BRPI1005033B1 - RECOMBINANT PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR IMMUNODIAGNOSIS TESTING OF VISCERAL LEISHMANIASIS - Google Patents
RECOMBINANT PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR IMMUNODIAGNOSIS TESTING OF VISCERAL LEISHMANIASIS Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI1005033B1 BRPI1005033B1 BRPI1005033-7A BRPI1005033A BRPI1005033B1 BR PI1005033 B1 BRPI1005033 B1 BR PI1005033B1 BR PI1005033 A BRPI1005033 A BR PI1005033A BR PI1005033 B1 BRPI1005033 B1 BR PI1005033B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- visceral leishmaniasis
- group
- immunodiagnostic test
- kit
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 206010047505 Visceral leishmaniasis Diseases 0.000 title claims abstract description 52
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 14
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 claims 2
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims 2
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims 2
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 claims 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims 2
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims 2
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims 2
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 claims 2
- 230000002514 anti-leishmanial effect Effects 0.000 claims 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims 2
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 claims 2
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical group [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims 2
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 claims 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 55
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 55
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 54
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 30
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 22
- 238000009589 serological test Methods 0.000 abstract description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 79
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 50
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 32
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 21
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 20
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 12
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 11
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 11
- JPOKAKNGULMYHZ-UILVTTEASA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=C(O)C=C1 JPOKAKNGULMYHZ-UILVTTEASA-N 0.000 description 10
- 102000010722 N-Glycosyl Hydrolases Human genes 0.000 description 9
- 108010063372 N-Glycosyl Hydrolases Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000222697 Leishmania infantum Species 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000003108 parasitologic effect Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 241000222727 Leishmania donovani Species 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 206010011668 Cutaneous leishmaniasis Diseases 0.000 description 2
- 101000978703 Escherichia virus Qbeta Maturation protein A2 Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005541 medical transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108700029231 Developmental Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000178949 Leishmania chagasi Species 0.000 description 1
- 108700019133 Leishmania donovani A2 Proteins 0.000 description 1
- 241001137872 Leishmania sp. Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000255129 Phlebotominae Species 0.000 description 1
- 241000722350 Phlebotomus <genus> Species 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 244000000040 protozoan parasite Species 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
peptídeos recombinantes, método e kit para teste imunodiagnástico de leishmaniose visceral. a presente invenção descreve um método e kit para diagnosticar leishmaniose visceral. mais particularmente, a invenção trata da associação dos antígenos recombinantes definidos ra2, rnh e rlack ou seus epítopos, peptídeos 47, 17, 18 e 19, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior especificidade, otimizando, assim, a reatividade dos testes sorológicos.recombinant peptides, method and kit for immunodiagnostic testing of visceral leishmaniasis. the present invention describes a method and kit for diagnosing visceral leishmaniasis. more particularly, the invention deals with the association of the defined recombinant antigens ra2, rnh and rlack or their epitopes, peptides 47, 17, 18 and 19, allowing the development of a diagnostic method with greater specificity, thus optimizing the reactivity of serological tests .
Description
A presente invenção descreve um método e kit para diagnosticar Leishmaniose visceral. Mais particularmente, a invenção trata da associação dos antígenos recombinantes definidos rA2, rNH e rLACK ou seus epítopos, peptídeos 47, 17, 18 e 19, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior especificidade, otimizando, assim, a reatividade dos testes sorológicos.The present invention describes a method and kit for diagnosing visceral leishmaniasis. More particularly, the invention deals with the association of defined recombinant antigens rA2, rNH and rLACK or their epitopes,
Espécies do gênero Leishmania são agentes etiológicos das diferentes formas clínicas da leishmaniose (visceral, cutânea, mucocutânea e difusa) que, por sua vez, apresentam distribuição geográfica e prevalências distintas. Dentre os 88 países em que é registrada a ocorrência de leishmaniose, 72 são países em desenvolvimento e 13 estão entre os menos desenvolvidos do mundo. Cerca de 90% dos casos de leishmaniose visceral (LV) ocorrem no Brasil, Bangladesh, índia, Nepal e Sudão e 90% dos casos de leishmaniose cutânea (LC) ocorrem no Brasil, Afeganistão, Argélia, Iran, Peru, Arábia Saudita e Síria (World Health Organization. 2002. Leishmaniasis Strategic Direction, “http://www.who.int/tdr/diseases/leish/lifecycle.htm”; Murray, H. W. J. D. Berman. 2005. "Advances in leishmaniasis." Lancet 366(9496): 1561-77). Cabe aqui ressaltar que a LV, quando não tratada, é normalmente fatal.Species of the genus Leishmania are etiological agents of the different clinical forms of leishmaniasis (visceral, cutaneous, mucocutaneous and diffuse), which, in turn, have different geographic distribution and prevalence. Among the 88 countries in which the occurrence of leishmaniasis is recorded, 72 are developing countries and 13 are among the least developed in the world. About 90% of cases of visceral leishmaniasis (VL) occur in Brazil, Bangladesh, India, Nepal and Sudan and 90% of cases of cutaneous leishmaniasis (CL) occur in Brazil, Afghanistan, Algeria, Iran, Peru, Saudi Arabia and Syria (World Health Organization. 2002. Leishmaniasis Strategic Direction, “http://www.who.int/tdr/diseases/leish/lifecycle.htm”; Murray, HWJD Berman. 2005. “Advances in leishmaniasis.” Lancet 366(9496 ): 1561-77). It should be noted here that VL, when left untreated, is usually fatal.
Em diferentes regiões geográficas, o ciclo de transmissão da doença se estabelece quando se encontram próximos, em um ambiente favorável, os vetores (fêmeas de flebotomíneos dos gêneros Lutzomiya e Phlebotomus) infectados por formas promastigotas de alguma das várias espécies de Leishmania e o hospedeiro definitivo (mamíferos, sendo o homem hospedeiro acidental). Formas promastigotas, após terem sido introduzidas na pele dos hospedeiros definitivos, são fagocitadas e se transformam em formas amastigotas, que permanecem em contato com o sistema imune do hospedeiro durante a infecção ativa. O cão é considerado o principal reservatório doméstico da LV em nosso meio (Matlashewski, G. 2001. Leishmania infection and virulence: Med Microbiol. Immunol., 190: 37-42).In different geographic regions, the disease transmission cycle is established when the vectors (female sandflies of the Lutzomiya and Phlebotomus genera) infected by promastigote forms of one of the various species of Leishmania and the definitive host are close together, in a favorable environment. (mammals, human being accidental host). Promastigote forms, after being introduced into the skin of definitive hosts, are phagocytosed and transform into amastigote forms, which remain in contact with the host's immune system during active infection. The dog is considered the main domestic reservoir of VL in our environment (Matlashewski, G. 2001. Leishmania infection and virulence: Med Microbiol. Immunol., 190: 37-42).
