipeptídeo parental", "proteina a-amilase de tipo selvagem” e "poli- peptídeos parentais" significam enzimas e polipeptideos a partir dos quais os polipeptideos de a-amilase variante são derivados. A enzima parental pode |

- ser uma enzima de tipo selvagem ou uma cr-amilase que tenha sido previa- : mente manipulada recombinantemente. A c-amilase variante pode incluir adicionalmente mutações na sequência de sinal do polipeptideo parental de tr-amilase ou em outro lugar do polipsptídeo pareéntal de a-amilase. Portanto, o polipeptideo de a-amilase pode ser uma enzima recombinantemente ma- nipulada.

Em um aspecto da invenção, a a-amilase usada de acordo com a invenção é uma o-amilase que possui atividade de a-amilase como medida ho "ensaio de u-amilase" aqui descrito, Em um aspecto da invenção, a beta-amilase usada de acordo com à invenção é uma beta-amilase que possui atividade de beta-amilase ' como medida no "ensaio de beta-amilase" aqui descrito.

A expressão "pululanase" refere-se a um tipo específico de gli- Ú canase, uma endoerzima amilolítica que degrada a pululana. Ela é produzi- Ú 15 da como, por exemplo, uma lipoproteína ancorada a superfície da célula, extracelular por bactérias Gram negativas do gênero Klebsiella. Entretanto, as bactérias Gram-negativas produzem pululanases como proteínas secre- tadas. As pululanases tipo | atacam especificamente ligações 0-1,6, enquan- to que as pululanases tipo || também são capazes de hidrolisar as ligações ca1,4 Elatambém é produzida por algumas outras bactérias é arquebacté- rias. A pululanase é usada como um detergente em biotecnologia. A pulula- nase. (EC 3.2.1.41) também é conhecida como pululan-6-glicanohidrolase (enzima desramíificadora). A pululana é observada como uma cadeia de uni- dades de maltotriose ligadas por ligações q-1,6-glicosídicas. A pululanase clivaráhidroliicamente à pululana (polissacarideos de o-glicano).

A expressão "enzima de transglicosilação” refere-se a qualquer enzima que possua atividade de tránsglicosidase, tal como a transglicosida- se. A expressão "transglicosidase" refere-se a qualquer enzima que transfira um resíduo a-D-glicosila em um 1,4-4-D-glicano para 0 grupo hidroxila pri- mãárioda glicose, livre ou combinado em um 1,4-0-D-glicano. A transglicosi- dase aqui descrita tem uma atividade descrita como EC 2,4.1.24, de acordo com a nomenciatura de enzima da IUBMB, O nome sistemático para a |

“ transglicosidase aqui descrita é 1,4-a-D-glicano: 1,4-1-D-glicano(D-glicose) 6- a-D-glicosiltiransferase, Essa enzima pode ser referida como uma ao- Ú glicosidase em certas publicações.

Como observado acima, a enzima transglicosidase geralmente tem uma atividade definida como EC 2.4.1.24 de acordo com a nomenciatu- ra de enzima da JUBMB, cuja atividade transfere os resíduos de glicosila de certos glicanos para o grupo hidroxila primário da glicose.

Em algumas mo- dalidades, a enzima também pode ter uma atividade que degrade uma goma de polissacarídeo natural (por exemplo, polissacarídeos que contêm xantana egalactomanana, tais como goma guar ou goma de feijão de lima), pelo cor- te das cadeias laterais de açúcar ou pela clivagem de ligações internas para quebrar o arcabouço do polissacarideo.

Qualquer enzima transglicosidase adequada encontra uso na presente invenção (veja, por exemplo, Pazur et al., Carbohydr.

Res. 1986, 149:137-47; e Nakamura et al., J.

Biotechnol. ] 15 53:/75-84, 1997). Em algumas modalidades, a enzima transglicosidase que . encontra uso na presente invenção está disponível comercialmente (por e- xemploa, incluindo, mas não limitadas a enzimas obtidas de Megazyme, Wic- klow, Irlanda; ou Danisco US Inc., Genencor Divisio, Palo Alto, CA). Em al- gumas modalidades, à enzima é uma transglicosidase de Aspergillus niger produzida em células de Trichoderma reesei.

Em algumas modalidades adi- cionais, a transglicosidase é uma transglicosidase fúngica de fipo selvagem (por exemplo; incluindo, mas não limitada a transglicosidase fúngica que Possui uma sequência de aminoácidos depositada no banco de dados GENBANKº da NGBI como números de acesso: D45356 (GID:2645159; As- pergillus níger, BADOSO0DE6E.1 (GID:4031328; Aspergillus awamori), BA- AO08S125.1 (GION0S4565; Aspergillus oryzae), XPJ)JOI 210809,1 (GID: 1 15492363; Aspergillus ferreus), XP. 001271891,1 (GID: 121707620; Asper- gillus clavatus), XPJ)J01266999.1 (GID: 1 19500484: Neosartorya fischeri), XP 75181 11 (GID:70993928; Aspergillus fumigatus), XP 6596211 (GID:67523121; Aspergillus nidulans), XP 001216899.1 (GID: 115433524; Aspergillus fterreus) and XPJ)0O1258585.1 (GID: 119473371; Neosartiorya fischerl)) ou uma variante dessas que tenha uma sequência de aminoácidos |

1B/78 º que é pelo menos cerca de 70% idêntica, pelo menos cerca de 80% idêntica, ' pelo menos cerca de 90% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica ou pelo menos cerca de 98% idêntica a uma transglicosidase de fungo de tipo selvagem.

Em um aspecto da invenção, a transglicosidase usada de acordo com a invenção é uma transglicosidase quê possui ativídade de transglicosi- dase como medida no "ensaio de transglicosidase" aqui descrito.

Ensaios de atividade de enzima de acordo com a invenção: Ensaio de solubilização da parede celular: Preferivelmente, a solubilidade do farelo é medida usando o se- qguinte ensaio. B Uma suspensão de farelo de trigo (0,1 M) = tampão fosfato hi- drogenado dissódico (0,2 M), pH 5.0, é preparada para uma concentração i de farelo de 1,33% (peso/peso). A partir dessa suspensão, alíquotas de 750 ' 15 ulsãotransferidas para tubos eppendorph sob agitação. Cada tubo de subs- . trato é preaquecido por 5 minutos a 40ºC. Depois disso, 250 Jl de solução de enzima são adicionados, tornando a concentração final do substrato de 1%. Três diluições (em duplicata) são feitas a partir de cada composição de enzima de acordo com à invenção, com concentrações crescentes de enzi- maí(por exemplo, 0,33; 1,0 e 3,0 ug de enzima/o de farelo) em cada período de determinação (0, 30, 60 e 240 minutos). Como controle, uma solução desnaturada pelo calor da composição de enzima é usada. À reação é ter- mMinada nos períodos determinados, pela transferência dos tubos pará uma incubadora ajustada para 95ºC. As amostras desnaturadas pelo calor são mantidasa4ºC até que todas as reações enzimáticas tenham terminado. Quando as reações enzimáticas estão finalizadas, os tubos de Eppendorph são centrifugados para sé obter um sóbrenádante límpido. A capacidade das enzimas de solubilizar o farelo é expressa como o aumento em grupos ter- minais reduzidos como determinado usando PAHBAH (Lever, 1972), so Se o farelo usado contiver amido residual, as atividades colate- rais taís como atividade de amilase, podem interferir com o ensaio acima, o ensaio de solubilização de farelo deve ser realizado apenas em enzimas que |

' modificam a parede celular modificadas (que não possuem atividade de ami- BR lase).

Alternativamente, o grau de solubilização pode ser medido de acordo com o seguinte método: o grau de solubilização de um material de planta, por exemplo, farelo de cereal, pode ser determinado pela suspensão de material de planta insolúvel em um tampão de extração (tipicamente 10-25% de farelo em tam- pão (peso/peso)) com é sem enzimas, incubando a suspensão sob agitação e 40º C por um tempo controlado (por exemplo, 30 a 1440 minutos). Depois da solubilização, o material solubilizado é separado do material 9insolúvel por centrifugação (20 min, 25000 x 9, temperatura ambiente). O conteúdo de : matéria seca no sobrenadante é determinado tanto pela liofilização de parte da amostra quanto pela análise da umidade (Analisador de umidade, AND ML-50, Buch & Holm, Dinamarca), Todo o tampão de extração não pode ser Ú 15 recuperado usando esse protocolo, entretanto, é presumido que a concen- ' tração de material solúvel é igual no tampão de extração recuperado e no tampão de extração não recuperado, por que é feita uma correção no tam- pão de extração usado no total, Havendo determinado o conteúdo de maté- ria seca na fração solúvel, conhecendo a quantidade de material de planta empregado e a quantidade de tampão de extração, o grau de solubilização pode ser determinado usando a seguinte equação.

Grau de solubilização = (((g de matéria seca/ml de sobrenadante recuperado) x (ml de tampão de extração usado)) x 100%)/g de material de planta empregado Ensaiode xilanase (atividade de endo-B-1,4-xilanase) As amostras foram diluídas em ácido cítrico (0,1 M) — tampão fosfato hidrogenado dissódico (0,2 M), pH 5,0, para obter aproximadamente ODs66 = 0,7 nesse ensaio. Três diluições diferentes da amostra foram incu- badas por 5 minutos a 40ºC. No tempo = 5 minutos, 1 tablete de Xylazyme (reticulada, substrato de xilano corado, Megazyme, Bray, Irlanda) foi adicio- nado à solução de enzima em um volume de reação de 1 ml, No tempo = 15 minutos, a reação foi terminada pela adição de 10 m! de TRIS/NaOH 2%, pH |

7 12. Os controles foram preparados usando 1000 ul de tampão ao invés da . solução de enzima. A mistura de reação foi centrifugada (1500 x 9, 10 minu- tos, 20ºC) e à OD do sobrenadante foi medida a 590 nm. Uma unidade de xilanase (XU) é definida como a atividade de xilanase que aumenta a ODss com0025porminuto.

Atividade de a-amilase: As a-amíláses hidrolisam as ligações u-D-14-glicosídicas é sua atividade pode ser detectada como uma taxa de mudança de cor de uma solução de amido-iodo devida à hidrólise das ligações alfa-1,4-D.

Atividade de beta-amilase: A atividade de beta-amilase pode ser detectada como a libera- ' ção de maltose da terminação não reduzida de uma solução de amido.

Atividade de transglicosidase: À transglicosidase catalisa ambas às reações hidrolítica e de ' 185 transferência na incubação com a-D-glico-oligossacçarideos. À atividade de . transglicosidase pode ser detectada como à formação de isomalto- oligossacarídeos tais como a isomaliose, pansose é isomaliriose depois da incubação com maltose ou maltodextrina.

Ensaio de atividade de desrámificação do amido: As enzimas específicas para as ligações a-D-1,6 glicosídicas do amido incluem, atualmente, a isoamilase (EC 3.2 1.68) e pululanases (EC

3.2.1 41). As enzimas que atuam sobre as ligações 0-D-1,6 glicosídicas do amido também são classificadas por sua ação sobre a pululana e sua ativi- dade é medida como a hidrólise específica das ligações a-D-1,6 glicosidicas doamidoedapululana, A expressão "enzima que modifica lipídeo", como usada aqui, re- fere-se a qualquer enzima que possa modificar um lipídeo.

Em algumas modalidades preferidas, a enzima que modifica e li- pídeo é uma enzima lipolítica, tal como a lipase.

A expressão "enzima lipolitica" como usada aqui refere-se a qualquer enzima que hidrolise um ou mais ácidos graxos dos lipídeos pre- sentes em um material de planta, tal como subprodutos de cereal, o que po- |

' de resultar na formação de lipídeos funcionais dentro do subproduto de ce- : real, o que fornece valor comercial.

As molêculas que contribuem para os efeitos funcionais mais significativos são as moléculas com características enmulsificantes, que são os produtos da hidrólise parcial, tais como as molé- culasdeliso-fosfolipídeos, liso-glicalipídeos e monoglicerideos.

Os produtos da hidrólise de lipídeo polar, tais como os liso-fosfolipideos e liso-glicolipi- deos são particularmente vantajosos na produção de pão e podem dar uma funcionalidade equivalente como emulsificadores, tais como DATEM.

Os substratos para as lipases nos subprodutos de cereal são os lipídeos do farelo que são uma mistura complexa de lipídeos polares e não polares.

Os lipídeos polares podem ser divididos em glicolipídeos e fosfolipí- 7 deos.

Esses lipídeos são os construtores do glicerol esterificado com dois ácidos graxos e um grupo polar.

O grupo polar contribui para a atividade de Ú superfície desses lipídeos.

A clivagem enzimática de um desses ácidos gra- ' 15 xos nesses lipídeos leva a lipídeos com uma atividade de superfície muito . maior.

É bem sabido que os emulsificadores, tais como DATEM, com atívi- dade de superfície muito alta, são muito funcionais quando adicionados ao alimento.

O uso das lipases (EC 3.1.1.X) em produtos de massa de farinha podeter um impacto prejudicial sobre a atividade de levedura e/ou um efeito negativo sobre o volume da pão.

O efeito negativo sobre o volume do pão é explicado, geralmente, pela superdosagem, A superdosagem pode levar a uma diminuição da elasticidade do glúten 0 que resulta em uma massa que é muito firme e, portanto, resulta em volumes reduzidos do pão.

Adicional- mente ou altemativamente, tais lipases podem degradar a gordura, óleo ou gordura do leite adicionadas à massa, resultando em perda de sabor da massa e do produto assado.

À superdosagem e a perda de sabor têm sido atribuídas ao acúmulo de ácidos graxos livres na massa.

Em relação a pre- sente invenção, esses efeitos indesejados podem ser evitados já que a lipa- seé adicionada ao subproduto de cereal como, por exemplo, uma suspen- são de farelo de cereal que é usada com ou sem processamento adicional como um beneficiador de massa de farinha.

O processamento adicional po- |

" de ser a diluição, purificação dos lipídeos funcionais. Além disso, os lipídeos . funcionais podem ser processados para serem fornecidos como um produto líquido ou como um produto seco formulado, tal como um produto liofilizado, Nas EP1193314, EPOS77869, WO02/094123, WO00/31758 e também no WOD1/39602, o uso de enzimas lipolíticas ativas em glicolipí- deos foi relatado ser particularmente benéfico na aplicação de produção de pão, já que os produtos da hidrólise parcial, os liso-glicolipideos, foram en- contrados ter uma funcionalidade de emulsificação muito alta, resultando aparentemente em uma proporção maior de funcionalidade de emulsificação positiva comparada com o acúmulo prejudicial de ácidos graxos livres. Entre- tanto, as enzimas também foram encontradas possuir uma atividade não " seletiva significativa sobre os triglicerídeos, o que resultou em aumento des- necessário de ácido graxo livre. Adicionalmente, a aplicação de lipases na fabricação do pão teve a adição de lipase à massa seguida por uma geração ' 15 insitu de emulsificante na massa.

