BRPI0919949B1 - usos de um lipoquito-oligossacarídeo - Google Patents
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Description
(54) Título: USOS DE UM LIPOQUITO-OLIGOSSACARÍDEO (73) Titular: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (C.N.R.S.). Endereço: 3, Rue Michel Ange, F75016,Paris, FRANÇA(FR); UNIVERSITE PAUL SABATIER (TOULOUSE III). Endereço: 118 Route De Narbonne, Toulouse, 31062 Cedex 09, FRANÇA(FR); INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - INRA, Sociedade Francesa. Endereço: Etablissement Public à Caractère Scientifique 147, Rue De L'Université, 75007, Paris, FRANÇA(FR) (72) Inventor: JEAN DENAIRE; FABIENNE MAILLET; VÉRÉNA POINSOT; OLIVIER ANDRE; GUILLAUME BECARD; MONIQUE GUEUNIER; LAURENCE CROMER; ALEXANDRA HAOUY; DELPHINE GIRAUDET.
Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 28/10/2009, observadas as condições legais
Expedida em: 06/11/2018
Assinado digitalmente por:
Liane Elizabeth Caldeira Lage
Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
1/50
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USOS DE UM LIPOQUITO-OLIGOSSACARÍDEO.
A presente invenção refere-se a lipoquito-oligossacarídeos envolvidos em simbiose micorrízica arbuscular e a suas aplicações.
Fungos micorrízicos arbusculares (AM) têm estabelecido associações simbióticas com raízes de plantas por mais de 400 milhões de anos, desde o aparecimento das plantas terrestres mais antigas, sugerindo que fungos AM auxiliaram plantas em sua colonização de terras (Remy et al., 1994). Este grupo de fungos, recentemente renomeado Glomeromycota, é um dos mais amplamente distribuídos e associações com AM estão amplamente distribuídas por todo o reino vegetal incluindo angiospermas, gimnospermas, pteridófitas e algumas briófitas (Smith e Read, 2008). Entre as angiospermas, pelo menos 80% das espécies podem formar simbioses AM, as únicas exceções sendo Brassicaceae e Chenopodiaceae. Fungos AM são capazes de transferir raros ou nutrientes minerais pouco solúveis como fósforo, zinco e cobre do solo para a planta, o que, por sua vez, proporciona carboidratos aos fungos. Esta troca de nutrientes pode ser de importância crítica quando a fertilidade do solo e a disponibilidade de água são baixas, condições que limitam gravemente a produção agrícola na maior parte do mundo (Smith e Read, 2008).
Outra associação simbiótica conhecida entre plantas e micro-organismos do solo é a simbiose de rizóbios. Em contraste com a simbiose micorrízica arbuscular, que é amplamente distribuída entre plantas, a simbiose de rizóbios é restrita a legumimosas, e em vez de fungos, ela envolve bactérias fixadoras de nitrogênio coletivamente chamadas rizóbios, que pertencem a diversos gêneros incluindo Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium e Sinorhizobium. A simbiose de rizóbios resulta na formação de estruturas específicas, os nódulos, nas raízes da leguminosa hospedeira. Nódulos proporcionam um ambiente apropriado para rizóbios, permitindo que eles se fixem a nitrogênio molecular e proporcionem nitrogênio combinado à leguminosa hospedeira. O início da associação rizóbio-leguminosa depende
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2/50 de sinais simbióticos que são produzidos por ambos os parceiros simbióticos. Os sinais liberados pela planta são usualmente flavonóides excretados em exsudatos radiculares. Estes flavonóides interagem com fatores de transcrição de rizóbios da família NodD, que ativam a transcrição de genes de nodulação (nod) envolvidos na produção da moléculas sinalizadoras de bactérias denominadas fatores Nod (Dénarié et al., 1996). Fatores Nod compartilham uma estrutura básica comum que consiste em uma estrutura de quitina de quatro ou cinco resíduos N-acetilglucosamina beta-1,4-ligados, Nacilados na extremidade não redutora com um grupo ácido graxo de com10 primento variável e grau de instauração. Esta estrutura básica pode ser ainda N-metilada na extremidade não redutora, e pode também ser Osubstituída na extremidade não redutora e/ou na extremidade redutora. Esta variedade de substituintes proporciona uma ampla diversidade de fatores Nod com diferentes estruturas (para a descrição de diversas estruturas dos fatores Nod, veja Dénarié et al., 1996; D’Haeze et al., 2002). A especificidade na interação legumimosa/rizóbio (isto é, uma dada espécie de rizóbios forma nódulos em determinadas espécies de leguminosas) é o resultado desta diversidade.
Dissecção genética da via envolvida em sinalização do fator Nod em raízes da leguminosa modelo Medicago truncatula identificou uma série de genes envolvidos nesta via (Stacey et al., 2006). Existe evidência crescente de que os receptores do fator Nod são quinases do tipo receptor com domínios extracelulares LysM de ligação a açúcar, como aqueles codificados pelos genes NFP e LYK3 de M. truncatula. A interação de um fator Nod com seu receptor induz uma cascata de sinalização a jusante, incluindo o rápido influxo de íons de cálcio, pulsos de cálcio e expressão de genes de nodulinas específicos. Estes eventos a jusante envolvem em particular genes que codificam proteínas envolvidas na sinalização de cálcio, como DM11, DMI2 e DM13 de M. truncatula que codificam respectivamente um canal de cátion, uma quinase do tipo receptor rico em repetições de leucina e uma proteína quinase dependente de Ca+2/calmodulina, e genes que codificam proteínas envolvidas no controle de expressão genética, como NSP1 e NSP2, que co3/50 dificam fatores de transcrição.
Embora fungos AM sejam tanto agricolamente quanto ecologicamente muito importantes, os mecanismos celulares e moleculares que controlam a formação da simbiose micorrízica são muito menos conhecidos do que aqueles envolvidos em simbiose de rizóbios.
Foi demonstrado em M. truncatula que os programas de nodulação e micorrízicos compartilham pelo menos três componentes (Catoira et al., 2000), a saber, os produtos dos genes DM11, DMI2 e DMI3 envolvidos na sinalização de cálcio.
Entretanto, os eventos que ocorrem a montante e a jusante des* ta sinalização de cálcio são ainda pouco caracterizados no caso da simbiose micorrízica asbuscular, em particular aqueles envolvidos no início da sinalização e que levam ao reconhecimento entre os parceiros vegetais e fúngicos. O estudo desses eventos tem sido dificultado pelo fato de que o parcei15 ro fúngico é um simbionte obrigatório que não pode ser cultivado em cultura pura na ausência de plantas vivas, e pela ausência de ferramentas genéticas disponíveis para este grupo de fungos (Harrison, 2005). Entretanto, foi demonstrado recentemente que sinais difusíveis são trocados entre os simbiontes antes da interação física. No lado da planta, compostos da família dos apocarotenoides, estrigolactonas, podem ser secretados em exsudatos radiculares e estimulam ramificações em hifas de esporos que germinam fungos AM, sinalizando uma troca fisiológica para ativar crescimento fúngico présimbiótico (Akiyama et al., 2005; Besserer et al., 2006). No lado fúngico, a existência de compostos difusíveis produzidos por fungos AM e capazes de ativar respostas de plantas associadas a programa de endomicorrização também foi relatada (Kosuta et al., 2003; Weidman et al., Navazio et al., 2007). Mais especificamente, uma série de experimentos realizados com M. truncatula recentemente mostraram que fungos AM produzem compostos difusíveis que são capazes de estimular a expressão de diversas respostas de plantas. Três espécies de Gigaspora e uma espécie de Glomus poderíam acionar através de uma membrana de celofane a indução da expressão do gene simbiótico MtENODH em raízes de mudas (Kosuta et al.., 2003). Três
4/50 patógenos fúngicos não provocam a mesma resposta, apoiando a hipótese de que a resposta foi induzida por uma molécula específica de sinal de fungos AM. De maneira similar, um fungo AM, Glomus intraradices, mostrou ativar através de uma membrana a transcrição de genes de plantas cuja ex5 pressão depende do gene simbiótico DM13 (Weidman et al., 2004). Em adição, verificou-se que um sinal difusível de fungos AM provoca uma elevação momentânea de cálcio citosólico em cultura celulares de soja e a regulação para cima de genes relacionados a DM11, DM12 e DM13 (Navazio et al., 2007).
Olah et al. (2005) relataram que fatores Nod de Sinorhizobium meliloti, o rizóbio simbionte de M. truncatula, eram capazes de estimular a micorrização e a formação de raízes laterais em M. truncatula. A estimulação da formação de raízes laterais também foi observada com fatores difusíveis de fungos micorrízicos arbusculares (fatores Myc), porém não com fatores
Nod de espécies de rizóbios (Sinorhizobium fredii e Rhizobium leguminosarum), que não podem modular Medicago ap. Eles também relataram que todos os genes da via de sinalização do fator Nod atualmente identificados, incluindo particularmente o gene NFP que codifica o receptor do fator Nod putativo, assim como os genes DM13 e NSP1, eram necessários para o es20 tímulo à formação de raízes laterais por fatores Nod, porém, não pelos fatores Myc, que requerem apenas os genes DM11 e DM12. Com base nessas observações, esses autores propuseram um modelo explicando o estímulo à micorrização e à formação de raízes laterais em leguminosas por fatores Myc e fatores Nod. De acordo com este modelo, fatores Myc e fatores Nod, que eram reconhecidos por diferentes receptores de superfície celular, ativaram uma via de sinalização DMI1/DMI2/DMI3 comum; no caso de fatores Myc, DM11 e DMI2 foram suficientes para estimular a formação de raízes laterais, enquanto DMI3 foi necessário para estímulo à micorrização. Olah et al. Também discutiram a possível natureza química dos fatores Myc. Eles levantaram a hipótese de que estes dificilmente seriam compostos do tipo auxina, visto que seu efeito sobre o desenvolvimento da raiz era diferente daquele observado com esses compostos. Eles também sugeriram que sua
5/50 estrutura seria diferente da estrutura de fatores Nod, visto que eles parecem ser discriminados pelo receptor NFP.
Portanto, parece que embora a existência de fatores myc difusíveis produzidos por fungos AM, e capazes de ativar respostas de plantas, seja reconhecida na técnica, a natureza química desses fatores não foi identificada até agora.
Os inventores obtiveram êxito na purificação de fatores Myc de exsudatos de raízes micorrizadas e esporos germinados dos fungos AM Glomus intradices. Eles também determinaram sua estrutura química e mos10 traram que eles estimulam de maneira eficiente o desenvolvimento do sistema radicular e a colonização de raízes por fungos AM.
Os fatores Myc purificados pelos inventores são uma mistura de lipoquito-olissacarídeos (LOCs) sulfatados e não sulfatados; eles compartilham com os fatores Nod uma estrutura de quitina comum básica de resí15 duos N-acetilglucosamina beta-1,4-ligados, N-acilados na extremidade não redutora com um grupo ácido graxo. Entretanto, os fatores Myc têm estruturas mais simples do que os fatores Nod. A única O-substituição que é observada em fatores Myc é O-sulfatação na extremidade redutora da molécula. Nenhuma outra O-substituição como O-carbamoíla na extremidade não re20 dutora, ou O-fucosila na extremidade redutora pode ser detectada. A única N-substituição no resíduo GlcNAc do terminal não redutor para fatores Myc purificados de Glomus intradices é a acilação por ácidos graxos comuns, principalmente ácidos oleico (C18:1) e palmítico (C16:0). Em contraste, a Nsubstituição de fatores Nod é mais complexa. É com frequência uma substi25 tuição dupla por um grupo N-metila e um grupo N-acila (frequentemente ácido vacênico), como em cepas de rizóbios que nodulam a maioria das leguminosas tropicais e leguminosas da subfamília Minosoideae. N-metilação é especificada pelo gene muito difundido de rizóbio NodS (Dénarié et al., 1996). De maneira alternativa, N-acilação por um ácido graxo poli-insaturado específico é a regra entre rizóbios que nodulam leguminosas temperadas do ciado Galegoid (Dénarié et al., 1996). De fato, LOCs com uma estrutura tão simples quanto os fatores Myc caracterizados pelos inventores não foram
6/50 observados entre os fatores Nod sintetizados pelas diversas cepas de rizóbios estudadas até o momento (Dénarié etal., 1996; D’Haeze etal., 2002).
A invenção proporciona um processo para obtenção de fatores Myc a partir de um fungo do grupo Glomeromycota, em que o dito processo compreende obter exsudatos de raízes de plantas micorrizadas com o dito fungo, ou a partir de esporos germinativos do dito fungo, extraindo os ditos exsudatos com butanol, e recuperando o extrato de butanol contendo os ditos lipoquito-oligossacarídeos.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o dito 10 processo compreende as etapas adicionais de submeter o dito extrato de butanol a extração de fase sólida em uma fase reversa C18, com sucessivas lavagens a 20%, 50% e 100% de acetonitrila e recuperando a fração eluída a 50% de acetonitrila contendo os ditos fatores Myc.
Ainda mais preferivelmente, o dito processo compreende as eta15 pas adicionais de submeter a dita fração eluída a 50% de acetonitrila a cromatografia líquida de alta performance de fase reversa em uma coluna C18 de fase reversa, usando um gradiente linear de 20% a 100% de acetonitrila, e recuperando a fração eluída a 30-48% de acetonitrila que contém lipoquitooligossacarídeos sulfatados, e/ou a fração eluída a 64-72% de acetonitrila que contém lipoquitooligossacarídeos não sulfatados.
De acordo com uma modalidade particular da invenção, o dito fungo do grupo Glomeromycota é Glomus intraradices.
Fatores Myc fúngicos podem, entretanto, também ser extraídos de outras espécies de Glomeromycota que produzem os mesmos, usando etapas de extração descritas aqui, ou variantes das mesmas.
Um fatorMyc é aqui definido um lipoquito-oligossacarídeo representado pela Fórmula (I) abaixo:
em que n = 0, 1, 2, 3, 4 ou 5, preferivelmente 2 ou 3, Ri repre7/50 senta um substituinte de lipídio, contendo 12 a 22, preferivelmente 14 a 20 átomos de carbono, que pode ser saturado ou mono, di, tri, tetra, penta ou hexainsaturado, e R2 representa H ou SO3H.
O substituinte de lipídio R1 é preferivelmente uma cadeia de ácido graxo. R1 também pode representar um análogo aromático de uma cadeia de ácido graxo, como em análogos de fator NOS descritos, por exemplo, por Grenouillat et al. (2004) ou no PCT WO 2005/063784.
Vantajosamente, R1 representa uma cadeia de um ácido graxo sintetizada por fungos micorrízicos arbusculares, em particular uma cadeia C16 ou C18 de ácido graxo, ou saturada ou mono ou di-insaturada. Preferivelmente, quando a dita cadeia de ácido graxo é insaturada, ela compreende pelo menos uma cis-insaturação (por exemplo, o ácido oléico C18:1). A título de exemplos não limitantes de cadeias de ácido graxo preferidas, é possível mencionar C16:0, C18:0, Ο16:1ω5, Ο16:1ω7, Ο18:1ω5, Ο18:1ω7, Ο18:1ω9, 18:2ω6,9, C20:0 iso, Ο20:1ω9 e Ο20:4ω69,12,15.
