BRPI0922174B1 - USE OF A TOPICAL PHARMACEUTICAL PREPARATION COMPRISING BLOOD MONONUCLEAR CELL CULTURE SUPERNATE - Google Patents
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Abstract
PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UMA PREPARAÇÃO, E, MÉTODO PARAPREPARAR UMA PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA A presente invenção diz respeito a umapreparação farmacêutica tópica para tratar condição inflamatória da pele, preferivelmente uma condiçãoassociada com isquemia, que compreende um sobrenadante de uma solução fisiológica obtenível pelocultivo de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) ou um subconjunto dos mesmos emuma solução fisiológica isenta de substâncias proliferadoras de PBMC e ativadoras de PBMC por pelomenos 1 hora.PHARMACEUTICAL PREPARATION, USE OF A PREPARATION, AND METHOD FOR PREPARING A PHARMACEUTICAL PREPARATION The present invention relates to a topical pharmaceutical preparation for treating an inflammatory skin condition, preferably a condition associated with ischemia, comprising a supernatant of a physiological solution obtainable by culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or a subset thereof in a physiological solution free of PBMC proliferating and PBMC activating substances for at least 1 hour.
Description
[001] A presente invenção diz respeito a uma preparação farmacêutica para o tratamento de condições inflamatórias de pele internas, preferivelmente condições de pele internas associadas com isquemia.[001] The present invention relates to a pharmaceutical preparation for the treatment of internal inflammatory skin conditions, preferably internal skin conditions associated with ischemia.
[002] Hipoxia, um estado de oxigênio reduzido, pode ocorrer quando os pulmões estão comprometidos ou o fluxo sanguíneo é reduzido. Isquemia, redução no fluxo sanguíneo, pode ser causada pela obstrução de uma artéria ou veia por um coágulo sanguíneo (trombo) ou por qualquer matéria circulante estranha (êmbolo) ou por um distúrbio vascular, tal como aterosclerose. A redução no fluxo sanguíneo pode ter um início súbito e duração curta (isquemia aguda) ou pode ter um início lento com longa duração ou recorrência frequente (isquemia crônica). Isquemia aguda é frequentemente associada com necrose de tecido irreversível regional (um infarto), visto que a isquemia crônica está usualmente associada com dano de tecido hipóxico transitório. Se a diminuição na perfusão for prolongada ou grave, entretanto, isquemia crônica também pode estar associada com um infarto. Os infartos ocorrem comumente no baço, rim, pulmões, cérebro, coração, produzindo distúrbios, tais como infarto intestinal, infarto pulmonar, acidente vascular periférico isquêmico e infarto do miocárdio.[002] Hypoxia, a state of reduced oxygen, can occur when the lungs are compromised or blood flow is reduced. Ischemia, a reduction in blood flow, may be caused by obstruction of an artery or vein by a blood clot (thrombus) or by foreign matter (embolus) or by a vascular disorder such as atherosclerosis. The reduction in blood flow may have a sudden onset and short duration (acute ischemia) or may have a slow onset with long duration or frequent recurrence (chronic ischemia). Acute ischemia is often associated with irreversible regional tissue necrosis (an infarction), whereas chronic ischemia is usually associated with transient hypoxic tissue damage. If the decrease in perfusion is prolonged or severe, however, chronic ischemia may also be associated with an infarction. Infarctions commonly occur in the spleen, kidney, lungs, brain, and heart, producing disorders such as intestinal infarction, pulmonary infarction, ischemic peripheral vascular accident, and myocardial infarction.
[003] As mudanças patológicas em distúrbios isquêmicos dependem da duração e da gravidade da isquemia e na duração da sobrevivência do paciente. A necrose pode ser vista no infarto nas primeiras 24 horas e uma resposta inflamatória aguda desenvolve-se no tecido adjacente viável ao infarto com leucócitos que migram da área de tecido morto. Em dias que sucedem, existe uma quebra gradual e remoção de células no infarto por fagocitose e substituição com colágeno ou cicatriz glial.[003] The pathological changes in ischemic disorders depend on the duration and severity of the ischemia and the length of survival of the patient. Necrosis may be seen in the infarct within the first 24 hours and an acute inflammatory response develops in the viable tissue adjacent to the infarct with leukocytes migrating from the area of dead tissue. Over the next few days, there is a gradual breakdown and removal of cells in the infarct by phagocytosis and replacement with collagen or glial scar.
[004] A hipoperfusão ou infarto em um órgão frequentemente afeta outros órgãos. Por exemplo, isquemia do pulmão causada por, por exemplo, um embolismo pulmonar, não afeta apenas o pulmão, mas também coloca o coração e outros órgãos, tais como o cérebro, sob tensão hipóxica. Infarto do miocárdio, que frequentemente envolve bloqueio da artéria coronária devido à trombose, vasoespasmos da parede arterial ou infecção viral do coração, pode levar à insuficiência cardíaca congestiva e hipotensão sistêmica. As complicações secundárias, tais como encefalopatia isquêmica secundária podem se desenvolver se o impedimento cardíaco for prolongado por hipoperfusão contínua. A isquemia cerebral, mais comumente causada pela oclusão vascular devido à aterosclerose, pode variar em gravidade de ataques isquêmicos transitórios (TIAs) ao infarto cerebral ou acidente vascular periférico. Enquanto os sintomas de TIAs são temporários e reversíveis, TIAs tendem a recorrer e são frequentemente seguidos por um acidente vascular periférico.[004] Hypoperfusion or infarction in one organ often affects other organs. For example, ischemia of the lung caused by, for example, a pulmonary embolism, not only affects the lung but also places the heart and other organs, such as the brain, under hypoxic stress. Myocardial infarction, which often involves coronary artery blockage due to thrombosis, vasospasm of the arterial wall, or viral infection of the heart, can lead to congestive heart failure and systemic hypotension. Secondary complications such as secondary ischemic encephalopathy may develop if cardiac impediment is prolonged by continued hypoperfusion. Cerebral ischemia, most commonly caused by vascular occlusion due to atherosclerosis, can range in severity from transient ischemic attacks (TIAs) to cerebral infarction or peripheral vascular accident. While the symptoms of TIAs are temporary and reversible, TIAs tend to recur and are often followed by peripheral vascular accident.
[005] A doença arterial oclusiva inclui doença da artéria coronária, que pode levar à infarto do miocárdio e doença arterial periférica, que pode afetar a aorta abdominal, suas ramificações principais e artérias das pernas. A doença arterial periférica inclui doença de Buerger, doença de Raynaud e acrocianose. Embora a doença arterial periférica seja comumente causada por aterosclerose, outras causas principais incluem, por exemplo, as causas principais incluem, por exemplo, diabetes, etc. As complicações associadas com a doença arterial periférica incluem câimbras severas nas pernas, angina, ritmos cardíacos anormais, insuficiência cardíaca, acidente vascular periférico e insuficiência renal.[005] Occlusive arterial disease includes coronary artery disease, which can lead to myocardial infarction, and peripheral arterial disease, which can affect the abdominal aorta, its main branches, and arteries of the legs. Peripheral arterial disease includes Buerger's disease, Raynaud's disease, and acrocyanosis. Although peripheral arterial disease is commonly caused by atherosclerosis, other major causes include, for example, the major causes include, for example, diabetes, etc. Complications associated with peripheral arterial disease include severe leg cramps, angina, abnormal heart rhythms, heart failure, peripheral vascular accident, and renal failure.
[006] Os distúrbios isquêmicos e hipóxicos são uma causa principal de morbidez e mortalidade. As doenças cardiovasculares são responsáveis por 30 % das mortes no mundo todo. Entre as várias doenças cardiovasculares, doença cardíaca isquêmica e doenças cerebrovasculares causam aproximadamente 17 % das mortes.[006] Ischemic and hypoxic disorders are a major cause of morbidity and mortality. Cardiovascular diseases account for 30% of deaths worldwide. Among the various cardiovascular diseases, ischemic heart disease and cerebrovascular diseases cause approximately 17% of deaths.
[007] Correntemente, o tratamento de distúrbios isquêmicos e hipóxicos está focalizado no alívio de sintomas e tratamento de distúrbios causadores. Por exemplo, os tratamentos para infarto do miocárdio incluem nitroglicerina e analgésicos para controlar a dor e aliviar a carga de trabalho do coração. Outras medicações incluindo, digoxina, diuréticos, amrinona, beta- bloqueadores, agentes redutores de lipídeo e inibidores de enzima que convertem angiotensina, são usados para estabilizar a condição, mas nenhuma destas terapias indicam diretamente o dano do tecido produzido pela isquemia e hipoxia.[007] Currently, treatment of ischemic and hypoxic disorders focuses on relieving symptoms and treating the causative disorders. For example, treatments for myocardial infarction include nitroglycerin and analgesics to control pain and relieve the workload of the heart. Other medications, including digoxin, diuretics, amrinone, beta-blockers, lipid-lowering agents, and angiotensin-converting enzyme inhibitors, are used to stabilize the condition, but none of these therapies directly address the tissue damage produced by ischemia and hypoxia.
[008] Devido a deficiências em tratamentos correntes, permanece uma necessidade quanto a métodos que eficazes no tratamento de condições que envolvem hipoxia. Também existe uma necessidade quanto a métodos eficazes na prevenção de dano de tecido causado por isquemia que ocorre devido a, por exemplo, aterosclerose, diabetes e distúrbios pulmonares.[008] Due to deficiencies in current treatments, there remains a need for methods that are effective in treating conditions involving hypoxia. There is also a need for methods that are effective in preventing tissue damage caused by ischemia that occurs due to, for example, atherosclerosis, diabetes, and pulmonary disorders.