O controle da leishmaniose visceral (LV) no Brasil se faz por meio da eliminação dos reservatórios domésticos da doença (cães infectados), controle das populações de vetor e, quando possível, pela prevenção do contato com vetores infectados. Cães infectados, sintomáticos ou não, podem transmitir os parasitas ao inseto vetor (Courtenay, O., R. J. Quinnell, L. M. Garcez, J. J. Shaw, and C. Dye. 2002. infectiousness in a cohort of Brazilian dogs: why culling fails to control visceral leishmaniasis in areas of high transmission. J. Infect. Dis. 186:1314-1320). Assim, a prevalência e incidência da infecção canina são parâmetros fundamentais para o controle da transmissão. No entanto, a estimativa das mesmas depende de métodos confiáveis de identificação dos cães infectados (Dye, C., E. Vidor, and J. Deneure. 1993. Serological diagnosis of leishmaniasis: on detecting infection as poço as disease. Epidemiol. Infect. 103:647-656; Dye, C., R. Killick-Kendrick, M. M. Vitutia, R. Walton, M. Killick-Kendrick, A. E. Harith, M. W. Guy, M.-C. Canãvate and G. Hasibeder. 1992. Epidemiology of canine leishmaniasis: prevalence, incidence and basic reproduction number calculated from a cross-sectional serological survey on the island of Gozo, Malta. Parasitology 105:35-41; Quinnell, R. J., O. Courtenay, L. Garcez, and C. Dye. 1997. The epidemiology of canine leishmaniasis: transmission rates estimated from a cohort study in Amazonian Brazil. Parasitology 115:143-156). Estudos baseados em modelagem matemática indicam, porém, que medidas de controle baseadas na detecção sorológica dos cães falham devido à alta incidência da infecção em cães, à alta infectividade dos parasitas, à falta de sensibilidade dos testes de diagnóstico sorológico e à demora entre diagnóstico e eliminação dos cães positivos, entre outros aspectos (Courtenay et al. 2002).The control of visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is done through the elimination of domestic reservoirs of the disease (infected dogs), control of vector populations and, when possible, by preventing contact with infected vectors. Infected dogs, symptomatic or not, can transmit the parasites to the insect vector (Courtenay, O., RJ Quinnell, LM Garcez, JJ Shaw, and C. Dye. 2002. Infectiousness in a cohort of Brazilian dogs: why culling fails to visceral control leishmaniasis in areas of high transmission. J. Infect. Dis. 186:1314-1320). Thus, the prevalence and incidence of canine infection are fundamental parameters for the control of transmission. However, their estimation depends on reliable methods of identifying infected dogs (Dye, C., E. Vidor, and J. Deneure. 1993. Serological diagnosis of leishmaniasis: on detecting infection as well as disease. Epidemiol. Infect. 103:647-656; Dye, C., R. Killick-Kendrick, MM Vitutia, R. Walton, M. Killick-Kendrick, AE Harith, MW Guy, M.-C. Canavate and G. Hasibeder. 1992. Epidemiology of canine leishmaniasis: prevalence, incidence and basic reproduction number calculated from a cross-sectional serological survey on the island of Gozo, Malta Parasitology 105:35-41; Quinnell, RJ, O. Courtenay, L. Garcez, and C. Dye 1997. The epidemiology of canine leishmaniasis: transmission rates estimated from a cohort study in Amazonian Brazil. Parasitology 115:143-156). Studies based on mathematical modeling indicate, however, that control measures based on serological detection of dogs fail due to the high incidence of infection in dogs, the high infectivity of the parasites, the lack of sensitivity of serological diagnostic tests and the delay between diagnosis and elimination of positive dogs, among other aspects (Courtenay et al. 2002).
A aplicação das medidas de controle da LV no Brasil é extremamente complexa e onerosa, devido ao complexo ciclo de transmissão da doença, que envolve reservatórios domésticos,silvestres e insetos vetores, à precária condição sócio-económica da população em muitas regiões do país e à urbanização e expansão da doença para áreas onde, até recentemente, ela não era registrada. Outros aspectos referem-se às diferenças ecoepidemiológicas da doença em diferentes regiões do país, à baixa sensibilidade dos testes de diagnóstico sorológicos convencionais, especialmente para a detecção de cães que se encontram nos estágios iniciais da doença, e à demora entre o diagnóstico e a eliminação dos cães infectados. Recentemente, a introdução de uma vacina no mercado contra a LV canina (Leishmune® - FordDodge), constituída de complexo antigênico FML purificado de formas promastigotas, tem dificultado a adoção dessas medidas de controle, uma vez que cães vacinados se tornam soropositivos nos testes convencionais, que empregam antígenos de formas promastigotas dos parasitas. Esse aspecto relaciona-se à presença dos mesmos antígenos na vacina e nos testes de diagnóstico sorológico que empregam formas promastigotas do parasita. Essa dificuldade poderia ser contornada empregando-se vacinas que não induzem soroconversão dos cães nos testes de diagnóstico empregando antígenos de formas promastigotas ou empregando-se nos testes sorológicos antígenos distintos daquelas presentes nas vacinas. Independentemente das características específicas de cada vacina, em um cenário complexo como esse, a introdução de novas ferramentas de controle pressupõe a não interferência com as demais medidas de controle vigentes.The application of VL control measures in Brazil is extremely complex and costly, due to the complex cycle of disease transmission, which involves domestic and wild reservoirs and vector insects, the precarious socio-economic condition of the population in many regions of the country and the urbanization and expansion of the disease to areas where, until recently, it was not registered. Other aspects refer to the ecoepidemiological differences of the disease in different regions of the country, the low sensitivity of conventional serological diagnostic tests, especially for the detection of dogs that are in the early stages of the disease, and the delay between diagnosis and elimination of infected dogs. Recently, the introduction of a vaccine on the market against canine VL (Leishmune® - FordDodge), consisting of an antigenic complex FML purified from promastigote forms, has made it difficult to adopt these control measures, since vaccinated dogs become seropositive in conventional tests , which employ antigens from the promastigote forms of the parasites. This aspect is related to the presence of the same antigens in the vaccine and in serological diagnostic tests that employ promastigote forms of the parasite. This difficulty could be overcome by using vaccines that do not induce seroconversion in dogs in diagnostic tests using promastigote antigens or by using antigens different from those present in vaccines in serological tests. Regardless of the specific characteristics of each vaccine, in a complex scenario like this, the introduction of new control tools presupposes non-interference with other control measures in force.
O diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é conduzido por meio de testes sorológicos e parasitológicos em aspirados de baço, medula óssea, biópsia das lesões e linfonodos (WHO, 2002; Tavares CA, Fernandes AP, Melo MN. 2003. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Expert Rev Mol Diagn. 3(5):657-67). Devido às limitações dos métodos de diagnóstico direto, tais como microscopia, cultura, inoculação em hamsters de amostras de biopsia, a presença de anticorpos contra os parasitas por meio de reação de imunofluorescência ou ELISA empregando antígenos de formas promastigotas de Leishmania sp. é pesquisada rotineiramente como marcador de infecção (Dye et al., 1993; Grimaldi, G., Jr., and R. B. Tesh. 1993. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev. 6:230-250; Tavares etal., 2003).The diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is conducted through serological and parasitological tests in aspirates from the spleen, bone marrow, biopsy of lesions and lymph nodes (WHO, 2002; Tavares CA, Fernandes AP, Melo MN. 2003. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Expert Rev Mol Diagn. 3(5):657-67). Due to the limitations of direct diagnostic methods, such as microscopy, culture, inoculation into hamsters of biopsy samples, the presence of antibodies against the parasites through immunofluorescence reaction or ELISA using antigens from promastigote forms of Leishmania sp. it is routinely researched as a marker of infection (Dye et al., 1993; Grimaldi, G., Jr., and RB Tesh. 1993. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev. 6 :230-250; Tavares et al., 2003).