Fatores Myc podem ainda ser caracterizados e também diferenciados de lipoquito-oligossacarídeos de estrutura relacionada como fatores Nos por suas propriedades biológicas. Estas propriedades biológicas podem ser testadas usando bioensaios apropriados. Em particular, é possível usar bioensaios com base na capacidade dos fatores Myc para estimular a formação de raízes laterais na leguminosa modelo M. truncatula. Mais especificamente, embora os fatores Myc compartilhem com fatores Nod a capacidade de estimular a formação de raízes laterais nas plantas do tipo selvagem, porém não nos mutantes deficientes em simbiose dmi1, dmi2 e dmi3, fatores Myc também são capazes, ao contrário dos fatores Nod, de estimular a formação de raízes laterais no mutante deficiente em simbiose nsp1.
Se desejado, bioensaios para diferenciar fatores Myc não sulfatados de fatores Myc sulfatados também estão disponíveis (por exemplo, se há o desejo de separar em um extrato fúngico, frações contendo fatores Myc não sulfatados daqueles contendo fatores Myc sulfatados): por exemplo, fatores Myc sulfatados são capazes de induzir a expressão do gene MtENOD11 no crescimento de raízes de M. truncatula enquanto fatores Myc não
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8/50 sulfatados são capazes de induzir a ramificação de pelo radicuiar em erviIhaca.
Fatores Myc podem ser purificados de fungos, conforme descrito acima. Eles também podem ser obtidos por síntese química e/ou produzidos em células bacterianas geneticamente engenheiradas. Por exemplo, uma estrutura de quito-oligossacarídeo, sulfatado ou não, pode ser sintetizada em bactérias recombinantes, conforme descrito, por exemplo, por Samain et al. (1997, 1999) para a síntese de precursores de fatores Nod, e subsequentemente acilados no grupo amina livre do açúcar terminal não redutor, conforme descrito, por exemplo, por Ohsten Rasmussen et al. (2004). Também é possível usar uma cepa mutante de uma bactéria Rhizobiaceae produtora de fatores Myc em vez de fatores Nod, por exemplo, uma cepa geneticamente modificada a fim de expressar, entre os genes estruturais da via biossintética Nod, apenas aqueles envolvidos na síntese da estrutura de quitooligossacarídeos e aqueles envolvidos na N-acilação da glucosamina terminal não redutora através de um C16 ou C6 ácido graxo apropriado, e opcionalmente aqueles envolvidos na O-sulfatação da glucosamina terminal redutora, conforme descrito, por exemplo, por Ardourel et al. (1994) ou Lugtenberg etal. (1995).
A invenção também abrange misturas de diferentes fatores Myc da fórmula (I), e em particular misturas de fatores Myc sulfatados e não sulfatados, compreendendo uma ou mais lipoquito-oligissacarídeos da fórmula (I), em que R2 representa H, e um ou mais lipoquito-oligissacarídeos da fórmula (I), em que R2 representa SO3H. Os lipoquito-oligissacarídeos da dita mistura podem ainda diferir entre si peio número de resíduos Nacetilglucosamina e/ou a natureza do substituinte R-ι (por exemplo, o comprimento e/ou o grau de insaturação da cadeia de ácido graxo).
Misturas de fatores Myc da invenção podem, por exemplo, ser obtidas através de extração de fatores Myc de fungos micorrízicos arbusculares, conforme descrito acima, e recuperação do extrato fúngico. Elas também podem ser obtidas através da produção separadamente dos diferentes fatores Myc e mistura dos mesmos.
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Lipoquito-oligissacarídeos purificados ou sintéticos e, mais especificamente, os fatores Myc purificados ou sintéticos da fórmula (I) ou misturas dos mesmos descritas aqui podem ser usadas para estimular micorrização, e assim têm uma ampla faixa de aplicações na agricultura, horticultura e silvicultura, para a maior parte das plantas cultivadas que podem estabelecer micorrização e, portanto, possuem receptores de fator Myc.
Além de seu uso para estimular a simbiose micorrízica arbuscular, os fatores Myc purificados ou sintéticos ou misturas dos mesmos também podem ser usados:
- para estimular a germinação de sementes, o que pode ser útil para tratamento de sementes com uma ampla faixa de aplicações na agricultura, horticultura e silvicultura;
- para estimular o desenvolvimento do sistema radicular, o que o benéfico para melhorar a nutrição da água e mineral.
Eles também podem ser usados, por exemplo, para tratar sementes, ou adicionados a inoculantes contendo fungos micorrízicos arbusculares, ou adicionados ao solo ou ao substrato de cultura da planta. Os fatores Myc purificados ou sintéticos da invenção podem ser usados com qualquer planta, a saber, com plantas que podem estabelecer a micorrização, incluindo também leguminosas como plantas não leguminosas, e incluindo também dicotiledôneas e monocotiledôneas, como cereais. Eles podem ser usados para cultivo de plantas sob câmara de crescimento, assim como em condições de estufa ou campo. Eles também podem ser usados para estimular a colonização micorrízica na produção de inoculantes micorrízicos (isto é, esporos ou hifas de fungos AM, ou fragmentos de raízes micorrizadas), como aditivos aos meios de cultura que são usados para a produção desses inoculantes por plantas cultivadas em solo ou sob condições hidropônicas ou aeropônicas, ou por cocultura de fungos micorrízicos com raízes extirpadas.
A invenção também abrange composições contendo fatores Myc purificados ou sintéticos ou misturas dos mesmos, e um veículo agricolamente adequado. As composições da invenção também podem compreender cepas mutantes de bactérias Rhizobiaceae geneticamente modificadas a
10/50 fim de produzir fatores Myc em vez de fatores Nod, conforme descrito acima. Composições preferidas são aquelas contendo uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados.
Os fatores Myc podem ser opcionalmente combinados com outros constituintes ativos, como flavonoides, apocarotenoides como estrigolactonas, ou jasmonato que são compostos vegetais que foram relatados como atuando como sinais simbióticos (Harrison, 2005; Akiyama et al., 2005; Besserer et al., 2006).
A formulação destas composições depende do modo pretendido de aplicação, (por exemplo, revestimento de sementes, adição a um meio de cultura para produção de inoculantes micorrízicos, tratamento da planta do solo). Elas podem ser, por exemplo, formuladas como sólidos dispersíveis em água ou solúveis em água como pós, grânulos, pelotas ou películas, como soluções aquosas líquidas, suspensões ou emulsões, ou como géis.
De acordo com uma modalidade preferida, essas composições são associadas com material fúngico e/ou vegetal, por exemplo, com um inoculante de um fungo micorrízico arbuscular, ou com sementes de uma planta capaz de estabelecer micorrização; vantajosamente, as ditas sementes são revestidas com a composição.
De maneira vantajosa, os fatores Myc são usados na composição a uma concentração de 10'5 M a 1012 M. Quando adicionados a um meio de cultura para produção de esporos de fungos AM, eles podem ser usados a uma concentração de 10'6 M a 10’1° M, preferivelmente a uma concentração de 10'7 a 10'9 M no meio. Quando usados para tratamento de sementes por para estimular o desenvolvimento do sistema radicular, eles podem ser usados a uma concentração de 10'6 M a 101° M, preferivelmente a uma concentração de IO’7 a 10'9 M. Quando uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados é usada, concentrações tão baixas quanto 108 a 101θ M podem ser usadas.
A invenção será entendida mais claramente com o auxílio da descrição adicionai que se refere aos exemplos abaixo e aos desenhos anexos. Deve ser claramente entendido, entretanto, que esses exemplos e de11/50 senhos são dados unicamente como ilustração da matéria da invenção e não constituem qualquer limitação da mesma.
Legendas dos Desenhos
Figura 1. Ensaios biológicos para detectar sinais simbióticos de fungos AM
a. O ensaio de MtENOD11. Raízes de mudas transgênicas M. truncatula Jemalong A17 portando o construto repórter pMtENOD11GUS. Atividade de GUS é detectada por fingimento histoquímico com 5bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucurônico. (1) Raízes de controle tratadas com acetonitrila a 2,5%. (2) Fração após SPE e eluição com acetonitrila a 50% diluída 40 vezes. (3) A mesma fração com uma diluição a 10 vezes.
b. O ensaio VsHab. Pelos radiculares de ervilhaca (Vicia sativa subsp. nigra) observados sob microscópio de luz após fingimento com azul metileno. (1) Pelos radiculares tratados com uma fração inativa são retas. (2) Pelos radiculares tratados com frações ativas são claramente ramificados.
Figura 2. Perfil de HPLC de fase reversa C18 semipreparativa de extratos de exsudatos de raiz micorrizada
A fase isocrática inicial com acetonitrila a 20% durou 10 min e foi seguida por um gradiente de acetonitrila a 20-100% por 20 min. O perfil revela a abundância de material contaminante presente em exsudatos de raiz micorrizada. Frações foram coletadas a cada dois minutos e foram testadas quanto à atividade biológica em MÍENOD11 e VsHab. Barras horizontais indicam o tempo de retenção de compostos em fração A são ativos em MtENOD11, e de compostos em fração B, mais hidrofóbicos, que são ativos em VsHAB.
Figura 3. Perfil de HPLC de fase reversa C18 semipreparativa de extratos de exsudatos de esporos germinantes
As condições cromatográficas são as mesmas que na figura 2. O perfil revela que exsudatos de esporos contêm muito menos material contaminante do que exsudatos de raiz micorrizada. Frações foram coletadas a cada dois minutos e foram testadas quanto à atividade biológica sobre MtENOD11 e VsHab. Barras horizontais indicam o tempo de retenção de com12/50 postos em fração A que são ativos sobre MtENOD11, e de compostos em fração B, mais hidrofóbicos, que são ativos em VsHab.
Figura 4. Influência de hidrólise metanólica suave sobre a atividade biológica de fração A.
Hidrólise metanólica suave foi relatada por remover a porção de sulfato de LOCs sulfatados sem alterar outras características estruturais dessas moléculas. A fração A coletada durante HPLC semipreparativa de exsudatos de esporos germinantes foi suavemente hidrolisada e testada quanto à atividade biológica em ensaios de MtENOD11 e VsHab. A atividade biológica é representada por barras verticais. Ao passo que a fração A não hidrolisada é ativa sobre MtENOD11 e inativa sobre VsHab, a fração hidrolisada perdeu atividade sobre MtENOD11 e ganhou atividade sobre VsHab. Esses dados indicam que a atividade biológica de fração A sobre o ensaio de MtENOD11 é devido à presença de LCOs sulfatados.
Figura 5. LCOs sulfatados tetramétricos N-acilados por ácidos graxos C16
Traços de UPLC/MS, no modo negativo, da fração 4 isolada após HPLC C18 semipreparativa. Correntes de íons extraídas correspondentes a tetrâmeros sulfatados e espectros correspondentes são dados. Esta figura indica que compostos que respondem a m/z 1101,5; 1103,5 e 1105,5 estão eficazmente presentes nas amostras. Estes m/z correspondem a LCOs tetraméricos sulfatados N-acilados por C16:2, C16:1 e C16:0, respectivamente. Com relação às intensidades relativas dos três, parece que 1105,5 (LCO-IV-C16:0) é a mais abundante, seguida por 1103,5 (LCO-IVC16:1).
Figura 6: LCOs sulfatados tetraméricos N-acilados por C18:1 ácido graxo
Traços de UPLC/MS, no modo negativo da fração 5 isolada após HPLC C18 semipreparativa mostrando que o composto mais abundante (m/z 1135,5) é N-acilado por um ácido graxo C18:1.
Este perfil também indica que nenhum LCO portando um ácido graxo C18:0 está presente nesta fração (m/z 1133,5) na medida em que este íon é apenas o isótopo +2 do LCO que porta a cadeia C18:1. Como o segundo espectro de massa demonstra, o C18-LCO di-insaturado é um com13/50 posto muito menor.
Figura 7. LCOs sulfatados pentaméricos N-acilados por acila graxa C18:1
Este perfil mostra que lipoquitopentâmeros também estão presentes, porém comparados aos tetrâmeros correspondentes (vide figura 5), eles são aproximadamente 30 vezes menos abundante. O LCO-V-C18:1 pode ser detectado.
Figura 8: Verificação da presença ou ausência de um dado composto
Quando a massa necessária não corresponde aos íons presentes na amostra, o perfil, em vez de dar um único pico, dá um número muito grande de picos de fundo. O perfil muito complexo obtido com corrente de íon m/z 1332,6 demonstra a ausência de um quitopentâmero C18:2 na amostra. Em contraste, o único pico claro observado com corrente de íon m/z 1334,6 claramente mostra a presença de um pentâmero C18:1.
Figura 9: Comparação de padrão de fragmentação por MS/MS de fator Myc sulfatado principal e fator Nod de S. meliloti
Demonstrar a presença de compostos com a massa adequada no tempo de retenção de HPLC esperado não é suficiente para atestar sua estrutura. Portanto, foi realizada análise MS/MS do composto Myc sulfatado principal. Esta figura representa a comparação entre o fator Nod tetramérico de S. meliloti N-acilado por C16:2 no modo negativo MS/MS e aquele registrado no fator Myc tetramérico principal presente na amostra. íons característicos da extremidade redutora em m/z 503 (Y2), 605 e 706 (Y3) são claramente detectados em ambos casos, assim como a perda neutra característica de 101 amu (ruptura intracíclica) partindo do íon molecular. O ajuste per25 feito entre os dois padrões de fragmentação indica a associação estrutural das duas moléculas.
Figura 10. Efeito de frações de extrato Myc sobre a formação de raízes laterais em M. truncatula (A) O sinal de fungos AM que estimula LRF é anfifílico
Comparação do efeito de extratos aquosos (aq) de butanol (BuOH) e acetato de etila (EA) de exsudatos de esporos germinantes (GSP24) sobre M. truncatula M7. O extrato de butanol estimula LRF do dia 5 em di14/50 ante (significante a P < 0,05), ao passo que os extratos aquosos e de acetato de etila não estão ativos.
(B) Estímulo à LRF é mediado através da via de sinalização simbiótica de DMI.
Comparação do efeito de extratos de butanol de exsudato de raiz micorrizada (MRE1), adicionalmente purificados por SPE eluído com acetonitrila a 50%, em M. truncatula do tipo selvagem (A17) e em um mutante dmi1 (Y6). O extrato Myc estimula LRF no tipo selvagem, porém não no mutante dmi1.
(C) Ambas frações A e B estimulam LRF.
Frações A e B foram coletadas após HPLC semipreparativa de exsudatos de raiz micorrizada (MRE-1). A fração MRE-1 A continha LCOs sulfatados e a fração MRE-1 B continha LCOs não sulfatados. Ambas frações estimulam LRF de maneira significante (P < 0,05).