: A lipase pode ser de qualquer origem, por exemplo, de origem animal (tal como, por exemplo, de mamífero), por exemplo, do pâncreas (por exemplo, pâncreas bovino ou porcino) ou de peçonha de cobra ou peçonha de abelha. Alternativamente, à lipasé pode ser da origem microbiana, por exemplo, de fungo filamentoso, levedura ou bactérias, tais como o gênero ou espécie Aspergillus, por exemplo, A. niíger, Dictyostelium, por exemplo, D. discoideum; Magnaporthe, por exemplo, M. grisae, Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo, M, subtilissimus; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Rhizomucor, por exemplo, R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R, arrhizus, R japonicus, R. stolonifer, Sclerotinia, por exemplo, S. libertiana; Triehophy- tan, por exemplo, T. rubrum; Whetzelínia, por exemplo, W. sclerotiorunt, Ba- cillus, por exemplo, 8. megaterium, B. subtilis; Citrobácter, por exemplo, CO. freundii; Enterobacter, por exemplo, E. aerogeries, E, cloaçae; Edwardsiella, E. farda; Erwinia, por exemplo, E. herbícola; Escherichia, por exemplo, E.

col Klebsielia, por exemplo, K. preumoniae; Proteus, por exemplo, P. vulga- ris; Providencia, por exemplo, P. stuartii, Salmonella, por exemplo, 8. typhi- murnum; Setratia, por exemplo, &. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, |

7 por exemplo, 8. flexneri, Streptomyces, por exemplo, S. violeteoruber, Yer- : sínia, por exemplo, Y. enterocolitica. Portanto, a lipase pode ser fúngica, por exemplo, da classe dos Pyrenomycetes, tal como do genero Fusarium, tal como uma cepa de F. culmorum, E. heterosporum, F. solami, ou uma cepa def, oxysporum. A fosfolipase também pode ser de uma cepa de fungo fi- lamentoso dentro do genero Aspergíllus, tal como umá cepa de Aspergillus awamori, Aspergíllus foetídus, Aspergillus japonicus, Aspergillus níger ou Aspergillus oryzaãe.

Uma fonie comercialmente disponível de enzimas lipolíticas é umalipase microbiana ou aciltransferase.

Em algumas modalidades, a lipase é de fungos filamentosos, ' tais como Aspergillus spp. e Fusarium spp. As lipases isoladas de fungos filamentosos foram encontradas fer características industrialmente aplicáveis e também foram encontradas ser expressas rotineiramente em sistemas de ' 15 produção heterólogos;, tais como em Aspergillus oryzae, Fusarium e levedu- : ra.

Em algumas modalidades, a lipase é de Aspergillus turingiensis como descrito na EP 1433852, cuja patente está incorporada aqui por refe- rencia.

Em algumas modalidades, a lipase é de Fusarium heterosporum como descrito na EP1722636, cuja patente está incorporada aqui por refe- rencia.

Em algumas modalidades, a lipase é de Fusarium oxysporum como identificada na EP 0 130 064 ou em Hoshino et al. (1992) Biosci. Bio- tech Biochem 56:660-664.

Em algumas modalidades, a lipase é a fosfolipase A2 pancreáti- ca de porco expressa, por exemplo, em Aspergillus niger (Cakenzyme”, DSM).

Em algumas modalidades, a lipase é como descrita na EPO 8659 167,emque é descrita a clonagem é a expressão de uma lipase de Fusari- um oxysporum e seu uso na panificação. À enzima é descrita como possuin- do atividade de fosfolipase, Essa enzima é vendida agora péla Novozymes |

" A/S (Dinamarca) como Lipopan Fº.

: Em algumas modalidades, a lipase é como descrita no WO 02/00852, que descreve cinco enzimas lipase e seus polinucleotídeos codifi- cadores, isoladas de F. venenatum, F. sulphureum, A. berketeyanum, F.

eculmorume Ff, solani. Todas as cinco enzimas estão descritas como possu- indo atividade de hidrólise de triacilglicero|, fosfolipase e atividade de galac- tolipase. Três das enzimas possuem atividade equivalenté a da enzima de F. oxysporum descrita na EP 0 869 167: F. venenatum, F. eulmorum, F. sulphu- reum.

Em algumas modalidades, a enzima que modifica o lipídeo é uma enzima lipolítica variante. Enzimas lipolíticas variantes, com substitui- ' ções e fusões de aminoácidos específicos, foram produzidas, algumas das quais possuem atividade intensificada sobre lipídeos polares comparadas i com enzimas parentais de tipo selvagem. WO01/39602 descreve tal varian- ' 15 te, referida como SP979, que é uma fusão da lipase de Thermomyces lanu- : ginosus e a lipase de Fusarium oxysporum descrita na EP 0 869 167. Essa variante foi encontrada ter uma taxa significativamente alta de atividade so- bre fosfolipídeos e glicolipideos comparada com triglicerídeos. Em algumas modalidades, a enzima que modifica o lipídeo é umalipídeo aciltransferase.

A expressão "lipídeo aciltransferase" como usada aáqui significa uma enzima que possui atividade de lipase (geralmente classificada como EC 3.1.1x de acordo com a Enzyme Nomenclature Recommendations (1992) do Nomenciature Comittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology), assim como possui atividade de aciltransferase (ge- ralmente classificada como EC 2.3.1.x), através da qual a enzima é capaz de transteúr um grupo acila de um lipídeo para um ou mais substratos acepto- res, tais como um ou mais dos seguintes: um esterol, um estanol, um car- boidrato, uma proteína, uma subunidade de proteína, glicerol.

Em algumas modalidades, à lipídeo aciltiransferase para uso nos métodos e/ou usos da presente invenção é capaz de transferir um grupo aci- la de um lipideo (como definido aqui) para um ou mais dos seguintes subs- | í tratos aceptores: um esterol, um estanol, um carboidrato, uma proteína ou ' suas subunidades ou glicerol.

Em alguns aspectos, 6 receptor de acila pode ser qualquer com- posto que compreenda um grupo hidroxi (-OH), tal como por exemplo, alco- i 5 óis polivalentes incluindo o glicerol; esterol; estanol; carboidratos; hidróxi- ácidos incluindo ácidos de frutas, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico e ácido ascórbico; proteínas ou uma subunidade dessa, tal como aminoácidos, hidrolisados de proteína e peptídeos (proteína parcialmente hidrolisada) por exemplo; e suas misturas e derivados.

Em algumas modalidades, o substrato de lipídeo sobre o qual a lipídeo aciltransferase usada de acórdo com a presente invenção átua, é um ' ou maáis dos seguintes lipídeos: um fosfolipideo, tal como uma lecitina, por exemplo, fosfatidileolina, um triglicerideo, uma cardiolipina, um diglicerídeo ou um glicolipídeo, tal como digalactosildiglicerideo (DGDG), por exemplo: À ] 15 expressão lecitina quando usada aqui, abrange à fosfatidilcelina, fosfatidile- . tanolamina, fosfatidilinoósito|, fosfatidilsérina e fosfatidilglicerol. Preferivelmente, em alguns aspectos, 6 substrato de lipídeo so- bre o qual a lipídeo aciltransferase atua é um fosfolipídeo, tal como lecitina, por exemplo, fosfatidilcolina ou fosfatidilinosital, Em algumas modalidades, o substrato de lipídeo é um lipídeo a- liménticio, o que significa dizer que é um componente lipídica de um gênero alimentício.

Adequadamente, a lipídeo aciltransferase usada de acordo com a presente invenção pode exibir uma ou mais das seguintes atividades de lipaseí atividade de glicolipase (E.C. 3,1.1.26), atividade de triacilglicero! li- pase (E.C. 3.1,1.3), atividade de fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4) ou atividade de fosfolipase A1 (E.C. 3.1.1,32). A expressão "atividade de glicolipase", como usada aqui, abrange a "atividade de galactolipase”, Adequadamente, a lipídeo aciltransferase usada de acordo com a presente invenção pode exibir uma ou mais das seguintes atividades: ati- vidade de glicolipase (E.C. 3.1.1.26) e/ou atividade de fosfolipase A1 (E.C.

3.1.1.32) e/ou atividade de fosfolipase A2 (E.O. 3.1.14), |

" Preferivelmente, em alguns aspectos, a lipideo acittransferase . usada de acordo com a presente invenção é capaz de transferir um grupo acila de um glicolipídeo e/ou de um fosfolipídeo para um estero| e/ou um es- tanol pará fórmar pelo menos um éster de estero! e/ou um éster de estanol.

Receptores de acila de esterol adequado incluem o colesterol e fitoesteróis, por exemplo, alfa-sitosterol, beta-sitosterol, estigmastero!, ergos- terol, campesterol, 5,6-di-hidrosterol, brassicasterol, alta-espinasterol, beta- espinasterol, gama-espinasterol, delta-espinasterol, fucosterol, dimosterol, ascostero|, serebistero|, episteral, anasterol, hipostero|, condrilasterol, des- mosterol, calinosterol, poriferastero|, clionasterol, glicosideo de esterol e ou- tras formas isoméricas naturais ou sintéticas e derivados. " Preferivelmente, em um aspecto, o receptor de acila é um ou mais dos seguintes: alfa-sitostero|, beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, beta-sitostanol, ss-sitostano! ou campesterol|. ' 15 Preferivelmente, em alguns aspectos, a lipídeo aciltransferase . usada de acórdo com à presente invenção é capaz de transferir um grupo acila de um glicólipídeo e/ou de um fosfolipídeo para um glicerol para formar pelo menos um diglicerideo e/ou um monoglicerideo. Em alguns aspectos, um ou mais dos esteróis presentes no ma- terial de planta que contém lipídeo podem ser convertidos em um ou mais estanóis antes ou ao mesmo tempo em que à lipídeo aciltransferase é adi- cionada de acordo com a presente invenção. Qualquer método adequado para a conversão de esteróis em estanóis pode ser empregado. Por exem- pla, a conversão pode ser realizada pela hidrogenação química. A conversão pode ser conduzida antes da adição da lipídeo aciltransferase de acordo tom à presente invenção ou simultaneamente a adição da lipídeo aciltirans- ferase de acordo com a presente invenção. Enzimas adequadas para a con- versão de esterol para estanóis são descritas no WOD00/061771. Adequadamente, a presente invenção pode ser empregada para produzir ésteres de fitostanol no lipídeo de material de plánta, Os ésteres de fitostanol possuem solubilidade adequada através de membranas lipídicas, bio-disponibilidade e beneficios à saúde aumentados (veja, por exemplo, |

. WOS2/99640). . Protocolo para a determinação do % de atividade de aciltransferase: O material de planta que contém lipídeo ao qual uma lipídeo acil- transferase tenha sido adicionada de acordo com a presente invenção pode | 5 serextraído depois da reação enzimática com CHsx:CH;OH 2:1 e à fase ór- gânica que contém o material lipídico é isolado e analisado por GLO é HPLC de acordo com o procedimento detalhado abaixo.

A partir das análises GLC e HPLC, é determinada a quantidade de ácidos graxos livres e um ou mais ésteres de esterol/estanol; ésteres de carboidratos; ésteres de proteina; di- glicerideos ou monoglicerídeos.

Um controle do material de planta que con- tém lipídeo ao qual não tenha sido adicionada a enzima é analisada da ' mesma maneira.

Cálculo: A partir das análises GLC é HPLC, o aumento de ácidos graxos Ú 15 livres e ésteres de esterol/estanol e/ou ésteres de carboidrato e/ou ésteres . de proteina e/ou diglicerídeos e/ou monoglicerídeos pode ser calculado: A% de ácido graxo = % ácido graxo (enzima) - % de ácido graxo (controle); Mv de ácido graxo = peso molecular mêdio dos ácidos graxos; A = 0% de ésier de esterol/Mv de êster de esterol (onde A% de éster de esterol = % de éster de esterol/estanol (enzima) - % de éster de esterol/estanol (controle) e Mv de éster de esterol = peso molecular médio dos ésteres de esteroVestanol) — aplicável onde o aceptor de acila é um es- tero| e/ou um estanol; B = A% de éster de carboidrato/Mv de éster de carboidrato (onde A%deésterde carboidrato = % de éster de carboidrato (enzima) - % de és- ter de carboidrato (controle) é Mv de éster de carboidrato = peso molecular médio dos êsteres de carboidrato) — aplicável onde o aceptor de acila é um carboidrato; 6 = A% de éster de proteina/Mv de éster de proteína (onde A% deésterde proteina = *% de éster de proteína (enzima) - % de éster de pro- teina (controle) é Mv de éster de proteina = péso molecular médio dos êste- res de proteina) = aplicável onde 0 aceptor de acila é uma proteína; e |

, D = valor absoluto de diglicérideo e/ou moncglicerideo/Mv de . di/monoglicerídeo (onde % de diglicerideo &/ou monoglicerideo = % de digli- cerídeo e/ou monogliceríideo (enzima) - % de diglicerideo e/ou monogliceri- deo (controle) e Mv de di/monoglicerídeo = peso molecular médio do diglice- S rídeoeloumonoglicerideo) — aplicável onde o receptor dé acila é glicerol, A atividade de transferase é calculada como um percentual da atividade enzimática total: % atividade de transferase = A“ + B* +C* + D* x 100 A* + B*+C* + D* + % ácido graxo/(Mv de ácido graxo) (* - delete como apropriado). Em um aspecto preferido, a presente invenção fornece um mate- ' rial de planta que contém lipídeo, no qual os lipídeos tenham sido modifica- dos para lipídeos funcionais pela ação de enzimas lipolíticas. Isso pode ser : usado com ou sem à purificáção dos lipídeos funcionais como um ingredien- “46 tealimentício.

. Adequadamente, a expressão "gênero alimentício", como usada aqui, significa um alimento em uma forma que está pronta para consumo, Alternativamente ou em adição, entretanto, a expressão gênero alimentício, como usada aqui, pode significar um ou mais materiais alimentícios que são usadosna preparação de um alimento. Apenas como exemplo, a expressão gênero alimentício abrange os produtos assados produzidos a partir de uma massa de farinha assim como a massa de farinha usada na preparação dos ditos produtos assados.

Adequadamente, a expressão "gênero alimentício”, como usada aqui, significa uma substancia que é adequada para o consumo humano e/ou de um animal.

Em outro aspecto, o gênero alimentício de acordo com a presen- te invenção pode ser uma ração para animal. Em algumas modalidades, o gênero alimentício usado de acordo coma presente invenção é selecionado entre um ou mais dos seguintes: ovos, produtos baseados em ovo, incluindo, mas não limitados. a maionese, molhos para salada, molhos, sorvetes, ovo em pô, gema de ovo modificada |

O e produtos feitos com ela; produtos assados, incluindo pães, bolos, produtos - de massa doce, massas folhadas, massas líquidas, muffins, donuts, biscoi- tos, torradas e cookies; produtos de confeitaria incluindo chocolate, carame- los, halawa, gomas, incluíndo gomas sem açúcar e adoçadas, goma de i 5 mascar, goma de mascar macia, chicletes e pudins; produtos congelados incluindo sorbets, preferivelmente, produtos lácteos congelados, incluindo sorvete e leite gelado; produtos lácteos incluindo queijo, manteiga, leite, creme não lácteo para café, creme batido, creme de. pastelaria, bebidas. láo- teas e iogurtes; musses, cremes batidos de vegetais, produtos com carne, incluindo produtos com came processada; óleos e gorduras comestíveis, produtos cremosos aerados é não aerados, emulsões de óleo em água, e- : muisões de água em óleo, margarina, gorduras e coberturas incluindo cober- turas com pouca gordura e com muito pouca gordura; molhos, maionese, i pastas, molhos a base de creme, Sopas a base de creme, bebidas, emul- i 15 sõescondimentadas e purês.