Vários tipos de testes sorológicos e antígenos têm sido avaliados, mas a sorologia é, em geral, menos específica do que a detecção de parasitas em amostras de biópsia, devido à reatividade cruzada com outros agentes como Erlichia canis e riquetsias. Os testes sorológicos disponíveis para o diagnóstico indireto incluem a reação de imunofluorêscencia (IFAT), ELISAs, dot-ELISA, teste de aglutinação direta, Western blotting, e teste imunocromatográfico (Mancianti, F. and N. Meciani. 1988. Specific serodiagnosis of canine leishmaniasis by indirect immunofluorescence, indirect hemagglutination, and counter-immunoelectrophoresis. Am. J. Vet. Res. 49:1409-1411; Badaró, R., D. Benson, M. C. Eulálio, M. Freire, S. Cunha, E. M. Neto, D. Pedral-Sampaio, C. Madureira, J. M. Burns, R. L. Houghton, J. R. David, and S. G. Reed. 1996. rK39: a cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis. J. Infect. Dis. 173:758-761; Vercammen, F., D. Berkvens, J. Brandt, and W. Vansteenkiste. 1998. A sensitive and specific 30-min Dot-ELISA for the detection of anti-leishmania antibodies in the dog. Vet. Parasitol. 79:221-228; Harith, A., A. H. Kolk, P. A. Kager, J. Leeuwenburg, R. Muigai, S. Kiugu, and J. J. Laarman. 1986. A simple and economical direct agglutination test for serodiagnosis and sero-epidemiological studies of visceral leishmaniasis.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 80:583-587; Aisa, M. J., S. Castillejo, M. Gallego, R. Fisa, M. C. Riera, M. De Colmenares, S. Torras, X. Roura, J. Sentis, and M. Portus. 1998. Diagnostic potential of Western blot analysis of sera from dogs with leishmaniasis in endemic areas and significance of the pattern. Am. J. Trop. Med. Hyg.; 58:154-159; Teodoro da Costa, R., J. C. Franc,a, W. Mayrink, E. Nascimento, O. Genaro, and A. Campos-Neto. 2003. Standardization of a rapid immunochromatographic test with the recombinant antigens K39 and K26 for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 97:678-682). A avaliação destes testes indica que, em geral, eles apresentam sensibilidade adequada para o sorodiagnóstico da LVC, em cães sintomáticos. Além dos testes sorológicos, testes imunocitoquímicos e moleculares, baseados em reações de PCR, também foram desenvolvidos para detecção de DNA de Leishmania em amostras humanas e de cães (Quinnell, R. J., O. Courtenay, S. Davidson, L. Garcez, B. Lambson, P. Ramos, J. J. Shaw, M. A. Shaw, and C. Dye. 2001. Detection of Leishmania infantum by PCR, serology and immune response in a cohort study of Brazilian dogs. Parasitology 122:253-261; Reithinger, R., R. J. Quinnell, B. Alexander, and C. R. Davies. 2002. Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs: comparative study using an immunochromatographic dipstick test, enzyme-linked immunosorbentassay, and PCR. J. Clin. Microbiol. 40:2352-2356). Entretanto, estes testes são laboriosos e de custo elevado, pois requerem equipamentos especializados e corpo técnico treinado, o que inviabiliza a sua aplicação em muitos casos. Estudos sugerem que a PCR é mais útil para detectar infecção ativa enquanto a sorologia pode ser mais sensível para detecção de todos os animais infectados (Quinnell et al., 2001).Several types of serological tests and antigens have been evaluated, but serology is generally less specific than the detection of parasites in biopsy samples, due to cross-reactivity with other agents such as Erlichia canis and rickettsiae. Serological tests available for indirect diagnosis include immunofluorescence reaction (IFAT), ELISAs, dot-ELISA, direct agglutination test, Western blotting, and immunochromatographic test (Mancianti, F. and N. Meciani. 1988. Specific serodiagnosis of canine leishmaniasis by indirect immunofluorescence, indirect hemagglutination, and counter-immunoelectrophoresis, Am. J. Vet. Res. 49:1409-1411; Badaró, R., D. Benson, MC Eulálio, M. Freire, S. Cunha, EM Neto, D. Pedral-Sampaio, C. Madureira, JM Burns, RL Houghton, JR David, and SG Reed. 1996. rK39: a cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis. ; Vercammen, F., D. Berkvens, J. Brandt, and W. Vansteenkiste, 1998. A sensitive and specific 30-min Dot-ELISA for the detection of anti-leishmania antibodies in the dog. Vet. Parasitol. -228; Harith, A., AH Kolk, PA Kager, J. Leeuwenburg, R. Muigai, S. Kiugu, and JJ Laarman, 1986. ple and economical direct agglutination test for serodiagnosis and sero-epidemiological studies of visceral leishmaniasis.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 80:583-587; Aisa, M.J., S. Castillejo, M. Gallego, R. Fisa, M.C. Riera, M. De Colmenares, S. Torras, X. Roura, J. Sentis, and M. Portus. 1998. Diagnostic potential of Western blot analysis of sera from dogs with leishmaniasis in endemic areas and significance of the pattern. Am.J.Trop. Med. Hyg.; 58:154-159; Teodoro da Costa, R., J.C. Franc,a, W. Mayrink, E. Nascimento, O. Genaro, and A. Campos-Neto. 2003. Standardization of a rapid immunochromatographic test with the recombinant K39 and K26 antigens for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 97:678-682). The evaluation of these tests indicates that, in general, they present adequate sensitivity for the serodiagnosis of CVL in symptomatic dogs. In addition to serological tests, immunocytochemical and molecular tests based on PCR reactions have also been developed for detection of Leishmania DNA in human and dog samples (Quinnell, RJ, O. Courtenay, S. Davidson, L. Garcez, B. Lambson, P. Ramos, JJ Shaw, MA Shaw, and C. Dye 2001. Detection of Leishmania infantum by PCR, serology and immune response in a cohort study of Brazilian dogs, Parasitology 122:253-261; RJ Quinnell, B. Alexander, and CR Davies. 2002. Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs: a comparative study using an immunochromatographic dipstick test, enzyme-linked immunosorbentassay, and PCR. J. Clin. Microbiol. 40:2352-2356) . However, these tests are laborious and costly, as they require specialized equipment and a trained technical staff, which makes their application unfeasible in many cases. Studies suggest that PCR is more useful for detecting active infection while serology may be more sensitive for detecting all infected animals (Quinnell et al., 2001).
