BRPI0919219B1 - Bactéria capaz de produzir ácido lático, e método para produção de ácido lático - Google Patents

Abstract

BACTÉRIA CAPAZ DE PRODUZIR ÁCIDO LÁTICO, E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO. A presente invenção fornece: uma Escherichia coli produtora de ácido lático incluindo uma atividade enzimática de pelo menos uma lactato desidrogenase dependente de NAD e uma atividade enzimática de pelo menos uma lactato oxidorredutase independente de NAD, ambas são aumentadas para decompor um ácido D-lático ou ácido L-lático e produzir o outro ácido D-lático ou ácido L-lático; e um método de produção de ácido lático usando a Escherichia coli produtora de ácido lático.

Description

Campo técnico

A presente invenção relaciona-sé a uma bactéria produtora de ácido lático e um método de produção de ácido lático.

Técnica relacionada

O ácido lático inclui ácido L-lático e ácido D-lático. O ácido L-lático é uma matéria-prima para o ácido polilático industrialmente produzido. O ácido D-lático tem também atraído crescente atenção nos últimos anos como uma matéria-prima para polímeros ou como um intermediário para agroquímicos e medicamentos. Entretanto, o ácido lático como uma matéria-prima é exigido ter alta pureza ótica em quaisquer dos usos descritos acima.

Na natureza, há microrganismos que produzem ácido lático com alta eficiência, e os métodos de produção de ácido lático usando os microrganismos são empregados em alguns casos. Entretanto, os subprodutos, tais como os compostos incluindo ácido acético, etanol, acetoína, e ácido pirúvico são também produzidos com os métodos, que podem conduzir à deterioração na qualidade de ácido lático que é o produto final. Adicionalmente, uma diminuição na pureza ótica devido à incorporação de isômeros óticos pode gerar um problema grave.

A fim de evitar tal diminuição na pureza de ácido lático, um método em que a produção de um subproduto de interesse é especificamente inibida ao interromper um gene específico de um microrganismo ao usar uma técnica de recombinação genética foi desenvolvido nos últimos anos. Em particular, as técnicas de produção de ácido lático com alta pureza ótica estão sob desenvolvimento usando Escherichia coli, levedura, e similares os quais a informação de genoma abundante está disponível e que tem suficientes registros de sucesso como hospedeiros para engenharia genética, ao invés de aplicações aos microrganismos intrinsecamente capazes de produzir o ácido lático com alto rendimento, tal como as bactérias de ácido lático e as bactérias filamentosas.

Por exemplo, Biotechnol Lett, outubro 2006; 28(19): 1527-1535 (documento por Grabar, e col.) descreve que o ácido L-lático com alta pureza ótica pode com sucesso ser produzido ao cultivar uma Escherichia coli em um meio sintético composto de minerais incluindo lmM de betaína, em que a Escherichia coli produz L-lactato desidrogenase derivado de Pedicoccus acidilactici, e na Escherichia coli, um gene de D-lactato desidrogenase (IdhA) , que é um gene envolvido na via metabólica a partir de ácido pirúvico ao ácido D-lático em Escherichia coli, e um gene msgA, que é um gene envolvido na via metabólica a partir de metilglioxal ao ácido D-lático em Escherichia coli, são interrompidos.

De acordo com este documento, foi demonstrado que quando uma Escherichia coli em que um gene msgA não está interrompido é usado na presença de betaína, a pureza ótica que pode ser conseguida mesmo com o interrupção de um gene D-lactato desidrogenase (IdhA) é somente aproximadamente 96% e.e. mesmo na ausência de incorporação de ácido D- lático em uma matéria-prima. Isto é porque o ácido D-lático derivado de metilglioxal é biosintetizado pela Escherichia coli.

Também foi demonstrado que mesmo embora a Escherichia coli descrita no documento tenha um gene D-lactato desidrogenase Dependente de FAD (did) para a decomposição de ácido D-lático, a pureza ótica que pode ser conseguida na presença de betaína é aproximadamente 95% a 96% se o gene msgA não é interrompido. Isto é, foi demonstrado que a expressão do gene did inato de uma Escherichia coli sozinho é incapaz de suficientemente decompor mesmo uma pequena quantidade de ácido D-lático sintetizado pela Escherichia coli, que conduz à inabilidade de conseguir alta pureza ótica. Adicionalmente, também foi demonstrado que a taxa de produção do ácido lático desejado é diminuída a aproximadamente metade em um meio que não contenha betaína, embora o ácido lático com alta pureza ótica de 99% ou mais possa ser produzido de uma matéria-prima não contendo o ácido D-lático.

Baseado no acima, foi demonstrado que é difícil simultaneamente conseguir alta eficiência de produção e alta pureza ótica de ácido L-lático quando o interrupção do gene msgA e a adição de betaína não são conduzidos.

Adicionalmente, o documento relaciona-se à produção de ácido L-lático com a alta pureza ótica conseguida inibindo a produção de ácido D-lático por Escherichia coli e usando um meio que não contenha o ácido D-lático. Entretanto, o documento não descreve nenhum método para aumentar a pureza ótica quando o ácido D-lático é incluído em componentes do meio.

O Pedido de Patente Japonês Aberto (JP-A) N° . 2004- 187643 divulga um método para abaixar a atividade de lactato racemase a fim de conseguir alta pureza ótica. Embora este método seja eficaz quando uma bactéria produtora de ácido lático sintetiza ácido DL-lático, este método não é eficaz quando o meio inclui ácido DL-lático.

Adicionalmente, Biotech. Bioeng., Vol. 73 (l),págs. 80-82 (2001) divulga um método em que uma solução de ácido D-lático é obtida de uma solução de mistura de ácido DL- lático ao usar L-lactato desidrogenase. Entretanto, o experimento descrito neste relatório é realizado em uma escala pequena de 1 ml e em uma baixa concentração de ácido lático de aproximadamente 10 mM. Portanto, este método não pode ser considerado como sendo eficaz para a produção industrial usando as bactérias produtoras de ácido lático, em que a concentração de ácido lático é geralmente 1000 mM ou maior.

De acordo com o panfleto do W02005/033324, o ácido D- lático com alta pureza ótica foi produzido com sucesso de um meio contendo licor de milho, usando uma Escherichia coli a qual o gene did é interrompido. 0 licor de milho inclui ácido DL-lático, e o ácido D-lático com alta pureza ótica foi produzido com sucesso pela Escherichia coli a qual o gene did é interrompido, pois a decomposição de ácido D-lático sob condições microaeróbias é suprimida, e o ácido D-lático é produzido enquanto o ácido L-lático é decomposto. Este documento demonstra que a aeração afeta a taxa de metabolismo de açúcares, a taxa de decomposição de isômero óticos, e a taxa de produção de impurezas, e que a aeração excessiva diminui a taxa de produção de ácido lático devido a uma diminuição na taxa de metabolismo de açúcares. Portanto, também foi demonstrado que, quando a produção de ácido lático é desejada, há um limite superior da taxa de aeração, e uma taxa de aeração ótima precisa ser determinada. Isto é, a quantidade de oxigênio que pode ser fornecida para a decomposição de ácido L-lático, que é uma reação metabólica aeróbia, deve ser uma quantidade que não diminui a taxa de produção de ácido D-lático.

Uma taxa de produção de ácido lático mais elevada é industrialmente preferível. Um isômero ótico que causa uma diminuição na pureza ótica é preferivelmente decomposto mais rápido possível. As enzimas que decompõem o ácido L- lático ou o ácido D-lático em ácido pirúvico convertem o ácido lático em ácido pirúvico usando uma coenzima, tal como mononucleotídeo de flavina (FMN) ou flavina adenina dinucleotídeo (FAD) ou ao diretamente usar oxigênio. Mesmo no caso de enzimas usando uma coenzima, a respiração, isto é, utilização de oxigênio, é eficiente para a regeneração da coenzima. Consequentemente, a atividade enzimática de cada enzima é limitada pela quantidade de oxigênio que pode ser fornecida.

Quando a quantidade de oxigênio fornecida é aumentada, embora um ácido lático que causa uma diminuição na pureza ótica seja rapidamente decomposto, a taxa de metabolismo de açúcares diminui, e a taxa de produção de ácido lático desejado diminui agudamente. Por estas razões, foi extremamente difícil aumentar a taxa de decomposição de um ácido lático derivado das matérias-primas extracelulares independentemente de uma quantidade de oxigênio, e desse modo aumentar a pureza ótica de um ácido lático desejado dentro de um período de tempo mais curto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema técnico

Portanto, é um objeto de presente invenção fornecer uma Escherichia coli produtora de ácido lático e um método de produção de ácido lático, com o qual o ácido lático com alta pureza ótica é produzido dentro de um período de tempo mais curto.

Solução técnica

A presente invenção inclui o seguinte. [1] Uma Escherichia coli produtora de ácido lático compreendendo uma atividade enzimática de pelo menos uma lactato desidrogenase dependente de NAD e uma atividade enzimática de pelo menos uma lactato oxidorredutase independente de NAD, ambas as quais são aumentadas para decompor um ácido D-lático ou ácido L-lático e para produzir outro ácido D-lático ou ácido L-lático. [2] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [1] , em que o aumento da atividade de lactato desidrogenase dependente de NAD causa a produção de um ácido D-lático ou ácido L-lático a partir de de ácido pirúvico, e o aumento da atividade de lactato oxidorredutase independente de NAD causa a decomposição do outro ácido D-lático ou ácido L-lático como um substrato. [3] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [1] ou [2] , em que o aumento da atividade de lactato desidrogenase dependente de NAD é o aumento da atividade de LdhA, e fornece a capacidade de produzir o ácido D-lático. [4] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [3] , em que o aumento da atividade de lactato oxidorredutase independente de NAD é o aumento da atividade de LldD, aumento da atividade de L-lactato oxidase, inativação ou atenuação de LldR, ou uma combinação de urn ou mais dos mesmos, e fornece a capacidade de produzir ácido D-lático. [5] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [4] , em que a L-lactato oxidase é pelo menos uma de Lox ou LctO. [6] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [4] ou [5] , em que o aumento da atividade de lactato oxidorredutase independente de NAD é por um gene lldD mutado tendo uma mutação silenciosa na posição 33 em ORF de um gene codificando LldD. [7] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [6], em que o lldD mutado é representado por uma sequência base de Id. de Seq. N°.: 41. [8] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com qualquer um de [3] a [7] , em que pelo menos uma selecionada do grupo consistindo de atividade de Did e atividade de Pfl é inativada ou atenuada. [9] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [1] ou [2] , em que o aumento da atividade de lactato desidrogenase dependente de NAD é o aumento de atividade de L-lactato desidrogenase dependente de NAD, e fornece a capacidade de produzir o ácido L-lático. [10] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [9] , em que o aumento da atividade de lactato oxidorredutase independente de NAD é o aumento da atividade de Did, e fornece a capacidade de produzir ácido L-lático. [11] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [9] ou [10], em que a L-lactato desidrogenase é derivada de uma bactéria do gênero Bifidobacterium. [12] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com [10] ou [11], em que o Did compreende um domínio Lact deh memb. [13] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com qualquer um de [10] a [12] , em que o Did é derivado de pelo menos um selecionado do grupo consistindo de Escherichia coli, Consistindo e Corynebacterium. [14] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com qualquer um de [9] a [13], em que pelo menos uma atividade de LdhA, atividade de LldD ou atividade de Pfl é inativada ou atenuada. [15] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com qualquer de [1] a [14] , em que pelo menos uma selecionada do grupo consistindo de atividade de Mdh e atividade de AspA é inativada ou atenuada. [16] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com qualquer de [1] a [15] , em que pelo menos um selecionado do grupo consistindo de genes não PTS de sacarose e FruK é aumentado. [17] A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com qualquer um de [1] a [16], em que a atividade de FruR é inativada ou atenuada. [18] Um método de produção de ácido lático, o método compreendendo: produzindo o ácido lático ao usar a Escherichia coli produtora de ácido lático de qualquer um de [1] a [17] . [19] Um método de produção de ácido D-lático, o método compreendendo: produzir o ácido D-lático ao usar a Escherichia coli produtora de ácido lático de qualquer um de [3] a [8]. [20] Um método de produção de ácido L-lático, o método compreendendo: produzir o ácido L-lático usando a Escherichia coli produtora de ácido lático de qualquer um de [9] a [14].

MODALIDADES PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

A Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com a invenção é uma Escherichia coli produtora de ácido lático compreendendo uma atividade enzimática de pelo menos uma lactato desidrogenase dependente de NAD e uma atividade enzimática de pelo menos uma lactato oxidorredutase independente de NAD, ambas as quais são aumentadas para decompor um ácido D-lático ou ácido L-lático e produzir outro ácido D-lático ou ácido L-lático.

A Escherichia coli de acordo com a invenção tem uma atividade enzimática aumentada de pelo menos uma lactato desidrogenase dependente de NAD e uma atividade enzimática aumentada de pelo menos uma lactato oxidorredutase independente de NAD em um sistema de metabolismo de ácido lático, e é capaz de decompor um ácido D-lático ou ácido L- lático a fim de produzir outro ácido D-lático ou ácido L- lático. Portanto, com a Escherichia coli de acordo com a invenção, a produção de um ácido D-lático ou ácido L-lático e a rápida decomposição de um isômero ótico diminuindo a pureza ótica podem prosseguir simultaneamente.

Como resultado, é possível fornecer uma Escherichia coli produtora de ácido lático e um método de produção de ácido lático, com o qual o ácido lático com alta pureza ótica é produzido dentro de um período de tempo mais curto. [21] "aumento" de uma atividade enzimática na invenção engloba, além da introdução de um gene codificando a enzima de interesse em uma bactéria hospedeira da parte externa da bactéria ao interior da bactéria, aumento da atividade enzimática que resulta do aumento da atividade de promotor para o gene de enzima que a bactéria hospedeira possui em seu genoma, expressão forte do gene de enzima pela substituição com outro promotor, ou atenuação ou inativação de uma atividade de repressor contra o gene de enzima.

A "atenuação" de uma atividade enzimática na invenção se refere a um estado em que a atividade da enzima de interesse é significativamente diminuída pela recombinação genética de um gene codificando a enzima de interesse, em comparação a um estado antes do tratamento de recombinação ser conduzido.

A "inativação" de uma atividade enzimática na invenção se refere a um estado em que a atividade da enzima de interesse medida está abaixo do limite de deteção apesar do sistema de medida entre os sistemas de medida existentes.

Adicionalmente, o "hospedeiro" na invenção significa uma Escherichia coli que se torna Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com a invenção como resultado da introdução de um ou mais genes fora da célula bacteriana.

Cada faixa numérica descrita no presente relatório descritivo representa uma faixa incluindo os valores indicados como o valor mínimo e o valor máximo, respectivamente. A invenção é descrita em detalhe abaixo.

A fim de produzir um ácido D-lático ou ácido L-lático, uma atividade enzimática de pelo menos uma lactato desidrogenase dependente de NAD e uma atividade enzimática de pelo menos uma lactato oxidorredutase independente de NAD são aumentadas na Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com a invenção, tal que o outro ácido D- lático ou ácido L-lático é decomposto em um ácido D-lático ou ácido L-lático. Especificamente, é preferível que o aumento da atividade de lactato desidrogenase dependente de NAD causa a produção de um ácido D-lático ou ácido L-lático a partir de ácido pirúvico, e que a lactato oxidorredutase independente de NAD decompõe o outro ácido D-lático ou ácido L-lático como um substrato. Como resultado, a produção de ácido D-lático ou ácido L-lático do ácido pirúvico é assegurada, e a decomposição do outro ácido D- lático ou ácido L-lático é promovida, e portanto, o ácido lático com alta pureza ótica é mais especificamente obtido com alta eficiência.

A "lactato desidrogenase dependente de NAD" se refere a uma lactato desidrogenase a qual a coenzima é NAD e que é classificada pelo número de enzima 1.1.1.27 ou número de enzima 1.1.1.28 de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.). No sistema de metabolismo de ácido lático, esta enzima realiza uma reação de oxirredução entre o ácido L-lático ou o ácido D-lático e ácido pirúvico usando NAD como uma coenzima. Esta enzima tem uma função de realizar uma reação de oxirredução de acordo com a quantidade do substrato, a quantidade de NAD, e similares. O aumento da atividade de uma lactato desidrogenase dependente de NAD que produz ácido D-lático ou ácido L-lático a partir de ácido pirúvico é preferível do ponto de vista de produção do ácido lático com alta pureza ótica.