. Adequadamente, o gênero alimentício de acordo com a presente invenção pode ser um "alimento refinado” incluindo bolos, pastelaria, confei- taria, chocolates, bombons é semelhantes, Em um aspecto, o gênero alimentício de acordo com a presente invenção pode ser um produto de massa de farinha, tal como pão, um produ- to frito, um petisco, bolos, toftas, brownies, cookies, macarrão, macarrão instantâneo, tortilhas, itens para petisco tais como biscoitos, biscoitos de Graham, pretzels e batatas chips, massas e cereais para o desjejum, Em um aspecto adicional, o gênero alimentício de acordo com a presente invenção pode ser um produto alimentício derivado de planta tal come farinhas, pré-misturas, óleos, górduras, manteiga de cacau, café cre- moso, molhos para salada, margarina, coberturas, manteiga de amendoim, gorduras, soryetes, óleos de cozinha. Em outro aspecto, 5 gênero alimentício de acordo com a presen- teinvenção pode ser um produto derivado do leite incluindo manteiga, leite, creme, queijo tal como queijos naturais, processados é imitações de queijo em uma variedade de formas (incluindo triturado, em bloco, fatias ou ralado), |

' queijo cremoso, sorvete, sobremesas geladas, iogurtes, bebidas à base de . iogurte, manteigá de garrafa, matéria gorda anidra, outros. produtos deriva- dos do leite. A enzima usada de acordo com a presente invenção pode me- lhorar a estabilidade da gordura em produtos a base de leite, Em outro aspecto, o gênero alimentício de acordo com à présen- te invenção pode ser um produto alimentício que contenha ingredientes de origem animal, tais como produtos de carne processada, óleos de cozinha e gorduras, Em um aspecto adicional, o gênero alimentício de acordo com a presente invenção pode ser uma bebida, uma fruta, uma mistura de frutas, um vegetal ou um vinho. Em alguns casos, a bebida pode conter até 20 q ' de fitosteróis adicionados derivados da invenção. Em outro aspecto, o gênero alimentício de acordo com à presen- : te invenção pode ser uma ração para animal. A ração para animal pode ser | 15 enriquecida com fitosterol e/ou fitostanóis, preferivelmente com beta- . sitosterol/estanol, Adequadamente; a ração para animal pode ser uma ração para aves domésticas. Quando o alimento for uma ração para aves domésti- cas, a presente invenção pode ser usada para diminuir o conteúdo de coles- terol dos ovos produzidos pelas aves alimentadas com o alimento de acordo comainvenção, Preferivelmente, em um aspecto, o gênero alimentício é selecio- nado entre um ou mais dos seguintes: ovos, produtos baseados ém ovo, incluindo, mas não limitados à maionese, molhos para salada, pastas, sorve- tes, ovo em pó, gema de ovo modificada e produtos feitos com ela.

Preferivelmente, o gênera alimentício de acordo com a presente invenção é um gênero alimentício que contém água. Adequadamente, o gê- nero alimentício pode ser constituído por 10-98% de água, adequadamente por 14-98%, adequadamente por 18-98% de água, adequadamente por 20- 98%, adequadamente por 40-98%, adequadamente por 50-98%, adequa- damentepor70-98%, adequadamente por 75-98%.

Em um aspecto da invenção, o lipídeo funcional produzido à par- tir da material de planta que contém lipídeo é um emulsificante. Preferivel- |

" mente, pelo menos um emulsificante é gerado no material de planta que - contém lipídeo.

Em um aspecto da invenção, pelo menos três emulsificantes di- ferentes são gerados no material de planta que contém lipídeo.

Em um aspecto da invenção, pelo menos quatro emulsificantes diferentes são gerados no matefial que contém lipídeo.

Adequadamente, o emulsificante de acordo com a presente in- venção pode ser, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um diglicerídeo, um monoglicerides, tal como 1-monoglicerideo ou uma lisolecitina, tal como lisofosfatidilcolina ou fosfatidilinositol, por exemplo, um monoglicerideo de digalactosila (DGMG). O emulsificante é produzido, preferivelmente, a partir ' de um lipídeo doador de acila depois da remoção de um ou mais grupos aci- la do dito lipídeo doador de acila. A expressão lisoleciítina como usada aqui i abrange a lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilinositol, Í 15 lisofosfatidilserina e lisofosfatidilglicerol. À expressão lisofosfatidilcolina como ' usada aqui é sinônima da expressão lisolecitina e éssas exprêssões podem ser usadas alternativamente, Onde um dos emulsificantes é um êster de proteina e/ou um di- glicerideo &/ou um monaglicerídeo, o segundo emulsificante pode ser, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um digliceríideo, um monoglicerídeo, tal como 1-monoglicerídeo, lisofosfatidilealina ou um monoglicerídeo de digalac- tosila (DGMG). O segundo emulsificante é produzido, preferivelmente, a par- tir do lipídeo doador de acila depois da remoção de um ou mais grupos acila do dito lipídeo doador de acila.

Em uma modalidade, 68 lipídeos funcionais gerados da invenção podem ser usados em um processo para à preparação de um gênero ali- mentício.

Os lipídeos funcionaís de acordo com a presente invenção po- dem ser usados com uma ou mais enzimas de grau aliménticio adequadas.

Portanto, está dentro do escopo da presente invenção que, em adição aos lipídeos funcionais da invenção, pelo menos uma enzima adicional seja adi- cionada ao gênero alimentício. Tais enzimas adicionais incluem enzimas que |

' degradam o amido tais como endo- e exo-amilases, pululanases, enzimas . desramificantes, hemicelulases incluindo as xilanases, celulases, oxidoredu- : tases, por exemplo, glicose oxidase, piranose oxidase, sulfidrila oxidase ou uma carboidrato oxidase tal como aquela que oxida a maltose, por exemplo, i 5 hexoseoxidase (HOX), lipases, fusfolipases, glicolipases e proteases, O material de planta que contém lipideo tratado com as enzimas lipolíticas para gerar lipídeos funcionais de acordo com a presente invenção pode ser usado sem purificação ou com purificação limitada dos lipídeos funcionais junto com uma ou mais enzimas de grau alimentício adequados.

Portanto, está dentro do escopo da presente invenção que, em adição aos lipídeos purificados ou não purificados da invenção, pelo menos uma pelo ' menos uma enzima adicional seja adicionada ao gênero alimentício. Tais enzimas adicionais incluem enzimas que degradam o amido tais como endo- e exo-amilases, pululanases, enzimas desramíificantes, hemicelulases inclu- indo as xilanases, celulases, oxidorreductases, por exemplo, glicose oxida- . se, piranose oxidase, sulfidrila oxidase ou uma carboidrato oxidase tal como aquela que oxida à maltose, por exemplo, hexose oxidase (HOX), lipases, fosfolipases, glicolipases e proteases.

Em uma modalidade preferida, a enzima lipolítica tem uma ou mais das seguintes atividades de lipase: atividade de glicolipase (E.C. 3,1.1,26), atividade de triacilglicero| lipase (E.C. 3.1.1.3), atividade de fosfoli- pase A2 (E.C. 3.1.1.4) ou atividade de fosfolipase A1 (E.G. 3.1.1.32). Ade- quadamente, as enzimas lipase são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as seguintes lipases: Grindamyl Powerbake 4070 ou 4080 26 (Danisco A/S), Lysomax Oil (Danisco A/S), Lipopanº F, Lipopanº Xtra, é/ou LECITASE? ULTRA (Novozymes A/S, Denmark), fosfolipase A2 (por exem- plo, fosfolipase A2 da LIPOMODº 221 de Biocatalysts, LIPOMAXº da Ge- nencor), LIPOLASE? (Novozymes A/S, Dinamarca), Panomoreº (DSM Nutri- tional Products), as lipases descritas no WON3/97835, EP 0 977 869 ou EP 1 193314, Aquele versado na técnica Será capaz de combinar proporções de enzimas lipolíticas.

Tradicionalmente, a indústria de bolos usa beneficiadores de bo- |

' lo para à produção de bolos e para assegurar a alta qualidade dos bolos em . termos de sabor, estrutura, qualidade e aspecto do alimento. Esses benefici- adores de bolo são hormalmente baseados em emulsificantes liofilizados em um veículo semelhante ao amido e maltodextrina. Alguns benefíciadores de i 5 bolotambém estão em forma de gel baseados em emulsificantes, açúcares ' ; e água. Esses beneficiadores de bolo são muito importantes para a indústria de bolos a fim de produzir um bolo de alta qualidade. Entretanto, os benefi- ciadores de bolo contêm emulsificantes é outros ingredientes "não naturais" com um "E-number", Devido à demanda dos consumidores para reduzir os números de "E-numbers”, a indústria de bolos tem pesquisado modos alter- nativos de produzir bolos de alta qualidade sem usar esse tipo de emulsifi- ' cantes. O material de planta que contém lipídeo tratado com as enzimas lipolíticas para gerar lipídeos funcionais de acordo com a presente invenção ' 15 pode ser usado como beneficiadores de alimento sem purificação ou com . purificação limitada dos lipídeos funcionais ou como lipídeos funcionais completamente purificados.

Em um aspecto da invenção, o beneficiador de alimento é um beneficiador de bolo.

Em um aspecto da invenção, o beneficiador de alimento é um beneficiador de pão.

O beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente in- venção pode compreender, adequadamente, um ou mais dos seguintes adi- tivos: matérial de proteina de soja: carotenoides, flavonoides, anti- oxidantes e fito-químicos (especialmente antocianina, carotenoide, bioflavo- noide, glutationa, catequina, isoflavona, licopeno, ginsenosideo, picnogenol, alcaloide, fitosterol de pygeum, sulforafona, resveretol; extrato de semente de uva ou alimento que contenha ésteres de estanol), vitamina (especial- mente vitamina O, vitamina À, vitamina B3, vitamina D, vitamina E, tiamina, riboflavina, niacina, piridoxina, cianocobalamina, ácido fólico, biotina, ácido pantotênico ou vitamina K), minerais (especialmente cálcio, iodo, magnésio, |

34/T8 7 Zinco, ferro, selenio, manganês, cromo, cobre, cobalto, molibdenio ou fósfo- . ro), ácidos graxos (especialmente ácido gama-linoleico, ácido eicosapentae- . nóico ou ácido docosaexaenóico), óleo (especialmente óleo de borragem, óleo de canola rico em carotenoide ou óleo de semente de linho), glicerol, sorbitol, aminoácidos (especialmente triptofano, lisina, metionina, fenilalani- na, treonina, valina, leucina, isoleucina, alanina, arginina, ácido aspártico, cistina, cisteina, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, prolina, hidro- xiprólina, serina, taurina ou tirosina), enzima como definida acima (especial- merite bromelaina, papaína, amilase, celulase ou coenzima OQ), lignina, éster de estanol ou bactérias favoráveis (especialmente Lacfobacíllus acidophílus, Lactobacillus bulgarícus, Lactobaciíllus bifidus, Lactobacillus plantarum ou S Streptococcus faecium), ácido fólico, fibras insolúveis e/ou solúveis. A presente invenção pode fornecer um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados em produtos com ovo, particularmente maione- ] 15 se: estabilidade térmica aperfeiçoada durante a pasteurização; propriedades : organolépticas aperfeiçoadas, consistência melhorada, A presente invenção pode fomecer um ou mais dos seguintes efeitos têcnicos inesperados em massa de farinha e/ou produtos assados: um volume específico aperfeiçoado da massa ou dos produtos assados (por exemplo, do pão e/ou do bolo); estabilidade aperfeiçoada da massa; uma crosta aperfeiçoada (por exemplo, uma crosta mais fina e/ou mais erocante do pão), um miolo melhorado (por exemplo, uma distribuição mais homogê- nea do miolo e/ou uma estrutura mais fina do miolo e/ou um miolo mais ma- cia); um aspecto melhorado (por exemplo, uma superfície lisa sem bolhas ou buracos ou substancialmente sem bolhas ou buracos); endurécimento redu- zido; maciez aperfeiçoada; odor melhorado; sabor melhorado.

A presente invenção pode fornecer um efeito benéfico a partir dos lipídeos funcionais já que esses funcionam como materiais altamente ativos na superfície em um alimento sem à formação de quantidades subs- tanciais de ácidos graxos livres, que reduzem à habilidade do alimento oxi- dar depois do armazenamento, por que os ácidos graxos livres são mais propensos a oxidação do que os êsteres de ácidos graxos correspondentes.

|

7 Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de BR uma enzima lipolítica para gerar outros compostos funcionais dé acordo com : a presénte invenção em um material de planta que contém lípideo, Deve ser compreendido que à ação das enzimas que modificam i 5 lipideos,tais como às enzimas lipolíticas sobre o material de planta que con- tém lipideo pode gerar não apenas lipídeos funcionais, mas também outros compostos funcionais, tais como com a ação de uma lipideo transferase, em que um grupo acila de um lipídeo é transferido para um ou mais outros subs- tratos aceptores, tais como um ou mais dos seguintes: um esterol, um esta- nol, um carboidrato, uma proteína, uma subunidade de proteína e glicerol.

Em algumas modalidádes particulares, os compostos funcionais ' gerados nos métodos de acordo com a presente invenção são ésteres fun- cionais, Em algumas modalidades, ambos os lipídeos funcionais e os ou- ' 15 tros compostos funcionais são gerados pelos métodos de acordo com a pre- . sente invenção.

Esses compostos funcionais gerados pelos métodos de acordo com a presente invenção podem então ser usados na fabricação de uma massa de farinha e/ou um produto assado, compreendendo adicionar os di- toscompostos funcionais à uma massa de farinha e (opcionalmente) assar a massa para fazer um produto assado com um ou mais dos seguintes: visco- sidade reduzida da massa; maquinabilidade aperfeiçoada da massa; redu- ção de bolhas durante o cozimento do produto assado; melhoramento do Volume &/ou da maciez do pão; prolongamento da vida Gtil do produto assa- doeouda massa; aperfeiçoamento do efeito antiendurecimento do produto assado e/ou da massa; aperfeiçoamento da estrutura da crosta do produto assado; redução da heterogenicídade do poro do produto assado; aperfeiço- amento da homogeneidade do poro de produto assado; redução do tamanho médio do poro do produto assado; intensificação do índice de glúten da massa; melhoramento do sabor e/ou do odor do produto assado; aperfeiço- amento da cor da crosta do produto assado. | Em um aspecto, os compostos funcionais gerados pelos méto- |

, dos de acordo com a presente invenção são purificados ou parcialmente pu- . rificados. . Em um aspecto, os compostos funcionais gerados pelos méto- dos de acordo com a presente invenção não são purificados antes do uso ' 5 emumalmento, Em um aspecto, os compostos funcionais gerados pelos méto- dos de acordo com a presente invenção são formulados como um produto seco.

Em um aspecto, 05 compostos funcionais são concentrados ou diluídos antes do uso em um alimento. Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método para fa- ' zer noodles ou uma massa para noodles ou um produto baseado em noo- dles, cujo método compreende adicionar um composto funcional de acordo com a presente invenção aos noodles, massa para noodles ou um produto “15 baseadoemnoodies, . Em um aspecto da presente invenção, é fornecido 6 uso de um composto funcional de acordo com a presente invenção na fabricação de macarrão ou de um produto baseado em macarrão para aperfeiçoar uma ou mais das características de cor/tom amarelado, estabilidade da cor, redução de brilho, redução do conteúdo de gordura, melhoramento da textura e da mordida (espessura), redução da atividade da água, redução de quebra, aumento da firmeza da cor e aperfeiçoamento da manutenção do tamanho durante o processámento, Em outro aspecto da invenção, é foreécido um método para fa- zertortilia ou massa de farinha para tortilha, cujo método compreende adi- cionar um beneficiador de alimento gerado de acordo com à presente inven- ção a tortilha ou Massa de farinha para tortilha.