O diagnóstico sorológico da LVC por ELISA empregando extrato de promastigotas ou Reação de Imunofluorescência ainda possui limitações relacionadas ao preparo e padronização dos antígenos de formas promastigotas e também pelo fato de requerer pessoal treinado e equipamentos especializados, dificultando sua aplicação rápida. Testes mais rápidos, como a imunocromatografia utilizando antígenos de proteínas recombinantes de L. infantum como o K39 (rK39) e rK26, têm auxiliado no diagnóstico de casos de LVC sintomáticos. Notam-se, no entanto, limitações para diferenciar cães assintomáticos de sintomáticos. Outro teste foi introduzido no mercado recentemente pela empresa Biogene, contendo o antígeno recombinante HSP70, denominado S7. No entanto, detecta-se uma escassez de dados da literatura em relação à avaliação de sensibilidade e especificidade e validação desse teste. Resultados preliminares obtidos pelo nosso grupo indicam elevada discordância em relação ao testes convencionais no diagnóstico de cães assintomáticos e sintomáticos.The serological diagnosis of CVL by ELISA using promastigote extract or Immunofluorescence Reaction still has limitations related to the preparation and standardization of antigens in promastigote forms and also because it requires trained personnel and specialized equipment, making its rapid application difficult. Faster tests, such as immunochromatography using recombinant L. infantum protein antigens such as K39 (rK39) and rK26, have helped in the diagnosis of symptomatic CVL cases. However, there are limitations in differentiating asymptomatic from symptomatic dogs. Another test was recently introduced on the market by the company Biogene, containing the HSP70 recombinant antigen, called S7. However, there is a scarcity of data in the literature regarding the assessment of sensitivity and specificity and validation of this test. Preliminary results obtained by our group indicate a high disagreement with conventional tests in the diagnosis of asymptomatic and symptomatic dogs.
Outro aspecto que deve ser ressaltado refere-se ao fato de que o Ministério da Saúde investiu na implantação e capacitação de laboratórios em todo o país para o diagnóstico sorológico da LVC e que esse esforço não deve ser desperdiçado, mas sim aprimorado. Testes de diagnóstico moleculares se apresentam como alternativas devido a sua alta sensibilidade, mas são ainda laboriosos e onerosos. Desta forma, o aprimoramento de testes de diagnóstico sorológico que possam se valer da infra-estrutura e capacitação instaladas tem óbvias vantagens para a aplicação no SUS.Another aspect that should be highlighted refers to the fact that the Ministry of Health has invested in the implementation and training of laboratories throughout the country for the serological diagnosis of CVL and that this effort should not be wasted, but rather improved. Molecular diagnostic tests are presented as alternatives due to their high sensitivity, but they are still laborious and costly. Thus, the improvement of serological diagnostic tests that can make use of the installed infrastructure and training has obvious advantages for its application in the SUS.
O antígeno A2, expresso pelas formas amastigotas de espécies viscerotrópicas, pertence a uma família de proteínas que possui um número variável de repetições de uma unidade de 10 aminoácidos, sendo considerado o primeiro fator de virulência amastigota específico descrito (Charest, H. and G. Matlashewski. 1994. "Developmental gene expression in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene." Mol Cell Biol 14(5): 2975-84; Zhang, W. W. and G. Matlashewski. 1997. Loss of virulence in Leishmania donovani deficient in an amastigote-specific protein, A2. Proc Natl Acad Sci U S A 94(16): 8807-11). A2 se mostrou reativo em 60 e 82% dos pacientes soropositivos com o kala-azar da índia e do Sudão, respectivamente, no teste de ELISA (Ghedin, E., W. W. Zhang, H. Charest, S. Sundar, R. T. Kenney, and G. Matlashewski. 1997. Antibody response against Leishmania donovani amastigote-stage-specific protein in patients with visceral leishmaniasis. Clin. Diagn.Lab. Immunol. 4:530-535). No Brasil, os anticorpos anti-A2 foram detectados por ELISA em 77% dos soros dos pacientes com LV sintomático e em 87% dos soros dos cães positivos pela I FAT para Leishmania ou na avaliação parasitológica (Carvalho, F. A. A., H. Charest, C. A. P. Tavares, G. Matlashewski, E. P. Valente, A. Rabello, R. T. Gazinelli, and A. P. Fernandes. 2002. Diagnosis of American visceral leishmaniasis in humans and dogs using the recombinant Leishmania donovani A2 antigen. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 43:289-295). Em um estudo recente, foram avaliados comparativamente antígenos recombinantes parasita-específicos rK39, rK26, e rA2 e o antígeno solúvel (CSA) em testes de ELISA (Porrozzi, R., M. V. S. Costa, A. Teva, A., Campos-Neto, A., Fernandes, A.P., Gazzinelli, RT., Grimaldi, G. Jr. 2007. Comparative evaluation of enzime-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant leishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs. Clinical and Vaccine Immunology 14:544-548). Os resultados mostraram que estes marcadores apresentam sensibilidade elevada para o diagnóstico da LVC em caes sintomáticos, que apresentam em geral elevados títulos de anticorpos. No entanto, quando foi calculada a razão entre casos sintomáticos e assintomáticos que foram identificados por cada antígeno, A2 foi o antígeno que apresentou o mais alto índice, seguido por K39, K26 e CSA, sugerindo associação entre resposta a A2 e imunidade protetora. Além disso, a especificidade do teste empregando A2 foi de 96%, enquanto para os outros antígenos variou entre 85 a 90% (Porrozzi et al. 2007). Esses dados sugerem que esses marcadores podem se complementar aumentando a sensibilidade total dos testes de detecção de anticorpos em cães sintomáticos e assintomáticos infectados por espécies de leishmania que causam a LVC.The A2 antigen, expressed by the amastigote forms of viscerotropic species, belongs to a family of proteins that have a variable number of repeats of a 10-amino acid unit, being considered the first amastigote-specific virulence factor described (Charest, H. and G. Matlashewski, 1994. "Developmental gene expression in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene." Mol Cell Biol 14(5): 2975-84; Zhang, WW and G. Matlashewski. 1997. Loss of virulence in Leishmania donovani deficient in an amastigote-specific protein, A2. Proc Natl Acad Sci USA 94(16): 8807-11). A2 was found to be reactive in 60 and 82% of seropositive patients with kala-azar from India and Sudan, respectively, in the ELISA test (Ghedin, E., WW Zhang, H. Charest, S. Sundar, RT Kenney, and G. Matlashewski, 1997. Antibody response against Leishmania donovani amastigote-stage-specific protein in patients with visceral leishmaniasis. Clin. Diagn.Lab. Immunol. 4:530-535). In Brazil, anti-A2 antibodies were detected by ELISA in 77% of the sera of patients with symptomatic VL and in 87% of the sera of dogs positive by I FAT for Leishmania or in the parasitological evaluation (Carvalho, FAA, H. Charest, CAP Tavares, G. Matlashewski, EP Valente, A. Rabello, RT Gazinelli, and AP Fernandes, 2002. Diagnosis of American visceral leishmaniasis in humans and dogs using the recombinant Leishmania donovani A2 antigen. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 43:289 -295). In a recent study, parasite-specific recombinant antigens rK39, rK26, and rA2 and the soluble antigen (CSA) were comparatively evaluated in ELISA tests (Porrozzi, R., MVS Costa, A. Teva, A., Campos-Neto, A., Campos-Neto, A., Fernandes, AP, Gazzinelli, RT., Grimaldi, G. Jr. 2007. Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant leishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs. Vaccine Immunology 14:544-548). The results showed that these markers have high sensitivity for the diagnosis of CVL in symptomatic dogs, which generally have high antibody titers. However, when the ratio between symptomatic and asymptomatic cases identified by each antigen was calculated, A2 was the antigen with the highest index, followed by K39, K26 and CSA, suggesting an association between response to A2 and protective immunity. Furthermore, the specificity of the test employing A2 was 96%, while for the other antigens it ranged from 85 to 90% (Porrozzi et al. 2007). These data suggest that these markers may complement each other by increasing the overall sensitivity of antibody detection tests in symptomatic and asymptomatic dogs infected with Leishmania species that cause CVL.