Como o gene capaz de introduzir uma atividade enzimática de lactato desidrogenase dependente de NAD em uma bactéria hospedeira, um DNA tendo a sequência base de um gene que codifica uma lactato desidrogenase dependente de NAD e que é obtido de um organismo possuindo esta enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene, pode ser usado. Os exemplos preferíveis incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, bactérias pertencendo ao gênero Pseudomonas, bactérias pertencendo ao gênero Aerobacter, bactérias pertencendo ao gênero Clostridium, e bactérias pertencendo ao gênero Bifidobacterium, particularmente aquelas derivadas das bactérias pertencendo ao gênero Escherichia e bactérias pertencendo ao gênero Bifidobacterium. Os exemplos incluem um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa MG1655 de Escherichia coli e um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma Bifidobacterium longum.

A "lactato oxidorredutase independente de NAD" na invenção refere-se a uma lactato desidrogenase da qual a coenzima é um fator diferente de NAD, ou uma lactato oxidase que oxida o ácido lático diretamente usando oxigênio. Esta enzima é uma enzima que realiza uma reação de oxirredução entre o ácido L-lático ou ácido D-lático e ácido pirúvico em um sistema de metabolismo de ácido lático, usando FAD, FMN, ou similares como uma coenzima, ou diretamente usando oxigênio. Esta enzima tem uma função de realizar uma reação de oxirredução de acordo com a quantidade de substrato, a quantidade de uma coenzima, e similares. Na invenção, esta enzima é preferivelmente uma enzima que aumenta uma função capaz de decompor um ácido D- lático ou ácido L-lático como um substrato em ácido pirúvico.

Como o gene capaz de introduzir atividade enzimática de lactato oxidorredutase independente de NAD em uma bactéria hospedeira, um DNA tendo a sequência base de um gene que codifica a lactato oxidorredutase independente de NAD e que é obtido de um organismo possuindo esta enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene, pode ser usado. Os exemplos preferíveis dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, as bactérias pertencendo ao gênero Pseudomonas, as bactérias pertencendo ao gênero Aerobacter, as bactérias pertencendo ao gênero Clostridium, as bactérias pertencendo ao gênero Enterococcus, as bactérias pertencendo ao gênero Streptococcus, as bactérias pertencendo ao gênero Pediococcus, as bactérias pertencendo ao gênero Lactococcus, as bactérias pertencendo ao gênero Aerococcus, as bactérias pertencendo ao gênero Corynebacterium, e as bactérias pertencendo ao gênero Zymomonas, particularmente aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, as bactérias pertencendo ao gênero Enterococcus, as bactérias pertencendo ao gênero Corynebacterium, e as bactérias pertencendo ao gênero Zymomonas. Os exemplos dos mesmos incluem um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa MG1655 de Escherichia coli, um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Enterococcus sp. ATCC9625, um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Corynebacterium glutamicum NBRC12168, e um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Zymomonas mobilis ATCC31821.

Quando uma lactato oxidorredutase independente de NAD e uma lactato desidrogenase dependente de NAD são usadas em combinação e a atividade de cada uma das enzimas é aumentada, um dos isômeros óticos é produzido enquanto outro dos isômeros óticos, que diminui a pureza ótica, é decomposto, em que o ácido lático pode ser produzido rapidamente com alta pureza ótica.

Na Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com a invenção, os genes a serem aumentados podem ser quaisquer genes que contribuem ao aumento das atividades enzimáticas respectivas descritas acima. 0 aumento com os genes descritos abaixo é preferível dos pontos de vista da pureza ótica e eficiência de produção de ácido D-lático ou ácido L-lático.

Uma bactéria produtora de ácido D-lático que produz o ácido D-lático e uma bactéria produtora de ácido L-lático que produz o ácido L-lático são separadamente descritas abaixo.

<Bactéria produtora de ácido D-lático

Na bactéria produtora de ácido D-lático de acordo com a invenção, a atividade de LdhA é preferivelmente aumentada como o aumento da atividade de uma lactato desidrogenase dependente de NAD.

A D-lactato desidrogenase (LdhA) que é usada como a lactato desidrogenase dependente de NAD na invenção e a qual a atividade deve ser aumentada se refere a uma enzima que produz o ácido D-lático e NAD a partir de ácido pirúvico e NADH. Ambas de uma enzima LdhA que produz o ácido L-lático e uma enzima LdhA que produz o ácido D- lático são conhecidos em geral. Entretanto, na invenção, somente uma enzima LdhA que produz o ácido D-lático é denotada como o "LdhA", a fim de evitar confusão na invenção.

O gene de IdhA pode ser um DNA tendo a sequência base do gene que é obtido de um organismo tendo uma atividade desta enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene.

Os exemplos preferíveis do gene de IdhA incluem aqueles derivados das bactérias descritas na explanação acima da lactato desidrogenase dependente de NAD, e especificamente os exemplos incluem um gene adquirido por Bunch, e col. (Microbiology 1,43 (Pt 1), págs. 187-195 (1997)), ou um gene tendo a sequência contida no fragmento de DNA descrito abaixo que é amplificado por PCR usando o DNA genômico de Escherichia coli como um molde e usando a Id. de Seq. N°.: 19 e Id. de Seq. N°.: 20.

Um método incluindo integrar um gene codificando LdhA em um plasmídeo de expressão para ser ligado a um promotor de gene que controla a expressão de uma proteína envolvida em um sistema glicolítico, em um sistema de biossíntese de ácido nucléico, ou em um sistema de biossíntese de aminoácido, e introduzir o plasmídeo de expressão em uma bactéria desejada, é uma medida eficaz para aumentar a atividade de LdhA na invenção. Neste caso, o promotor de gene que controla a expressão de uma proteína envolvida no sistema glicolítico, no sistema de biossíntese de ácido nucléico, ou no sistema de biossíntese de aminoácido refere-se a um forte promotor que constantemente funciona em uma bactéria, preferivelmente em Escherichia coli, e que é menos suscetível à supressão de expressão mesmo na presença de glicose. Os exemplos específicos dos mesmos incluem um promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e um promotor de serina hidróximetiltransferase. Quando a Escherichia coli assim obtida é usada na produção de ácido D-lático sob condições aeróbias, a quantidade de acumulação de ácido D-lático é aumentada, e a pureza ótica de ácido D-lático pode ser aumentada, comparado a um caso em que a expressão de IdhA não é aumentada.

Na bactéria produtora de ácido D-lático de acordo com a invenção, o aumento da atividade da lactato oxidorredutase independente de NAD é preferivelmente o aumento da atividade de LldD, aumento da atividade de L- lactato oxidase, inativação ou atenuação de LldR, ou uma combinação de uma ou mais das mesmas.

Portanto, o ácido L-lático pode ser eficientemente decomposto em ácido pirúvico, e a pureza ótica pode ser rapidamente aumentada ao produzir o ácido D-lático.

A L-lactato desidrogenase independente de NAD (LldD) que é usada como a lactato oxidorredutase independente de NAD na invenção e a qual a atividade deve ser aumentada como referido a uma enzima que é classificada pelo número de enzima 1.1.2.3 de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.), e que produz ácido pirúvico e FMNH a partir de ácido L-lático e FMN. O gene de lldD pode ser um DNA tendo a sequência base do gene que é obtido de um organismo tendo a atividade desta enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene.

Os exemplos preferíveis dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, bactérias pertencendo ao gênero Pseudomonas, bactérias pertencendo ao gênero Shigella, bactérias pertencendo ao gênero Citrobacter, e bactérias pertencendo ao gênero Salmonella, particularmente aquelas derivadas das bactérias pertencendo ao gênero Escherichia. Os exemplos dos mesmos incluem um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa MG1655 de Escherichia coli.

Do ponto de vista de conseguir uma decomposição mais rápida de ácido L-lático, o LldD é preferivelmente um LldD expresso por um gene de lldD mutante tendo uma mutação silenciosa na posição 33 da sequência de codificação do ORF do gene de lldD, e é mais preferivelmente um lldD mutante (lldD mutante C33T) (Id. de Seq. N°.: 41) o qual a base na posição 33 foi mudada de C ao T. Uma variante de Escherichia coli de alta atividade pode ser facilmente obtida ao introduzir o gene de lldD mutante C33T em uma Escherichia coli por uma técnica genética de recombinação conhecida. O uso desta variante de alta atividade permite a decomposição de ácido L-lático em taxas mais elevadas e a melhoria na pureza ótica de ácido D-lático.

A L-lactato oxidase que é usada como a lactato desidrogenase independente de NAD e a qual a atividade deve ser aumentada se refere a uma enzima que é classificada como a enzima número 1.13.12., de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.), e que produz ácido pirúvico e peróxido de hidrogênio na presença de ácido L-lático e oxigênio. Aqui, lox ou IctO, que é um gene para esta enzima, pode ser um DNA tendo a sequência base do gene que é obtido a partir de um organismo tendo a atividade desta enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene.

Os exemplos preferíveis dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Enterococcus, bactérias pertencendo ao gênero Streptococcus, bactérias pertencendo ao gênero Pediococcus, bactérias pertencendo ao gênero Lactococcus, e bactérias pertencendo ao gênero Aerococcus. Entre elas, aquelas isoladas de Enterococcus sp. ATCC9625 e Lactococcus lactis ATCC 19435 são particularmente preferíveis.

Um método incluindo integrar uma codificação de gene LldD ou L-lactato oxidase em um plasmídeo de expressão para para ser ligado a um promotor de gene que controla a expressão de uma proteína envolvida em um sistema glicolítico, um sistema de biossíntese de ácido nucleico, ou um sistema de biossíntese de aminoácido, e introduzir o vetor de expressão em uma Escherichia coli desejada, é uma medida eficaz para aumentar a atividade de LldD ou L- lactato oxidase na invenção. Neste caso, o promotor de gene que controla a expressão de uma proteína envolvida no sistema glicolítico, sistema de biossíntese de ácido nucleico, ou sistema de biossíntese de aminoácido refere-se a um promotor forte que constantemente funciona em uma bactéria, preferivelmente em Escherichia coli, e que é menos suscetível à supressão de expressão mesmo na presença de glicose. Os exemplos específicos dos mesmos incluem um promotor de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase e um promotor de serina hidróximetiltransferase. Quando a Escherichia coli assim obtida é usada na produção de ácido D-lático sob condições aeróbias, a quantidade de acumulação de ácido D-lático é aumentada, e a pureza ótica de ácido D- lático pode ser aumentada, em comparação a um caso em que a expressão de LldD ou L-lactato oxidase não é aumentada.

Cada LldD e L-lactato oxidase pode ter uma sequência conhecida do mesmo sem nenhuma modificação, ou pode alternativamente ser um mutante que não deteriora sua atividade enzimática. Os exemplos da mutação incluem adição, deleção, conversão, ou similares de aminoácido(s). 0 mutante que não deteriora a atividade enzimática pode ser obtido de acordo com um método conhecido na técnica. LldR que deve ser inativado ou atenuado a fim de aumentar a atividade da lactato desidrogenase independente de NAD é um fator de controle que inibe a transcrição da L- lactato desidrogenase (LldD). A atenuação ou inativação da atividade de LldR previne que a atividade de LldD seja inibida, ou eficazmente aumenta a atividade de LldD.

Na bactéria produtora de ácido D-lático de acordo com a invenção, é preferível que pelo menos uma selecionada do grupo consistindo de atividade de Did e atividade de Pfl seja inativada ou atenuada.

A "D-lactato desidrogenase dependente de FAD (Did)" na invenção é um nome genérico para enzimas que catalisam uma reação de geração de ácido pirúvico a partir de ácido D- lático na presença de flavina adenina dinucleotídeo oxidada servindo como uma coenzima. A decomposição de ácido D- lático, que é um produto, pode ser inibida ao inativar ou atenuar a atividade de Did.

A piruvato formato liase (Pfl) na invenção é uma enzima classificada com o número de enzima 2.3.1.54 de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.), e é também chamado "formato acetil transferase". A "piruvato formato liase (Pfl)" é um nome genérico para as enzimas que reversivelmente catalisam uma reação de geração do ácido formic a partir de ácido pirúvico. A decomposição de ácido pirúvico, que é uma matéria-prima para a produção de ácido D-lático, pode ser inibida ao inativar ou atenuar a atividade de Pfl.

Um exemplo de um microrganismo em que a atividade de LdhA é aumentada enquanto a atividade de Did ou atividade de Pfl ou ambas são inativadas ou atenuadas na invenção é uma cepa de Escherichia coli MT-10994 (FERM BP-10058) descrita no W02005/033324.

Em adição ao acima, é preferível que pelo menos uma selecionada do grupo consistindo de atividade de Mdh e atividade de AspA na bactéria produtora de ácido D-lático de acordo com a invenção seja inativada ou atenuada, do ponto de vista de suprimir a quantidade de subprodutos produzidos.

A malato desidrogenase (Mdh) na invenção é classificada com o número de enzima 1.1.1.37 de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.), e é um nome genérico para as enzimas que reversivelmente catalisam uma reação de geração do ácido oxaloacético a partir de ácido málico na presença de nicotinamida-adenina dinucleotídeo oxidada servindo como uma coenzima. Portanto, a produção de ácido succínico como um subproduto pode ser inibida ao inativar ou atenuar a atividade de Mdh.

A aspartato amónia liase (AspA) na invenção é uma enzima classificada com o número de enzima 4.3.1.1 de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.), e é chamada "aspartase". A "aspartato amónia liase (AspA)" é um nome genérico para as enzimas que reversivelmente catalisam uma reação de geração do ácido fumárico a partir de ácido L- aspartico. Portanto, a produção de ácido fumárico como um subproduto pode ser inibida ao inativar ou atenuar a atividade de AspA.

A bactéria produtora de ácido D-lático de acordo com a invenção pode produzir o ácido D-lático usando um açúcar, tal como glicose como uma matéria-prima. Na bactéria produtora de ácido D-lático de acordo com a invenção, pelo menos uma selecionada do grupo consistindo de um grupo de gene não PTS de sacarose e FruK pode ser aumentada a fim de permitir a produção de ácido D-lático usando outro açúcar como uma matéria-prima, e é preferível que ambos grupo de gene não PTS de sacarose e FruK sejam aumentados, e é mais preferivelmente que somente cscA entre do grupo de gene não PTS de sacarose e FruK ambos sejam aumentados.

O "grupo de gene não PTS sacarose" na invenção se refere a um grupo de gene envolvido no sistema não PTS das vias de assimilação de sacarose de um microrganismo. Especificamente, é um grupo de gene consistindo de uma proteína repressora (cscR), uma hidrolase de sacarose (cscA), uma frutoquinase (cscK), e uma permease de sacarose (cscB). Quando um gene do grupo de gene não PTS de sacarose é selecionado na invenção, um gene, ou dois ou mais genes do grupo de gene não PTS de sacarose pode ser selecionado, e exemplos dos mesmos incluem o cscA sozinho, uma combinação de cscA e cscK, uma combinação de cscA e cscB, uma combinação de cscA e cscR, uma combinação de cscA, cscB, e cscR, e uma combinação de cscA, cscK, e cscR. Entre eles, é preferível selecionar o cscA sozinho do ponto de vista de mais eficientemente produzir ácido lático. Em uma modalidade específica da invenção, é preferível selecionar "um gene, ou dois ou mais genes, do grupo de gene não PTS de sacarose" diferente de uma combinação de proteína repressora (cscR), sacarose hidrolase (cscA), frutoquinase (cscK) e sacarose permease (cscB) e uma combinação de sacarose hidrolase (cscA), frutoquinase (cscK) e sacarose permease (cscB) .

A sacarose hidrolase (invertase, CscA) na invenção é um termo genérico para as enzimas que são classificadas com o número de enzima 3.2.1.26 de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.), e que catalisa uma reação de geração da D-glicose e D-frutose a partir de sacarose.