Figura 11. Efeito de uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados sobre micorrização de Medicago truncatula
a. Micorrização em condições axênicas. Plantas foram cultivadas em tubos de teste sobre inclinações gelificadas de meio M em que fatores Myc foram incorporados a uma concentração de 10'8 M. 50 esporos estéreis (Glomus intraradices) foram dispostos próximo a raízes de mudas. A extensão da micorrização foi medida contando-se o número de unidades de infecção seis semanas após inoculação. Os resultados foram analisados pelo teste estatístico não paramétrico de Kruskal-Wallis.
b. Micorrização em condições não estéreis. Plantas foram cultivadas em um substrato feito de grânulos carbonizados de argila, inoculadas com 50 esporos estéreis de G. intraradices, fatores Myc sendo adicionados à solução nutriente a uma concentração de 10'8 M. Três semanas após inoculação, a colonização de raízes foi estimada pelo método de interseção em placa quadriculada.
Figura 12. Efeito de fatores Myc sobre arquitetura de raiz em Medicago truncatula
a. Efeito sobre a formação de raízes laterais. Histograma mos15/50 trando o efeito de uma mistura de ambos fatores Myc sulfatados e não sulfatados (NS + S), Fatores Myc sulftados (S) e fatores Myc não sulfatados (NS) a concentrações de 10'8 Μ, 109 M e 10'1θ M sobre a formação de raízes laterais de M. truncatula do tipo selvagem (A17), oito dias após tratamento.
Quarenta plantas foram usadas por experimento e análise estatística foi feita pelo teste t de Student entre plantas de controle e plantas tratadas.
b. Efeito sobre comprimento total de raiz. Histograma mostrando o efeito de uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados sobre o comprimento total de raiz de mudas. Mudas foram cultivadas por oito dias, raízes foram cortadas e o sistema radicular foi triado e medido pelo software WinRhizo. Os dados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis.
(*) e (**) representam respectivamente uma diferença significante (P < 0,05) ou altamente significante (P < 0,01) e barras representam o erro padrão da média (SEM).
Figura 13. Análise genética da via de sinalização ativada por fator Myc levando a estímulo à formação de raízes laterais
Histograma mostrando o efeito do fator Myc não sulfatado (10θ
M) sobre a formação de raízes laterais de M. truncatula do tipo selvagem (A17) e mutantes dmi1, dmi2, dmi3 e nsp1 da via de sinalização simbiótica.
Médias são representadas como percentagem do valor de controle oito dias após tratamento.
Para cada genótipo, dados de pelo menos dois experimentos independentes com 40 plantas por experimento foram reunidos e compara25 ções estatísticas foram feitas usando o teste t de Student entre controle e cada tratamento. (**) indica uma diferença altamente significante (P < 0,01) e barras representam o erro padrão da média (SEM).
Figura 14. Efeito de fatores Myc sobre colonização micorrízica in vitro de raízes extirpadas transformadas de cenoura
a. Efeito de uma mistura de fatores Myc bacteriano sulftados e não sulfatados. Raízes foram inoculadas com esporos estéreis de G. intraradices (10 esporos/mL de meio de crescimento) e tratadas uma vez por
16/50 semana durante três semanas com ou sem uma mistura de fatores Myc a 10'8 Μ. A taxa de colonização micorrízica foi observada após seis semanas. (**) significa uma diferença altamente importante com controle (teste t de Student, valor P < 0,01). Barras verticais representam o erro padrão da média (SEM).
b. Efeito de uma mistura de fatores Myc sintéticos sulfatados e não sulfatados. Raízes foram inoculadas com esporos estéreis de G. intraradices (100 esporos/mL de meio de crescimento) e tratadas uma vez por semana durante quatro semanas com ou sem uma mistura de fatores Myc a 10'8 Μ. A taxa de colonização micorrízica foi observada após oito semanas. (*) significa uma diferença significante com controle (teste t de Student, valor P = 0,0119).
Figura 15. Efeito de fatores Myc sobre micorrização de Tagetes patula a: Efeito de uma mistura de Fatores Myc sulfatados e não sulfatados sobre o número de unidades de infecção por planta (a1), comprimento de raiz (a2) e densidade de infecção (a3). Plantas foram inoculadas com cerca de 100 esporos estéreis de Glomus intraradices e tratadas duas vezes por semana durante três semanas com ou sem fatores Myc a 10'8 Μ. O número de unidades de infecção, comprimento de raiz e a densidade de unidades de infecção foram determinados após quatro semanas. (**) significa uma diferença altamente significante com controle (teste t de Student, valor P = 0,004086).
B: Efeito de Fatores Myc sulfatados (S), não sulfatados (NS) ou uma mistura de ambos Fatores Myc sulfatados e não sulfatados sobre a colonização de raiz micorrízica. Plantas foram inoculadas com cerca de 100 esporos estéreis de G. intraradices e tratadas duas vezes por semana durante três semanas com ou sem fatores Myc a 10~8 Μ. A taxa de colonização foi medida após quatro semanas.
Figura 16. Efeito de fatores Myc sobre germinação de sementes de tomate
a. Efeito de Fatores Myc não sulfatados (NS), sulfatados (S) e uma mistura de ambos Fatores Myc sulfatados e não sulfatados (NS +
S) sobre germinação de sementes de tomate a 14 cão de sementes de to17/50 mate a 14°C. Fatores Myc foram adicionados a placas de germinação a 10'8 Μ, 10'9 M e 10'1θ Μ. A taxa de germinação foi marcada todos os dias. Os resultados foram analisados com o teste de Kruskal-Wallis. (***) e (**) significam, respectivamente, uma diferença muito altamente significante (valor P < 0,001) e altamente significante (< 0,01) com controle, e barras verticais representam o erro padrão da média (SEM).
c. Efeito de uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados sobre a germinação de sementes a 14°C b1. Cinética de germinação. Fatores Myc foram adicionados a 10'1θ M. Resultados foram analisados com o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Após o dia 6, diferenças foram altamente significantes. Barras verticais representam o erro padrão da média (SEM).
b2. Fotografia de placas de germinação representativas com ou sem fatores Myc dez dias após semeadura.
Materiais e Métodos
Fontes naturais de Fatores Myc
A cepa de fungo AM Glomus intraradices DAOM 197198, que foi mantida em co-cultura com raízes extirpadas por muitos anos (Chabot et al., 1992), é bem caracterizada e seu genoma está sendo sequenciado. Esta cepa é usada pela companhia PREMIER TECH para o preparo industrial de inoculantes comerciais e para a produção de esporos purificados para fins de pesquisa. Por exemplo, esses esporos purificados foram usados como uma fonte de DNA para o projeto de seqüenciamento de genomas de G. intraradices. Foram usados dois tipos de exsudatos, ambos preparados a partir de materiais adquiridos da PREMIER TECH BIOTECHNOLOGIES (Rivère-du-Loup, Quebec, Canadá):
(i) Exsudatos de raízes micorrizadas (EMR). A produção de micorriza foi alcançada por co-cultivo de G. intraradices com raízes extirpadas transformadas de cenoura. O meio de crescimento foi solidificado com Phytagel. Após crescimento apropriado das raízes micorrizadas, o gel foi liquefeito adicionando-se citrato de sódio como agente quelante, e o EMR líquido foi condicionado em recipientes de 4 litros que foram armazenados a
18/50
4°C.
(ii) Exsudatos de esporos germinantes (GSP). Esporos estéreis purificados do fungo AM Glomus intraradices foram condicionados através de garrafas contendo aproximadamente um milhão de esporos. As garrafas foram armazenadas a 4°C. Esporos foram germinadas a 30°C em um incubador a 2% de CO2 por 10 dias.
Bioensaios usados para purificação de fatores Myc
Para detectar a presença de sinais simbióticos de fungos AM durante as diversas etapas de extração e purificação, três bioensaios foram usados, (i) Mostrou-se que o construto de M. truncatula ENOD11::GUS é induzido durante formação de micorrizas e por um composto difusível de diversos fungos AM (Journet et al., 2001; Kosuta et al., 2003) (= ensaio MtENOD11). (ii) Mostrou-se que a formação de raízes laterais em M. truncatula é estimulada por um composto difusível de diversos fungos AM e a resposta exigiu a via de sinalização simbiótica DMI (Olah et al., 2005) (= ensaio MtLRF). (iii) Em adição, foi utilizado um ensaio de ramificação de pelo radicular de Vicia sativa (ervilhaca) modificada que permite a detecção de diversos LCOs não sulfatados (= ensaio VsHab).
(i) Indução do gene MtENOD11 simbiótico em Medicago truncatula transgênica
Anteriormente mostrou-se através de experimentos em que o fungo AM foi separado da raiz da planta por uma membrana de celofane que um composto fúngico de AM pode induzir a expressão de um transgene promotor gusA de MtENOD11 no crescimento de raízes laterais de M. truncatula (Kosuta et al., 2003). O protocolo usado foi conforme anteriormente descrito (Andriakaja et al., 2007) com as modificações a seguir: nenhum disco de papel foi inserido no topo da placa de ágar e o tratamento foi feito através da adição de 40 microlitros por muda. Para verificar se a resposta a ENOD11 foi induzida através da via de sinalização DMI, comparou-se a resposta observada na linhagem do tipo selvagem de M. truncatula A17 e em uma linhagem mutante que porta uma mutação no gene DM111 (mutação Y6).
19/50 (ii) Ramificação de pelo radicular de ervilhaca
Ervilhaca (Vicia sativa subsp. nigra) é uma pequena leguminosa com semente que é conveniente para a observação microscópica de deformações de pelo radicular. Deformações de pelo radicular de ervilhaca são provocadas não apenas pelos fatores Nod do simbionte bacteriano específico Rhizobium leguminosarum bv. Viciae, mas também por uma variedade de fatores Nod não sulfatados (Roche etal., 1991; Price etal., 1992).
Este ensaio é assim apropriado para detectar a presença de LCOs não sulfatados. Em respostas anteriores, o ensaio foi feito em um meio líquido. Foi planejado um ensaio sobre placa de ágar que é mais sensível e reprodutível. Sementes foram primeiro esterilizadas em ácido sulfúrico por 20 minutos, enxaguadas duas vezes com água estéril e então tratadas por 20 minutos em hipoclorito de cálcio (5 g/150 ml após filtração em papel) e enxaguadas cinco vezes com água estéril. Sementes foram deixadas em água de um dia para o outro a 4°C, transferidas para placas macias de ágar e incubadas três dias a 4°C para aumentar a homogeneidade de germinação. Placas foram então deixadas por 36 horas a 22°C no escuro para germinação. Cinco mudas jovens (comprimento de raiz de aproximadamente 1 cm) foram semeadas em placa de Petri, sobre placas de ágar de Fahraeus, circundadas com parafilme, e deixadas três dias em uma posição vertical em uma câmara de crescimento a 22°C. Quando as raízes se tornam peludas, 40 microlitros da solução a ser testada foram suavemente depositados ao longo das raízes, e mudas foram cultivadas por 30 horas a 22°C. Para observação de ramificações de pelo radicular, as raízes foram cortadas, inseridas entre uma inclinação e uma lamela em uma solução de azul de metileno a 0,02%, e observadas sob um microscópio de luz. Dez plantas foram observadas por tratamento.
Ensaios de micorrização
Fontes de inóculo fúngicas de AM para experimentos de micorrização foram esporos estéreis de Glomus intraradices, ou adquiridos da Premier Tech Biotechnologies Ltée (Rivière-du-loup, Quebec, Canadá) ou produzidos em raízes de cenoura extirpadas transformadas conforme descri20/50 to por Bécard e Fortin (1998). Raízes de cenoura transformadas micorrizadas foram cultivadas conforme descrito em Chabot et al. (1992) e subcultivadas a cada 10 dias em meio M (Bécard e Fortin, 1988) gelificado com Phytagel a 0,4% (Sigma). Após solubilização de Phytagel com tampão de citrato (Doner e Bécard, 1991), esporos foram coletados conforme descrito sob condições estéreis e armazenados a 4°C em água Ultrapure por pelo menos quatro semanas antes do uso.
Testes de micorrização foram realizados em três espécies de plantas, a leguminosa modelo M. truncatula e duas não leguminosas, cenoura (Daucus carota, família Umbelliferae) e malmequer francês (Tagetes patula, família Astereceae).
Fatores Myc foram dissolvidos em água acetonitrila (50/50) para preparar uma solução estoque a 10'3 M, que foi então diluída à concentração apropriada com água ou meio de crescimento. A mesma quantidade de traços de solvente acetonitrila foi adicionada a placas de controle.
Micorrização in vitro de raízes de cenoura extirpadas transformadas
Raízes de cenoura estéreis extirpadas transformadas foram cultivadas em meio M solidificado por Phytagel a 0,4%, a 24°C no escuro e subcultivadas a cada dez dias (Chabot et al., 1992). Raízes foram coletadas por solubilização de Phytagel com tampão de citrato (Doner e Bécard, 1991) e lavadas com água deionizada estéril. Placas para ensaio de micorrização foram preparadas conforme segue: em placas de Petri (0 90 mm), uma primeira camada de 20 ml de meio M contendo Phytagem a 0,3% foi vertida e deixada para solidificar. Uma segunda camada do mesmo meio foi então vertida contendo 20 ou 200 esporos/ml e fatores Myc à concentração apropriada. Em placas de controle, solução de fator Myc foi substituída pelo mesmo volume do meio usado para preparar a solução de fator Myc. Fragmentos de raízes foram dispostos sobre a superfície do meio com aproximadamente a mesma quantidade (número de fragmentos e comprimento de raiz) nas diferentes placas. As placas foram fechadas com fita de parafilme e incubadas no escuro, em uma sala escura a 24°C e umidade a 50%, durante seis ou oito semanas. Fatores Myc foram adicionados uma vez por semana
21/50 sobre a superfície da placa durante as primeiras três ou quatro semanas para experimentos de seis ou oito semanas, respectivamente. Para observar a colonização de fungos, as raízes foram coletadas após liquefação de Phytagel por tampão de citrato, lavadas e tingidas pelo método de tinta-vinagre (Vierheilig et al., 1988). A taxa de colonização foi estimada pelo método de interseção em placa quadriculada (Giovanetti e Mosse, 1980).
Micorrização in vivo de Tagetes patula
Sementes de Tagetes patula, var. Légion d’honneur, foram obtidos a partir de Caillard (84091 Avignon, França). Mudas foram cultivadas quatro semanas em tubos Falcon de 50 ml cheios com um substrato feito de argila lavada e autoclavada (Montmorilonita granular carbonizada; ref Oil Dry US Special, Brenntag Bretagne, Zl de Tory, BP41, Avenue des Ferrancins, 71210 Montchanin). Para garantir a irrigação das mudas, tubos foram perfurados com três orifícios pequenos no fundo, e individualmente colocados em caixas plásticas de 120 ml (5,5 cm de diâmetro / 7 cm de altura), fechadas com uma tampa opaca perfurada para receber e fixar os tubos Falcon.
