BRPI0918806B1 - Composição de vacina compreendendo quitosana e antígeno do vírus de doença de newcastle (nvd) adaptada à administração ocular em ave, uso de quitosana e de nvd paraaumentar resposta imune em ave, bem como kit de vacinação de aves - Google Patents
Composição de vacina compreendendo quitosana e antígeno do vírus de doença de newcastle (nvd) adaptada à administração ocular em ave, uso de quitosana e de nvd paraaumentar resposta imune em ave, bem como kit de vacinação de aves Download PDFInfo
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Abstract
composição compreendendo quitosa para administração ocular de vacinas em aves. a presente invenção se refere a composições de vacina compreendendo quitosana e uma vacina que são administradas em espécies aviárias via rota ocular, e métodos ou programas de vacinação incluindo o uso da quisana para aumentar ou melhorar a imunudade mediada pela célula nas espécies aviárias e a persist~encia dos tecidos de aves de vacina.
Description
“COMPOSIÇÃO DE VACINA COMPREENDENDO QUITOSANA E ANTÍGENO DO VÍRUS DE DOENÇA DE NEWCASTLE (NVD) ADAPTADA À ADMINISTRAÇÃO OCULAR EM AVE, USO DE QUITOSANA E DE NVD PARA AUMENTAR RESPOSTA IMUNE EM AVE, BEM COMO KIT DE VACINAÇÃO DE AVES”
Campo da Invenção [001]A presente invenção se refere a composições de vacina compreendendo quitosana e uma vacina que são administradas em espécies aviárias via rota ocular, e métodos ou programas da vacinação incluindo o uso da quitosana para aumentar ou melhorar a resposta imune à vacina nas espécies aviárias.
Antecedentes da Invenção [002]As vacinas são as preparações de materiais antigênicos, administrados a um paciente para melhorar a resistência à infecção induzindo imunidade ativa a micro-organismos específicos, tais como bactérias, vírus ou parasitas. Vacinas podem ser co-administradas com adjuvantes para intensificar a resposta imune. Os exemplos de adjuvantes incluem imunoestimulantes químicos e polipeptídios que melhoram a resposta do sistema imune a antígenos. Tais adjuvantes podem incluir, por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, óleos vegetais e animais bem como óleos minerais, toxinas bacterianas, derivados de quitina e quitosana e assim por diante que são administrados com a vacina em uma quantidade suficiente para melhorar a resposta imune.
[003]As vacinas e os adjuvantes são geralmente administrados via injeções parenterais, tais como injeções subcutâneas ou intramusculares. A administração direta sobre a mucosa nasal de várias espécies de animais também pode ser realizada especialmente para tratar infecções das vias respiratórias superiores. Por exemplo, a Patente Européia EP 865 297B1 descreve a co-administração intranasal em ratos de antígenos de proteínas ou polissacarídeos de agentes patogênicos e quitosana como adjuvante. Estas composições intranasais são formuladas como pó seco na forma de microesferas, via aerossóis, gotas ou insuflações, e permitem o aumento tanto das respostas imunes da IgA humoral das mucosas como da IgG sistêmica em associação à várias administrações intranasais sucessivas.
[004]O Requerente descobriu agora que a quitosana usada em combinação
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2/27 com uma vacina para aves dentro do mesmo programa de vacinação tem o potencial de melhorar muito a resposta imune mediada pela célula, mantendo elevadas respostas imunes humorais e sistêmicas de pássaros vacinados quando administrado via a rota ocular. Além disso, foi descoberto que a quitosana atuava sobre a conjuntiva de aves e resultou em um aumento significativo da persistência da vacina dentro dos tecidos das aves.
Sumário da Invenção [005]A presente invenção se refere a composições de vacina para administração ocular às espécies aviárias, compreendendo uma ou mais vacinas e uma quantidade eficaz de adjuvante quitosana. A invenção também se refere a um método de imunização de espécies aviárias compreendendo administração por via ocular de composições de vacina em espécies aviárias, e a utilização de uma ou mais vacinas em combinação com quitosana para a produção de uma composição de vacina para administração ocular para imunizar eficientemente espécies aviárias contra doenças infecciosas. A presente invenção também se refere a um kit de vacinação para aves compreendendo as composições de vacina e um meio ou dispositivo para administração ocular da dita composição de vacina.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1: ilustra a barra cronológica da vacinação.
A Figura 2: ilustra o protocolo de rechamada de antígeno.