[009] As condições associadas com isquemia e hipoxia são usualmente acompanhadas por inflamação. Portanto, também são necessários meios e métodos que reduzam a inflamação.[009] Conditions associated with ischemia and hypoxia are usually accompanied by inflammation. Therefore, means and methods that reduce inflammation are also needed.
[0010] É um objetivo da presente invenção fornecer meios que permitam o tratamento eficaz de condições inflamatórias internas, preferivelmente condições associadas com isquemia.[0010] It is an object of the present invention to provide means that allow the effective treatment of internal inflammatory conditions, preferably conditions associated with ischemia.
[0011] A presente invenção diz respeito a uma preparação farmacêutica tópica para o tratamento de uma condição inflamatória da pele, preferivelmente uma condição de pele associada com isquemia, que compreende um sobrenadante de uma solução fisiológica obtenível pelo cultivo de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) ou um subconjunto dos mesmos em uma solução fisiológica isenta de substâncias proliferadoras de PBMC e ativadoras de PBMC por pelo menos 1 hora.[0011] The present invention relates to a topical pharmaceutical preparation for the treatment of an inflammatory skin condition, preferably a skin condition associated with ischemia, comprising a supernatant of a physiological solution obtainable by culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or a subset thereof in a physiological solution free of PBMC proliferating and PBMC activating substances for at least 1 hour.
[0012] É confirmado que a administração de uma preparação farmacêutica como definido acima a um paciente que sofre de uma condição inflamatória interna, preferivelmente uma condição interna associada com isquemia, resulta em um alívio dos sintomas respectivos e em um processo de cura.[0012] It is confirmed that the administration of a pharmaceutical preparation as defined above to a patient suffering from an internal inflammatory condition, preferably an internal condition associated with ischemia, results in a relief of the respective symptoms and in a healing process.
[0013] A preparação farmacêutica da presente invenção compreende PBMCs cultivados ou um subconjunto dos mesmos e/ou o sobrenadante em que os PBMCs foram cultivados. No curso do cultivo de PBMCs estas células expressam e secretam substâncias como citocinas que diferem daquelas expressadas e secretadas em PBMCs ativados. Isto significa que o secretoma de PBMCs da presente invenção é diferente do secretoma de PBMCs ativados. As células da presente invenção sofrem uma produção de secretoma disparada pela porção que não de célula de superfície. Portanto, é surpreendente que os PBMCs que não foram contatados com substâncias ativadoras de PBMC como PHA ou LPS pode ser utilizado para tratar condições inflamatórias internas, em particular condições isquêmicas, que permitem que o secretoma destas células compreendam substancias que suportem o tratamento de tais condições ou similares.[0013] The pharmaceutical preparation of the present invention comprises cultured PBMCs or a subset thereof and/or the supernatant in which the PBMCs have been cultured. In the course of culturing PBMCs these cells express and secrete substances such as cytokines that differ from those expressed and secreted in activated PBMCs. This means that the secretome of PBMCs of the present invention is different from the secretome of activated PBMCs. The cells of the present invention undergo secretome production triggered by the non-cell surface portion. It is therefore surprising that PBMCs that have not been contacted with PBMC-activating substances such as PHA or LPS can be used to treat internal inflammatory conditions, in particular ischemic conditions, allowing the secretome of these cells to comprise substances that support the treatment of such or similar conditions.
[0014] O sobrenadante de PBMC de acordo com a presente invenção é obtenível pelo cultivo destes em uma solução fisiológica que não compreende substâncias proliferadoras de PBMC e ativadoras de PBMC. Entretanto, os PBMCs são incubados na solução fisiológica por pelo menos 1 hora. Este tempo mínimo de cultivo é requerido para deixar que os PBMCs secretem citocinas e outras substâncias benéficas.[0014] The PBMC supernatant according to the present invention is obtainable by culturing them in a physiological solution that does not comprise PBMC proliferating and PBMC activating substances. However, the PBMCs are incubated in the physiological solution for at least 1 hour. This minimum cultivation time is required to allow the PBMCs to secrete cytokines and other beneficial substances.
[0015] Os PBMCs partem da preparação de acordo com a presente invenção podem ser obtidos do sangue total usando-se métodos conhecidos na técnica, tais como o gradiente Ficoll, lise hipotônica etc.. Estes métodos são bem conhecidos na técnica.[0015] PBMCs starting from the preparation according to the present invention can be obtained from whole blood using methods known in the art, such as Ficoll gradient, hypotonic lysis, etc. These methods are well known in the art.
[0016] Os PBMCs da preparação farmacêutica podem ser obtidos a partir de um grupo de doadores ou do mesmo indivíduo ao qual a preparação será administrada.[0016] The PBMCs of the pharmaceutical preparation may be obtained from a pool of donors or from the same individual to whom the preparation will be administered.
[0017] A solução fisiológica cujo sobrenadante é obtido compreende pelo menos 500, preferivelmente pelo menos 1000, mais preferivelmente pelo menos 105 ainda mais preferivelmente pelo menos 106, células por ml de solução ou por unidade de dosagem.[0017] The physiological solution whose supernatant is obtained comprises at least 500, preferably at least 1000, more preferably at least 105 even more preferably at least 106, cells per ml of solution or per dosage unit.
[0018] “Solução fisiológica”, como usado neste, refere-se a uma solução líquida em que PBMCs são cultivados antes do seu uso na preparação farmacêutica de acordo com a presente invenção.[0018] “Physiological solution”, as used herein, refers to a liquid solution in which PBMCs are cultured prior to their use in the pharmaceutical preparation according to the present invention.
[0019] “Solução fisiológica” refere-se a uma solução que não leva à morte de PBMCs dentro de uma hora, preferivelmente dentro de 30 minutos. Se o número de PBMCs viáveis for decrescente em uma solução por 75 %, mais preferivelmente por 90 % dentro de uma hora, preferivelmente dentro 30 minutos, uma solução não é considerada ser uma “solução fisiológica” como definido neste. A “solução fisiológica” não leva a uma lise espontânea de PBMCs quando contatado com a dita solução.[0019] “Physiological solution” refers to a solution that does not lead to the death of PBMCs within one hour, preferably within 30 minutes. If the number of viable PBMCs is decreased in a solution by 75%, more preferably by 90% within one hour, preferably within 30 minutes, a solution is not considered to be a “physiological solution” as defined herein. The “physiological solution” does not lead to a spontaneous lysis of PBMCs when contacted with said solution.
[0020] Neste contexto, a etapa de “cultivo” ou “cultura” compreende ou consiste da etapa de “incubar”, uma etapa em que as células são contatadas com uma solução por um período definido (pelo menos 1 h, preferivelmente pelo menos 4 h, mais preferivelmente pelo menos 8 h, ainda mais preferivelmente pelo menos 12 h) sob condições que são regularmente usadas para o cultivo de PBMCs.[0020] In this context, the “cultivation” or “culture” step comprises or consists of the “incubation” step, a step in which the cells are contacted with a solution for a defined period (at least 1 h, preferably at least 4 h, more preferably at least 8 h, even more preferably at least 12 h) under conditions that are regularly used for the cultivation of PBMCs.
[0021] O termo “condição de pele associada com isquemia” no contexto da presente invenção pode ser usado de maneira intercambeável com o termo “condições isquêmicas de pele” e indica qualquer condição, doença ou distúrbio em que as regiões do corpo humano ou animal são privadas de fornecimento de oxigênio adequado resultante de dano ou de disfunção de tecido. Uma condição patológica pode ser caracterizada pela redução ou abolição de fornecimento de sangue dentro de um órgão ou parte de um órgão, que pode ser causado pela constrição ou obstrução de um vaso sanguíneo. Tais condições são coletivamente referidas aqui pelo termo “isquemia” ou “condições relacionadas com isquemia da pele” ou “condição de pele relacionada com isquemia”. Na doença cardíaca, por exemplo, isquemia é frequentemente usada para descrever o músculo cardíaco que não está conseguindo a quantidade apropriada de sangue rico em oxigênio por causa de artérias coronárias estreitadas ou bloqueadas. Os sintomas de isquemia dependem do órgão que é “isquêmico”. Com o coração, isquemia frequentemente resulta em angina do peito. No cérebro, isquemia pode resultar em um acidente vascular periférico. As condições de isquemia são acompanhadas por inflamação.[0021] The term “skin condition associated with ischemia” in the context of the present invention may be used interchangeably with the term “ischemic skin conditions” and indicates any condition, disease or disorder in which regions of the human or animal body are deprived of adequate oxygen supply resulting from tissue damage or dysfunction. A pathological condition may be characterized by the reduction or abolition of blood supply within an organ or part of an organ, which may be caused by the constriction or obstruction of a blood vessel. Such conditions are collectively referred to herein by the term “ischemia” or “ischemia-related conditions of the skin” or “ischemia-related skin condition”. In heart disease, for example, ischemia is often used to describe the heart muscle not getting the appropriate amount of oxygen-rich blood because of narrowed or blocked coronary arteries. The symptoms of ischemia depend on the organ that is “ischemic”. With the heart, ischemia often results in angina pectoris. In the brain, ischemia can result in a peripheral vascular accident. Ischemia conditions are accompanied by inflammation.
[0022] Os exemplos não limitantes para condições de pele patológicas que dizem respeito a inflamação, em particular à isquemia, incluem ferimentos, ferimentos crônicos, ferimentos diabéticos, úlcera da pele, psoríase etc.[0022] Non-limiting examples of pathological skin conditions involving inflammation, in particular ischemia, include wounds, chronic wounds, diabetic wounds, skin ulcers, psoriasis, etc.
