BRPI0911906A2 - substâncias e métodos para um ensaio de traçado de perfil baseado em dna - Google Patents
substâncias e métodos para um ensaio de traçado de perfil baseado em dna Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0911906A2 BRPI0911906A2 BRPI0911906-0A BRPI0911906A BRPI0911906A2 BR PI0911906 A2 BRPI0911906 A2 BR PI0911906A2 BR PI0911906 A BRPI0911906 A BR PI0911906A BR PI0911906 A2 BRPI0911906 A2 BR PI0911906A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- seq
- nucleotides
- deletion
- polymorphism
- dip
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 677
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 677
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 358
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 255
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 60
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 60
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 81
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 81
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 47
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 21
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims description 18
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 13
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 11
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 6
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 5
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 238000007838 multiplex ligation-dependent probe amplification Methods 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 abstract description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 72
- 239000000047 product Substances 0.000 description 34
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 102100036254 E3 SUMO-protein ligase PIAS2 Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 13
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 108010007570 Amelogenin Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 5
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 5
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 5
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000007325 Amelogenin Human genes 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 241000207208 Aquifex Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091092919 Minisatellite Proteins 0.000 description 2
- -1 Nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108020004487 Satellite DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 2
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUNKPNYCNUKOAU-VXJRNSOOSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]a Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XUNKPNYCNUKOAU-VXJRNSOOSA-N 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMGKYXFDYYTZFD-UHFFFAOYSA-N 4-amino-1-hydroxy-2-methylbutane-2-sulfonic acid Chemical compound OCC(C)(S(O)(=O)=O)CCN XMGKYXFDYYTZFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyrhodamine 6G Chemical compound [Cl-].C=12C=C(C)C(NCC)=CC2=[O+]C=2C=C(NCC)C(C)=CC=2C=1C1=CC(C(O)=O)=CC=C1C(=O)OCC VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001502050 Acis Species 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 101150068340 Amelx gene Proteins 0.000 description 1
- 241000893512 Aquifex aeolicus Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031872 Body Remains Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001233195 Eucalyptus grandis Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000605233 Hydrogenobacter Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 description 1
- 101100355584 Mus musculus Rad51 gene Proteins 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000186339 Thermoanaerobacter Species 0.000 description 1
- 101100388071 Thermococcus sp. (strain GE8) pol gene Proteins 0.000 description 1
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical group OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N lichenxanthone Natural products COC1=CC(O)=C2C(=O)C3=C(C)C=C(OC)C=C3OC2=C1 QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000003547 miosis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 102000034288 naturally occurring fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006048 naturally occurring fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920002939 poly(N,N-dimethylacrylamides) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N rhodamine 110 Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N)=CC2=[O+]C2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007725 thermal activation Methods 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000018412 transposition, RNA-mediated Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 101150032615 ung gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
"SUBSTÂNCIAS E MÉTODOS PARA UM ENSAIO DE TRAÇADO DE PERFIL BASEADO EM DNA". A presente invenção refere-se a ensaio de traçado de perfil de DNA compreendendo as etapas que seguem: provisão de uma amostra a ser analisada, provisão de reagentes, enzima e iniciador-oligonucleotídeos que são necessários para amplificação de reação em cadeia da polimerase simultânea de pelo menos 20 loci, amplificação dos loci, detecção dos pro- dutos de amplificação, onde os produtos de amplificação e os loci a serem amplificados são caracterizados pelas características que seguem, cada locus a ser amplificado é caracterizado por pelo menos um polimorfismo de deleção-inserção conhecido estar presente na população, onde os dois alelos de cada locus diferem em tamanho em mais de 2 nucleotídeos e menos do que 100 nucleotídeos, um primeiro conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois loci diferentes carrega um primeiro marcador, um segundo conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois loci diferentes carrega um segundo marcador, um terceiro conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois loci diferentes carrega um terceiro marcador, o marcador um, o marcador dois e o marcador três são cada um marcadores fluorescentes diferentes que podem ser diferenciados e simultaneamente detectados através de detector multicolorido em combinação com, por exemplo, um dispositivo de sequenciamento de DNA.
Description
' Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SUBSTAN- CIAS E MÉTODOS PARA UM ENSAIO DE TRAÇADO DE PERFIL BASE- ADO EM DNA".
CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se em geral à detecção de marcado- res genéticos em um sistema genômico. Em uma modalidade particular da invenção ela refere-se especificamente à amplificação simultânea de loci genéticos polimórficos distintos múltiplos usando a reação em cadeia da po- limerase ou outros sistemas de amplificação para determinar, preferivelmen- 10 te em uma reação, os alelos de cada locus contido no sistema multiplex. A invenção está então no campo de química e biologia, mais particularmente em biologia molecular, mais particularmente genética humana e mais parti- cularmente em testes forenses bem como de paternidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 15 Tipificação de DNA é geralmente usada para identificar a pater- nidade de crianças humanas e confirmar a linhagem de cavalos, cachorros e outros animais e culturas agriculturais. Tipificação de DNA é também geral- mente empregada para identificar a fonte de sangue, saliva, sêmen e outro tecido encontrado na cena de um crime ou outros locais que necessitem de 20 identificação de restos humanos. Tipificação de DNA é também empregada em ambientes clínicos, por exemplo, a terapia de certas leucemias, para de- terminar o sucesso ou falha de transplante de medula óssea na presença de tecidos cancerosos particulares. Tipificação de DNA envolve a análise de alelos de DNA genômico com características de interesse, geralmente refe- 25 ridos como "marcadores". A maioria dos métodos de tipificação em uso hoje é especificamente projetada para detectar e analisar diferenças no compri- mento elou sequência de uma ou mais regiões de marcadores de DNA co- nhecidos aparecer em pelo menos duas formas diferentes na população. Tais variações em comprimento elou sequência são referidas como "poli- 30 morfismo". Qualquer região, isto é, "locus" de DNA onde tal variação aconte- ce, é referida como "locus polimórfico". Quando falando sobre sequências de DNA polimórfico uma pes-
soa deve distinguir em particular entre as chamadas sequências de DNA polimórfico repetidas e elementos polimórficos não-repetitivos.
No estudo de sequências de DNA uma pessoa pode distinguir dois tipos principais de se- quências repetidas; repetições em tandem e repetições interespaçadas.
Re- 5 petições em tandem incluem DNA satélite.
DNA satélite consiste em DNA altamente repetitivo e é também chamado assim porque repetições de se- quência de DNA curto tendem a produzir frequência diferente dos nucleotí- deos adenina, citosina, guanina e timina e então têm densidade diferente de DNA bruto — de maneira que eles formam uma segunda faixa ou "satélite" 10 em DNA genômico separado em um gradiente de densidade.
Um minissaté- lite é uma seção de DNA que consiste em séries curtas de bases de 10 a 100 pb.
Essas ocorrem em mais de 1.000 locais no genoma humano.
Alguns mino-satélites contêm uma sequência central (ou núcleo) de letras "GGG- CAGGANG" (onde N pode ser qualquer nucleotídeo) (N = código UPAC para 15 A, C, G, T) ou mais geralmente uma tendência a filamento.
Foi mostrado que a sequência per se encoraja cromossomos a permutar DNA.
Em modelos alternativos, é a presença de um hotspot de rompimento de filamento duplo miótico de ação cis, vizinho, que é a causa principal de variações no número de cópia de repetição de minissatélite 20 DNA repetitivo não-disperso é encontrado em todos os genomas eucarióticos.
Essas sequências se propagam através de transposição medi- ada por RNA e elas foram chamadas retroposons.
Tais retroposons são substancialmente maiores do que os elementos repetitivos discutidos acima.
Os chamados elementos nucleares não-dispersos curtos (SI- 25 NEs) são uma classe adicional de elementos de DNA repetitivos.
Um tipo particular de SINEs são as chamadas sequências ALU.
Essas são de cerca de 300 pares de base de comprimento.
Desta maneira, esses elementos também não são particularmente úteis para um ensaio de traçado de perfil simples e direto. 30 Microssatélites são repetições de sequência simples (SSRs) ou também repetições em tandem curtas (STRs) ou loci polimórficos presentes em DNA nuclear e DNA de organela que consistem em unidades de repeti-
ção de 1 a 6 pares de base de comprimento.
Eles são usados como marca- dores moleculares que têm aplicação de faixa ampla no campo de genética incluindo parentesco e estudos de população- Microssatélites podem tam- bém ser usados para estudar dosagem de gene (procurando por duplicações 5 ou deleções de uma região genética particular). Um exemplo comum de mi- crossatélite é repetição (CA), onde n é variável entre os alelos.
Esses mar- cadores estão frequentemente presentes em níveis altos de polimorfismos inter- e intraespecíficos.
Particularmente quando número de repetição em tandem 10 ou maior aparece.
As sequências de repetição são frequente- 10 mente simples, consistindo em dois, três ou quatro nucleotídeos (repetições de di-, tri-, tetranucieotídeo respectivamente) e podem ser repetidas 10 a 100 vezes.
Repetições de nucleotídeo CA são muito frequentes em geno- mas humanos e outros, e estão presentes a cada alguns pares de base.
Como frequentemente há extremamente muitos alelos presentes em um lo- 15 cus de STR, genótipos dentro de espécies são frequentemente muito infor- mativos e o progenitor de um alelo particular pode ser frequentemente identi- ficado.
No entanto, fazer uso desses chamados STRs em ensaios genéticos tem o efeito fundamental que devido à grande variação dentro da população que uma pessoa pode encontrar em quantidades extremamente grandes de 20 alelos e os ditos alelos quando analisando esses em, por exemplo, sistema em gel eletroforético vão diferir substancialmente em tamanho.
Quando usando, por exemplo, RFLP, o risco teórico de uma combinação coincidente é 1 em 1 bilhão (100.000.000.000). No entanto, a taxa de erro de laboratório é quase certamente maior do que esta, e frequen- 25 temente procedimentos de laboratórios reais não refletem a teoria sob a qual as probabilidades de coincidência foram computadas.
Por exemplo, as pro- babilidades de coincidência podem ser calculadas com base nas probabili- dades que marcadores em duas amostras tenham faixas precisamente no mesmo local, mas um funcionário de laboratório pode concluir que padrões 30 de faixa similares — mas não precisamente idênticos - resultam de amostras genéticas idênticas com alguma imperfeição em gel de agarose.
No entanto, neste caso, o funcionário do laboratório aumenta o risco de coincidência ao expandir os critérios para declarar uma combinação.
STRs têm o mesmo problema.
Isto é devido ao fato que muitos alelos existem para cada locus e esta complexidade pode levar a produtos de amplificação ambíguos que são então incorretamente apontados. 5 Sistemas contendo vários loci são chamados sistemas multiplex e muitos tais sistemas contendo até mais de 11 loci de STR separados fo- ram desenvolvidos e estão comercialmente disponíveis.
No entanto, protoco- los de amplificação com loci de STR podem ser projetados que produzem produtos pequenos geralmente de 60 a 500 pares de base (pb) de compri- 10 mento e alelos de cada locus estão frequentemente contidos dentro da faixa de menos do que 100 pares de base_ O inconveniente substancial com uso de loci de STR é que devido à alta variabilidade dentro da população com relação a loci particulares certos alelos podem ter um número alto de repeti- ções e então resultam em produtos de amplificação grandes.
Projeto desses 15 sistemas é limitado, em parte, pela dificuldade em separar loci múltiplos em um gel ou capilar único.
Isto acontece porque há compressão espacial de fragmentos de tamanhos diferentes, especialmente fragmentos maiores em géis ou capilares, isto é, meios para separação de fragmentos de DNA ge- ralmente usados por aqueles versados na técnica.
Embora a análise de re- 20 petições em tandem curtas multialélicas (STRs) (Short Tandem Repeats) ainda tenha o maior impacto sobre genética forense e trabalho de caso, de- ve ser dito que os sistemas são limitados especialmente a evidências de DNA de qualidade e quantidade baixas.
Por exemplo, amostras de DNA de- gradadas representam um dos maiores desafios das principais análises STR 25 uma vez que tamanhos de amplicon dentro de ensaios multiplex frequente- mente excedem 200 pares de base.
Amostras degradadas são extremamen- te difíceis de empregar.
Ao mesmo tempo têm sido focados os chamados polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) (Single Nucleotide Polymorphisms), no en- 30 tanto, esses SNPs são difíceis de analisar porque um dado sistema deve ser capaz de identificar uma posição polimórfica de nucleotídeo simples.
A presente invenção representa um aperfeiçoamento significante sobre a tecnologia existente, trazendo maior poder de discriminação, posi- ção e resultado do traçado de perfil de DNA para análise de ligação, justiça criminal, teste de paternidade e outras aplicações de identificações médica e genética. Isto é em particular devido ao fato de que a presente invenção faz 5 uso de uma combinação de um tipo diferente de marcadores polimórficos, isto é, os chamados polimorfismos de deleção-inserção (DIP) (Deletion- Insertion Polymorphisms) bialélicos frequentes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um ensaio de traçado de perfil 10 de DNA compreendendo as etapas que seguem, provisão de uma amostra a ser analisada, provisão de reagentes, oligonucleotídeos de enzima e inicia- dor que são necessários para amplificação da reação em cadeia da polime- rase simultânea de pelo menos 20 loci, amplificação do loci, detecção dos produtos de amplificação, onde os produtos de amplificação e os loci a se- 15 rem amplificados são caracterizados pelas características que seguem, cada focus a ser amplificado é caracterizado por pelo menos uma polimorfismo de deleção-inserção conhecido estar presente na população, onde os dois ale- los de cada focus diferem em tamanho em mais de 1 nucleotídeo e menos do que 100 nucleotídeos, um primeiro conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotí- deos a cerca de 300 nucleotídeos originando-se de pelo menos dois loci di- ferentes carrega um primeiro marcador, um segundo conjunto de pelo me- nos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos originando-se de pelo me- 25 nos dois loci diferentes carrega um segundo marcador, um terceiro conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos originando- se de pelo menos dois loci diferentes carrega um terceiro marcador, o mar- cador um, o marcador dois e o marcador três são cada um marcadores fluo- 30 rescentes diferentes que podem se diferenciados e simultaneamente detec- tados através de um detector multicolorido em combinação com um disposi- tivo de sequencíamento de DNA. É também um objetivo da presente inven-
[:]
ção prover um método, um estojo e iniciadores específicos para ampliações multiplex compreendendo loci especificados (DIPs). Aqui, a probabilidade de identidade combinada (CPI) (Combined Probability of Identity) expressa a probabilidade de encontrar dois indivíduos 5 com o mesmo genátipo para um certo conjunto de loci na população. (Kirst, M., Cordeiro, C.M., Rezende, G.D., Grattapaglia, D. "Power of microsatellite markers for fingerprinting and parentage analysis in Eucalyptus grandis bre- eding populations". J.
Hered. 2005 96:161-166. PMID: 15601907). Aqui, a CPEITrio (probabilidade combinada de exclusão de pa- 10 ternidade (Combined Probability of Paternity Exclusion) expressa a probabi- lidade de exclusão de uma paternidade quando genótipos de ambos os pais são conhecidos para um certo conjunto de loci na população . (Jamieson, A., Taylor SCS (1997) "Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion". Animal Genetics, 28, 397-400). 15 Aqui, um escala alélico é um marcador de tamanho padrão con- sistindo em alelos amplificados de pelo menos um locus usando o mesmo iniciador de PCR de aplicação para amplificar amostras de DNA desconhe- cidas.
Cada DIP tem dois alelos.
Aqui, um alelo é uma variação genética associada com um seg- 20 mento de DNA, isto é, uma de duas ou mais formas alternativas de uma se- quência de DNA ocupando o mesmo locus.
Aqui, um polimorfismo de DNA é uma condição onde duas ou mais sequências de nucleotídeo diferentes em uma sequência de DNA coe- xistem na mesma população intercruzamento. 25 Aqui, um locus ou locus genético é uma posição especifica em um cromossomo.
Aqui, alelos de um locus estão localizados em sítios idênticos em cromossomos homólogos, mas diferem em suas sequências de DNA em pelo menos uma posição de nucleotídeo_ 30 Aqui, iniciador específico de locus é um iniciador que hibridiza especificamente com uma porção do locus declarado ou seu filamento com- plementar, pelo menos para um alelo do locus, e não hibridiza eficientemen-
rA te com outras sequências de DNA sob as condições usadas no método de amplificação. Em geral, iniciador refere-se a um oligonucleotídeo de DNA de filamento simples que tem tipicamente um comprimento entre 10 e 40 (15- 35; 18-30) nucleotídeos e que forma após hibridização com um filamento de 5 DNA complementar um complexo de substrato prolongável para uma polime- rase de DNA. Aqui, um ensaio de traçado de perfil é um padrão de marcadores de DNA polimórficos amplificados que é adequado para diferenciar indiví- duos de uma espécie, especialmente seres humanos. O método é também 10 referido como "padrão de identificação genética molecular" ou "impressão digital genética".