Em outro aspecto da invenção, é fomecido um método para fa- zer macarrão ou macarrão de grão inteiro ou massa de farinha para macar- rão, cujo método compreende adicionar um beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção ao macarrão ou massa de farinha para macarrão.

|

' Um aspecto adicional da presente invenção fornece 6 uso de um - beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção na fa- : bricação de uma tortilha ou de uma massa para tortilha para aperfeiçoar o enrolamento da tortilha, aumentar a flexibilidade de uma tortilha, aperfeiçoar àaspropriedades antiendurecimento da tortilha e/ou da massa de farinha para tortilha, aperfeiçoar à maciez e/qu reduzir a perda de sabor da ftortilha e/ou massa de farinha para tortilha. A funcionalidade do beneficiador de alimento pode ser aperfei- çoada pela combinação com emulsificantes tais como DATEM. Adequadamente, a presente invenção pode fornecer um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados em um gênero alimentício: as- ' pecto melhorado, paladar melhorado, estabilidade aperfeiçoada, em particu- . lar uma estabilidade térmica aperfeiçoada, sabor melhorado, maciez melho- rada, elasticidade melhora e emulsificação melhorada, Adequadamente, a presente invenção pode fomecer um ou mais : dos seguintes efeitos técnicos inesperados em produtos derivados do leite, tais como sorvetes: um paladar aperfeiçoado (preferivelmente um paladar mais cremoso); sabor melhorado e fusão melhorada. Adequadamente, a presente invenção pode fornecer um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados no ovo ou em produtos fabrica- dos com ovo; estabilidade aperfeiçoada da êmuisão; estabilidade férmica da emulsão; sabor melhorado; redução do odor; propriedades de espessamento melhoradas; consistência melhorada Efeitos técnicos específicos associados com o uso do beneficia- dorde alimentocomo aqui definido na preparação de um alimento estão lis- tados na tabela abaixo: [no BR

OO EEE mecânica e aumenta a capacidade de ab- sorção de água. Aumenta o volume de pro- dutos de panificação e mantém a maciez do miolo. |

- [Care Pão de ló Benefícia o volume do bolo e a textura macia ' uniforme 7 4 | Biscoito, bolacha e cockie | Torna as emuisões de gordura mais estáveis . E evita a aderência a máquina. Evita a lami- nação de produtos muito gordurosos | | Pastelaria e panificação Aperfeiçoa a textura de produtos fritos Noodles Evita que aderência da massa à máquina. Aumenta 6 conteúdo de água é diminui à perda no cozimento Noodies instantâneo Evita que os noodles grudem um no outro Macarrão Condicionador de massa evita a adesão no cozimento ' Creme de pastelaria Torna a pasta de amido macia e com textura cremosa e previne a desidratação Creme não lácteo para | Evita a separação de óleo e água Creme batido Fornece emulsão estável o efe — ever tminação 13 | Caramelo, bala e nougat Melhora a emulsificação do açúcar derretido e do óleo. Evita a separação da óleo 14 Came processada, salsi- | Melhora a capacidade de retenção de água chas das salsichas e do presunto e evita a sepa- ração da fase oleosa dé pastas e purês.

Em um aspecto adicional da presente invenção, é fomecido o uso de uma enzima lipólítica em um processo para a preparação de lipídeos funcionais, Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um proces- soparaa preparação de um lisofosfolipídeo, por exemplo, lisolecitina, cujo processo compreende tratar um material de planta que contém lipideo com a enzima lipolítica de acordo com à presente invenção.

Em um aspecto adicional da presente invenção, é fomecido o Uso de uma enzima lipolítica em um processo para à preparação de um liso- glicolipideo (por exemplo, monoglicerídea de digalactosila (DGMG) ou mo- noglicerídeo de monogalactosila (MGMG)), pelo tratamento de um materia)

" de planta que contém lipídeo com a enzima lipolítica de acordo com a pre- - sente invenção. . Em algumas modalidades da invenção, a suspensão liquida de pelo menos parte do material de planta que contém lipídeo parcialmente so- lubilizadoê essencialmente livre de amido.

Em algumas modalidades da invenção, menos do que cerca de 50%, tal como menos do que cerca de 40%, tal como menos do que cerca de 30%, tal coma menos do que cerca de 20%, tal como menos do que cer- ca de 10%, tal como menos do que cerca de 6%, tal como menos do que cercade 3%, tal como menos do que ceica de 1% (peso/peso) da suspen- são líquida de material de planta que contém lipídeo parcialmente solubiliza- ] do é amido ou componentes que contêm amido, tal como farinha, : Consequentemente, em algumas modalidades, compreende-se que as enzimas são para ter um efeito enzimático sobre o material de planta quecontém lipjdeo que está essencialmente isento de amido ou que contém : apenas amido residual de uma etapa de processamento prévia.

A presente invenção não é pretendida abranger o tratamento enzimático de composi- ções com preparações adicionais de farinha adicionada, tais como em apli- cações enzimáticas in situ na fabricação de pão, Determinação de atividade de galactolipase (ensaio de atividade de glicoli- pase): Substrato: Digalactosildigaliceríideo 0,6% (Sigma D 4651), Triten-X 100 0,4% (Sigma X-100) e CaCl; 5 mM foram dissolvidos em tampão HEPES 0,05 M pH7, Procedimento do ensaio: 400 ul de substrato foram adicionados a um tubo Eppendarf de 1,5 mL e colocados em um Eppendorf Thermomixer à 37ºC por 5 minutos.

No tempo t=0 min, 50 pl de solução de enzima foram adicionados.

Um con- trolecom água ao invés de enzima também foi analisado.

À amostra foi mis- turada à 10100 rpm em um Eppendorf Thermomixer à 37ºC por 10 minutos.

No tempo t=10 min, 6 tubo de Eppendorf foi colocado em outro misturador |

" térmico a 89ºC por 10 min. para parar a reação.

O ácido graxo livre nas a- - mostras foi analisado usando ó kit NEFA € da WAKO GnbH. . À atividade de enzima GLU em pH 7 foi calculada como micro- moles de ácido graxo produzidos por minuto sob às condições do ensaio.

Determinação da atividade de fosfolipase (ensaio de atividade de fosfolipa- se): A atividade de fosfolipase foi medida usando dois métodos dife- rentes que fornecem resultados comparáveis.

Qualquer um desses métodos pode ser usado para detenninar a atividade de fosfolipase de acordo com a presente invenção. “Ensaio PLU" para determinação da atividade de fosfolipase ' Substrato: ; ' L-a fosfatidilcolina 95% Plant 0,6% (Avanti H441601), Triton-X 100 0,4% (Sigma X-100) é CaCl 5 mM foram dissolvidos em tampão HE- PESOOSMpH?7. . Procedimento do ensaio: 400 ul. de substrato foram adicionados a um tubo Eppendorf de 1,5 mL é colocados em um Eppendorf Thermomixer à 37ºC por 5 minutos.

No tempo t=0 min., 50 pl de solução de enzima foram adicionados.

Um con- trole com água ao invés de enzima também foi analisado.

A amostra foi mis- turada a 10*100 rpm em um Eppendorf Thermomixer a 37ºC por 10 minutos.

Na tempo t=10 min., o tubo de Eppendorf foi colocado em outro misturador térmico a 99ºC por 10 min. para parar a reação.

O ácido graxo livre nas a- mostras foi analisado usando o kit NEFA C da WAKO GnbH.

A atividade de enzima PLU-7 em pH 7 foi calculada como Mi- eromolés de ácido graxo produzidos por minuto sob as condições do ensaio. "Ensaio TIPU" pára determinação da atividade de fosfolipase 1 TIPU (Unidade de Titulação de Fosfolipase) é definido como à quantidade de enzima que libera 1 pumol de ácido graxo livre por minuto nas condições de ensaio.

A fosfolipase A1 e A? catalisam à conversão de lecitina em liso- lecitina com a liberação de ácido graxo livre das posições 1 e 2, respectiva- |

' mente.

A atividade de fosfolipase pode ser determinada pela titulação contí- - nua dos ácidos graxos liberados da lecitina durante a enzimação, já que o . consumo de álcali iguala a quantidade de ácido graxo liberado.

Substrato:

i 5 Lecitina 4%, Triton-X 100 4% é CaCl; 6 mM: 12 q de lecitina em pó (Avanti Polar Lipids X44160) e 12 g de Triton-X 100 (Merck 108643) fo- ram dispersos em aproximadamente 200 ml! de água desmineralizada duran- te agitação magnética. 3,0 ml! de CaCl? 0,5 mM (p.à.

Merck 1.02382) foram adicionados.

O volume foi ajustado para 300 mL com água desmineralizada eaemulsão foi homogeneizada usando um Ultra Thurax.

O substrato era preparado recentemente a cada dia.

Procedimento do ensaio: ' uma solução de enzima foi preparada para dar uma curva de ti- . tulação entre 0,06 e 0,48 mlmin. com a adição de 300 ul, de enzima.

Uma amostra de controle de atividade conhecida está incluída.

As amostras foram i 15 dissolvidas em água desmineralizada e agitadas por 15 min. a 300 rpm. . 25,00 ml de substrato tiveram a temperatura ajustada para 37ºC por 10-15 min. antes do pH ser ajustado para 7.0 com NaOH 0,05 M. 300 uL de solu- ção de enzima foram adicionados e a titulação contínua com NãOH 0,05 M foi realizada usando um titulador pH-Stat (Phm 290, Mettler Toledo). Duas determinações de atividade foram feitas em cada escala.

Depois de 8 minu- tos, a titulação é finalizada e a inclinação da curva de titulação é calculada entre 5 e 7 minutos.

O limite de detecção é de 3 TIPU/ml de solução de en- zima.

A atividade de fosfolipase (TIPU/g de enzima) foi calculada da seguinte maneira: Tue ma mi can, m:V, A onde: a é a inclinação da curva de titulação entre 5 e 7 minutos do tempo de reação (mlímin.). N é à normalidade do NãaOH usado (mol/1). V1 é 6 volume no qual a enzima é dissolvida (ml). |

Í m é a quantidade de enzima adicionada a V1 (g). - V2 é o volume de solução de enzima ádicionada ao substrato “ (m)), Determinação da atividade de triacilglicerídeo lipase:ensaio baseado em tri- glicerideo (iributiina) como substrato (LIPU): A atividade de lipase baseada em tributirina é medida de acordo com o Food Chemical Codex, Fourth Edition, National Academic Press, 1996, p. 803, com as modificações de que a amostra é dissolvida em água deionizada ao invés de tampão glicina e o pH de ajuste estatístico é de 5.5 aoinvésde7. 1 LIPU é definida como a quantidade de enzima que pode liberar ' 1 mol de ácido butírico por minuto sob as condições de ensaio. . Em um aspecto da invenção, à enzima lipolítica usada de acordo com a presente invenção pode ser obtida de um fungo filamentoso. Mais Ú 15 preferivelmente, a enzima lipolitica fúngica é obtida (preferivelmente obtida) . de Fusarium spp. Preferivelmente, a enzima lipolítica fúngica usada de acor- do com a presente invenção pode ser obtida (preferivelmente obtida) de Fu- sarium heterosporum eu Fusarium semitectum. Adequadamente, a enzima lipolítica fúngica usada de acordo com a presente invenção pode ser obtida (preferivelmente obtida) de Fusarium heterosporum (CBS 782.83) ou Fusari- um semitectum (IBT 9507).

Portanto; em um aspecto, a enzima lipoólítica fúngica usada de acordo com à presente invenção é, preferivelmente, uma enzima lipolitica de fungo filamentoso, preferivelmente uma erizima lipolítica de fungo filamento- sodetiposelvagem.

Em algumas das aplicações mencionadas aqui, particularmente as aplicações em alimentos, tais como aplicações em panificação, o benefi- ciador de alimento gerado de acordo com a presente invenção pode ser u- sado com um ou mais emulsificantes convencionais, incluíndo, por exemplo, monoglicerideos, ésteres de ácido diacetil tartárico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, estearoil lactilato de sódio (SSL) e lecitinas.

O beneficiador de alimento gerado pelos métodos de acordo |

" com a presente invenção é especialmente preferido em receitas de pão com + adição de gordura. . Adicionalmente ou alternativamente, o beneficiador de alimento gerado pelos métodos de acordo com a presente invenção pode ser usado Ú : 5 com uma ou mais enzimas de grau alimentício adequadas. Portanto, está dentro do escopo da presente invenção que, em adição à enzima lipolitica da presente invenção, pelo menos uma enzima adicional pode ser adiciona- da ao produto assado e/ou a massa de farinha, Tais enzimas adicionais in- cluem enzimas que degradam o amido tais como as endo ou exoamílases, pululanases, enzimas desramificantes, hemicelulases incluindo as xilanases, celulases, oxidoredutases, por exemplo, glicose oxídase, piranose oxidase, Ú sulfidrila oxidase ou uma carboidrato oxidase tal como aquela que oxida à ' maltose, por exemplo, hexose oxidase (HOX), lipases, fosfolipases, galaçto- lipases e hexose oxidase, proteases e aciltransferases (tais como aquelas descritasnoWO04/064987, por exemplo).

- É particularmente preferida que à enzima lipolitica usada de a- cordo com a presente invenção seja usada em combinação com alfa- amilases na produção de produtos alimentícios. Em particular, a amilase po- de dér uma amilase não maltogênica, tal como um polipeptídeo que possua atividade de exo-amilase não maltogênica, em particular, atividade de glica- no 14alfamaltotetra-hidrolase (EC 321.60) (como descrita no WOD05/003339). Uma amíilase não maltogênica adequada está disponível comercialmente como Powersoft? (disponibilizada por Danisco A/S, Dina- marca). Às amíilases maltogênicas tais como Novamylº (Novozymes A/S, Dinamarca)íambém podem ser usadas. Em uma modalidade, 6 uso combi- nado de alfa-amilases e do bensficiador de alimento da invenção pode ser usado em uma massa de farinha e/ou na produção de um produto assado tal como pão, bolos, donuts, bolo de donuts ou bagels. A combinação de alfa- amilases e do beneficiador de alimento da invenção também é considerada como preferivel para usó nos métodos de produção de tortilhas, tais como tortilhas de trigo e/ou milho.

Em outra modalidade preferida, o beneficiador de alimento gera- |

, do de acordo com a presente invenção pode ser usado em combinação com - uma xilanase na produção de produtos alimentícios.

GRINDAMYLº e PO- . WERBake 7000 são exemplos de enzimas xilanases comercialmente dispo- . níveis da Danisco A/S, Outros exemplos de enzimas xilanases podem ser encontrados noVWO03/020923 e WOD1/42433. Preferivelmente, o beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção pode ser usado em combinação com uma xilanase e uma alfa-amilase, Adequadamente, à alfa-amilase podé ser uma alfa- amilase maltogênica ou não mialiogênica (tal como GRINDAMYLº ou PO- WERSOft, disponibilizadas por Danisco A/S) ou uma combinação dessas.

O beneficiador de alimento da invenção também pode, preferi- ' velmente, ser usado em combinação com uma enzima oxidante, tal como : uma enzima que óxida a Maliose (MOX), por exemplo, a hexose oxidase (HOX). Métodos adequados estão descritos no WO03/099016. Enzimas que oxidam a maltose comercialmente disponibilizadas pela Danisco A/S são - GRINDAMYL'" e SUREBake.