[0023] Apesar do acima, a condição patológica no contexto da invenção pode ser caracterizada por dano ou disfunção de células endoteliais, isto é, ferimento. Os exemplos não limitantes de ferimentos que podem ser tratados pelo uso da preparação de acordo com a presente invenção são ferimentos crônicos, ferimentos diabéticos, úlceras, queimaduras, doença de pele inflamatória e doença intestinal.[0023] Notwithstanding the above, the pathological condition in the context of the invention may be characterized by damage or dysfunction of endothelial cells, i.e. wounding. Non-limiting examples of wounds that may be treated by use of the preparation according to the present invention are chronic wounds, diabetic wounds, ulcers, burns, inflammatory skin disease and intestinal disease.
[0024] “Solução fisiológica”, como usado aqui, refere-se a uma solução que apresenta uma pressão osmótica que não leva à destruição dos PBMCs ou subconjuntos dos mesmos e pode ser administrada diretamente a um indivíduo.[0024] “Saline solution,” as used herein, refers to a solution that exhibits an osmotic pressure that does not lead to the destruction of PBMCs or subsets thereof and can be administered directly to an individual.
[0025] O termo “isento de substâncias proliferadoras de PBMC e ativadoras de PBMC” refere-se a uma solução fisiológica que não compreende substâncias que ativam PBMCs e induzem a proliferação de PBMCs ou subconjuntos dos mesmos. Estas substancias incluem PHA, LPS etc..[0025] The term “free of PBMC proliferating and PBMC activating substances” refers to a saline solution that does not comprise substances that activate PBMCs and induce the proliferation of PBMCs or subsets thereof. Such substances include PHA, LPS, etc.
[0026] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a doença de pele inflamatória é selecionada do grupo que consiste de inflamação, inflamação induzida por hipoxia e doença autoimune, preferivelmente psoríase, acne, rosácea, pioderma gangrenoso, dermatite, doença de pele atópica, dermatite de contato, dermatite seborreica, eritema nodoso, infecções, doença de pele causada por infestações bacterianas, virais, fúngicas, infestações parasíticas, picadas, mordidas e urticária e condições de pele associadas com isquemia. As condições de pele particularmente preferidas são condições de pele associadas com isquemia.[0026] According to a preferred embodiment of the present invention the inflammatory skin disease is selected from the group consisting of inflammation, hypoxia-induced inflammation and autoimmune disease, preferably psoriasis, acne, rosacea, pyoderma gangrenosum, dermatitis, atopic skin disease, contact dermatitis, seborrheic dermatitis, erythema nodosum, infections, skin disease caused by bacterial, viral, fungal infestations, parasitic infestations, bites, stings and urticaria and skin conditions associated with ischemia. Particularly preferred skin conditions are skin conditions associated with ischemia.
[0027] De acordo com uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção a condição de pele associada com isquemia é selecionada do grupo que consiste de ferimentos, isquemia de tecido, ferimentos crônicos, ferimentos diabéticos, úlcera da pele, queimaduras de pele, enxertos de pele na cirurgia plástica e regeneração de tecido após enxerto dentário.[0027] According to a particularly preferred embodiment of the present invention the skin condition associated with ischemia is selected from the group consisting of wounds, tissue ischemia, chronic wounds, diabetic wounds, skin ulcer, skin burns, skin grafts in plastic surgery and tissue regeneration after dental grafting.
[0028] O sub-grupo de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) é preferivelmente células T, células B ou células NK. É claro, também é possível usar combinações destas células; células T e células B; células T e células NK; células B e células NK; células T, células B e células NK. Os métodos para fornecer e isolar as ditas células são conhecidos.[0028] The subset of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) is preferably T cells, B cells or NK cells. Of course, it is also possible to use combinations of these cells; T cells and B cells; T cells and NK cells; B cells and NK cells; T cells, B cells and NK cells. Methods for providing and isolating said cells are known.
[0029] É surpreendentemente observado que os PBMCs da presente invenção podem ser cultivados em qualquer tipo de solução contanto que a dita solução não compreenda substâncias que não sejam farmaceuticamente aceitáveis, levam a uma morte imediata dos PBMCs, ativam os PBMCs e estimulam a proliferação de PBMCs (como definido acima). Portanto, a solução a ser usada pelo menos apresenta propriedades osmóticas que não levam à lise dos PBMCs. a solução fisiológica é preferivelmente uma solução salina fisiológica, preferivelmente uma solução de NaCl fisiológica, sangue total, uma fração sanguínea, preferivelmente soro ou um meio de cultura celular.[0029] It is surprisingly observed that the PBMCs of the present invention can be cultured in any type of solution as long as said solution does not comprise substances that are not pharmaceutically acceptable, lead to an immediate death of the PBMCs, activate the PBMCs and stimulate the proliferation of PBMCs (as defined above). Therefore, the solution to be used at least presents osmotic properties that do not lead to the lysis of the PBMCs. The physiological solution is preferably a physiological saline solution, preferably a physiological NaCl solution, whole blood, a blood fraction, preferably serum or a cell culture medium.
[0030] O meio de cultura celular é preferivelmente selecionado do grupo que consiste de RPMI, DMEM, X-vivo e Ultraculture.[0030] The cell culture medium is preferably selected from the group consisting of RPMI, DMEM, X-vivo and Ultraculture.
[0031] De acordo com uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção, as células da presente invenção são cultivadas sob condições indutoras de tensão.[0031] According to a particularly preferred embodiment of the present invention, the cells of the present invention are cultured under stress-inducing conditions.
[0032] O termo “sob condições indutoras de tensão”, como usado neste, refere-se às condições de cultivo que levam á células submetidas à tensão. As condições que causam tensão às células incluem, entre outros calor, produtos químicos, radiação, hipoxia, pressão osmótica (isto é condições osmóticas não fisiológicas) etc.[0032] The term “under stress-inducing conditions,” as used herein, refers to culture conditions that cause cells to be subjected to stress. Conditions that cause stress to cells include, but are not limited to, heat, chemicals, radiation, hypoxia, osmotic pressure (i.e. non-physiological osmotic conditions), etc.
[0033] A tensão adicional às células da presente invenção levam a um aumento adicional da expressão e da secreção de substâncias benéficas para o tratamento das condições inflamatórias internas, preferivelmente condições internas associadas com isquemia.[0033] The additional stress to the cells of the present invention leads to a further increase in the expression and secretion of substances beneficial for the treatment of internal inflammatory conditions, preferably internal conditions associated with ischemia.
[0034] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção as condições indutoras de tensão incluem hipoxia, ozônio, calor (por exemplo, mais do que 2° C, preferivelmente mais do que 5° C, mais preferivelmente mais do que 10° C, maior do que a temperatura de cultivo ótima de PBMCs, isto é 37° C), radiação (por exemplo, radiação por UV, radiação gama), produtos químicos, pressão osmótica (isto é, condições osmóticas que elevadas pelo menos 10 em comparação com condições osmóticas que ocorrem regularmente em um fluido corporal, em particular no sangue), mudança de pH ou combinações dos mesmos.[0034] According to a preferred embodiment of the present invention the stress-inducing conditions include hypoxia, ozone, heat (e.g., greater than 2° C., preferably greater than 5° C., more preferably greater than 10° C., greater than the optimum culturing temperature of PBMCs, i.e. 37° C.), radiation (e.g., UV radiation, gamma radiation), chemicals, osmotic pressure (i.e., osmotic conditions that are elevated by at least 10 compared to osmotic conditions that regularly occur in a body fluid, in particular in blood), pH change, or combinations thereof.
[0035] Se radiação for usada para submeter os PBMCs à tensão da presente invenção, as células são preferivelmente irradiadas com pelo menos 10 Gy, preferivelmente pelo menos 20 Gy, mais preferivelmente pelo menos 40 Gy, por meio do qual, como fonte, o Césio Cs-137 é preferivelmente usado De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção os PBMCs não ativados ou um subconjunto dos mesmos são cultivados em um meio por pelo menos 4 h, preferivelmente por pelo menos 6 h, mais preferivelmente por pelo menos 12 h.[0035] If radiation is used to subject the PBMCs to the stress of the present invention, the cells are preferably irradiated with at least 10 Gy, preferably at least 20 Gy, more preferably at least 40 Gy, whereby, as a source, Cesium Cs-137 is preferably used. According to a preferred embodiment of the present invention the non-activated PBMCs or a subset thereof are cultured in a medium for at least 4 h, preferably for at least 6 h, more preferably for at least 12 h.
[0036] A preparação farmacêutica de acordo com a presente invenção é topicamente administrada. Portanto, a dita preparação é preferivelmente fornecida como um gel, preferivelmente, hidrogel, como um unguento, como um emplastro dérmico, como uma matriz farmaceuticamente aceitável, preferivelmente em uma matriz de colágeno/elastina (ver, por exemplo, Haslik W et al. J Plast Reconst Aesth Burg (2008): 'Management of full- thickness skin defects in the hand and wrist region: first long-term experiences with the dermal matrix Matriderm”), como uma pasta, como um creme, como um pó, como um unguento ou como uma loção.[0036] The pharmaceutical preparation according to the present invention is topically administered. Therefore, said preparation is preferably provided as a gel, preferably hydrogel, as an ointment, as a dermal patch, as a pharmaceutically acceptable matrix, preferably in a collagen/elastin matrix (see, for example, Haslik W et al. J Plast Reconst Aesth Burg (2008): 'Management of full-thickness skin defects in the hand and wrist region: first long-term experiences with the dermal matrix Matriderm'), as a paste, as a cream, as a powder, as an ointment or as a lotion.