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um ensaio de traçado de perfil de DNA compreendendo as etapas que seguem provisão de uma amostra a 15 ser analisada, provisão de reagentes, oligonucleotídeos de enzima e inicia- dor que são necessários para amplificação de reação em cadeia da polime- rase simultânea de pelo menos 20 loci, amplificação dos loci, detecção dos produtos de amplificação, onde os produtos de amplificação e os loci a se- rem amplificados são caracterizados pelas características que seguem, cada 20 locus a ser amplificado é caracterizado por pelo menos um polimorfismo de deleção-inserção conhecido estar presente na população, onde os dois ale- los de cada locus diferem em tamanho em mais de 1 nucleotídeo e menos do que 100 nucleotídeos, um primeiro conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotí- 25 deos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois loci dife- rentes carrega um primeiro marcador, um segundo conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois loci diferentes carrega um segundo marcador, um terceiro conjunto de 30 pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotideos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois loci diferentes carrega um terceiro marcador, o marcador
:
um, o marcador dois e o marcador três são cada um marcadores fluorescen- tes diferentes que podem ser diferenciados e simultaneamente detectados através de um detector multicolorido de um dispositivo de sequenciamento de DNA, a diferença de tamanho entre dois alelos para um dado locus é 5 maior do que 1 nucleotideo e menor do que 100 nucleotídeos.
Idealmente, a diferença de tamanho é maior que 2 e menor do que 80, menor do que 60, menor do que 40, menor do que 30 ou menor do que 20 nucleotídeos.
Os inventores constataram que o ensaio dá resultados signifi- cantemente melhores quando uma amostra que é usada compreende DNA 10 degradado, DNA parcialmente degradado, DNA muito degradado ou, por exemplo, inibidores da PCR.
A amostra a ser analisada pode ser uma de muitas coisas, tais como DNA isolado, células, saliva, urina ou sangue.
Outros tecidos são da mesma maneira compreendidos. 15 0 DNA pode ser de humano, gato, cachorro ou qualquer outro animal.
Um "DNA isolado" é ou (1) um DNA que contém sequência não- idêntica àquela de qualquer sequência de ocorrência natural ou (2), no con- texto de um DNA com uma sequência de ocorrência natural (por exemplo, 20 um cDNA ou DNA genômico), um DNA livre de pelo menos um dos genes que flanqueiam o gene contendo o DNA de interesse no genoma do orga- nismo onde o gene contendo o DNA de interesse acontece naturalmente.
O termo inclui então um DNA recombinante incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma ou no DNA genõmico de um 25 procarionte ou eucarionte.
O termo inclui também uma molécula separada tal como um cDNA onde o DNA genõmico correspondente tem íntrons e então uma sequência diferente; um fragmento genômico que não tem pelo menos um dos genes de flanqueamento; um fragmento de cDNA ou DNA genômico produzido através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e que não tem 30 pelo menos um dos genes de flanqueamento; um fragmento de restrição que não tem pelo menos um dos genes de flanqueamento; um DNA codificando uma proteína de ocorrência não-natural tal como uma proteína de fusão, mu-
teína ou fragmento de uma dada proteína; e um ácido nucleico que é uma variante degenerada de um cDNA ou um ácido nucleico de ocorrência natu- ral. Ainda, ele inclui uma sequência de nucleotídeo recombinante que é parte de um gene híbrido, isto é, um gene codificando uma proteína de fusão de 5 ocorrência não-natural. Será aparente a partir do acima que DNA isolado não significa um DNA presente dentre centenas a milhões de moléculas de DNA dentro de, por exemplo, bibliotecas de cDNA ou DNA genômico ou di- gestões de restrição de DNA genômico em, por exemplo, uma mistura de reação de digestão de restrição ou uma fatia de gel eletroforética. 10 Uma reação de PCR pode consistir em 10 a 45 "ciclos" de des- naturação e síntese de uma molécula de DNA. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, PCR (conforme descrito nas Patentes U.S. N0- 5
4.683.195 e 4.683.202, que são aqui incorporadas a título de referência), Amplificação de Deslocamento de Filamento ("SDA") (conforme descrito na 15 Patente U.S. Nº 5.455.166, que é aqui incorporada aqui a título de referên- cia), e Amplificação Baseada em Sequência de Ácido Nucleico ("NASBA") (conforme descrito na Patente U.S. N2 5.409.818, que é aqui incorporada a título de referência). Por exemplo, amplificação pode ser conseguida através de um sistema de replicação em círculo rolante que pode até mesmo usar 20 uma helicase para eficiência aumentada em fusão de DNA com calor reduzi- do (vide Yuzhakou e outros, Cell 86:877-886 (1996) e Mok e outros, J. Biol. Chem. 262:16558-16565 (1987), que são aqui incorporados a título de refe- rência). Em uma modalidade preferida, a temperatura na qual a desnatu- 25 ração é feita em uma reação de amplificação de termociclização está entre cerca de 90° C a mais do que 95° C, mais preferivelmente entre 92-94° C. Métodos de amplificação de termociclização preferidos incluem reações em cadeia da polimerase envolvendo de a partir de cerca de 10 a cerca de 100 ciclos, mais preferivelmente de a partir de cerca de 25 a cerca de 50 ciclos, e 30 temperaturas de pico de a partir de cerca de 90° C a mais do que cerca de 95° C, mais preferivelmente 92-94° C. Em uma modalidade preferida, uma reação de PCR é feita u-
sando uma Polimerase de DNA I para produzir, em quantidades exponenci- ais com relação ao número de etapas de reação envolvidas, pelo menos uma sequência de ácido nucleico-alvo, dado que (a) as extremidades da se- quência-alvo são conhecidas em detalhes suficientes que iniciadores de oil- 5 gonucleotídeo podem ser sintetizados que vão hibridizar para elas e (b) uma pequena quantidade da sequência-alvo está disponível para iniciar a reação em cadeia.
O produto da reação em cadeia será um dúplex de ácido nuclei- co diferente com terminais correspondendo às extremidades dos iniciadores específicos empregados. 10 Qualquer fonte de ácido nucleico, em forma purificada ou não- purificada, pode ser utilizada como o ácido nucleico de partida, se ela conti- ver ou for pensada conter a sequência de ácido nucleico-alvo desejada.
Des- ta maneira, o processo pode empregar, por exemplo, DNA que pode ser de filamento simples ou filamento duplo.
Ainda, um híbrido de DNA-RNA que 15 contém um filamento de cada pode ser utilizado.
Uma mistura de qualquer um desses ácidos nucleicos pode ser também empregada, ou os ácidos nu- cleicos produzidos a partir de uma reação de amplificação prévia usando os mesmos iniciadores ou iniciadores diferentes podem ser então utilizados.
O ácido nucleico amplificado é preferivelmente DNA.
A sequência de ácido nu- 20 cleico-alvo a ser amplificada pode ser apenas uma fração de uma molécula maior ou pode estar presente inicialmente como uma molécula separada, de maneira que a sequência-alvo constitui o ácido nucleico total.
Não é neces- sário que a sequência-alvo a ser amplificada esteja inicialmente presente em uma forma pura; ela pode ser uma fração pequena de uma mistura comple- 25 xa ou uma porção de sequência de ácido nucleico devido a um animal parti- cular cujo organismo constituiria apenas uma fração muito menor de uma amostra biológica particular.
O ácido nucleico de partida pode conter mais de uma sequência de ácido nucleico-alvo desejada que pode ser igual ou dife- rente.
Desta maneira, o método é útil não apenas para produção de quanti- 30 dades grandes de uma sequência de ácido nucleico-alvo, mas também para amplificar simultaneamente sequências de ácido nucleico-alvo múltiplas lo- calizadas nas mesmas moléculas de ácido nucleico ou diferentes.
Isto é par-
ticularmente o caso se e quando DNA humano é amplificado na base de DNA de animais.
Que pode acontecer em algumas cenas de crime.
O(s) ácido(s) nucleico(s) pode(m) ser obtido(s) a partir de qual- quer fonte e incluem plasmídeos e DNA clonado, DNA de qualquer fonte, 5 incluindo bactérias, levedura, vírus e organismos superiores tais como plan- tas ou animais.
DNA pode ser extraído de, por exemplo, sangue ou outro fluido, ou material de tecido tal como vilosidades coriõnicas ou células ami- nióticas através de uma variedade de técnicas tais como aquelas descritas por Sambrook, J., Fritsche, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning.
A Labora- 10 tory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). O ensaio faz uso de iniciadores específicos de locus.
Os inicia- dores são dispostos a montante e a jusante de DIP.
Os iniciadores são ide- almente mais ou menos equidistantes, mas são postos de maneira que falta de emparelhamento é reduzida e uma temperatura de fusão ideal é atingida. 15 Iniciadores preferidos têm um comprimento de a partir de cerca de 15-100, mais preferivelmente cerca de 20-50, mais preferivelmente cerca de 20-40, bases.
É essencial que os iniciadores do método ultrapassem a região com- preendendo o DIP (polimorfismo de deleção-inserção). Especialmente, os inventores constataram para PCR altamente multiplexada com mais de 20 20 loci que a temperatura de anelamento dos iniciadores deve ser entre 56-65° C, mais preferivelmente entre 57-63° C e mais preferivelmente entre 59-61° C.
Ainda, a diferença entre temperaturas de anelamento dos iniciadores a- vançado e reverso de um par de iniciador específico de locus bem como en- tre todos os iniciadores da mistura de PCR multiplex deve ser menos do que 25 4° C.
Todos os iniciadores devem dar PCRs específicas de ensaio, por e- xemplo, devem ser específicos de humano no caso de aplicações multiplex forenses ou de diagnóstico humanas.
Os pares de iniciador específicos de locus bem como todos os iniciadores dentro da mistura de reação multiplex não devem dar subprodutos não-específicos dentro de PCR ou PCR multi- 30 plex.
Ainda, é muito importante evitar autocomplementaridade de sequências de DNA entre todos os iniciadores da mistura de reação multiplex para pre- venir formações de autodímero ou heterodïmero dentro da PCR ou PCR multiplex.
Iniciadores de oligonucleotídeo podem ser preparados usando qualquer método adequado, tal como, por exemplo, os métodos de fosfotri- éster ou fosfodiéster ou suas modalidades automatizadas.
Em tal modalida- 5 de automática dietilfosforotiamidas são usadas como materiais de partida e podem ser sintetizadas conforme descrito por Beacauge e outros, Tetrahe- dron Letters, 22:1859-1862 (1981), que é aqui incorporado a titulo de refe- rência.
Um método para síntese de oligonucleotídeos em um apoio sólido modificado é descrito na Patente U.S.
N2 4.458.006, que é aqui incorporado 10 a título de referência.
É também possível usar um iniciador que foi isolado de uma fonte biológica (tal como uma digestão de endonuclease de restrição). A sequência de ácido nucleico-alvo é amplificada usando o ácido nucleico contendo esta sequência como um molde.
Se o ácido nucleico con- tém dois filamentos, é necessário separar os filamentos do ácido nucleico 15 antes dele ser usado como o molde, ou como uma etapa separada ou simul- taneamente com a síntese dos produtos de extensão de iniciador.
A separa- ção de filamento pode ser realizada através de qualquer método de desnatu- ração adequado incluindo meios físicos, químicos ou enzimáticos.
Um méto- do físico de separação dos filamentos do ácido nucleico envolve aquecimen- 20 to do ácido nucleico até que ele esteja completamente desnaturado (>99%). Desnaturação com calor típica pode envolver temperaturas variando de a partir de cerca de 80° C a 105° C, preferivelmente cerca de 90° C a cerca de 98° C, mais preferivelmente ainda 93° C a 95° C, para tempos variando de a partir de cerca de 1 a 10 minutos.
Separação de filamento pode ser também induzida por uma enzima da classe de enzimas conhecida como helicases ou a enzima ReCa, que tem atividade de helicase e é conhecida desnaturar DNA.
As condições de reação adequadas para separação dos filamentos de ácidos nucleicos com helicases são descritas por Cold Spring Harbor Sym- posia on Quantitative Biology, Vol.
XLII, "DNA: Replication and Recombinati- 30 on"(New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978) e técnicas para uso de RecA são revistas em C.
Radding, Ann.
Rev.
Genetics, 16:405-37 (1982), que é aqui incorporado a título de referência.
Síntese pode ser realizada usando qualquer método adequado.
Em geral, ela acontece em uma solução aquosa tamponada.
Em algumas modalidades preferidas, o pH do tampão é cerca de 7,5-9,2 (ajustado em temperatura ambiente). Preferivelmente, um excesso molar (para ácido nu- 5 cleico clonado, geralmente cerca de 1000:1 iniciador: molde, e para ácido nucleico genômico, geralmente cerca de 106:1 iniciador: molde) de dois ini- ciadores de oligonucleotídeo é adicionado ao tampão contendo os filamentos de molde separados.
É compreendido, no entanto, que a quantidade de fila- mento complementar pode não ser conhecida se o presente processo for 10 usado para algumas aplicações, de maneira que a quantidade de iniciador com relação à quantidade de filamento complementar não pode ser determi- nada com certeza.
Como uma questão prática, no entanto, a quantidade de iniciador adicionada estará geralmente em excesso molar acima da quanti- dade de filamento complementar (molde) quando a sequência a ser amplifi- 15 cada está contida em uma mistura de filamentos de ácido nucleico de cadeia longa complicados.
Um excesso molar grande é preferido para melhorar a eficiência do processo.
Condições de reação preferidas para uma PCR são como segue: tampão de Tris-HCI 20 mM (pH 8,8; ajustado em temperatura ambiente), dNTPs 200 pM (40-500 pM), MgCl2 1-10 (1-4) mM, KCI 50 mM, 20 0,05-2 pM de cada iniciador de oligonucleotídeo, 0,05-0,5% (volivol.) de Tween 20 e 1-2,5 unidades de Taq DNA polimerase.
Em algumas modalida- des (análise de manchas forenses, DNA de células únicas ou de número de cópia baixo (LCN)) Taq DNA polimerases com a chamada "tecnologia de início quente"(Patente U.S. 05587287; Patente U.S.
N2 05677152; Patente 25 U.S.
N2 06214557; Patente U.S.
N2 06183967) são preferidas para evitar amplificação não-específica.
Ainda, Taq DNA polimerases geneticamente engenheiradas que não têm atividade de 5'—~3' exonuclease (por exemplo, Patente EU No. 0553264, Patente EU No. 1507002, Patente EU No. 0395736, Patente EU No. 0983364) são vantajosas em certas aplicações.
O 30 detergente Tween 20 pode ser substituído por Nonidet P-40 [0,05 — 0,5% (vol/vol.)] ou Triton X-100 (0,05-0,5% (vol.vol.)] ou misturas desses deter- gentes são aplicadas (por exemplo, Tween 20 junto com Nonidet P-40). O
`i cátion monovalente K+ pode ser substituído por NH4+ ( concentração final 1- 20 mM) ou misturas de ambos os cátions são usadas.
Algumas vezes ânions outros que não cloreto tal como sulfato ou acetato são preferidos.
Para ver- sados na técnica mais aditivos são conhecidos como estabilizadores da po- 5 limerase de DNA elou aumentadores de PCR.
Exemplos desses substratos são betaina (0,1-2,0 M), trealose (0,02-2,0 M), sorbitol (0,02-2,0 M), dimetil- sulfóxido (até 5% vol./vol.) ou cloreto de tetrametilamõnio (até 5% vol.Ivol.). Ainda algumas vezes 200-2000 mglmL de albumina de soro bovino (BSA) ou gelatina são aplicados para neutralizar o efeito de inibidores de PCR deriva- 10 dos de preparações de amostra de DNA impura.
Nucleosídeo trifosfatos, preferivelmente dATP, dCTP, dGTP, dTTP elou dUTP, são também adicionados à mistura de síntese em quanti- dades adequadas.
A molaridade preferida de nucleotídeos é 40-500 NM, em particular 100-150 NM.
Embora tais concentrações de dNTP sejam condes- 15 cendentes aos métodos da invenção, concentrações maiores do que 500 pM podem ser vantajosas em algumas modalidades.
É preferido que a polimerase de acordo com a invenção seja se- lecionada do grupo dos gêneros de Thermus, Aquifex, Thermotoga, Thermo- cridis, Hydrogenobacter, Thermosynchecoccus e Thermoanaerobacter. 20 É preferido que a polimerase de acordo com a invenção seja se- lecionada do grupo de organismos de Aquifex aeolicus, Aquifex pyogenes, Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Thermotoga neapolitana, Ther- mus pacificus e Thermotoga marítima.
Polimerase de DNA I é uma enzima que faz a mediação do pro- 25 cesso de replicação de DNA em procariontes.
Pol I foi a primeira enzima constatada com atividade de polimerase, e é a enzima melhor caracterizada.