As caixas foram cheias com 80 ml de água e embrulhadas com papel alumínio. O substrato de argila dos tubos Falcon foi hidratado com 20 ml de solução com baixo teor de fosfato Long Ashton (Hewitt et al., 1966). Em cada tubo, uma semente foi colocada sob a superfície do substrato, e cem esporos fúngicos foram espalhados ao redor da semente, em 1 ml de fator Myc a 10'7 M ou solução de controle. Cada planta recebeu 1 ml de fator Myc a 10'7Mou 1 ml de solução de controle, duas vezes por semana por três semanas. Os potes foram colocados em uma câmara de crescimento, a 25°C, com um fotoperíodo de 16 h e uma intensidade de luz de 180 pEinstein.m'2.s1.
Duas séries de experimentos foram feitas. Na primeira, uma mistura de Fatores Myc sintéticos sulfatados e não sulfatados foi testada com 12 mudas por tratamento. Na segunda, sulfatados, não sulfatados e uma mistura de ambos foram testados com 20 mudas por tratamento. As plantas foram colhidas após 4 semanas. O sistema radicular interno foi tingido com tinta
22/50 preta Schaeffer (Vierheilig et al., 1998). A quantificação de colonização de raiz pelo fungo foi realizada sob uma lupa binocular, e dois métodos foram usados: (i) para o primeiro experimento, o número de unidades de infecção (zonas contendo arbúsculos, vesículas e redes de hifas internas) foi contado para cada planta, e (ii) para o segundo, a percentagem de comprimento de raiz colonizada pelo fungo, isto é, mostrando arbúsculos, vesículas ou ambos, foi determinada pelo método de interseção em placa quadriculada (Giovannetti etal., 1980).
Micorrização de Medicago truncatula em condições axênicas
As plantas foram cultivadas em tubos de teste em inclinações de 20 ml de meio MM gelificado (Olàh et al., 2005) conforme descrito em Bem Amor et al. (2003). Fatores Myc à concentração de 108 M (ou solução de controle) foram incorporados diretamente ao meio estéril. Cinquenta esporos estéreis de G. intraradices foram colocados na parte inferior de cada inclinação próximo à raiz da muda. Os tubos de teste foram colocados em uma câmara de crescimento a 25°C com um fotoperíodo de 16 h e intensidade de luz de 366 pEinstein.m'2.s1. Após seis semanas, a arquitetura do sistema radicular foi analisada pelo software Winrhizo Scientific (Instruments Regent Inc, 2672 Chemin Ste Foy RD, Sainte Foy, Quebec, Canadá). A quantificação de colonização da raiz foi feita por contagem direta de contagens de infecção sob uma lupa binocular, após fingimento da raiz pelo método de tintavinagre (Vierheilig etal., 1998).
Micorrização de Medicago truncatula sobre um substrato carbonizado de argila
Mudas germinadas foram cultivadas por três semanas em tubos Falcon de 50 ml conforme descrito acima para micorrização de Tagetes. Vinte esporos de G. intraradices foram espalhados ao redor das raízes de mudas, em 1 ml de fator Myc a 107 M ou solução de controle. Então, cada planta recebeu 1 mi de fator Myc a 10'7 M, ou 1 ml de solução de controle, duas vezes por semana durante duas semanas. Duas séries de experimentos foram feitas com 12 mudas por tratamento. Os potes foram colocados em uma câmara de crescimento, a 25°C, com um fotoperíodo de 16 h e intensidade
23/50 de luz de 366 pEinstein.m2.s'1.
As plantas foram colhidas após 3 semanas. O sistema radicuiar interno foi tingido com tinta preta Schaeffer (Vierheilig et al., 1998). A percentagem de comprimento de raiz colonizada pelo fungo, isto é, mostrando arbúsculos, vesículas ou ambos, foi determinada pelo método de interseção em placa quadriculada (Giovannetti etal., 1980).
Bioensaios usados para testar a atividade desenvolvimental de fatores Myc
Bioensaios foram planejados para estudar a atividade desenvolvimental de fatores Myc purificados ou sintéticos.
(i) Estímulo ao desenvimento do sistema de raiz na leguminosa modelo M. truncatula
Mostrou-se anteriormente que um fator difusível de fungos AM estimula a formação de raízes laterais (LRF) em M. truncatula através da via DMI (Olah et al., 2005). Foi utilizado este bioensaio para testar a atividade desenvolvimental de fatores Myc purificados. O protocolo usado foi conforme descrito anteriormente, exceto que vitaminas não foram adicionadas ao meio M.
Identificação de genes de plantas envolvidos na sinalização de fator Myc foi realizada em M. truncatula, usando a análise genética da resposta de LRF já descrita (Olah et al., 2005). Respostas de LRF a fatores Myc foram estudadas na linhagem A17 Jemaiong de M. truncatula do tipo selvagem, como um controle, e nos mutantes deficientes em simbiose dmi1 (Y6), dmi2 (TR25), dmi3 (TRV25) e nsp1 (B85).
(ii) Germinação de sementes de tomate
Sementes de tomate variedade Heinz 1706 eram da coleta Core de sementes de tomate de INRA. Elas foram gentilmente providas por René Daamidaux do laboratório Génétique et Améiioration des Fruits et Légumes a INRA 84143 Montfavet cedex (França). A partir desta amostra de coleta Core, as sementes foram multiplicadas a LIPM (INRA-CNRS, Toulouse). As sementes foram armazenadas a 4°C. As sementes foram esterilizadas por 45 minutos em uma solução filtrada de hipoclorito de cálcio a 0,262 M (2,5 g de CaOCl em 75 ml de água), à qual duas gotas de Tween 20 foram adicio24/50 nadas. A solução de hipoclorito foi removida e as sementes foram enxaguadas três vezes com água destilada estéril. Placas de ágar de germinação foram preparadas através da dissolução de 9,375 g de Difco Agar Granulated (Becton-Dickinson) em um litro de água destilada. Uma solução de fator Myc a 1CT3 M foi preparada em 50/50 de água / acetonitrila, e foi então diluída às diluições apropriadas com água. A mesma quantidade de traços de solvente acetonitrila foi adicionada às placas de controle. Quinze sementes foram dispostas por placa, com seis ou oito repetições por tratamento. As placas foram incubadas no escuro a 14°C, 20°C e 28°C. A taxa de germinação foi marcada todo dia.
Análise estatística de dados
Dados de ensaios biológicos foram estatisticamente analisados com o teste t de Student ou análise de variância para dados após uma distribuição normal e com variâncias homogêneas, e testes não paramétricos de Kruskal-Wallis ou Wilcoxon para distribuições não normais. Software estatístico foi do sistema R (R Development Core Team, 2009).
Análises bioquímicas
Extração líquido/líquido para exsudatos de raízes micorrizadas
Em um bulbo de dois litros, 1,6 litros de exsudatos de raízes micorrizadas foram extraídos uma primeira vez com 400 ml (1/4 de volume) de butabol (1-butanol ou 2-metil-1 -propanol) e a mistura foi deixada para decantação para alcançar uma fase clara de butanol com uma interfase fina, permitindo uma boa separação de fases aquosa e de butanol (pelo menos seis horas). A fase aquosa foi então extraída uma segunda da vez com 350 ml (aproximadamente 1/5 de volume) de butanol e deixada de um dia para o outro. Após esta segunda extração, a fase de butanol total (extração 1 e extração 2) foi evaporada a um volume de aproximadamente 0,5 litro, que foi lavado através de uma extração líquido/líquido com o mesmo volume de água bidestilada. A fase de butanol lavada foi evaporada, transferida em um balão pequeno e seca usando um evaporador giratório. O extrato seco foi então novamente dissolvido em 5 mi de água / acetonitrila (1/1) e filtrado em algodão (preliminarmente lavado com clorofórmio) em um tubo de vidro de 8
25/50 ml e então seco sob fluxo de nitrogênio.
Extração líquido / líquido para germinar exsudatos de esporos:
Exsudatos de um milhão de esporos germinantes (aproximadamente 150 ml) foram primeiro extraídos com 1/3 de volume de acetato de etila. A mistura foi deixada para decantação para alcançar uma interfase fina e uma boa separação das fases aquosa e de acetato de etila (pelo menos seis horas). A fase aquosa foi extraída uma segunda vez com 1/3 de volume de acetato de etila de um dia para o outro. A fase aquosa foi então extraída com butanol (1-butanol ou 2-metil-1-propanol) após as mesmas etapas como para a extração de acetato de etila. As fases de butanol e acetato de etila foram reduzidas a poucos ml usando um evaporador giratório. Cada fase foi transferida para um tubo de 5 ml e seca sob fluxo de nitrogênio.
Purificação por extração de fase sólida (SPE):
Preparo de coluna-, o sistema SPE foi composto de uma coluna de vidro de 3 ml Chromabond cheia com fase reversa C18 (SUPELCO Discovery DSC-18). Um primeiro filtro de fibra de vidro foi introduzido à parte inferior da coluna. A fase sólida foi adicionada à coluna para representar 3,5 cm de altura na coluna. Um segundo filtro de fibra de vidro foi disposto sobre a fase sólida e empurrado para comprimir a fase sólida. Antes do uso, a coluna foi lavada com acetonitrila (ACN) e com água, e então condicionada com 20% de acetonitrila (ACN) em água.
Pré-filtração: o extrato foi dissolvido em um ml de ACN a 20%. O extrato foi filtrado em algodão em uma pipeta Pasteur (preliminarmente lavada com clorofórmio) e depositado sobre a coluna C18. O tubo e os filtros foram enxaguados com 1,5 ml de ACN a 20%.
Cromatografia: Usando uma seringa, o extrato foi empurrado através da fase C18. O líquido que se esgota da coluna foi coletado em um tubo de vidro de 8 ml. Para se livrar dos compostos não absorvidos, a fase foi abundantemente lavada (5 vezes equivalente ao volume da fase sólida com ACN a 20% em água). Este volume foi recuperado no mesmo tubo. Então moléculas retidas na coluna foram eiuídas com uma solução a 50% de ACN em água. O volume de eluição sendo equivalente a 5 vezes o volume
26/50 de fase sólida foi recuperado em um segundo tubo de vidro. Por fim, as moléculas fortemente adsorvidas foram aluídas da coluna com ACN a 100%. O volume de solvente (cerca de 6 ml) foi recuperado em um terceiro tubo. As três soluções (20%, 50% e 100% de ACN) foram evaporadas sob fluxo de nitrogênio, a fim de obter resíduos secos. Cada resíduo pode então ser novamente dissolvido no volume apropriado para realizar a HPLC semipreparativa. A coluna SPE foi usada para purificar aproximadamente 5 litros de exsudatos de raiz micorrizada.
HPLC semipreparativa:
Purificação foi realizada em um módulo de separação de Cromatografia Líquida de Alta Performance Shimadzu LC10 (Shimadzu Corporation, Lyoto, Japão) com uma coluna de fase reversa C18 semipreparativa (8 mm x 250 mm; 5 pm, Equisorb, CIL-Cluzeau). A alça de injeção tinha volume de 100 microlitros. O procedimento de cromatografia foi o seguinte: por 10 min em modo isocrático com solvente A (acetonitrila a 20% em água), seguido por um gradiente linear por 20 min de solvente A para solvente B (acetonitrila a 100%) e outra etapa isocrática a 100% de acetonitrila por 5 min. Dois minutos são necessários para voltar às condições iniciais (ACN a 20%). A taxa de fluxo foi 2 ml min'1 e a absorção de UV foi monitorada a 206 nm. A coleta de amostras ao longo do gradiente foi feita a cada minuto (2 ml) resultando em 14 frações.
HPLC analítica suplementar para detecção de LCOs não sulfatados
A purificação foi realizada em um módulo de separação de Cromatografia Líquida de Alta Performance Shimadzu LC10 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão) com uma coluna de fase C8 (Zorbax XDB-C8 HPEclipse (Hewlett Packard) 5 pm; 4,6 x 150 mm) por 5 min em modo isocrático com metanol a 30% em solvente água, seguido por um gradiente linear por 20 min para o solvente metanol a 100%, seguido por outra etapa isocrática a 100% de metanol por 5 min. 2 min foram necessários para voltar às condições iniciais. A taxa de fluxo foi de 1 ml min'1 e a absorção de UV foi monitorada a 206 nm. A coleta de amostras ocorreu ao longo do gradiente isocrático e etapa isocrática a 100% de metanol a cada minuto (cerca de 1
27/50 ml) de 15 a 23 min produzindo 8 frações.
Análise por UPLC-ToF MS:
Cada fração coletada de HPLC semipreparativa foi submetida à análise por UPLC-MS em um UPLC Acquity acoplado a espectrômetro de massa Q-Tof Premier (Waters Corporation). A coluna UPLC foi uma coluna Acquity (2,1 mm x 10 cm ; 1,7 pm) (Waters, EUA), e a taxa de fluxo foi 0,45 ml/min. Para os compostos mais hidrofílicos (frações de HPLC semipreparativa 1 a 9), o programa foi um gradiente linear variando de 10% de ACN (em ácido acético / água a 1%) a 100% de ACN dentro de 7 minutos, seguido por uma etapa isocrática a 100% de ACN por 2 min e então um retorno às condições iniciais (2 minutos) e finalmente uma etapa recondicionante de 1 min com ACN a 10% (em ácido acético / água a 1%). Para alcançar uma melhor resolução dos compostos mais hidrofóbicos (frações de HPLC semipreparativa 6 a 11), o gradiente UPLC foi mais estendido: gradiente linear iniciando a 25% de ACN em ácido acético / água a 0,1% e alcançando 100% de ACN dentro de 7 minutos. Para o espectrômetro de massa, a capilaridade foi ajustada a 3,2 kV e o cone a 10 V. Massa de bloqueio interno foi realizada por introdução contínua à fonte de uma solução de Leucina-encefalina. O espectrômetro foi calibrado antes de cada experimento. Os compostos mais hidrofílicos (frações de HPLC semipreparativa 1 a 9) foram analisados em ambos modos negativos e positivos a fim de facilitar respectivamente a detecção de compostos aniônicos (sulfatados) e catiônicos (não sulfatados).
Para fragmentação de moléculas, íons específicos foram selecionados e submetidos à análise MS/MS usando energia de colisão a 15V. Hidrólise suave:
Este método é usado para remover a porção sulfato de LCOs sulfatados sem afetar o resto das moléculas (Roche etal., 1991b). Fração A, eluindo entre 15 e 16 min em HPLC semipreparativa, foi transferida em um frasco de vidro com rosca e seca sob fluxo de nitrogênio. Ela foi novamente dissolvida duas vezes em metanol anidro e novamente seca, a fim de remover água residual. 250 pl de HCI a 0,05M em metanol foram adicionados à amostra seca. A reação foi realizada de um dia para o outro à temperatura
28/50 ambiente. A amostra foi então seca novamente sob fluxo de nitrogênio e lavada duas vezes com metanol anidro a fim de remover todo a ácido. Produção de quantidades em miligrama de fatores Myc
A purificação de fatores Myc a partir de exsudatos de esporos germinantes de Glomus intraradices e de raízes micorrizadas resulta em rendimentos extremamente baixos. Duas estratégias foram usadas para produzir grandes quantidades dessas moléculas, fazendo uso de engenharia genética bacteriana.