Embora os dados apresentados por Porrozzi et al. (2007) demonstrem uma considerável melhoria na sensibilidade e especificidade de testes com antígenos recombinantes em comparação com testes empregando extrato antigênico, observa-se que ainda existem limitações em relação a uma menor sensibilidade dos testes empregando os antígenos K39, K26 e extrato antigênico em relação ao diagnóstico de cães assintomáticos. Esses animais tendem em geral a apresentar títulos de anticorpos mais baixos, menores que 1:640. No entanto, animais assintomáticos podem apresentar os parasitos na pele e representar uma importante fonte de transmissão dos mesmos para os vetores, resultando na manutenção da transmissão da infecção e sendo um dos fatores importantes para a falência das medidas de controle. Assim, testes mais sensíveis e específicos, capazes de detectar cães assintomáticos e/ou com baixos títulos de anticorpos, se fazem ainda necessários. Considerando que a detecção e o sacrifício de cães com sorologia positiva ainda é adotado no Brasil como medida de controle e que animais com baixos títulos de anticorpos e assintomáticos podem transmitir a infecção, o emprego de testes de diagnóstico com maior sensibilidade para esse tipo de animal pode apresentar impacto favorável sobre as medidas de controle da leishmaniose visceral no Brasil.Although the data presented by Porrozzi et al. (2007) demonstrate a considerable improvement in the sensitivity and specificity of tests with recombinant antigens compared to tests using antigenic extract, it is observed that there are still limitations regarding a lower sensitivity of tests using K39, K26 and antigenic extract antigens in relation to to the diagnosis of asymptomatic dogs. These animals generally tend to have lower antibody titers, less than 1:640. However, asymptomatic animals can present the parasites on the skin and represent an important source of their transmission to vectors, resulting in the maintenance of infection transmission and being one of the important factors for the failure of control measures. Thus, more sensitive and specific tests, capable of detecting asymptomatic dogs and/or with low antibody titers, are still needed. Considering that the detection and sacrifice of dogs with positive serology is still adopted in Brazil as a control measure and that animals with low titers of antibodies and asymptomatic can transmit the infection, the use of diagnostic tests with greater sensitivity for this type of animal may have a favorable impact on visceral leishmaniasis control measures in Brazil.
A associação de antígenos definidos é uma estratégia importante para o aprimoramento dos métodos de diagnóstico sorológico, uma vez que antígenos recombinantes, tais como rK39, rK26, e rA2, apesar de apresentarem elevada especificidade, quando empregados isoladamente podem apresentar menor sensibilidade (Carvalho et al. 2002; Porrozi et al., 2007). No entanto, estes marcadores apresentam o potencial de se complementarem, aumentando a sensibilidade total nos testes sorológicos de cães sintomáticos (Porrozzi et al., 2007). Assim, combinações de antígenos podem ser mais sensíveis do que uma única proteína ou epítopo, considerando a heterogeneidade genética das populações caninas. Antígenos recombinantes também podem apresentar especificidade reduzida se epítopos presentes em sua seqüência são também compartilhados por moléculas ortólogas presentes em outros organismos. Usando métodos moleculares, esses problemas podem ser contornados com a remoção destas seqüências, resultando em moléculas otimizadas tanto para sensibilidade quanto especificidade. Instrumentos disponíveis on line podem ser úteis para predição de epítopos de células B. A partir de um antígeno com sequência conhecida e que tenha apresentado reatividade com soros de cães e pacientes com leishmaniose visceral, pode-se identificar as porções da molécula com maior afinidade por anticorpos e sintetizar os peptídeos correspondentes, otimizando em cada molécula a reatividade em testes sorológicos.The association of defined antigens is an important strategy for the improvement of serological diagnostic methods, since recombinant antigens, such as rK39, rK26, and rA2, despite their high specificity, when used alone, they may have lower sensitivity (Carvalho et al. . 2002; Porrozi et al., 2007). However, these markers have the potential to complement each other, increasing the total sensitivity in serological tests of symptomatic dogs (Porrozzi et al., 2007). Thus, combinations of antigens may be more sensitive than a single protein or epitope, considering the genetic heterogeneity of canine populations. Recombinant antigens may also have reduced specificity if epitopes present in their sequence are also shared by orthologous molecules present in other organisms. Using molecular methods, these problems can be circumvented by removing these sequences, resulting in molecules optimized for both sensitivity and specificity. Instruments available online can be useful for predicting B cell epitopes. From an antigen with known sequence and which has shown reactivity with sera from dogs and patients with visceral leishmaniasis, it is possible to identify the portions of the molecule with greater affinity for antibodies and synthesize the corresponding peptides, optimizing the reactivity in each molecule in serological tests.
Tal abordagem foi empregada no presente estudo, selecionando-se, a partir das sequências dos antígenos A2, NH e LACK, peptídeos correspondentes a regiões com características ótimas para reatividade como epítopos para células B. Assim, a presente invenção descreve um método e Kit para diagnosticar Leishmaniose através da associação dos antígenos definidos rA2, rNH e rLACK ou seus epítopos, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior sensibilidade, otimizando, dessa forma, a reatividade dos testes sorológicos.This approach was used in the present study, selecting, from the sequences of the A2, NH and LACK antigens, peptides corresponding to regions with optimal characteristics for reactivity as epitopes for B cells. Thus, the present invention describes a method and Kit for diagnose Leishmaniasis through the association of the defined antigens rA2, rNH and rLACK or their epitopes, allowing the development of a diagnostic method with greater sensitivity, thus optimizing the reactivity of serological tests.
Já se encontram patentes que descrevem o uso de antígenos de leishmania e a combinação destes no diagnóstico da Leishmaniose. Dentre os quais podemos citar:There are already patents that describe the use of leishmania antigens and their combination in the diagnosis of Leishmaniasis. Among which we can mention:
O documento US20100136046- RECOMBINANT POLYPROTEIN VACCINES FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF LEISHMANIASIS- descreve composições e métodos para prevenir, tratar e detectar leishmaniose. As composições geralmente incluem polipeptídeos de fusão compreendendo múltiplos antígenos de Leishmania, em particular, A2 KMPII, SMT, e /ou CBP, ou porções imunogênicas ou variantes das mesmas, bem como polinucleotídeos codificando tais polipeptídeos de fusão.The document US20100136046 - RECOMBINANT POLYPROTEIN VACCINES FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF LEISHMANIASIS - describes compositions and methods to prevent, treat and detect leishmaniasis. Compositions generally include fusion polypeptides comprising multiple Leishmania antigens, in particular, A2 KMPII, SMT, and/or CBP, or immunogenic portions or variants thereof, as well as polynucleotides encoding such fusion polypeptides.