Embora esta tenha sido a primeira enzima a ser constatada ter as atividades de polimerase requeridas, ela não é a enzima primária envolvida com repli- cação de DNA bacteriana.
Descoberta por Arthur Kornberg em 1956, ela foi 30 a primeira polimerase de DNA conhecida e foi inicialmente caracterizada em E. coil, embora ela seja ubíqua em procariontes.
Ela é frequentemente refe-
rida simplesmente como Pol I.
Em E. coli e muitas outras bactérias, o gene
`N1 que codifica Pol 1 é conhecido como p01-A.
Na presente invenção é preferido que a enzima seja uma polimerase tipo pol-A.
É mais preferido que a polimerase seja Taq DNA polimerase.
Em uma modalidade, resíduos de uracila são incorporados du- 5 rante a reação de PCR.
Uracil DNA glicosilase (uracil-N-glicosilase) é o pro- duto do gene ung de Escherichia coil, e foi clonado, sequenciado e expresso em E. coli.
Uracil DNA glicosilase (UDG) remove esses resíduos uracila de DNA (de filamento simples e duplo) sem destruir a estrutura principal de a- çúcar-fosfodiéster do DNA, desta maneira prevenindo seu uso como um alvo 10 de hibridização ou como um molde para polimerases de DNA.
Os sítios abásicos resultantes são suscetíveis à clivagem hidrolí- tica em temperaturas elevadas.
Desta maneira, remoção de bases uracila é geralmente acompanhada por fragmentação do DNA.
Um versado na técni- ca sabe como usar a Uracil DNA glicosilase a fim de evitar contaminação. 15 Da mesma maneira, ambos a enzima bem como o nucleotídeo de uracila podem estar no estojo da invenção.
Em uma modalidade preferida pelo me- nos 25 loci são amplificados simultaneamente.
Em outra modalidade os loci de DIP da invenção (SEQ IDs reve- ladas aqui) podem ser amplificados e genotipificados usando PCR multiplex 20 específica de alelo (patente U.S.
N2 5.595.890; Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, L.E., Powell, S.J., Summers, c., Kalsheker, N., Smith, J.C., Mar- kham, A.F. "Analysis of any point mutation in DNA.
The amplification refrac- tory mutation system (ARMS)". Nucleic Acids Res. 17:2503-2516, 1989). Neste caso três iniciadores são usados para cada locus, um específico para 25 locus e dois específicos para alelo.
As extremidades 3'dos iniciadores espe- cíficos de alelo estão localizadas dentro da sequência de DIP de uma manei- ra que produtos de extensão específicos de alelo são sintetizados através de DNA polimerases.
Desta maneira, no caso de um DNA heterozigoto dois amplicons diferentes são produzidos junto com o iniciador específico de ío- 30 cus em uma PCR.
Se os dois amplicons específicos de alelo puderem ser eletroforeticamente distinguidos pelo seu tamanho um iniciador marcado (o específico de locus) pode ser usado.
Se este não for o caso um dos iniciado-
res específicos de alelo pode ser estendido em sua extremidade 5' por uma sequência de cauda artificial (cauda 5' com nucleotideos ou modificador de mobilidade) ou os dois iniciadores específicos de alelo são marcados em suas extremidades 5'com dois fluorõforos diferentes. 5 Em uma modalidade particularmente preferida pelo menos 30 loci são amplificados simultaneamente.
Em uma modalidade preferida adicional pelo menos 40 foci são simultaneamente amplificados.
Em uma modalidade preferida adicional pelo menos 50 loci são 10 amplificados simultaneamente.
Em uma modalidade particularmente preferida do ensaio de tra- çado de perfil de acordo com a invenção os três conjuntos de produtos de amplificação compreendem pelo menos seis produtos de amplificação.
Pela primeira vez os inventores demonstraram que é possível fazer uma reação 15 com 30 produtos de amplificação, onde pelo menos três cores são usadas como marcador para iniciadores de PCR.
Os inventores identificaram esta distribuição ideal que permite a detecção em dispositivos múltiplos, enquanto ao mesmo tempo permitindo uma probabilidade de identidade combinada alta (CPI). Os inventores constataram que isto permite o uso adicional da 20 quarta cor frequentemente presente em dispositivos de sequenciamento pa- ra controles elou escalas de tipo variável.
Desta maneira, o fato surpreendente de que é possível que os pelo menos três conjuntos de produtos de amplificação possam compreen- der pelo menos dez produtos de amplificação pela primeira vez permite o 25 uso de DIPs em um número suficientemente alto para permitir um score de probabilidade de identidade combinada (CPI) alto ao mesmo tempo permi- tindo uma faixa/corante/marcador controle extra.
Isto torna o uso de STRs desnecessário.
Os inventores testaram o sistema usando amostra da população 30 Alemã.
O sistema tem uma probabilidade de identidade combinada (CPI) de 2,1 x 10-13. Este é um valor excelente melhor do que o estojo AmpFISTR Minifilier que faz uso de 8 STRs (CPI de 8,21 x 10-").
`r4
Ainda os inventores podem mostrar que os 30 DIPs de acordo com a invenção têm uma CPE/Trio (probabilidade combinada de exclusão de paternidade) de 0,9979205. Desta maneira, em uma modalidade do ensaio de traçado de 5 perfil de acordo com a invenção os três conjuntos a) a c) de produtos de amplificação compreendem pelo menos dez produtos de amplificação e es- ses mostram uma probabilidade de identidade combinada (CPI) de 2,1 x 10- 13 ou melhor elou um CPE/Trio (probabilidade combinada de exclusão de paternidade) de 0,9979205 ou melhor. 10 É preferido que os dois alelos de cada locus possam diferir em tamanho em mais de 1 nucleotídeo e menos do que 40 nucleotídeos.
É preferido que os dois ou mais produtos de amplificação vari- ando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois foci diferentes carreguem um 15 quarto marcador.
Da mesma maneira com certeza em uma modalidade adi- cional 5, 6, 7 ou mais marcadores podem ser usados.
Quatro marcadores são preferidos porque devido ao teor de nucleotídeo de DNA a maioria dos dispositivos de sequenciamento de DNA que podem ser usados para detec- tar o produto é capaz de detectar 4 marcadores. 20 0 marcador é preferivelmente um corante florescente.
Tal coran- te pode ser selecionado do grupo que segue compreendendo fluoresceinai- sotiocianato (FITC), 6-carboxifluoresceína (6-FAM), xanteno, rodamina, 6- carboxi-2',4',7',4,7'-hexaclorofluoresceína (HEX), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'- dimetodifluoresceína (JOE), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TA- 25 MRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 5-carboxirodamina-6G (R6G5), 2'-cloro- 7'-fenil-1,4-dicloro-6-carboxifluoresceína (VIC), 2'-cloro-5'-fluor-7', 8'-benzo- 1 ,4-dicloro-6-carboxifluoresceína (NED) ou PET (propriedade da Applied Bi- osystems, Foster City, CA, USA), 6-carboxirodamina-6G (RG6), rodamina 110; corantes cumarina, texas red, Cy3, Cy5, Cy7 e BODIPY. 30 Uma combinação preferida é 6-FAM (azul), VIC (verde), NED (amarelo) quando usando três cores para marcadores de oligonucleotídeos de PCR e ROX (vermelho) para o padrão de comprimento interno.
E, opcio-
nalmente, 6-FAM (azul), VIC (verde), NED (amarelo) e PET (vermelho) são usados como marcadores de iniciador de PCR em combinação com um pa- drão de comprimento interno marcado LIZ (laranja). A Tabela 1 lista combi- nações preferidas adicionais de marcadores corantes usados para PCR mul- 5 tiplex em combinação com automáticos de sequenciamento de Applied Bi- osystems (Foster City, CA, USA). Deve ser mencionado que outros automá- ticos de sequenciamento multicoloridos tais como a série CEQ® 8000 Gene- tic Analyzer (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA), a série MEGABace® (GE Healthcare, Buckinghamshire, RU) ou o LI-CORE 4300 DNA Analysis System (LI-CORE Biosciences RU, Cambridge, RU) existem ou podem sur- gir que possuem outros sistemas ópticos e, então, requerem outros corantes fluorescentes e combinações de corante.
Consequentemente, modalidades da presente invenção que utilizam combinações de outros fluoróforos e são dedicadas a outros automáticos de sequenciamento são possíveis a qual- 15 quer momento.
A Patente U.S.
N2 6.734.296, as Patentes U.S.
N2 5.624.800 e o WO 2006071568 (que são aqui incorporados a título de referência) revelam o uso dos chamados modificadores de mobilidade para aumentar o grau de multiplexação para genotipificação subsequente através de eletroforese em 20 gel capilar.
Modificadores de mobilidade são definidos como modificações de não-nucleotídeo covalentes da extremidade 5'de iniciadores que diminuem a mobilidade eletroforética de produtos de amplificação de DNA, produtos de extensão de iniciador ou produtos de oligo-ligase.
Esta tecnologia permite separar fragmentos de DNA de uma pluralidade de produtos de amplificação com o mesmo número de nucleotídeos.
Em uma modalidade preferida nú- meros diferentes (n = 1, 2, 3, ...) de porções hexaetilenoglicol são sintetiza- dos através de química de fosforamidita padrão entre a extremidade 5' do oligonucleotídeo e o marcador fluorescente de subconjuntos dos iniciadores multiplex (Grossman, P.D., Bloch, W., Brinson, E., Chang, C.C., Eggerding, 30 F.A., Fung, S., lovannisci, D.M., Woo, S., Winn-Deen, E.S., "High-density multiplex detection of nucleic acid sequences: oligonucleotide ligation assay and sequence-coded separation". Nuclei Acis Res. 22:4527-34, 1994).
Tabela 1: Combinações de corantes fluorescentes que são compatíveis com dispositivos de seguenciamento da Applied Biosystems_ As abreviações para os corantes são explicadas no texto.
N° de cores azul verde amarelo vermelho laranja 4 6-FAM HEX NED ROX 4 6-FAM VIC NED ROX 4 6-FAM TET HEX TAMRA 4 6-FAM JOE NED ROX 5 6-FAM VIC NED PET LIZ 5 6-FAM HEX NED PET LIZ 4 5/6-FAM JOE TMR ROX
Em uma modalidade, a etapa de detecção é realizada com um 5 dispositivo de eletroforese em gel capilar.
A etapa de detecção pode ser também realizada em um dispositivo baseado em gel.
Seguindo a construção de escalas alélicos para loci individuais, esses podem ser misturados e carregados para eletroforese em gel ao mesmo tempo que o carregamento de amostras amplificadas acontece.
Ca- 10 da escala alélica comigra com alelos na amostra a partir do locus correspon- dente.
Os produtos das reações multiplex da presente invenção podem ser avaliados usando um padrão de faixa interno, um tipo especializado de mar- cador de tamanho configurado para funcionar na mesma faixa de um gel de poliacrilamida ou mesmo capilar.
O padrão de faixa interno consiste preferi- 15 velmente em uma série de fragmentos de comprimento conhecido.
O padrão de faixa interno é mais preferivelmente marcado com um corante fluorescente que é distinguível de outros corantes na reação de amplificação.
A invenção refere-se também ao uso dos DIPs revelados aqui 20 para fabricação de uma escala alélica.
Seguindo a construção do padrão de faixa interno, este padrão pode também ser misturado com amostra amplificada ou escalas alélicas e carregado para eletroforese para comparação de migração em faixas dife- rentes de eletroforese em gel ou capilares diferentes de eletroforese capilar.
Variação na migração do padrão de faixa interno indica variação na perfor- mance do meio de separação.
Quantificação desta diferença e correlação com as escalas alélicas permitem correção na determinação do tamanho de alelos em amostras desconhecidas. 5 Em uma modalidade adicional ainda uma ou mais sequências de repetição em tandem curtas (STR) são amplificadas elou uma ou mais se- quências de repetição em tandem de número variável (VNTR) são amplifica- das elou um ou mais polimorfismos de nucleotídeo simples (SNP) são ampli- ficados.
Desta maneira, de acordo com essas modalidades os DIPs podem 10 ser misturados com outras sequências polimórficas.
Sequências de STR são preferidas.
Frequentemente, é importante ser capaz de determinar o sexo de um indivíduo.
Desta maneira, em uma modalidade do ensaio de traçado de perfil de qualquer uma das reivindicações anteriores, onde adicionalmen- 15 te uma ou mais sequências de DNA X- elou Y-cromossomais sem variação não-recombinantes, sequências de repetição em tandem curtas especificas de sexo (STR) e/ou uma ou mais sequências de repetição em tandem de número variável específicas de sexo (VNTR) são amplificadas elou um ou mais polimorfismos de nucleotídeo simples específicos de sexo (SNP) são 20 amplificados.
Um locus preferido é o locus amelogenina do qual duas cópias parálogas, AmeIX e AmelY, existem, as quais estão localizadas dentro das regiões de não-recombinação dos gonossomas humanos (Akane, A., "Sex determination by PCR analysis of the X-Y amelogenin gene". Methods Moi.
Biol., Vol. 98, pp. 245-249, 1998). Partes de íntron 1 dos genes para amelo- 25 genina codificam DIPs que podem ser usados em determinação de sexo de amostras de origem humana desconhecida através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Por exemplo, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO:62 de DNA são sequências de Ame1X e AmelY, respectivamente, que codificam um DIP de 6 pb (-IAAAGTG). Usando os iniciadores SEQ ID NO. 185 e SEQ 30 ID NO: 186 um fragmento de 113 pb do cromossomo Xe um cromossomo Y de 119 pb podem ser amplificados e eletroforeticamente separados.
Da mesma maneira, SEQ ID NO. 63 e SEQ ID NO. 64 de DNA são sequências de AmeIX e AmelX, respectivamente, que codificam um DIP de 3 pb (-/GAT). Usando os iniciadores SEQ ID NO. 187 e SEQ ID NO. 188 um fragmento de 83 pb do cromossomo X e um cromossomo Y de 86 pb podem ser amplifica- dos e eletroforeticamente separados. 5 Os pares de iniciador para o método de acordo com a invenção devem satisfazer certos critérios.
Eles devem hibridizar especificamente para o local desejado.
Falso anelamento é muito ruim para a reação.
Um Ta de 50-68° C é preferido, um Ta de 56-65° C ou 57-63° C é ainda mais preferido e 59-61° C é mais preferido ainda.
Um teor de GC de 20-60% GC é preferi- 10 do.
Um comprimento de 18-30 pb é preferido.
Autocomplementaridade má- xima de iniciadores e complementaridade máxima entre todos os iniciadores na PCR-multiplex de 3-7 pb são preferidas.