(i) Produção de fatores Myc por mutantes de Rizóbio
Rizóbios produzem fatores Nod que são LCOs substituídos que compartilham algumas similaridades estruturais com fatores Myc. A principal diferença é que fatores Myc são LCOs muito simples com um número muito limitado de substituições, essencialmente restritas à possível O-sulfatação do resíduo de N-acetil glucosamina redutor. A estratégia foi usar mutantes rizóbios alterados em genes que codificam enzimas responsáveis por substituições de precursores de fator Nod e, portanto, secretando LCOs muito simples similares a fatores Myc. Escolheu-se utilizar cepas mutantes derivadas de espécies rizóbias que produzem a maioria de LCOs tetraméricos e uma minoria (cerca de 10%) de LCOs pentaméricos, como no caso de fatores Myc fúngicos.
Para a produção de fatores Myc sulfatados, foi utilizado um mutante duplo Sinorhizobium meliloti nodFEnodL. A mutação nodL suprime Oacetilação do resíduo terminal GluNac não redutor, e a mutação nodFe bloqueia a síntese do ácido graxo insaturado 16:2 resultando na N-acilação com C18:1 (vacênico) ou C16:0 (palmítico) ácidos graxos (Ardourel et al., 1994). Para aumentar a produção de LCOs, um plasmídeo multicópia portando genes nod regulatórios (pMH682) foi introduzido na cepa mutante. A cepa de superprodução resultante, GMI 6629, foi cultivada em um meio de crescimento líquido contendo 5 pg/ml de tetraciclina para manter a presença do plasmídeo pMH682 e luteolina (10 μΜ) como um indutor de gene Nod (Ardourel etal., 1994). Quando a cultura bacteriana alcançou uma densidade celular de cerca de 109 células por ml, fatores Nod foram extraídos por ex29/50 tração líquido/líquido com butanol e acetato de etila (Roche et al., 1991). LCOs foram então purificados por HPLC em uma coluna de fase reversa C18 conforme anteriormente descrito (Dermont et al., 1993), com a seguinte modificação de gradiente de água acetonitrila: uma fase isocrática de 10 min a 20% de acetonitrila foi seguida por uma execução de gradiente linear de acetonitrila a 20 até 65% por 30 min a uma taxa de fluxo de 2 ml/min. Os picos contendo LCOs sulfatados foram coletados entre 32 e 35% de acetonitrila e analisados por espectrometria de massa. A maioria dos LCOs foi tetramérica e a minoria pentamérica, como para fatores Myc. LCOs foram Osulfatados na extremidade redutora e N-acilados com C18:1 e C16:0 ácidos graxos na extremidade não redutora. Nenhuma substituição O-acetila pode ser detectada.
Para a produção de fatores Myc não sulfatados, a cepa LPR5045 (pMP247) foi usada. Ela é um derivado da cepa de R. leguminosarum bv. Trífolii RCR5, curada do plasmídeo Sym, em que um plasmídeo multicópia contendo os genes comuns nodABCIJ (= pMP247) foi introduzido (Lugtenberg et al., 1995(. Esta cepa de superprodução foi cultivada em meio de B-cultura com 5 pg/ml de tetraciclina para manter o plasmídeo pMP247 e naringenina a 10 pM como um indutor de gene nod (Spaink et al., 1994). LCOs foram extraídos do meio de cultura conforme descrito acima. Purificação por HPLC foi realizada com a mesma coluna de fase reversa C18 como para LCOs sulfatados, com uma fase isocrática de 20 min a 26,5% de acetonitrila seguida por um gradiente linear de acetonitrila água de 26,5% a 1005 de acetonitrila por 40 min a uma taxa de fluxo de 2 ml/min. Picos correspondendo a LCOs não sulfatados foram coletados a cerca de acetonitrila a 50% e analisados por espectrometria de massa. A maioria dos LCOs foi tetramérica e a minoria pentamérica, como para fatores Myc. N-acilação foi com C18:1 e C16:0 ácidos graxos. Nenhuma O-acetila ou O-sulfato substituição pode ser detectada.
A estrutura dos principais LCOs sulfatados e não sulfatados produzidos pelas cepas mutantes rizóbias, Sinorhizobium meliloti GMI 6629 e Rhizobium leguminosarum bv. trífolii LPR5045 (pMP247), está respectivamente representada abaixo. Eles são mimes perfeitos dos fatores Myc produzidos pelo fungo AM Glomus intraradices (vide exemplo 2).
R2 = H ou SO3H
30/50
Ri - C15:0, C-|5:1 or C-iyO, C17:1 n = 2 ou 3
Esses fatores Myc, preparados a partir de culturas mutantes de rizóbios, foram testados quanto à atividade biológica. O exemplo 7 mostra que uma mistura desses fatores Myc sulfatados e não sulfatados estimula grandemente a formação de micorrizas (figura 14a), demonstrando que essas moléculas atuam como autênticos sinais micorrízicos.
(ii) Produção de fatores Myc através da abordagem de usina celular
Esses fatores Myc sintéticos foram gentilmente providos por Eduardo Andres Martinez e Hugues Driguez de CERMAV CNRS Laboratory em Grenoble, França. O procedimento que eles utilizaram foi essencialmente conforme descritos na literatura (Samain et al., 1999): cultivo de alta densidade celular de cepas recombinantes de E. coli abrigando os genes nodBC ou nodBCH de Sinorhizobium meliloti proporcionou Nlll,ll-triacetilquitintetraose e 60l-sulfatado-Nl,ll,lll-triacetil-quitintetraose como compostos principais junto com pequenas quantidades de seus pentâmeros correspondentes.
Após extração e purificação desses compostos, N-acilação seletiva foi conduzida usando cloretos de ácido hexadecanoico ou oleico em diversos solventes hidro-orgânicos ou utilizando os ácidos livres, e o procedimento de N-acilação anteriormente desenvolvido para o preparo de fatores de nodulação de lipoquito-oligossacarídeos (Ohsten Rasmussen et al., 2004).
Os quatro lipoquito-oligossacarídeos a seguir foram preparados:
31/50
LCO IV-(contaminado com—10%-deLCOV)C16:0
LCO-IV-(contaminadocom^-10%-deLCOV)SC16:0
LCO-IV(C16iO)
C46HE2N4O21 massa exata: 1026,5 peso molecular; ]027,2 m/e: 1026,5
LCO-IV-(contaminadocom^-10%-de-LCO-V)-SC18:1
LCQ-IV($,C18:1)
CwIIsjNjNaOaS massa exata; 1154,5 peso molecular.; 1155,2 ffl/K 1154,5
Resultados
Exemplo 1: Purificação de fatores Myc de exsudatos de raízes micorrizadas e de exsudatos de esporos germinantes
Estratégia geral
Cepa de Glomus intraradices DAOM 197198 foi usada como uma fonte de fatores Myc porque esta cepa tem uma ampla faixa de hospedeiro e é usada para produção industrial de larga escala de inoculantes de fungos AM. Esta cepa é bem caracterizada e seu genoma está sendo sequenciado. Duas fontes de fatores Myc foram usadas de uma maneira com10 plementar. Exsudatos de raízes micorrizadas têm a vantagem de permitir a extração de grandes volumes com a possibilidade de obter quantidades significantes de fatores Myc. A desvantagem dessa fonte é que exsudatos contêm uma mistura de compostos de origem vegetal e fúngica. Isso é porque também foi utilizada outra fonte, exsudatos de esporos germinantes purifica15 dos, que contêm apenas compostos de origem de fungos AM, porém têm a
32/50 desvantagem de produzir concentrações extremamente baixas de fatores
Myc.
Compostos biologicamente ativos presentes em exsudatos de fungos AM são anfifílicos
Exsudatos de raiz micorrizada foram primeiro extraídos através de um procedimento líquido-líquido, com butanol e acetato de etila. Fases aquosas, de butanol e de acetato de etila foram verificadas quanto à atividade biológica com bioensaios de MtENOD11 e VsHab: atividade foi encontrada na fração de butanol, o que indicou que fatores Myc são compostos anfifílicos. Conforme mostrado na figura 1, um composto ativo pode ser detectado com o ensaio de MtENOD11 através de um tingimento com azul que aparece nas raízes crescentes, e com o ensaio VsHab através do aparecimento de ramificações claras próximo à ponta de pelos radiculares de ervilhaca.
Então, o extrato de butanol foi submetido à Extração de Fase Sólida (SPE) com uma coluna C18 de fase reversa e sucessivamente eluída com 20%, 50% e 100% de solvente acetonitrila. Atividade biológica foi encontrada na fração eluída por 50% de acetonitrila em ensaios de MtENOD11 e VsHab confirmando que o(s) composto(s) ativo(s) é(são) anfifílico(s). Resultados similares foram obtidos com mais de cinco amostras independentes de exsudatos de raiz micorrizada. Uma atividade muito leve sobre VsHab também pode ser algumas vezes observada nos 100% de eluato de acetonitrila, sugerindo que diferentes compostos podem ser responsáveis pelas respostas a MtENOD11 e VsHab, o composto atuando sobre o ensaio de VsHab sendo ligeiramente mais hidrofóbico do que o composto que atua sobre o ensaio de MtENOD11.
Exsudatos de esporos germinantes foram extraídos pelo menos procedimento líquido-líquido com butanol e acetato de etila. A atividade em ambos ensaios de MtENOD11 e VsHab estava presente apenas na fase de butanol. Os mesmos resultados foram obtidos com cinco amostras independentes de esporos germinantes. Portanto, também é possível concluir que o(s) composto(s) anfifílico(s) ativos sobre os ensaios de MtENOD11 e VsHab são de origem fúngica de AM.
33/50
Dois tipos de compostos ativos em exsudatos de raiz micorrizada
Para melhor determinar os compostos ativos sobre MtENOD11 e VsHab e obter informação com relação a suas propriedades cromatográficas, a fração de butanol precisou ser analisada por HPLC. Entretanto, os exsudatos de raiz micorrizada sendo altamente contaminados por compostos de raiz vegetal e por Phytagel, a fração de butanol foi pré-tratada por SPE antes da etapa de HPLC, conforme descrito no parágrafo anterior. A fração de SPE eluída por 50% de acetonitrila, e ativa nos dois bioensaios, foi então analisada em uma HPLC semipreparativa com uma coluna C18 de fase reversa e um gradiente de acetonitrila-água. Quatorze frações foram coletadas a cada dois minutos. Um perfil típico é dado na figura 2. Cada fração foi testada quanto à atividade sobre MtENOD11 e VsHab. Frações eluídas a 30 - 48% de acetonitrila (ACN) (fração A) foram verificadas como sendo ativas em MtENOD11, e frações eluídas a 64 - 72% de ACN (fração B) foram ativas no bioensaio de VsHab. Esses dados mostram que não é o mesmo composto que é ativo em ambos bioensaios. O(s) composto(s) ativos(s) em MtENOD11 é mais hidrofílico do que aquele(s) ativo em VsHab.
É interessante notar que as características de eluição da fração ativa sobre MtENOD11 correspondem àquelas observadas com fatores Nod sulfatados de Sinorhizobium meliloti e Rhizobium tropici (33 - 45%), que também podem exibir atividade com o bioensaio de MtENOD11. Por outro lado, as características de eluição da fração ativa sobre VsHab correspondem bem àquelas observadas com fator Nod não sulfatado de R. leguminosarum bv. Viciae (Q7%) e fatores Nod não acilados de Rhizobium meliloti nodHnodL (66%) que também podem exibir atividade com o bioensaio de ervilhaca. Esses dados são compatíveis com a hipótese de que os exsudatos de raiz micorrizada contêm uma mistura de LCOs sulfatados e não sulfatados.
Dois tipos de compostos ativos em exsudatos de esporos germinantes
Extratos de butanol de exsudatos de esporos germinantes foram analisados em uma HPLC semipreparativa nas mesmas condições conforme descrito acima. Conforme visto na figura 3, exsudatos de esporos também
34/50 continham dois tipos de compostos ativos, um mais hidrofílico ativo sobre MtENOD11 (fração A) e um mais hidrofóbico ativo sobre VsHab (fração B). As características de eluição dos dois compostos são idênticas àquelas observadas com os dois compostos ativos dos exsudatos de raiz micorrizada. Esses resultados indicam que os dois compostos ativos presentes nos exsudatos de raiz micorrizada são de origem fúngica de AM. Seu comportamento cromatográfico e suas atividades biológicas são compatíveis com a hipótese de que eles podem corresponder a LCOs sulfatados e não sulfatados. Modificação de atividade associada à dessulfatação da fração A
Uma hidrólise metanólica suave de LCOs sulfatados, como fatores Nod de S. meliloti, mostrou remover o grupo sulfato sem causar outras modificações estruturais (Roche et al., 1991b). Para verificar se a atividade biológica sobre MtENOD11 da fração A coletada após HPLC de extratos de butanol de exsudatos de esporos germinantes pode ser devido a um LCO sulfatado, uma amostra da fração A foi submetida a este tratamento de hidrólise suave. A fração tratada perdeu totalmente a atividade sobre MtENOD11 (vide figura 4). De maneira interessante, ao passo que a fração A não foi originalmente ativa sobre o bioensaio de VsHab, a fração tratada exibiu uma clara atividade sobre VsHab (figura 4). Que a fração A pode após hidrólise suave ganhar uma função, a atividade sobre VsHab, mostra que essa hidrólise metanólica suave não degradou de maneira drástica o composto ativo da fração A, mas simplesmente o modificou, provavelmente através da remoção da porção sulfato que é uma O-substituição muito instável em LCOs. Estes dados indicam que a atividade da fração A sobre MtENOD11 pode ser devido a LCO(s) sulfatados e que a atividade da fração B mais hidrofóbica sobre VsHab pode ser devido a LCO(s) não sulfatados. Exemplo 2: caracterização bioquímica de fatores Myc
LC/MS e UPLC/MS
As diferentes frações obtidas após a HPLC de fase reversa semipreparativa de extratos de raiz micorrizada foram individualmente cromatografadas sobre uma coluna de fase reversa analítica sob pressão ultravioleta (UPLC). A detecção ocorreu através de ESI-MS.
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Os resultados estão mostrados nas figuras 5 a 8. Estas figuras apresentam as correntes iônicas correspondentes a LCOs supostamente presentes nas amostras, de acordo com os tempos de retenção de HPLC e UPLC, e atividade biológica. Se existirem compostos exibindo a massa necessária dentro de sua distribuição isotópica, então eles irão aparecer no cromatograma como picos. Visto que os picos obtidos desta maneira podem ser artefactuais (os picos podem corresponder a um composto menor do perfil isotópico), os espectros correspondentes também estão dados na parte inferior de cada figura.