A Figura 3: mostra os níveis da produção de interferon gama de frango (Densidade Ótica) quando medido de 2 a 5 semanas após administração ocular de CEVAC® VITAPEST L (Ceva Phylaxia, Hungria) com ou sem quitosana.
[006]A Figura 4: mostra os títulos da cepa vacina para a doença de Newcastle (ND) expressada na dose de infecção de ovo (EID50) dentro de tecidos de aves de frangos SPF que receberam CEVAC® UNI L (Ceva Phylaxia, Hungria), ou CEVAC® VITAPEST L, com ou sem quitosana via a rota ocular.
[007]A Figura 5: mostra os títulos da cepa de vacina para a doença de Newcastle expressada na dose de infecção de ovo (EID50) dentro de tecidos de aves de galinhas poedeiras convencionais que receberam CEVAC® UNI L, ou CEVAC® VITAPEST L, com ou sem quitosana via a rota ocular.
[008]As Figuras 6A e 6B: mostram a imunocompetência e a imunidade
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3/27 específica mediada pela célula após vacinação de frangos SPF (Figura 6A) e galinhas poedeiras convencionais (Figura 6B) com vacina viva para a doença de Newcastle (NDV). Os pássaros foram vacinados com idade de um dia, via a rota ocular, com CEVAC® VITAPEST L sozinha (colunas pretas) ou em combinação com quitosana (colunas cinzentas). Os animais não vacinados são indicados por colunas brancas. Os esplenócitos foram estimulados com o mitógeno PMA/Iono (0,1 pg/ml), rechamada de antígeno gp-NDV (1 pg/ml) e os sobrenadantes das células estimuladas foram colhidos após 72 h de ativação. A produção de ChIFN γ foi determinada por ELISA de captura do ChIFN γ. Os resultados correspondem à média ± desvio padrão da densidade ótica (O.D) em cada ponto de tempo (n = 5). A média ± desvio padrão sem superescrito comum diferencia-se significativamente (P <0,05).
[009]As Figuras 7A e 7B: mostram a imunidade lacrimal mediada por anticorpo após a vacinação de frangos SPF (Figura 7A) e galinhas poedeiras convencionais (Figura 7B) com a vacina ND viva. Os pássaros foram vacinados com um dia de idade, via a rota ocular, com CEVAC® VITAPEST L sozinha (colunas pretas) ou em combinação com quitosana (colunas cinzentas). Os animais não vacinados são indicados por colunas brancas. Os dados representam a média ± desvio padrão de valores da absorbância (O.D.) determinada por ELISA em um determinado tempo pós-vacinação (n = 5). As amostras de lágrimas foram diluídas 1:4 para IgA/G e 1:32 para IgM. A média ± desvio padrão em pontos de tempo sem super-escrito comum diferencia-se significativamente (P <0,05). N.D. = não determinado, devido a quantidade limitada de amostras deixadas depois de IgA específico NDV e medições de IgG.
[010]As Figuras 8A e 8B: mostram a imunidade mediada por anticorpo biliar após a vacinação de frangos SPF (Figura 8A) e galinhas poedeiras convencionais (Figura 8B) com a vacina ND viva. Os pássaros foram vacinados com um dia de idade, via a rota ocular, com CEVAC® VITAPEST L sozinha (colunas pretas) ou em combinação com quitosana (colunas cinzentas). Os animais não vacinados são indicados por colunas brancas. Os dados representam a média ± desvio padrão de valores da absorbância (O.D.) determinado por ELISA em um determinado tempo pós-vacinação (n = 5). As amostras de bile foram diluídas 1:50. A média ± desvio padrão em pontos de tempo sem superescrito comum diferencia-se significativamente (P <0,05).
[011]As Figuras 9A e 9B: mostram a imunidade mediada por anticorpo
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4/27 duodenal após a vacinação de frangos SPF (Figura 9A) e galinhas poedeiras convencionais (Figura 9B) com a vacina ND viva. Os pássaros foram vacinados com um dia de idade com CEVAC® VITAPEST L sozinha (colunas pretas) ou em combinação com quitosana (colunas cinzentas). Os animais não vacinados são indicados por colunas brancas. Os dados representam a média ± desvio padrão de valores da absorbância (O.D.) determinado por ELISA em um determinado tempo pós-vacinação (n = 5). A resposta Ig foi medida em sobrenadantes não diluídos de ex vivo culturas de tecidos duodenais. A média ± desvio padrão em pontos de tempo sem superescrito comum diferencia-se significativamente (P <0,05).
