BRPI1006879B1

BRPI1006879B1 - Composição compreendendo ácido fúlvico derivado de uma fonte de carboidrato (CHD-FA) e um composto antifúngico, e, uso de uma combinação

Info

Publication number: BRPI1006879B1
Application number: BRPI1006879-1A
Authority: BR
Inventors: Peter Warn; Stephen William Leivers
Original assignee: Natracine Uk Limited
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2010-01-18
Publication date: 2019-04-02
Also published as: EP2387398B1; CN102724977A; GB0900786D0; EP2387398A1; US20120035125A1; WO2010082182A1; BRPI1006879A2; CN102724977B; ZA201105919B; RU2535037C2; RU2011134414A

Abstract

composição compreendendo ácido fúlvico derivado de uma fonte de carboidrato (chd-fa) e um composto antifúngico, e, uso de uma combinação descreve-se uma combinação de ácido fúlvico 5 ou um sal, éster, ou derivado do mesmo e um composto antifúngico selecionado dentre fluconazol e anfotericina b para uso no tratamento ou profilaxia de uma doença ou condição do corpo humano ou animal. o ácido fúlvico pode ser chd-fa.

Description

“COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO ÁCIDO FÚLVICO DERIVADO DE UMA FONTE DE CARBOIDRATO (CHD-FA) E UM COMPOSTO ANTIFÚNGICO, E, USO DE UMA COMBINAÇÃO”

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a ácido fúlvico em combinação com um ou mais compostos antifúngicos para uso no tratamento terapêutico ou profilaxia de várias condições no corpo humano ou animal.

Ácido fúlvico é uma das substâncias formadas durante a degradação de matéria orgânica no ambiente. Ele é solúvel em água sob todas as condições de pH e tem geralmente menor peso molecular e peso e menor intensidade de cor do que ácidos húmicos também produzidos durante o processo de degradação.

Embora o ácido fúlvico ocorra naturalmente em baixos níveis no solo e água ele é difícil de isolar. um processo conhecido para proporcionar ácido fúlvico para uso em aplicações medicinais é por meio de uma oxidação a úmido controlada de carvão betuminoso conforme descrito na Patente dos Estados Unidos n° 4.912.256. O uso de referido ácido fúlvico para o tratamento de inflamação, acne, eczema, infecções bacterianas, fúngicas e virais foi revelado previamente na Publicação de Patente Internacional WO00/19999. Adicionalmente, as Patentes dos Estados Unidos nums. 4.999.202 e 5.204.368 revelam composições contendo ácido fúlvico, sal ou um derivado do mesmo, que apresentam propriedades bacteriostáticas ou bactericidas, e são úteis como desinfetantes.

Ácidos fúlvicos derivados de carvão contêm altas concentrações de metais pesados, como alumínio, mercúrio, cádmio, cromo e chumbo que precisam ser evitados em preparações farmacêuticas. Uma composição de ácido fúlvico derivada de uma fonte de carboidrato (CHD-FA, earbohydrate derived fulvie aeid) por meio de oxidação a úmido foi revelada previamente na Publicação de Patente Internacional WO2007/125492. Este

Petição 870180144564, de 25/10/2018, pág. 8/11

CHD-FA é particularmente útil para aplicação farmacêutica pelo fato de que apresenta um baixo teor de metais pesados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com uma primeira concretização da invenção, proporciona-se uma combinação de ácido fúlvico ou um sal, éster, ou derivado do mesmo e um composto antifungico selecionado dentre fluconazol e anfotericina B.

O ácido fúlvico, sal, éster ou derivado do mesmo pode apresentar qualquer pH, de ácido a básico. Por exemplo, o pH do ácido fúlvico pode ser elevado convertendo-se o ácido a um sal, como sal de sódio ou potássio. Isto pode ser obtido adicionando-se um hidróxido adequado ao ácido fúlvico. Tipicamente, o ácido fúlvico encontra-se em forma de um ácido ou de um sal.

De preferência, o ácido fúlvico é derivado de carboidrato (CHD-FA) produzido por meio do método descrito no WO 2007/125492. Em particular, o CHD-FA may ser derivado de um sacarídeo. Tipicamente, o CHD-FA possui um peso molecular que não excede 20.000 Daltons e um baixo teor dos elementos alumínio, mercúrio, cádmio, e cromo. O CHD-FA é fabricado submetendo-se um carboidrato a oxidação a úmido e, depois, tratando-se o produto de reação obtido para remover substancialmente todos os componentes ácidos com um peso molecular que não excede 20.000 Daltons.

O Fluconazol é um agente antifungico conhecido e é descrito como, por exemplo, Item 4122 do Merck Index, 14^a Ed. O fluconazol pode ser administrado em forma de um éster e compreende-se que o termo fluconazol como usado aqui e nas reivindicações inclui ésteres e outras formas farmacêuticas adequadas de fluconazol.

A anfotericina B também é um agente antifúngico conhecido e é descrita como, por exemplo, Item 585 do Merck Index, 14^a Ed.

Verificou-se que uma combinação de ácido fúlvico e fluconazol é efetiva quando administrada contra fungos resistentes ao fluconazol. Em particular, a combinação de ácido fulvico e fluconazol é efetiva quando administrada contra espécies de Candida resistentes ao fluconazol.

Verificou-se que a anfotericina B é efetiva numa dose nãotóxica menor quando administrada contra espécies fungicas em combinação com ácido fulvico.

Em uma forma da invenção a combinação compreende de cerca de 10 ml/kg de uma solução de cerca de 0,25 % a cerca de 1 % de ácido fulvico ou um sal, éster ou derivado do mesmo e cerca de 10 mg/kg de fluconazol.