[0037] A preparação farmacêutica de acordo com a presente invenção pode compreender excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como diluentes, estabilizantes, carregadores, etc. Dependendo da via de administração, a preparação de acordo com a presente invenção é fornecida em uma forma de dosagem respectiva: solução de injeção, etc. Os métodos para a preparação dos mesmos são bem conhecidos pelos técnicos habilitados.[0037] The pharmaceutical preparation according to the present invention may comprise pharmaceutically acceptable excipients, such as diluents, stabilizers, carriers, etc. Depending on the route of administration, the preparation according to the present invention is provided in a respective dosage form: injection solution, etc. The methods for preparing the same are well known to the skilled artisan.
[0038] A fim de aumentar a vida de prateleira de uma preparação de acordo com a presente invenção a solução a) ou o sobrenadante b) é liofilizado. Os métodos para liofilizar tais preparações são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica.[0038] In order to increase the shelf life of a preparation according to the present invention the solution a) or the supernatant b) is lyophilized. Methods for lyophilizing such preparations are well known to the person skilled in the art.
[0039] Antes de seu uso, a preparação liofilizada pode ser contatada com água ou uma solução aquosa que compreende tampões, estabilizadores, sais etc..[0039] Before use, the lyophilized preparation may be contacted with water or an aqueous solution comprising buffers, stabilizers, salts, etc.
[0040] Um outro aspecto da presente invenção relates ao uso de uma preparação como definido acima para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição inflamatória da pele, em particular, uma condição de pele associada com isquemia.[0040] A further aspect of the present invention relates to the use of a preparation as defined above for the manufacture of a medicament for the treatment of an inflammatory skin condition, in particular a skin condition associated with ischemia.
[0041] Ainda, um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método para a preparação da preparação farmacêutica tópica como divulgado neste que compreende as etapas dea) fornecer células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) ou um subconjunto dos mesmos,b) cultivar as células da etapa a) em uma solução fisiológica isenta de substâncias proliferadoras de PBMC e ativadoras de PBMC por pelo menos 1 h,c) isolar o sobrenadante da etapa b) ed) preparar a preparação farmacêutica usando-se o sobrenadante da etapa c).[0041] Yet another aspect of the present invention relates to a method for preparing the topical pharmaceutical preparation as disclosed herein comprising the steps of a) providing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or a subset thereof, b) culturing the cells from step a) in a physiological solution free of PBMC proliferating and PBMC activating substances for at least 1 h, c) isolating the supernatant from step b) and d) preparing the pharmaceutical preparation using the supernatant from step c).
[0042] A preparação de acordo com a presente invenção pode ser obtida pela incubação ou cultura de PBMCs em uma solução fisiológica por pelo menos 1 h, preferivelmente pelo menos 4 h, mais preferivelmente pelo menos 8 h, ainda mais preferivelmente pelo menos 12 h. No curso desta etapa, os PBMCs começando a sintetizar e a secretar substâncias que são úteis no tratamento de condições inflamatórias internas. Antes, após e no curso da etapa de cultura, as células não são ativadas pela adição de substâncias ativadoras de PBMC como PHA ou LPS. Após a etapa de cultivo, as células e/ou o sobrenadante da cultura são isolados para ainda serem usados na preparação da preparação farmacêutica final. Como debatido acima, a preparação farmacêutica pode compreender PBMCs cultivados, o sobrenadante da cultura em que as ditas células foram incubadas ou ambos os PBMCs cultivados bem como o meio de cultura.[0042] The preparation according to the present invention can be obtained by incubating or culturing PBMCs in a physiological solution for at least 1 h, preferably at least 4 h, more preferably at least 8 h, even more preferably at least 12 h. In the course of this step, the PBMCs start to synthesize and secrete substances that are useful in the treatment of internal inflammatory conditions. Before, after and in the course of the culture step, the cells are not activated by the addition of PBMC-activating substances such as PHA or LPS. After the culture step, the cells and/or the culture supernatant are isolated to be further used in the preparation of the final pharmaceutical preparation. As discussed above, the pharmaceutical preparation can comprise cultured PBMCs, the culture supernatant in which said cells were incubated or both the cultured PBMCs as well as the culture medium.
[0043] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção as células são submetidas à condições indutoras de tensão antes ou no curso da etapa b), em que as ditas condições indutoras de tensão incluem hipoxia, ozônio, calor, radiação, produtos químicos, pressão osmótica (por exemplo, induzido pela adição do sal, em particular NaCl, a fim de dar uma pressão osmótica mais alta do que no sangue), mudança de pH (isto é, mudança de pH pela adição de ácidos ou hidróxidos para dar um valor de pH de 6,5 a 7,2 ou 7,5 a 8,0) ou combinações dos mesmos.[0043] According to a preferred embodiment of the present invention the cells are subjected to stress-inducing conditions before or in the course of step b), wherein said stress-inducing conditions include hypoxia, ozone, heat, radiation, chemicals, osmotic pressure (e.g. induced by the addition of salt, in particular NaCl, in order to give a higher osmotic pressure than in blood), pH change (i.e. pH change by the addition of acids or hydroxides to give a pH value of 6.5 to 7.2 or 7.5 to 8.0) or combinations thereof.
[0044] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção as células são irradiadas antes ou no curso da etapa b) com pelo menos 10 Gy, preferivelmente pelo menos 20 Gy, mais preferivelmente pelo menos 40 Gy, com ozônio, com temperatura elevada ou com radiação por UV.[0044] According to a preferred embodiment of the present invention the cells are irradiated before or in the course of step b) with at least 10 Gy, preferably at least 20 Gy, more preferably at least 40 Gy, with ozone, with elevated temperature or with UV radiation.
[0045] Um outro aspecto da presente invenção relates a uma preparação obtenível por um método como descrito acima.[0045] Another aspect of the present invention relates to a preparation obtainable by a method as described above.
[0046] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método para o tratamento de condições de pele inflamatória, em particular, as condições de pele associadas com isquemia pela administração, a uma indivíduo em necessidade deste, de uma quantidade apropriada de uma preparação farmacêutica de acordo com a presente invenção.[0046] A further aspect of the present invention relates to a method for treating inflammatory skin conditions, in particular skin conditions associated with ischemia by administering to a subject in need thereof an appropriate amount of a pharmaceutical preparation according to the present invention.
[0047] A presente invenção ainda é ilustrada pela seguintes figuras e exemplos, entretanto, sem estar restrito a este.[0047] The present invention is further illustrated by the following figures and examples, however, without being restricted to this.
[0048] A Fig. 1 mostra o efeito de sobrenadantes de cultura derivados de (PBMC) celular mononuclear de sangue periférico (SN) na migração celular em queratinócitos primários humanos (KC) e fibroblastos dérmicos (FB).[0048] Fig. 1 shows the effect of peripheral blood mononuclear cell (PBMC)-derived culture supernatants (SN) on cell migration in human primary keratinocytes (KC) and dermal fibroblasts (FB).
[0049] KC e FB foram desenvolvidos em meio de desenvolvimento KC e DMEM (suplementado com 1C) FBS), respectivamente. Após atingir a confluência, a monocamada celular foi raspada com uma ponta de pipeta e ainda cultivado com SN derivado de PBMC por 16 h. Pudemos apenas detectar pouco efeito de SN de PBMCs viventes (LL) em KC, visto que SN de PBMCs apoptóticos (APO) induzem fortemente a migração de KC. Em contraste ambos os SN (LL e APO) induziram fortemente a migração celular no FB dérmico.[0049] KC and FB were grown in KC growth medium and DMEM (supplemented with 1C FBS), respectively. After reaching confluence, the cell monolayer was scraped with a pipette tip and further cultured with PBMC-derived SN for 16 h. We could only detect little effect of SN from living PBMCs (LL) on KC, whereas SN from apoptotic PBMCs (APO) strongly induced KC migration. In contrast, both SN (LL and APO) strongly induced cell migration in dermal FB.
[0050] A Fig. 2 mostra o efeito de SN derivado de PBMC na progressão do ciclo celular de KC e FB.[0050] Fig. 2 shows the effect of PBMC-derived SN on the cell cycle progression of KC and FB.
[0051] A proliferação de KC e FB foi cultivada em SN derivado de PMBC. Após 24 horas, as células foram incubadas com BrdU por 2 h e ainda tratadas como indicado no manual do usuário (kit de ciclo celular de fluxo BrdU-FACS, BD Biosciences). Como mostrado na Fig. 2, o estímulo de FB com SN derivado de PMBC levaram a uma diminuição da proliferação da população celular por um aumento das células na fase G2/M. Em contraste, um aumento significante da proliferação de KC tanto com LL- e APO-SN foi observado. Entretanto, o efeito de SN derivado de células apoptóticas foi mais pronunciado em KC.[0051] Proliferating KC and FB were cultured in PMBC-derived SN. After 24 h, the cells were incubated with BrdU for 2 h and further treated as indicated in the user manual (BrdU-FACS flow cell cycle kit, BD Biosciences). As shown in Fig. 2, stimulation of FB with PMBC-derived SN led to a decrease in the proliferation of the cell population by an increase in cells in the G2/M phase. In contrast, a significant increase in the proliferation of KC with both LL- and APO-SN was observed. However, the effect of SN derived from apoptotic cells was more pronounced in KC.
[0052] A Fig. 3 mostra que o SN derivado de PBMC intensifica fortemente a cura de ferimento in vivo.[0052] Fig. 3 shows that PBMC-derived SN strongly enhances wound healing in vivo.