Ainda, a seleção de iniciadores apropriados para PCRs altamente multiplexadas precisa sempre de otimiza- ção empírica para evitar subprodutos não-específicos. 15 Em uma modalidade muito preferida do ensaio de traçado de perfil de acordo com a invenção os pares de iniciador-oligonucleotídeo são selecionados do grupo de moléculas de ácido nucleico com as sequências que seguem: a) DIP NO. 1: SEQ ID NO. 125 e SEQ ID NO. 126 20 ou SEQ ID NO. 267 e SEQ ID NO. 268 b) DIP NO. 2: SEQ ID NO. 127 e SEQ ID NO. 128 c) DIP NO. 3: SEQ ID NO. 129 e SEQ ID NO. 130 d) DIP NO. 4: SEQ ID NO. 131 e SEQ ID NO. 132 e) DIP NO. 5: SEQ ID NO. 133 e SEQ ID NO. 134 25 f) DIP NO. 6: SEQ ID NO. 135 e SEQ ID NO. 136 g) DIP NO. 7: SEQ ID NO. 137 e SEQ ID NO. 138 h) DIP NO. 8: SEQ ID NO. 139 e SEQ ID NO. 140 ou SEQ ID NO. 287 e SEQ ID NO. 288 i) DIP NO. 9: SEQ ID NO. 141 e SEQ ID NO. 142 30 j) DIP NO. 10: SEQ ID NO. 143 e SEQ ID NO. 144 k) DIP NO. 11: SEQ ID NO. 145 e SEQ ID NO. 146 I) DIP NO. 12: SEQ ID NO. 147 e SEQ ID NO. 148 m) DIP NO. 13: SEQ ID NO. 149 e SEQ ID NO. 150 n) DIP NO. 14: SEQ ID NO. 151 e SEQ ID NO. 152 o) DIP NO. 15: SEQ ID NO. 153 e SEQ ID NO. 154 ou SEQ ID NO. 281 e SEQ ID NO. 282 5 p) DIP NO. 16: SEQ ID NO. 155 e SEQ ID NO. 156 q) DIP NO. 17: SEQ ID NO. 157 e SEQ ID NO. 158 ou SEQ ID NO. 273 e SEQ ID NO. 274 r) DIP NO. 18: SEQ ID NO. 159 e SEQ ID NO. 160 ou SEQ ID NO. 277 e SEQ ID NO. 278 s) DIP NO. 19: SEQ ID NO. 161 e SEQ ID NO. 162 ou SEQ ID NO. 279 e SEQ ID NO. 280 t) DiP NO. 20: SEQ ID NO. 163 e SEQ ID NO. 164 ou SEQ ID NO. 275 e SEQ ID NO. 276 u) DIP NO. 21. SEQ ID NO. 165 e SEQ ID NO. 166 v) DIP NO. 22: SEQ ID NO. 167 e SEQ ID NO. 168 w) DIP NO. 23: SEQ ID NO. 169 e SEQ ID NO. 170 x) DIP NO. 24: SEQ ID NO. 171 e SEQ ID NO. 172 y) DIP NO. 25: SEQ ID NO. 173 e SEQ ID NO. 174 z) DIP NO. 26: SEQ ID NO. 175 e SEQ ID NO. 176 aa) DIP NO. 27: SEQ ID NO. 177 e SEQ ID NO. 178 ab) DIP NO. 28: SEQ ID NO. 179 e SEQ ID NO. 180 ac) DIP NO. 29: SEQ ID NO. 181 e SEQ ID NO. 182 ou SEQ ID NO. 271 e SEQ ID NO. 272 ad) DIP NO. 30: SEQ ID NO. 183 e SEQ ID NO. 184 ou SEQ ID NO. 283 e SEQ ID NO. 284 ae) DIP NO. 31: SEQ ID NO. 185 e SEQ ID NO. 186 aí) DIP NO. 32: SEQ ID NO. 187 e SEQ ID NO. 188 ou SEQ ID NO. 269 e SEQ ID NO. 270 ag) DIP NO. 33: SEQ ID NO. 189 e SEQ ID NO. 190 ou SEQ ID NO. 285 e SEQ ID NO. 286 ah) DIP NO. 34: SEQ ID NO. 191 e SEQ ID NO. 191 ai) DIP NO. 35: SEQ ID NO. 193 e SEQ ID NO. 194 aj) DIP NO. 36: SEQ ID NO. 195 e SEQ ID NO. 196 ak) DIP NO. 37: SEQ ID NO. 197 e SEQ ID NO. 198 al) DIP NO. 38: SEQ ID NO. 199 e SEQ ID NO. 200 am) DIP NO. 39: SEQ ID NO. 201 e SEQ ID NO. 202 5 an) DIP NO. 40: SEQ ID NO. 203 e SEQ ID NO. 204 ao) DIP NO. 41: SEQ ID NO. 205 e SEQ ID NO. 206 ou SEQ ID NO. 251 e SEQ 1D NO. 252 ap) DIP NO. 42: SEQ ID NO. 207 e SEQ ID NO. 208 ou SEQ ID NO. 253 e SEQ ID NO. 254 aq) DIP NO. 43: SEQ ID NO. 209 e SEQ ID NO. 210 ou SEQ ID NO. 255 e SEQ ID NO. 256 ar) DIP NO. 44: SEQ ID NO. 211 e SEQ ID NO. 212 ou SEQ ID NO. 257 e SEQ ID NO. 258 as) DIP NO. 45: SEQ ID NO. 213 e SEQ ID NO. 214 ou SEQ ID NO. 259 e SEQ ID NO. 260 at) DIP NO. 46: SEQ ID NO. 215 e SEQ ID NO. 216 ou SEQ ID NO. 261 e SEQ ID NO. 262 au) DIP NO. 47. SEQ ID NO. 217 e SEQ ID NO. 218 ou SEQ ID NO. 263 e SEQ ID NO. 264 av) DIP NO. 48: SEQ ID NO. 219 e SEQ ID NO. 220 aw) DIP NO. 49: SEQ ID NO. 221 e SEQ ID NO. 222 ax) DIP NO. 50: SEQ ID NO. 223 e SEQ ID NO. 224 ay) DIP NO. 51: SEQ ID NO. 225 e SEQ ID NO. 226 ou SEQ ID NO. 265 e SEQ ID NO. 266 az) DIP NO. 52: SEQ ID NO. 227 e SEQ ID NO. 228 ba) DIP NO. 53: SEQ ID NO. 229 e SEQ ID NO. 230 bb) DIP NO. 54: SEQ ID NO. 231 e SEQ ID NO. 232 bc) DIP NO. 55: SEQ ID NO. 233 e SEQ ID NO. 234 bd) DIP NO. 56: SEQ ID NO. 235 e SEQ ID NO. 236 be) DIP NO. 57: SEQ ID NO. 237 e SEQ ID NO. 238 bt) DIP NO. 58: SEQ ID NO. 239 e SEQ ID NO. 240 bg) DIP NO. 59: SEQ ID NO. 241 e SEQ ID NO. 242 bh) DIP NO. 60: SEQ ID NO. 243 e SEQ ID NO. 244 bi) DIP NO. 61: SEQ ID NO. 245 e SEQ ID NO. 246 bj) DIP NO. 62: SEQ ID NO. 247 e SEQ ID NO. 248 bk) DIP NO. 63: SEQ ID NO. 249 e SEQ ID NO. 250 5 Preferivelmente pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou mais de 30 pares são selecionados.
A invenção refere-se a um estojo para uso em um método de traçado de perfil de DNA compreendendo pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais pares de iniciador para amplificação de reação em cadeia da polimera- se, onde os pares de iniciador, consistindo em cada um de um iniciador a montante e um a jusante, são capazes de se ligar à sequência de DIP espe- cífica de acordo com qualquer uma das sequências selecionadas do grupo 15 de, DIP NO. 1: - SEQ ID NO. 1 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 2 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 2: - SEQ ID NO. 3 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 4 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, DIP NO. 3: - SEQ ID NO. 5 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 6 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 4: - SEQ ID NO. 7 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 8 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 262, DIP NO. 5: 5 - SEQ ID NO. 9 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 10 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 6: 10 - SEQ ID NO. 11 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 12 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 7: 15 - SEQ ID NO. 13 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 14 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 8: 20 - SEQ ID NO. 15 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No.251 e No. 252, - SEQ ID NO. 16 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256, DIP NO. 9: 25 - SEQ ID NO. 17 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 18 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 10: 30 - SEQ ID NO. 19 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247, - SEQ ID NO. 20 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, DIP NO. 11: - SEQ ID NO. 21 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 5 - SEQ ID NO. 22 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 12: - SEQ ID NO. 23 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 10 - SEQ ID NO. 24 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 260, DIP NO. 13: - SEQ ID NO. 25 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 15 - SEQ ID NO. 26 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 14: - SEQ ID NO. 27 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 20 - SEQ ID NO. 28 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 15: - SEQ ID NO. 29 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 25 - SEQ ID NO. 30 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 16: - SEQ ID NO. 31 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 30 - SEQ ID NO. 32 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO: 17:
- SEQ ID NO. 33 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 34 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 270, 5 DIP NO. 18: - SEQ ID NO. 35 onde o polimorfismo de inserção-deleção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 36 onde o polimorfismo de inserção-deleção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, 10 DIP NO. 19: - SEQ ID NO. 37 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 38 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, 15 DIP NO. 20: - SEQ ID NO. 39 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 40 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, 20 DIP NO. 21: - SEQ ID NO. 41 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ 1D NO. 42 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, 25 DIP NO. 22: - SEQ ID NO. 43 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 44 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 257, 30 DIP NO. 23: - SEQ ID NO. 45 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252,
- SEQ ID NO. 46 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 24: - SEQ 1D NO. 47 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 48 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 25: - SEQ ID NO. 49 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 50 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 296, DIP NO. 26: - SEQ ID NO. 51 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 52 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 266, DIP NO 27: - SEQ ID NO. 53 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 54 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 273, DIP NO. 28: - SEQ ID NO. 55 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 56 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 260, DIP NO. 29: - SEQ ID NO. 57 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 58 onde o polimorfismo de deleção-inserçáo está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 267,
DIP NO. 30: - SEQ ID NO. 59 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 60 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 270, DIP NO. 31: - SEQ ID NO. 61 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 271 e No. 272, - SEQ ID NO. 62 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 271 e No. 278, DIP NO. 32: - SEQ ID NO. 63 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 280 e No. 281, - SEQ ID NO. 64 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 280 e No. 284, DIP NO. 33: - SEQ ID NO. 65 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 66 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, ie]Ia►1;+lI - SEQ ID NO. 67 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 68 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 35: - SEQ ID NO. 69 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 70 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, If]I2►LS I1 - SEQ ID NO. 71 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 72 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 258, DIP NO. 37: 5 - SEQ ID NO. 73 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 74 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, I' r• c: 10 - SEQ ID NO. 75 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 255 e No. 256, - SEQ ID NO. 76 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 255 e No. 261,
15 - SEQ ID NO. 77 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 78 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 40: 20 - SEQ ID NO. 79 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 80 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 259, DIP NO. 41: 25 - SEQ ID NO. 81 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 82 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 254, DIP NO. 42: 30 - SEQ ID NO. 83 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 84 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 254, DIP NO. 43: - SEQ ID NO. 85 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 5 - SEQ ID NO. 86 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 255, DIP NO. 44: - SEQ ID NO. 87 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 10 - SEQ ID NO. 88 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 45: - SEQ ID NO. 89 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 15 - SEQ ID NO. 90 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 46: - SEQ ID NO. 91 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 20 - SEQ ID NO. 92 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 47: - SEQ ID NO. 93 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 25 - SEQ ID NO. 94 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 48: - SEQ ID NO. 95 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 30 - SEQ ID NO. 96 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 49:
- SEQ ID NO. 97 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 247 e No. 248, - SEQ ID NO. 98 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 247 e No. 252, 5 DIP NO. 50: - SEQ ID NO. 99 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 100 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, 10 DIP NO. 51: - SEQ ID NO. 101 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 102 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, 15 DIP NO. 52: - SEQ ID NO. 103 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 104 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 256, 20 DIP NO. 53: - SEQ ID NO. 105 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 106 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, 25 DIP NO. 54: - SEQ ID NO. 107 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 108 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, 30 DIP NO. 55: - SEQ ID NO. 109 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252,
- SEQ ID NO. 110 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 56: - SEQ ID NO. 111 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotideos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 112 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 258, DIP NO. 57: - SEQ ID NO. 113 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247, - SEQ ID NO. 114 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, DIP NO. 58: - SEQ ID NO. 115 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 116 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 263, DIP NO. 59: - SEQ ID NO. 117 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 118 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 266, DIP NO. 60: - SEQ ID NO. 119 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 120 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 268, DIP NO. 61: - SEQ ID NO. 121 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 122 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 277,
DIP NO. 62: - SEQ ID NO. 123 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 124 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 63: - SEQ ID NO. 289 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 290 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, e onde os pares de iniciador são cada um específicos para uma sequência de DIP diferente.
É preferido que o estojo compreenda pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 25, 27 ou mais 15 de 30 pares de iniciador.
É preferido que o estojo compreenda pelo menos iniciadores pa- ra 20, 30 ou 40 DIPs e que tal estojo compreenda iniciadores para o DIP número 31 (SEQ ID Nos. 61 e 62) e para o DIP número 32 (SEQ ID Nos. 63 e 64). Esses dois DIPs são DIPs no cromossomo Y e no cromossomo X, respectivamente.
É preferido que o estojo compreenda 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 pares de iniciador que são cada um capazes de se ligar a uma sequência diferente selecionada do grupo revelado acima. 25 É preferido um estojo onde os pares de iniciador são seleciona- dos do grupo de pares de iniciador que seguem: a) DIP NO. 1: SEQ ID NO. 125 e SEQ ID NO. 126 ou SEQ ID NO. 267 e SEQ ID NO. 268 b) DIP NO. 2: SEQ ID NO. 127 e SEQ ID NO. 128 30 c) DIP NO. 3: SEQ ID NO. 129 e SEQ ID NO. 130 d) DIP NO. 4: SEQ ID NO. 131 e SEQ ID NO. 132 e) DIP NO. 5: SEQ ID NO. 133 e SEQ ID NO. 134 f) DIP NO. 6: SEQ ID NO. 135 e SEQ ID NO. 136 g) DIP NO. 7: SEQ ID NO. 137 e SEQ ID NO. 138 h) DIP NO. 8: SEQ ID NO. 139 e SEQ ID NO. 140 ou SEQ ID NO. 287 e SEQ ID NO. 288 5 i) DIP NO. 9: SEQ ID NO. 141 e SEQ ID NO. 142 j) DIP NO. 10: SEQ ID NO. 143 e SEQ ID NO. 144 k) DIP NO. 11: SEQ ID NO. 145 e SEQ ID NO. 146 !) DIP NO. 12: SEQ ID NO. 147 e SEQ ID NO. 148 m) DIP NO. 13: SEQ ID NO. 149 e SEQ ID NO. 150 n) DIP NO. 14: SEQ ID NO. 151 e SEQ ID NO. 152 o) DIP NO. 15: SEQ ID NO. 153 e SEQ ID NO. 154 ou SEQ ID NO. 281 e SEQ ID NO. 282 p) DIP NO. 16: SEQ ID NO. 155 e SEQ ID NO. 156 q) DIP NO. 17: SEQ ID NO. 157 e SEQ ID NO. 158 ou SEQ ID NO. 273 e SEQ ID NO. 274 r) DIP NO. 18: SEQ ID NO. 159 e SEQ ID NO. 160 ou SEQ ID NO. 277 e SEQ ID NO. 278 s) DIP NO. 19: SEQ ID NO. 161 e SEQ ID NO. 162 ou SEQ ID NO. 279 e SEQ ID NO. 280 t) DIP NO. 20: SEQ ID NO. 163 e SEQ ID NO. 164 ou SEQ ID NO. 275 e SEQ ID NO. 276 u) DIP NO. 21: SEQ ID NO. 165 e SEQ ID NO. 166 v) DIP NO. 22: SEQ ID NO. 167 e SEQ ID NO. 168 w) DIP NO. 23: SEQ ID NO. 169 e SEQ ID NO. 170 x) DIP NO. 24: SEQ ID NO. 171 e SEQ ID NO. 172 y) DIP NO. 25: SEQ ID NO. 173 e SEQ ID NO. 174 z) DIP NO. 26: SEQ ID NO. 175 e SEQ ID NO. 176 aa) DIP NO. 27: SEQ ID NO. 177 e SEQ ID NO. 178 ab) DIP NO. 28: SEQ ID NO. 179 e SEQ ID NO. 180 ac) DIP NO. 29: SEQ ID NO. 181 e SEQ ID NO. 182 ou SEQ ID NO. 271 e SEQ ID NO. 272 ad) DIP NO. 30: SEQ ID NO. 183 e SEQ ID NO. 184 ou SEQ ID NO. 283 e SEQ ID NO. 284 ae) DIP NO. 31: SEQ ID NO. 185 e SEQ ID NO. 186 af) DIP NO. 32: SEQ ID NO. 187 e SEQ ID NO. 188 ou SEQ ID NO. 269 e SEQ ID NO. 270 5 ag) DIP NO. 33: SEQ ID NO. 189 e SEQ ID NO. 190 ou SEQ ID NO. 285 e SEQ ID NO. 286 ah) DIP NO. 34: SEQ ID NO. 191 e SEQ ID NO. 191 ai) DIP NO. 35: SEQ ID NO. 193 e SEQ ID NO. 194 aj) DIP NO. 36: SEQ ID NO. 195 e SEQ ID NO. 196 10 ak) DIP NO. 37: SEQ ID NO. 197 e SEQ ID NO. 198 al) DIP NO. 38: SEQ ID NO. 199 e SEQ ID NO. 200 am) DIP NO. 39: SEQ ID NO. 201 e SEQ ID NO. 202 an) DIP NO. 40: SEQ ID NO. 203 e SEQ ID NO. 204 ao) DIP NO. 41: SEQ ID NO. 205 e SEQ ID NO. 206 15 ou SEQ ID NO. 251 e SEQ ID NO. 252 ap) DIP NO. 42: SEQ ID NO. 207 e SEQ ID NO. 208 ou SEQ ID NO. 253 e SEQ ID NO. 254 aq) DIP NO. 43: SEQ ID NO. 209 e SEQ ID NO. 210 ou SEQ ID NO. 255 e SEQ ID NO. 256 20 ar) DIP NO. 44: SEQ ID NO. 211 e SEQ ID NO. 212 ou SEQ ID NO. 257 e SEQ ID NO. 258 as) DIP NO. 45: SEQ ID NO. 213 e SEQ ID NO. 214 ou SEQ ID NO. 259 e SEQ ID NO. 260 at) DIP NO. 46: SEQ ID NO. 215 e SEQ ID NO. 216 25 ou SEQ ID NO. 261 e SEQ ID NO. 262 au) DIP NO. 47: SEQ ID NO. 217 e SEQ ID NO. 218 ou SEQ ID NO. 263 e SEQ ID NO. 264 av) DIP NO. 48: SEQ ID NO. 219 e SEQ ID NO. 220 aw) DIP NO. 49: SEQ ID NO. 221 e SEQ ID NO. 222 30 ax) DIP NO. 50: SEQ ID NO. 223 e SEQ ID NO. 224 ay) DIP NO. 51: SEQ ID NO. 225 e SEQ ID NO. 226 ou SEQ ID NO. 265 e SEQ ID NO. 266 az) DIP NO. 52: SEQ ID NO. 227 e SEQ ID NO. 228 ba) DIP NO. 53: SEQ ID NO. 229 e SEQ ID NO. 230 bb) DIP NO. 54: SEQ ID NO. 231 e SEQ ID NO. 232 bc) DIP NO. 55: SEQ ID NO. 233 e SEQ ID NO. 234 5 bd) DIP NO. 56: SEQ ID NO. 235 e SEQ ID NO. 236 be) DIP NO. 57: SEQ ID NO. 237 e SEQ ID NO. 238 bt) DIP NO. 58: SEQ ID NO. 239 e SEQ ID NO. 240 bg) DIP NO. 59: SEQ ID NO. 241 e SEQ ID NO. 242 bh) DIP NO. 60: SEQ ID NO. 243 e SEQ ID NO. 244 10 bi) DIP NO. 61: SEQ ID NO. 245 e SEQ ID NO. 246 bj) DIP NO. 62: SEQ ID NO. 247 e SEQ ID NO. 248 bk) DIP NO. 63: SEQ ID NO. 249 e SEQ ID NO. 250 Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso de uma sele- ção de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 15 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais sequências selecionadas do grupo de: DIP NO. 1: - SEQ ID NO. 1 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 20 - SEQ ID NO. 2 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 2: - SEQ ID NO. 3 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 25 - SEQ ID NO. 4 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, DIP NO. 3: - SEQ ID NO. 5 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 30 - SEQ ID NO. 6 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 4:
- SEQ ID NO. 7 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 8 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 262, 5 DIP NO. 5: - SEQ ID NO. 9 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 10 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No 256, 10 DIP NO. 6: - SEQ ID NO. 11 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 12 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, 15 DIP NO. 7: - SEQ ID NO. 13 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 14 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, 20 DIP NO. 8: - SEQ ID NO. 15 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No.251 e No. 252, - SEQ ID NO. 16 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, 25 DIP NO. 9: - SEQ ID NO. 17 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 18 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 257, 30 DIP NO. 10: - SEQ ID NO. 19 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247,
- SEQ ID NO. 20 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, DIP NO. 11: - SEQ ID NO. 21 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 22 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 12: - SEQ ID NO. 23 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 24 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 260, DIP NO. 13: - SEQ ID NO. 25 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 26 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 14: - SEQ ID NO. 27 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 28 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 15: - SEQ ID NO. 29 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 30 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 16: - SEQ ID NO. 31 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 32 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256,
m
DIP NO: 17: - SEQ ID NO. 33 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 34 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 270, DIP NO. 18: - SEQ ID NO. 35 onde o polimorfismo de inserção-deleção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 36 onde o polimorfismo de inserção-deleção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 19: - SEQ ID NO. 37 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 38 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 20: - SEQ ID NO. 39 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 40 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 21: - SEQ ID NO. 41 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 42 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 22: - SEQ ID NO. 43 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 44 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 257, DIP NO. 23: - SEQ ID NO. 45 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 46 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, U7110[II*ZI 5 - SEQ ID NO. 47 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 48 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 25: 10 - SEQ ID NO. 49 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 50 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 296, DiP NO. 26: 15 - SEQ ID NO. 51 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 52 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 266, DIP NO 27: 20 - SEQ ID NO. 53 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 54 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 273, DIP NO. 28: 25 - SEQ ID NO. 55 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 56 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 29: 30 - SEQ ID NO. 57 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 58 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 267, I_91120418 X0"1 - SEQ ID NO. 59 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 5 - SEQ ID NO. 60 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No 270, DIP NO. 31: - SEQ ID NO. 61 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 271 e No. 272, 10 - SEQ ID NO. 62 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 271 e No. 278, DIP NO. 32: - SEQ ID NO. 63 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 280 e No. 281, 15 - SEQ ID NO. 64 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 280 e No. 284, DIP NO. 33: - SEQ ID NO. 65 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 20 - SEQ ID NO. 66 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 34: - SEQ ID NO. 67 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, 25 - SEQ ID NO. 68 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 35: - SEQ ID NO. 69 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 30 - SEQ ID NO. 70 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, DIP NO. 36:
- SEQ ID NO. 71 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 72 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 258, 5 DIP NO. 37: - SEQ ID NO. 73 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 74 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, 10 DIP NO. 38: - SEQ ID NO. 75 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 255 e No. 256, - SEQ ID NO. 76 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 255 e No. 261, 15 DIP NO. 39: - SEQ ID NO. 77 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 78 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256, 20 DIP NO. 40: - SEQ ID NO. 79 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 80 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 259, 25 DIP NO. 41: - SEQ ID NO. 81 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 82 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 254, 30 DIP NO. 42: - SEQ ID NO. 83 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252,
- SEQ ID NO. 84 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 254, I2ll,i:[0)1k] - SEQ ID NO. 85 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 86 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 255, DIP NO. 44: - SEQ ID NO. 87 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 88 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 45: - SEQ ID NO. 89 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 90 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 46: - SEQ ID NO. 91 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 92 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 47: - SEQ ID NO. 93 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 94 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 48: - SEQ ID NO. 95 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 96 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256,
DIP NO. 49: - SEQ ID NO. 97 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 247 e No. 248, - SEQ ID NO. 98 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 247 e No. 252, DIP NO. 50: - SEQ ID NO. 99 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 100 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotideos No. 250 e No. 256, DIP NO. 51: - SEQ ID NO. 101 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 102 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 52: - SEQ ID NO. 103 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 104 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 53: - SEQ ID NO. 105 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 106 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 54: - SEQ ID NO. 107 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 108 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 55: - SEQ ID NO. 109 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 110 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 56: 5 - SEQ ID NO. 111 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 112 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 258, DIP NO. 57: 10 - SEQ ID NO. 113 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247, - SEQ ID NO. 114 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, DIP NO. 58: 15 - SEQ ID NO. 115 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 116 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 263, DIP NO. 59: 20 - SEQ ID NO. 117 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 118 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 266, DIP NO. 60: 25 - SEQ ID NO. 119 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 120 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 268, I1II►[i U 30 - SEQ ID NO. 121 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 122 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 277, DIP NO. 62: - SEQ ID NO. 123 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 5 - SEQ ID NO. 124 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260 e DIP NO. 63: - SEQ ID NO. 289 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 10 - SEQ ID NO. 290 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256. As sequências podem ser usadas apenas em parte.
O uso pode ser 90% da sequência, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% ou 20% contanto que o uso compreenda DIP.
Isto significa que se uma sequência que tenha 15 100 nucleotídeos for revelada aqui e o DIP esteja localizado 30 nucleotídeos distantes da extremidade 5' da sequência, então um uso de 50% significaria, por exemplo, amplificação dos primeiros 50 nucleotídeos começando na ex- tremidade 5', também significaria com certeza amplificação de quaisquer 50 nucleotídeos contanto que compreendesse o polimorfismo DIP.
Os DIPs 20 Nos. 31 e 32 são os DIPs de amelogenina.
É preferido que esses sejam par- te daqueles DIPs selecionados.
Em uma modalidade, o estojo pode compreender ainda compo- nentes necessários para realizar aplicações de "PCR em tempo real". O ter- mo "PCR em tempo real" descreve um sistema baseado na detecção e na 25 quantificação de um sinal fluorescente.
Este sinal aumenta em proporção direta à quantidade de produto de PCR em uma reação.
Ao registrar a quan- tidade de emissão de fluorescência em cada ciclo, é possível monitorar a reação de PCR durante fase exponencial onde o primeiro aumento signifi- cante na quantidade de produto de PCR se relaciona com a quantidade ini- 30 cial de molde alvo.
Quanto maior o número de cópia de inicialização do alvo de ácido nucleico, mais cedo um aumento significante em fluorescência é observado.
Um aumento significante em fluorescência acima do valor de linha de base medido durante 3-15 ciclos indica a detecção de produto de PCR acumulado.
Componentes incluem, mas não estão limitados a, coran- tes de intercalação, iniciadores e sondas fluorescentemente marcados e de- rivados dos mesmos. 5 Os estojos da presente invenção podem incluir panfletos infor- mativos.
É preferido que o uso de acordo com o ensaio de traçado de perfil da invenção seja um ensaio de reação em cadeia de ligase, um ensaio de hibridização, ensaio de reação em cadeia da polimerase, ensaios basea- 10 do em chip.
Um ensaio de hibridização, extensão de iniciador disposto (A- PEX) também referido como reação de minissequenciamento baseada em chip ou extensão de base simples, ensaio de ligação disposta, ensaio de ligação disposta específica de alelo é também preferido.
Um ensaio de rea- ção em cadeia da polimerase é mais preferido. 15 Outras técnicas de genotipificação que possuem um grau alto de capacidade multiplex são tecnologias à base de chip extensão de iniciador de base simples (SnaPShot) ou baseada em OLA (SNPIex) em combinação com eletroforese capilar e tecnologias à base de conta com sequências de endereçamento.
Esses e os métodos abaixo podem ser usados com as son- 20 das reveladas aqui e se encaixam na invenção.
Técnicas de detecção adicionais são conhecidas, as quais per- mitem genotipificação de polimorfismos bialélicos a partir de misturas de DNA multiplex.
Para revisões vide Syvãnen (2001) (Syvãnen, A.C.; 2001. "Acessing genetic variation: Genotyping single nucleotide polymorphisms". 25 Nature Reviews Genetics 2:930-941) e Kwock (2003) (Kwock, P.Y., 2003. "Single Nucleotide Polymorphisms". Methods and Protocols.
Humana Press, Totowa, Nova Jersey, USA). De valor particular para o processo da invenção são aquelas técnicas que permitem a genotipificação simultânea de uma pluralidade de DIPs em uma reação.
Dois sistemas comerciais disponíveis 30 que são automáticos de sequenciamento de DNA multicor em combinação com eletroforese capilar são o SNaPshot® Multiplex System e o SNPlex® Genotyping System (ambos da Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
O primeiro é um método baseado em extensão de iniciador que permite, de acordo com o fabricante, a detecção de mais de 10 polimorfismo bialélicos, o segundo combina um ensaio de ligação de alelo multiplex-oligo específico (OLA) com uma PCR e permite a genotipificação simultânea de até 48 poli- 5 morfismos bialélicos. Outra abordagem de genotipificação multiplex baseada em eletroforese é descrita como Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifi- cation (MLPA; Schouten, J.O., McElgunn, C.J., Waaijer, R., Zwijnenburg, D., Diepvens, F. e Pals, G. (2002). "Relative Quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification". Nucleic A- cids Res., 30:e57). Ainda, tecnologias baseadas em DNA chip são de uso especial para o processo da invenção. A Patente U.S. No. 820.542 e a Pa- tente U.S. No. 5.679.524 (que são aqui incorporadas a título de referência) revelam ensaios de hibridização específicos para alelo baseados em chip, extensão de iniciador disposta (APEX, também referida como reação de mi- 15 nissequenciamento baseada em chip ou extensão de iniciador de base sim- pies em um chip), reação de ligação disposta e ensaio de ligação disposta específica de alelo. A Patente E.U. N2 799.897 (que é aqui incorporada a título de referência) ensina o uso de etiqueta-disposições universais e a Pa- tente U.S. N2 1.186.669 897 (que é aqui incorporada a título de referência) refere-se a específico de alelo aninhado em um chip (NOC®-PCR). Final- mente, a Patente U.S. No. 6.287.778 897 (que é aqui incorporada a título de referência) descreve etiqueta-sequências universais em combinação com contas. O estojo da invenção pode ser usado para traçado de perfil de 25 DNA, em particular para aplicações forenses. O estojo pode compreender ainda uma escala alélica.
TEXTO EXPLICATIVO DA FIGURA Figura 1: Traçado de perfil de DNA humano e determinação do sexo através de amplificação de PCR multiplex e genotipificação de um DIP 30 gonossomal e 30 autossomais. Eletroferogramas que mostram as unidades fluorescentes relati- vas (RFUs) para os corantes 6-FAM, VIC, NED, PET e LIZ no tamanho de fragmento em pares de base [pb] são mostrados.
A PCR multiplex e a geno- tipificação foram feitas conforme explicado no texto para o exemplo 1 come- çando do DNA genômico 250 pg de uma pessoa do sexo masculino.
Uma etapa de purificação pós-PCR foi aplicada antes da eletroforese conforme 5 mostrado no texto.
Um padrão de tamanho marcado com LIZ interno foi usa- do para calcular o tamanho do fragmento.
A especificação entre picos e ale- los é marcada na parte inferior de cada eletroferog rama.
Figura 2: Compilação de códigos de marcador de DIP e números de SEQ ID de alelos e iniciadores de PCR 10 EXEMPLOS Exemplo 1: Traçado de perfil de DNA humano e determinação de sexo através de amplificação de PCR multiplex e genotipificação de um DIP gonossoma e 30 autossomais Protocolos básicos e preparação de DNA.
Todos os reagentes e 15 outros consumíveis usados eram de qualidade de PCR, particularmente Ii- vres de DNA, nucleases dependentes de DNA e RNA.
Experimentos genéti- cos moleculares básicos foram feitos de acordo com Sambrook e outros (1989) (Sambrook, J., Fritsche, E.F_, Maniatis, T.
Molecular cloning: A labo- ratory manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989). Espé- 20 cimes de teste humanos eram sangue integral ou esputo, o último deles foi coletado com esfregaços bucais estéreis (Nerbe Plus GmbH, Winsen/Luhe, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
DNA foi extraído u- sando o estojo NucleoSpin® Tissue (Macherey Nagel, & Dueren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
Quantificação de DNA foi feita 25 através de espectroscopia VIS UV (Sambrook e outros, 1989) registrando a absorbãncia de bases de nucleotídeo a 260 nm ou PCR em tempo real quantitativa (qPCR) usando o estojo Quantifyler@ Human DNA quantification (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e um termociclizador de tempo real ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 30 Seleção de marcadores genéticos e proleto de iniciador de PCR.
Um DIP de 3 pb (SEQ ID NOs. 61 e 62) e um DIP de 6 pb (SEQ ID NOs. 63 e 64) que distinguem as duas cópias parálogas do gene de amelogenina humano que estão localizadas dentro das regiões de não-recombinação dos cromossomos X e Y foram escolhidos para determinação do sexo.
O locus de DIP definido pela SEQ ID NO. 63164 foi usado ainda dentro da PCR mul- tiplex deste exemplo.
No total 61 loci de DIP autossomal foram usados de 5 acordo com os critérios que seguem: sequência-alvo de cópia simples defi- nida e mapeada dentro do genoma humano, comprimento de nucleotídeo do DIP 2-30 pb, localização em cromossomos ou distância física diferentes dos marcadores de pelo menos 10.000.000 pb para multiplexes de PCR, fre- quência de alelo do alelo menor 0,3-0,5 e heterozigosidade de pelo menos 10 40% relatada em pelo menos um estudo de população.
A partir desses loci 30 DIPs que são mostrados na tabela 2 foram usados adicionalmente para a PCR multiplex deste exemplo.
Projeto de iniciador de PCR foi realizado.
A especificidade dos iniciadores foi checada contra a sequência de genoma humano usando o software Blastn ("Basic Local Alignment Search Tool Nu- 15 cleotides"; Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. "Basic local alignment search tool". J.
Mol.
Biol., Vol. 215, pp. 403-410, 1990). A compatibilidade dos pares de iniciador para multiplexação foi con- trolada com o software Autodimer (Vallone, P.M., Butler, J_M. "AutoDimer: a screening tool for iniciador-dimer and hairpin structures". Biotechniques, Vol. 20 37, pp. 226-231, 2004). Para multiplexação os pares de iniciador de oligonu- cleotídeo foram cuidadosamente selecionados mais de acordo com seu ta- manho de amplicon e marcador de corante fluorescente para garantir sepa- ração de sinal ótima em eletroforese em gel capilar.
Os iniciadores de oligo- nucleotídeo foram sintetizados através de química de fosforamidita padrão 25 em um laboratório de prestação de serviço (Eurogentec, S.A., Seraing, Bél- gica: ou Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Um iniciador de cada par de iniciador foi covalentemente marcado em sua extremidade 5' com os corantes fluorescentes 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2'-cloro-7'-fenil-1,4- dicloro-6-carboxifluoresceína (VIC), 2'-cloro-5'-fluor-7',8'-benzo-1,4-dicloro-6- 30 carboxifluoresceína (NED) ou PET (propriedade da Applied Biosystems, Fos- ter City, CA, USA) usando química padrão.