Descrição Detalhada da Invenção [012]A presente invenção fornece uma composição de vacina para administração ocular em espécies aviárias, cuja composição compreende uma ou mais vacinas e uma quantidade eficaz de adjuvante quitosana. Como acima mencionado, foi surpreendentemente encontrado que, quando em co-administração ocular, a quitosana e uma vacina melhoram muito a resposta imune mediada pela célula de espécies aviárias e resulta em uma persistência mais longa da vacina em tecidos específicos dos pássaros vacinados. As composições de vacina da presente invenção são, desse modo, particularmente eficazes para melhorar a proteção de longo prazo de espécies aviárias contra doenças aviárias.
[013]O termo quantidade eficaz de adjuvante é bem entendido por aqueles versados na técnica, e inclui uma quantidade de uma quitosana sendo capaz de estimular a resposta imune contra os antígenos ocularmente administrados, isto é, uma quantidade que aumenta a resposta imune de uma composição de vacina ocularmente administrada, por exemplo, como medido quanto a níveis da produção de gama-interferon por esplenócitos e a persistência da vacina em tecidos de ave. Os aumentos significativos nos níveis da produção de gama-interferon e a persistência de tecidos de vacina foram observados na presença da quitosana. Como forma de exemplo, o aumento da resposta celular também pode ser evidenciado pelo teste de proliferação celular (medido pela incorporação da 3H timidina em células se dividem após estimulação de rechamada de antígeno), medindo a atividade citotóxica de células CTL em células alvo radiomarcadas (determinação da liberação do isótopo radioativo durante um período do tempo), ou via um teste de migração de macrófagos.
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5/27 [014]De acordo com a presente invenção, uma vacina pode ser de quaisquer micro-organismos aviários patogênicos ou não, tais como vírus, bactérias, qualquer outro parasita, ou antígenos. Estes podem ser micro-organismos vivos atenuados ou micro-organismos mortos inativados, micro-organismos completos ou subunidades de micro-organismos, micro-organismos quiméricos ou recombinantes inativados, microorganismos rompidos, micro-organismos mutantes, micro-organismos defeituosos, ou combinações dos mesmos. A vacina também pode ser um antígeno incluindo epítopos ou partes antigênicas da estrutura do microrganismo, por exemplo, vírus, bactérias ou parasitas, tais como as preparações de proteínas antigênicas de agentes patogênicos, proteínas de recombinante, antígeno preferivelmente viral, tais como proteínas de capsídeo virais, proteínas de parede de célula, peptídeos, ou partes de bacteriano ou estrutura de parasita, tais como polissacarídeo, lipopolissacarídeos e glicoproteínas. A vacina também pode ser um DNA ou DNA recombinante que produz o antígeno de agentes patogênicos em células após introdução do DNA. Os antígenos podem ser fornecidos de uma forma purificada ou não purificada.
[015]Quando a vacina é um microrganismo vivo atenuado (replicativo), tal como vírus, bactérias ou outro agente patogênico de ave, o agente patogênico atenuado não conserva as propriedades patogênicas, e é capaz de replicação. A atenuação pode vir do processo de atenuação natural ou artificial. A atenuação artificial é geralmente obtida usando várias técnicas que incluem passagens em animais vivos ou em vários meios naturais incluindo órgãos, células, ovos embrionados, etc. A atenuação artificial também pode ser obtida secando de órgãos infeccionados, envelhecendo de culturas, adaptação a temperaturas baixas ou determinadas condições de cultura, eliminações genéticas, etc.
[016]A vacina também pode ser de micro-organismos mortos inativados. A preparação de vírus inativados para vacinação é geralmente conseguida via meios químicos ou físicos. A inativação química pode ser realizada tratando vírus, por exemplo, com enzimas, formaldeído, β-propiolactona, etileno-imina ou um derivado do mesmo. O vírus inativado assim obtido pode ser neutralizado ou estabilizado posteriormente. Inativação física pode ser realizada submetendo-se o vírus à radiação rica em energia, tais como luz UV, raios-X ou radiação gama.
[017]Tais micro-organismos atenuados ou inativados, por exemplo, os vírus,
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6/27 as bactérias ou outros parasitas de aves também podem ser comprados de fontes comerciais.
[018]A vacina pode ser dos tipos homóloga (tal como vírus de frango para proteger frangos) ou heteróloga (tal como vírus de peru para proteger frangos). Alternativamente, as preparações de vacina podem compreender uma combinação de antígenos vivos com anticorpos específicos, chamados vacinas de imuno complexos.