[0053] Cremes contendo LL (Fig. 3a, b) ou APO (Fig. 3b) PBMC-SN foram aplicados em ferimentos de biópsia com punção de 6 mm nas costas de camundongos B6/129 imediatamente após o ferimento. 8 dias após o ferimento os camundongos foram sacrificados e os ferimentos foram analisados pelo tingimento com H&E. Como mostrado na Fig. 3a e 3b tanto na cura de ferimento fortemente intensificada por SN quanto nos compartimentos dérmicos e epidérmicos da pele.[0053] Creams containing LL (Fig. 3a, b) or APO (Fig. 3b) PBMC-SN were applied to 6 mm punch biopsy wounds on the backs of B6/129 mice immediately after wounding. 8 days after wounding the mice were sacrificed and the wounds were analyzed by H&E staining. As shown in Fig. 3a and 3b both SN strongly enhanced wound healing and both dermal and epidermal compartments of the skin.
[0054] A Fig. 4 mostra SN que o derivado de PBMC intensifica fortemente a cura de ferimento in vivo.[0054] Fig. 4 shows that PBMC derivative strongly enhances wound healing in vivo.
[0055] O tamanho do ferimento durante os primeiros 5 dias após o ferimento até uma casca ser formada foi medido. Como mostrado na Fig. 4 foi observado que o fechamento do ferimento após o tratamento com cremes contendo sobrenadantes derivados de PBMC foi muito mais rápido do que o creme sozinho durante os 5 dias totais. Visto que o tamanho de ferimento aumentou um pouco durante os primeiros 2 dias com creme apenas, os ferimentos tratados com sobrenadantes derivados de PBMC começaram a fechar durante as primeiras 24 h após o ferimento e aplicação dos cremes.[0055] The wound size during the first 5 days after wounding until a scab was formed was measured. As shown in Fig. 4 it was observed that wound closure after treatment with creams containing PBMC-derived supernatants was much faster than the cream alone during the total 5 days. Whereas wound size increased slightly during the first 2 days with cream alone, wounds treated with PBMC-derived supernatants began to close during the first 24 h after wounding and application of the creams.
[0056] A Fig. 5 mostra a angiogênese aumentada em ferimentos no camundongo in vivo após o tratamento com SN derivado de PBMC.[0056] Fig. 5 shows increased angiogenesis in mouse wounds in vivo after treatment with PBMC-derived SN.
[0057] Por imuno-histoquímica para o fator VIII (Fig. 5a) e CD31 (Fig. 5b), ambos os marcadores para os vasos sanguíneos, um aumento massivo nas células positivas CD31 em ferimentos tratados com SN em comparação com os controles, indicativo de angiogênese aumentada, que pode contribuir com a cura de ferimento intensificada foi observado. Em contraste, um número aumentado de células proliferadoras neste ponto de tempo quando analisado pelo tingimento com Ki67 não pode ser detectado (Fig. 5a).[0057] By immunohistochemistry for factor VIII (Fig. 5a) and CD31 (Fig. 5b), both markers for blood vessels, a massive increase in CD31 positive cells in SN-treated wounds compared to controls, indicative of increased angiogenesis, which may contribute to enhanced wound healing, was observed. In contrast, an increased number of proliferating cells at this time point when analyzed by Ki67 staining could not be detected (Fig. 5a).
[0058] A Fig. 6a mostra que nem o PBMC e nem o IA-PBMC viáveis não estimulados secretam a citocina pró-inflamatória principalmente derivada de monócito TNF-α. (As significâncias são indicadas como segue: * p = 0,05, ** p = 0,001; n = 8)[0058] Fig. 6a shows that neither unstimulated viable PBMC nor IA-PBMC secrete the primarily monocyte-derived pro-inflammatory cytokine TNF-α. (Significances are indicated as follows: *p = 0.05, **p = 0.001; n = 8)
[0059] A Fig. 6b demonstra uma indução forte de secreção de Interferon- Y pró-inflamatória após a ativação em comparação com o PBMC não estimulado. (As significâncias são indicadas como segue: * p = 0,05, ** p = 0,001; n = 8)[0059] Fig. 6b demonstrates a strong induction of pro-inflammatory Interferon-Y secretion after activation compared to unstimulated PBMC. (Significances are indicated as follows: *p = 0.05, **p = 0.001; n = 8)
[0060] A Fig. 7a mostra resultados unidos de análise citométrica de fluxo. Os PBMCs foram presos para as células T e a expressão de marcadores de ativação CD69 e CD25 serem avaliados. (As significâncias são indicadas como segue: * p = 0,05, ** p = 0,001; n = 4)[0060] Fig. 7a shows merged results of flow cytometric analysis. PBMCs were gated for T cells and the expression of activation markers CD69 and CD25 were assessed. (Significances are indicated as follows: *p = 0.05, **p = 0.001; n = 4)
[0061] A Fig. 7b mostra uma análise FACS representativa de PBMCs ativados (PHA, CD3 mAb). O aprisionamento representa a % de células positivas.[0061] Fig. 7b shows a representative FACS analysis of activated PBMCs (PHA, CD3 mAb). Trapping represents the % of positive cells.
[0062] A Fig. 8 mostra taxas de proliferação altas como medido pela incorporação de 3[H]-timidina de PBMC estimulado quando comparado com o PBMC viável cultivado em RPMI sem estímulo.[0062] Fig. 8 shows high proliferation rates as measured by 3[H]-thymidine incorporation of stimulated PBMC when compared to viable PBMC cultured in RPMI without stimulation.
[0063] A Fig. 9 mostra a inibição da resposta de célula T de secretoma de PBMC em ensaios de proliferação de célula T.[0063] Fig. 9 shows inhibition of T cell response by PBMC secretome in T cell proliferation assays.
[0064] A Fig. 10 mostra experimentos de estímulo anti-CD3 e PHA pré- formado com PBMC.[0064] Fig. 10 shows anti-CD3 and preformed PHA stimulation experiments with PBMC.
[0065] A Fig. 11 mostra a proliferação de PBMC no estímulo com anti- CD3, PHA e linfócitos mistos.[0065] Fig. 11 shows the proliferation of PBMC upon stimulation with anti-CD3, PHA and mixed lymphocytes.
[0066] A Fig. 12 mostra o nível de Anexina V e positividade PI do sobrenadante de células CD4+ inoculadas com sobrenadantes de PBMC.[0066] Fig. 12 shows the level of Annexin V and PI positivity of the supernatant of CD4+ cells inoculated with PBMC supernatants.
[0067] A Fig. 13 mostra a inibição da super-regulação de CD25 e CD69 em células CD4+ pelo sobrenadante de PBMC.[0067] Fig. 13 shows inhibition of CD25 and CD69 upregulation on CD4+ cells by PBMC supernatant.
[0068] A Fig. 14 mostra que a desmonetização de IL-10 e TGF-β não aumenta as taxas de proliferação de células CD4+.[0068] Fig. 14 shows that demonetization of IL-10 and TGF-β does not increase CD4+ cell proliferation rates.
[0069] As úlceras na pele que não curam são frequentemente resistentes aos tratamentos mais comuns. Em um estudo prévio foi mostrado que a aplicação de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) junto com o fator de desenvolvimento de fibroblasto básico pareceu ser um tratamento útil contra a gangrena diabética. No presente exemplo, foi investigado se os sobrenadantes de cultura de PBMCs (não irradiados ou irradiados) são suficientes para induzir a cura de ferimento intensificada em um modelo de camundongo. Além disso, o efeito destes sobrenadantes em fibroblastos humanos primários (FB), queratinócitos (KC) e células endoteliais (EC) foi analisado.[0069] Non-healing skin ulcers are often resistant to most common treatments. In a previous study it was shown that the application of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) together with basic fibroblast growth factor appeared to be a useful treatment against diabetic gangrene. In the present example, it was investigated whether culture supernatants of PBMCs (non-irradiated or irradiated) are sufficient to induce enhanced wound healing in a mouse model. Furthermore, the effect of these supernatants on primary human fibroblasts (FB), keratinocytes (KC) and endothelial cells (EC) was analyzed.