A anfotericina B pode estar presente na combinação numa dose efetiva que é não-tóxica para o sujeito. Mais particularmente, a combinação compreende cerca de 0,25 % de ácido fulvico e de cerca de 0,06 mg/1 a cerca de 0,5 mg/1 de anfotericina B.

De acordo com uma concretização adicional da invenção proporciona-se uma composição farmacêutica compreendendo a combinação como descrita acima como os ingredientes ativos.

A composição farmacêutica pode encontrar-se em uma forma adequada para administração oral, ou administração tópica ou qualquer outra forma de administração. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada em um líquido, tablete, cápsula ou análogo ou em um creme, ou unguento.

De acordo com um aspecto adicional da invenção proporcionase uma combinação ou composição farmacêutica como descrito acima para uso em um método de tratamento ou profilaxia de uma doença ou condição do corpo humano ou animal. O método pode compreender oral, tópica ou qualquer outra forma adequada de administração.

O humano ou animal a ser tratado pode ser imunossuprimido ou imunocomprometido.

A doença ou condição pode ser causada por um fungo resistente à droga.

A doença ou condição pode ser causada por leveduras. De preferência, a doença ou condição é causada por Candida spp.

A doença ou condição pode ser causada por Aspergillus spp ou Zygomycetes.

De acordo com um aspecto adicional da invenção proporcionase o uso da combinação descrita acima na fabricação de uma composição farmacêutica para tratamento ou profilaxia de uma doença ou condição do corpo humano ou animal.

A composição farmacêutica pode ser em uma forma adequada para administração oral, ou administração tópica ou qualquer outra forma adequada de administração. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada em um líquido, tablete, cápsula ou análogo ou em um creme, ou unguento.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 mostra carga no tecido do rim após infecção por Candida albicans em camundongos tratados com diferentes concentrações de CHD-FA sozinho ou em combinação com fluconazol.

Descrição detalhada da invenção

Resistência a droga é um problema importante para o tratamento de doenças e condições causadas por agentes fungicos, como ocorreu com o uso de fluconazol para o tratamento de infecção por Candida e o uso de anfotericina B no tratamento de Aspergillus. Em particular, o uso de anfotericina B no tratamento de infecções por Aspergillus não é mais efetivo, porque a dose requerida para inibir Aspergillus é tóxica para o sujeito (3 mg/1).

Adicionalmente, as infecções fúngicas oportunistas que ocorrem em pacientes imunocomprometidos, ou imunossuprimidos são difíceis de controlar com agentes antifungicos. Necessita-se, portanto, de uma estratégia de tratamento para estes pacientes, em particular pacientes de câncer que estão recebendo drogas anticâncer e outros pacientes que estão tomando quaisquer drogas que causam imunossupressão.

Realizou-se três estudos para avaliar as características antifúngicas do ácido fúlvico contra organismos específicos. O ácido fúlvico usado nestes estudos foi aquele descrito e produzido por meio do método descrito no WO 2007/125492 e é referido a seguir como CHD-FA. Em resumo, o ácido fulvico foi derivado de um carboidrato, em particular um sacarídeo. O CHD-FA possui um peso molecular que não excede 20.000 Daltons e um baixo teor, i.e. inferior a 30 ppm, de elementos, como alumínio, mercúrio, cádmio, cromo, chumbo, prata, arsênico e berílio. O CHD-FA foi fabricado submetendo-se o carboidrato a oxidação a úmido e, então, tratandose o produto de reação obtido para remover substancialmente todos os componentes ácidos com um peso molecular que excede 20.000 Daltons.

No primeiro estudo determinou-se cargas renais de Candida albicans como uma indicação da eficácia de concentrações crescentes de CHD-FA sozinho ou em combinação com o composto antifúngico, fluconazol. Resultados mostraram que o ácido fúlvico aumenta significativamente a atividade do fluconazol contra Candida albicans.

No segundo estudo determinou-se a eficácia do ácido fúlvico sozinho ou em combinação com o composto antifúngico anfotericina B contra Aspergillus ou zygomycetes, por meio de contagens quantitativas de colônias em placas de cultura de tecidos.

No terceiro estudo determinou-se a eficácia do fluconazol em combinação com ácido fulvico contra cepas resistentes a droga de Candida spp por meio de contagens quantitativas de colônias em placas de cultura de tecidos.

Todas as soluções são apresentadas como percentuais de peso por volume.

Os exemplos a seguir são apenas para fins de ilustração e não devem ser interpretados como limitando de qualquer forma a invenção.

Exemplo 1 - Eficácia in vivo de CHD-FA contra Candida

1.1. PROPRIEDADES FÍSICAS DE NOVOS AGENTES MODULADORA DA RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICO TAMBÉM CONHECIDO ÁCIDO FÚLVICO DERIVADO DE CARBOIDRATO (CHD-FA)

CHD-FA foi reconstituído como uma solução a 4 %. A solução foi armazenada à temperatura ambiente no escuro desde a entrega. A solução a 4 % de CHD-FA foi uma solução viscosa ligeiramente castanha/amarela com um forte odor e um pH de 2,1 a 25°C.

1.2. MÉTODOS

1.2.1 Questões regulatórias

Todos os experimentos animais foram realizados sob a licença UK Home Office Licence 40/3101 Invasive Fungai Diseases (detentor da licença, Dr Peter Wam) e com liberação do comitê ético local. Todos os experimentos serão realizados por técnicos que completaram as partes 1, 2 e 3 do curso Home Office Personal License e possuem uma licença pessoal corrente. Todos os experimentos foram realizados em instalações dedicadas de risco biológico 2 no interior da Unidade de serviços biológicos da Universidade de Manchester (este sítio detém um Certificado de Designação).