Esta enzima é uma enzima que uma Escherichia coli, tal como a cepa K12 não possui naturalmente, e esta enzima é uma das enzimas da via de metabolismo não PTS incluindo um co-transportador de próton, uma invertase, uma frutoquinase, e um repressor específico de sacarose (veja Canadian Journal of Microbiology, (1991) Vol. 45, págs. 418-422). Na invenção, como um resultado do fornecimento de cscA sozinho, a sacarose fora da célula bacteriana é decomposta em glicose e frutose no periplasma e liberada fora da célula, e são fosforiladas e incorporadas no citoplasma através de urn PTS glicose e urn PTS frutose. Como resultado, a frutose pode ser fornecida a um sistema de metabolismo de frutose da bactéria, e pode ser assimilada usando um sistema glicolítico.

Como o gene da sacarose hidrolase (invertase, CscA) a ser introduzida na bactéria hospedeira de acordo com a invenção, um DNA tendo a sequência base de um gene que codifica uma sacarose hidrolase (invertase, CscA) e que é obtido de um organismo tendo a enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene, pode ser usada. Os exemplos preferíveis dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Erwinia, bactérias pertencendo ao gênero Proteus, bactérias pertencendo ao gênero Vibrio, bactérias pertencendo ao gênero Agrobacterium, bactérias pertencendo ao gênero Rhizobium, bactérias pertencendo ao gênero Staphylococcus, bactérias pertencendo ao gênero Bifidobacterium, e bactérias pertencendo ao gênero Escherichia. Os exemplos dos mesmos incluem um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Escherichia coli 0157. Um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Escherichia coli 0157 é particularmente preferível. Adicionalmente, é preferível que uma sequência de sinal para transferir o CscA ao periplasma da célula bacteriana seja adicionada ao CscA.

Como o gene da proteína repressora (CscR) a ser introduzido na bactéria hospedeira de acordo com a invenção, um DNA tendo a sequência base de um gene que codifica uma proteína repressora (CscR) e que é obtido de um organismo tendo a enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene, pode ser usado. Os exemplos preferíveis dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Erwinia, bactérias pertencendo ao gênero Proteus, bactérias pertencendo ao gênero Vibrio, bactérias pertencendo ao gênero Agrobacterium, bactérias pertencendo ao gênero Rhizobium, bactérias pertencendo ao gênero Staphylococcus, bactérias pertencendo ao gênero Bifidobacterium, e bactérias pertencendo ao gênero Escherichia. Os exemplos dos mesmos incluem um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Escherichia coli 0157. Um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Escherichia coli 0157 é particularmente preferível.

Como o gene da frutoquinase (CscK) a ser introduzido na bactéria hospedeira de acordo com a invenção, um DNA tendo a sequência base de um gene que codifica uma frutoquinase (CscK) e que é obtido de um organismo tendo a enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida de gene, pode ser usado. Os exemplos preferíveis dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Erwinia, bactérias pertencendo ao gênero Proteus, bactérias pertencendo ao gênero Vibrio, bactérias pertencendo ao gênero Agrobacterium, bactérias pertencendo ao gênero Rhizobium, bactérias pertencendo ao gênero Staphylococcus, bactérias pertencendo ao gênero Bifidobacterium, e bactérias pertencendo ao gênero Escherichia. Os exemplos dos mesmos incluem um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Escherichia coli 0157. Um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Escherichia coli 0157 é particularmente preferível.

Como o gene da sacarose permease (CscB) a ser introduzido na bactéria hospedeira de acordo com a invenção, um DNA tendo a sequência base de um gene que codifica uma sacarose permease (CscB) e que é obtido de um organismo tendo a enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene, pode ser usado. 0s exemplos preferíveis dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Erwinia, bactérias pertencendo ao gênero Proteus, bactérias pertencendo ao gênero Vibrio, bactérias pertencendo ao gênero Agrobacterium, bactérias pertencendo ao gênero Rhizobium, bactérias pertencendo ao gênero Staphylococcus, bactérias pertencendo ao gênero Bifidobacterium, e bactérias pertencendo ao gênero Escherichia. Os exemplos dos mesmos incluem um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Escherichia coli 0157. Um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa de Escherichia coli 0157 é particularmente preferível.

A frutose-l-fosfato quinase (FruK) na invenção é uma enzima classificada com o número de enzima 2.7.1.56 de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.), e é também referida como "fosfofrutoquinase 1". A captação de frutose pelas bactérias, tais como Escherichia coli, é geralmente suprimida na presença de glicose. Previamente, não houve nenhuma descoberta que a expressão aumentada de FruK promove a captação de frutose mesmo na presença de glicose, e contribui para melhoria na eficiência de produção de ácido D-lático em uma bactéria produtora de ácido D-lático. Adicionalmente, é inesperado que a eficiência de produção de ácido lático seja aumentada pelo aumento de expressão de fruK sozinho em uma série de sistemas de metabolismo de frutose, subsequente à captação de frutose gerada a partir de sacarose pelo CscA na célula e metabolismo da mesma em frutose-1-fosfato.

Como o gene da frutose-l-fosfato quinase (FruK) a ser introduzida em uma Escherichia coli hospedeira de acordo com a invenção, um DNA tendo a sequência base de um gene que codifica a frutose-l-fosfato quinase (FruK) e que é obtida a partir de um organismo possuindo esta enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene, pode ser usado. Os exemplos preferíveis dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, bactérias pertencendo ao gênero Pseudomonas, bactérias pertencendo ao gênero Aerobacter, e bactérias pertencendo ao gênero Clostridium, particularmente bactérias pertencendo ao gênero Escherichia. Os exemplos dos mesmos incluem um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa MG1655 de Escherichia coli. Um DNA tendo a sequência base de um gene derivado de uma cepa MG1655 de Escherichia coli é particularmente preferível.

Na invenção, é mais preferivelmente que cada uma de sacarose hidrolase (CscA) e frutose fosfato quinase seja obtida pela introdução de um gene codificando a proteína correspondente derivada de Escherichia coli 0157 ou Escherichia coli MG1655. O uso de genes derivados de tais bactérias assegura a expressão de funções.

Na bactéria produtora de ácido D-lático de acordo com a invenção, a atividade de FruR é preferivelmente inativada ou atenuada do ponto de vista da capacidade de promover a captação de frutose.

O gene de FruR o qual a atividade deve ser atenuada na invenção não é limitado contanto que o gene seja um gene inato da bactéria hospedeira, e pode ser um DNA tendo a sequência base do gene inato da bactéria hospedeira que codifica FruR, ou uma sequência de DNA sintético introduzida baseada em uma sequência base conhecida de gene.

O ácido D-lático pode ser rapidamente produzido com alta pureza ótica ao usar a bactéria produtora de ácido D- lático no método de produção descrito abaixo.

<Bactéria produtora de ácido L-lático

Na bactéria produtora de ácido L-lático de acordo com a invenção, a atividade de L-lactato desidrogenase dependente de NAD é preferivelmente aumentada como o aumento de uma atividade de lactato desidrogenase dependente de NAD.

A L-lactato desidrogenase que é usada como a lactato desidrogenase dependente de NAD na invenção e a qual a atividade deve ser aumentada se refere a uma enzima que produz o ácido L-lático e NAD a partir de ácido pirúvico e NADH. O gene da L-lactato desidrogenase dependente de NAD pode ser um DNA tendo a sequência base de um gene que é obtido de um organismo tendo a atividade desta enzima, ou uma sequência de DNA sintético sintetizada baseada em uma sequência base conhecida do gene.

Um gene de L-lactato desidrogenase dependente de NAD preferível não é particularmente limitado contanto que o gene seja capaz de expressar em Escherichia coli e codifique uma L-lactato desidrogenase dependente de NAD capaz de produzir o ácido L-lático. Os exemplos preferíveis dos mesmos incluem L-lactato desidrogenases dependentes de NAD derivadas do gênero Bifidobacterium, gênero Enterobacter, gênero Lactococcus, e gênero Lactobacillus. 0 gene de L-lactato desidrogenase dependente de NAD é preferivelmente L-lactato desidrogenase dependente de NAD (Ldh2) derivado de Bifidobacterium longum, particularmente do ponto de vista da eficiência de produção de ácido lático.

Um exemplo da medida para aumentar a atividade de L- lactato desidrogenase dependente de NAD é uso do promotor descrito em conexão com IdhA na Escherichia coli produtora de ácido D-lático, a qual a explanação acima é diretamente aplicável. Quando a bactéria com a atividade de L-lactato desidrogenase aumentada é usada na produção de ácido L- lático sob condições aerõbias, a quantidade de acumulação de ácido L-lático é aumentada, e a pureza ótica de ácido L- lático pode ser aumentada, comparada a um caso em que a expressão de L-lactato desidrogenase não é aumentada.

É preferível que a atividade de Did como a lactato oxidorredutase independente de NAD na bactéria produtora de ácido L-lático de acordo com a invenção seja aumentada, do ponto de vista de aumentar a pureza ótica.

A D-lactato desidrogenase dependente de FAD (Did) na invenção é classificada com o número de enzima 1.1.2.4 de acordo com o relatório do comitê de enzima da União Internacional de Bioquímica (I.U.B.), e é um nome genérico para enzimas que catalisam uma reação de geração de ácido pirúvico a partir de ácido D-lático na presença de flavina adenina dinucleotídeo oxidada servindo como uma coenzima.

O gene did que pode ser introduzido em uma bactéria hospedeira a fim de aumentar a atividade de Did pode ser derivado de qualquer microrganismo, e exemplos dos mesmos incluem aqueles derivados das bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, bactérias pertencendo ao gênero Corynebacterium, e bactérias pertencendo ao gênero Zymomonas.

Em particular, do ponto de vista de aumentar a pureza ótica, o gene did é mais preferivelmente pelo menos um gene did selecionado de grupo consistindo de genes did de Escherichia coli, Zymomonas, e Corynebacterium, que tem um domínio Lact deh memb em comum, e cada qual é particularmente preferivelmente derivado de Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, ou Zymomonas mobilis. Os genes de did do gênero Zymomonas e o gênero Corynebacterium ainda têm um domínio de FAD oxidase em comum. O domínio Lact deh memb é uma sequência de aminoácido que as lactato desidrogenases situadas na membrana de célula possuem em comum com alta similaridade.

A informação sobre a presença ou a ausência da sequência do domínio Lact deh memb ou domínio de FAD oxidase é obtida entrando e procurarando a sequência de aminoácido de uma enzima usando a base de dados Pfam (Nucleic Acids Research (2008) Edição da Base de Dadoss 36: D281-D288) ou similares. Por exemplo, a presença ou ausência da sequência do domínio Lact deh memb ou o domínio de FAD oxidase em uma sequência de aminoácido desejada pode ser confirmada ao entrar a sequência de aminoácido em http://pfam.sanger.ac.uk/search, seguir por procurarando com o ajuste inicial.

Em um caso em que há um fator de controle que iniba a transcrição do gene de atividade de lactato desidrogenase independente de NAD, o aumento da atividade de lactato desidrogenase independente de NAD pode ser a atenuação ou inativação do fator.

Um exemplo da medida para aumentar a atividade de Did é o uso do promotor descrito em conexão com IdhA na Escherichia coli produtora de ácido D-lático, a qual a explanação acima é diretamente aplicável.

Além disso, é preferível que pelo menos uma selecionada do grupo consistindo de atividade de LdhA, atividade de LldD, e atividade de Pfl na bactéria produtora de ácido L-lático de acordo com a invenção seja inativada ou atenuada.

Com relação aos detalhes sobre LdhA, LldD, e Pfl os quais a atividade deve ser inativada ou atenuada, os detalhes dos mesmos descritos acima são diretamente aplicáveis.

A decomposição de ácido pirúvico, que é uma matéria- prima para a produção de ácido L-lático, pode ser inibida ao inativar ou atenuar a atividade de LdhA.

O consumo de ácido L-lático, que é um produto, pode ser inibido ao inativar ou atenuar a atividade de LldD.

Em adição ao acima, é preferível que pelo menos uma selecionada do grupo consistindo de atividade de Mdh e atividade de AspA na bactéria produtora de ácido L-lático de acordo com a invenção seja inativada ou atenuada, do ponto de vista de suprimir a quantidade de subprodutos produzidos, similarmente ao exemplo da bactéria produtora de ácido D-lático descrita acima.

Além disso, a fim de permitir a produção de ácido L- lático usando outro açúcar como uma matéria-prima, pelo menos um selecionado do grupo consistindo de CscA e FruK na bactéria produtora de ácido L-lático de acordo com a invenção pode ser aumentado, similarmente ao caso da bactéria produtora de ácido D-lático descrita acima; é mais preferivelmente que ambas CscA e FruK sejam aumentadas. Adicionalmente, na bactéria produtora de ácido L-lático de acordo com a invenção, a atividade de FruR é preferivelmente inativada ou atenuada do ponto de vista de fornecer a capacidade de promover a captação de frutose.

Com relação aos detalhes sobre Mdh e AspA, grupo de gene não PTS de sacarose, FruK, e FruR que devem ser inativados ou atenuados ou aumentados, os detalhes dos mesmos descritos acima são diretamente aplicáveis.

<Método de produção de ácido lático>

Em seguida, o método de produção de ácido lático de acordo com a invenção é descrito abaixo.

O método de produção de ácido lático de acordo com a invenção é um método de produção de ácido lático usando a bactéria produtora de ácido lático descrita acima.

Em particular, o ácido D-lático pode ser produzido com alta pureza ótica e alta eficiência pela cultura usando a bactéria produtora de ácido D-lático descrita acima. Similarmente, o ácido L-lático pode ser produzido com alta pureza ótica e alta eficiência pela cultura usando a bactéria produtora de ácido L-lático descrita acima.

O método de produção de ácido lático de acordo com a invenção inclui, especificamente: cultivar a bactéria produtora de ácido lático em um líquido de cultura; e coletar um ácido lático específico produzido pela bactéria produtora de ácido lático a partir da cultura obtida pelo cultivo.

No método de produção de ácido lático de acordo com a invenção, uma matéria-prima derivada de planta que é comumente usada como uma matéria-prima para a produção de ácido lático pode ser usada. A matéria-prima derivada de planta pode ser qualquer fonte de carbono obtida de uma planta. Especificamente, o escopo da matéria-prima derivada de planta engloba órgãos, tais como raizes, troncos, troncos, galhos, folhas, flores, ou sementes, corpos de planta incluindo os órgãos, e produtos de decomposição do órgão de planta. Adicionalmente, as fontes de carbono que são obtidas dos corpos de planta, órgãos de planta, ou produtos de decomposição dos mesmos, e que podem ser usados por microrganismos como fontes de carbono durante o cultivo são também incluídas no escopo da matéria-prima derivada de planta.

Os exemplos gerais da fonte de carbono incluída na matéria-prima derivada de planta incluem: sacarídeos, tais como amido, glicose, frutose, xilose, e arabinose; produtos de decomposição herbácea e madeira contendo estes componentes de sacarídeo em teores elevados; hidrolisatos de celulose contendo estes componentes de sacarídeo em teores elevados; e combinações dos mesmos. Adicionalmente, a glicerina ou ácidos graxos derivados de óleo vegetal podem também ser incluídos no escopo da fonte de carbono de acordo com a invenção.

Em particular, quando a Escherichia coli produtora de ácido lático de acordo com a invenção tem a atividade de CscA, a Escherichia coli produtora de ácido lático tem uma capacidade de assimilação de sacarose; portanto, a Escherichia coli produtora de ácido lático conduz a assimilação bem sucedida para produzir o ácido lático mesmo quando uma matéria-prima de planta contendo sacarose é usada.

Os exemplos preferíveis da matéria-prima derivada de planta na invenção incluem colheitas agrícolas, tais como cereal, milho, arroz, trigo, soja, cana-de-açúcar, beterraba, algodão, e combinações das mesmas. A forma das mesmas quando usadas como uma matéria-prima não é particularmente limitada, e pode ser um material não processado, um sumo, um material esmagado, ou similares. Adicionalmente, a matéria-prima derivada de planta pode tomar uma forma consistindo de fonte(s) de carbono somente.

A mistura da matéria-prima derivada de planta e da bactéria produtora de ácido lático pode variar dependendo da atividade da bactéria produtora de ácidos lático. Em geral, a concentração inicial de açúcar (em termos de concentração de equivalente de glicose) como a concentração da matéria-prima derivada de planta no meio pode ser 2 0% por massa ou menor relativa à massa total da mistura, e a concentração inicial de açúcar é preferivelmente 15% por massa ou menor do ponto de vista da tolerância de açúcar da bactéria. Outros componentes podem ser adicionados em quantidades usuais para adição a um meio microbiano, e as quantidades dos mesmos não são particularmente limitadas.