[0070] Pela incubação de FB e KC com os sobrenadantes derivados de PBMC foi observado que os sobrenadantes tanto de células não irradiadas e irradiadas induziram fortemente a migração de FB, visto que estes não afetaram a proliferação de FB. Em contraste, foi observado que ambos os sobrenadantes foram eficazes em KC com respeito à sua capacidade de migra- ção e proliferação. Entretanto, o efeito de sobrenadantes derivados de células irradiadas foi mais pronunciado. Visto que os sobrenadantes derivados de PBMC induziram o maquinário de migração e proliferação in vitro, ainda foi investigado se estes sobrenadantes também forem capazes de induzir a cura de ferimento in vivo. Portanto, os cremes contendo sobrenadante de PBMC contendo cremes foram preparados e aplicados em ferimentos de biópsia com punção de 6 mm nas costas de camundongos B6/129 imediatamente após o ferimento. O tamanho do ferimento foi medido durante os próximos 4 a 5 dias até uma casca ser formada. Foi surpreendentemente observado que o fechamento do ferimento após o tratamento com cremes contendo sobrenadantes derivados de PBMC foi muito mais rápido em comparação com o creme sozinho durante os 5 dias totais. Interessantemente, visto que o tamanho do ferimento aumentou algumas vezes durante os primeiros 2 dias com creme apenas, ferimentos tratados com sobrenadantes derivados de PBMC começaram a fechar durante as primeiras 24 h após o ferimento e a aplicação dos cremes. De 8 a 10 dias após o ferimento, os camundongos foram sacrificados e os ferimentos foram analisados pelo tingimento H&E e pela imuno-histoquímica para CD31, um marcador para vasos sanguíneos. O tingimento com H&E revelou que a cura do ferimento tanto nos compartimentos dérmicos quanto epidérmicos da pele foi mais avançada na presença de cremes de sobrenadantes derivados de PBMC. Além disso houve um aumento massivo em células positivas CD31 em tais ferimentos, o indicativo de angiogênese aumentado, que pode contribuir para a cura de ferimento intensificada.[0070] By incubating FB and KC with PBMC-derived supernatants, it was observed that supernatants from both non-irradiated and irradiated cells strongly induced FB migration, whereas they did not affect FB proliferation. In contrast, it was observed that both supernatants were effective on KC with respect to their migration and proliferation ability. However, the effect of supernatants derived from irradiated cells was more pronounced. Since PBMC-derived supernatants induced the migration and proliferation machinery in vitro, it was further investigated whether these supernatants are also capable of inducing wound healing in vivo. Therefore, PBMC supernatant-containing creams were prepared and applied to 6 mm punch biopsy wounds on the backs of B6/129 mice immediately after wounding. The wound size was measured over the next 4 to 5 days until a scab was formed. It was surprisingly observed that wound closure after treatment with creams containing PBMC-derived supernatants was much faster compared to the cream alone over the total 5 days. Interestingly, whereas wound size increased several-fold during the first 2 days with cream alone, wounds treated with PBMC-derived supernatants began to close during the first 24 h after wounding and application of the creams. At 8 to 10 days after wounding, mice were sacrificed and the wounds were analyzed by H&E staining and immunohistochemistry for CD31, a marker for blood vessels. H&E staining revealed that wound healing in both the dermal and epidermal compartments of the skin was more advanced in the presence of PBMC-derived supernatant creams. In addition, there was a massive increase in CD31-positive cells in such wounds, indicative of increased angiogenesis, which may contribute to enhanced wound healing.
[0071] Em resumo, foi mostrado que os sobrenadantes derivados de PBMC levaram à cura de ferimento intensificada em camundongos in vivo e que estes sobrenadantes também induziram a proliferação e a migração em células humanas in vitro. A formulação de cremes contendo sobrenadantes de PBMC deve representar uma vantagem grande para o tratamento de úlceras da pele que não curam (ver Fig. 1 a 5).[0071] In summary, it was shown that PBMC-derived supernatants led to enhanced wound healing in mice in vivo and that these supernatants also induced proliferation and migration in human cells in vitro. Formulating creams containing PBMC supernatants should represent a great advantage for the treatment of non-healing skin ulcers (see Figs. 1 to 5).
[0072] As células mononucleares sanguíneas periféricas ativadas (PBMCs) e seus sobrenadantes (SN) são supostas serem benéficas na regeneração de ferimento (Holzinger C et al. Eur J Vasc Surg. Maio de 1994; 8(3): 351-6). Nos exemplos 1 e 2 pode ser mostrado que o PBMC não ativado e o SN derivado deste têm efeitos benéficos em um infarto do miocárdio agudo experimental (AMI) e modelo de cura. Visto que a não ativação de PBMC deve ser verificada experimentalmente, foi investigado se o cultivo de PBMC leva aos marcadores de ativação de célula T intensificada (CD69, CD25) ou secreção de citocina inflamatória intensificada (ativação de monócito = TNFα, ativação de célula T = INFY). Em um experimento de controle, as células T cultivadas foram disparadas pelo estímulo de CD3 mAb ou Fitoemaglutinina (PHA).[0072] Activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their supernatants (SN) are supposed to be beneficial in wound regeneration (Holzinger C et al. Eur J Vasc Surg. 1994 May; 8(3): 351-6). In examples 1 and 2 it can be shown that non-activated PBMC and SN derived therefrom have beneficial effects in an experimental acute myocardial infarction (AMI) and healing model. Since non-activation of PBMCs has to be verified experimentally, it was investigated whether PBMC culture leads to markers of enhanced T cell activation (CD69, CD25) or enhanced inflammatory cytokine secretion (monocyte activation = TNFα, T cell activation = INFY). In a control experiment, cultured T cells were triggered by CD3 mAb or Phytohemagglutinin (PHA) stimulation.
[0073] O sangue venoso foi coletado em tubos EDIA de voluntários saudáveis. Após a separação de grau de densidade de Ficoll-Hypaque, o PBMC foi coletado e dividido em células apoptóticas viáveis e irradiadas (IA- PBMC). Para obter as células apoptóticas, o PBMC foi irradiado com 60 Gy (Césio-137). Para a análise citométrica de fluxo 500.000 PBMC foram cultivados em 200 μl de meio isento de soro. As células foram estimuladas com PHA (1 μg/ml) ou CD3-mAb (10 μg/ml) ou foram deixadas não estimuladas. Após 24 horas de incubação, as células foram lavadas, tingidas para CD3, CD69 e CD25 (R&D System) e avaliada quanto a marcadores de ativação de superfície em um FC500 (Coulter). Para ensaios ELISA, o PBMC foi cultivado durante a noite em uma densidade de 2,5 x 106 células/ml, com ou sem PHA ou estímulo de CD3. Após 24 horas, os sobrenadantes foram coletados e congelados a -20° C. Os kits ELUSA comercialmente disponíveis para TNF-α (R&D) e INF-y (Bender) foram adquiridos. Em resumo, as placas MaxiSorp foram revestidas com anticorpos contra TNF-a e INF-y e armazenado durante a noite. Após 24 horas, as placas foram lavadas e as amostras adicionadas em duplicata também. Após a incubação e a adição de um anticorpo de detecção e estreptavidina-HRP, TMB-substrato foi adicionado também. Após o desenvolvimento de cor, a reação enzimática foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico. Os valores de densidade ótica foram lidos em um leitor de placa Wallac Victor3.[0073] Venous blood was collected in EDIA tubes from healthy volunteers. After Ficoll-Hypaque density grade separation, PBMC were collected and divided into viable and irradiated apoptotic cells (IA-PBMC). To obtain apoptotic cells, PBMC were irradiated with 60 Gy (Cesium-137). For flow cytometric analysis 500,000 PBMC were cultured in 200 μl of serum-free medium. Cells were stimulated with PHA (1 μg/ml) or CD3-mAb (10 μg/ml) or were left unstimulated. After 24 hours of incubation, cells were washed, stained for CD3, CD69 and CD25 (R&D System) and assessed for surface activation markers on a FC500 (Coulter). For ELISA assays, PBMC were cultured overnight at a density of 2.5 × 106 cells/ml, with or without PHA or CD3 stimulation. After 24 h, supernatants were collected and frozen at −20°C. Commercially available ELUSA kits for TNF-α (R&D) and INF-γ (Bender) were purchased. Briefly, MaxiSorp plates were coated with antibodies against TNF-α and INF-γ and stored overnight. After 24 h, the plates were washed and samples added in duplicate as well. After incubation and addition of a detection antibody and streptavidin-HRP, TMB-substrate was also added. After color development, the enzymatic reaction was stopped by the addition of sulfuric acid. Optical density values were read on a Wallac Victor3 plate reader.
[0074] Análise FACS: as células T estimuladas por CD3 e PHA T apresentaram uma super-regulação de marcadores de ativação CD69 e CD25 após 24 h de incubação. As células não estimuladas e apoptóticas expressaram apenas quantidades baixas de CD69 e CD25 (Fig. 6a (amostra representativa, Fig. 6b, histograma, n = 4). A significância estatística é indicada por asterisco (xx p<0,001, x p<0,05). Análise ELISA: Visto que nem TNF-α nem INF—Y em sobrenadantes derivados de PBMC não estimulados foram detectados, sobrenadante de PBMC estimulado por PHA ou CD3 evidenciou valores altos para estas citocinas como indicado pela análise ELISA (asterisco ** p<0,001, * p<0,05, n=8). Os resultados claramente mostram um padrão de secreção diferente de citocinas inflamatórias em comparação com PBMC não estimulado.[0074] FACS analysis: CD3 and PHA T-stimulated T cells showed upregulation of activation markers CD69 and CD25 after 24 h of incubation. Unstimulated and apoptotic cells expressed only low amounts of CD69 and CD25 (Fig. 6a (representative sample, Fig. 6b, histogram, n = 4). Statistical significance is indicated by asterisk (xx p < 0.001, x p < 0.05). ELISA analysis: Since neither TNF-α nor INF-γ in supernatants derived from unstimulated PBMC were detected, supernatant from PBMC stimulated by PHA or CD3 showed high values for these cytokines as indicated by ELISA analysis (asterisk ** p < 0.001, * p < 0.05, n = 8). The results clearly show a different secretion pattern of inflammatory cytokines compared to unstimulated PBMC.
[0075] Estes dados indicam que o “PBMC não estimulado” evidenciam um fenótipo diferente distinto (marcador de ativação, secreção de citocina) em comparação com PBMCs estimulados (PHA e CD3 mAb).[0075] These data indicate that “unstimulated PBMC” evidence a distinct different phenotype (activation marker, cytokine secretion) compared to stimulated PBMCs (PHA and CD3 mAb).