Todos os iniciadores foram puri- ficados nos laboratórios de prestação de serviço através de uma cromato-
grafia líquida de alta performance de fase reversa em par de íon de acordo com protocolos padrão, dissolvidos em tampão de TE (Tris/HCI 10 mM, pH 8,0, ajustado em temperatura ambiente, EDTA 1 mM) para 100 iiMolar e ar- mazenados a 4° C no escuro. 5 A qualificação dos iniciadores quanto à sensitividade e especifi- cidade foi primeiro testada em PCR monoplex (vide próximo intervalo) em concentração final de 200 nM aplicando concentrações diferentes de DNA humano (0,03-5,0 ng) e não-humano (até 20 ng). Ainda, gradientes de tem- peratura (55-65° C) para a etapa de anelamento foram aplicados.
Esses ex- 10 perimentos foram repetidos para o ajuste de PCR multiplex e muitas rodadas de novo projeto de iniciador manual bem como otimização das concentra- ções de iniciador foram realizadas.
Os iniciadores finais e sua concentração em PCR multiplex são mostrados na tabela 2. Reação em cadeia da polimerase (PCR). A reação de enzima 15 continhaa em um volume total de 25 pL Tris/HCI 50 mM (pH 8,8; ajustado em temperatura ambiente), NH4SO2 20 mM, dNTPs 0,2 mM (mistura equi- molar de dATP, dCTP, dGTP, dTTP), MgCl2 1,5 mM, 1,5 Unidade de JumpS- tart® Taq DNA polimerase (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Ale- manha), 200 pg/mI de albumina de soro bovino (Roche Diagnostics GmbH, 20 Mannheim, Alemanha), Tween 20 0,01% e 0,1-1,0 ng de DNA genômico humano.
Os pares de iniciador usados e sua concentração final na PCR são mostrados na tabela 2, e suas sequências de nucleotídeo são mostradas nos protocolos de sequência (SEQ ID NOs. 125-184 e 187-188). Um termo- ciclizador ABI 9600 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) foi usado.
As 25 condições de ciclização consistiam em uma ativação térmica inicial de 240 s a 95° C, seguido por 30 ciclos de 30 s de desnaturação a 94° C, 120 s de anelamento de iniciador a 60° C e extensão de iniciador de 75 s a 72° C.
A velocidade da rampa foi ajustada para 1° C/s para todas as mudanças de temperatura.
Em seguida uma etapa de alongamento final de 3600 s a 68° C 30 foi realizada para maximizar a adição independente de molde de um nucleo- tídeo na extremidade 3' (preferivelmente A) devido à atividade de transferase terminal intrínseca de Taq DNA polimerase.
IMO L- t4 x O O O O O O O O O O O O O O O C) C) C O O (D (D ct t 't'ÇI C) C) d' ct (V N co co N N N Np N N C\) CV N N r r r r r r r r r L 9 U-E _ a) Ii ❑ o a E ª~ + + + + + + + + + + + + + + + + + + ó r r N Nl) 'j LO 127 () CU co I` I- 00 00 0) d) ~- N m O N v O a)) cìá O (1) a) Cl) Cl) (I) (I) (I) a) (l) •- O L 1 1 1 1 1 O -O r r N N (') f 1 Y I 1 i I 1* LCD LO (Q CD ti ti co co 0) () c, I 1 1 1 1 1 ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ E óU 0 0 o ct E o c~ o QQ N = = x- = CO - - C) i U+ CU CO Co 00 C) = NN Nt `* Q N N N C) o N N Qì O O N N Q} Q} 1) (D U) Z r r cr) Com! LC) 'O N- N- r r- c) c) LO LO I` f` d) U O C-© r r r r r T T r O -0 Q) o C U) c .0 "O 1 O d) O 1 U) o ú OU)
O E Ú E 2 O 2E O E E 2E E E C U C U_ N O Q) LW c W c LL C LL c LL c LL C LL C LL C> C Q ~ O Cl) (I] O O 6 O a) Cl) O a) r C C C C C C C C C E c ~ c
LCD O E º U
O O a- U o ~ U C❑ o 0 o O w U) U) o U Q ~ U a)o U)0 Q Q) o oE U 0 C) 0 (D Q Q Q v Q a)
U O C o<
C o QU C uj <~¢{~OPcDQ~5(~Q~~U<H O `cl) a) FU- H U ~} Ú Q Q `-' Q Q V (D U H Ú a) U U o Ü_ ~ 1-
N - LC) CO I,- OO M O r N M nt LO CQ I-- 00 d) O r N n O- 0 NN N N ('4 C') ch c`) c) cr] c') cr) M M c' ct Cl) Z r 'r- r r r r r r r r c- r-- - r- r - r r r F-
le U L, C x o C) o a o C) C) C) 0 C) C) C) a C) C) C) C) C) C 0 N O O (O (p a) O C) C) C) N N (N N C) C) 'cJ d CU o 5 0-E c~ 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + E O ) T r N (N CO CO c} 'o 'o CD to N- 1- CD DO Q) C) C7 T r T f T r T r r r r r r r f T r T = N o o ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ ❑ 000 ❑ ❑ ❑ -❑ O NQ) Q) o N O 0 N O Q) Q) N Q) Q? XD O o O CD - c O -0 C) r r N (N CO CO o 1 e 1 1 1 1 1 1 1 e 1 l£) LO CO CD 1-- f-- CO co m à) C) 1 e a a e e 1 i 0 r T T T T T T T T r T T T r T T T r T (1J Ú 00000000000000000000 o
O j c> N N (O CO CO CO O O (N CV Cp C) CO O N N N N N N N N N CO CO CO CO CO CO m CO C7 CO
Q 7 M T T CO (') Lid lf) I` N- O) O) T T CO CO 10 LSD N- Ì-- O)
L ❑ Y N N N N N N N N (N (N CO CO CO CO CO c,7 co CO CO Q) (/) OU)
E E E E E E E E E C -- t w- w W C w N a) C e> c> C> c 1 Cfi U C C C c C C C c C o
U Q UU C7 Ú C7 U ~ H ~- U U Q~ c~~cDa ~QQ~UQUo~oH0< 0
Q á°OO~~~~~áQ~C)( D< ~(D<< O <Q o HH < << U) H U U U U {~ U Q U U U H ¢ Q U Q H U U H U < 0 0 0 H Q Ú ~~ C7 H 00 0 00O 0 < i al CD ( U 01-1- 0 o 00 ~ H H O H 000 ~ 0 U 0 0 Ú U) (D H Q~ ~- 0<0 F_ Q o0o< o U(D U Q~~ ¢ ~~ U 0<0 o tco O' _ ❑ Nt 'o CO 1- CO O) CD T (N CO lO CD N- Co C) d r (N CO 4_. 6 -' R*ttt 'o LO U) LU LO LO LU It) ti} LU (O CO CO (O C O Z T r r r= r ~- r t-- r r r- X-- T T r r T r T o C') i c' U~
W ca x O O O O O O Q CD O d O C) CS O C) O 0 a O C- co o 0 o a o C) C) C) C) C) 0 0 CD C) 0 0 C) C) -r U N N (N (N c1) c') 't ct ce) c*) CO (O 'ct nt CD á cU
US E ctx 2 ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + (N (N C') Cr) ct`* LO 10 CO CCU N- N- co CO Q) O
N N N N N N N N N N N N N N N N N N N M o ó - ❑o❑❑o❑❑❑❑ooo❑ooooooo -ü ❑ ^'a) a) a) a) U a) a) a) a) Q) a) 4) u) d) 4) w a) a) a) N P) o o O c- r N (N c') C,) * '- LU LU CD CO N- N- co co O) à O O LW 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ó a N N N N N (N (N N N N N N N N N N (Ni N (N C') 00 00000000000000000000 o 0 U j O N N `ci- '~ co Co co 00 CD O N N 'cJ- 'cJ- Cc co co 00 O Z -d- - vt çr Ln In Lo to LU LU it) In Ire LU (o ❑ Q U Q) U N N Q3 Q) Q} Q) N(V O (D N N N —Z 0) X-- r C'r) C') LU LU N- N- a) O) r r C') C') i!? [L7 I N- C)) CT ❑ M -* -* ct * * L(] 'o Lo IA) LCD to LI) LC) LO Q) Q)
L o L?
ODODHDHHHHHJHDHH C C W L W- W- W- W- W -c W- W- W- W
C Nz C z N a 0 W Q} W (U ci
C a s U
C Q) W O a
H C~ () O H V C7 U U H H Q H Q O C7 Q CD U U Q U U CD C7 U
LU H o Q Ú Ú Ú Ú Q v ( !- V V- Q U Q U C7 - ~ Q Q C7 U Q ~ Ú Q (D ~ Q (D U U F- -o 00H
H Q H 0000oo
O < 0 0 U H O v C~ U U C7 U U U U U U V < U H- f- i7 < ~~ Q U ¢ Q Q C7 U(D ~ v C7 ¢ < o H ❑ C q*LO (D I- CO O) C) r (N C) I) CD I~ co Q) O r (N CY) co (o co cQ co co co N- N- I- N- N- N- r` N- I-- r~ co co co 0o C r X- r r r r r r- = r r r r r r r r T r r o
AA ck ZC0 U 2
CD a~ o (D'r ó ó co 1* 4- 4-
O Ua E E O N cm o`~ -o o°Õ- ❑❑❑ O -a WOW L a) 1 1 I O D O N (N D0 Cr) Cr) C ) 'o m coo o - o
Z ❑ Qm cr ❑ UC) CD co 0 U)
OW E o
E ~4y Cü C C
Q Ú ~ C7
LU `
O H U H V, o < H
I ~U o 1(4 o , c) c o 4- — ~r r` co ao co co o c Z r r r
Eletroforese capilar e genotipificação.
Uma alíquota de 1 NI da PCR foi retirada e misturada com 12 pL de formamida HiDi` (Applied Biosys- tems) e 0,5 pL de padrão de comprimento interno SST550-O (Biotype AG) que compreende um conjunto de fragmento de DNA marcado com o corante 5 fluorescente LIZ (propriedade da Applied Biosystems). Alternativamente, a PCR foi purificada com MiniElute® PCR purification kit (Qiagen GmbH, Hil- den, Alemanha) e eluída em 25 pL de tampão de TE antes da mistura com 1 pL do eluato com formamida HiDi® e SST550-O.
A amostra foi desnaturada por 3 minutos a 95° C, esfriada para 0° C e armazenada em temperatura 10 ambiente antes da eletroforese.
Um analisador ABI Prism 3130 Genetic (Ap- plied Biosystems) foi usado para separar fragmentos de PCR através de ele- troforese capilar.
As amostras foram injetadas eletrocineticamente (15.000 V, 10 s). As condições de realização eletroforética foram como segue: Uma disposição capilar com 4 capilares (diâmetro interno de 50 pM, 35 cm de 15 comprimento) cheios com POP-4 (poli-(N,N-dimetilacrilamida) 4%, ureia 8 M, 2-pirrolidona 5%, ácido (hidroximetil)-metil-3-aminopropan-sulfõnico (TAPS) 100 mM/NaOH pH 8,0, ajustado em temperatura ambiente; Applied Biosys- tems], a 60° C e 15.000 Volts por 25 minutos.
O ajuste do filtro G5 foi aplica- do para a detecção simultânea das 5 cores 6-FAM, VIC, NED, PET e LIZ. 20 Comprimentos e genótipos de fragmento dos loci de gene foram calculados com o padrão de comprimento interno e o Software Genmapper® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A Figura 1 mostra o eletroferograma de um experimento de ge- notipificação começando com 250 pg de DNA genômico de uma pessoa do 25 sexo masculino.
O genótipo deste DNA pode ser encurtado como segue co- mo uma lista de loci com a fórmula do alelo em parênteses: D1 (+1+), D2 (+1+), D3 (-I-), 04 (-1+), 05 (-1-), D6 (+1+), D7 (-I-), D8 (-1+), 09 (-1+), D10 (-1+), D11 (-1+), D12 (-1+), D13 (-1+), D14 (+1+), D15 (-1+), 016 (-1+), D17 (-1-), D18 (-/-), D19 (-1+), 020 (-1+), D21 (-1-), D22 (-1+), 023 (-1+), D24 (-1+), D25 (-1+), 30 D26 (-1+), D27 (-1+), D28 (-I-), D29 (-1+), D30 (-1+), D32 (-1+ ou X/Y).