O teor da bactéria produtora de ácido lático no meio pode variar dependendo do tipo e atividade de bactéria. Em geral, a concentração bacteriana inicial pode ser de 0,1% por massa a 30% por massa, e preferivelmente de 1% por massa a 10% por massa, relativa ao líquido de cultura, do ponto de vista de controle das condições de cultura.

O cultivo na invenção se refere ao cultivo do microrganismo de acordo com a invenção usando um meio. O meio a ser usado não é particularmente limitado se o meio contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, um íon inorgânico, e elementos traço orgânicos, ácidos nucleicos, vitaminas, e similares, que são exigidos pelo microrganismo a fim de produzir o ácido lático.

Em particular, é preferível conduzir o cultivo usando um meio adicionado com dois ou mais aminoácidos, do ponto de vista da taxa de produção. 0 meio adicionado com dois ou mais aminoácidos na invenção significa um meio que inclui pelo menos dois aminoácidos dentre vários aminoácidos naturais, e o escopo do mesmo engloba um meio que inclui um hidrolisato de um produto natural ou extrato de produto natural, tal como extrato de levedura, ácido casamino, peptona, soro de leite, melaço escuro, e licor de milho. A fim de obter resultados mais favoráveis, um meio que incluí pelo menos um selecionado do extrato de levedura, peptona, soro de leite, melaço escuro, ou licor de milho, ou uma mistura de, em um teor de 0,5% por massa a 20% por massa é preferível, e o teor é mais preferivelmente de 2% por massa a 15% por massa. Especialmente, a adição de licor de milho produz um grande efeito, neste caso a não adição de sais, tais como sulfato de amônio produz algum melhores resultados. O meio é geralmente um meio líquido.

As condições de cultura variam dependendo das bactérias preparadas e do aparelho de cultura. Por exemplo, a temperatura de cultivo durante o cultivo é preferivelmente de 20°C a 40°C, e mais preferivelmente de 25°C a 35°C. O pH durante o cultivo é preferivelmente de 6,0 a 8,0, e mais preferivelmente 7,0 a 7,6, pelo ajuste com NaOH, NH3, OU similares. O tempo de cultivo não é particularmente limitado, e é um período de tempo necessário para as bactérias crescerem suficientemente e produzirem ácido lático.

O cultivo é geralmente realizado usando um recipiente de cultura capaz de controlar a temperatura, pH, condições aeróbias, e velocidade de agitação. Entretanto, o uso de um recipiente de cultura não é essencial no cultivo de acordo com a invenção. Em um caso em que o cultivo é conduzido usando um recipiente de cultura caso necessário, o cultivo de semente pode ser realizado adiantado como uma pré- cultura, e uma quantidade exigida da cultura resultante pode ser inoculada em um meio em um recipiente de cultura que foi preparado adiantado.

O produto de cultura na invenção refere-se às células bacterianas e um líquido de cultura que são produzidos pelo método descrito acima, e produtos processados dos mesmos.

Em um caso em que o ácido lático deve ser coletado do líquido de cultura, o método de coleta do ácido lático apartir do produto de cultura assim obtido, tal como líquido de cultura, pode ser um método geralmente conhecido, e exemplos dos mesmos incluem: um método para diretamente destilar após a acidificação; um método para permitir a formação e destilação da lactida; um método de adicionar um álcool e um catalizador para causar esterificação, e então destilar o resultante; um método de extração em um solvente orgânico; um método de separação usando uma coluna de troca iônica; um método de concentração e separação por eletrodiálise; e combinações dos mesmos. Adicionalmente, já que a célula bacteriana produzida pelo método de acordo com a invenção produz um grupo de enzimas apropriadas para a produção de ácido lático, a produção de ácido lático usando a célula bacteriana e coleta de ácido lático produzido é também considerada como uma modalidade do método de coleta do ácido lático a partir do produto de cultura.

Com o método de produção de ácido lático de acordo com a invenção, o ácido lático com alta pureza ótica pode ser produzido. Portanto, o ácido D-lático ou o ácido L-lático pode ser obtido com pureza elevada coletando o ácido lático contido no produto de cultura.

A produção de ácido lático ao cultivar o microrganismo obtido na invenção pode ser realizada sem condução de aeração; entretanto, a aeração é preferivelmente conduzida a fim de obter resultados mais favoráveis. Aqui, "sob condições de aeração" não necessariamente exige a passagem do ar através do líquido de cultura, e o escopo do mesmo engloba, dependendo do formato do recipiente de cultura, a aeração de superfície em que uma camada de ar acima do líquido de cultura é substituída enquanto o líquido de cultura é agitado moderadamente; "sob condições de aeração" se refere a permitir um gás contendo oxigênio fluir no recipiente de cultura. No caso de aeração no líquido, a concentração de oxigênio dissolvido varia com a combinação de pressão interna, posição da lâmina de agitação, formato da lâmina de agitação, e velocidade de agitação. Portanto, as condições ótimas podem ser determinadas como segue usando a eficiência de produção de ácido lático, a quantidade de ácidos orgânicos diferentes do ácido lático, ou similares como indicadores.

Por exemplo, em um caso em que 500 g do líquido de cultura são usadas para cultivo em um recipiente de cultura relativamente pequeno, tal como um aparelho de cultura BMJ- 01 fabricado por ABLE Corporation, os resultados favoráveis podem ser obtidos sob condições de aeração que podem ser conseguidas com uma taxa de aeração de 0,01 vvm a 1 vvm e uma velocidade de agitação de 50 rpm a 500 rpm em pressão normal, mais preferivelmente em uma taxa de aeração de 0,1 vvm a 0,5 vvm e uma velocidade de agitação de 100 rpm a 400 rpm em pressão normal. Estas condições de aeração/agitação permitem o abastecimento de oxigênio de um coeficiente de transferência de oxigênio kLa de 1/h a 400/h com relação à água em uma temperatura de 30°C em pressão normal.

Adicionalmente, outro indicador da condição de aeração ótima é uma condição de aeração conseguida com uma taxa de aeração e uma velocidade de agitação em que a quantidade total de ácido fórmico, ácido acético, ácido succínico, etanol, ou uma combinação dos mesmos que são produzidos pela variante inserida o genoma pGAP-cscA-lox- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA em cultura anaeróbica é 5,0 g/1 ou menos, e mais preferivelmente 1,0 g/1 ou menos, e em que ácido lático é produzido.

Adicionalmente, outro indicador da condição de aeração ótima é uma condição conseguida por uma taxa de aeração e uma velocidade de agitação em que a variante inserida o genoma pGAP-cscA-lox- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA cultivada em um meio contendo 0,3% de ácido L-lático, que é um isômero ótico, diminui a concentração de ácido L-lático no meio a 0,02% por massa ou menos dentro de 10 horas a 100 horas.

As condições de aeração descritas acima não precisam ser realizadas durante todo o tempo, do começo ao fim do cultivo, e os resultados favoráveis podem também ser obtidos ao implementar as condições de aeração para uma parte da duração do processo de cultivo. A eficiência da produção de ácido lático pode ser aumentada e um isômero ótico pode ser reduzido, ao conduzir a aeração na maneira descrita acima.

De acordo com o método de produção de ácido lático de acordo com a invenção, o ácido L-lático ou o ácido D-lático pode ser obtido com alta pureza ótica. Adicionalmente, mesmo quando o outro isômero ótico, que deteriora a pureza ótica, é incluído na matéria-prima, o isômero ótico desejado pode ser produzido ao decompor o isômero ótico indesejado.

No método de produção de ácido lático de acordo com a invenção, a pureza ótica pode ser determinada usando um HPLC comum ou um F-Kit de ácido D-/L-lático (código de produto 1112821, J.K. International Inc.). O ácido de L- ou D-lático desejado com pureza ótica de 98%e.e. ou maior pode ser obtido, e, preferivelmente, um ácido L- ou D-lático desejado com pureza ótica de 99.5%e.e. ou maior pode ser obtido, em que a pureza ótica é calculada de acordo com a seguinte equação a partir da quantidade de ácido L-lático e da quantidade de ácido D-lático no sobrenadante resultante como medido usando o F-Kit. Pureza ótica (%e.e.) = 100 x (concentração de ácido D- lático - concentração de ácido L-lático)/(concentração de ácido D-lático + concentração de ácido L-lático) Na equação, as concentrações de ácido lático são baseadas na massa.

De acordo com o método de produção de ácido lático de acordo com a invenção, um isômero ótico com alta pureza ótica como descrito acima pode rapidamente ser produzido, em comparação a um caso em que o ácido D-lático ou ácido L- lático é produzido usando uma Escherichia coli em que a lactato desidrogenase dependente de NAD e a lactato oxidorredutase independente de NAD não são ambas aumentadas.

EXEMPLOS

Em seguida, a invenção é descrita em detalhe com referência aos seguintes exemplos. Entretanto, a invenção não é limitada aos mesmos. A menos que especificado de outra maneira, "%" e "parte(s)" se refere à "% por massa" e "partes por massa", respectivamente.

- Bactéria produtora de ácido D-lático - [Exemplo 1] <Preparação de variante MG1655 de Escherichia coli deletada do gene dld>

A sequência base inteira do DNA genômico de Escherichia coli é conhecida (número de acesso GenBank: U00096) , e a sequência base de um gene codificando desidrogenase D-lactato dependente de FAD de Escherichia coli (em seguida, referida simplesmente como "Did") foi também relatada (número de acesso GenBank: M10038). Baseado na informação de gene de regiões de DNA genômico de cepa MG1655 de Escherichia coli adjacente ao gene did, quatro tipos de primer de oligonucleotídeo, CAACACCAAGCTTTCGCG (Id. de Seq. N° . : 1) , TTCCACTCCTTGTGGTGGC (Id. de Seq. N° . : 2), AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG (Id. de Seq. N° . : 3), e TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC (Id. de Seq. N° . : 4), foram sintetizados.

Um DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli foi preparado de acordo com o método descrito em Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico resultante como um molde e usando os primers de Id. de Seq. N°. : 1 e Id. de Seq. N°. : 2, como resultado dos quais um fragmento de DNA de aproximadamente 1,4 kpb (em seguida às vezes referido como "fragmento dld-L") foi amplificado. O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico como um molde e usando os primers de Id. de Seq. N° . : 3 e Id. de Seq. N°. : 4, como resultado dos quais um fragmento de DNA de aproximadamente 1,2 kpb (em seguida às vezes referido como "fragmento dld-R") foi amplificado. O fragmento dld-L resultante foi digerido com enzimas de restrição HindTTT e PstI, e o fragmento dld-R resultante foi digerido com enzimas de restrição PstI e XbaT. Estes fragmentos digeridos foram misturados com um fragmento que foi obtido ao digerir um plasmídeo sensível à temperatura pTHlδcsl (Hashimoto-Gotoh, T., e col., Gene, Vol. 241 (1), págs.185-191 (2000)) com HindiII e XbaT, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, a célula competente DH5α (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol em 30°C foi obtido. A colônia resultante foi cultivada durante a noite em 3 0°C em um meio líquido LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol. Então, um plasmídeo foi recuperado das células bacterianas resultantes. O plasmídeo obtido foi nomeado "pTHΔdld".

Adicionalmente, a cepa MG1655 de Escherichia coli está disponível da American Type Culture Collection (ATCC), que é um banco para células, microrganismos, e genes.

[Exemplo 2]

Uma cepa MG1655 foi transformada com o plasmídeo pTHΔdld obtido no Exemplo 1 em 30°C, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol foi obtido. O transformante resultante foi aplicado em uma placa de ágar, e cultivado durante a noite em 30°C. Em seguida, a fim de obter as células bacterianas cultivadas do mesmo, o transformante cultivado foi aplicado em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado do qual uma colônia que cresceu em 42°C foi obtida.

Adicionalmente, a operação de obter colônias sozinhas que cresceram em 42°C foi repetida novamente, desse modo selecionando um clone em que o plasmídeo inteiro foi integrado no cromossoma por recombinação homóloga. Confirmou-se que o clone não tinha o plasmídeo no citoplasma.

Em seguida, o clone acima mencionado foi aplicado em uma placa de ágar LB, cultivado durante a noite em 3 0°C, inoculado em um meio líquido LB (3 mL/tubo de ensaio), e então cultivado com agitação em 42°C de 3 horas a 4 horas. Este foi apropriadamente diluído (aproximadamente 1CT2 vezes a 10-6 vezes) a fim de obter colônias sozinhas, e o líquido diluído foi aplicado em uma placa de ágar LB, e cultivado durante a noite em 4 2°C, como resultado do qual as colônias foram obtidas. Das colônias que apareceram, 100 colônias foram aleatoriamente escolhidas, e cada uma foi permitida crescer em uma placa de ágar LB, e em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol. Os clones sensíveis ao cloranfenicol que cresceram somente na placa de ágar LB foram selecionados. Adicionalmente, um fragmento de aproximadamente 2,0 kb contendo did foi amplificado por PCR usando o DNA cromossomial de cada um destes clones alvos, e uma variante em que uma região de gene did foi suprimida foi selecionada. O clone que passou pelas seleções acima foi considerado como uma variante dld- deletado, e a variante resultante foi nomeada "variante MG1655Δdld".

[Exemplo 3] <Preparação de variante de genes pfl e did deletados de Escherichia coli MG1655>

A sequência base inteira do DNA genômico de Escherichia coli é conhecida (número de acesso GenBank: U00096) , e a sequência base de um gene codificando piruvato formato liase de Escherichia coli (em seguida às vezes referida como "Pfl") foi também relatado (número de acesso GenBank: AE000192). A fim de clonar as regiões adjacentes à sequência base do gene codificando Pfl, quatro tipos de primer de oligonucleotídeo, GCACGAAAGCTTTGATTACG (Id. de Seq. N° . : 5), TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG (Id. de Seq. N° . : 6), TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG (Id. de Seq. N° . : 7), e AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG (Id. de Seq. N° . : 8), foram sintetizados.

O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando os primers de Id. de Seq. N°.: 5 e Id. de Seq. N°.: 6, como resultado dos quais um fragmento de DNA de aproximadamente 1,8 kpb (em seguida às vezes referido como "fragmento pflB-L") foi amplificado. O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando os primers de Id. de Seq. N°.: 7 e Id. de Seq. N°.: 8, como resultado dos quais um fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kpb (em seguida às vezes referido como "fragmento pflB-R") foi amplificado. Estes fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em agarose e recuperados, e o fragmento pflB-L foi digerido com HindTTl e SphT e o fragmento pflB-R foi digerido com SphT e PstI, respectivamente. Estes dois tipos de fragmentos digeridos e um produto obtido ao digerir um plasmídeo sensível à temperatura pTH18csl (número de acesso GenBank: AB019610) com HindTTT e PstI foram permitidos reagir na presença de DNA ligase T4. Em seguida, uma célula competente de Escherichia coli DH5a (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, como resultado do qual um plasmídeo contendo dois fragmentos: o 5'- fragmento adjacente a montante e 3'- fragmento adjacente a jusante, do gene pflB foi obtido e nomeado "pTHΔpfl".

A variante MG1655Δdld obtida no Exemplo 2 foi transformada com o plasmídeo pTHΔpfl obtido, e um transformante que cresceu em 3 0°C em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol foi obtido. 0 transformante resultante foi aplicado em uma placa de ágar, e cultivado durante a noite em 30°C. Em seguida, a fim de obter células bacterianas cultivadas do mesmo, o transformante cultivado foi aplicada em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado do qual as colônias que cresceram em 42°C foram obtidas.

A variante MG1655Δdld interrompida de gene pfl foi obtida a partir do clone resultante de acordo com um método similar ao empregado no Exemplo 2, e foi nomeada "variante MG1655ΔpfIΔdld".