1.2.2 Modelo animal

Camundongos usados neste estudo, camundongos CD1 machos (uma cepa hibridada que é muito similar a camundongos Swiss) foram fornecidos pela Charles River (Margate UK) e eram livres de patógenos específicos (16-18 g na entrega). Todos os camundongos pesaram 20-22 g no momento da imunossupressão.

Camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individuais (IVCs, individual ventilated cages) que são fornecidas com ar filtrado com HEPA. Material para ninho constituído de cavacos de álamo estéreis em caixas pré-autoclavadas. Fomeceu-se água estéril à vontade usando-se bolsas descartáveis. Fomeceu-se ração padrão de camundongo à vontade (o alimento foi umedecido em papa se camundongos demonstrassem sinais de sepse).

Camundongos experimentaram um ciclo de luz/escuridão de 12 horas a 22±1°C, 55-60 % de umidade relativa e ruído de fundo <60 db.

Animais foram tratados usando, ou monojatos de 'insulina' descartáveis 30G (para administrações iv ou ip) ou agulhas de gavagem reutilizáveis 19G.

Todos os animais foram imunossuprimidos com uma dose única de 200 mg/kg de ciclofosfamida (Pharmacia) intraperitonealmente (ip) 3 dias antes da infecção. Isto resulta em um estado profundo de neutropenia que dura 3-4 dias após a infecção.

1.2.3 Duração do experimento

O experimento foi continuado até 53 horas após a infecção.

1.2.4 Tamanho do grupo de animais

Para o estudo de combinação, animais foram tratados em grupos de 4 camundongos por grupo de tratamento.

1.2.5 Infecção

Camundongos foram infectados com 0,2 ml de uma suspensão de FA7070 em PBS + 0,05 % de tween 80 contendo 1,5 x 10⁵ de blastoconidia/ml i.e. 3,0 x 10⁴ leveduras por camundongo. Após a infecção todos os camundongos foram observados pelo menos 4 vezes ao dia. Animais excedendo a banda de severidade do experimento foram eutanizados de forma humana.

1.2.6 Tratamento antifúngico

Camundongos foram tratados 5 horas após a infecção com:

a) 0,125 ml de 2 % de CHD-FA administrado por meio de gavagem (presumindo-se que os camundongos pesam 25 g no momento do tratamento). CHD-FA foi administrado duas vezes ao dia (total de 6 doses administradas).

b) 0,125 ml de 0,5 % de CHD-FA administrado por meio de gavagem (presumindo-se que os camundongos pesam 25 g no momento do tratamento). CHD-FA foi administrado duas vezes ao dia (total de 6 doses administradas).

c) 10 mg/kg de fluconazol administrado intravenosamente em 5 % glicose (em 0,25 ml)

d) Terapia de combinação de 0,125 ml de 2 % de CHD-FA administrado duas vezes ao dia oralmente e 10 mg/kg de fluconazol administrado intravenosamente em 5 % de glicose.

e) Terapia de combinação de 0,125 ml de 0,5 % de CHD-FA administrado duas vezes ao dia oralmente e 10 mg/kg de fluconazol administrado intravenosamente em 5 % de glicose.

f) 0,5 mg/kg de anfotericina B (diluído em 5 % de glicose) administrada intraperitonealmente.

g) Camundongos tratados com veículo receberão 0,125 ml de solução salina a 0,9 % por meio de gavagem administrada duas vezes ao dia e 0,25 ml de glicose a 5 % administrada intravenosamente.

1.2.7 Fim do experimento animal

Horas após a infecção todos os animais foram eutanizados usando-se um procedimento de programas de dosagem 1. Todos os animais foram pesados; rins foram removidos imediatamente e homogeneizados em solução salina tamponada com fosfato estéril gelada. Homogeneizados de rim foram cultivados quantitativamente sobre agar Sabouraud Dextrose e incubados a 37°C durante até 4 dias e as colônias foram contadas.

1.2.8 Análise estatística

Os dados das cargas de cultura foram analisados por meio do teste de Kruskal-Wallis usando Stats Direct.

1.3 Resultados

1.3.1 Cargas renais

Um sumário das cargas renais encontra-se detalhado na Figura

1.

Neste estudo não houve efeitos secundários observados após tratamento com CHD-FA e o estudo foi terminado 53 horas após a infecção devido à infecção severa no grupo tratado com veículo.

1.3.2. Análise estatística

Tabela 1; Kruskal-Wallis: todas as comparações aos pares (Conover15 Inman)

	Solução salina	0,25 % de CHD-FA	1 % de CHD-FA	10 mg/kg Fluconazo 1	0,25 % de CHD-FA+ 10 mg/kg fluconazol	1 % de CHDFA+10 mg/kg fluconazol	0,5 mg/kg Anfotericina
Solução salina		NS (0,06)	0,028	<0,0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001
0,25 %CHD-FA			NS(0,67)	0,0026	<0,0001	<0,0002	<0,0001
1 % de CHD-FA				0,007	<0,0001	0,006	<0,0001
10 mg/kg fluconazol					0,044	NS(0,19)	0,004
0,25 % de CHD-FA + 10 mg/kg fluconazol						NS(0,51)	NS (0,29)
1 % de CHD-FA + 10 mg/kg fluconazol							NS (0,11)
0,5mg/kg Anfotericin a

NS = não significante

1.4 SUMÁRIO

Experimentos foram estabelecidos usando-se gavagens de

0,125 ml de 2 % e 0,5 % de CHD-FA duas vezes ao dia (equivalente a 1 % e 0,25 % de CHD-FA administrado a 10 ml/kg).