O documento US20060211056- LEISHMANIA ANTIGENS SUITABLE FOR A DIAGNOSTIC KIT OF LEISHMANIA- descreve a obtenção de polipeptídeos de 10 aminoácidos consecutivos purificados a partir de Leishmania infantum. E, ainda, o uso desses polipeptídeos para diagnosticar LV Mediterrânea..US20060211056- LEISHMANIA ANTIGENS SUITABLE FOR A DIAGNOSTIC KIT OF LEISHMANIA- describes the obtainment of purified 10 consecutive amino acid polypeptides from Leishmania infantum. And, still, the use of these polypeptides to diagnose VL Mediterrânea...
O documento US7740859- POLYPEPTIDES FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPY OF LEISHANANIASIS- descreve compostos e métodos para a detecção de anticorpos anti-leishmania em indivíduos suspeitos de infecção com o parasita protozoário do gênero Leishmania, onde o agente infeccioso é uma cepa indiana, semelhante ou muito relacionada à cepa de Leishmania indiana.The document US7740859 - POLYPEPTIDES FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPY OF LEISHANANIASIS - describes compounds and methods for the detection of anti-leishmania antibodies in individuals suspected of infection with the protozoan parasite of the genus Leishmania, where the infectious agent is an Indian strain, similar or very related to the Indian Leishmania strain.
O documento PI9405713-3- DIAGNOSE DA LEISHMANIOSE- descreve um método para o diagnóstico da leishmaniose que compreende: (a) obter uma amostra a partir de um paciente sob suspeita de estar infectado com o parasita Leishmania contendo anticorpos do paciente e (b) determinar a presença de anticorpos que se ligam a uma unidade repetitiva do antígeno K39.The document PI9405713-3- DIAGNOSIS OF LEISHMANIOSIS- describes a method for the diagnosis of leishmaniasis which comprises: (a) obtaining a sample from a patient suspected of being infected with the Leishmania parasite containing the patient's antibodies and (b) determining the presence of antibodies that bind to a repetitive unit of the K39 antigen.
O documento WO2010020028- PEPTÍDEOS SINTÉTICOS E POLÍMERO PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA A LEISHMANIOSE- descreve dois peptídeos antigênicos sintéticos (epítopos ou mimotopos) selecionados e o método de conjugação desses peptídeos para formar um polímero. O polímero antigênico formado por esses peptídeos produz imunização contra leishmaniose visceral e será usado em método e kit imunodiagnóstico específico para detectar a doença.The document WO2010020028 - SYNTHETIC PEPTIDES AND POLYMER FOR IMMUNIZATION AGAINST LEISHMANIASIS - describes two selected synthetic antigenic peptides (epitopes or mimotopes) and the method of conjugating these peptides to form a polymer. The antigenic polymer formed by these peptides produces immunization against visceral leishmaniasis and will be used in a specific immunodiagnostic method and kit to detect the disease.
Breve Descrição das Figuras Figura 1 - Reatividade do peptídeo 47 (1 pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640). Observa-se que nessas condições o peptídeo foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade e especificidade do peptídeo 47 com soros de cães com altos títulos de anticorpos. Figura 2 - Reatividade do peptídeo 47 (1pg/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos. Observa-se que, nessas condições, o peptídeo 47 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensiblidade apresentada quando a proteína A2 recombinante foi testada frente aos mesmos soros, como descrito por Porrozzi et. al. (2007). Figura 3 - Reatividade do peptídeo 17 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640). Figura 4 - Reatividade do peptídeo 17 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos. Figura 5 - Reatividade do peptídeo 18 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640). Figura 6 - Reatividade do peptídeo 18 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos. Figura 7 - Reatividade do peptídeo 19 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640). Figura 8 - Reatividade do peptídeo 19 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos. Figura 9 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 17 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Figura 10 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 18 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Figura 11 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Figura 12 - Reatividade de combinações dos peptídeos 17 e 18 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Figura 13 - Reatividade de combinações dos peptídeos 17 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Figura 14 - Reatividade de combinações dos peptídeos 18 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Figura 15 - Dados das reações de ELISA, utilizando-se soro humano, em que os peptídeos foram testados isoladamente na quantidade de 4pg/poço. Figura 16 - Dados das reações de ELISA, utilizando-se soro humano, em que os peptídeos foram testados em associação.Brief Description of the Figures Figure 1 -
Na presente invenção foi feita uma combinação de peptídeos correspondentes a regiões com características ótimas para reatividade como epítopos para células B, selecionados a partir das sequências dos antígenos A2, NH e LACK de leishmania, empregando os critérios descritos na tabela 1. Tais peptídeos foram então testados, isoladamente ou em combinação, frente a soros de cães sintomáticos, assintomáticos e com baixos (< 1:320) e médios (1:320 > 1:640) títulos de anticorpos. Cabe ressaltar que foram empregados nessa análise os mesmos soros categorizados como provenientes de cães sintomáticos e assintomáticos testados previamente por Porrozzi et al. (2007), permitindo a comparação com os mesmos antígenos sob a forma de proteínas recombinantes. Os peptídeos foram testados também frente a soros humanos de pacientes diagnosticados com leishmaniose visceral e soros controle de indivíduos hígidos.In the present invention, a combination of peptides corresponding to regions with optimal characteristics for reactivity was made as epitopes for B cells, selected from the sequences of the A2, NH and LACK antigens of leishmania, using the criteria described in table 1. Such peptides were then tested, alone or in combination, against sera from symptomatic, asymptomatic dogs and with low (< 1:320) and medium (1:320 > 1:640) antibody titers. It is noteworthy that the same sera categorized as coming from symptomatic and asymptomatic dogs previously tested by Porrozzi et al. (2007), allowing comparison with the same antigens in the form of recombinant proteins. The peptides were also tested against human sera from patients diagnosed with visceral leishmaniasis and control sera from healthy individuals.
As sequências das proteínas A2 e LACK e NH foram submetidas a análise com programas disponíveis online no site http://www.expasv.orq/tools/protscale.html. Os programas aos quais as sequências foram submetidas geram gráficos e valores de scores que são considerados de acordo com as características ideais para a presença de epítopos de células B. A seleção das sequências sintetizadas como peptídeos com características de epítopos de células B obedeceu os seguintes critérios: Tabela 1- Critérios utilizados para seleção das sequências sintetizadas
A presente invenção será melhor descrita através dos exemplos a 10 seguir. Ressalta-se que esses exemplos não possuem a intenção de limitar a natureza da invenção, mas, ao contrário, ilustram e ajudam na compreensão da tecnologia.The present invention will be further described through the following examples. It is noteworthy that these examples are not intended to limit the nature of the invention, but rather illustrate and help to understand the technology.