[Exemplo 4] <Preparação da variante MG1655ΔpfIΔdldΔmdh de Escherichia coli>

A sequência base inteira do DNA genômico de Escherichia coli é conhecida (número de acesso GenBank: U00096) , e a sequência base de urn gene mdh de Escherichia coli foi também relatada (número de acesso Genbank AE000403). A firn de clonar as regiões adjacentes à sequência base do gene (939 pb) codificando Mdh, quatro tipos de primer de oligonucleotideo, AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC (Id. de Seq. N° . : 9), AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG (Id. de Seq. N° . : 10), AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG (Id. de Seq. N° . : 11), e AAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC (Id. de Seq. N°.: 12), foram sintetizados.

O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando uma combinação de primer de Id. de Seq. N°.: 9 e Id. de Seq. N°.: 10, como resultado do qual um fragmento de DNA de aproximadamente 800 pb (em seguida às vezes referido como "fragmento mdh-L") foi amplificado. O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando uma combinação de primer de Id. de Seq. N°. : 11 e Id. de Seq. N°. : 12, como resultado do qual um fragmento de DNA de aproximadamente 1000 pb (em seguida às vezes referido como "fragmento mdh-R") foi amplificado. Estes fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em agarose e recuperados. O fragmento mdh-L foi digerido com KpnT e BamHI, e o fragmento mdh-R foi digerido com BamHI e Xbal. Estes dois tipos de fragmento digerido, e um produto obtido ao digerir um plasmídeo pTH18csl sensível à temperatura (número de acesso GenBank: AB019610) com KpnT e Xbal, foram permitidos reagir na presença de DNA ligase T4. Em seguida, uma célula competente DH5OÍ de Escherichia coli (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, como resultado da qual um plasmídeo contendo dois fragmentos: 5'- fragmento adjacente a montante e 3'- fragmento adjacente a jusante, do gene codificando mdh foi obtido, e o plasmídeo obtido foi nomeado "pTHΔmdh".

A variante MG1655ΔpfIΔdld de Escherichia coli obtida no Exemplo 3 foi transformada com o plasmídeo pTHΔmdh, e

uma variante MG1655ΔpfIΔdld interrompida de gene mdh foi preparada de acordo com um método similar ao empregado no Exemplo 2. Esta variante foi nomeada "variante MG1655ΔpfIΔdldΔmdh".

[Exemplo 5] <Preparação da variante MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp de Escherichia coli>

A sequência base inteira do DNA genômico de Escherichia coli é conhecida (número de acesso GenBank: U00096) , e a sequência base de um gene aspA de Escherichia coli foi também relatada (número de acesso GenBank: AE000486). A firn de clonar as regiões adjacentes à sequência base de um gene (1.4 82 pb) codificando AspA, quatro tipos de primer de oligonucleotide©, TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG (Id. de Seq. N° . : 13), CGAACAGTAATCGTACAGGG (Id. de Seq. N° . : 14), TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG (Id. de Seq. N° . : 15), e TTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC (Id. de Seq. N° . : 16), foram sintetizados.

O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando uma combinação de primer de Id. de Seq. N°. : 13 e Id. de Seq. N°.: 14, como resultado do qual um fragmento de DNA de aproximadamente 910 pb (em seguida às vezes referido como "fragmento aspA-1") foi amplificado. O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando uma combinação de primer de Id. de Seq. N°. : 15 e Id. de Seq. N°.: 16, PCR, como resultado do qual um fragmento de DNA de aproximadamente 1.100 pb (em seguida às vezes referido como "fragmento aspA-r") foi amplificado. Estes fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em agarose e recuperados. Ambos o fragmento aspA-1 e o fragmento aspA-r foram terminalmente aparados com um DNA Blunting Kit (Takara Bio Inc.), e então os terminais 5'- dos mesmos foram fosforilados usando a polinucleotídeo quinase T4 de acordo com um método comum. Separadamente, um plasmídeo pTH18csl sensível à temperatura foi digerido com Smal, e então submetido ao tratamento de desfosforilação usando uma fosfatase alcalina. Os dois tipos de fragmento fosforiladas e o plasmídeo defosforilado foram permitidos reagir na presença de DNA ligase T4. Em seguida, uma célula competente DH5α de Escherichia coli (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, como resultado da qual um plasmídeo contendo dois fragmentos: 5'- fragmento adjacente a montante e 3'- fragmento adjacente a jusante, do gene codificando AspA foi obtido. Este plasmídeo foi nomeado "pTHΔasp".

A variante MG1655ΔpfIΔdldΔmdh de Escherichia coli obtida no Exemplo 4 foi transformada com o plasmídeo pTHΔasp, e a finalmente a variante MG1655ΔpfIΔdldΔmdh interrompida de gene aspA foi obtida, a qual foi nomeada "variante MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp". O método específico para obter esta variante era similar ao método descrito no Exemplo 2 de acordo com a invenção.

[Exemplo 6] <Substituição do promotor GAPDH pelo promotor IdhA no genoma de variante MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp Escherichia coli>

A sequência base de urn gene IdhA de Escherichia coli já foi relatada (número de acesso GenBank: U36928). A fim de obter o promotor de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH), a amplificação por um método de PCR foi realizada usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC (Id. de Seq. N° . : 17) e ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG (Id. de Seq. N° . : 18). O fragmento de DNA resultante foi digerido com uma enzima de restrição EcoRT, desse modo fornecendo um fragmento de aproximadamente 100 pb que codificou um promotor GAPDH. A fim de obter o gene de D-lactato desidrogenase (IdhA) , a amplificação por um método de PCR foi realizada usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT (Id. de Seq. N° . : 19) e CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC (Id. de Seq. N° . :20) . O fragmento de DNA resultante foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e HindTTT, desse modo fornecendo um fragmento de gene de D-lactato desidrogenase (IdhA) de aproximadamente 1,0 kpb. Os dois fragmentos de DNA acima foram misturados com um fragmento obtido digerindo um plasmídeo pUC18 com enzimas de restrição EcoRT e HindTTT, e os fragmentos misturados foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente DH5α de Escherichia coli (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia resultante foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 30°C, e um plasmídeo pGAP-IdhA foi recuperado das células bacterianas resultantes.

O PCR foi realizado usando o DNA genômico de Escherichia coli como um molde e usando AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC (Id. de Seq. N°. : 21) e GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC (Id. de Seq. N° . : 22), que foram preparados baseados na informação de gene da cepa MG1655 de Escherichia coli em uma região adjacente 5'- do gene IdhA, desse modo amplificando um fragmento de DNA de aproximadamente 1000 pb.

Adicionalmente, o PCR foi realizado usando o plasmídeo pGAPldhA preparado acima como um molde e usando GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG (Id. de Seq. N° . : 23) preparado baseado na informação de sequência de um promotor gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da cepa MG1655 de Escherichia coli, e AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC (Id. de Seq. N°. : 24) preparado baseado na informação de sequência do gene IdhA da cepa MG1655 de Escherichia coli, como resultado do qual um fragmento de DNA de aproximadamente 850 pb que continha um promotor GAPDH e uma região do gene IdhA ou em torno do codon de iniciação foi obtido.

Os fragmentos obtidos acima foram digeridos com as enzimas de restrição KpnT e Xbal, e XbaT e PstT, respectivamente. Os fragmentos resultantes foram misturados com um fragmento obtido ao digerir um plasmídeo pTH18csl sensível à temperatura com KpnT e PstT, e os fragmentos misturados foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente DH5ot (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação em 30°C, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol foi obtido. A colônia resultante foi cultivada em um meio líquido LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol durante a noite em 30°C. Um plasmídeo foi recuperado das células bacterianas resultantes, e foi nomeado "pTH-GAPIdhA".

A variante MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp de Escherichia coli obtida no Exemplo 5 foi transformada com o plasmídeo pTH- GAPldhA obtido, e cultivada em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol durante a noite em 30°C, como resultado do qual um transformante foi obtido. 0 transformante resultante foi inoculado em um meio líquido LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol, e cultivado durante a noite em 30°C. Em seguida, a fim de obter as células bacterianas cultivadas do mesmo, o transformante cultivado foi aplicado em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado do qual uma colônia que cresceu em 42 °C foi obtida. A colônia resultante foi cultivada em um meio líquido LB não contendo cloranfenicol durante a noite em 30°C, e em adicionalmente aplicado em uma placa de ágar LB não contendo cloranfenicol, como resultado do qual uma colônia que cresceu em 42 °C foi obtida.

Das colônias que apareceram, 100 colônias foram aleatoriamente escolhidas, e foram cada uma crescida em uma placa de ágar LB não contendo cloranfenicol e uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol, e os clones sensíveis ao cloranfenicol foram selecionados. Adicionalmente, um fragmento de aproximadamente 800 pb contendo o promotor GAPDH e o gene IdhA foi amplificado por PCR usando o DNA cromossomial de cada um destes clones alvos, e uma variante em que a região de promotor IdhA foi substituída com o promotor GAPDH foi selecionado. 0 clone que passou as seleções acima foi nomeado "variante inserido de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA".

<Preparação de variante lldR interrompida>

Um plasmídeo em que um gene lldR é interrompido foi construído de acordo com o seguinte método.

A sequência base de um gene lldR de Escherichia coli já foi relatada (número de acesso Genbank U00096 ZTTIGll a 3777853).

A fim de clonar uma região adjacente à sequência base do gene codificando lldR, PCR foi conduzido usando o DNA genômico de Escherichia coli como um molde e usando GGGAATTCGACATCATTCGCTCGTCTATTCTTTCGATA (Id. de Seq. N° . : 25) e GGGTACCTTAAGGAATCATCCACGTTAAGACAT (Id. de Seq. N° . : 26), desse modo amplificando um fragmento de DNA a montante de lldR, e o fragmento amplificado foi então clivado com enzimas de restrição EcoRI e KpnT. Então, o PCR foi conduzido usando o DNA genômico de Escherichia coli como um molde e usando ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (Id. de Seq. N° . : 27) e GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG (Id. de Seq. N°. : 28) como primers, desse modo amplificando um fragmento de DNA a jusante de lldR, e o fragmento amplificado foi então clivado com enzimas de restrição KpnT e Sail. Estes dois tipos de fragmento digerido e um produto obtido ao digerir um plasmídeo pTH18csl sensível à temperatura (número de acesso GenBank: AB019610) com EcoRT e Sail foram permitidos reagir na presença de DNA ligase T4. Em seguida, uma célula competente DH5α de Escherichia coli (nome de comércio: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, desse modo fornecendo um plasmídeo contendo dois fragmentos: 5'- fragmento adjacente a montante e 3'- fragmento adjacente a jusante do gene codificando LldD. Este plasmídeo foi nomeado "pTHΔlldR".

A variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA foi transformada com o plasmídeo obtido, e cultivada em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol durante a noite em 30°C, como resultado da qual um transformante foi obtido. O transformante obtido foi inoculado em um meio líquido LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol, e cultivado durante a noite em 30°C. Em seguida, a fim de obter uma célula bacteriana cultivada, o transformante cultivado foi aplicado em uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado do qual uma colônia que cresceu em 42°C foi obtida. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB não contendo cloranfenicol durante a noite em 3 0°C, e em mais tarde aplicado em uma placa de ágar LB não contendo cloranfenicol, como resultado do qual uma colônia que cresceu em 42°C foi obtida.

Das colônias que apareceram, 100 colônias foram selecionadas aleatoriamente, e eram cada uma permitida crescer em uma placa de ágar LB não contendo cloranfenicol e uma placa de ágar LB contendo 10 μg/ml de cloranfenicol, e os clones sensíveis ao cloranfenicol foram selecionados. Adicionalmente, uma região ou em torno de lldR foi amplificada por PCR usando o DNA cromossomial de cada um destes clones alvos, e uma variante em que a região de lldR foi deletada foi selecionada. O clone que passou as seleções acima foi nomeado "variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔlldR/GAPldhA".

[Exemplo 7] <Preparação de variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA de Escherichia coli>

A sequência base inteira de DNA genômico de Escherichia coli é conhecida (número de acesso GenBank: U00096) , e a sequência base de um gene fruR de Escherichia coli MG1655 foi também relatada. Isto é, o gene fruR é descrito em 88028 a 89032 da sequência de genoma de cepa MG1655 de Escherichia coli descrita no número de acesso Genbank U00096.

A fim de clonar as regiões adjacentes à sequência base de gene fruR (1005 pb) , quatro tipos de primer de oligonucleotídeo, TACTGCAGATCTCAATAACCGCTATCTGG (Id. de Seq. N° . : 29), GCTCTAGATAGCCATTGTACTGGTATGG (Id. de Seq. N° . : 30), TATCTAGATGCTCAGCCGTAGCTAAGC (Id. de Seq. N° . : 31), e CGAATTCATCCATCTGACATTCGCTGG (Id. de Seq. N° . : 32), foram sintetizados.

O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando uma combinação de primer de Id. de Seq. N°. : 29 e Id. de Seq. N°.: 30, como resultado da qual um fragmento de DNA de aproximadamente 950 pb (em seguida às vezes referido como "fragmento fruR-L") foi amplificado. O PCR foi conduzido sob condições usuais usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando uma combinação de primer de Id. de Seq. N° . : 31 e Id. de Seq. N°. : 32, como resultado da qual um fragmento de DNA de aproximadamente 880 pb (em seguida às vezes referido como "fragmento fruR-R") foi amplificado. Estes fragmentos de

DNA foram separados por eletroforese em agarose e recuperados. O fragmento de fruR-L foi digerido com PstI e Xbal, e o fragmento de fruR-R foi digerido com Xbal e EcoRl. Estes dois tipos de fragmento digerido e um produto obtido ao digerir um plasmídeo pTHIScsl sensível à temperatura (número de acesso GenBank: AB019610) com PstI e EcoRl foram permitidos reagir na presença de DNA ligase T4. Em seguida, uma célula competente DH5α de Escherichia coli (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, como resultado da qual um plasmídeo contendo dois fragmentos: 5'- fragmento adjacente a montante e 3'- fragmento adjacente a jusante do gene fruR foi obtido. Este plasmídeo foi nomeado "pTHΔfruR".

A variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA de Escherichia coli obtida no Exemplo 6 foi transformada com o plasmídeo pTHΔfruR, e uma variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA interrompida de gene fruR foi preparada em uma maneira similar ao exemplo 2. Esta variante foi nomeada "variante inserida de genoma MG16 5 5 Δpf1ΔdldΔmdhΔaspΔ fruR/GAPIdhA".

[Exemplo 8] <Construção de vetor de expressão para gene de sacarose hidrolase (invertase) derivada de Escherichia coli 0157 e transformante com o vetor de expressão>

A sequência de aminoácido de invertase de Escherichia coli 0157 e a sequência base do gene da mesma já foram relatadas. Isto é, o gene codificando invertase (cscA) é descrito em 3274383 a 3275816 da sequência de genoma da cepa de Escherichia coli 0157 descrita no número de acesso Genbank AE005174. A sequência base de um promotor necessário para expressar o gene pode ser a sequência promotora de uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase derivada de Escherichia coli (em seguida às vezes referida como GAPDH) que é descrito em 397-440 na informação de sequência base do número de acesso Genbank X02662.

A fim de obter o promotor de GAPDH, a amplificação por um método de PCR foi realizada usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG (Id. de Seq. N° . : 33) e TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG (Id. de Seq. N° . : 34). O fragmento de DNA resultante foi digerido com uma enzima de restrição Ndel, desse modo fornecendo um fragmento de DNA de aproximadamente 110 pb correspondendo ao promotor de GAPDH. O fragmento de DNA resultante foi misturado com um fragmento obtido ao digerir um plasmídeo pBR322 (número de acesso Genbank J01749) com enzimas de restrição Ndel e FvuII, e os fragmentos misturados foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5a de Escherichia coli (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia resultante foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pBRgapP foi recuperado das células bacterianas resultantes.

A fim de obter o gene de invertase, a amplificação por um método de PCR foi realizada usando o DNA genômico (SIGMA-ALDRICH: IRMM44 9) de Escherichia coli 0157 como um molde e usando GATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGACGCAATCTCGATTGCATG (Id. de Seq. N°. : 35) e ATGGTACCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC (Id. de Seq. N°. : 36) . O fragmento de DNA resultante foi digerido com uma enzima de restrição XbaT, desse modo fornecendo um fragmento de gene de invertase de aproximadamente 1,4 kpb. O fragmento de DNA resultante foi misturado com um fragmento obtido ao digerir o plasmídeo pBRgapP preparado acima com enzimas de restrição XbaT e PshAT, e os fragmentos misturados foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5a de Escherichia coli (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtida. A colônia resultante foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pGAP-cscA foi recuperado das células bacterianas resultantes.