As primeiras oito frações de HPLC, para as quais o comportamento cromatográfico e atividades biológicas sugeriram a presença de LCOs sulfatados, foram analisadas no modo negativo. De acordo com os tempos de retenção medidos em UPLC usando LCOs tetraméricos (DP4) e pentaméricos (DP5) padrão, massas exatas (erro menor do que 10 ppm) correspondendo a entidades sulfatadas DP4 e DP5 foram pesquisadas na fração 4 que mostrou a atividade mais alta no ensaio MtENOD11. Nessa fração, massas correspondendo a DP4 sulfatado portando C16 acilas podem ser facilmente detectadas (figura 5). Em concordância com seus respectivos tempos de retenção de HPLC, 4ão de HPLC, foi possível detectar na fração anterior (fração 3) os DP5s correspondentes (figura 7) e nas seguintes cadeias C18 portando DP4 sulfatados (fração 5) (figura 6). Nas frações a seguir (6 a 8), entidades DP3 foram pesquisadas sem sucesso. Os compostos foram caracterizados primeiro usando diferentes correntes iônicas (ajuste entre as chamadas massas exatas e os tempos de retenção esperados) e em segundo lugar com relação ao perfil isotópico dos espectros correspondentes. A figura 8 ilustra a eficiência do método para detectar a presença ou ausência de um dado composto, tendo uma massa específica. Corrente iônica m/z 1332,6; correspondendo a um LCO putativo (V,C18:2,S) produziu apenas amplificação de ruído de fundo (nenhum pico individual bem definido), ao passo que a corrente iôniea m/z 1334,6 correspondendo a um LCO putativo (V,C18:1,S) claramente demonstrou a presença de um pico de UPLC contendo um composto que exibe a massa esperada (dados confirma36/50 dos pelo espectro de massa registrado). Desse modo, os extratos Myc contêm o LCO sulfatado pentamérico N-acilado por C18:1, porém nenhum derivado acilado por C18:2.
Usando-se esse procedimento, não foi possível detectar entidades DP4 ou DP4 sulfatadas portando O-substituições como grupos acetila, carbamoíla ou fucosila ou N-substituições como um grupo metila, que são muito frequentemente encontradas nos fatores Nod de lipoquitooligossacarídeos produzidos por diversas cepas de rizóbios.
As frações 7 a 11 foram analisadas então em UPLC, porém a detecção ocorreu no modo ESI-MS positivo. A mesma estratégia foi aplicada: chamada iônica (ion call) seguida por análise dos espectros correspondentes.
Extratos de raízes micorrizadas também foram analisados por LC/MS. Frações eluindo entre 20 e 23 minutos na HPLC semipreparativa foram reunidas, secas sob fluxo de nitrogênio e novamente dissolvidas em 150 pl de ACN a 50% em água e ácido acético a 1%. As soluções foram diretamente infundidas na fonte ESI de um espectrômetro Q-Tof Ultima (Waters, US). A capilaridade foi ajustada a 3 kV, a voltagem de cone a 70V, a lente Rf a 35V. No modo, positivo, os íons moleculares de dois compostos menores a m/z 1045,5 e 1047,5 podem ser detectados correspondendo aos LCOs tetraméricos cationizados de sódio portando uma C16:1 ou um C16:2 acila e nenhuma O-substituição. Massas e perfis isotópicos confirmaram as estruturas propostas.
Como importantes quantidades de contaminantes (por exemplo, PEG), co-eluição com os compostos de LCO não sulfatados pesquisados nas frações 9-11 impediram suas detecção por MS, uma purificação por HPLC suplementar foi realizada. As frações 9 e 10 da HPLC semipreparativa foram reunidas e injetadas em uma coluna C8 analítica e eluídas usando um gradiente iniciando com MeOH a 30% em água e finalizando com MeOH a 100%. Contaminantes eluíram de 1 a 15 minutos. Os compostos de LCO esperados foram aguardados em torno de 20 minutos. Frações coletadas entre 15 e 23 minutos foram separadamente analisadas em UPLC-MS e a
37/50 detecção de íons específicos realizada com base nas espécies sulfatadas correspondentes observadas (DP4 e DP5; cadeias C16:0 e C18:1 acila). A chamada iônica da massa exata m/z 1027,56 (DP4,C16:1) deu uma resposta em fração eluindo entre 18 e 19 minutos. O tempo de retenção comparado a padrões sintéticos e a massa exata e perfil isotópico corresponderam ao composto pesquisado. A estrutura foi definitivamente confirmada pelo espectro de massa registrado, que exibiu a fragmentação B clássica a m/z 400,2; 603,3; 806,4.
MS/MS
Demonstrar a presença de compostos tendo a massa adequada no tempo de retenção esperado de HPLC ou UPLC não é suficiente para atestar sua estrutura. Portanto, foi realizada análise MS/MS de um do composto de LCO putativa. A figura 9 apresenta a comparação entre o fator Nod sulfatado de S. meliloti DP4 C16:2 em MS/MS no modo negativo e aquele registrado no fator Myc candidato presente na amostra, LCO (IV,C16:0,S). íons característicos da extremidade redutora a m/z 503 (Y2), 605 e 706 (Y3) são claramente detectados em ambos casos, assim como a perda neutra característica de 101 amu (ruptura intracíclica) partindo do íon molecular. O ajuste perfeito entre os dois padrões de fragmentação indica a associação estrutural das duas moléculas e indica que o grupo sulfato está localizado no resíduo glucosamina redutor, ao passo que a substituição acila graxa está localizada no resíduo glucosamina não redutor terminal. Visto que a fragmentação não produz íons de beta-eliminação (íons de ácido graxo), é muito provável que a substituição acila graxa seja uma amida no átomo de N do resíduo glucosamina.
Exemplo 3: estímulo à formação de raízes laterais por fatores Myc
Extrato de butanol de exsudatos de raiz micorrizada, após purificação adicional por extração de fase sólida (SPE) e eluição em 50% de acetonitrila, foi incorporado a placas M e testado quanto ao crescimento de mudas de M. truncatula A17. Esse extrato de Myc purificado induziu um estímulo significante à formação de raízes laterais (P = 0,05). Quando testado em um mutante de M. truncatula dmi1 (Y6), esse extrato de Myc não estimulou a
38/50 formação de raízes laterais, indicando que esse extrato semipurificado continha um sinal Myc que ativa a formação de raízes laterais (LRF) através da via de sinalização simbiótica DMI (figura 10A).
Exsudatos de esporos germinantes foram extraídos com acetato de etila e butanol. Os três extratos (aquoso, acetato de etila e butanol) foram então verificados quanto ao estímulo à LRF sobre mudas de M. truncatula A17. O extrato de butanol estimulou a LRF de maneira significante (P = 0,05), ao passo que os extratos aquoso e de acetato de etila não foram ativos (figura 10B). Este experimento confirma a origem fúngica de AM do(s) composto(s) anfifílico(s) que provocam o estímulo à LRF.
O extrato de butanol de exsudatos de raízes micorrizadas, após SPE, foi ainda purificado por HPLC semipreparativa e as frações correspondentes a LCOs sulfatados (fração A, ativa no ensaio de MtENODH) e a LCOs nãosulfatados (fração B, ativa no ensaio de VsHab) foram coletadas de maneira separada e testadas em mudas de M. truncatula A17. Verificouse que as duas frações estimulam de maneira significante LRF (figura 10C). Esses dados indicam que os fatores Myc são feitos de uma mistura de LCOS simples sulfatados e não sulfatados que são ambos capazes de estimular a formação de raízes laterais em plantas.
Exemplo 4: efeito de fatores Myc sobre a formação de AM na leguminosa modelo M. truncatula
Fatores Myc sintéticos produzidos pela abordagem de usina celular, conforme descrito em materiais e métodos, foram usados para estudar a possível influência de fatores Myc sobre a micorrização de raízes na leguminosa modelo Medicago truncatula pelo fungo AM Glomus intraradices.
Em uma primeira série de experimentos, mudas de M. truncatula foram cultivadas em condições axênicas em tubos de teste sobre um meio gelificado inclinado pobre em fósforo e nitrogênio, em que fatores Myc foram adicionados a uma concentração de 10'θ M. Cada muda foi inoculada com 500 esporos fúngicos estéreis (Olah et al., 2005). O número de unidades de infecção (zonas contendo arbúsculos, vesículas e redes internas de hifas) por planta foi contado sob uma lupa binocular seis semanas após inocula39/50 ção. O tratamento por fatores Myc aumentou o número de unidades de infecção por planta em 148% (veja figura 11a).
Em uma segunda série de experimentos, mudas de M. truncatula foram cultivadas em um substrato feito de granulados de argila carbonizados em condições não estéreis e cada muda foi inoculada com 50 esporos fúngicos. Fatores Myc foram adicionados ao meio a uma concentração de 10'8 Μ. O percentual de colonização de raiz foi medido pelo método de interseção em placa quadriculada três semanas após inoculação. O percentual de raízes micorrizadas em plantas tratadas por fatores Myc foi 28,5% mais alto do que nas plantas de controle (figura 11b).
Conclusões: À baixa concentração (1Ο'θ M), fatores Myc sintéticos estimulam a formação de AM na leguminosa modelo M. truncatula, proporcionando evidência do que os fatores Myc identificados são autênticos sinais micorrízicos.
O fato de que fatores Myc estimulam de maneira eficiente a formação de AM em leguminosas abre caminho para amplas aplicações em horticultura (por exemplo, feijão, grão de bico, lentilha), agricultura (por exemplo, soja, ervilha, ervilha em fava, alfafa, amendoim) e silvicultura (por exemplo, gafanhoto preto).
Exemplo 5: efeito de fatores Myc sobre o desenvolvimento de raízes de leguminosas
Fungos AM secretam compostos difusíveis que estimulam a formação de raízes laterais (LRF) na leguminosa modelo Medicago truncatula (Olah et al., 2005). Foi mostrado (veja Exemplo 3) que frações de HPLC contendo LCOs sulfatados e não sulfatados fúngicos provocam esse estímulo à LRF. Para demonstrar que esse estímulo à LRF é realmente devido a LCOs e não a compostos de contaminação fúngica possivelmente presentes nessas frações de HPLC, foram utilizados LCOs sintéticos sulfatados e não sulfatados, tendo a mesma estrutura que aqueles detectados em exsudatos fúngicos (vide exemplo 4 e materiais e métodos).
À 10'8 M, fatores Myc sulfatados sintéticos puros, ou fatores não sulfatados puros, assim como uma mistura de ambos fatores Myc sulfatados
40/50 e não sulfatados, foram todos claramente estimulantes de LRF (vide figura 12a), mostrando que ambos tipos de compostos atuam como reguladores do crescimento de plantas. Em contraste, à 10'1θ M, a mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados foi ainda extremamente ativa, ao passo que os compostos puros, sulfatados ou não, não foram ativos. Esses dados mostram que uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados é claramente mais ativa do que fatores Myc puros sulfatados ou não sulfatados.
Portanto, fatores Myc não são apenas sinais simbióticos que ativam o programa simbiótico da planta hospedeira durante as primeiras etapas de micorrização, eles podem também atuar como autênticos reguladores de plantas, estimular a formação de raízes laterais e influenciar a arquitetura radicular.
De um ponto de vista agrícola, foi importante abordar a questão da possível influência de fatores Myc não apenas sobre a ramificação radicular, mas também sobre o desenvolvimento geral do sistema radicular. Após desenvolvimento das mudas de plantas por 8 dias no meio de crescimento contendo ou não uma mistura de fatores Myc sulfatados ou não sulfatados, as raízes foram cortadas, triadas e o sistema radicular foi analisado com o software WinRhizo. O tratamento com fatores Myc resultou em um aumento de 13,16% de comprimento total de raiz (figura 12b). O tratamento com fatores Myc é, portanto, capaz de estimular o desenvolvimento de todo o sistema radicular.
Conclusões: Ambos fatores Myc sulfatados e não sulfatados são sinais ativos, atuando a uma baixa concentração (1O'S M), porém uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados é claramente mais ativa (abaixo de 10'1°M).
Eles estimulam de maneira eficaz a formação de raízes laterais e o desenvolvimento do sistema radicular e são, portanto, não apenas sinais simbióticos, mas também potentes reguladores do crescimento de plantas.
Essas descobertas abrem caminho para o uso dessas moléculas em horticultura, agricultura e silvicultura para estimular o desenvolvimento da raiz da planta e o crescimento da planta.
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Exemplo 6: fatores Myc provocam respostas de plantas através da via de sinalização simbiótica DMI
Uma via de sinalização simbiótica foi identificada em M. truncatula com genes codificando percepção de fator Nod (NFP), para sinalização de cálcio (DM111, DM12 e DM13) e um ativador de transcrição específico de nodulação (NSP1) (Catoira et al., 2000; Smith et al., 2005). Mutações em genes DM11, DM12 e DM13 resultam na alteração da formação de nódulos, porém também da formação de micorrizas, indicando que esses três genes DMI estão envolvidos em uma via de sinalização comum para nodulação e micorrização (Catoira et al., 2000). Em contraste, mutações no gene NSP1 resultam em um defeito na nodulação, porém a micorrização não é afetada (Catoira etal., 2000). Esta descoberta levou à hipótese de que sinais simbióticos micorrízicos, fatores Myc, estão ativando o programa micorrízico de plantas através da via DMI (Catoira et al., 2000). É impossível determinar se os genes DMI estão envolvidos no estímulo à formação de AM por fatores Myc porque mutantes dmi são defeituosos quanto à formação de micorrizas. Para abordar a questão do possível envolvimento de genes simbióticos de plantas na resposta a fatores Myc, foi utilizado o ensaio de formação de raízes laterais de M. truncatula (LRF) descrito nos Exemplos 3 e 5.
Fatores Myc sulfatados exibem algumas similaridades estruturais com fatores Nod de Sinorhizobium meliloti. Para evitar possível cruzamento entre sinalização de fator Nod e fator Myc, foram utilizados fatores Myc sintéticos nãosulfatados. Foi estudada a resposta a estímulo à LRF na linhagem A17 do tipo selvagem de M. truncatula como um controle, e em mutantes dmi1 (Y6), dmi2 (TR25), dmi3 (TRV25) e nsp1 (B85).
Conforme já descrito no Exemplo 5, tratamento da linhagem do tipo selvagem com 10'8 M de fatores Myc não sulfatados resultou em um claro estímulo à formação de raízes laterais. Em contraste, nos mutantes dmi1, dmi2 e dmi3 deficientes em micorriza, fatores Myc não acionaram o estímulo à LRF (veja figura 13). No mutante msp1 que é deficiente em nodulação, porém tem um fenótipo micorrízico normal, e em que fatores Nod são incapazes de estimular LRF, fatores Myc acionaram um estímulo à LRF muito
42/50 claro (figura 13). Esses dados mostram que fatores Myc provocam respostas de plantas a jusante dos genes DMI através de uma via de sinalização específica de micorriza, distinta da via de sinalização de fator Nod (NSP1).