Ainda, o teste para imunodiagnóstico de leishmaniose pode ser selecionado do grupo compreedendo ELISA, Western blot, dot blot, imunodifusão e imunocromatografia. Nos exemplos que se seguem foi utilizado o teste de ELISA. Exemplo 1Furthermore, the test for immunodiagnosis of leishmaniasis can be selected from the group comprising ELISA, Western blot, dot blot, immunodiffusion and immunochromatography. In the following examples the ELISA test was used. Example 1
Para testar a reatividade do peptídeo 47 como antígeno em testes de diagnóstico da leishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, de acordo com o protocolo descrito a seguir.To test the reactivity of
Placas de 96 poços (Flexible PVC Microplates, flat-bottom, BD Biosciences) foram sensibilizadas com o peptídeo sintético 47, derivado do antígeno A2, diluído em água. Foram testadas variações nas quantidades de peptídeo por poço, dependendo do ensaio (4 ou 1pg/poço ou ainda 0,5 ou 0,250 pg/poço). As placas foram mantidas em estufa até a secagem e depois na geladeira por 18 horas a 4 °C. As placas foram bloqueadas com PBS-2% caseína a 37 °C por 1 hora e incubadas com soros de cães na diluição de 1:100 por 1 hora a 37 °C. Anticorpos marcados com Peroxidase específicos para IgG canina (Sigma, USA) foram diluídos 1:5000 e adicionados aos poços por 1 hora a 37 °C. Após a lavagem das placas, foi adicionado o substrato cromogênico 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) em tampão citrato contendo peróxido de hidrogênio. As reações foram interrompidas pela adição de H2SO4 2N. A densidade ótica foi determinada a 450 nm em leitor de ELISA (BioRad, Model 2550, CA, USA).96-well plates (Flexible PVC Microplates, flat-bottom, BD Biosciences) were sensitized with
Através da figura 1 pode-se observar que 0 peptídeo foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos (>1:640), apresentando a alta sensibilidade e especificidade do peptídeo 47 frente soros de cães com altos títulos de anticorpos. Exemplo 2Through figure 1 it can be seen that the peptide was able to detect 100% of dogs with high antibody titers (>1:640), showing the high sensitivity and specificity of the
Observada a elevada reatividade do peptídeo 47 (4 pg/poço) com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640), verificou-se também a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et. al. (2007).Having observed the high reactivity of peptide 47 (4 pg/well) with sera from dogs with high antibody titers (> 1:640), it was also verified the possibility of it reacting with sera from symptomatic and asymptomatic dogs, but using a smaller amount of antigen (250 ng/well). It is noteworthy that the same sera used by Porrozzi et. al. (2007).
Na figura 2 observa-se que o peptídeo 47 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade apresentada quando a proteína A2 recombinante foi testada frente aos mesmos soros, como descrito por Porrozzi et. al. (2007). Exemplo 3Figure 2 shows that
Para testar a reatividade do peptídeo 17, derivado do antígeno nucleosídeo hidrolase (NH), como antígeno em testes de diagnóstico da leishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4pg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito no exemplo 1. Inicialmente o peptídeo 17 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorpos.To test the reactivity of
Na figura 3 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo foi capaz de detectar 80% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptídeo 17 com soros de cães com altos títulos de anticorpos. Exemplo 4Figure 3 shows that, under the conditions tested, the peptide was able to detect 80% of dogs with high antibody titers, with a high sensitivity of
Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando o peptídeo 17, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et. al. (2007).As high reactivity was observed with sera from dogs with high antibody titers (> 1:640) using
Na figura 4 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo 17 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade por outros testes de diagnóstico que com frequência não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos. Exemplo 5Figure 4 shows that, under the conditions tested,
Para testar a reatividade do peptídeo 18, derivado do antígeno nucleosídeo hidrolase (NH), como antígeno em testes de diagnóstico da leishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4pg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito no exemplo 1. Inicialmente o peptídeo 18 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorposTo test the reactivity of
Na figura 5 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo 18 foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptídeo 18 com soros de cães com altos títulos de anticorpos. Exemplo 6Figure 5 shows that, under the conditions tested,
Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando-se o peptídeo 18, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et. al. (2007).As high reactivity was observed with sera from dogs with high antibody titers (> 1:640) using
Na figura 6 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo 18 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade apresentada por outros testes de diagnóstico que, com frequência, não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos.Figure 6 shows that, under the conditions tested,
Exemplo 7 Para testar a reatividade do peptídeo 19, derivado do antígeno LACK, como antígeno em testes de diagnóstico da leishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4pg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito, no exemplo 1. Inicialmente o peptídeo 18 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorpos.Example 7 To test the reactivity of
Na figura 7 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo foi capaz de detectar 80% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptídeo 19 com soros de cães com altos títulos de anticorpos.Figure 7 shows that, under the conditions tested, the peptide was able to detect 80% of dogs with high antibody titers, with high sensitivity of
Exemplo 8 Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando-se o peptídeo 19, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et al. (2007).Example 8 Having observed high reactivity with sera from dogs with high antibody titers (> 1:640) using
Na figura 8 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo 19 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade por outros testes de diagnóstico que com frequência não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos.In figure 8 it is observed that, under the conditions tested,
Exemplo 9 Considerando que a detecção da infecção em cães com baixos títulos de anticorpos também é uma limitação de testes de diagnóstico que empregam os antígenos K39 e K26, como demonstrado por Porrozzi et al. (2007), os peptídeos 47 (derivado de A2), 17 e 18 (derivados de NH) e 19 (derivados de LACK) foram testados isoladamente ou em associação, com o intuito de aumentar a sensibilidade para soros de cães com títulos de anticorpos baixos ou médios. Esses soros são provenientes de animais com exame parasitológico positivo, mas com títulos de anticorpos baixos ou médios, como detectado na reação de imunofluorescência ou em ELISA com extrato antigênico de formas promastigotas do parasita, testes considerados convencionais para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina. Ressalta-se mais uma vez que, nessa faixa de detecção, os testes sorológicos empregando antígenos definidos como o K39 ou K26 têm limitações de sensibilidade.Example 9 Whereas detection of infection in dogs with low antibody titers is also a limitation of diagnostic tests employing K39 and K26 antigens, as demonstrated by Porrozzi et al. (2007), peptides 47 (derived from A2), 17 and 18 (derived from NH) and 19 (derived from LACK) were tested alone or in association, with the aim of increasing the sensitivity to dog sera with antibody titers low or medium. These sera come from animals with a positive parasitological test, but with low or medium antibody titers, as detected in the immunofluorescence reaction or in ELISA with antigenic extract of promastigote forms of the parasite, tests considered conventional for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. It is noteworthy once again that, in this detection range, serological tests using defined antigens such as K39 or K26 have sensitivity limitations.