[019]De acordo com a presente invenção, a vacina ou antígeno pode ser derivado de vírus responsáveis por doenças aviárias comuns como descrito por G.D. Butcher, J.P. Jacob, e F.B. Mather (PS47, Veterinary Medicine-Large Animal Clinical Sciences Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences Universidade da Flórida; maio de 1999), tal como Varíola de Ave, Doença de Newcastle, Bronquite Infecciosa, Bronquite de Codorna, Leucose Linfoide, Doença de Marek, Doença Bursal Infecciosa, Laringotraqueíte Infecciosa, Síndrome de Querda de Ovo, Reovirose, Tenosinovite Infecciosa, Encefalomielite Aviária, Síndrome da Cabeça Inchada, Rinotraqueíte de peru ou Influenza aviária, de bactérias responsáveis por micoplasmose, pasteurelose, salmonelose, bordetelose, etc., e/ou de outros parasitas de aves responsáveis por coquidiose, campilobacteriose. A vacina preferida usada na composição de vacina da presente invenção compreende a cepa completa viva de vírus atenuado.
[020]Preferivelmente a vacina é derivada do vírus de Doença de Newcastle (NDV) ou do vírus responsável da Doença de Marek, isto é, o vírus de Doença de Marek (MDV) ou vírus de Herpes de peru (HVT). Também, HVT recombinante (rHVT) e MDV recombinante (rMDV) podem ser usados. Estes vírus recombinantes foram geneticamente modificados pela incorporação no genoma do vírus de pelo menos uma seqüência heteróloga de ácido nucleico, isto é, DNA que corresponde a um gene ou parte do mesmo não idêntica à seqüência de ácido nucleico de um gene naturalmente presente em HVT ou MDV. Alternativamente, o rHVT ou rMDV podem ser geneticamente modificados pela incorporação no genoma do vírus de uma seqüência homóloga de ácido nucleico, isto é, DNA que corresponde a um gene ou parte do mesmo idêntica de um gene naturalmente presentes em HVT ou MDV.
[021]A quitosana é um derivado da quitina e corresponde a um polissacarídeo linear composto de β- (1 -4) - D-glicosamina ligada aleatoriamente distribuído (unidade
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7/27 de desacetilado) e N-acetil-D-glicosamina (unidade acetilada). A quitosana é produzida comercialmente pela desacetilação da quitina, sendo o elemento estrutural no exoesqueleto de crustáceos. O grau da desacetilação pode ser determinado pela espectroscopia de RMN. Por exemplo, o grau da desacetilação da quitosana comercial está variando de 60-100%.
[022]A quitosana usada nas composições de vacina da presente invenção pode ser produzida da quitina por desacetilação a um grau de maior do que 40%, preferivelmente entre 50% e 90%, e mais preferivelmente entre 70% e 95%, desacetilação. Tais quitosanas desacetiladas estão comercialmente disponíveis sob a designação comercial Sea Cure+ glutamato de quitosana da Protan Biopolymer A/S, Drammen, Noruega. O peso molecular da quitosana pode estar entre 10 kD e 500 kD, preferivelmente entre 50 kD e 300 kD e mais preferivelmente entre 100 kD e 300 kD.
[023]De acordo com a presente invenção, a quitosana pode ser usada como adjuvante eficaz na forma de Quitosana Mono Carboxi Metilada (MMC) também denominada Carboxi Metil Quitosana (CMC) ou na forma de Hidroxicloreto de Quitosana (HCl Quitosana). A HCl Quitosana é bem conhecida na técnica e é vendida, por exemplo, pela Kraeber Gmbh & Co.
[024]Por exemplo, as concentrações da HCl Quitosana usada nas composições de vacina pode variar de 0,1% a 5%, e preferivelmente de aproximadamente 0,5% ou de aproximadamente 1%.
[025]As composições de vacina de acordo com a presente invenção podem ser usadas na imunização eficaz de espécies aviárias contra doenças aviárias infecciosas. Com efeito, como acima mencionado, encontrou-se que pela administração ocular, estas composições de vacina melhoraram muito a resposta imune mediada pela célula de aves bem como a persistência da vacina em numerosos tecidos de aves. De fato, a persistência da vacina em tecidos de aves foi observada uma semana após vacinação, em tecidos de aves que incluíam a conjuntiva, pulmões, baço, traquéia, trato digestivo, tais como duodeno, pâncreas e tonsilas cecais. Além disso, tal persistência foi mantida cinco semanas após vacinação, particularmente na conjuntiva, pulmões, duodeno, pâncreas e tonsilas cecais.