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES1. Ensaio de traçado de perfil de DNA compreendendo as etapas que seguem: (i) provisão de uma amostra a ser analisada, 5 (ii) provisão de reagentes, enzima e iniciador- oligonucleotídeos que são necessários para amplificação de reação em ca- deia da polimerase simultânea de pelo menos 20 loci, (iii) amplificação do loci, (iv) detecção dos produtos de amplificação, onde os produ- 10 tos de amplificação e os loci a serem amplificados são caracterizados pelas características que seguem, a) cada locus a ser amplificado é caracterizado por pelo menos um polimorfismo de deleção-inserção conhecido estar presente na população, onde os dois alelos de cada locus diferem em tamanho em mais 15 de 1 nucleotídeo e menos do q eu 100 nucleotídeos, b) um primeiro conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois loci diferentes carrega um primeiro marcador, 20 C) um segundo conjunto de pelo menos dois produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois foci diferentes carrega um segundo marcador, d) um terceiro conjunto de pelo menos dois produtos de 25 amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos se originando de pelo menos dois loci diferentes carrega um terceiro marcador, e) o marcador um, o marcador dois e o marcador três são cada um marcadores fluorescentes diferentes 30 f) a diferença de tamanho entre dois alelos para um dado locus é maior do que 1 nucleotideo e menor do que 100 nucleotídeos.2. Ensaio de traçado de perfil de acordo com a reivindica-ção 1, onde pelo menos 25 loci são amplificados simultaneamente.3. Ensaio de traçado de perfil de acordo com a reivindica- ção 1, onde pelo menos 30 loci são amplificados simultaneamente.4. Ensaio de traçado de perfil de acordo com a reivindica- 5 ção 3, onde cada um dos três conjuntos fb) a d) de produtos de amplificação compreende pelo menos dez produtos de amplificação.5. Ensaio de traçado de perfil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde os dois alelos de cada locus diferem em tamanho em mais de um nucleotídeo e menos do que 40 nucleotídeos. 10 6. Ensaio de traçado de perfil de acordo com as reivindica- ções 1 a 5, onde dois ou mais dos produtos de amplificação variando em tamanho de a partir de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotí- deos se originando de pelo menos dois loci diferentes carregam um quarto marcador. 15 7. Ensaio de traçado de perfil de acordo com as reivindica- ções 1 a 6, onde a etapa de detecção é realizada com um dispositivo de ele- troforese em gel capilar.8. Ensaio de traçado de perfil de acordo com as reivindica- ções 1 a 7, onde os loci a serem amplificados são selecionados do grupo de 20 sequências que segue: DIP NO. 1: - SEQ ID NO. 1 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 2 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 2: - SEQ ID NO. 3 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 4 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, DIP NO. 3: - SEQ ID NO. 5 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 6 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 4: 5 - SEQ ID NO. 7 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 8 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 262, DIP NO. 5: - SEQ ID NO. 9 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 10 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256, DIP NO. 6: - SEQ ID NO. 11 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 12 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 7: - SEQ ID NO. 13 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 14 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256, DIP NO. 8: - SEQ ID NO. 15 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No.251 e No. 252, - SEQ ID NO. 16 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 9: - SEQ ID NO. 17 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 18 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 10: - SEQ ID NO. 19 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247, 5 - SEQ ID NO. 20 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, DIP NO. 11: - SEQ ID NO. 21 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 10 - SEQ ID NO. 22 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 12: - SEQ ID NO. 23 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 15 - SEQ ID NO. 24 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 260, IU]11 [. Kc - SEQ ID NO. 25 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 20 - SEQ ID NO. 26 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 14: - SEQ ID NO. 27 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 25 - SEQ ID NO. 28 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 15: - SEQ ID NO. 29 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 30 - SEQ ID NO. 30 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 16:- SEQ ID NO. 31 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 32 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, 5 DIP NO: 17: - SEQ ID NO. 33 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 34 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 270, 10 DIP NO. 18: - SEQ ID NO. 35 onde o polimorfismo de inserção-deleção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 36 onde o polimorfismo de inserção-deleção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, 15 DIP NO. 19: - SEQ ID NO. 37 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 38 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, 20 DIP NO. 20: - SEQ ID NO. 39 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 40 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, 25 DIP NO. 21: - SEQ ID NO. 41 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 42 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, 30 DIP NO. 22: - SEQ ID NO. 43 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251,A- SEQ ID NO. 44 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 257, DIP NO. 23: - SEQ ID NO. 45 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 46 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 24: - SEQ ID NO. 47 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, SEQ ID NO. 48 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 25: - SEQ ID NO. 49 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 50 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 296, DIP NO. 26: - SEQ ID NO. 51 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 52 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 266, DIP NO 27: - SEQ ID NO. 53 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 54 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 273, DIP NO. 28: - SEQ ID NO. 55 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 56 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260,rADIP NO. 29: - SEQ ID NO. 57 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 58 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotideos No. 251 e No. 267, DIP NO. 30: - SEQ ID NO. 59 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 60 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 270, DIP NO. 31: - SEQ ID NO. 61 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 271 e No. 272, - SEQ ID NO. 62 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 271 e No. 278,- SEQ ID NO. 63 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 280 e No. 281, - SEQ ID NO. 64 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotideos No. 280 e No. 284, DIP NO. 33: - SEQ ID NO. 65 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 66 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 34: - SEQ ID NO. 67 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 68 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 35: - SEQ ID NO. 69 onde o polimorfismo de deleção-inserção estáE1 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 70 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, J]I221reial1 5 - SEQ ID NO. 71 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, SEQ ID NO. 72 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 258, DIP NO. 37: 10 - SEQ ID NO. 73 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 74 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 38: 15 - SEQ ID NO. 75 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 255 e No. 256, - SEQ ID NO. 76 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 255 e No. 261, DIP NO. 39: 20 - SEQ ID NO. 77 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 78 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 40: 25 - SEQ ID NO. 79 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 80 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 259, DIP NO. 41: 30 - SEQ ID NO. 81 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 82 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 254, DIP NO. 42: - SEQ ID NO. 83 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 5 - SEQ ID NO. 84 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 254, DIP NO. 43: - SEQ ID NO. 85 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 10 - SEQ ID NO. 86 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 255, I1]taì•[~ - - SEQ ID NO. 87 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 15 - SEQ ID NO. 88 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 45: - SEQ ID NO. 89 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 20 - SEQ ID NO. 90 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 46: - SEQ ID NO. 91 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 25 - SEQ ID NO. 92 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 47: - SEQ ID NO. 93 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 30 - SEQ ID NO. 94 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 48:- SEQ ID NO. 95 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 96 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, 5 DIP NO. 49: - SEQ ID NO. 97 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 247 e No. 248, - SEQ ID NO. 98 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 247 e No. 252, 10 DIP NO. 50: - SEQ ID NO. 99 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 100 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, 15 DIP NO. 51: - SEQ ID NO. 101 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 102 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257,20 DIP NO. 52: - SEQ 1D NO. 103 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 104 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, 25 DIP NO. 53: - SEQ ID NO. 105 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 106 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, 30 DIP NO. 54: - SEQ ID NO. 107 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252,DIP NO. 61: - SEQ ID NO. 121 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 122 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 277, ICCl,0[•X.'4 - SEQ 1D NO. 123 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 124 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 63: - SEQ ID NO. 289 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 290 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, e onde os pares de iniciador são cada um específicos para uma sequência de DIP diferente.9. Ensaio de traçado de perfil de qualquer uma das reivin- dicações anteriores, onde adicionalmente uma ou mais sequências de repe- 20 tição em tandem (STR) são amplificadas elou uma ou mais sequências de repetição em tandem de número variável (VNTR) são amplificadas elou um ou mais polimorfismos de nucleotídeo simples (SNP) são amplificados.10. Ensaio de traçado de perfil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde adicionalmente uma ou mais sequências 25 de repetição em tandem curtas específicas de sexo (STR) elou segmentos de DNA não-variantes específicos de sexo são amplificados elou uma ou mais sequências de repetição em tandem de número variável específicas de sexo (VNTR) são amplificadas elou um ou mais polimorfismos de nucleotí- deo simples específicos de sexo (SNP) são amplificados. 30 11. Ensaio de traçado de perfil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde os pares de iniciador-oligonucleotídeo são selecionados do grupo de moléculas de ácido nucleico com as sequên-cias que seguem: a) DIP NO. 1: SEQ ID NO. 125 e SEQ ID NO. 126 ou SEQ ID NO. 267 e SEQ ID NO. 268 b) DIP NO. 2: SEQ ID NO. 127 e SEQ ID NO. 128 5 c) DIP NO. 3: SEQ ID NO. 129 e SEQ ID NO. 130 d) DIP NO. 4: SEQ ID NO. 131 e SEQ ID NO. 132 e) DIP NO. 5: SEQ ID NO. 133 e SEQ ID NO. 134 f) DIP NO. 6: SEQ ID NO. 135 e SEQ ID NO. 136 g) DIP NO. 7: SEQ ID NO. 137 e SEQ ID NO. 138 10 h) DIP NO. 8: SEQ ID NO. 139 e SEQ ID NO. 140 ou SEQ ID NO. 287 e SEQ ID NO. 288 i) DIP NO. 9: SEQ ID NO. 141 e SEQ ID NO. 142 j) DIP NO. 10: SEQ ID NO. 143 e SEQ ID NO. 144 k) DIP NO. 11: SEQ ID NO. 145 e SEQ ID NO. 146 15 1) DIP NO. 12: SEQ ID NO. 147 e SEQ ID NO. 148 m) DIP NO. 13: SEQ ID NO. 149 e SEQ ID NO. 150 n) DIP NO. 14: SEQ iD NO. 151 e SEQ ID NO. 152 o) DIP NO. 15: SEQ ID NO. 153 e SEQ ID NO. 154 ou SEQ ID NO. 281 e SEQ ID NO. 282 20 p) DIP NO. 16: SEQ ID NO. 155 e SEQ ID NO. 156 q) DIP NO. 17: SEQ ID NO. 157 e SEQ ID NO. 158 ou SEQ ID NO. 273 e SEQ ID NO. 274 r) DIP NO. 18: SEQ ID NO. 159 e SEQ ID NO. 160 ou SEQ ID NO. 277 e SEQ ID NO. 278 25 s) DIP NO. 19: SEQ ID NO. 161 e SEQ ID NO. 162 ou SEQ ID NO. 279 e SEQ ID NO. 280 t) DIP NO. 20: SEQ ID NO. 163 e SEQ ID NO. 164 ou SEQ ID NO. 275 e SEQ ID NO. 276 u) DIP NO. 21: SEQ ID NO. 165 e SEQ ID NO. 166 30 v) DIP NO. 22: SEQ ID NO. 167 e SEQ ID NO. 168 w) DIP NO. 23: SEQ ID NO. 169 e SEQ ID NO. 170 x) DIP NO. 24: SEQ ID NO. 171 e SEQ ID NO. 172 y) DIP NO. 25: SEQ ID NO. 173 e SEQ ID NO. 174 z) DIP NO. 26: SEQ ID NO. 175 e SEQ ID NO. 176 aa) DIP NO. 27: SEQ ID NO. 177 e SEQ 1D NO. 178 ab) DIP NO. 28: SEQ ID NO. 179 e SEQ ID NO. 180 5 ac) DIP NO. 29: SEQ ID NO. 181 e SEQ ID NO. 182 ou SEQ ID NO. 271 e SEQ ID NO. 272 ad) DIP NO. 30: SEQ ID NO. 183 e SEQ ID NO. 184 ou SEQ ID NO. 283 e SEQ ID NO. 284 ae) DIP NO. 31: SEQ ID NO. 185 e SEQ ID NO. 186 af) DIP NO. 32: SEQ ID NO. 187 e SEQ ID NO. 188 ou SEQ ID NO. 269 e SEQ ID NO. 270 ag) DIP NO. 33: SEQ ID NO. 189 e SEQ ID NO. 190 ou SEQ ID NO. 285 e SEQ ID NO. 286 ah) DIP NO. 34: SEQ ID NO. 191 e SEQ ID NO. 191 ai) DIP NO. 35: SEQ ID NO. 193 e SEQ ID NO. 194 aj) DIP NO. 36: SEQ ID NO. 195 e SEQ ID NO. 196 ak) DIP NO. 37: SEQ ID NO. 197 e SEQ 1D NO. 198 al) DIP NO. 38: SEQ ID NO. 199 e SEQ ID NO. 200 am) DIP NO. 39: SEQ ID NO. 201 e SEQ ID NO. 202 an) DIP NO. 40: SEQ ID NO. 203 e SEQ ID NO. 204 ao) DIP NO. 41: SEQ ID NO. 205 e SEQ ID NO. 206 ou SEQ ID NO. 251 e SEQ ID NO. 252 ap) DIP NO. 42: SEQ ID NO. 207 e SEQ ID NO. 208 ou SEQ ID NO. 253 e SEQ ID NO. 254 aq) DIP NO. 43: SEQ ID NO. 209 e SEQ ID NO. 210 ou SEQ ID NO. 255 e SEQ ID NO. 256 ar) DIP NO. 44: SEQ ID NO. 211 e SEQ ID NO. 212 ou SEQ ID NO. 257 e SEQ ID NO. 258 as) DIP NO. 45: SEQ ID NO. 213 e SEQ ID NO. 214 ou SEQ ID NO. 259 e SEQ ID NO. 260 at) DIP NO. 46: SEQ ID NO. 215 e SEQ ID NO. 216 ou SEQ ID NO. 261 e SEQ ID NO. 262 au) DIP NO. 47: SEQ ID NO. 217 e SEQ ID NO. 218 ou SEQ ID NO. 263 e SEQ ID NO. 264 av) DIP NO. 48: SEQ ID NO. 219 e SEQ ID NO. 220 aw) DIP NO. 49: SEQ ID NO. 221 e SEQ ID NO. 222 5 ax) DIP NO. 50: SEQ ID NO. 223 e SEQ ID NO. 224 ay) DIP NO. 51: SEQ ID NO. 225 e SEQ ID NO. 226 ou SEQ ID NO. 265 e SEQ ID NO. 266 az) DIP NO. 52: SEQ ID NO. 227 e SEQ ID NO. 228 ba) DIP NO. 53: SEQ ID NO. 229 e SEQ ID NO. 230 10 bb) DIP NO. 54: SEQ ID NO. 231 e SEQ ID NO. 232 bc) DIP NO. 55: SEQ ID NO. 233 e SEQ ID NO. 234 bd) DIP NO. 56: SEQ ID NO. 235 e SEQ ID NO. 236 be) DIP NO. 57: SEQ ID NO. 237 e SEQ ID NO. 238 bf) DIP NO. 58: SEQ ID NO. 239 e SEQ ID NO. 240 15 bg) DIP NO. 59: SEQ ID NO. 241 e SEQ ID NO. 242 bh) DIP NO. 60: SEQ ID NO. 243 e SEQ ID NO. 244 bi) DIP NO. 61: SEQ ID NO. 245 e SEQ ID NO. 246 bj) DIP NO. 62: SEQ ID NO. 247 e SEQ ID NO. 248 bk) DIP NO. 63: SEQ ID NO. 249 e SEQ ID NO. 250 20 12. Estojo para uso em um método de amplificação de DNA compreendendo pelo menos 3 pares de iniciador para amplificação de rea- ção em cadeia da polimerase, onde os pares de iniciador, consistindo cada um em um iniciador a montante e um a jusante, são capazes de se ligar a uma sequência de acordo com qualquer uma das sequências listadas do 25 grupo de: DIP NO. 1: - SEQ ID NO. 1 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 2 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 2: - SEQ ID NO. 3 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 4 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, DIP NO. 3: 5 - SEQ ID NO. 5 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 6 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256, DIP NO. 4: 10 - SEQ ID NO. 7 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 8 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 262, DIP NO. 5: 15 - SEQ ID NO. 9 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 10 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 6: 20 - SEQ ID NO. 11 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 12 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 7: 25 - SEQ ID NO. 13 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 14 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 8: 30 - SEQ ID NO. 15 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No.251 e No. 252, - SEQ ID NO. 16 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, [']I1 `[i)?J - SEQ ID NO. 17 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 5 - SEQ ID NO. 18 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 10: - SEQ ID NO. 19 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247, 10 - SEQ ID NO. 20 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, DIP NO. 11: - SEQ ID NO. 21 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 15 - SEQ ID NO. 22 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256,- SEQ ID NO. 23 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 20 - SEQ ID NO. 24 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 260, DIP NO. 13: - SEQ ID NO. 25 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 25 - SEQ ID NO. 26 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 14: - SEQ ID NO. 27 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 30 - SEQ ID NO. 28 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 15:w- SEQ ID NO. 42 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 22: - SEQ ID NO. 43 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 44 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 257, DIP NO. 23: - SEQ ID NO. 45 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 46 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 24: - SEQ ID NO. 47 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 48 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 263, DIP NO. 25: - SEQ ID NO. 49 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 50 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 296, DIP NO. 26: - SEQ ID NO. 51 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 52 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 266, DIP NO 27: - SEQ ID NO. 53 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 54 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 273,X11DIP NO. 28: - SEQ ID NO. 55 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 56 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 29: - SEQ ID NO. 57 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 58 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 267, DIP NO. 30: - SEQ ID NO. 59 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 60 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotideos No. 251 e No. 270, DIP NO. 31: - SEQ ID NO. 61 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 271 e No. 272, -- SEQ ID NO. 62 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 271 e No. 278, DIP NO. 32: - SEQ ID NO. 63 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 280 e No. 281, - SEQ ID NO. 64 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 280 e No. 284, 1911M - SEQ ID NO. 65 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 66 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 34: - SEQ ID NO. 67 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 68 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 35: 5 - SEQ ID NO. 69 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 70 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, DIP NO. 36: - SEQ ID NO. 71 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 72 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 258, DIP NO. 37: - SEQ ID NO. 73 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 74 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256, DIP NO. 38: - SEQ ID NO. 75 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 255 e No. 256, - SEQ ID NO. 76 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 255 e No. 261, DIP NO. 39: - SEQ ID NO. 77 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 78 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 40: - SEQ ID NO. 79 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 80 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 259, DIP NO. 41: - SEQ ID NO. 81 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 5 - SEQ ID NO. 82 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 254, DIP NO. 42: - SEQ ID NO. 83 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 10 - SEQ ID NO. 84 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 254, DIP NO. 43: - SEQ ID NO. 85 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 15 - SEQ 10 NO. 86 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 255, DIP NO. 44: - SEQ ID NO. 87 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 20 - SEQ ID NO. 88 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 45: - SEQ ID NO. 89 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 25 - SEQ ID NO. 90 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 46: - SEQ ID NO. 91 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 30 - SEQ ID NO. 92 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 47:- SEQ ID NO. 93 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 94 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, 5 DIP NO. 48: - SEQ ID NO. 95 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 96 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, 10 DIP NO. 49: - SEQ ID NO. 97 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 247 e No. 248, - SEQ ID NO. 98 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 247 e No. 252, 15 DIP NO. 50: - SEQ ID NO. 99 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 100 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, 20 DIP NO. 51: - SEQ ID NO. 101 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 102 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, 25 DIP NO. 52: - SEQ ID NO. 103 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 