Conclusões: A capacidade de fatores Myc para estimular a LRF é anulada em mutantes dmi1, dmi2 e dmi3. Isso mostra que as respostas desenvolvimentais induzidas por fatores Myc são provocadas através da via simbiótica DMI, também demonstrando que fatores Myc são autênticos sinais simbióticos.
O gene NSP1 específico de nodulação não é necessário para a resposta de estímulo à LRF, indicando que fatores Myc acionam essa resposta desenvolvimental através de uma via específica de Myc que atua através e a jusante de genes DMI e independente da via específica de nodulação (NSP1). Isso também evidencia que os fatores Myc que foram identificados não autênticos sinais micorrízicos.
Exemplo 7: estímulo de formação de AM em raízes extirpadas transformadas de cenoura, um sistema usado para a produção de inoculantes micorrízicos industriais
Fungos AM são simbiontes obrigatórios: eles não podem se propagar e formar esporos em cultura pura. Para seu desenvolvimento, eles precisam colonizar raízes de plantas hospedeiras. Esta exigência restrita tem impedido ambas restritas básicas quanto à simbiose de AM e quanto à possibilidade de produzir inoculantes de fungos AM em grande escala para fins de horticultura e agricultura. Um importante avanço foi alcançado usando-se culturas de raízes extirpadas transformadas para desenvolver fungos AM, tornando possível a produção de grandes quantidades de esporos fúngicos estéreis (Bécard e Fortin, 1988). Um sistema que foi usado por muitos anos (Chabot et al., 1992) é o co-cultivo da cepa DAOM 197198 de Glomus intraradices do fungo AM com um clone de raiz extirpada de cenoura transformado por Agrobacterium rhizogenes. Este sistema de cocultivo é usado nomeadamente pela empresa de biotecnologia PremierTech (Québec) para a produção de inoculantes de fungos AM comerciais. Foi abordada a questão da possibilidade do uso de fatores Myc em baixas concentrações, como
43/50 um aditivo em meios de crescimento, estimular a micorrização de raízes extirpadas.
Primeiro foi utilizada uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados, produzidos por mutantes rizóbios apropriados (vide materiais e métodos), que foi adicionada ao meio de crescimento a uma concentração de 10'θ M. Raízes de cenoura extirpadas axênicas foram inoculadas com esporos estéreis de G. intraradices. O percentual de comprimento de raiz colonizado pelos fungos AM foi estimado pelo método de interseção em placa quadriculada (Giovannetti e Mosse (1980). Cinco repetições foram usadas. A leitura foi realizada com uma lupa binocular após oito semanas, em um modo duplo-cego.
Na figura 14, pode ser visto que a adição de uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados a W8 M no meio de crescimento resultou em um aumento muito forte no percentual de colonização (+ 68,6%).
Em um segundo experimento, uma mistura de fatores Myc sintéticos sulfatados e não sulfatados foi adicionada ao meio de crescimento a 10'8 M. Quinze repetições foram usadas. Conforme mostrado na figura 14b, após oito semanas o efeito de fatores Myc sobre o estímulo da formação de AM foi bastante significativo (+ 20,5).
Conclusões: uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados estimula de maneira ativa a formação de AM nas raízes da cenoura não leguminosa. Isso é mais uma evidência de que os fatores Myc que foram identificados e que foram sintetizados são autênticos sinais micorrízicos.
Ambos fatores Myc sintéticos preparados através de um procedimento bioquímico e fatores Myc preparados a partir de cepas rizóbias mutantes são eficazes em estimular a formação de micorrizas, mostrando que esses dois tipos de estratégias são adequados para produção em larga escala de fatores Myc.
Esses dados abrem caminho para o uso de fatores Myc como aditivos nos meios de crescimento utilizados para produção de inoculante de AM pela indústria biotecnológica, usando raízes extirpadas transformadas. Exemplo 8: efeito de fatores Myc sobre a formação de AM na nãoleguminosa
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Tagetes patula
Tagetes patula, membro da família Asteraceae, foi escolhida como uma planta hospedeira não leguminosa. T. patula (malmequer francês) é uma planta de jardim muito popular. Essa espécie é usada em plantio companheiro para muitas culturas vegetais. Suas secreções radiculares são relatadas por matar nematódeos no solo e acredita-se que repele insetos danosos, como a mosca branca entre tomates. A planta inteira pode ser colhida quando em flor e destilada por seu óleo essencial, que é usado em perfumaria. T. patula é usada para testar micorrização porque é uma planta pequena fácil de manusear e exibe rápida colonização de raiz por fungos AM. A variedade Légion d’honneur foi usada. Ensaios de micorrização foram realizados por mudas crescentes sobre um substrato feito de partículas de argila carbonizada. Sementes foram inoculadas com esporos estéreis de G. intraradices, e fatores Myc foram adicionados à concentração de 108 M.
Em uma primeira série de experimentos, uma mistura de fatores Myc sintéticos sulfatados e não sulfatados foi usada. O grau de micorrização foi estimado quatro semanas após inoculação contando-se o número de unidades de infecção. Plântulas tratadas com fator Myc tiveram um aumento altamente significante de 153,5% no número de unidades de infecção por planta (figura 15a1). Fatores Myc podem aumentar o número de locais de infecção ou estimulando o desenvolvimento do sistema radicular o aumentando a densidade de infecção. De fato, o tratamento por fatores Myc resultou em um aumento de 49,1% do comprimento de raiz (figura 15a2) e um aumento de 30,9% da densidade de infecção (figura 15a3).
Em um segundo experimento, plantas inoculadas foram tratadas ou com fatores Myc puros sulfatados ou não sulfatados ou com uma mistura de ambos. Quatro semanas após inoculação, a taxa de colonização foi estimada pelo método de interseção em linha quadriculada. Os resultados estão representados na figura 15b. O tratamento com uma mistura de fatores Myc sulfatados e não sulfatados provocou uma duplicação significante da taxa de colonização da raiz (+ 104,5%), ao passo que fatores Myc puros sulfatados e puros não sulfatados resultaram em aumentos de 42,3% e 75,4%, respecti45/50 vamente.
Conclusões: Fatores Myc estimulam a formação de AM em uma planta não Ieguminosa, também evidenciam que os fatores Myc que foram identificados não autênticos sinais micorrízicos.
Ambos fatores Myc sulfatados e não sulfatados são ativos, porém a mistura de ambos é claramente mais ativa.
O fato de que fatores Myc estimulam de maneira eficiente a formação de AM e o desenvolvimento radicuiar em uma não Ieguminosa abre caminho para aplicações extremamente amplas em horticultura, agricultura e silvicultura.
Exemplo 9: efeito de fatores Myc sobre a germinação de sementes de uma não ieguminosa, tomate
Nos exemplos anteriores, foi mostrado que fatores Myc não são apenas sinais simbióticos que ativam o programa micorrízico da planta, mas também podem atuar como reguladores do crescimento de planta e estimulam o desenvolvimento do sistema radicuiar em um estágio muito precoce do desenvolvimento de mudas. Foi investigada, assim, a possível influência de fatores Myc sobre a germinação de sementes em uma planta não leguminosa. mA variedade de tomate Heinz 1706 foi escolhida porque esta linhagem é bem caracterizada e foi selecionada para o projeto norte-americano de sequenciamento do genoma do tomate. Em adição, microarrays affymetrix estão disponíveis, tornando possíveis os estudos de perfis de expressão genética com esta linhagem de tomate.
Para esses estudos, fatores Myc sintéticos purificados foram usados, ou sulfatados, não sulfatados ou uma mistura de ambos. Fatores Myc foram adicionados a meio ágar de germinação e vertidos sobre placas de Petri. As sementes foram dispostas na superfície de placas ágar e incubadas no escuro a 14°C, 20°C e 28°C. O percentual de germinação foi marcado todo dia.
Os experimentos foram realizados com sementes que foram vernalizadas por armazenamento a 4°C por pelo menos oito semanas. A presença de fatores Myc no meio de germinação, na faixa de 10θ M a 10'1°
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M, resultou em um estímulo muito claro de germinação a 14°C e 20°C (veja figura 16). Cada tipo de fatores Myc, sulfatados ou não sulfatados, foi ativo, porém interessantemente a mistura de ambos tipos foi claramente mais ativa. Nenhum efeito significante de fatores Myc sobre a germinação pode ser detectado na temperatura mais alta, 28°C (dados não mostrados). Esses dados sugerem que esse efeito de estímulo é operante a temperaturas que correspondem à faixa de temperaturas comuns do solo. Foi levantada a hipótese de que plantas e seus simbiontes de fungos AM co-evoluíram não apenas para a formação de micorrizas nas raízes em desenvolvimento, mas também em um estágio muito precoce de suas interações, germinação. Ambos parceiros podem ter a vantagem de unir a eficiência da germinação de sementes e o desenvolvimento precoce de raiz à presença do parceiro fúngico. O estímulo de germinação foi associado a um subsequente melhor desenvolvimento da muda, conforme mostrado na figura 16b.
O fato de que as sementes respondem a fatores Myc mostra que os componentes da planta necessários para percepção (receptores) e transdução de fator Myc estão presentes e funcionais em sementes. Esta descoberta abre o caminho para o tratamento de sementes de culturas com fatores Myc em condições agrícolas. A observação de que fatores Myc são ativos sobre a germinação de sementes em concentrações extremamente baixas (10’1θ M) abre caminho para tecnologia de tratamento de semente a um custo baixo (baixa necessidade de material ativo) e respeitando o meioambiente (uso de concentrações extremamente baixas de compostos naturais).
Conclusões: Ambos fatores Myc sulfatados e não sulfatados estimulam a germinação de sementes de tomate, uma planta não leguminosa, porém a mistura de ambos é claramente mais ativa. Esses dois tipos de fatores Myc são, portanto, não apenas sinais simbióticos, mas também potentes reguladores do crescimento de planta que atuam em leguminosas e não leguminosas.
De um ponto de vista agrícola, esses resultados abrem caminho para importantes aplicações em horticultura, agricultura e silvicultura: trata47/50 mento de sementes por fatores Myc, preferivelmente uma mistura de ambos sulfatados e não sulfatados, pode aumentar o percentual e taxa de germinação e estimular o desenvolvimento de mudas jovens para a maior parte das plantas cultivadas, sendo a maioria capaz de estabelecer esta simbiose endomicorrízina.
BIOGRAFIA
Akiyama K, Matsuzaki K, Hayashi H (2005) Plant sesquiterpenes induce hyphal branching in arbuscular mycorrhizal fungi. Nature, 435: 824827.
Andriakaja A, Boisson-Dernier A, Francês L, Sauviac L, Jauneau A, Barker DG, Carvalho-Niebel F (2007) AP2-ERF transcription factors mediate Nod factor dependent Mt ENOD11 activation in root hairs via a novel cisregulatory motif. Plant Cell, 19:2866-2885.
Ardourel M, Demont N, Debellé F, Maillet F, de Billy F, Promé JC, Dénarié J, Truchet G (1994) Rhizobium meliloti lipooligosaccharide nodulation factors: Different structural requirements for bacterial entry into target root hair cells and induction of plant symbiotic developmental responses. Plant Cell, 6:1357-1374.
Bécard G, Fortin JA (1988) Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation in Ri T-DNA transformed roots. New Phytol., 108:211218.
Benamor B, Shaw S, Oldroyd G, Maillet F, Penmetsa RV, Cook D, Long S, Dénarié J, Gough C (2003). The NFP locus of Medicago truncatula contrais an early step of Nod factor signal transduction upstream of a rapid calcium flux and root hair deformation. Plant J., 34: 495-506.
Besserer A, Puech-Pagès V, Kiefer P, Gomez-Roldan V, Jauneau A, Roy S, Portais JC, Roux C, Bécard G, Séjalon-Delmas N (2006) Strigolactones stimulate arbuscular mycorrhizal fungi by activating mitochondria. PLoS Biol., 4(7):e226.
Catoira R, Galera C, De Billy F, Penmetsa RV, Journet EP, Maillet F, Rosenberg C, Cook D, gough C, Dénarié J (2000) Four genes of Medicago truncatula controlling components of a Nod factor transduction pathway.
48/50
PlantCell, 12: 1647-1666.
Chabot S, Bécard G, Piché Y (1992) The life cycle of Glomus intraradices in root organ culture. Mycologia, 84: 315-321.
Demont N, Debellé F, Aurelle H, Dénarié J, Promé JC (1993) Role of the Rhizobium meliloti nodF and nodE genes in the biosynthesis of lipo-oligosaccharidic nodulation factors. J. Biol. Chem., 268 : 20134-20142.
Dénarié J, Debellé F, Promé JC (1996) Rhizobium lipochitooligosaccharide nodulation factors: signaling molecules mediating recognition and morphogenesis. Annu. Rev. Biochem., 65: 503-535.
D’Haeze W, Holsters M (2002) Nod factor structures, responses, and perception during initiation of nodule development. Glycobiology, 12: 79R-105R.
Doner LW, Bécard G (1991) Solubilization of gellan gels by chelation of cátions. Biotechnol Tech., 1991; 5:25-28.
Giovanetti M, Mosse B (1980) An evaluation of techniques for measuring vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist, 84:489-500.
Grenouillat N, Vauzeilles B, Bono JJ, Samain E, Beau JM. (2004) Simple synthesis of nodulation-factor analogues exhibiting high affinity towards a specific binding protein. Angew Chem Int Ed Engl., 43:4644-4646.
Harrison M (2005) Signaling in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Annu. Rev. Microbiol., 59: 19-42.
Hewitt, E.J (1966) Sand and water culture methods used in the study of plant nutrition. Technical Communication No. 22 (revised 2nd edn). Com. Bur. of Horticul. and Plant Crops East Mailing, Maidstore, Kent, UK.
Journet EP, El-Gachtouli N, Vernoud V, de Billy F, Pichon M, Dedieu A, Arnould C, Morandi D, Barker D, Gianinazzi-Pearson V (2001) Medicago truncatula ENOD11: a novel RPRP-encoding early nodulin gene expressed during mycorrhization in arbuscule-containing cells. Mol. Plant Microbe Internet., 14: 737-748.
Kosuta S, Chabaud M, Lougnon G, Gough C, Dénarié J, Barker DG, Bécard G (2003) A diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi
49/50 induces symbiosis-specific MtENODI1 expression in roots of Medicago truncatula. Plant Physiol., 131: 952-962.
Navazio L, Moscatiello R, Genre A, Novero M, Baldan B, Bonfante P, Mariani P (2007) A diffusible signal from arbuscular mycorrhizal fungi elicits a transient cytosolic calcium elevation in host plant cells. Plant Physiol. 144: 673-681.
Olah B, Brière C, Bécard G, Dénarié J, Gough C (2005) Nod factors and a diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi stimulate lateral root formation in Medicago truncatula via the DM11/DMI2 signalling pathway. Plant J., 44: 195-207.