[026]As espécies aviárias que podem ser ocularmente administradas com as composições de vacina da presente invenção incluem, por exemplo, frangos, perus,
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8/27 gansos, patos, faisões, codornizes, ou pombos e mais geralmente aves criadas, aves poedeiras ou aves de criação.
[027]De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um uso de composições de vacina tal como definido aqui em um método de vacinação aviária contra infecções aviárias, cujo método compreende administração por via ocular a uma ave paciente de uma composição de vacina compreendendo uma vacina em conjunto com uma quantidade eficaz do adjuvante quitosana.
[028]De acordo com a presente invenção, a quantidade eficaz de quitosana e a vacina podem ser administradas separadamente ou simultaneamente via colírios, borrifos ou aerossóis. Alternativamente, a quitosana e a vacina são administradas em espécies aviárias em sequência, a quitosana é administrada antes da vacina ou posteriormente à vacina.
[029]A presente invenção também se refere ao uso de uma quantidade eficaz de quitosana e vacina na preparação de uma composição de vacina para aumentar a resposta imune da ave contra um agente patogênico de aves em que a quitosana e uma vacina são administradas a aves via colírios, borrifos ou aerossóis, e em que a resposta das aves mediada por célula e a persistência do agente patogênico dentro de tecidos de aves são aumentados. Como acima mencionado, vacina pode ser um parasita, um vírus, ou bactérias das aves. Mais precisamente, a vacina pode ser um microrganismo atenuado vivo, um microrganismo inativado morto, um microrganismo atenuado ou inativado completo, subunidades do mesmo, ou combinações do mesmo. Também, de acordo com a presente invenção, a quitosana e a vacina podem ser administradas separadamente ou simultaneamente em espécies aviárias. Quando a quitosana e o agente patogênico são administrados em sequência, a quitosana então pode ser administrada antes da vacina ou posteriormente à vacina.
[030]Além disso, de acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um uso de uma composição de vacina como definido aqui um método de melhorar a resposta imune protetora mediada pela célula e a persistência da vacina em tecidos de aves pela administração ocular em espécies aviárias de uma composição de vacina compreendendo uma vacina e uma quantidade eficaz de adjuvante quitosana como anteriormente definido.
[031]A presente invenção também se refere a um método de imunização de
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9/27 espécies aviárias compreendendo uma etapa de administração, nos olhos de espécies aviárias, a composição de vacina como descrito em cima. A presente invenção também se refere a um método para aumentar a imunidade mediada pela célula nas espécies aviárias e a persistência da vacina dentro de tecidos de aves administrando uma ou mais vacinas em combinação com uma quantidade eficaz da quitosana nos olhos de espécies aviárias. A vacina e a quitosana podem ser administradas separadamente, em sequência ou simultaneamente.
[032]Também, de acordo com o método da presente invenção, a administração ocular pode ser realizada via borrifo, aerossol ou colírio. Preferivelmente, tal administração ocular é realizada após diminuição de anticorpo de derivado produtor.
[033]Bem mais preferivelmente, um intensificador de vacinação é também conduzido para estimular a resposta imune de aves que já foram submetidas à vacinação no ovo ou em poucos dias de idade que assim induz um estímulo mais elevado da resposta imune. Tal intensificação de vacinação pode ser realizada de 1 dia a 4 semanas de idade, posteriormente ou concomitantemente à primeira imunização.
[034]As composições de vacina oculares de acordo com a presente invenção podem ser formuladas como líquidos ou pó seco, para a administração como aerossóis, borrifos ou colírios. As composições de vacina podem ser assim administradas a aves borrifando diretamente na cabeça das aves. Alternativamente, uma ou várias gotas da composição de vacina podem ser colocada diretamente nos olhos de cada indivíduo tanto pássaro como humano. As composições preferidas de acordo com a presente invenção são formuladas como colírios na forma de líquidos.
[035]Composições para administração como aerossóis, colírios ou borrifos podem conter ou mais excipientes do tipo normalmente incluído em tais composições, por exemplo, preservativos, agentes de ajuste de viscosidade, agentes de ajuste de tonicidade, agentes bloqueadores lacrimais, agentes tampão, estabilizadores, transportadores, adjuvantes, e assim por diante, para preparação da administração ocular. Para assegurar que a quitosana permanece solúvel em um meio aquoso, e assegurar também que o antígeno não seja adversamente afetado por um pH altamente ácido, uma solução para administração ocular preferivelmente tem um pH variando de 5,5 a 6,5. Os transportadores podem ser qualquer um dos diversos tampões aquosos bem conhecidos daqueles versados na técnica, tal como tampões de fosfato, por exemplo.