104 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, 30 DIP NO. 53: - SEQ ID NO. 105 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251,- SEQ ID NO. 106 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 54: - SEQ ID NO. 107 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 108 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 55: - SEQ ID NO. 109 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 110 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 56: - SEQ ID NO. 111 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 112 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 258, II]I1i+[s Th - SEQ ID NO. 113 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247, - SEQ ID NO. 114 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, I#]I10[i J - SEQ ID NO. 115 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ 1D NO. 116 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 263, DIP NO. 59: - SEQ ID NO. 117 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 118 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 266,DIP NO. 60: - SEQ ID NO. 119 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 120 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 268, DIP NO. 61: - SEQ ID NO. 121 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 122 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 277, DIP NO. 62: - SEQ ID NO. 123 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 124 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260 e Ii]1a21rox*1 - SEQ ID NO. 289 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 290 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, e onde os pares de iniciador são cada um específicos para uma sequência de DIP diferente.13. Estojo de acordo com a reivindicação 12, onde o estojo compreende pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 pares de iniciador que são cada um capazes de ligação a uma sequência diferente selecionada do grupo revela- do na reivindicação 11.14. Uso de uma seleção de pelo menos 2 sequências de DIP selecionadas do grupo: 30 DIP NO. 1: - SEQ ID NO. 1 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252,- SEQ ID NO. 2 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 2: - SEQ ID NO. 3 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 4 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, DIP NO. 3: - SEQ ID NO. 5 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 6 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, I.7I.ki[. - SEQ ID NO. 7 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 8 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 262, DIP NO. 5: - SEQ ID NO. 9 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 10 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 6: - SEQ ID NO. 11 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 12 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256, DIP NO. 7: - SEQ ID NO. 13 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 14 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256,DIP NO. 8: - SEQ ID NO. 15 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No.251 e No. 252, - SEQ ID NO. 16 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 9: - SEQ ID NO. 17 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 18 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 10: - SEQ ID NO. 19 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247, - SEQ ID NO. 20 onde o polimorfismo de deleção-inserçáo está 15 entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, DIP NO. 11: - SEQ ID NO. 21 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 22 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 12: - SEQ ID NO. 23 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 24 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 260, DIP NO. 13: - SEQ ID NO. 25 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 26 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 14: - SEQ ID NO. 27 onde o polimorfismo de deleção-inserção está w entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 28 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, DIP NO. 15: 5 - SEQ ID NO. 29 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 30 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 16: 10 - SEQ ID NO. 31 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 32 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 256, DIP NO: 17: 15 - SEQ ID NO. 33 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 34 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 270, DIP NO. 18: 20 - SEQ ID NO. 35 onde o polimorfismo de inserção-deleção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 36 onde o polimorfismo de inserção-deleção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 19: 25 - SEQ ID NO. 37 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 38 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 257, DIP NO. 20: 30 - SEQ ID NO. 39 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 40 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 21: - SEQ ID NO. 41 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 5 - SEQ ID NO. 42 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, I•1I1►[iWY1 - SEQ ID NO. 43 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 251, 10 - SEQ ID NO. 44 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 257, DIP NO. 23: - SEQ ID NO. 45 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 15 - SEQ ID NO. 46 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 24: - SEQ ID NO. 47 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 20 - SEQ ID NO. 48 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 263, DIP NO. 25: - SEQ ID NO. 49 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 25 - SEQ ID NO. 50 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 296, DIP NO. 26: - SEQ ID NO. 51 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 30 - SEQ ID NO. 52 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 266, DIP NO 27:Ti,- SEQ ID NO. 53 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 54 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 273, 5 DIP NO. 28: - SEQ ID NO. 55 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 56 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260, 10 DIP NO. 29: - SEQ ID NO. 57 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 58 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 267, 15 DIP NO. 30: - SEQ ID NO. 59 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 60 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 251 e No. 270, 20 DIP NO. 31: - SEQ ID NO. 61 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 271 e No. 272, - SEQ ID NO. 62 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 271 e No. 278, 25 DIP NO. 32: - SEQ ID NO. 63 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 280 e No. 281, - SEQ ID NO. 64 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 280 e No. 284, 30 DIP NO. 33: - SEQ ID NO. 65 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251,- SEQ ID NO. 66 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 34: - SEQ ID NO. 67 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 68 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, Ii1IJ►[[ Ti - SEQ ID NO. 69 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 70 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 255, DIP NO. 36: - SEQ ID NO. 71 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 72 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 258, DIP NO. 37: - SEQ ID NO. 73 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 74 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 38: - SEQ ID NO. 75 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 255 e No. 256, - SEQ ID NO. 76 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 255 e No. 261, DIP NO. 39: - SEQ ID NO. 77 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 78 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256,DIP NO. 40: - SEQ ID NO. 79 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 80 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 5 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 259, DIP NO. 41: - SEQ ID NO. 81 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 82 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 10 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 254, DIP NO. 42: - SEQ ID NO. 83 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 84 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 15 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 254,- SEQ ID NO. 85 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucieotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 86 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 20 entre os nucleotídeos No. 251 e No. 255, DIP NO. 44: - SEQ ID NO. 87 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 88 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 25 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 45: - SEQ ID NO. 89 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 90 onde o polimorfismo de deleção-inserção está 30 entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 46: - SEQ ID NO. 91 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 92 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 254, DIP NO. 47: 5 - SEQ ID NO. 93 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 94 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 48: - SEQ ID NO. 95 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 96 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 256, DIP NO. 49: - SEQ ID NO. 97 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 247 e No. 248, - SEQ ID NO. 98 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 247 e No. 252, DIP NO. 50: - SEQ ID NO. 99 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 100 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 51: - SEQ ID NO. 101 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 102 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 257, DIP NO. 52: - SEQ ID NO. 103 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 104 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 53: - SEQ ID NO. 105 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 5 - SEQ ID NO. 106 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, DIP NO. 54: - SEQ ID NO. 107 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 10 - SEQ ID NO. 108 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 55: - SEQ ID NO. 109 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, 15 - SEQ ID NO. 110 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 258, DIP NO. 56: - SEQ ID NO. 111 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, 20 - SEQ ID NO. 112 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 258, DIP NO. 57: - SEQ ID NO. 113 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 247, 25 - SEQ ID NO. 114 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 246 e No. 252, DIP NO. 58: - SEQ ID NO. 115 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotideos No. 250 e No. 251, 30 - SEQ ID NO. 116 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 263,- SEQ ID NO. 117 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 118 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 266, 5 DIP NO. 60: - SEQ ID NO. 119 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 120 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 268, 10 DIP NO. 61: - SEQ ID NO. 121 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 122 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 277, 15 DIP NO. 62: - SEQ ID NO. 123 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 252, - SEQ ID NO. 124 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 251 e No. 260 e 20 DIP NO. 63: - SEQ ID NO. 289 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 251, - SEQ ID NO. 290 onde o polimorfismo de deleção-inserção está entre os nucleotídeos No. 250 e No. 256, 25 em um ensaio de traçado de perfil e onde os iniciadores são dis- postos de tal maneira que o polimorfismo de deleção-inserção pode ser am- plificado.15. Uso de acordo com a reivindicação 14, onde o método de amplificação é selecionado do grupo de PCR multiplex específica de ale- 30 lo, um ensaio de reação em cadeia da ligase, ensaio de amplificação de sonda dependente de ligação multiplex, um ensaio de hibridização, um en- saio de reação em cadeia da polimerase, ensaio baseado em chip, ensaio~C de hibridização, um ensaio de extensão de iniciador com base simples, en- saio de ligação disposta de extensão de iniciador disposta (APEX), ensaio de ligação disposta específica de alelo e PCR em um chip.4
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08155280.4 | 2008-04-28 | ||
| EP08155280A EP2113574A1 (en) | 2008-04-28 | 2008-04-28 | Substances and methods for a DNA based profiling assay |
| PCT/EP2009/003351 WO2009132860A1 (en) | 2008-04-28 | 2009-04-24 | Substances and methods for a dna based profiling assay |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0911906A2 true BRPI0911906A2 (pt) | 2021-04-20 |
Family
ID=39434295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0911906-0A BRPI0911906A2 (pt) | 2008-04-28 | 2009-04-24 | substâncias e métodos para um ensaio de traçado de perfil baseado em dna |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8771952B2 (pt) |
| EP (2) | EP2113574A1 (pt) |
| JP (1) | JP2011518568A (pt) |
| KR (1) | KR20110014997A (pt) |
| CN (1) | CN102016074B (pt) |
| BR (1) | BRPI0911906A2 (pt) |
| WO (1) | WO2009132860A1 (pt) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8637655B2 (en) | 2009-08-13 | 2014-01-28 | Life Technologies Corporation | Amelogenin SNP on chromosome X |
| WO2012059888A1 (en) * | 2010-11-05 | 2012-05-10 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois | Method for detecting the presence of a dna minor contributor in a dna mixture |
| US20120122093A1 (en) * | 2010-11-15 | 2012-05-17 | Life Technologies Corporation | Methods and kits for multiplex amplification of short tandem repeat loci |
| US10004561B2 (en) | 2012-10-15 | 2018-06-26 | Life Genetics Lab, Llc | Method for genetic detection using interspersed genetic elements: a multiplexed DNA analysis system |
| EP3008466B1 (en) * | 2013-06-11 | 2019-09-11 | Coastal Genomics Inc. | Method for assessing fragment lengths of molecular chains using multiple dyes |
| US20160110427A1 (en) * | 2014-10-21 | 2016-04-21 | Yttro Mobile Inc. | Apparatus, system, and method for organizing and embedding applications |
| CA2976411A1 (en) * | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Primer set and method for amplifying exons of pkd1 gene and pkd2 gene |
| JP2019129706A (ja) * | 2016-03-31 | 2019-08-08 | 積水メディカル株式会社 | イオン交換クロマトグラフィーを用いた一塩基置換検出方法 |
| CN107354222B (zh) * | 2017-08-30 | 2020-10-30 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | 用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法 |
| KR20200083461A (ko) * | 2017-09-26 | 2020-07-08 | 주노 다이어그노스틱스, 인크. | 바이오마커 분석을 위한 디바이스, 시스템 및 방법 |
| US10626452B2 (en) | 2017-09-29 | 2020-04-21 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for detecting single base substitution using ion-exchange chromatography |
| JP2021500883A (ja) | 2017-10-27 | 2021-01-14 | ジュノ ダイアグノスティックス，インク． | 超微量リキッドバイオプシーのためのデバイス、システム、および方法 |
| WO2019191319A1 (en) | 2018-03-30 | 2019-10-03 | Juno Diagnostics, Inc. | Deep learning-based methods, devices, and systems for prenatal testing |
| CN110093436B (zh) * | 2019-03-27 | 2023-05-02 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | 用于鉴定桉树无性系的snp位点多色荧光检测引物、试剂盒、检测方法及其应用 |
| EP3739064A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-18 | Biotype GmbH | Comparative analysis of microsatellites by capillary electrophoresis (ce) dna profiles |
| JP2023105739A (ja) * | 2022-01-19 | 2023-07-31 | 株式会社島津製作所 | 電気泳動システム、電気泳動装置、電気泳動解析方法、および、電気泳動解析プログラム |
| CN116904583B (zh) * | 2023-09-08 | 2024-02-02 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 动态突变str和vntr基因位点的检测探针组、试剂盒及方法 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3223104A1 (de) | 1982-06-21 | 1983-12-22 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Photopolymerisierbares gemisch und damit hergestelltes photopolymerisierbares kopiermaterial |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| IL88923A (en) | 1988-01-12 | 1995-07-31 | Hoffmann La Roche | Gene encoding a thermostable dna polymerase from thermus aquaticus said dna polymerase and its purification |
| CA1340807C (en) | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| IE61148B1 (en) | 1988-03-10 | 1994-10-05 | Ici Plc | Method of detecting nucleotide sequences |
| DE553264T1 (de) | 1990-10-05 | 1994-04-28 | Wayne M Barnes | Thermostabile dna polymerase. |
| US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| JP2775346B2 (ja) | 1992-04-03 | 1998-07-16 | アプライド バイオシステムズ，インコーポレイテッド | プローブ構成物および方法 |
| US5338671A (en) | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| JP3175110B2 (ja) | 1994-02-07 | 2001-06-11 | オーキッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用 |
| GB9507238D0 (en) | 1995-04-07 | 1995-05-31 | Isis Innovation | Detecting dna sequence variations |
| US6183967B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-02-06 | Nexstar Pharmaceuticals | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases |
| US5773258A (en) | 1995-08-25 | 1998-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme |
| US6458530B1 (en) | 1996-04-04 | 2002-10-01 | Affymetrix Inc. | Selecting tag nucleic acids |
| US5994064A (en) * | 1996-04-24 | 1999-11-30 | Identigene, Inc. | Simple and complex tandem repeats with DNA typing method |
| US6265193B1 (en) | 1997-03-12 | 2001-07-24 | Pe Corporation (Ny) | DNA polymerases having improved labeled nucleotide incorporation properties |
| JP3628614B2 (ja) | 1999-03-15 | 2005-03-16 | アプレラ コーポレイション | 多重核酸検出のためのプローブ／移動度モディファイア複合体 |
| US6287778B1 (en) | 1999-10-19 | 2001-09-11 | Affymetrix, Inc. | Allele detection using primer extension with sequence-coded identity tags |
| US6214557B1 (en) | 2000-06-06 | 2001-04-10 | Washington University | Cold sensitive mutant DNA polymerases |
| DE50012114D1 (de) | 2000-09-05 | 2006-04-13 | Zeltz Patrick | Verfahren zur spezifischen Bestimmung von DNA-Sequenzen mittels paralleler Amplifikation |
| US6844152B1 (en) * | 2000-09-15 | 2005-01-18 | Promega Corporation | Detection of microsatellite instability and its use in diagnosis of tumors |
| EP1319718A1 (en) * | 2001-12-14 | 2003-06-18 | Keygene N.V. | High throughput analysis and detection of multiple target sequences |
| FR2836484B1 (fr) * | 2002-02-25 | 2005-02-04 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Procede de detection in vitro des cancers par la mise en evidence de desequilibres alleliques de marqueurs d'insertion-deletion |
| US20050164229A1 (en) * | 2002-02-25 | 2005-07-28 | Assistance Publique-Hopitaux De Paris | Methods for in vitro detection of cancers by highlighting allelic imbalances in insertion-deletion markers |
| WO2004081186A2 (en) * | 2003-03-10 | 2004-09-23 | Applera Corporation | Single nucleotide polymorphisms associated with stenosis, methods of detection and uses thereof |
| AU2004203649B2 (en) | 2003-08-12 | 2006-01-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thermostable Taq polymerase fragment |
| EP1914483A3 (en) | 2004-08-11 | 2008-07-09 | Lawrence Kates | Method and apparatus for monitoring refrigerant-cycle systems |
| WO2006071568A2 (en) | 2004-12-29 | 2006-07-06 | Applera Corporation | Methods, compositions, and kits for forming labeled polynucleotides |
| ATE502122T1 (de) * | 2006-06-01 | 2011-04-15 | Trilink Biotechnologies | Chemisch modifizierte oligonukleotidprimer zur nukleinsäureamplifikation |
-
2008
- 2008-04-28 EP EP08155280A patent/EP2113574A1/en not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-04-24 KR KR1020107026564A patent/KR20110014997A/ko not_active Ceased
- 2009-04-24 WO PCT/EP2009/003351 patent/WO2009132860A1/en not_active Ceased
- 2009-04-24 JP JP2011506613A patent/JP2011518568A/ja active Pending
- 2009-04-24 CN CN200980115783.5A patent/CN102016074B/zh active Active
- 2009-04-24 US US12/990,155 patent/US8771952B2/en active Active
- 2009-04-24 EP EP09737904.4A patent/EP2271777B1/en active Active
- 2009-04-24 BR BRPI0911906-0A patent/BRPI0911906A2/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2271777B1 (en) | 2015-10-07 |
| CN102016074A (zh) | 2011-04-13 |
| EP2113574A1 (en) | 2009-11-04 |
| EP2271777A1 (en) | 2011-01-12 |
| US20110143347A1 (en) | 2011-06-16 |
| CN102016074B (zh) | 2014-07-09 |
| JP2011518568A (ja) | 2011-06-30 |
| US8771952B2 (en) | 2014-07-08 |
| WO2009132860A1 (en) | 2009-11-05 |
| KR20110014997A (ko) | 2011-02-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0911906A2 (pt) | substâncias e métodos para um ensaio de traçado de perfil baseado em dna | |
| US12319957B2 (en) | Nucleic acid analysis by joining barcoded polynucleotide probes | |
| US7238476B2 (en) | Methods and compositions for genotyping | |
| Täpp et al. | Homogeneous scoring of single-nucleotide polymorphisms: comparison of the 5′-nuclease TaqMan® assay and molecular beacon probes | |
| CN103898199B (zh) | 一种高通量核酸分析方法及其应用 | |
| DK1991698T3 (en) | "High-throughput" -sekvensbaseret detection of SNPs using ligeringsassays | |
| Pati et al. | A comparison between SNaPshot, pyrosequencing, and biplex invader SNP genotyping methods: accuracy, cost, and throughput | |
| CN1896284B (zh) | 一种鉴别等位基因类型的方法 | |
| CN102449166B (zh) | 一种单管检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法 | |
| KR20100063050A (ko) | 디지털 ｐｃｒ에 의한 다양한 길이의 핵산의 분석 | |
| CN101932726A (zh) | 用于多重扩增短串联重复基因座的方法和试剂盒 | |
| CN105296474A (zh) | 对fmr1和fmr2基因5’非翻译区进行表征的pcr方法 | |
| KR20150028063A (ko) | 리포터 및 소광자가 결합된 프로브를 이용한 액상형 어레이 및 이를 이용한 표적핵산 또는 돌연변이 검출방법 | |
| US20200299764A1 (en) | System and method for transposase-mediated amplicon sequencing | |
| US20100297633A1 (en) | Method of amplifying nucleic acid | |
| JP2007530026A (ja) | 核酸配列決定 | |
| US8637655B2 (en) | Amelogenin SNP on chromosome X | |
| US20080305470A1 (en) | Nucleic Acid Sequencing | |
| Li et al. | Tag/anti-tag liquid-phase primer extension array: a flexible and versatile genotyping platform | |
| JPWO2006070666A1 (ja) | 遺伝子多型の同時検出方法 | |
| ANG et al. | A NOVEL METHOD OF GENOTYPING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNP) USING MELT CURVE ANALYSIS ON A CAPILLARY THERMOCYCLER | |
| Armour | Identification and | |
| CN111321211A (zh) | 人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B25D | Requested change of name of applicant approved |
Owner name: QUIAGEN DRESDEN GMBH (DE) |
|
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: QIAGEN GMBH (DE) |
|
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] |
Free format text: MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL.MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL. |