• 5 ml/kg de 2 % ou 0,5 % de CHD-FA (equivalente a 10 ml/kg a 1 % e 0,25 % de CHD-FA) foram bem tolerados em camundongos.

• 5 ml/kg de 2 % ou 0,5 % de CHD-FA (equivalente a 10 ml/kg a 1 % e 0,25 % de CHD-FA) foram efetivos na redução da carga renal em camundongos infectados com Candida albicans. A carga após o tratamento foi significativamente menor do que em camundongos tratados com veículo (~0,6 loglO ufc[unidades formadoras de colônias]/grama de redução) • 5 ml/kg de 2 % ou 0,5 % de CHD-FA (equivalente a 10 ml/kg a 1 % e 0,25 % de CHD-FA) foi aditivo quando usado em combinação com fluconazol. A redução combinada da carga renal foi significativamente superior a qualquer tratamento usado como monoterapia.

Exemplo 2 - Eficácia in vitro de CHD-FA contra Aspergillus e Zygomycetes

2.1 PROPRIEDADES FÍSICAS DO CHD-FA TAMBÉM CONHECIDO COMO ÁCIDO FÚLVICO

CHD-FA foi reconstituído como uma solução a 4 %. As soluções foram armazenadas à temperatura ambiente no escuro desde a entrega. A solução de CHD-FA a 4 % foi uma solução viscosa ligeiramente castanha/amarela com um odor forte e um pH de 2,1 a 25°C.

2.2 MÉTODOS - EXPERIMENTO PRELIMINAR

2.2.1 Isolados fungicos

Realizou-se testes de suscetibilidade nos isolados a seguir que são, todos, cepas isoladas de casos de doença clínica humana.

(i) 2 x Aspergillus fumigatus.

(ii) 2 x Aspergillus terreus - estas cepas são moderadamente resistentes in vitro e resistentes in vivo à anfotericina B que é tipicamente de A. terreus cepas.

(iii) 2 x Aspergillus flavus - estas cepas são de suscetibilidade intermediária in vitro e respondem de maneira deficiente in vivo à anfotericina B (1 cepa).

(iv) 2 x Aspergillus flavus - estas cepas são de suscetibilidade intermediária in vitro e respondem de maneira deficiente in vivo à anfotericina B (1 cepa).

(v) 2 x Absidia corymbifera - estas cepas são suscetível in vitro mas respondem mui fracamente in vivo à anfotericina B.

(vi) 2 x Fusarium solani - estas cepas são altamente resistentes in vitro e não respondem in vivo baseado à anfotericina B.

Cada cultura foi desenvolvida em agar Sabouraud a 37°C durante 10 dias para assegurar a pureza e permitir que esporos maturassem.

2.2.2 Meio

RPMI-1640 (Sigma, Dorset, UK) suplementada a 2 % de glicose (Sigma), tamponada com ácido morfolinopropanossulfônico (MOPS), (Sigma) e ajustado em pH 7,0 foi usado como recomendado no documento M38A do Clinicai Laboratory Standards (método de referência para testagem de suscetibilidade antifungica de diluição de caldo de fungos filamentosos formadores de conídio. Padrão aprovado, documento M38-A 2002a. NCCLS, Wayne, PA . 2002, NCCLS, Wayne, PA, E.U.A.).

2.2.3 Preparação do inóculo

a) Todos os fungos foram cultivados ao ar ambiente a 35-37°C em meio de recuperação (agar dextrose Sabouraud) durante 8-10 dias antes da testagem.

b) Suspensões de inóculo foram preparadas de culturas do dia 8 ao 10 dia desenvolvidas em agar dextrose Sabouraud a 37°C em frascos de cultura de tecidos ventilados para evitar exame cruzada. Esporos foram colhidos por meio de inundação da superfície de desenvolvimento com 25 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril acrescido de 0,05 % de Tween 80. A contagem de esporos foi ajustada usando uma câmara de contagem.

c) O inóculo foi suspenso completamente por meio de agitação vigorosa em um misturador de vórtex durante 15s. A densidade final de esporos nos testes de MIC [n.t.: concentração inibidora mínima (Minimum Inhibitory Concentration)\ foi entre 0,5 x 104 e 5 x 104 CFU/ml como demonstrado por contagens quantitativas de colônias. Incluiu-se controles isentos de drogas e isentos de células. (O meio RPMI usado nas placas foi preparado a 2 x ou 4 x a concentração final para permitir diluição uma vez que se adicionou o inóculo e CHD-FA diluído).

2.2.4 Condições de ensaio

Usou-se placas de microtitulação plásticas, estéreis, descartáveis com 96 poços de fundo plano.

Etapa 1 Adição de anfotericina B (solução de carga preparada em 100 % de DMSO)

a) Coluna 1 da bandeja de microtitulação foi enchida com 100 μΐ de água estéril contendo quatro vezes a concentração final de droga (16 mg/1 de anfotericina B).

b) Colunas 2-12 foram enchidas com 50 μΐ de água destilada

c) Retirou-se quantidades de 50 μΐ dos poços na coluna 1 e estas foram diluídas duas vezes por meio de transferência das mesmas para a coluna 2 com uma pipeta de multicanais (coeficiente de variação de ± 2 %). Removeu-se então amostras de 50 μΐ da coluna 2 e transferidas para a coluna 3, etc até a coluna 10. Os últimos 50 μΐ de droga diluída são então descartados. Assim, cada poço nas colunas 1-10 conterá 50 μΐ de água contendo quatro vezes as concentrações finais de droga antifungica.