Opcionalmente, uma alfa-amilase, tal como uma exo-amilase não maltogênica e/ou uma amilase maltogênica e/ou uma enzima que oxida a malitose (MOX) em combinação com à enzima, pode ser usadas nos mé- todosde acordo coma presente invenção para a preparação de uma massa de farinha, um produto assado, tortilha, bolo, macarrão, macarrão instantã- neólpetiscos fritos ou um produfo derivado do leite tal como 6 queijo.

O beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente in- venção é incluído no alimento, tipicamente, por métodos conhecidos na têc- nica Tais métodos incluem a adição do beneficiador de alimento diretamen- te no alimento ou na composição, adição do beneficiador de alimento em combinação com um estabilizador e/ou veículo e adição de uma mistura que compreenda o beneficiador de alimento e um estabilizador e/ou veículo.

Estabilizadores adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não são limitados a sais inorgânicos (tais como NaCl, sulfato de amônia), sorbitol, emulsificantes e detergentes (tais como Tween 20, Tween 80, Panodan AB100 sem triglicerídeos, éster de poliglicerol, mono- |

, oleato de sorbitana), óleo ( tal como óleo de canola, óleo de girassol! e óleo . de soja), pectina, trealose, sorbitol e glicerol. . Veículos adequados para uso com a presénte invenção incluem, . mas não são limitados à amido, farinha de cereal, trigo moido, farinha de trigo, NaCle citrato.

Para produtos assados, tais como pão, pão de vapor e pão de forma branco americano, por exemplo, a adição de um beneficiador de ali- mento da presente invenção pode resultar em um ou mais dos seguintes: volume e maciez do pão aumentados, vida útil prolongada e/ou efeito anti- decomposição, estrutura do miolo melhorada, heterogenicidade do poro re- duzida, tamanho médio do poro reduzido, índice de glúten intensificado, sa- " bor e/ou odor aperfeiçoados e cor da crosta melhorada. . Vantajosamente, o beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção pode ser usado para substituir emulsificantes em i 15 alimentos, tais como massa de farinha e/ou produtos assados. - O beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente in- venção pode ter sinergia com os emulsificantes tais como DATEM, SSL, CSL, monaglicerídeos, polissorbatos e Tween. Portanto, o beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção pode ser usado em combinação com um ou mais emulsificantes, Vantajosamente, o uso do be- neficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção em com- binação com um ou mais emulsificantes pode reduzir a quantidade total de emulsificante usado comparada com a quantidade necessária quando ne- nhum beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção é usado.

O beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente in- venção também pode ter sinergia com hidrocoloides, Guar, xantana e pectí- na e com enzimas que oxidam a maltose, tais como à hexose oxidase.

Para donuts, bolo de donuts, bagels, bolinhos e muífins, por e- xembplo,ousodo beneficiador de alimento da presente invenção pode resul- tar em um efeito sinérgico quando usado em combinação com uma ou mais alfa-amilases, alfa-amíilase maltogênica e alfa-amilase não maltogênica.

|

' Para bolos, pão de ló e torta de dendê, por exemplo, o uso do - beneficiador de alimento da presente invenção pode resultar em um efeito , sinérgico quando usado em combinação com um ou mais hidrocoloides tais . como Guar e/ou um ou mais emulsificantes tal como DATEM.

Para biscoitos, por exemplo, o uso do beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção confere propriedades aperfeiço- adas de capacidade de enrolamento e manuseio, particularmente quando frios (enrolamento a frio), Vantajosamente, na maionese e outros produtos baseados em ovo, por exemplo, e usa de um benefíciador de alimento gerado de acordo com a presente invenção póde levar à melhora da textura, redução do tama- ' nho médio da partícula e/ou redução da distribuição do tamanho médio da : partícula, aperfeiçoamento da estabilidade têrmica, melhor desemperiho no mícro-ondas e/ou estabilidade, i 15 Em bolos, o uso da presente invénção leva, vantajosamente, a - maciez aperfeiçoada, volume, propriedades de armazenamento e vida útil aperfeiçoadas.

Para macarrão ou produtos baseados em macarrão, por exem- plo, macarrão instantâneo, 6 beneficiador de alimento da presente invenção Z20 pode conferir uma ou mais das seguintes características: cortom amarelado aperfeiçoado, características mais estáveis da cor, redução de brilho, redu- ção do conteúdo de gordura, melhoramento da textura e da mordida (espes- sura), redução dá atividade da água, redução de quebra, aumento da firme- za da cor e aperfeiçoamento da manutenção do formato durante 0 proces- samento.

Preferivelmente, o beneficiador de alimento da presente inven- ção pode ser usado para reduzir o conteúdo de gordura de um macarrão ou um produto de macarrão, por exemplo, macarrão instantâneo, Em tortilhas, por exemplo, o uso de um beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção pode resultar em um ou mais dos seguintes: capacidade de enrolamento reduzída da tortilha, por exemplo, pelo aumento da flexibilidade, propriedades antidecomposição aperfeiçoa- |

Í das, maciez aperfeiçoada e/ou redução da falta de sabor. - Vantajosamente, a capacidade de enrolamento e/ou flexibilidade : aperfeiçoadas pode levar a uma probabilidade reduzida de despedaçamento : da tortilha quando enrolada.

O beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente in- venção é particularmente útil na preparação de produtos assados, tais como aqueles preparados a partir de uma massa de farinha, incluindo pães, bolos, produtos de massa doce, massas folhadas, massas líquidas, muffins, do- nuts, biscoitos, bolachas e cookies.

O beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente in- venção é particularmente útil na preparação de cereais para o desjejum, tais. ' como aqueles preparados à partir de uma massa de farinha, , O beneficiador de alimento também pode ser usado como aditivo : para o melhoramento do pão, por exemplo, composições de massa de fari- nha,aditivo para massa, condicionadores de massa, pré-misturas e prepara- . ções similares convencionalmente adicionados à farinha e/ou a massa de farinha durante os processos de fabricação do pão ou outros produtos assa- dos, para fornecer propriedades aperfeiçoádas ao pão ou a outros produtos assados, Portanto, a presente invenção refere-se a uma composição para o melhoramento do pão e/ou uma composição para o melhoramento de massa de farinha que compreenda um beneficiador de alimento gerado de acordo com a presente invenção; e também a uma massa de farinha ou pro- duto assado que compreenda tal composição para o melhoramento do pão eloumelhoramento da massa de farinha.

À composição para o melhoramento do pão e/ou a composição para 9 melhoramento da massa de farinha pode compreender, em adição à uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção, outras substancias, cujas substancias são convencionalmente usadas na panifica- ção para aperfeiçoar as propriedades da massa de farinha e/ou produtos assados. A composição para 6 melhoramento do pão e/ou à composição |

' para o melhoramento da massa de farinha pode compreender um ou mais - agentes convencionais para panificação, tais como um ou mais dos seguin- « tes constituintes: : Leite em pó, glúten, um emulsificante, gordura granulada, um o0- xidante, um aminoácido, açúcar, sal, farinha ou amido.

Exemplos de emulsificantes adequados são: monoglicerídeos, ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- ou digliceridens de ácidos gra- xos, ésteres de açúcar, estearoil lactilato de sódio (SSL) e lecitinas.

A composição para o melhoramento do pão e/ou massa de fari- nha pode compreender outra enzima, tal como uma ou mais enzimas de grau alimentício adequadas, incluíndo enzimas que degradam 6 amido fais 7 como endo ou exoamilases, pululanases, enzimas desramíficantes, hemiçe- : lulases incluíndo as xilanases, celulases, oxidorredutases, por exemplo, gli- : cose oxidase, piranose oxidase, sulfidrila oxidase ou uma cárboidrato oxida- se tal como aquela que oxída a maltose, por exemplo, hexose oxidase : (HOX), lipases, fosfolipases, galaciolipases e hexose oxidase, proteases e aciltransferases (tais como aquelas descritas no WOO04/064987, por exem- plo).

A expressão "produto assado" como usada aqui, incluí um pro- duto preparado a parir de uma massa de farinha. Exemplos de produtos assados (do tipo branco, light ou escuro) que podem ser vantajosamente produzidos. pela presente invenção incluem um ou mais dos seguintes: pão (incluindo pão branco, integral e de centeio), tipicamente na forma de fatias ou rolos ou torrada, pão tipo baguete francesa, pão pita, tortilhas, tacos, bo- los, panquecas, biscoitos, macarrão, noodles e semelhantes).

A massa de farinha de acordo com a presente invenção pode ser uma massa fermentada ou uma massa à ser submetida à fermentação. A massa pode ser fermentada de várias maneiras tais como péla adição de bicarbonato de sódio ou semelhantes ou pela adição de uma cultura de le- vedura adequada tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (fer mento de pão).

A massa de farinha de acordo com à presente invenção pode |

Í ser uma massa de farinha para a preparação de um produto de cereal desi- - drátado, torrada, biscoito ou bolacha, . Modalidades específicas da invenção: : Como discutido acima, a presente invenção refere-se a um mé- & todo para otratamento de material de planta que contém lipídeo, o método compreendendo a etapa de tratar uma suspensão líquida de pelo menos um material de planta contendo lipídeo parcialmente solubilizado com uma ou Mais enzimas que modificam lipídeo. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmen- teuma etapa precedente ou simultânea de tratar uma suspensão líquida de um material de planta que contém lipídeo para obter 6 dito material de planta : parcialmente solubilizado. : Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmen- : te uma etapa subsequente de tratar uma suspensão liquida para obter o dito —materialde planta solubilizado.

- Em algumas modalidades, 6 tratamento para obfer pelo menos um material de planta parcialmente solubilizado é um tratamento com uma ou mais enzimas que modificam a parede celular, Em algumas modalidades, o tratamento para obter pelo menos um material de planta parcialmente solubilizado é um tratamento por sonica- ção, tal como tratamento ultrassônico e/ou extrusão, Em algumas modalidades, a suspensão líquida de material de planta pelo menos parcialmente solubilizada contém material de planta inso- lúvel, Em algumas modalidades, 0 material de planta é tratado sob as ditas etapas do método simultaneamente.

Em algumas modalidades, o material de planta é tratado sob às ditas etapas do método de acordo com à presente invenção sem a remoção de uma quantidade substancial de qualquer componente.

Em algumas modalidades, a suspensão liquida é tratada adicio- nalmente com um ou mais enzimas adicionais.

Em algumas modalidades, a enzima adicional é uma ou mais |

' enzimas de transglicosilação. z Em algumas modalidades, a enzima adicional é uma protease. : Em algumas modalidades, uma ou mais enzimas que modificam : 6 lipídeo é uma enzima lipolítica selecionada do grupo que consiste em: uma triaciglicerol lipase, uma fosfolipase e uma galacto-lipase.

Em algumas modalidades; uma ou mais enzímas que modificam o lipídeo contém duas ou três atividades selecionadas do grupo que consiste em: atividade de triacilalicero] lipase, atividade de fosfolipase e atividade de galacto-lipase.

Em algumas modalidades, uma ou mais enzimas que modificam o lipídeo é uma, duas, três, quatro óu cinco enzimas que modificam lípideo : diferentes. . Em algumas modalidades, o método de acordo com a presente : invenção compreende uma etapa adicional de isolamento da fração solúvel. Em algumas modalidades, uma ou mais enzimas que modificam - à parede celular são selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase e Uma celulase, tal como celobio-hidrolases, endoglicanases e beta-glicanase, Em algumas modalidades, a celulase é selecionada a partir de uma endocelulase, uma exocelulase, uma celobiase, uma celulase oxidativa, umacelulosefosforilase, Em algumas modalidades, uma ou mais enzimas adicionais são enzimas que modificam o amido, selecionadas do grupo que consiste em uma alfa-amilase, uma pululanase, isoamílase e uma beta-amilase.

Em algumas modalidades, uma ou mais enzimas de transglicosi- laçãosão selecionadas do grupo que consiste em enzimas da classe de en- zima EC 3.2.1.20.

Em algumas modalidades, o material de planta é fornecido em partículas, nas quais o tamanho médio da partícula do dito material de planta particulado está abaixo dé 3000 um, tal como abaixo de 1000 um, tal como abaixode500 pm Em algumas modalidades, o material de planta é um farelo de cereal.

|

" Em algumas modalidades, o farelo de cereal é selecionado entre « trigo, cevada, aveia, centeio, triticalêe, arroz e milho.

" Em algumas modalidades, o método de acordo com a presente : invenção compreende, adicionalmente, uma etapa precedente de i) fracionar ogrãode cereal obtido para obter o endosperma, farelo e germe; ji) separar e distribuir o endosperma, farelo e germe para possibilitar que eles sejam tratados; e iii) moer o farelo, Em algumas modalidades, o farelo de cereal é obtido a partir de um processo de moagem industrial e moido posteriormente para obter um 1D tamanho médio da partícula abaixo de 500 pm, tal como abaixo de 400 pm, tal como abaixo de 200 um. , Em algumas modalidades, o material de planta é um produto 6o- í lateral do processamento de material de planta, tal como pasta de neutrali- : zação do refino de óleos vegetais, grãos usados para fermentação ou grãos secos dedestilaria com solúveis (DDGS).

. Em algumas modalidades, a composição obtida compreendendo os lipídeos modificados, tais como lipídeos funcionais, são tratadas adicio- nalmente para inativar a atividade enzimática adicional.

Em algumas modalidades, o grau de solubilização obtido do dito material de planta, como determinado sobre a matéria seca versus a matéria seca de material de planta, é maior do que 15%, tal como maior do que 25%, tal como maior do que 35%, tal como maior do que 40%, tal como maior do que 50%, tal como na faixa entre 40% a 60%, tal como na faixa entre 50% a 60%.

Em algumas modalidades, o conteúdo total de lipideos e lipídeos modificados, tal como lipídeos funcionais, como determinado sobre a matéria seca versus a matéria seca de material de planta na fração solúvel obtida é de pelo menos cerca de 0,05%, tal como pelo menos cerca de 1,0%, tal co- mo na faixa entre 0,05 a 5%.

Em algumas modalidades, o método de acordo com a presente invenção compreende ainda uma etapa de desidratar a composição obtida que compreende lipídeos e/ou lipídeos modificados, tais como lipídeos fun- |

' cionais. - Em algumas modalidades, o método de acordo com a presente . invenção compreende ainda uma etapa de secar por pulverização a compo- - sição obtida que compreende lipídeos e/ou lipídeos modificados, tais como lipídeos funcionais.

Em algumas modalidades, o método de acordo com a presente invenção compreende ainda uma etapa de liofiização da composição obtida que compreende lipídeos e/ou lipídeos modificados, tais como lípídeos fun- cionais, Em algumas modalidades, o tratamento com uma ou mais enzi- mas que modificam lipídeo gera lipideos funcionais, tais como emulsifican- M tes. : Em algumas modalidades, o tratamento com uma ou mais enzi- . mas que modificam lipídeo gera outros compostos funcionais, tais como és- teres de esterol funcional.

: Em algumas modalidades, o tratamento com uma ou mais enzi- mas que modificam lipídeo gera mais do que 5%, tal como mais do que 10%, tal como mais do que 25%, tal como mais do que 50% de conversão dé fos- fatidilinosito] em lisofosfatidilinosítol (liso-P1).