Nas figuras 9, 10, 11, 12, 13 e 14 comparam-se os resultados dos testes realizados com os peptídeos 47, 17, 18 e 19 isoladamente ou associados 2 a 2. Cabe mencionar que associações desses peptídeos 3 a 3 não resultaram em dados expressivos, uma vez que quando associados 2 a 2 o limite máximo de sensibilidade do teste foi atingido.Figures 9, 10, 11, 12, 13 and 14 compare the results of tests performed with
A figura 9 compara a reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 17 (500 ng/poço) frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Esses soros são provenientes de animais com exame parasitológico positivo, mas com títulos de anticorpos baixos ou médios, como detectado na reação de imunofluorescência ou em ELISA com extrato antigênico de formas promastigotas do parasita, testes considerados convencionais para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina. Ressalta-se mais uma vez que, nessa faixa de detecção, os testes sorológicos empregando antígenos definidos como o K39 ou K26 têm limitações de sensibilidade. Observa-se que, nessas condições, a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 17 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 9 compares the reactivity of combinations of
Na figura 10 observa-se que a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 18 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 10 shows that the association of
Na figura 11 observa-se que, a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 11 shows that the association of
Na figura 12 observa-se que, a associação do peptídeo 17 com o peptídeo 18 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 12 shows that the association of
Na figura 13 observa-se que, a associação do peptídeo 17 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 13 shows that the association of
Na figura 14 observa-se que, a associação do peptídeo 18 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço. Exemplo 10Figure 14 shows that the association of
Os peptídeos 47, 17, 18 e 19 foram empregados também em reações de ELISA com soros humanos de pacientes com diagnóstico de leishmaniose visceral, tendo como controles soros de indivíduos hígidos. Na figura 15, são apresentados os dados das reações de ELISA em que os peptídeos foram testados isoladamente na quantidade de 4pg/poço. Isoladamente, os peptídeos 17, 18, 19 e 47 apresentaram sensibilidade de 86,6%, 96,6%, 100% e 90%, respectivamente. Esses valores são próximos ou superiores à sensibilidade relatada para testes de diagnóstico da LV humana, tais como as técnicas RIFI (imunofluorescência indireta) (88%), ELISA L. (L.) chagasi 92%, empregando antígenos de formas promastigotas do parasita ou a ELISA empregando o antígeno recombinante rK39 (97%) ou para o teste imunocromatográfico rápido IT-LEISH® (DiaMed IT-LEISH®) (93%) que também emprega o K39 (Machado de Assis et. al., 2008)
Na figura 16, são apresentados os dados das reações de ELISA em que os peptídeos foram testados em associação. Observa-se aumento de sensibilidade quando o peptídeo 19 foi associado aos peptídeos 47 e 18, alcançando um valor de 100%. Embora o valor de 100% de sensibilidade tenha sido alcançado nos testes em que o peptídeo 19 foi avaliado isoladamente, a sua associação melhorou a sensibilidade do testes empregando os peptídeos 47 e 18, os quais, isoladamente, apresentaram 90 e 96,6% de sensibilidade. 5 Para as outras associações não foram observadas alterações significativas. Considerando a heterogeneidade da condição clínica dos pacientes e da resposta imune humoral dos mesmos, a associação de peptídeos pode ser uma alternativa para o aprimoramento de testes de diagnóstico, uma vez que epítopos adicionais são acrescentados aos testes sorológicos. Esses 10 resultados demonstram a capacidade dos peptídeos testados de otimizar a sensibilidade dos testes para detecção de leishmaniose visceral humana.Figure 16 shows the data of the ELISA reactions in which the peptides were tested in association. An increase in sensitivity is observed when
Claims (18)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI1005033-7A BRPI1005033B1 (en) | 2010-12-13 | 2010-12-13 | RECOMBINANT PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR IMMUNODIAGNOSIS TESTING OF VISCERAL LEISHMANIASIS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI1005033-7A BRPI1005033B1 (en) | 2010-12-13 | 2010-12-13 | RECOMBINANT PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR IMMUNODIAGNOSIS TESTING OF VISCERAL LEISHMANIASIS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI1005033A2 BRPI1005033A2 (en) | 2013-04-02 |
| BRPI1005033B1 true BRPI1005033B1 (en) | 2021-05-04 |
Family
ID=47989453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI1005033-7A BRPI1005033B1 (en) | 2010-12-13 | 2010-12-13 | RECOMBINANT PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR IMMUNODIAGNOSIS TESTING OF VISCERAL LEISHMANIASIS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BR (1) | BRPI1005033B1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR102013033627B1 (en) * | 2013-12-27 | 2021-02-09 | Universidade Federal De Minas Gerais | synthetic peptides, method and kit for immunodiagnosis of canine visceral leishmaniasis and human cutaneous and visceral leishmaniasis |
| WO2023077206A1 (en) * | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Universidade Federal Do Rio De Janeiro - Ufrj | Genetically modified epitopes and multiepitope proteins, immunogenic compositions and use thereof |
-
2010
- 2010-12-13 BR BRPI1005033-7A patent/BRPI1005033B1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI1005033A2 (en) | 2013-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dellagi | Comparative evaluation of ELISAs based on ten recombinant or purified Leishmania antigens for the serodiagnosis of Mediterranean visceral leishmaniasis | |
| Ryan et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay based on soluble promastigote antigen detects immunoglobulin M (IgM) and IgG antibodies in sera from cases of visceral and cutaneous leishmaniasis | |
| Holec-Gasior et al. | GRA2 and ROP1 recombinant antigens as potential markers for detection of Toxoplasma gondii-specific immunoglobulin G in humans with acute toxoplasmosis | |
| US20070092938A1 (en) | Diagnostics for sars virus | |
| ES2647764T3 (en) | Improved vaccination diagnoses | |
| CN111751553A (en) | Detection method and application of H protein antibody of Peste des petits ruminants virus by iELISA | |
| Tsuruoka et al. | Evaluation of IgG ELISA using N-lauroyl-sarcosine–soluble proteins of Bartonella henselae for highly specific serodiagnosis of cat scratch disease | |
| CN107727854A (en) | A kind of avian infectious bronchitis virus protein chip antibody assay kit and its application | |
| BRPI1005033B1 (en) | RECOMBINANT PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR IMMUNODIAGNOSIS TESTING OF VISCERAL LEISHMANIASIS | |
| Bostock et al. | Characterisation of the European seal morbillivirus | |
| Jameie et al. | Detection of leishmania infantum infection in reservoir dogs using a multiepitope recombinant protein (PQ10) | |
| Lauricella et al. | An rK28-based immunoenzymatic assay for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in Latin America | |
| BRPI1013447B1 (en) | recombinant peptides, method and kit for immunodiagnostic testing of leishmaniasis | |
| Farahmand et al. | Assessment of recombinant A2-Latex Agglutination Test (RA2-LAT) and RA2-ELISA for detection of canine visceral Leishmaniasis: a comparative field study with direct agglutination test in Northwestern Iran | |
| US9290548B2 (en) | Proteins used for the diagnosis of lyme borreliosis | |
| CN102221619A (en) | ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) detection method and kit of cryptosporidium virus capsid protein antibody | |
| Ramírez et al. | The laboratory diagnosis in Toxoplasma infection | |
| BR102013013069B1 (en) | method, kit for immunodiagnostic test of canine visceral leishmaniasis and vaccine | |
| US7740859B2 (en) | Polypeptides for the diagnosis and therapy of Leishamaniasis | |
| CN113391067A (en) | Indirect ELISA detection method of anti-nipah virus G protein antibody | |
| BRPI0903089A2 (en) | recombinant peptides and leishmania antigens mimetic protein motifs and their applications | |
| BR102023011888A2 (en) | Synthetic peptides from Leishmania infantum in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis and uses. | |
| BR102022010287A2 (en) | SYNTHETIC PEPTIDES, RUBELLA DIAGNOSIS METHOD AND KIT, AND USE | |
| Toma | Serological Diagnosis of Aujeszky’s Disease Using Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) | |
| BR102022013918A2 (en) | RECOMBINANT HISTONE DEACETYLASES FROM LEISHMANIA SPP., DIAGNOSTIC KIT AND USES |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B03H | Publication of an application: rectification [chapter 3.8 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A RPI 2204 DE 02/04/2013, QUANTO AO ITEM (72). |
|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS. |
|
| B07G | Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06A | Notification to applicant to reply to the report for non-patentability or inadequacy of the application [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 13/12/2010, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME MEDIDA CAUTELAR DE 07/04/2021 - ADI 5.529/DF |