ETAPA 2 Adição de CHD-FA

Soluções de carga de CHD-FA foram produzidas contendo 4 %, 2 %, 1 %, 0,5 % e 0,25 % do composto nativo.

100 μΐ do CHD-FA diluído foram adicionados em bandejas de microtitulação de forma que a linha A contém uma diluição final de 2 % linha B, 1 %, linha C 0,5 %, linha D 0,25 % linha E 0,125 % e linha F diluente apenas.

ETAPA 3 Adição de cepas de Aspergillus ou Zygomycetes μΐ da suspensão diluída de esporos em 4 x RPMI foram adicionados em todos os poços. Isto produz um poço contendo um volume final de 200 μΐ (constituído de 50 μΐ de antifungico diluído, 100 μΐ de CHDFA diluído ou diluente, 50 μΐ de 4 X RPMI contendo esporos fungicos) ETAPA 4 Incubação de placas

Todas as placas foram incubadas a 37°C ao ar em um incubador escurecido.

Etapa 5 Leitura das placas

Placas foram lidas visualmente com o ponto de viragem tomado como a menor concentração de droga que inibiu o crescimento em 50 % em comparação com aquela do controle livre de droga.

2.3. RESULTADOS - Experimento Preliminar

2.3.1 MICs contra CHD-FA e Anfotericina B

MICs contra os agentes individuais demonstraram que CHDFA a 4 %, 2 % e 1 % inibiu o crescimento de Aspergillus e Zygomycetes durante pelo menos 24 horas. Os valores de MIC para CHD-FA e Anfotericina B encontram-se detalhados na Tabela 2.

Tabela 2: Eficácia de CHD-FA contra Aspergillus e zygomycetes

Espécie de isolado	Número de isolados	MIC (%) CHD-FA	Anfotericina MIC (mg/1)
A. fumigatus	1	0,5	0,5
A. fumigatus	2	0,5	0,25
A. terreus	1	0,5	0,5
A. terreus	2	0,5	L0
A. flavus	1	0,5	4,0
A. flavus	2	0,25	0,5
Absidia	1	0,25	0,25
Absidia	2	0,25	0,06
Fusarium	1	0,25	2,0
Fusarium	2	0,25	2,0

3.3.2 MICs contra a combinação de CHD-FA e Anfotericina B

MICs contra a combinação de CHD-FA e anfotericina B são mostrados na Tabela 3. Deve-se observar que nenhuma das combinações foi antagonística, mas a combinação foi altamente efetiva contra uma cepa de 5 Aspergillus fumigatus que é resistente in vitro e in vivo à anfotericina B.

Tabela 3: Eficácia da combinação de CHD-FA e anfotericina B contra

Aspergillus

Espécie de isolado	Diluição de CHD-FA	MIC CHD-FA	Anfotericina MIC	Combinação MIC	Efeito
A. fumigates cepa 1	0,5 0,25 0,125	sem crescimento sem crescimento crescimento	sem crescimento sem crescimento 0,06	sem crescimento sem crescimento <0,06	sinergia possível
A.fumigates cepa 2	0,5 0,25 0,125	sem crescimento sem crescimento crescimento	sem crescimento sem crescimento 0,125	sem crescimento sem crescimento 0,125	nem sinergia nem antagonismo
A. terreus cepa 1	0,5 0,25 0,125	sem crescimento sem crescimento crescimento	sem crescimento sem crescimento 0,25	sem crescimento sem crescimento 0,25	nem sinergia nem antagonismo
A. terreus cepa 2	0,5 0,25 0,125	sem crescimento sem crescimento crescimento	sem crescimento sem crescimento 0,125	sem crescimento sem crescimento 0,125	nem sinergia nem antagonismo
A. flavus cepa 1	0,5 0,25 0,125	sem crescimento sem crescimento crescimento	sem crescimento sem crescimento >4,0	sem crescimento sem crescimento <0,06	combinação reduziu MIC de resistente a altamente suscetível
A. flavus cepa 2	0,5 0,25 0,125	sem crescimento sem crescimento crescimento	sem crescimento sem crescimento 0,25	sem crescimento sem crescimento 0,5	nem sinergia nem antagonismo

2.4. SUMÁRIO • CHD-FA não demonstra atividade antagonista quando usado 10 em combinação com anfotericina B Aspergillus spp.

• A combinação de 0,25 % de CHD-FA com anfotericina B (0,06 - 0,5 mg/1) inibe o crescimento de todos os isolados de Aspergillus testados independentemente da MIC da anfotericina B dos isolados.

EXEMPLO 3 - Eficácia in vitro de uma combinação de fluconazol e 15 CHD-FA contra Candida spp.

3.1 PROPRIEDADES FÍSICAS DE CHD-FA TAMBÉM CONHECIDO COMO ÁCIDO FÚLVICO

CHD-FA foi reconstituído como uma solução a 4 %. As soluções foram armazenadas à temperatura ambiente no escuro desde a entrega. A solução de CHD-FA a 4 % foi uma solução viscosa ligeiramente castanha/amarela com um forte odor e um pH de 2,1 a 25°C.

3.2 MÉTODOS - Experimento preliminar

3.2.1 Isolados fungicos

Testes de suscetibilidade foram realizados em 5 isolados de Candida albicansf,] todos isolados clínicos (todos com reduzida suscetibilidade ao fluconazol). Cada cultura foi desenvolvida sobre agar Sabouraud a 37°C durante 48 h para assegurar a pureza.