Em algumas modalidades, o tratamento com uma ou mais enzi- mas que modificam lipídeo hidrolisa pelo menos 5% dos fosfolipídeos, tal somo pelo menos 10% dos fosfolipideos, tal como pelo menos 20% dos fos- folipídeos, tal como pelo menos 50% dos fosfolipideos, tal como pelo menos 75% dos fosfolipídeos.

Em algumas modalidades, o tratamento com uma ou mais enzi- mas que modificam lipídeo hidrolisa pelo menos 5% dos glicolipideos, tal como pelo menos. 10% dos glicalipídeos, tal como pelo menos 20% dos gli- colipídeos, tal como pelo menos 50% dos glicolipideos, tal como pelo menos 75% dos glicolipídeos.

Em algumas modalidades, o tratamento com uma óu Mais enzi- mas que modificam lipídeo hidrolisa pelo menos 5% dos triglicerídeos, tal comó pelo menos 10% dos triglicerídeos, tal como pelo menos 20% dos tri- |

' glicerídeos, tal como pelo menos 50% dos triglicerídeos, tal como pelo me- - nos 75% dos triglicerídeos. ; Em algumas modalidades, a composição que compreende os li- ' pideos &/ou lipídeos modificados, tais como os lipídeos funcionais obtidos no método de acordocoma invenção é adicionada diretamente como uma mis- tura de material de planta solúvel e insolúvel na produção de um produto alimenticio. Em algumas modalidades, 5 produto alimentício de acordo com à presente invenção é selecionado do grupo que consiste em pão, um cereal paraodesjejum, um macarrão, biscoitos, cookies, petiscos e cerveja.

EXEMPLOS ' EXEMPLO 1 ' Exemplo 1. Modificação em Escala Laboretorial de farelo de trigo Comercial . e lipídeos de farelo de trigo seguida pela avaliação na panificação: Farelo: “ As frações de farelo de trigo obtidas de um moinho comercial fo- ram usadas. As frações consistiam em uma fração de farelo fino e uma fra- ção de farelo grosseiro. Antes do uso, a fração de farelo grosseiro foi moida para obter um tamanho de partícula menor, o que aumentará a superfície específica do farelo, aumentando eventualmente a eficiência da solubiliza- ção enzimática do farelo. A moagem foi realizada em um moedor Retch para obter um tamanho médio de partícula de 500 pum. Entretanto, deve ser ob- servado que um tamanho de partícula menor pode ser preferível, em relação ao grau de solubilização, Enzimas Tabela 1. Enzimas usadas para a modificação do farelo de trigo Atividade da Enzima — — IDda Enzima Xilanase Xilanase bacteriana Celulase/glicanase Genencor GC220 Amilase Genencor, Spezyme Fred (4016101001) |

B4/78 ' Atividade da Enzima ID da Enzima Pululanase Genencor Optimax 1-1000 (401-05349-002) . Beta-amilase Genencor Optimalt BBA (EDS 221) Fosío-galacto lipase Grindamy| Powerbake 4070 Transglicosidase Genencor TGL-500 (1600675782) Protocolo: Tabela 2. Protocolo usado para a modificação do farelo O farelo de trigo foi suspenso em NaPí 50 mM, pH & (13% pe- so/peso) em um recipiente/reator com táampa fechada z 5 A suspensão de farelo é aquecida a 100ºC sob agitação e fervi- da por 2 min. , A amostra é colocada sob agitação (com a tampa fechada) a 50 . *C e deixada para equilibrar em relação à temperatura As enzimas são adicionadas e a reação é continuada a 50ºC por 24h (temperatura e tempo podem ser otimizados posteriormente) Sobrenadante é separado dos resíduos sólidos Sobrenadante é fervido para inativar atividade enzimática adi- cional Amostra é resíriada e armazenada para evitar a contaminação Péléte é liofilizado Sobrenadante é analisado Testes: As modificações a seguir foram feitas no farelo (tabela 3) Tabela 3: Quantidade de farelo, g, tratado com diferentes enzimas Gramas de amostra de enzima/109 de farelo Teste Fo Tra e GC220 = Ú a > Transa.

Fo z 10 667 112 005 004 001 OO 005 0000007 3 10 667 112 005 DO 00) OM 0,05 — 0000017 4 10 68867 112 005 0M 00 o 005 0000172 |

' Análise: j A fração solúvel do farelo (o sobrenadante) é analisada com re- : lação a: : Conteúdo de matéria seca (%): Uma amostra quantitativa do fárelo solóvel obtido é liofilizada. Depois da liofilização, 6 tamanho da amostra é novamente quantificado e a quantidade de matéria seca é calculada, Como controle, o tampão é incluído na análise. Avaliação da modificação do lipídeo usando testes de cozimento: Receitade cozimento: O desempenho no cozimento da farinha, farinha com adição de ' farelo solubilizado foi avaliado em testes de cozimento em pequena escala . (50 g de mistura e fatias de 10 9) usando a receita abaixo (tabela 4). i . Tabela 4. Receita usada para a avaliação do desempenho da farinha, farinha com adição de com farelo solubilizado e farinha reconstituída com adição de - farelo insolúvel. Salfaçúcar é uma mistura 1:1 (peso/peso) de sal e açúcar. À água é a água de absorção determinada pela análise Farinográfica. Ingredientes. Mini escala ml ou g Farinha so Fermento seco 1 SalAçúcar 16 Água 400BU -2% Fabricação da massa e cozimente A farinha (ou a mistura de farinha e farelo) e os ingredientes se- cos são misturados por um minuto, depois do que a água é adicionada e a misturação é continuada por outros cinco minutos.

Depois da misturação, quatro blocos de massa foram pesados, cada um contendo 10 gramas de farinha. Esses foram moldados em forma de pão usando um moldador manual. As fatias foram colocadas em assadei- rasecolocadasem um recipiente fechado (com uma tampa) e deixadas so- bre à mesa por 10 minutos. Depois disso, o pão é fermentado a 34ºC RH de |

' 85% por 45 minutos e finalmente assado a 230ºC por cinco minutos em um - forno Bago (Bago-line, Fábora, Dinamarca). Duránte a expansão da massa, * à viscosidade foj avaliada subjetivamente em uma escala de 1 (muito visco- . sa) a 5 (seca). O pãs foi resfriado por 20 minutos antes da avaliação (pesagem, Medidá do volume; avaliação do miolo, da crosta e sensorial). Testes de cozimento Os testes de cozimento abaixo foram realizados (tabela 5). Tabela 5. Estrutura experimental do teste de cozimento. 1!D refere-se à com- posição da farinha tanto com a adição de farelo solubilizado quanto reconsti- tuída com farelo insolúvel, 68 números êntre parênteses referem-se ao tra- : tamento da farinha de acordo com a tabela 3. Farinha (g) é a quantidade de . farinha no pão.

Farelo (6) é a quantidade de farelo usada para a reconstitui- ção.

Farelo Sol. (ml!) é a quantidade de farelo solubilizado adicionado à fari- i 15 nhaáão invés de água.

Água (ml) é à quantidade de água adicionada a fari- " nha "Farelo" (%) é a quantidade de farelo, tanto de farelo solubilizado quanto insolúvel baseado no pesa da farinha.

TIPU refere-se à Unidade de Titulação de Fosfolipase como descrita acima.

Lozimento o Farona: Foo Soo Água bico TA comee 8 0 0 2800 - 2 Farelo & 150% sã o 2900 = 5,22 3 str so o 28,00 - 4 reu so o 29,00 - jo 5 A oonPUca 50 o 29,00 - 8 Farelo 5,0% a75 25 - 29,00 5,00 : Resultados: Graude solubilização do farelo: Com base na matéria seca, à quantidade de farelo solubilizado nos testes foi de aproximadamente 54%. Resultados do cozimento: |

: Como pode ser visto na fabela 6 e na figura 1, a adição de fibras - solúveis têm pouco ou nenhum efeito sobre o volume específico do pão.

En- " tretanto, a combinação da solubilização do farelo com a fosfolipase tem um . efeito significativo sobre o volume do pão.

Tabela6 Resultados do teste de cozimento.

ID refere-se à composição da | farinha tanto com a adição de farelo solubilizado quanto reconstituída com farelo insolúvel.

Farinha (9) é a quantidade de farinha no pão.

Farelo (gq) é a quantidade de farelo usada para a reconstituição.

Volume Específico (mg/ml) é o volume específico absoluto dos pães.

Volume relativo versus controle (%)êo volume relativo dos pães versas o pão 1 (controle) : Cozimento D Volume Específico, — Volume relativo mi/g versus controle . k Controle 3,58 100 BR 2 Farelo Sol.5,0% 346 a7 Farelo Sol,5,0%, : 3 1TIPU 4,05 113 Farelo Sol,5,0%, 4 10TIPU 4,24 118 Farelo Sol.5,0%, 5 100TIPU 497 138 6 Farelo 5,0% 3,38 4 Os pães resultantes podem ser vistos na figura 2, Exemplo 2. Modificação em Escala laboratorial de lipídeos de farelo de trigo comercial sequida pela avaliação no cozimento: Para avaliar o efeito da modificação da fração lipídica que gera lipídeos funcionais com propriedade emulsificantes.

Outro experimento u- sando doses diferentes e lipases diferentes foi realizado.

Farelo: Frações de farelo de trigo obtidas de um moinho comercial foram usadas.

As frações consistiam em uma fração de farelo fino e uma fração de farelo grosseiro, Antes do uso, à fração de farelo grosseiro foi moida para obter um tamanho de partícula menor, o que aumentará a superfície especíi- |

Ú fica do farelo, aumentando eventualmente a eficiência da solubilização en- . zimática do farelo.

A moagem foi realizada em um moedor Retch para obter . um tamanho médio de partícula de 500 um.

Entretanto, deve ser observado ; que um tamanho de partícula menor pode ser preferível, em relação ao grau desolubilização.

Enzimas: Tabela 7: Enzimas usadas para a modificação do farelo de trigo Atividade Enzimática 1D da Enzima Fosfo-galacto lipase Grindamyl Powerbake 4070 - Lipase EDS 321 ' Protocolo: : Tabela 8. Protocolo usado para a modificação do farelo O farelo de trigo foi suspénso em NaPi 59 mM, pH 5 (13% pe- : so/peso) em um recipiente/reator com tampa fechada A suspensão de farelo é aquecida a 100ºC sob agitação e fervi- da por 2 min.

A amostra é colocada sob agitação (com a tampa fechada) à 50ºCedeixada para equilibrar em relação à temperatura As enzimas são adicionadas e a reação é continuada a 50ºC por 24 h (temperatura e tempo podem ser otimizados posteriormente) Sobrenadante é separado dos resíduos sólidos Sobrenadante é fervido para inativar atividade enzimática adi- cional Amostra é resfriada e armazenada para evitar à contaminação Pélete é liofilizado Sabrenadante é analisado Testes: As seguintes modificações foram feitas no farelo (tabela 9) |

Ú Tabela 9: Quantidade de farelo, g, tratado com diferentes enzimas : Gramas de amostra de enzima/ 10g de . farelo Teste —Farelb,g Tampãog —Fosfoipass —Lipase ' 1 10 886,7 0,0009017 2 10 66,7 0,000172 3 10 686,7 7,28E-09 4 10 66,7 7,28E-08 66,7 7,2BE-07 8 10 86,7 D,00D017 7,28E-08 Análise: A fração solúvel do farelo (o sobrenadante) é analisada com re- . lação a: 5 Conteúdo de matéria seca (%): ' Uma amostra quantitativa do farelo solúvel obtido é liofilizada. ' Depois da liofiização, o tamanho da amostra é novamente quantificado e a . quantidade de matéria seca é calculada, Como controle, o tampão é incluído na análise. 1D Avaliaçãoda modificação do lipideo usando testes de cozimento: Receita de cozimento:

O desempenho no cozimento da farinha, farinha com adição de farelo modificado solubilizado foi avaliado em testes de cozimento em pe- quena escala (50 gq de mistura e fatias de 10 g) usando a receita abaixo (ta-

bela10). Tábela 10. Receita usada para a avaliação do desempenho do cozimento da farinha, farinha com adição de com farelo solubilizado e farinha reconstituída com adição de farelo insolóvel.

SaVaçúcar é uma mistura 1:1 (peso/peso) de sal e açúcar.

À água é a água de absorção determinada pela análise Farino- gráfica.

Ingredientes Mini escala ml ou q Farinha 50 Fermento seco 1 |

" Ingredientes Mini escala . Sal/Açúcar 16 . Água 400BU -2% . Fabricação da massa e cozimento A farinha (ou a mistura de farinha e farelo) e os ingredientes se- cos são misturados por um minuto, depois do que a água é adicionada e a misturação é continuada por outros cinco minutos.

Depois da misturação, quatro blocos de massa foram pesados, cada um contendo 10 gramas de farinha. Esses foram moldados em forma de pão usando um moldador marnual. As fatias foram colocadas em assadei- fas é colocadas em um récipiente fechado (com uma tampa) e deixadas so- bre à mesa por 10 minutos. Depois disso, 6 pão é fermentado a S4ºC RH de - 10 85% por 45 minutos e finalmente assado à 230ºC por cinto minutos em um - forno Bago (Bago-line, Fáborg, Dinamarca). O pão foi resfriado por 20 minu- tos antes da avaliação (pesagem, medida do volume, avaliação do miolo, da ' crosta e sensorial). Testes de cozimento Os testes de cozimento abaixo foram realizados (tabela 11). Tabela 11. Estrutura experímental do teste de cozimento. ID refere-se à composição da farinha com a adição de farelo solubilizado, 08 fúmeros en- tre parênteses referem-se ao tratamento da farinha de acordo com a tabela

9. Farinha (9) é a quantidade de farinha no pão. Extrato de Farelo (ml) é a quantidade de farelo solubilizado adicionado à farinha ao invés de água. Á- gua (ml) é a quantidade de água adicionada à farinha. Cozimento ID Farma: ta fo TT Cole 8 o 328. 3 a = 50 29,00 - 4 Lipídeo do farelo 100 TIPU (2) so 29,00 - 5 pano as 3 so 29,00 - |

| Cozimento — ID Fama o = a. : 6 ada a 5 E 29,00 - . 7 Lipideo do farelo 300 LIPU (5) 50 29,00 = 8 Lipideo tio farelo 10TIPI+3 LIPU so 29,00 - (6) Resultados: Grau de solubilização do farelo: Com base na matéria seca, a quantidade de farelo solubilizado nos testes foi de aproximadamente 30%. — Resultadosdo cozimento: . Como pode ser visto na tabela 12 e na figura 3, a adição de fi- bras solúveis têm pouco ou nenhum efeito sobre 6 volume específico do , pão, Entretanto, a combinação da solubilização do farelo com a fosfolipase ' tem um efeito significativo sobre o volume dao pão. : 10 Tabelja12. Resultados do teste de cozimento.

ID refere-se à composição da farinha com à adição de farelo solubilizado, 05 números entre parênteses referem-se ao tratamento do farelo de acordo com a tabela 9, Farinha (9) é à quantidade de farinha no pão.

Volume Especifico(mgími) é 0 volume especi- fico absoluto dos pães.