Uma célula competente da variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA preparada no Exemplo 7 foi transformada com o plasmídeo pGAP-cscA, e o transformante resultante foi cultivado em uma placa de ágar de caldo LB de Miller contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, como resultado da qual uma variante inserida de genoma/variante pGAP-cscA MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA foi obtida.

Adicionalmente, uma célula competente da variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA preparada no Exemplo 6 foi transformada com o plasmídeo pGAP-cscA, e o transformante resultante foi cultivado em uma placa de ágar de caldo LB de Miller contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37 °C, como resultado do qual uma variante inserida de genoma/variante pGAP-cscA MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA foi obtida.

[Exemplo 9] <Isolamento do gene lox>

Baseado na sequência base de L-lactato oxidase divulgada em JP-A N°. 10-248574, dois tipos de primer de oligonucleotide©, ATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGAAAAAACATATCAAGCAGGTACAAATG (Id. de Seq. N° . : 37) e CAGGTACCTTAAATAAAACGATTCTCACGCAATTTTA (Id. de Seq. N° . : 38), foram projetados e sintetizados. 0 primer de Id. de Seq. N° . : 3 7 tem um local de reconhecimento XbaT e uma sequência SD de IdhA em seu lado terminal 5'-. O primer de Id. de Seq. N°.: 38 tem um local de reconhecimento KpnT em seu lado terminal 5'-. Um DNA cromossomial foi isolado de Enterococcus sp. ATCC9625 (que é descrito como Lactococcus lactis (subsp. Cremoris IFO3427) em JP-A N°. 10-248574). 0 PCR foi realizado usando o DNA cromossomial isolado como um molde, e um fragmento de DNA amplificado foi isolado. O fragmento de DNA amplificado foi purificado, e foi digerido com XbaT. O fragmento digerido foi misturado com um fragmento obtido ao digerir o pBRgapP obtido no Exemplo 8 com enzimas de restrição XbaT e PshAT, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome de comércio: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C. Um plasmídeo pGAP-lox foi recuperado das células bacterianas resultantes.

A sequência base do gene lox isolado foi determinada usando um sequênciador de DNA.

[Exemplo 10] <Isolamento de lldD>

A sequência base inteira do DNA genômico de Escherichia coli é conhecida, e a sequência base de um gene codificando L-lactato desidrogenase dependente de FMN de Escherichia coli (lldD) foi também relatada (número de acesso Genbank U00096, 3777850 a 3779040) . A fim de clonar o lldD, dois tipos de primer de oligonucleotídeo, ATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (Id. de Seq. N° . : 39) e GATGGTACCCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG (Id. de Seq. N°.: 40), foram projetados e sintetizados.

O DNA genômico da cepa K12 de Escherichia coli foi isolado por um método comum, e o PCR foi realizado usando o DNA resultante como um molde. O fragmento de DNA amplificado foi purificado e digerido com XbaT. O fragmento digerido foi misturado com um fragmento obtido ao digerir o pBRgapP obtido no Exemplo 8 com enzimas de restrição Xbal e PshAT, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.)) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C. Um plasmídeo pGAP-lldD foi recuperado das células bacterianas resultantes. A sequência base do lldD isolado foi determinada usando um sequenciador de DNA.

<Construção do lldD mutado>

A fim de construir o lldD mutado, um gene variante de lldD foi construído por PCR de acordo com o protocolo de GeneMorph (marca registada) II Random Mutagenesis Kit (Stratagene), usando primers de oligonucleotide© de Id. de Seq. N°.: 39 e Id. de Seq. N°.: 40 usados acima, e usando o pGAP-lldD como um molde. O fragmento de DNA amplificado foi purificado e digerido com XbaT. 0 fragmento digerido foi misturado com um fragmento obtido ao digerir o pBRgapP obtido no Exemplo 8 com enzimas de restrição XbaT e PshAT, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi semeada em uma placa de poço profundo de 96 poços que tinha um volume de 2 ml/poço e a qual 300 μl de um meio (glicose 1%, peptona 1,2%, extrato de levedura 2%, (pH 7,5)) tinha sido adicionado, e seguido pelo cultivo sob agitação em 33°C por 24 horas. Após o cultivo ter sido terminado, as células bacterianas foram coletadas, e o sobrenadante foi removido. Em seguida, 200 μl de líquido de enzima bacteriolítica (0,285 mg/ml de Lisozima, 1,5 U/ml de DNasel, 2 mM de MgCl2) foi adicionado ao mesmo, e a mistura ao pipetar por 35 vezes foi conduzida. Após a incubação em 35°C por 15 minutos, a pipetagem para misturar foi conduzida mais 35 vezes, e a lise de células bacterianas foi confirmada visualmente. Em seguida, 10 μl da mesma foi captada e adicionada 190 μl de um líquido de reação (20 mg/ml de metosulfato de fenazina, 3 mg/ml brometo de 3-[4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio 0,5 MKPB (pH7.0)). Então, 40 μl de 100 mM L-lactato de sódio (pH 7,0) foram adicionados, e uma taxa de aumento de absorvância em 570 nm foi observada.

Um plasmídeo foi extraído de uma colônia que exibiu uma taxa de aumento 1,5 vez ou maior em comparação ao controle, e a sequência base de lldD mutado isolado foi determinada por um sequênciador de DNA. A sequência é determinada como a Id. de Seq. N°.: 41. O plasmídeo obtido foi nomeado "lldD pGAP-mutado".

<Construção de plasmídeo com o coaumento de Lox e LldD>

O PCR foi realizado usando o lldD pGAP-mutado como um molde e usando ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (Id. de Seq. N° . : 42) e GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG (Id. de Seq. N°. : 28) como primers, como resultado do qual um fragmento lldD foi obtido. O fragmento lldD foi clivado com uma enzima de restrição Sail, e purificado. O fragmento purificado foi misturado com um fragmento obtido ao clivar o pGAP-lox com uma enzima de restrição Sail, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.)) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. Um plasmídeo lldD pGAP-lox-mutado foi obtido do transformante obtido. A direção de inserção do lldD mutado foi confirmada por sequenciamento.

[Exemplo 11] <Isolamento de lctO>

A sequência base de um gene codificando L-lactato oxidase de Lactococcus lactis IL1403 foi divulgada (número 5 de acesso Genbank AE006357, 4813 a 3662). Baseado na informação de sequência base, dois tipos de primer de oligonucleotídeo, AATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGCATCTATCATCTACAGATGTAAACTTTA (Id. de Seq. N° . : 43) e ACAGGTACCTTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGATTT 10 (Id. de Seq. N° . : 44), foram projetados e sintetizados, a fim de isolar o gene da L-lactato oxidase a partir de L. lactis. subsp. lactis ATCC 19435. O primer de Id. de Seq. N°.: 43 tem um local de reconhecimento XbaT e uma sequência SD de Idh em seu lado terminal 5'-. O primer de Id. de Seq. 15 N°. : 44 tem um local de reconhecimento KpnT em seu lado terminal 5' - .

O DNA genômico de L. lactis. subsp. lactis ATCC 19435 foi isolado. 0 PCR foi realizado sob condições usuais, usando o DNA genômico isolado como um molde e usando os 20 primers de oligonucleotídeo de Id. de Seq. N°.: 43 e 44. O fragmento de DNA amplificado foi purificado e digerido com Xbal. 0 fragmento digerido foi misturado com um fragmento obtido ao digerir o pBRgapP obtido no Exemplo 8 com enzimas de restrição Xbal e PshAT, e os fragmentos foram ligados 25 usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A 30 colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C. Um plasmídeo contendo IctO foi obtido das células bacterianas resultantes e nomeado "pGAP-lctO". A sequência base do IctO isolado foi determinada usando um sequênciador de DNA.

[Exemplo 12] <Construção de plasmídeo para produção de ácido lático>

O pGAP-cscA obtido no Exemplo 8 foi clivado com as enzimas de restrição KpnT e Sail e purificado, desse modo fornecendo um fragmento purificado. O PCR foi realizado em uma maneira similar ao exemplo 9, usando ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGGAAAAAACATATCAAGCAGGTACAAATG (Id. de Seq. N° . : 45) e CAGTCGACTTAAATAAAACGATTCTCACGCAATTTTA (Id. de Seq. N° . : 46) como primers, como resultado do qual um fragmento lox foi obtido. O PCR foi realizado em uma maneira similar ao exemplo 10 usando ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (Id. de Seq. N° . : 27) e GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG (Id. de Seq. N°. : 28) como primers, como resultado do qual um fragmento lldD foi obtido. O PCR foi realizado em uma maneira similar ao exemplo 11 usando AATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGCATCTATCATCTACAGATGTAAACTTTA (Id. de Seq. N° . : 47) e ACAGTCGACTTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGATTT (Id. de Seq. N°. : 48) como primers, como resultado do qual um fragmento IctO foi obtido. Cada um dos fragmentos obtidos acima foi clivado com as enzimas de restrição KpnT e Sail. Cada fragmento foi misturado com o fragmento de pGAP-cscA obtido acima, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, as células competentes da cepa DH5α de de Escherichia, coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foram transformadas respectivamente com os produtos de ligação, e os transformantes que cresceram em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foram obtidos. Dos transformantes obtidos, spGAP-cscA-lox, pGAP-cscA-lldD, e pGAP-cscA-lctO foram obtidos. Adicionalmente, o PCR foi realizado usando o DNA genômico de Escherichia coli como um molde, e usando ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (Id. de Seq. N° . : 42) e GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG (Id. de Seq. N°. : 28) como primers, como resultado do qual um fragmento lldD foi obtido. O fragmento foi então clivado com uma enzima de restrição Sail e purificado. O fragmento purificado foi misturado com um fragmento obtido ao digerir o pGAP-cscA-lox com uma enzima de restrição Sail, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd)) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. Do transformante obtido, um plasmídeo pGAP-cscA- lox-lldD foi obtido. A direção de inserção foi confirmada por sequenciamento. Adicionalmente, o PCR foi realizado usando o DNA genômico de Escherichia coli como um molde, e usando ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (Id. de Seq. N°. : 42) e GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG (Id. de Seq. N°. : 28) como primers, como resultado do qual um fragmento lldD foi obtido. O fragmento lldD foi então clivado com uma enzima de restrição Sail e purificado. 0 fragmento purificado foi misturado com um fragmento obtido ao clivar o pGAP-cscA-IctO com uma enzima de restrição Sail e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. Um plasmídeo pGAP-cscA-IctO-lldD foi obtido do transformante obtido. Estes plasmídeos foram usados individualmente para transformar a variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA obtida no Exemplo 7, como resultado da qual uma variante inserida de genoma p GAP-c s cA-1ox/MG16 5 5 Δpf1ΔdldΔmdhΔaspΔ fruR/GAP1dhA, uma variante inserida de genoma pGAP-cscA- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA, uma variante inserida de genoma pGAP-cscA- lctO/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA, uma variante inserida de genoma pGAP-cscA-lox- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA, e uma variante inserida de genoma pGAP-cscA-IctO- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA, foram obtidas.

[Exemplo 13] <Efeitos do aumento de LldD>

A variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA preparada no Exemplo 6 foi transformada com os plasmídeos pBRgapP e pGAP-lldD, como resultado da qual uma variante inserida de genoma pBRgapP/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA e uma variante inserida de genoma pGAP-lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA foram obtidas. Como pré-cultura, 100 ml de urn meio LB (Difco cat. 244620) contendo ampicilina em uma concentração de 50 g/ml foram colocados em frascos Erlenmeyer de 500 ml de volume equipados com defletores, as bactérias produtoras de ácido D-láticos descritas acima foram separadamente semeadas ao mesmo, e foram cultivadas durante a noite em 35 °C com agitação em 120 rpm. Em seguida, as pré-culturas resultantes foram separadamente semeadas, em 0,5%, em recipientes de cultura de 1 L de volume (nome comercial: BMJ-01, aparelho de cultura fabricado por ABLE Corporation), cada qual continha 500 ml de um meio (glicose 12%, licor de milho 3%: fabricado por Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd., lote (190718C) , o mesmo se aplicará em seguida). O cultivo foi realizado por 48 horas em pressão atmosférica com uma taxa de aeração de 0,5 vvm, em uma velocidade de agitação de 200 rpm, em uma temperatura de cultura de 35°C, e um pH de 7,2. O ensaio de ácido lático no líquido de cultura resultante foi realizado por HPLC de acordo com um método convencional. A pureza ótica do ácido lático gerado foi calculada de acordo com a seguinte equação da quantidade de ácido L-lático e quantidade de ácido D-lático no sobrenadante resultante como medido usando um F-Kit de ácido D-/L-lático (código de produto: 1112821, J.K. International Inc.). Pureza ótica (%e.e.) = 100 x (concentração de ácido D- lático - concentração de ácido L-lático)/(concentração de ácido D-lático + concentração de ácido L-lático)

Os resultados são dados na Tabela 1. Como mostrado na Tabela 1 foi demonstrado que o aumento de lldD melhora a pureza ótica do ácido lático obtido. Tabela 1

<Efeitos do aumento de LldD por lldD mutado>

A variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA preparada no Exemplo 6 foi transformada com lldD pGAP-mutado obtido no Exemplo 10, como resultado do qual uma variante inserida de genoma lldD pGAP-mutado/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA foi obtida. Como pré-cultura, 100 ml de um meio LB (Difco cat. 244620) contendo ampicilina em uma concentração de 50 μg/ml foram colocados em frascos Erlenmeyer de 500 ml de volume equipados com defletores, as bactérias produtoras de ácido D-láticos descritas acima foram separadamente semeadas aos mesmos, e cultivadas durante a noite em 35°C com agitação em 120 rpm. Em seguida, as pré-culturas resultantes foram separadamente semeadas, em 0,5%, em recipientes de cultura de 1 L de volume (nome comercial: BMJ-01, aparelho de cultura fabricado por ABLE Corporation), cada qual continha 500 ml de um meio (glicose 12%, licor de milho 5%) . O cultivo foi realizado por 30 horas em pressão atmosférica com uma taxa de aeração de 0,5 vvm, em uma velocidade de agitação de 200 rpm, em uma temperatura de cultura de 35°C, e um pH de 7,5. O ensaio de ácido lático no líquido de cultura resultante foi realizado por HPLC de acordo com um método convencional. A pureza ótica do ácido lático gerado foi calculada de acordo com a seguinte equação da quantidade de ácido L-lático e a quantidade de ácido D- lático no sobrenadante resultante como medido usando um F- Kit de ácido D-/L-lático (código de produto: 1112821, J.K. International Inc.). Pureza ótica (%e.e.) = 100 x (concentração de ácido D- lático - concentração de ácido L-lático)/(concentração de ácido D-lático + concentração de ácido L-lático)

Para comparação, a variante inserida de genoma pGAP- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA acima preparada antes da introdução da mutação foi cultivada na mesma maneira.

Os resultados são mostrados na Tabela 2. Como mostrado na Tabela 2, foi demonstrado que o uso de lldD mutado melhora a pureza ótica de ácido lático obtido, em comparação ao lldD antes da introdução da mutação. Tabela 2

<Efeitos do interinterrupção de lldR>

A variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔlldR/GAPldhA, que é a variante lldR- interrompida obtida no Exemplo 6, foi transformada com o pGAP-lldD obtido no Exemplo 10. Como pré-cultura para a colônia resultante, 100 ml de um meio LB (Difco cat. 244620) contendo ampicilina em uma concentração de 50 μg/ml foram colocados em frascos Erlenmeyer de 500 ml de volume equipados com defletores, e as bactérias produtoras de ácido D-lático descritas acima foram semeadas aos mesmo, e foram cultivadas durante a noite em 35°C com agitação em 120 rpm. Em seguida, as pré-culturas resultantes foram separadamente semeadas, em 0,5%, em recipientes de cultura de 1 L de volume (nome comercial: BMJ-01, aparelho de cultura fabricado por ABLE Corporation) cada qual continha 500 ml de um meio (glicose 12%, licor de milho 5%) . O cultivo foi realizado por 30 horas em pressão atmosférica com uma taxa de aeração de 0,5 vvm, em uma velocidade de agitação de 200 rpm, em uma temperatura de cultura de 35°C, e um pH de 7,5. O ensaio de concentração do ácido lático no líquido de cultura resultante foi medido por HPLC de acordo com um método convencional. A pureza ótica do ácido lático gerado foi calculada de acordo com a seguinte equação a partir da quantidade de ácido L-lático e da quantidade de ácido D-lático no sobrenadante resultante como medido usando um F-Kit de ácido D-/L-lático (código de produto: 1112821, J.K. International Inc.). Pureza ótica (%e.e.) = 100 x (concentração de ácido D- lático - concentração de ácido L-lático)/(concentração de ácido D-lático + concentração de ácido L-lático)

Para comparação, a variante inserida de genoma pGAP- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA antes, em que lldR não foi interrompido, foi cultivada da mesma maneira.