[0076] A Fig. 6a indica que nem PBMC nem IA-PBMC viáveis não estimulados secretam a citocina pró-inflamatória principalmente derivada de monócito TNF-α. (As Significâncias são indicadas como segue: * p=0,05, ** p=0,001; n=8)[0076] Fig. 6a indicates that neither unstimulated viable PBMC nor IA-PBMC secrete the primarily monocyte-derived pro-inflammatory cytokine TNF-α. (Significances are indicated as follows: * p=0.05, ** p=0.001; n=8)
[0077] A Fig. 6b demonstra uma indução de secreção de Interferon-y pró- inflamatório após a ativação em comparação com o PBMC não estimulado. (As significâncias são indicadas como segue: * p=0,05, ** p=0,001; n=8)[0077] Fig. 6b demonstrates an induction of pro-inflammatory Interferon-γ secretion following activation compared to unstimulated PBMC. (Significances are indicated as follows: *p=0.05, **p=0.001; n=8)
[0078] A Fig. 7a mostra os resultados unidos de análise citométrica de fluxo. Os PBMCs foram presos às células T e expressão de marcadores de ativação CD69 e CD25 foram avaliados. (As significâncias são indicadas como segue: * p=0,05, ** p=0,001; n=4)[0078] Fig. 7a shows the merged results of flow cytometric analysis. PBMCs were gated on T cells and expression of activation markers CD69 and CD25 were assessed. (Significances are indicated as follows: * p=0.05, ** p=0.001; n=4)
[0079] A Fig. 7b apresenta uma análise de FACS representativa de PBMCs ativados (PHA, CD3 mAb). O aprisionamento representa % de células positivas.[0079] Fig. 7b presents a representative FACS analysis of activated PBMCs (PHA, CD3 mAb). Trapping represents % positive cells.
[0080] O objetivo deste exemplo é mostrar que o PBMC não tem atividade proliferativa em comparação com os ensaios imunes que utilizam (CD3) específico, disparo de célula T não específico (lectina, PHA) e alogeneico (reação de linfócito mista, MLR) em um ensaio de estímulo de 2 dias (CD3, PHA) e 5 dias (MLR).[0080] The purpose of this example is to show that PBMC have no proliferative activity compared to immune assays utilizing specific (CD3), non-specific (lectin, PHA) and allogeneic (mixed lymphocyte reaction, MLR) T cell triggering in a 2 day (CD3, PHA) and 5 day (MLR) stimulation assay.
[0081] PBMC foram separados a partir dos voluntários saudáveis jovens pela centrifugação de gradiente de densidade Ficoll e recolocado em suspensão em RPMI (Gibco, USA) contendo 0,2 % de gentamicinsulfato (Sigma Chemical Co, USA), 1 % de L-GlutaminA (Sigma, USA) nas células 1*105 por 200 μ L. As células Responder foram estimuladas por MoAb a CD3 (10 μ g/mL, BD, NJ, USA), PHA (7 μ L/mL, Sigma Chemical Co, USA) ou com PBMC alogeneico irradiado em uma razão 1:1 (for MLR). As placas foram incubadas por 48 horas ou 5 dias e então pulsadas por 18 horas com 3[H]-timidina (3,7*101 Bq/reservatório; Amersham Pharmacia Biotech, Suécia). As células foram coletadas e incorporação de 3[H]-timidina foi medido em um contador de cintilação líquida.[0081] PBMC were separated from young healthy volunteers by Ficoll density gradient centrifugation and resuspended in RPMI (Gibco, USA) containing 0.2% gentamicin sulfate (Sigma Chemical Co, USA), 1% L-GlutaminA (Sigma, USA) at 1*105 cells per 200 μL. Responder cells were stimulated by MoAb to CD3 (10 μg/mL, BD, NJ, USA), PHA (7 μL/mL, Sigma Chemical Co, USA) or with irradiated allogeneic PBMC in a 1:1 ratio (for MLR). Plates were incubated for 48 h or 5 days and then pulsed for 18 h with 3[H]-thymidine (3.7*101 Bq/well; Amersham Pharmacia Biotech, Sweden). Cells were harvested and 3[H]-thymidine incorporation was measured in a liquid scintillation counter.
[0082] O PBMC estimulado mostrou as taxas de proliferação alta como medido pela incorporação de 3[H]-timidina quando comparado ao PBMC viável cultivado em RPMI sem o estímulo (Fig. 8). Este efeito foi observado pela adição do estímulo específico pela célula T (PHA, CD3) bem como nos ensaios onde a proliferação foi disparada pelas células que apresentam as células (MLR).[0082] Stimulated PBMC showed high proliferation rates as measured by 3[H]-thymidine incorporation when compared to viable PBMC cultured in RPMI without the stimulus (Fig. 8). This effect was observed by the addition of specific T cell stimuli (PHA, CD3) as well as in assays where proliferation was triggered by cell presenting cells (MLR).
[0083] Esta série dos experimentos comunicam que o PBMC viável retém a cultura por até 5 dias não proliferativo visto que o PBMC estimulado pelas maneiras diferentes que mostra uma resposta proliferativa marcada. É concluído que a cultura de PBMC sem estimulação não leva a resposta proliferativa.[0083] This series of experiments report that viable PBMC remain in culture for up to 5 days without proliferating, whereas PBMC stimulated by different means show a marked proliferative response. It is concluded that culture of PBMC without stimulation does not lead to a proliferative response.
[0084] Visto que a neo-angionese e inflamação são fortemente ligados in vivo este foi investigado se este secretoma de PBMC também exibe os efeitos anti-proliferativos nas células T e portanto interfere com uma resposta imune inflamatória.[0084] Since neo-angiosis and inflammation are strongly linked in vivo it was investigated whether this PBMC secretome also exhibits anti-proliferative effects on T cells and therefore interferes with an inflammatory immune response.
[0085] Os secretomas forma obtidos pela incubação de PBMC (2,5*106/mL) a partir dos voluntários saudáveis jovens separados pela centrifugação de gradiente de densidade Ficoll por 24 horas em RPMI (Gibco, CA, USA) contendo 0,2 % de gentamicinsulfato (Sigma Chemical Co, USA), 1 % de L-Glutamina (Sigma, USA). Os sobrenadantes foram separados a partir da fração celular e armazenado a -80° C. Para os ensaios de proliferação alogeneicos PBMC foram recolocados em suspensão a 1*105 células por 200 μ L de RPMI após a separação. As células Responder foram estimuladas por MoAb a CD3 (10 μ g/mL, BD, USA) ou PHA (7 μ L/mL, Sigma Chemical Co, USA). As diluições diferentes dos sobrenadantes foram adicionados. As placas foram incubadas por 48 horas e então pulsadas por 18 horas com 3[H]- timidina (3,7*104 Bq/reservatório; Amersham Pharmacia Biotech, Suécia). As células foram coletadas e a incorporação de 3[H]-timidina foi medida em um contador de cintilação líquido.[0085] Secretomes were obtained by incubating PBMC (2.5*106/mL) from young healthy volunteers separated by Ficoll density gradient centrifugation for 24 hours in RPMI (Gibco, CA, USA) containing 0.2% gentamicin sulfate (Sigma Chemical Co, USA), 1% L-Glutamine (Sigma, USA). Supernatants were separated from the cellular fraction and stored at -80° C. For allogeneic proliferation assays PBMC were resuspended at 1*105 cells per 200 μL RPMI after separation. Responder cells were stimulated by MoAb to CD3 (10 μg/mL, BD, USA) or PHA (7 μL/mL, Sigma Chemical Co, USA). Different dilutions of the supernatants were added. Plates were incubated for 48 h and then pulsed for 18 h with 3[H]-thymidine (3.7*104 Bq/well; Amersham Pharmacia Biotech, Sweden). Cells were harvested and 3[H]-thymidine incorporation was measured in a liquid scintillation counter.
[0086] A secretoma de PBMC alogeneico evidenciou uma redução significante das taxas de proliferação medidas pela incorporação de 3[H]- timidina quando comparado aos controles positivos (Fig. 9). Este efeito foi dependente da dosagem e deve ser visto em anti-CD3 bem como no estímulo PHA.[0086] Allogeneic PBMC secretome showed a significant reduction in proliferation rates measured by 3[H]-thymidine incorporation when compared to positive controls (Fig. 9). This effect was dose dependent and should be seen in anti-CD3 as well as in PHA stimulation.
[0087] Esta série de experimentos envolve que o secretoma obtido de PBMC viável mantido na cultura por 24 horas exibido nos efeitos anti- proliferativos significantes in vitro. Estes dados indicam que o sobrenadante derivado de PBMC ou na forma liofilizada pode servir como a fórmula terapêutica potencial para tratar doenças humanas que são relacionadas a inflamação induzida por hipoxia ou outras doenças hiperinflamatórias (por exemplo, doenças autoimunes, doenças de pele inflamatórias).[0087] This series of experiments involves that the secretome obtained from viable PBMC maintained in culture for 24 hours exhibited significant anti-proliferative effects in vitro. These data indicate that the PBMC-derived supernatant or in lyophilized form may serve as the potential therapeutic formula to treat human diseases that are related to hypoxia-induced inflammation or other hyperinflammatory diseases (e.g., autoimmune diseases, inflammatory skin diseases).
[0088] No Exemplo 1 os efeitos anti-inflamatórios do secretoma PBMC em um modelo animal de infarto do miocárdio agudo (AMI) são evidenciados. Neste exemplo este é mostrado que a aplicação de secretoma PBMC após a indução de AMI inibe o dano inflamatório do músculo cardíaco pela sub-regulação massiva da resposta imune.[0088] In Example 1 the anti-inflammatory effects of PBMC secretome in an animal model of acute myocardial infarction (AMI) are evidenced. In this example it is shown that the application of PBMC secretome after the induction of AMI inhibits the inflammatory damage of the cardiac muscle by massive down-regulation of the immune response.