Volume relativo versus controle (%) é o volume rela- tivodos pães versus o pão 1 (controle) Cozimento Ta VolumeEspecífico, Volume relativo mia versus controle 1 Controle 3,39 100 2 Lipídeo do farelo de 3,16 às controle Lipídeo do farelo 1D 3 O neu O) 32 7 Lipídeo do farelo 100 4 TIPU (2) 2344 101 Lipídeo do farelo 3 $ p LIPU (3) 318 o 6 Lipídeo do farelo 30 3,20 94 |

: Cozimento iD YVolumeEspecífico, “Volume relativo : ' mig versus controle

O UT Lipídeo do farelo 300 ' 7 P UPU GS) 3,9 97 Lipídeo do farelo 8 10TIPI+3 LIPU (6) sã me Os pães resultantes podem ser vistos na figura 4.

Como pode ser observado a partir dos resultados acima no ex- perimento 2, nenhum efeito significativo foi obtido no desempenho no cozi- mento nesse experimento. Comparada com o exemplo 1, à estrutura do e- é 5 xemplo2diferiuna ausência de parede celular e de enzimas que modificam o amido, Então, pode ser concluído que deve haver um efeito sinérgico entre ' as enzimas que modificam à parede celular, o amido e lipídeos em relação a ' geração de lipídeos funcionais a partir de farelo de trigo. Exemplo 3. Modificação em Escala Laboratorial de farelo de triqo comercial elipídeos de farelo de trigo pela avaliação no cozimento -2: Para avaliar adicionalmente o efeito sinérgico da modificação de farelo de trigo com enzimas que modificam a parede celular, o amido e lipí- deos, esse experimento foi realizado.

Farelo: Frações de farelo de trigo obtidas de um moinho comercial foram usadas, As frações consistiam ém uma fração de farelo fino é uma fração de farelo grosseiro. Antes do uso, a fração de farelo grosseiro foi moída para obter um tamanho de partícula menor, o que aumentará a superfície especí- fica do farelo, aumentando eventualmente a eficiência da solubilização en- Zimática do farelo, A moagem foi realizada em um moedor Retch para obter um tamanho médio de partícula de 500 jim. Entretanto, deve ser obsérvado que um tamanho de partícula menor pode ser preferivel, em relação ao grau de solubilização.

Enzimas: |

' Tabela13: Enzimas usadas para a modificação do farelo de trigo : Atividade Enzimática , ID da Enzima : Xilanase Xilanase bacteriana Celulase/glicanase Genencor GC220 : Genencor, Spezyme Fred Amilãss (4016101007) Fosfo-galacto lipase Grindamyl Powerbake 4070 Protocolo: Tabela 14. Protocolo usado para à modificação do farelo . O farelo de trigo foi suspenso em NaPi 50 mM, pH 5 (13% pe- - 5 so/peso)em um recipiente/reator com tampa fechada A suspensão de farelo é aquecida a 100ºC sob agitação e fervi- " da por 2 min.

A amostra é colocada sob agitação (com à tampa fechada) à 50ºC e deixada para equilibrar em relação à temperatura As enzimas são adicionadas e a reação é continuada a 50ºC por 24 h (temperatura e tempo podem ser otimizados posteriormente) Sobrenadante é separado dos resíduos sólidos Sobrenadante é fervido para inativar atividade enzimática adi- cional Amostra é resfriada e armazenada para evitar a contaminação Pélete é liofilizado Sobrenadante é analisado Testes: As seguintes modificações foram feitas no farelo (tabela 15)

|

BAfTB ' Tabela 15: Quantidade de farelo, 4, tratado com diferentes enzimas : Gramas de amostra de enzima/10g de farelo Teste Faso.

Teneão Xilanase —GCr20 Amilase Fosfalipase 1 wo 67 2 10 866,7 112 0,000172 3 10 66,7 1,12 0,05 0,000172 4 10 66,7 1,12 0,05 0,04 0,000172 66,7 0,05 0,000172 5 10 56,7 0,04 0,000172 7 10 66,7 0,000172 - Análise: A fração solúvel do farelo (o sobrenadante) é analisada com re- ' lação a: 7 5 Conteúdo de matéria seca (%): Uma amostra quantitativa do farelo solúvel obtido é liofilizada. ' Depois da liofilização, o tamanho da amostra é novamente quantificado e a quantidade de matéria seca é calculada.

Como controle, o tampão é incluído na análise. 10 Avaliaçãoda modificação do lipídeo usando testes de cozimento: Receita de cozimento:

O desempenho no cozimento da farinha, farinha com adição de farelo modificado salubilizado foi avaliado em testes de cozimento em pe- queria escala (50 q de mistura e fatias de 10 g) usando a receita abaixo (ta-

bela/1S) Tabela 16. Receita usada para a avaliação do desempenho da farinha, farinha com adição de com farelo solubilizado e farinha reconstituíida com adição de farelo insolúvel.

Sal/açúcar é uma mistura 1:1 (peso/peso) de sal e açúcar.

À água é a água de absorção determinada pela análise Farinográfica. “ingredientes — —————.Mniescala = [tt EA Farinha 50 Fermento seco 1 |

B5/T8 7 SalAçúcar 16 : Água 400BU -2% . Fabrivação da massa e cozimento : A farinha (ou a mistura de farinha e farelo) e os ingredientes se- . cos são misturados por um minuto, depois do que a ádua é adicionada e a misturação é continuada por outros cinco minutos.

Depois da misturação, quatro blocos de massa foram pesados, cada um contendo 10 gramas de farinha, Esses foram moldados em forma de pão usando um moldador manual. As fatias foram colocadas em assadei- ras e colocadas em um fecipiente fechado (com uma tampa) e deixadas so- bre a mesa por 10 minutos, Depois disso, o pão é fermentado a 34ºC RH de ' 10 85% por45 minutos e finalmente assado a 230ºC por cinco minutos em um forno Bago (Bago-line, Fábora, Dinamarca). O pão foi resfriado por 20 minu- tos antes da avaliação (pesagem, medida do volume, avaliação do miolo, da ' crosta e sensorial). - Testes de cozimento Os testes de cozimento abaixo foram realizados (tabela 17). Tabela 17, Estrutura experimental do teste de cozimento. ID refere-se à composição da farinha com a adição de farelo solubilizado, os números en- tre parênteses referem-se ao tratamento da farinha de acordo com a tabela

15. Farinha (q) é a quantidade de farinha ho pão. Extrato de Farelo (ml) é a quantídade de farelo solubilizado adicionado à farínha ao invés de água. Á- gua (m)) é a quantidade de água adicionada à farínha. Cozimento ho. 9 é uma repetição do cozimento 5, entretanto com a adição de 0,2 mg de xilana- se 6 0,5 mg de fosfolipase/kg de farinha durante a misturação da massa. Cozimento o Fa ra são Água, ml NS Sr Sr Sr SS DT 2 Farelo de controle (1) so o 29 3 Fareto BSS, KLM1 (2) 50 29 4 Farelo BS3, GC 220, KLM1 so 29 (e) 5 Farelo Fe MERO so 28 |

' Cozimento D Fo a PS Água, ml 6 Farelo GC220, KLM1 (5) so 29 7 7 Farelo Spezyme, KLM1 (6) 50 29 : B Bran KLM1 (7) so 29 OUTER mos Resultados: Grau de solubilização do farelo: Com base na matéria seca, a quantidade de farelo solubilizado nos testes foi, em média, de aproximadamente 30 à 54%, Resultadosdo cozimento: W Como pode ser visto na tabela 18 e na figura 5, a adição de fi- bras solúveis têm pouco ou nenhum efeito sobre o volume específico do Ú pão.

Entretanto, à combinação da solubilização do farelo com à fosfolipase ] tem um efeito significativo sobre 6 volume do pão. . 10 Tabela 18 Resultados do teste de cozimento. 1D refere-se à composição da farinha com a adição de farelo solubilizado, os números entre parênteses referem-se ao tratameênto do farelo de acordo com à tabela 16. Farinha (9) é a quantidade de farinha no pão.

Volume Especifico(mgím) é o volume espe- cífico absoluto dos pães.

Volume relativo versus controle (%) é o volume relativo dos pães versus o pão 1 (controle) cosmarto Do SEE EEE. 1 Farelo 3,88 110 2 Farelo de controle (1) 3,08 100 3 Farelo BS3, KLM1 (2) 3,14 102 4 Farelo BS3, GC 220, KLM1 357 115 s) h ), e 5 Farelo Se ENE 3,84 125 6 Farelo GC220, KLM1 (5) 3,57 116 7 Farelo Spezyme, KLM1 (6) 3,26 106 8 Farelo KLM1 (7) 3,10 101 |

' Volume Espe- Vi e relativo ver- . Corimento DP . o atado Ae ponta : MO Farelo, BSS,.GO220, 9 Spezyme, KLM1 (+BS3, 4,98 162 x KLM1) Os pães resultantes podem ser vistos na figura 6.

Como pode ser observado a partir dos resultados ácima no ex- perimento 3, um efeito significativo foi obtido no desempenho no cozimento nesse experimento pela combinação do tratamento do farelo com enzimas quemodificama parede celular, amido e lipídeos. Exemplo 4. Modificação em escala laboratorial de farelo de trido comercial e : de lipídeos de farelo de trigo seguida pela avaliação do farelo modificado no cozimento: . Para avaliar o efeito sinérgico do farelo de trigo modificado com “ 10 enzimas que modificam a parede celular, amido e lipídeo, foi testado o efeito da geração in sítu de lipideos modificados que possuem propriedades emul- : sificantes, sobre a adição de farelo de trigo em relação ao desempenho no cozimento. É bem sabido que a adição de farelo à farinha ou a farinha de grão inteiro, tem um potencial de cozimento menor do que a farinha com en- dosperma, Farelo: Frações de farelo de trigo obtidas de um moinho comercial foram usadas. As frações consistiam em uma fração de farelo fino e uma fração de farelo grosseiro, Antes do uso, a fração de farelo grosseiro foi moida para obter um tamanho de partícula menor, o que aumentará à superficie especí- fica do farelo, aumentando eventualmente a eficiência da solubilização en- zimática do farelo. A moagem foi realizada em um moedor Retch para obter um tamanho médio de partícula de 500 um. Entretanto, deve ser observado que um tamanho de partícula menor pode ser preferível, em relação ao grau desolubilização.

Enzimas: ' |

: Tabela19: Enzimas usadas para a modificação do farelo de trigo Atividade Enzimática ID da Enzima ' Hlanase Xilanase bacteriana Danisco - (1223449, 4010866762) Celulase/glicanase Genencor GC220 Amilase Genencor, Spezyme Fred (4018101001) Fosfo-galacto lipase Grindamyl PFowerbake 4070 Danisco . Protocolo: Tabela 20. Protocolo usado para a modificação do farelo - O farelo de trigo foi suspenso em NaPi 50 mM, pH 5 (13% pe- " 5 so/peso)em um recipiente/reator com tampa fechada A suspensão de fárelo é aquecida a 100ºC sob agitação e fervi- ' da por 2 min.

A amostra é colocada sob agitação (com a tampa fechada) a 50ºC e deixada para equilibrar em relação a temperatura As enzimas são adicionadas e a reação é continuada a 50ºC por 24 h (temperatura e tempo podem ser otimizados posteriormente) O farelo modificado é fervido para inativar atividade enzimática adicional Amostra é resfriada e armazenada para evitar a contaminação Testes: As seguintes modificações foram feitas no farelo (tabela 21) Tabela 21: Quantidade de farelo, 9, tratado com diferentes enzimas Gramas de amostra de erizima/109 de farelo Teste É ão Torçêo: Xilanase —GC220 Amilase & A sctoto = 1 10 667 0.19 005 — od 2 10 66,7 0,19 LA) 0,04 D0,00D03 Avaliação da modificação do lipideo usando testes de cozimento: : | i Receita de cozimento: ' O desempenho no cozimento da farinha e da farinha com adição . de farelo modificado foi avaliado em testes de cozimento em pequena escala . (50 q de mistura e fatias de 10 g) usando a receita abaixo (tabela 22). Tabela2z22, Receita usada para a avaliação do desempenho da farinha, fari- nha com adição de com farélo modificado.

Salaçúcar é uma mistura 11 (peso/peso) de sal e açúcar.

A água é à água de absorção determinada pela análise Farinográfica.

Ingredientes Mini escala . mloug , Farinha 50 O Fermentaseco o - Sall/Açúcar 1,6 . Água 400BU -2% : Fabricação da massa e cozimento A farinha e os ingredientes secos são misturados por um minuto, depois do que à água (ou água e farelo modificado) é adicionada e a mistu- ração é continuada por outros cinco minutos.

Depois da misturação, quatro blocos de massa foram pesados, cada um contendo 10 gramas de farinha, Esses foram moldados em forma depãousandoum moldador manual, As fatias foram colocadas em assadel- ras e colocadas em um recipiente fechado (com uma tampa) e deixadas so- bre a mesa por 10 minutos.

Depuis disso, o pão é fermentado a 34ºC RH de 85% por 45 minutos e finalmente assado a 230ºC por cinco minutas em um forno Bago (Bagó-line, Fábora, Dinamarca), O pão foi resfriado por 20 minu- tosantesda avaliação (pesagem, medida do volume, avaliação do miolo, da crosta e sensorial). Testes de cozimento Os testes de cozimento abáixo foram realizados (tabela 23). |

Ú Tabela 23, Estrutura experimental do teste de cozimento. ID refere-se à ' composição da massa de farinha, os números entre parênteses referem-se “ ao tratamento do farelo de acordo com a tabela 21. Farinha (q) é a quantida- : de de farinha no pão. Extrato de Farelo (mi) é a quantidade de farelo solubi- fizado adicionado à farinha ao invés de água. Água (ml) é a quantidade de água adicionada a farinha. Cozimento ID Fem eta a Água, ml 1 Controle (Trigo) 50 o 29 2a So ao o . Enz, parede celular W Bran 3 (com insolúveis) + Lipase (com 50 30 o : insol.) (2) é Resultados: Resultados do cozimento: ' Como pode ser visto na tabela 24 e na figura 7, a adição de fi- bras modificadas teve um efeito negativo sobre o volume específico do pão, Entretanto, a adição de farelo também modificado com fosfolipase, gerando lipídeos funcionais, possui um efeito muito menos prejudicial sobre o volume do pão comparado com à adição apenas de farelo com parede celular modi- ficado.

Tabela 24, Resultados do teste de cozimento. ID refere-se à composição da farínha, os números entre parênteses referem-se ao tratamento do farelo de acordo com à tabela 21. Farinha (q) é a quantidade de farinha no pão. Volume Especifico(mgíml) é o volume específico absoluto dos pães. Volume relativo versus controle (%) é o volume relativo dos pães versus o pão 1 (controle) GCozimento D Vol E MMuliahirias 1 Controle (trigo). 2,40 100 > EM. parei s ir Tul (com 344 às 5 piece tos |

TIUW7B ' Os pães resultantes podem ser vistos na figura 7. Ú Coma pode ser observado a partir dos resultados acima, um e- " feito significativo foi obtido no desempenho no cozimento nesse experimento - pela combinação do tratamento do farelo com enzimas que modificam a pa- redecelular, amido e lipídeos antes da adição à massa de farinha.