Os resultados são dados na Tabela 3. Como mostrado na Tabela 3, foi demonstrado que o interrupção de lldR melhora a pureza ótica do ácido lático obtido, em comparação a antes do interrupção de lldR. Tabela 3

<Efeitos do aumento de Lox>

As células da variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔlldR/GAPldhA, que é a variante lldR- interrompida obtida no Exemplo 6, foram respectivamente transformadas com o pGAP-lox obtido no Exemplo 9 e o lldD pGAP-lox-mutado obtido no Exemplo 10. Como pré-cultura para as colônias resultantes, 100 ml de um meio LB (Difco cat. 244620) contendo ampicilina em uma concentração de 50 μg/ml foram colocados em frascos Erlenmeyer de 500 ml equipados com defletores, e as bactérias produtoras de ácido D- láticos descritas acima foram separadamente semeadas aos mesmos, e cultivadas durante a noite em 35°C com agitação em 120 rpm. Em seguida, as pré-culturas resultantes foram separadamente semeadas, em 0,5%, em recipientes de cultura de 1 L de volume (nome comercial: BMJ-01, aparelho de cultura fabricado por ABLE Corporation) cada qual continha 500 ml de um meio (glicose 12%, licor de milho 5%) . O cultivo foi realizado por 24 horas em pressão atmosférica com uma taxa de aeração de 0,5 vvm, em uma velocidade de agitação de 200 rpm, em uma temperatura de cultura de 35°C, e um pH de 7,4. O ensaio da concentração de ácido lático no líquido de cultura resultante foi realizado por HPLC de acordo com um método convencional. A pureza ótica do ácido lático gerado foi calculada de acordo com a seguinte equação a partir da quantidade de ácido L-lático e da quantidade de ácido D-lático no sobrenadante resultante como medido usando um F-Kit de ácido D-/L-lático (código de produto: 1112821, J.K. International Inc.). Pureza ótica (%e.e.) = 100 x (concentração de ácido D- lático - concentração de ácido L-lático)/(concentração de ácido D-lático + concentração de ácido L-lático)

Para comparação, a variante inserida de genoma lldD pGAP-mutado/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔlldR/GAPldhA, que é a variante lldD-aumentado mutada obtida acima, foi cultivada da mesma maneira. Os resultados são mostrados na tabela 4. Como mostrado na Tabela 4, foi demonstrado que o aumento de Lox tem um efeito nos termos de aumentar a pureza ótica, que é mais forte do que o conseguido pelo aumento pela variante de gene lldD. Foi demonstrado que o coaumento de Lox e lldD mutado melhora a pureza ótica do ácido lático obtido. Tabela 4

<Produção de ácido D-lático de melaço

Como pré-cultura, a variante inserida de genoma pGAP- cscA-lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA e a variante inserida de genoma pGAP-cscA-lox- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA obtidas no Exemplo 12 foram separadamente semeadas nos frascos Erlenmeyer de 100 ml de volume equipados com defletores, cada qual continha 20 ml do líquido de pré-cultura mostrado na tabela 5, e o cultivo foi realizado durante a noite em 35°C com agitação em 120 rpm. Em seguida, as pré-culturas resultantes foram separadamente semeadas, em 0,5%, em recipientes de cultura de 1 L de volume (nome comercial: BMJ-01, aparelho de cultura fabricado por ABLE Corporation), cada qual continha 500 ml do meio mostrado na tabela 6. O cultivo foi realizado por 48 horas em pressão atmosférica com uma taxa de aeração de 0,5 vvm, em uma velocidade de agitação de 350 rpm, em uma temperatura de cultura de 35°C, e um pH de 7,5. A concentração de ácido lático no líquido de cultura resultante foi medida por HPLC de acordo com um método convencional. A pureza ótica de ácido lático gerado foi calculada de acordo com a seguinte equação a partir da quantidade de ácido L-lático e da quantidade de ácido D-lático no sobrenadante resultante como medido usando um F-Kit de ácido D-/L-lático (código de 5 produto: 1112821, J.K. International Inc.). Pureza ótica (%e.e.) = 100 x (concentração de ácido D- lático - concentração de ácido L-lático)/(concentração de ácido D-lático + concentração de ácido L-lático) Tabela 5 Composição do meio de pré-cultura pH 7,8 após autoclave (ajustado por NaOH 24%) Tabela 6 Composição de meio pH 7,5 após autoclave (ajustado por NaOH 24%) Para comparação, uma variante inserida de genoma pGAP- cscA/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA em que o pGAP-cscA obtido no Exemplo 8 foi recombinado na variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA obtida no Exemplo 7 foi cultivado da mesma maneira.

Os resultados são mostrados na tabela 7. Como mostrado na Tabela 7 foi demonstrado que a pureza ótica do ácido lático obtido é aumentada pelo aumento de LldD e Lox, também quando o melaço é usado como uma matéria-prima. Tabela 7

<Efeitos do aumento de LctO>

Como pré-cultura, a variante inserida de genoma pGAP- cscA-lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA e a variante inserida de genoma pGAP-cscA-lctO- lldD/MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA obtidas no Exemplo 10 12 foram separadamente semeadas em frascos Erlenmeyer de 100 mL de volume equipados com defletores, aos quais 10 g de carbonato de cálcio (primeiro grau, Junsei Chemical Co., Ltd.) foram adicionados e esterilizados previamente, e aos quais 20 ml do meio mostrado na tabela 8 foram adicionados, 15 e as variantes foram cultivadas durante a noite em 35°C com agitação em 120 rpm. Os líquidos de pré-cultura foram adicionados, em uma quantidade de 1 mL, a frascos Erlenmeyer de 100 ml equipados com defletores, aos quais 10 g de carbonato de cálcio (primeiro grau, Junsei Chemical Co., Ltd.) foram adicionados e esterilizados previamente, e aos quais 20 ml do meio mostrado na tabela 8 foram adicionados. 0 cultivo foi realizado por 24 horas em 35°C com agitação em 100 rpm. Tabela 8 Composição de meio pH 8,0 após autoclave (ajustado por NaOH 24%)

Após o cultivo ter sido completado, o ácido lático no líquido de cultura resultante foi analisado por HPLC de acordo com um método convencional. A pureza ótica do ácido lático gerado foi calculada de acordo com a seguinte equação a partir da quantidade de ácido L-lático e da quantidade de ácido D-lático no sobrenadante resultante como medido usando um F-Kit de ácido D-/L-lático (código de produto: 1112821, J.K. International Inc.). Pureza ótica (%e.e.) = 100 x (concentração de ácido D- lático - concentração de ácido L-lático)/(concentração de ácido D-lático + concentração de ácido L-lático)

Os resultados são dados na tabela 9. Como mostrado na Tabela 9, foi demonstrado que o aumento de IctO melhora a pureza ótica do ácido lático obtido. Tabela 9

- Bactéria produtora de ácido L-lático – [Exemplo 14] <Construção do vetor de expressão para o gene ldh2 derivado de Bifidobacterium e preparação de variante MG1655Δpfl/pGAP-ldh2 transformante com o vetor de expressão>

A sequência de aminoácido de L-lactato desidrogenase dependente de NAD de Bifidobacterium longum e a sequência base do gene da mesma já foram relatadas. Isto é, o gene codificando L-lactato desidrogenase dependente de NAD (ldh2) é descrito em 555 a 1517 da sequência de genoma de Bifidobacterium no número de acesso Genbank M33585.

A sequência promotora de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase derivada de Escherichia coli (em seguida também referida como "GAPDH") que é descrita em 397-440 na informação de sequência base de número de acesso Genbank X02662 pode ser usada como a sequência base de um promotor necessário à expressão do gene.

A fim de obter o promotor de GAPDH, a amplificação por um método de PCR foi realizada usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde e usando CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG (Id. de Seq. N° . : 33) e TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG (Id. de Seq. N° . : 34). 0 fragmento de DNA resultante foi digerido com uma enzima de restrição Ndel, desse modo fornecendo um fragmento de DNA de aproximadamente 110 pb correspondendo ao promotor de GAPDH. O fragmento de DNA resultante foi misturado com um fragmento obtido ao digerir um plasmídeo pBR322 (número de acesso Genbank J01749) com enzimas de restrição Ndel e PvuII, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente de uma cepa DH5a de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pBRgapP foi recuperado das células bacterianas resultantes.

A fim de obter um gene L-lactato desidrogenase dependente de NAD, a amplificação por um método de PCR foi realizada usando Bifidobacterium longum (ATCC 15707) como um molde e usando AATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC (Id. de Seq. N° . : 49) e CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG (Id. de Seq. N° . : 50) . 0 fragmento de DNA resultante foi digerido com uma enzima de restrição XbaT, desse modo fornecendo um fragmento de gene de L-lactato desidrogenase de aproximadamente 1,0 kpb. O fragmento de DNA resultante foi misturado com um fragmento obtido ao digerir o plasmídeo pBRgapP construído acima com uma enzima de restrição Xbal, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pGAP-ldh2 foi recuperado das células bacterianas resultantes.

Uma célula competente da cepa MG1655 da qual o gene pfl tinha sido deletado em uma maneira similar a empregada no Exemplo 2 usando o pTHΔpfl construído no Exemplo 3 (referido como "variante MG1655Δpfl") foi transformada com o plasmídeo pGAP-ldh2, e o transformante obtido foi cultivado em uma placa de ágar de caldo LB de Miller contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, desse modo fornecendo uma variante MG1655Δpfl/pGAP-ldh2.

[Exemplo 15] <Produção de ácido L-lático por variante MG1655Δpfl/pGAP-ldh2>

Similarmente ao Exemplo 13, a produção de ácido L- lático a partir de glicose pela variante MG1655Δpf1/pGAP- ldh2 foi examinada. 25 ml dos conteúdos do frasco obtidos por pré-cultura em uma maneira similar ao exemplo 13 foram semeados em 475 g do meio mostrado na tabela 10 abaixo. Tabela 10

O cultivo foi realizado por 18 horas em pressão atmosférica com uma taxa de aeração de 0,25 l/min, uma velocidade de agitação de 200 rpm, uma temperatura de cultura de 35°C, e um pH de 7,5 (ajustado com NaOH 24%). Após o cultivo por 18 horas, a concentração de ácido L-lático no líquido de cultura foi 97,02 g/1.

Destes resultados, confirmou-se que o ácido L-lático pode ser produzido a partir de glicose usando a L-lactato desidrogenase dependente de NAD derivada de Bifidobacterium.

[Exemplo 16] <Preparação de variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA/variante pGAP-ldh2>

Um transformante foi preparado ao introduzir o plasmídeo pGAP-ldh2 construído no Exemplo 14 na variante produtora de ácido D-lático preparada no Exemplo 6. Especificamente, o seguinte procedimento foi adotado.

Uma célula competente da variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA preparada no Exemplo 6 foi transformada com o plasmídeo pGAP-ldh2. 0 transformante obtido foi cultivado em uma placa de ágar de caldo LB Miller contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, desse modo fornecendo uma variante inserida de genoma MG16 5 5ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA/variante/pGAP-ldh2.

[Exemplo 17] <Produção de ácido L-lático por variante inserida de genoma MG1655Δpf IΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA/ variante pGAP-ldh2>

Similarmente ao exemplo 13, a produção de ácido L- lático a partir de glicose pela variante inserida de genoma MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA/variante/pGAP-ldh2 foi examinada.

O cultivo foi realizado por 18 horas em pressão atmosférica com uma taxa de aeração de 0,25 1/min, uma velocidade de agitação de 200 rpm, uma temperatura de cultura de 35°C, e um pH de 7,5 (ajustado com NaOH 24%) . Após o cultivo por 18 horas, a concentração de ácido L-lático no líquido de cultura foi 116,84 g/1.

Destes resultados, confirmou-se que o ácido L-lático pode ser produzido a partir de glicose como uma matéria- prima ao integrar o plasmídeo pGAP-ldh2 em uma variante de Escherichia coli produtora de ácido D-lático. A produção de ácido L-lático foi confirmada medindo a quantidade de ácido L-lático e a quantidade de ácido D-lático usando um F-Kit de ácido D-/L-lático (código de produto: 1112821, J.K. International Inc.).

[Exemplo 18] <Preparação de variante inserida de genoma MG16 5 5 Δp f 1 ΔmdhΔ aspΔ 11 dDΔ 1 dhA/ GAP 1 dh.2 >

O gene ldh2 foi substituído pelo gene IdhA da variante de Escherichia coli para a produção de ácido D-lático usada no Exemplo 15, e lldD, que é o gene uma enzima que catalisa a decomposição de ácido L-lático, foi interrompido, desse modo preparando uma variante de Escherichia coli para a produção de ácido L-lático (variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA). Especificamente, o seguinte procedimento foi adotado.

(Preparação de variante interrompida de gene IdhA)

Baseado na informação de gene de regiões de DNA genômico MG1655 de Escherichia coli adjacentes ao gene IdhA, quatro tipos de primer de oligonucleotídeo, AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC (Id. de Seq. N°.: 21), GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC (Id. de Seq. N° . : 22), GCTCTAGAGCATTCCTGACAGCAGAAGC (Id. de Seq. N°.: 51), e AACTGCAGTCGGCGTGTAGTAGTGAACC (Id. de Seq. N° . : 52), foram sintetizados. Usando estas primers, um plasmídeo pTHΔldhA para a interrupção de gene foi construído em uma maneira similar ao exemplo 1. Adicionalmente, uma célula competente de variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA foi transformada com o pTHΔldhA, e uma variante IdhA-deletada foi selecionada em uma maneira similar ao exemplo 2. A variante resultante foi nomeada "variante ΔldhA inserida de genoma MG16 5 5ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA".

(Preparação de revertente de gene did)

Baseado na informação de gene de regiões de DNA genômico MG1655 de Escherichia coli adjacentes ao gene did, dois tipos de primer de oligonucleotídeo, CAACACCAAGCTTTCGCG (Id. de Seq. N°.: 1) e TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC (Id. de Seq. N°. : 4), foram sintetizados. 0 PCR foi realizado usando estes primers e usando o DNA genômico MG1655 de Escherichia coli como um molde, e o fragmento de DNA resultante foi clivado com enzimas de restrição HíndIII e Xbal. Adicionalmente, um plasmídeo pTH18csl foi clivado com enzimas de restrição HindIII e Xbal, misturadas com o fragmento did, e os fragmentos foram então ligados usando uma ligase, desse modo construindo um plasmídeo pTHDLD. Adicionalmente, uma célula competente de variante inserida de genoma MG1655ΔpfIΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA foi transformada com o pTHDLD, e um revertente de did foi selecionado em uma maneira similar ao Exemplo 2. A variante resultante foi nomeada "variante ΔldhA inserida de genoma MG1655ΔpfIΔmdhΔasp/GAPldhA".