3.2.2 Meio

RPMI-1640 (Sigma, Dorset, UK) suplementado a 2 % de glicose (Sigma), tamponado com ácido morfolinopropanossulfônico (MOPS, morpholinosulfonic acid), (Sigma) e ajustado em pH 7,0 foi usado como recomendado no Comitê Europeu sobre Testagem de Suscetibilidade Antimicrobiana \European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing] (E.Dis. 7,1) (Rodriguez-Tudela, J. L., F. Barchiesi, J. Bille, E. Chryssanthou, M. Cuenca-Estrella, D. Denning, J. P. Donnelly, B. Dupont, W. Fegeler, C. Moore, M. Richardson, P. E. Verweij, e o Subcomitê sobre Testagem de Suscetibilidade Antifungica [Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing] (AFST) do Comitê Europeu para Testagem de Suscetibilidade Antimicrobiana ESCMID [European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing] (EUCAST) 2003. Método para a determinação da concentração inibidora mínima (MIC, minimum inhibitory concentratiori) via diluição de caldo de leveduras fermentativas. Clinicai Microbiology and Infection 9:1-VIII.)

3.2.3 Preparação do inóculo

a) Todas as leveduras foram cultivadas ao ar ambiente a 3537°C sobre meio de recuperação (agar dextrose Sabouraud) durante 18-24 h antes da testagem.

b) O inóculo foi preparado removendo-se cinco colônias distintas de culturas de 18 a 24 h e suspendendo-se as mesmas em 5 ml de água destilada estéril.

c) O inóculo foi completamente suspenso por meio de agitação vigorosa em um misturador de vórtice durante 15 s. A densidade de células foi ajustada à densidade de um padrão McFarland 0,5 por meio de adição de água destilada estéril e medindo-se a absorbância em um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 530 nm. Isto deu uma suspensão de levedura de 1-5 x 10⁶ufc/ml. Preparou-se uma suspensão de trabalho via uma diluição adicional de 1 em 10 adicionalmente em 4 X RPMI dando 1-5 x 10⁵ufc/ml (O meio RPMI usado nas placas foi preparado a 4 x a concentração final para permitir uma diluição de 75 % uma vez que o se adicionou inóculo e CHDFA diluído).

3.2.4 Condições de ensaio

Usou-se placas de microtitulação plásticas, estéreis, descartáveis com 96 poços planos.

ETAPA 1 Adição de fluconazol

a) Coluna 1 da bandeja de microtitulação foi enchida com 100 μΐ de água estéril contendo quatro vezes a concentração final da droga (512 mg/1 fluconazol).

b) Colunas 2-12 foram enchidas com 50 μΐ de água destilada

c) Quantidades de 50 μΐ foram retiradas de poços na coluna e diluídas duas vezes por meio de transferência das mesmas para a coluna 2 com uma pipeta de multi-canais (coeficiente de variação de ± 2 %). Amostras de 50 μΐ foram então removidas da coluna 2 e transferidas para a coluna 3, etc até a coluna 10. Os últimos 50 μΐ da droga diluída são então descartados. Assim, cada poço nas colunas 1-10 conterá 50 μΐ de água contendo quatro vezes as concentrações finais da droga antifúngica.

ETAPA 2 Adição de CHD-FA

Soluções de carga de CHD-FA foram produzidas contendo 4 %, 2 %, 1 %, 0,5 % e 0,25 % do composto nativo. 100 μΐ do CHD-FA diluído foram adicionados em bandejas de microtitulação de forma que a linha A contém uma diluição final de 2 % linha B, 1 %, linha C 0,5 %, linha D 0,25 % linha E 0,125 % e linha F diluente apenas.

ETAPA 3 Adição de Candida albicans μΐ da suspensão diluída de Candida albicans em 4 x RPMI foram adicionados em todas as células. Isto produz um poço contendo 200 μΐ de volume final (constituído de 50 μΐ de fluconazol diluído, 100 μΐ de CHDFA diluído ou diluente, 50 μΐ de 4 X RPMI contendo Candida albicans) ETAPA 4 Incubação de placas

Todas as placas foram incubadas a 37°C ao ar em um incubador escurecido.

ETAPA 5 Leitura das placas

Placas foram lidas visualmente com o ponto de viragem considerado como a menor concentração de droga que inibiu o crescimento em 50 % relativamente ao controle livre de droga.

3.3.1 RESULTADOS - Experimentos preliminares

Testes iniciais demonstraram que CHD-FA a 4 %, 2 % e 1 % inibiu o crescimento de Candida albicans durante pelo menos 24 horas quando combinado com 1 X meio de cultura RPMI 1640, crescimento em 0,5 % de CHD-FA ocorre em níveis similares aos controles com solvente. A inibição do crescimento (4 %, 2 % e 1 %) deveu-se possivelmente ao pH fortemente ácido. No pH nativo de CHD-FA (pH 2,1) não foi possível detectar sinergia ou antagonismo com fluconazol.

O pH do CHD-FA foi ajustado em pH 7,0 usando-se solução de NaOH 10M (o pH ideal para atividade de fluconazol). Isto resultou em uma solução viscosa ligeiramente castanha com um forte odor característico.

Ensaios de suscetibilidade foram repetidos como acima.

Como observado previamente com CHD-FA nativo, soluções a 4 %, 2 % e 1 % inibiram o crescimento de Candida albicans durante pelo menos 24 horas quando combinadas com 1 X meio de cultura RPMI 1640, crescimento em 0,5 % de CHD-FA ocorre em níveis similares a controles de solvente. Não se observou sinergia ou antagonismo com fluconazol.