Exemplo 5. Modificação em escala laboratorial de farelo de arroz e lipídeos de farelo de arroz pela avaliação do farelo solubilizado e dos lipídeos do fa- telo modificado no cozimento: Para avaliar adicionalmente os achados surpreendentes com re- laçãoàsolubilização de farelo combinada com a modificação dos lipídeos do farelo, foi testado o efeito do farelo de arróz solubilizado é dos lipídeos do farelo de arroz modificado em testes de cozimento. . Farelo: . Uma fração de farelo de arroz comercial foi usada no experimen- to “ Enzimas: Tabela 25: Enzimas usadas para a modificação do farelo de arroz Atividade Enzimática ID da Enzima Xilanase Xilanase bacteriana Danisco (1223449, 4010866762) Celulase/glicanase Genencor GC220 “ Genencor; S me Fred Amilase ' (4n16101007) . Grindamyl Powerbake 4070 Fosfo-galacto lipase Y Danisco Protocolo: Tabela 26, Protocolo usado para a modificação do farelo O farelo de arroz foi suspénso em NaPj 50 mM, pH 5 (13% pe- so/peso) em um recipiente/reator com tampa fechada |

A suspensão de farelo é aquecida a 100ºC sob agitação e fervi- da por 2 min, * A amostra é colocada sob agitação (com a tampa fechada) à - 50ºC e deixada para equilibrar em relação a temperatura As enzimas são adicionadas e a reação é continuada a 50ºC por 24 h (temperatura e tempo podem ser otimizados posteriormente) Sobrenadante é separado dos resíduos sólidos Sobrenadante é fervido para inativar atividade enzimática adi- cional Amostra é resíriada e armazenada para evitar a contaminação Testes: ' As seguintes modificações foram feitas no farelo de arroz (tabela . 27) . Tabela 27: Quantidade de farelo de arroz, o, tratado com diferentes enzimas Tr “Grames de amostra de enzima/10g de farelo — Taste Fo To Xilandsé GC220 Amilase actos 1 10 66,7 D,19 0.05 D,04 2 10 66,7 0,19 0,05 D,04 0,0003 Avaliaçãoda modificação do lipídeo usando testes de cozimento: Receita de cozimento: O desempenho no cozimento da farinha e da farinha com adição de farelo modificado foi avaliado em testes de cozimento em pequena escala (50 q de mistura e fatias de 10 g) usando a receita abaixo (tabela 28).

Tábela2Zs Receita usada para a avaliação do desempenho de diferentes composições de massa de farinha (+£- farelo solubilizado). Salaçúcar é uma mistura 1:1 (peso/peso) de sal e açúcar. A água é à água de absorção de- terminada pela análise Farinográfica, Ingredientes Mini escala ml ou g Farinha 50 Fermento seco 1 |

73MB ' Ingredientes Mini escala Sal/Agúcar 1,6 Água 400BU -2% s Fabricação da massa e cozimento A farinha e os ingredientes secos são misturados por um minuto, depois do que a água (ou água e farelo modificado) é adicionada e a mistu- ração é continuada por outros cinco minutos.

' Depois da misturação, quatro blocos de massa foram pesados, cada um contendo 10 gramas de farinha. Esses foram moldados em forma de pão usando um moldador manual. As fatias foram colocadas em assadei- ras e colocadas em um recipiente fechado (com uma tampa) e deixadas so- bre a mesa por 10 minutos. Depois disso, o pão é fermentado a 34ºC RH de E 10 85% por 45 minutos e finalmente assado a 230ºC por cinco minutos em um . forno Bago (Baágo-line, Fábora, Dinamarca), O pão foi resfriado por 20 minu- tos antes da avaliação (pesagem, medida do volume, avaliação do miolo, da , crosta e sensorial). Testes de cozimento 18 Os testes de cozimento abaixo foram realizados (tabela 29), Tabela 29. Estrutura experimental do teste de cozimento. ID refere-se à composição da massa de farinha, os números entre parênteses referem-se ao tratamento do farelo de acordo com a tabela 27. Farinha (9) é à quantída- de de farinha no pão, Extrato de Farelo (ral) é a quantidade de farelo solubi- Jlizado adicionado à farinha ao invés de água. Água (ml) é a quantidade de água adicionada a farinha. Gozimento D Farinha, q ão ã 2 Ernz. parede celular R Bran (1) 50 30 3 Enz ta RBran + 50 30 Resultados: Resultados do cozimento: |

TATO ' Como pode ser visto ná tabela 30 e na figura 6, a adição de fi- bras solúveis modificadas não teve um efeito negativo sobre o volume espe- " Cífico do pão, na realidade teve um efeito positivo em relação ao volume do - pão. Entretanto, a adição de fibras solúveis também modificadas com fosfo- lipase, gerando lipídeos funcionais, possui um efeito muito melhor sobre o volume do pão comparado com a adição apenas de fibras solúveis modifica- das, Tabela 30, Resultados do feste de cozimento. ID refere-se à composição da farinha, os números entre parênteses referem-se ao tratamento do farelo de acordo coma tabela 27, Farinha (9) é à quantidade de farinha no pão. Volu- me Espeécifico(ma/ml) é o volume específico absóluto dos pães. Volume rela- ' tivo versus controle (9%) é 5 volume relativo dos pães versus o pão 1 (contro- , le) | Quimera , a vemsemi - 1 Controle (trigo) 3,40 100 2 Enz. parede celular R Bran (1) 4,16 123 3 Enz. parede celular R Bran + 4 sm 154 Lipase (2) Os pães resultantes podem ser vistos na figura 8.

Como pode ser observado à partir dos resultados acima, um e- feito significativo foi obtido no desempenho no cozimento nesse experimento pela adição de farelo solúvel e lipídeos modificados obtidos pela combinação do tratamento prévio do farelo de arroz com enzimas que modificam a pare- de celular, amido e lipídeos.

Exemplo6 Modificação em escala laboratorial de farelo de trigo comercial e lipídeos de farelo de trigo usando diferentes lipases, sequide pela avaliação no cozimento.

Para avaliar adicionalmente os achados surpreendentes com re- lação à solubilização de farelo combinada com à modificação dos lipídeos do fareloforam testadas outras lipases diferentes da Fosfo-galacto lipase da Danisco, seguido pela avaliação dos lipídeos modificados gerados em testes de cozimento.

|

Frações de farelo de trigo obtidas de um moinho comercial foram SG usadas.

As frações consistiam em uma fração de farelo fino é uma fração de « farelo grosseiro.

Antes do uso, a fração de farelo grosseiro foi moida para obterumtamanho de partícula menor, o que aumentará a superfície especi- fica do farelo, aumentando eventualmente a eficiência da solubilização en- zimática do farelo, A moagem foi realizada em um moedor Retch para obter um tamantio médio de partícula de 500 um.

Entretanto, deve ser observado que um tamanho de partícula menor pode ser preferível, em relação ao grau desolubilização.

Enzimas; : Tabela31: Enzimas usadas para a modificação do farelo de trigo : Atividade Enzimática ID da Enzima | É — Xilanase bacteriana Danisco Xilanase (1223449, 4010866762) Celulase/glicanase Genencor GC220 Amilase Genencor, Spezyme Fred (4016101001) Fosfo-galacto lipase Grindamyl Powerbake 4070 Danisco Fosfo-galacto lipase Novozymes Lipopan F (lipopan F) Fosfo-galacto lipase DSM'S Panamore (Panaámore) Protocolo: Tabela 32. Protocolo usado para à modificação do farelo O farelo de trigo foi suspenso em NaPí 50 mM, pH 5 (13% pe- so/peso) em um recipiente/reator com tampa fechada A suspensão de farelo é aquecida a 100ºC sob agitação e fervi- da por 2 min.

A amostra é colocada sob agitação (com a tampa fechada) a 60ºCedeixada para equilibrar em relação à temperatura As enzimas são adicionadas e a reação é continuada a 50ºC por |

' 24 h (temperatura e tempo podem ser otimizados posteriormente) Sobrenadante é separado dos resíduos sólidos . Sobrenadante é fervido para inativar atividade enzimática adi- + cional Amostra é resfriada e armazenada para evitar a contaminação Testes: As seguintes modificações foram feitas no farelo (tabela 33) Tabela 33: Quantidade de farelo, 9, tratado com diferentes enzimas O &Gamasde amostra de enzima/10gdefarelo — Teste Faso Tampão Xilanase —GC220 Amilase — Fosfolipase : TT o 67 o oo GM 2 10 86,7 0,19 0,05 0,04 Í 3 10 66,7 019 0,05 0,04 Dántsco) 0,00013 i ES 10 86,7 019 0,05 0,04 (Lipopan P) 5 10 66,7 p19 0,05 D,04 (Paramos) Avaliação da modificação do lipídeo usando testes de cozimento: Receitade cozimento: O desempenho no cozimento da farinha e da farinha com adição de farelo modificado solubilizado (+/- lipídeos modificados) foi avaliado em — testes de cozimento em pequena escala (50 g de mistuía e fatias de 10 g) usando a receita abaixo (tabela 34).

Tabela34 Receita usada para a avaliação do desempenho no cozimento de farinha, farínha com adição de farelo solubilizado e farinha com adição de farelo solubilizado e lipídeos modificados. Sal/açúcar é uma mistura 1:1 (pe- so/peso) de sal e açúcar. A água é a água de absorção determinada pela análise Farinográfica.

Ingredientes Mini escala ml éu g Farinha 50 |

T7TB ] Ingredientes Mini escala ' Fermento seco 1 : Sal/Açúcar 1,6 : Água 400BU -2% Fabricação da massa e cozimento A farinha e os ingredientes secos são misturados por um minuto, depois do que a água ê adicionada é a misturação é continuada por outros cinco minutos.

Depois da misturação, quatro blocos de massa foram pesados, cada um conténdo 10 grámas de farinha, Esses foram moldados em forma de pão usando um moldador manual. As fatias foram colocadas em assadei- i ras e colocadas em um recipiente fechado (com uma tampa) e deixadas so- . bre a mesa por 10 minutos. Depois disso, o pão é fermentado a 34ºC RH de - 10 85% por 45 minutos e finalmente assado a 230ºC por cinco minutos em um forno Bago (Bago-line, Fáborg, Dinamarca). O pão foi resfriado por 20 minu- ] tos antes da avaliação (pesagem, medida do volume, avaliação do miolo, da crosta e sensorial). Testes de cozimento Os testes de cozimento abaixo foram realizados (tabela 35). Tabela 35, Estrutura experimental do teste de cozimento. ID refere-se à composição da massa de farínha, 68 números entre parênteses referem-se ao tratamento do farelo de acordo com a fabela 33. Farintia (9) é a quantida- de de farinha no pão. Extrato de Farelo (ml) é a quantidade de farelo solubi- lizado adicionado a farinha ao ínvés de água. Água (m)) é a quantidade de água adicionada a farinha. GCozimento ID Farinha, g FS = Água, ml 2 Enz, parede celular R Brán (1) so 30 3 Enz. parede Belular R Bran + 50 o Danisco (2) n + 4 Emz aan Bra so 30 |

Cozimento ID Farinha, g farelo, ml Água, ml . 5 Enz, parede celular R Bran + ão ao Panamore (4) : Resultados: sultados do cozimento: Como pode ser visto na tabela 36 e na figura 9, a adição de fi- bras solúveis teve pouco ou nenhum efeito sobre o volume específico do & pão Entretanto, a combinação da solubilização do farelo com fosfolipase, teve um efeito significativo sobre o volume do pão; todo o pão assado com farelo tratado com as lipases em combinação com às enzimas que modifi- » cam à parede celular e o amido, teve um aumento de volume comparado com a farinha do controle.

Ú 10 Tabela36 Resultados do teste de cozimento. 1D refere-se à composição da , massa de farinha, os números entre parênteses referem-se ao tratamento do farelo de acordo com à tabela 33. Farinha (9) é a quantidade de farinha no pão.

Volume Especíifico(mgiml) é o volume específico absoluto dos pães.

Vol 1êl versus controle (%) é 6 volume rélativo dos pães versus o pão 1 (contro- Je) Cozimento o Volume Especi- Volume rel ver- fico, mg sus controle 1 Controle (trigo) 3,40 100 2 Enz. parede celular W Bran (1) 3,33 E 3 Eriz. parede celular W Bran + 3,38 114 Danisco (2) Enz. parede celular R Bran + 4 b 13 Lipopan F (3) 254 1 Enz. parede celular R Bran + 301 us Panamore (4) Os pães resultantes podem ser vistos na figura 9. Como pode ser observado a partir dos resultados acima no ex- perimento 6, um efeito significativo foi obtido no desempenho nó cozimento Nesse experimento pela combinação do tratamento do farelo com enzimas quemodificam a parede celular, amido e lipídeos.

Claims (15)

: REIVINDICAÇÕES

1. Método para o tratamento de um material de planta que . contém lipídeo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de tratar uma suspensão líquida de um material de planta pelo menos parcialmente —solubilizado que contém lipídeo com uma ou mais enzimas que modificam lipídeo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a suspensão líquida de um material de planta pelo menos parcialmente solubilizado que contém lipídeo é essencialmente livre de amido.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que menos do que cerca de 50%, tal como menos do que cerca de 40%, tal como menos do que cerca de 30%, tal como menos do que cerca de 20%, tal como menos do que cerca de 10%, tal como menos do que cerca de 6%, tal como menos do que cerca de 3%, tal como menos do que cerca de 1% (peso/peso) da suspensão líquida de um material de planta pelo menos parcialmente solubilizado que contém lipídeo é amido ou componentes que contêm amido, ta! como farinha.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma etapa precedente ou simultânea de tratar uma suspensão líquida de material de planta que contém lipídeo para obter o dito material de planta pelo menos parcialmente solubilizado, em que o dito tratamento para obter um material de planta pelo menos parcialmente solubilizado é um tratamento com uma ou mais enzimas que modificam a parede celular selecionada do grupo que consiste em xilanase e uma celulase, tal como celobio-hidrolases, endoglicanases e beta- glicanase.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas que modificam lipídeo é selecionada do grupo que consiste em: uma triacilglicero! lipase, uma fosfolipase e uma galactolipase.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a á 5, caracterizado pelo fato de que o dito material de planta é um farelo de cereal. :

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito farelo de cereal é obtido a partir de um processo de — moagem industrial e adicionalmente moído para obter um tamanho médio de partícula abaixo de 500 um, tal como abaixo de 400 um, tal como abaixo de 200 pum.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito material de planta é um produto colateral do processamento de material de planta, tal como pasta de neutralização do refinamento de óleos vegetais, grãos usados para fermentação ou grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS).

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição obtida que compreende lipídeos modificados, tais como lipídeos funcionais, é tratada adicionalmente para inativar atividade adicional de enzima.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o grau de solubilização do dito material de planta como determinado na matéria seca versus a matéria seca de material de planta obtido, é maior do que 15%, tal como maior do que 25%, tal como maior do que 35%, tal como maior do que 40%, tal como maior do que 50%, tal como na faixa entre 40% a 60%, tal como na faixa entre 50% a 60%.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o conteúdo total de lipídeos e lipídeos modificados, tais como lipídeos funcionais, como determinado na matéria seca versus a matéria seca de material de planta na fração solúvel obtida é pelo menos cerca de 0,05%, tal como pelo menos cerca de 1,0%, tal como na faixa de 0,05 a 5%.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito tratamento com uma ou mais enzimas que modificam lipídeos converte mais do que 5%, tal como mais do que 10%, tal como mais do que 25%, tal como mais do que 50% de

Ê fosfatidilinositol em lisofosfatidilinosito! (liso-PI).

13. Composição, caracterizada pelo fato de ser produzida por io um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Uso de uma composição como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ser na produção de um produto alimentício ou na produção de bioetanol.

15. Produto alimentício, caracterizado pelo fato de ser obtido por um uso, como definido na reivindicação 14.