[0089] Com base nestas descobertas os efeitos imunossupressores possíveis de secretoma nos experimentos in vitro foram investigados. As células CD4+ desempenham um papel chave na orquestração da resposta imune como estes são fundamentais para a assistência de outros leucócitos (por exemplo, macrófagos, células B, células T citotóxicas) nos processos imunológicos.[0089] Based on these findings the possible immunosuppressive effects of secretome in in vitro experiments were investigated. CD4+ cells play a key role in orchestrating the immune response as they are critical for the assistance of other leukocytes (e.g. macrophages, B cells, cytotoxic T cells) in immunological processes.
[0090] O PBMC a partir dos voluntários saudáveis foram separados pela centrifugação da densidade Ficoll. As células foram recolocadas em suspensão no meio de Ultra Cultura (Lonza, Basel, Suíça) em uma concentração de 1*106 células/mL (sup liv). Para a produção de secretoma a partir da apoptose PBMC apoptótica foi induzida pela irradiação com 60 Gy (sup APA). As células foram incubadas por 24 horas em uma atmosfera umidificada (5 % de CO2, 37° C, umidade relativa 95 %). Os sobrenadantes foram removidos e submetidos à diálise com um corte de 3,5 kDa (Spectrum laboratories, Breda, Países Baixos) contra 50 mM de acetato de amônio durante a noite a 4° C. Então os sobrenadantes foram filtrados estéreis e liofilizados. Os secretomas liofilizados foram armazenados a -80° C e frescamente recolocados em suspensão para cada experimento. As secretomas foram aleatórias submetido a amostragem por seu valor de pH.[0090] PBMC from healthy volunteers were separated by Ficoll density centrifugation. Cells were resuspended in Ultra Culture medium (Lonza, Basel, Switzerland) at a concentration of 1*106 cells/mL (sup liv). For secretome production from apoptotic PBMC apoptosis was induced by irradiation with 60 Gy (sup APA). Cells were incubated for 24 h in a humidified atmosphere (5 % CO2, 37°C, relative humidity 95 %). Supernatants were removed and dialyzed with a 3.5 kDa cutoff (Spectrum laboratories, Breda, The Netherlands) against 50 mM ammonium acetate overnight at 4°C. Then supernatants were sterile filtered and lyophilized. The lyophilized secretomes were stored at -80°C and freshly resuspended for each experiment. The secretomes were randomly sampled for their pH value.
[0091] As células CD4+ foram separadas pela depleção de células T não CD4+ utilizando um sistema de pérola MACS (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha). As células foram frescamente preparadas e imediatamente usadas para cada experimento.[0091] CD4+ cells were separated by depletion of non-CD4+ T cells using a MACS bead system (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany). Cells were freshly prepared and immediately used for each experiment.
[0092] A apoptose foi detectada pela citometria de fluxo usando um kit Annexin V/PI comercialmente disponível (BD, Nova Jérsei, USA). A apoptose foi definida pelo tingimento positivo Annexin, apoptose tardia pela positividade PI.[0092] Apoptosis was detected by flow cytometry using a commercially available Annexin V/PI kit (BD, New Jersey, USA). Apoptosis was defined by positive Annexin staining, late apoptosis by PI positivity.
[0093] PBMC ou células CD4+ purificadas foram diluídas na Ultra Cultura suplementadas com 0,2 % de gentamicinsulfato (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,5 % de β-mercapto-etanol (Sigma, St Louis, MO, USA) e 1 % de GlutaMAX-I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a uma concentração de 1*105/reservatório em uma placa de 96 reservatórios de fundo redondo. As células foram estimuladas com PHA (7 μ g/mL, Sigma, USA), CD3 (10 μ g/mL, BD, Nova Jérsei, USA) IL-2 (10 U/mL, BD, USA) ou uma razão 1:1 de alogeneico irradiado (60 Gy) PBMC por MLR. As células foram incubadas por 48 horas ou 5 dias (MLR) com concentrações diferentes de secretoma PBMC, IL-10 ou TGF-β. Então as células foram pulsadas por 18 horas com 3[H]-timidina (3,7 x 106 Bg/reservatório; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). As células foram coletadas e incorporação de 3[H]-timidina foi medida em um contador de cintilação líquida.[0093] PBMC or purified CD4+ cells were diluted in Ultra Culture supplemented with 0.2% gentamicin sulfate (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0.5% β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO, USA) and 1% GlutaMAX-I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) at a concentration of 1*105/well in a 96-well round bottom plate. Cells were stimulated with PHA (7 μg/mL, Sigma, USA), CD3 (10 μg/mL, BD, New Jersey, USA) IL-2 (10 U/mL, BD, USA) or a 1:1 ratio of irradiated (60 Gy) allogeneic PBMC per MLR. Cells were incubated for 48 h or 5 days (MLR) with different concentrations of PBMC secretome, IL-10, or TGF-β. Then cells were pulsed for 18 h with 3[H]-thymidine (3.7 × 106 Bg/well; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Cells were harvested, and 3[H]-thymidine incorporation was measured in a liquid scintillation counter.
[0094] As células CD4+ purificadas foram estimuladas com anti-CD3 (10 μ g/mL) e co-incubadas com concentração diferente de secretoma PBMC.[0094] Purified CD4+ cells were stimulated with anti-CD3 (10 μg/mL) and co-incubated with different concentration of PBMC secretome.
[0095] As células foram tingidas por CD69 e CD25 seguindo um protocolo de tingimento de fluxo citométrico padrão e analisado em um citômetro de fluxo FC500 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).[0095] Cells were stained for CD69 and CD25 following a standard flow cytometric staining protocol and analyzed on an FC500 flow cytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
[0096] Nos experimentos preliminares as propriedades anti-proliferativas de sobrenadantes PBMC a partir das células viáveis (sup liv) foram testadas. Nas taxas de proliferação de experimentos de estímulo anti-CD3 e PHA foram significantemente reduzidos pela adição de secretoma (n=10).[0096] In preliminary experiments the anti-proliferative properties of PBMC supernatants from viable cells (liv sup) were tested. In anti-CD3 and PHA stimulation experiments proliferation rates were significantly reduced by the addition of secretome (n=10).
[0097] Com base na descoberta do efeito do secretoma PBMC no compartimento da célula T auxiliar foi avaliada, visto que estas células desempenham um papel fundamental no lançamento e perpetuação de uma resposta imune. Em analogia a Fig. 10 a perda das células CD4+ altamente purificadas sua capacidade proliferativa pela adição de secretoma. Este fenômeno foi observado pelo sobrenadante de vida bem como o PBMC apoptótico, irradiado (Fig. 11, n=5).[0097] Based on the finding the effect of PBMC secretome on the helper T cell compartment was evaluated, since these cells play a fundamental role in launching and perpetuating an immune response. In analogy to Fig. 10 the loss of highly purified CD4+ cells their proliferative capacity by the addition of secretome. This phenomenon was observed for the supernatant of living as well as apoptotic, irradiated PBMC (Fig. 11, n=5).
[0098] A próxima etapa foi para determinar os efeitos possíveis do secretoma na viabilidade celular. Portanto as células CD4+ restantes foram inoculadas com sobrenadante e Anexina V e positivamente PI foi avaliado. Os sobrenadantes a partir de ambos, vida e PBMC apoptótico, evidenciaram efeitos pró-apoptóticos notáveis (Fig. 12, n=5).[0098] The next step was to determine the possible effects of the secretome on cell viability. Therefore the remaining CD4+ cells were inoculated with supernatant and Annexin V and PI was positively evaluated. Supernatants from both living and apoptotic PBMC showed remarkable pro-apoptotic effects (Fig. 12, n=5).
[0099] Para testar se a secretoma PBMC foi capaz de inibir a ativação da célula CD4+ os marcadores de ativação da célula T CD25 e CD69 seguindo o estímulo anti-CD3 das células CD4+ foi avaliado. Na sub-regulação de ambos marcadores foi significantemente e dependente da dosagem inibido pelo secretoma PBMC (Fig. 13, n=5).[0099] To test whether PBMC secretome was able to inhibit CD4+ cell activation the T cell activation markers CD25 and CD69 following anti-CD3 stimulation of CD4+ cells were assessed. The downregulation of both markers was significantly and dosage dependently inhibited by PBMC secretome (Fig. 13, n=5).
[00100] Na última série de experimentos o efeito das citocinas supressivas imunes IL-10 e TGF-β pela adição de anticorpos de neutralização nestes experimentos foi examinado. Nenhum dos IL-10 e TGF-β foi observado ser responsável pelos efeitos anti-proliferativos ou de secretoma PBMC, visto que a desmonetização estas citocinas não aumentam as taxas de proliferação (Fig. 14, n=5).[00100] In the last series of experiments the effect of the immune suppressive cytokines IL-10 and TGF-β by the addition of neutralizing antibodies in these experiments was examined. Neither IL-10 nor TGF-β was found to be responsible for the anti-proliferative or PBMC secretome effects, since demonetization of these cytokines did not increase proliferation rates (Fig. 14, n=5).
[00101] Estes experimentos evidenciaram para o primeiro período que a secretoma PBMC possui as características imunossupressoras in vitro. Foi mostrado que o sobrenadante a) reduz a taxa de proliferação nos experimentos de estímulo anti-CD3, PHA e MLR, b) tem a potência de induzir a apoptose e inibe a ativação das células CD4+ no disparo de célula T.[00101] These experiments demonstrated for the first period that the PBMC secretome has immunosuppressive characteristics in vitro. It was shown that the supernatant a) reduces the proliferation rate in the anti-CD3, PHA and MLR stimulation experiments, b) has the potency to induce apoptosis and inhibits the activation of CD4+ cells in T cell triggering.
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