As MICs das cepas de Candida albicans com e sem CHD-FA encontram-se listadas na Tabela 4 (o pH do CHD-FA foi ajustado em 7,0).

Tabela 4: Concentrações inibidora mínimas de Fluconazol (mg/1) combinado com CHD-FA

Cepa de Candida	2 % de CHD-FA	1 % de CHD-FA	0,5% de CHD-FA	0,25% de CHD-FA	0,125% de CHD-FA	Solvente
1	sem crescimento	sem crescimento	16	16	16	128
2	sem crescimento	sem crescimento	32	16	16	16
3	sem crescimento	sem crescimento	2	16	16	16
4	sem crescimento	sem crescimento	32	32	32	32
5	sem crescimento	sem crescimento	32	32	32	16

3.4 MÉTODOS - Experimento principal

3.4.1 Isolados fungicos

Testes de suscetibilidade foram realizados em 40 isolados clínicos de Candida dos quais 38 apresentaram reduzida suscetibilidade ao fluconazol. O grupo compreendeu 25 C. albicans, 11 C. glabrata (todas com reduzida suscetibilidade ao fluconazol), e 4 C. tropicalis (todas com reduzida suscetibilidade ao fluconazol). Cada cultura foi desenvolvida sobre agar Sabouraud a 37°C durante 48 h para assegurar a pureza.

3.4.2 Meio

Como indicado em 3.2.2.

3.4.3 Preparação do inóculo

Como indicado em 3.2.3.

3.4.4 Condições de ensaio

Usou-se placas de microtitulação plásticas, estéreis, descartáveis com 96 poços com fundo plano.

ETAPA 1 Adição de fluconazol

a) Coluna 1 da bandeja de microtitulação foi enchida com 100 μΐ de água estéril contendo quatro vezes a concentração final da droga (512 mg/1 de fluconazol).

b) Colunas 2-12 foram enchidas com 50 μΐ de água destilada

c) Quantidades 50 μΐ foram recolhidas de poços na coluna 1 e diluídas duas vezes por meio de transferência das mesmas para a coluna 2 com uma pipeta de multi-canais (coeficiente de variação de ± 2 %). Amostras de 50 μΐ foram então removidas da coluna 2 e transferidas para a coluna 3, etc até a coluna 10. Os últimos 50 μΐ da droga diluída são então descartados. Assim, cada poço nas colunas 1-10 conterá 50 μΐ de água contendo quatro vezes as concentrações finais de droga antifúngica.

ETAPA 2 Adição de CHD-FA

Soluções de carga de CHD-FA foram produzidas contendo 4 % e 2 % (também 1 % e 0,5 % para Candida parapsilosis e Candida krusei). 100 μΐ do CHD-FA diluído foram adicionados em bandejas de microtitulação de forma que fileiras contêm diluições finais de:

Para Candida albicans e tropicalis: I^o linha de par 0,5 % de CHD-FA, 2^a linha de par de solvente apenas

Para Candida glabrata: I^a linha do tripleto 1 % de CHD-FA, 2^alinha de tripleto 0,5 % de CHD-FA, 3^a linha de solvente de tripleto apenas

Para Candida parapsilosis e Candida krusei linhas incluíram 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,25 e 0,125 % de CHD-FA e uma linha de solvente apenas.

Todas as concentrações acima foram misturadas com concentrações fixas de fluconazol a 128, 32, 8, 2, 0,5 mg/1 e solvente para avaliação de sinergia/antagonismo.

ETAPA 3 Adição de Candida spp μΐ da suspensão diluída de Candida spp em 4 x RPMI foram adicionados em todos os poços. Isto produz um poço contendo 200 μΐ de volume final (constituído de 50 μΐ de fluconazol diluído, 100 μΐ CHD-FA diluído ou diluente, 50 μΐ de 4 X RPMI contendo Candida)

ETAPA 4 Incubação de placas

Todas as placas foram incubadas a 37°C ao ar em um 5 incubador escurecido.

ETAPA 5 Leitura das placas

Placas foram lidas visualmente com o ponto de viragem considerado como a menor concentração de droga que inibiu o crescimento em 50 % relativamente ao controle isento de droga.

3.5. RESULTADOS - Experimento Principal

Resultados encontram-se resumidos nas Tabelas de 5 a 10.

Não ocorreu crescimento renovado de Candida após incubação prolongada (96 horas) a 37°C ou à temperatura ambiente.

Tabela 5 Eficácia do CHD-FA (0,5 %) em combinação com fluconazol contra 15 Candida albicans

Espécie de isolado	Número de isolados	Fluconazol MIC (mg/1) sozinho	Fluconazol MIC com 0,5 % de CHD-FA
C. albicans	1	128	sem crescimento
C. albicans	2	8	sem crescimento
C. albicans	3	16	sem crescimento
C. albicans	4	4	sem crescimento
C. albicans	5	128	sem crescimento
C. albicans	6	> 128	sem crescimento
C. albicans	7	128	sem crescimento
C. albicans	8	128	sem crescimento
C. albicans	9	64	sem crescimento
C. albicans	10	128	sem crescimento
C. albicans	11	0,5	sem crescimento
C. albicans	12	64	sem crescimento
C. albicans	13	0,5	sem crescimento
C. albicans	14	32	sem crescimento
C. albicans	15	3	sem crescimento
C. albicans	16	64	sem crescimento
C. albicans	17	> 128	sem crescimento
C. albicans	18	> 128	sem crescimento
C. albicans	19	0,5	sem crescimento
C. albicans	20	> 128	sem crescimento
C. albicans	20		sem crescimento
C. albicans	21	4	sem crescimento
C. albicans	22	2	sem crescimento
C. albicans	23	11	sem crescimento
C. albicans	24	> 128	sem crescimento