(Preparação de variante interrompida de gene lldD)

Baseado na informação de gene de regiões de DNA genômico de cepa MG1655 adjacente ao gene lldD, quatro tipos de primer de oligonucleotídeo, GGAAGCTTCAAATTGGCGTCTCTGATCT (Id. de Seq. N° . : 53), AAACCCGGGCCATCCATATAGTGGAACAGGAACGG (Id. de Seq. N° . : 54), GGGCTCGAGTGGCGATGACGCTGACTGG (Id. de Seq. N°. : 55) e CGTCTAGAACGGGTAAATCTGGTGGTGACCGTCACCCG (Id. de Seq. N° . : 56), foram sintetizados. Usando estes primers, um plasmídeo pTHΔlldD para a interrupção de gene foi construído em uma maneira similar ao Exemplo 1. Adicionalmente, uma célula competente de variante ΔldhA inserida de genoma MG1655ΔpfIΔmdhΔasp/GAPldhA foi transformada com pTHΔlldD, e uma variante deletada de lldD foi selecionada em uma maneira similar ao Exemplo 2. A variante resultante foi nomeada "variante ΔldhA inserida de genoma MG1655ΔpfiΔmdhΔaspΔlldD/GAPldhA". (Preparação de variante inserida de genoma de gene ldh2)

A sequência de aminoácido de L-lactato desidrogenase dependente de NAD de Bifidobacterium longum e a sequência base do gene da mesma já foram relatadas. Isto é, o gene codificando a L-lactato desidrogenase dependente de NAD (ldh2) é descrito em 555 a 1517 da sequência de genoma de Bifidobacterium no número de acesso Genbank M33585.

A fim de obter o gene (ldh2) codificando a L-lactato desidrogenase, dois tipos de primer de oligonucleotídeo, AAGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC (Id. de Seq. N° . : 57) e CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG (Id. de Seq. N° . : 50) , foram sintetizados usando o DNA genômico de Bifidobacterium longum (ATCC15707) como um molde. O PCR foi realizado usando estes primers, e o fragmento de DNA resultante foi clivado com as enzimas de restrição EcoRT e XbaT.

A fim de obter o promotor de GAPDH, dois tipos de primer de oligonucleotídeo, GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCG (Id. de Seq. N° . : 58) e CGGAATTCCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAG (Id. de Seq. N°. : 59), foram sintetizados usando o DNA genômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como um molde. O fragmento de DNA resultante foi clivado com as enzimas de restrição EcoRT e XbaT.

Um plasmídeo obtido ao clivar o pTHΔldhA obtido no Exemplo 15 com XbaT, o fragmento EcoRT-XbaT de ldh2 derivado de Bifidobacterium longum obtido como descrito acima, e o fragmento EcoRT-XbaT de promotor GAPDH derivado de Escherichia coli foram misturados, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pTHΔldhA::GAPldh2 foi recuperado das células bacterianas resultantes. Uma variante ΔldhA inserida de genoma MG1655ΔpfIΔmdhΔaspΔlldD/GAPldhA foi transformada com o plasmídeo obtido, e uma variante inserida de genoma ldh2 foi selecionada, por amplificação de PCR de ldh2, em uma maneira similar ao Exemplo 2. A variante obtida foi nomeada "variante inserida de genoma MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2".

[Exemplo 19] <Preparação de variante pGAP-cscA/inserida de genoma MG16 5 5Δpf1ΔmdhΔaspΔ1IdDΔIdhA/GAP1dh2 >

Um vetor de expressão para urn gene de sacarose hidrolase (invertase) foi introduzido na variante de Escherichia coli para a produção de ácido L-lático preparado do Exemplo 16, desse modo fornecendo uma variante de Escherichia coli que produz o ácido L-lático a partir de sacarose. Especificamente, o seguinte procedimento foi adotado.

Uma célula competente da variante inserida de genoma MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2 preparada no Exemplo 16 foi transformada com o plasmídeo pGAP-cscA construído no Exemplo 8, e o transformante obtido foi cultivado em uma placa de ágar de caldo LB de Miller contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, como resultado da qual uma variante de pGAP-cscA/genoma inserido MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2 foi obtida.

[Exemplo 20] <Preparação de Escherichia coli expressando D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Escherichia coli>

Baseado na informação de gene das regiões de DNA genômico da cepa MG1655 adjacente ao gene did, dois tipos de primer de oligonucleotídeo, CGGGTACCTTCGCCACCACAAGGAGTGGA (Id. de Seq. N° . : 60), GGTCTAGAGTCGACTTACTCCACTTCCTGCCAGTT (Id. de Seq. N° . : 61), foram sintetizados. O PCR foi realizado usando estes primers, e o fragmento de DNA resultante foi clivado com as enzimas de restrição KpnT e Sail. Este fragmento foi misturado com um fragmento obtido ao clivar o pGAP-cscA construído no Exemplo 8 com KpnT e SalT, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pGAP-cscA-dld(EC) foi recuperado das células bacterianas resultantes.

[Exemplo 21] <Preparação de Escherichia coli expressando D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Corynebacterium glutamicum>

A sequência de aminoácido de D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Corynebacterium glutamicum, e a sequência base do gene da mesma são descritas em 261009 a 259294 da sequência de genoma de Corynebacterium glutamicum no número de acesso Genbank BX927150.

A fim de obter o gene codificando a D-lactato desidrogenase dependente de FAD (did), dois tipos de primer de oligonucleotídeo, GCGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGACGCAACCAGGACAG (Id. de Seq. N° . : 62) e TGGGTACCTTAGGCCCAGTCCTTGTGCGGCGACGTGC (Id. de Seq. N°. : 63), foram sintetizados usando o DNA genômico de

Corynebacterium glutamicum (NBRC12168) como um molde. 0 Corynebacterium glutamicum (NBRC12168) está disponível do NITE Biological Resource Center. O PCR foi realizado usando estes primers, e o fragmento de DNA resultante foi clivado com uma enzima de restrição KpnT. Este fragmento foi misturado com um fragmento obtido ao clivar o pGAP-cscA construído no Exemplo 8 com KpnT, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pGAP-cscA-dld (CG) foi recuperado das células bacterianas resultantes.

[Exemplo 22] <Preparação de Escherichia coli expressando D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Zymomonas mobilis>

A sequência de aminoácido de D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Zymomonas mobilis e a sequência base do gene da mesma são descritas em 256658 a 258382 da sequência de genoma de Zymomonas mobilis no número de acesso Genbank AE008692.

A fim de obter o gene codificando a D-lactato desidrogenase dependente de FAD (did), dois tipos de primer de oligonucleotide©, GCGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGGTGCAGCTTCCTTC (Id. de Seq. N° . : 64) e GTGGTACCCTATCTCCAATAAGCGGCCTTGCTGGTATG (Id. de Seq. N° . : 65) , foram sintetizados, e o PCR foi realizado usando os primers e usando o DNA genômico de Zymomonas mobilis (ATCC 31821) como um molde. 0 fragmento de DNA resultante foi clivado com uma enzima de restrição KpnT. Este fragmento foi misturado com um fragmento obtido ao clivar pGAP-cscA construído no Exemplo 8 com KpnT, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pGAP-cscA-did(ZM) foi recuperado das células bacterianas resultantes.

[Exemplo 23] <Preparação de Escherichia coli expressando D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Xanthomonas campestris>

A sequência de aminoácido de D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Xanthomonas campestris e a sequência base do gene da mesma são descritas em 10284 a 8890 da sequência de genoma de Xanthomonas campestris no número de acesso Genbank AE012169.

A fim de obter o gene codificando a D-lactato desidrogenase dependente de FAD (did), dois tipos de primer de oligonucleotídeo, AACCCGGGCGGAGAAAGTCTTATGACTGATGGACTTCCCACCGC (Id. de Seq. N°.: 66) e ATCCCGGGTCACTCTGCGGGCGATGTGGGCAGCACCTTGCCCGGATTC (Id. de Seq. N° . : 67), foram sintetizados, e o PCR foi realizado usando os primers e usando o DNA genômico de Xanthomonas campestris (ATCC 33913) como um molde. 0 fragmento de DNA resultante foi clivado com uma enzima de restrição SmaT. Este fragmento foi misturado com um fragmento obtido ao clivar o pGAP-cscA construído no Exemplo 8 com Kpnl e aparando os locais de clivagem de enzima de restrição usando um DNA Blunting Kit (TAKARA cat. 6025), e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5α de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pGAP-cscA-dld(XC) foi recuperado das células bacterianas resultantes.

[Exemplo 24] <Preparação de Escherichia coli expressando D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Xanthomonas oryzae>

A sequência de aminoácido de D-lactato desidrogenase dependente de FAD derivada de Xanthomonas oryzae e a sequência base do gene da mesma é descrita em 4098235 a 4099662 da sequência de genoma de Xanthomonas oryzae no número de acesso Genbank AE013598.

A fim de obter o gene codificando a D-lactato desidrogenase dependente de FAD (did), dois tipos de primer de oligonucleotídeo, TTGGTACCGGAGAAAGTCTTATGACCGATGTACTTCCCACCGCAC (Id. de Seq. N° . : 68) e TTGGTACCTAGGCGGGCGGCAACACCTTGCCAGGATTCAAGATCCCA (Id. de Seq. N°. : 69), foram sintetizados usando o DNA genômico de Xanthomonas oryzae (JCM 20241) como um molde, e o PCR foi realizado usando-os. O fragmento de DNA resultante foi clivado com uma enzima de restrição KpnT. Este fragmento foi misturado com um fragmento obtido ao clivar o pGAP-cscA construído no Exemplo 8 com KpnT, e os fragmentos foram ligados usando uma ligase. Em seguida, uma célula competente da cepa DH5OÍ de Escherichia coli (nome comercial: DNA-903, Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com o produto de ligação, e um transformante que cresceu em uma placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina foi obtido. A colônia obtida foi cultivada em um meio líquido LB contendo 50 μg/ml de ampicilina durante a noite em 37°C, e um plasmídeo pGAP-cscA-dld(XO) foi recuperado das células bacterianas resultantes. JCM 20241 está disponível de Japan Collection of Microorganisms.

[Exemplo 25] <Pureza ótica de ácido L-lático produzido por Escherichia coli expressando D-lactato desidrogenase dependente de FAD com ou sem domínio de ligação de membrana de D-lactato desidrogenase>

A variante inserida de genoma MG1655ΔpfiΔmdhΔaspΔlldDΔfruRΔIdhA/GAPldh2 preparada no Exemplo 18 foi transformada com cada um dos seguintes plasmídeos, desse modo fornecendo as variantes de Escherichia coli que expressam D-lactato desidrogenases dependentes de FAD das quais as origens são diferentes uma da outra. (A): pGAP-cscA obtido no Exemplo 8 (B): pGAP-cscA-dld(EC) obtido no Exemplo 20 (C): pGAP-cscA-dld(CG) obtido no Exemplo 21 (D): pGAP-cscA-dld(ZM) obtido no Exemplo 22 (E): pGAP-cscA-dld(XC) obtido no Exemplo 23 (F): pGAP-cscA-dld(XO) obtido no Exemplo 24 Como pré-cultura, as variantes expressando D-lactato desidrogenase dependente de FAD foram respectivamente semeadas em frascos Erlenmeyer de 100 mL de volume equipados com defletores, cada qual continha 20 ml do líquido de pré-cultura mostrado na Tabela 11, e o cultivo foi realizado durante a noite em 35°C com agitação em 120 rpm. Em seguida, os líquidos de pré-cultura foram respectivamente adicionados, em uma quantidade de 1 ml, a frascos Erlenmeyer de 100 mL de volume equipados com defletores, aos quais 10 g de carbonato de cálcio (primeiro grau, Junsei Chemical Co., Ltd.) tinham sido adicionados e esterilizados previamente, e aos quais 20 ml do meio mostrado na Tabela 12 tinham sido adicionados. 0 cultivo foi realizado por 24 horas durante a noite em 35°C com agitação em 100 rpm. Tabela 11 Composição do líquido de pré-cultura pH 7,8 após autoclave (ajustado por NaOH 24%) Tabela 12 Composição do meio pH 8,0 após autoclave (ajustado por NaOH 24%)

Após o cultivo ter sido completado, o sobrenadante foi obtido por centrifugação. A pureza ótica foi calculada de acordo com a seguinte equação a partir da quantidade de 5 ácido L-lático e da quantidade de ácido D-lático no sobrenadante resultante como medido usando um F-Kit de ácido D-/L-lático (código de produto: 1112821, J.K. International Inc.). Pureza ótica (%e.e.) = 100 x (concentração de ácido L- 10 lático -) ácido D-lático de concentração/(concentração de ácido L-lático + concentração de ácido D-lático)

Os resultados são dados na Tabela 13. Como mostrado na Tabela 13, foi demonstrado que uma Escherichia coli expressando did derivado de Escherichia coli, derivado de 15 Corynebacterium glutamicum, ou derivado de Zymomonas mobilis, cada qual tem um domínio Lact-deh-membro, consegue particular alta pureza ótica dentro de um curto período de tempo. Tabela 13

As divulgações do Pedido de Patente Japonês N°. 2008- 237177 depositado em 16 de setembro de 2008, o Pedido de Patente Japonês N° . 2009-32042 depositado em 13 de fevereiro de 2009, e o Pedido de Patente Japonês N° . 2009- 5 32043 depositado em 13 de fevereiro de 2009 são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

Todas as publicações, pedidos de patente, e padrões técnicos mencionados neste relatório descritivo são incorporados aqui por referência na mesma extensão como se 10 cada publicação individual, pedido de patente, ou padrão técnico fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (15)

1. Escherichia coli produtora de ácido lático caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido L-lático, um gene da lactato desidrogenase dependente de NAD é introduzido na Escherichia coli produtora de ácido L-lático ou um promotor para o gene é substituído por outro promotor, e um Dld compreendendo um domínio Lact deh memb é introduzido na Escherichia coli produtora de ácido L-lático, ou em que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido D-lático, um LdhA é introduzido na Escherichia coli produtora de ácido D-lático ou um promotor para o LdhA é substituído por outro promotor, e um LldD tendo uma substituição de C para A, C para T ou C para G na posição 33 na ORF de um gene que codifica LldD é introduzido na Escherichia coli produtora de ácido D-lático.

2. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido D- lático, LldR é deletado na Escherichia coli produtora de ácido D-lático, ou Lox ou LctO é introduzido na Escherichia coli produtora de ácido D-lático ou um promotor do gene é substituído por outro promotor.

3. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido D- lático, o gene que codifica o LldD é um gene LldD mutado, representado por uma sequência de base de Id. de Seq. N°.: 41.

4. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido D- lático, LldR é deletado na Escherichia coli produtora de ácido D-lático, e Lox é introduzido na Escherichia coli produtora de ácido D-lático ou um promotor para o gene é substituído por outro promotor, ou Lox é introduzido na Escherichia coli produtora de ácido D-lático ou um promotor do gene é substituído por outro promotor.

5. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que um gene de LldD é um gene da Escherichia coli, um gene do Lox é um gene do gênero Enterococcus, e um gene de LctO é um gene do gênero Lactococcus.

6. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido D-lático, pelo menos um selecionado do grupo que consiste em Dld e Pfl é deletado.

7. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido L- lático, a L-lactato desidrogenase dependente de NAD é de uma bactéria do gênero Bifidobacterium.

8. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com a reivindicação 1 ou 7, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido L- lático, o Dld é de pelo menos um selecionado do grupo consistindo em Escherichia coli, um gênero Zymomonas e um gênero Corynebacterium.

9. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido L-lático, o Dld compreende ainda um domínio FAD-oxidase_C.

10. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 7, 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido L-lático, o Dld é pelo menos um selecionado do grupo consistindo em um microorganismo do gênero Zymomonas e um microorganismo do gênero Corynebacterium.

11. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 7, 8, 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que, em um caso no qual a Escherichia coli produtora de ácido lático é uma Escherichia coli produtora de ácido L-lático, pelo menos uma de LdhA, LldD ou Pfl é deletado.

12. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos um selecionado do grupo consistindo em Mdh e AspA é deletado.

13. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que pelo menos um selecionado do grupo consistindo em genes não PTS de sacarose e FruK é: introduzido na Escherichia coli produtora de ácido lático na parte externa; uma atividade promotora para genes não PTS de sacarose ou FruK que a Escherichia coli produtora de ácido lático possui no seu genoma é aumentada; ou um promotor para um gene não PTS de sacarose ou FruK é substituído por outro promotor.

14. Escherichia coli produtora de ácido lático, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que FruR é deletado.

15. Método para produção de ácido lático caracterizado por compreender: produzir ácido D-lático usando a Escherichia coli produtora de ácido lático, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou reivindicações 12 a 14; ou produzir ácido L-lático usando a Escherichia coli produtora de ácido lático, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 7 a 14.