Ohsten Rasmussen M, Hogg B, Bono JJ, Samain E, Driguez H (2004) New access to lipo-chitooligosaccharide nodulation factors. Org. Biomol. Chem., 2: 1908-1910.
Price NPJ, Relic B, Talmont F, Lewin A, Promé D, Pueppke SG, Maillet F, Dénarié J, Promé JC, Broughton WJ (1992) Broad-host-range Rhizobium species strain NGR234 secretes a family of carbamoylated, and fucosylated, nodulation signals that are O-acetylated or sulphated. Mol. Microbiol., 23: 3575-3584.
R Development Core Team (2009) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Áustria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-proiect.org·
Remy W, Taylor TN, Hass H, Kerp H (1994) Four hundredmillion-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proc. Natl. Acad. Sei. LISA, 91: 11841-43.
Roche P, Debellé F, Maillet F, Lerouge P, Faucher C, Truchet G, Dénarié J, Promé JC (1991a) Molecular basis of symbiotic host specificity in Rhizobium meliloti-. nodH and nodPQ genes encode the sulfation of lipooligosaccharide signals. Ce//, 67: 1131-1143.
Roche P, Lerouge P, Ponthus C, Promé JC (1991b) Structural determination of bacterial nodulation factors involved in the Rhizobium meli/oí/-alfalfa symbiosis. J. Biol. Chem., 266: 10933-10940.
Samain E, Drouillard S, Heyraud A, Driguez H, Gram-scale syn50/50 thesis of recombinant chitooligosaccharides in Escheríchia coli. Carbohydrate Research, 302: 35-42.
Samain E, Chazalet V, Geremia RA (1999), Production of Oacetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escheríchia coli strains harboring different combinations of nod genes. Journal of Biotechnology, 72: 33-47.
Smit P, Raedts J, Portyanko V, Debellé F, Gough C, Bisseling T, Geurts R (2005) NSP1 of the GRAS protein family is essential for rhizobial Nod factor-induced transcription. Science, 308:1789-91.
Smith SE, Read DJ (2008) Mycorrhizal symbiosis. 787 pp., Academic Press.
Stacey G, Libault M, Brechenmacher L, Wan J, May G (2006) Genetics and functional genomics of legume nodulation. Curr. Opin. Plant Biol., 9:110-121.
Spaink HP, Wijfjes AHM, van der Drift KMGM, Haverkamp J,
Thomas-Oates JE, Lugtenberg BJJ (1994) Structural Identification of metabolites produced by the NodB and NodC proteins of Rhizobium leguminosarum. Mol. Microbiol., 13:821 -831.
Spaink HP, Wijfjes AHM, Lugtenberg BJJ (1995) Rhizobium Nodl and NodJ proteins play a role in the efficiency of secretion of lipochitin oligosaccharides. J. Bacteríol., 177: 6276-6281.
Vierheilig H, Coughlan AP, Wyss U, Piché Y (1998) Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl. Environm. Microbiol., 64:5004-5007.
Weidmann S, Sanchez L, Descombin J, Chatagnier O, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V (2004) Fungai elicitation of signal transductionrelated plant genes precedes mycorrhiza establishment and requires the dmi3 gene in Medicago truncatula. Mol. Plant Microbe Interact., 17: 13851393.
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Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. Uso de um lipoquito-oligossacarídeo definido pela fórmula (I) abaixo:caracterizado pelo fato de que é para estimular a micorrização de uma planta, em que, na fórmula (I), n = 2 ou 3, Ri representa uma cadeia de ácido graxo saturada ou monoinsaturada contendo 16 ou 18 átomos de carbono e R2 representa H ou SO3H.
- 2. Uso de um lipoquito-oligossacarídeo de fórmula (I) como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para estimular o desenvolvimento do sistema radicular de uma planta, em que, na fórmula (I), n = 2 ou 3, R1 representa uma cadeia de ácido graxo saturada ou monoinsaturada contendo 16 ou 18 átomos de carbono e R2 representa H ou SO3H.
- 3. Uso de um lipoquito-oligossacarídeo de fórmula (I) como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a germinação de uma semente de planta, em que, na fórmula (I), n = 2 ou 3, R1 representa uma cadeia de ácido graxo saturada ou monoinsaturada contendo 16 ou 18 átomos de carbono e R2 representa H ou SO3H.
- 4. Uso de um lipoquito-oligossacarídeo de fórmula (I) como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é como um aditivo para produção de um inoculante micorrízico arbuscular, em que, na fórmula (I), n = 2 ou 3, R1 representa uma cadeia de ácido graxo saturada ou monoinsaturada contendo 16 ou 18 átomos de carbono e R2 representa H ou SO3H.
- 5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I)12/07/2018, pág. 12/222/2 é selecionado dentre:- um lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I), em que n = 2 ou 3, Ri representa uma cadeia de ácido graxo saturada ou monoinsaturada contendo 16 átomos de carbono e R2 representa H ou SO3H;- um lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I), em que n = 2 ou 3, R1 representa uma cadeia de ácido graxo saturada ou monoinsaturada contendo 18 átomos de carbono, e R2 representa H ou SO3H.
- 6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é usada uma mistura de um lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I), em que R2 representa H, com um lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I), em que R2 representa SO3H.
- 7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é usada uma mistura compreendendo um lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I), em que n=2, R1 representa uma cadeia de ácido graxo monoinsaturada contendo 18 átomos de carbono, e R2 representa H, e um lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I), em que n=3, R1 representa uma cadeia de ácido graxo monoinsaturada contendo 18 átomos de carbono, e R2 representa H.
- 8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I) é usado em uma concentração de 105 a 1012 M.
- 9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito lipoquito-oligossacarídeo da fórmula (I) é usado em uma concentração de IO'7 a 101θ M.
- 12/07/2018, pág. 13/221/16
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| AU2007235408A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-18 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Processes for chemical synthesis of lipochitooligosaccharides |
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| US8999698B2 (en) | 2011-03-31 | 2015-04-07 | Novozymes Biologicals, Inc. | Competitive and effective bacterial strains |
| US8992653B2 (en) | 2011-09-08 | 2015-03-31 | Novozymes Bioag A/S | Seed treatment methods and compositions |
| PL2748123T3 (pl) | 2011-09-14 | 2024-05-13 | Novozymes Bioag A/S | Zastosowanie lipochito-oligosacharydów i/lub chito-oligosacharydów w kombinacji z mikroorganizmami solubilizującymi fosforany do poprawy wzrostu roślin |
| AU2012312009B2 (en) | 2011-09-23 | 2015-11-26 | Novozymes Bioag A/S | Combinations of lipo-chitooligosaccharides and methods for use in enhancing plant growth |
| BR112014006912A2 (pt) | 2011-09-23 | 2017-04-11 | Novozymes Bioag As | método para intensificar o crescimento de plantas de milho |
| WO2013044212A1 (en) | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Novozymes Biologicals Holdings A/S | Chitooligosaccharides and methods for use in enhancing soybean growth |
| BR112014006919B1 (pt) | 2011-09-23 | 2019-05-21 | Novozymes Bioag A/S | Método para intensificar o crescimento e/ou rendimento de plantas |
| CA2859425C (en) | 2011-12-16 | 2020-05-12 | Novozymes Bioag A/S | Bradyrhizobium strains |
| RU2511299C2 (ru) * | 2012-07-02 | 2014-04-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования КАБАРДИНО-БАЛКАРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ В.М.КОКОВА | Способ повышения симбиотической активности бобовых трав |
| FR2994793A1 (fr) | 2012-08-30 | 2014-03-07 | Agronomique Inst Nat Rech | Utilisation d'un recepteur kinase a motifs lysm pour ameliorer la reponse des plantes aux lipochitooligosaccharides. |
| WO2014049546A2 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-03 | Institut National De La Recherche Agronomique | Compositions and methods for enhancing plant growth and development |
| US9365464B2 (en) | 2012-11-16 | 2016-06-14 | Novozymes Bioag A/S | Microbial strains, compositions, and methods for increasing available phosphate for plants |
| EP2950801A1 (en) * | 2013-01-31 | 2015-12-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Synthetic lipochitooligosaccharides for improvement of plant growth and yield |
| US20160007600A1 (en) * | 2013-03-06 | 2016-01-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Synthetic lipochitooligosaccharide analogs for enhancing plant performance |
| WO2014143620A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Synthetic lipoamino acid glucosamine derivatives for improvement of plant growth and yield |
| WO2014160827A1 (en) | 2013-03-28 | 2014-10-02 | Novozymes Bioag A/S | Compositions and methods for enhancing microbial stability |
| UA119331C2 (uk) | 2013-11-08 | 2019-06-10 | Новозімес Біоаґ А/С | Композиції та способи для обробки від шкідників |
| WO2015077278A1 (en) | 2013-11-20 | 2015-05-28 | Novozymes Bioag A/S | Compositions and methods comprising chromobacterium for controlling plant nematode pests and plant insect pests |
| WO2015134691A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Novozymes A/S | Formulations comprising polymeric xyloglucan as a carrier for agriculturally beneficial agents |
| FR3023452B1 (fr) | 2014-07-11 | 2016-07-08 | Prp Holding | Utilisation d'une composition organo-minerale pour augmenter l'assimilation des elements nutritifs du sol par la plante |
| BR112017000877B1 (pt) | 2014-07-23 | 2020-04-07 | Novozymes Bioag As | método para intensificação sinérgica do crescimento de uma planta ou parte de planta |
| US10149472B2 (en) | 2015-06-17 | 2018-12-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chitin oligomers for use in promoting non-leguminous plant growth and development |
| EP3346842A1 (en) | 2015-09-11 | 2018-07-18 | Novozymes BioAG A/S | Stable inoculant compositions and methods for producing same |
| BR112018013111A2 (pt) | 2015-12-28 | 2018-12-11 | Novozymes Bioag A/S | composição inoculante não aquosa, material de propagação de planta revestido, kit, planta, parte de planta, produto processado, cultura, e, método. |
| UA130359C2 (uk) | 2015-12-28 | 2026-02-04 | Новонесіс Плант Біосолушнз А/С | Водна композиція для підвищення стабільності й виживаності мікробних спор у композиціях з інокулянтом |
| EP3462881A1 (en) | 2016-05-31 | 2019-04-10 | Novozymes BioAG A/S | Stable inoculant compositions and methods for producing same |
| BR112018074605A2 (pt) | 2016-05-31 | 2019-03-19 | Novozymes Bioag As | composição inoculante líquida, semente de planta revestida, kit, método, e, uso de um composto |
| CN105993904A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-10-12 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种用于外生菌根合成的幼苗气雾培育装置 |
| BR112019012319A2 (pt) | 2016-12-20 | 2019-11-19 | Novozymes Bioag As | composição inoculante, métodos, material de propagação de planta revestido, e, kit. |
| BR112019013748A2 (pt) | 2017-01-04 | 2020-01-21 | Novozymes Bioag As | cepa de bacillus isolada, cultura de b. megaterium nrrl b-67352 ou b. megaterium nrrl b-67357, composição inoculante, material de propagação de planta revestido, kit, e, métodos para tratar uma semente de planta e para aprimorar o rendimento da plantação. |
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| BR112019019694B1 (pt) | 2017-03-24 | 2024-01-30 | Novozymes Bioag A/S | Composição que compreende quantidades sinergicamente eficazes de yersinia entomophaga, ou um filtrado isento de células da mesma, e um inseticida químico; e método |
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| CN109136243B (zh) * | 2017-06-27 | 2022-07-12 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 改造禾谷类作物识别结瘤因子并增加根瘤菌定殖数目的方法 |
| CN109280670A (zh) * | 2017-07-21 | 2019-01-29 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 调控脂肪酸合成基因并促进豆科植物菌根共生的方法 |
| BR112020004700A2 (pt) | 2017-09-12 | 2020-09-15 | Monsanto Technology Llc | processos para preparação de sementes tratadas |
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| BR112020022581A2 (pt) | 2018-05-07 | 2021-02-09 | Novozymes Bioag A/S | estirpe isolada de microbacterium trichothecenolyticum, cultura biologicamente pura, uso de uma microbacterium trichothecenolyticum, métodos, composição inoculante, composição de semente não ocorrendo naturalmente, consórcio microbiano sintético, e, uso do consórcio microbiano sintético. |
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| BR112022009600A2 (pt) | 2019-11-22 | 2022-08-16 | Novozymes Bioag As | Paenibacillus peoriae fixador de nitrogênio isolado, cultura biologicamente pura de um paenibacillus peoriae fixador de nitrogênio, uso de um ou mais paenibacillus peoriae fixadores de nitrogênio e do consórcio microbiano sintético, método, composição inoculante e de sementes de ocorrência não natural, e, consórcio microbiano sintético |
| JP7307026B2 (ja) * | 2020-04-01 | 2023-07-11 | トヨタ自動車株式会社 | アーバスキュラー菌根菌の共生促進剤及び共生促進方法 |
| CN111411048A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-14 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法 |
| CN113403204B (zh) * | 2021-05-12 | 2022-10-11 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种促进丛枝菌根真菌非共生产孢的方法及其应用 |
| EP4656050A1 (en) | 2024-05-30 | 2025-12-03 | Green Greener S.r.l. | Method for the production of organic plant stimulants |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5549718A (en) | 1990-04-06 | 1996-08-27 | Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) | Substance with lipo-oligosaccharide structure capable of acting as plant-specific symbiotic signals, processes for producing them and their applications |
| US5175149A (en) | 1991-10-04 | 1992-12-29 | The University Of Tennessee Research Corporation | Pentasaccharide phytohormones and methods for their use |
| US5321011A (en) | 1991-10-04 | 1994-06-14 | The University Of Tennessee Research Corporation | Pentasaccharide phytohormones and methods for their use |
| JPH09241112A (ja) * | 1996-03-06 | 1997-09-16 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 菌根菌の感染率を向上させる方法 |
| CA2243669A1 (en) * | 1998-07-21 | 2000-01-21 | Bios Agriculture Inc. | Composition for accelerating plant seed germination, plant growth and methods using same |
| AU2004231284B2 (en) * | 2003-04-22 | 2009-08-06 | Novozymes Biologicals Holding A/S | Use of Lipo-chitooligosaccharides to initiate early flowering and fruit development in plants and related methods and compositions |
| FR2864538B1 (fr) | 2003-12-30 | 2006-03-03 | Bayer Cropscience Sa | Composes synthetiques utiles comme facteurs de nodulation des plantes legumineuses et procedes de preparation de tels composes |
| CN103461385A (zh) | 2007-01-09 | 2013-12-25 | 默克专利股份有限公司 | 用于促进植物生长和提高产量的脂壳寡糖联用组合物 |
| WO2010049751A1 (en) * | 2008-10-29 | 2010-05-06 | Institut National De La Recherche Agronomique | Lipochitooligosaccharides stimulating arbuscular mycorrhizal symbiosis |
-
2008
- 2008-10-29 WO PCT/IB2008/003484 patent/WO2010049751A1/en not_active Ceased
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2009
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