Tabela 6 Eficácia do CHD-FA (0,5 %) em combinação com fluconazol contra Candida glabrata

Espécie de isolado	Número de isolados	Fluconazol MIC (mg/1) sozinho	Fluconazol MIC com 0,5 % de CHD-FA
C. glabrata	1	> 128	> 128
C. glabrata	2	> 128	> 128
C. glabrata	3	> 128	> 128
C. glabrata	4	> 128	> 128
C. glabrata	5	> 128	crescimento em traços
C. glabrata	6	> 128	> 128
C. glabrata	7	> 128	> 128
C. glabrata	8	> 128	> 128
C. glabrata	9	> 128	> 128
C. glabrata	10	> 128	> 128
C. glabrata	11	> 128	> 128

Tabela 7 Eficácia do CHD-FA (1 %) em combinação com fluconazol contra

Candida glabrata

Espécie de isolado	Número de isolados	Fluconazol MIC (mg/L)sozinho	Fluconazol MIC com 0,5 % de CHD-FA
C. glabrata	1	> 128	sem crescimento
C. glabrata	2	> 128	sem crescimento
C. glabrata	3	> 128	sem crescimento
C. glabrata	4	> 128	sem crescimento
C. glabrata	5	> 128	sem crescimento
C. glabrata	6	> 128	sem crescimento
C. glabrata	7	> 128	sem crescimento
C. glabrata	8	> 128	sem crescimento
C. glabrata	9	> 128	sem crescimento
C. glabrata	10	> 128	sem crescimento
C. glabrata	11	> 128	sem crescimento

Tabela 8 Eficácia do CHD-FA (0,5 %) em combinação com fluconazol contra Candida tropicalis

Espécie de isolado	Número de isolados	Fluconazol MIC (mg/1) sozinho	Fluconazol MIC com 0,5 % de CHD-FA
C. tropicalis	1	16	sem crescimento
C. tropicalis	2	>64	sem crescimento
C. tropicalis	3	16	sem crescimento
C. tropicalis	4	16	sem crescimento

Tabela 9 Eficácia do CHD-FA (0,5 %) em combinação com fluconazol contra Candida parapsilosis

Espécie de isolado	Número de isolados	Fluconazol MIC (mg/I) sozinho	Fluconazol MIC com 0,5 % de CHD-FA	CHD-FA(%) sem fluconazol
C. parapsilosis	1	8	sem crescimento	0,25
C. parapsilosis	2	2	sem crescimento	0,5
C. parapsilosis	3	8	sem crescimento	0,5
C. parapsilosis	4	8	sem crescimento	0,5
C. parapsilosis	5	8	sem crescimento	0,5

Tabela 10 Eficácia do CHD-FA (0,5 %) em combinação com fluconazol contra Candida krusei

Espécie de isolado	Número de isolados	Fluconazol MIC (mg/1) sozinho	Fluconazol MIC com 0,5 % de CHD-FA	CHD-FA(%) sem fluconazol
C. Krusei	1	32	sem crescimento	0,25
C. Krusei	2	32	sem crescimento	0,5
C.Krusei	3	32	sem crescimento	0,25
C. Krusei	4	32	sem crescimento	0,5
C. Krusei	5	32	sem crescimento	0,5

3.6 SUMÁRIO • CHD-FA é igualmente efetivo como um agente antifungico 5 in vitro quer examinado em seu pH nativo de 2,1 ou tamponado em pH 7,0.

• CHD-FA inibe o crescimento de Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis e Candida krusei quando usado como uma [concentração a] 0,5 % in vitro.

• CHD-FA inibe o crescimento de Candida glabrata quando 10 usado como uma solução a 1 %.

• A combinação de 1 % de CHD-FA com fluconazol (0,25-128 mg/1) inibe o crescimento de todos os isolados de Candida testados.

• CHD-FA é altamente efetivo contra cepas de C. krusei que são intrinsecamente resistentes ao fluconazol.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação de ácido fúlvico derivado de uma fonte de carboidrato (CHD-FA) ou um sal do mesmo e um composto antifúngico selecionado dentre fluconazol e anfotericina B.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o sal compreende o sal de sódio ou potássio.
3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que compreende 10 ml/kg de uma solução de 0,25 % a 1 % (peso/volume) de CHD-FA, ou um sal do mesmo e 10 mg/kg de fluconazol.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizada pelo fato de que compreende uma solução de 0,25 % (peso/volume) de CHD-FA, ou um sal do mesmo e de 0,06 mg/l a 0,5 mg/l de anfotericina B.
5. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a combinação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 como ingredientes ativos.
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser na forma de um líquido, tablete, cápsula ou análogo.
7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que a composição está em uma forma adequada para administração oral.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a composição está em uma forma adequada para administração tópica.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de estar em forma de um creme, unguento ou líquido.

Petição 870180144564, de 25/10/2018, pág. 9/11
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou profilaxia de uma doença ou condição do corpo humano ou animal.
11. Uso de uma combinação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição farmacêutica para uso no tratamento ou profilaxia de uma doença ou condição do corpo humano ou animal.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é causada por um fungo resistente à droga.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o animal ou humano é imunossuprimido ou imunocomprometido.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o medicamento ser para administração oral, tópica ou qualquer outra forma adequada de administração.