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Os adjuvantes adicionais podem ser usados. Estes são bem conhecidos na técnica e podem incluir as emulsões de óleo, sais de alumínio ou géis, tais como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, saponina, vitaminas, extratos da parede bacteriana, polímero a base de ácido poliacrílico, tal como carbopóis, polímeros em bloco não iônicos, aminas de ácido graxo, tais como avridina e DDA, polímero a base de dextrano, tal como sulfato de dextrano e dextrano DEAE, microcápsulas biodegradáveis, lipossomas, estimuladores imunes virais, tais como MDP, LPS, e glicanos.
[036]A presente invenção também fornece um produto ou um kit de vacinação para aves compreendendo um meio para dispensar as composições de vacina ocular compreendendo uma vacina e uma quantidade eficaz da quitosana. Mais precisamente, o kit para vacinação de aves compreende um dispositivo de distribuição adaptado para dispensar a composição de vacina diretamente nos olhos dos pássaros. Tal dispositivo de distribuir, por exemplo, pode tomar a forma de um aerossol, um spray ou sistema de gotejamento nos olhos, e pode ser combinado para dispensar só uma dose única, ou uma multiplicidade de doses nos olhos das aves. O kit de vacinação de aves pode compreender reservatórios separados que respectivamente compreendem uma quantidade eficaz da quitosana e da vacina. O kit de vacinação de aves de acordo com a presente invenção pode compreender também instruções técnicas com a informação sobre a administração e a dosagem da composição farmacêutica.
[037]A vacina pode ser administrada em uma quantidade eficaz para estimular a resposta imune mediada pela célula e aumentar a persistência da vacina, tal como, por exemplo, do vírus da vacina cepa nas espécies aviárias. Por exemplo, a vacina pode ser administrada a aves em uma ou várias doses, cada dose contendo, por exemplo, 105 para 108 EID50.
[038]As vacinas vivas atuais são normalmente limitadas devido à presença em pássaros recentemente incubados de um pouco de proteção contra agentes patogênicos fornecidos pela transmissão do anticorpo de derivado maternal (MDA), transferido via a gema de ovo e posteriormente reabsorvido e presente no soro de pintos. Estes MDA podem interferir com a vacinação neutralizando as vacinas vivas. Por conseguinte, a resposta imune à vacinação pode ser atrasada e/ou limitada em frangos convencionais, como anteriormente observado a nível sistêmico.
[039]As vacinas de acordo com a presente invenção são assim
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11/27 preferivelmente administradas após a diminuição do MDA, permitindo assim a indução de uma boa resposta imunológica antes que os pássaros sejam provavelmente expostos a uma cepa virulenta de NDV. Bem mais preferivelmente, uma vacinação intensificada é realizada em 2 ou 3 semanas de idade de acordo com o declínio do MDA.
[040]Como mostrado com mais detalhes nos Exemplos abaixo, os experimentos de vacinação foram conduzidos em quatro grupos de SPF (Agente patogênico Específico livre) ou camada convencional um dia velhos frangos (Figura 1). As composições de vacina foram administradas a todos os grupos de frangos via a rota ocular via uso de um colírio. O grupo denominado “Frangos Negativos” não recebeu nenhuma vacina. Os segundos e terceiros grupos foram vacinados com uma dose de CEVAC® UNI L ou com uma dose de CEVAC® VITAPEST L ambos correspondendo ao vírus vivo atenuado da Doença de Newcastle. A quitosana também foi usada como adjuvante. Só os Negativos e os CEVAC® VITAPEST L foram vacinados com ou sem adjuvante para confirmar que a quitosana surpreendentemente efetua tanto na imunidade mediada pela célula como na persistência do vírus da vacina em tecidos de ave. As amostras foram coletadas cada semana da primeira à quinta semana. Foi conduzida avaliação e a confirmação da imunidade local (BALT).
[041]Particularmente, o Requerente demonstrou que a ativação de rechamada de antígeno é particularmente eficiente. Com efeito, os esplenócitos de frangos vacinados foram coletados de 2 a 5 semanas pós-vacinação (p.v.) e postos em contato com a proteína do vírus da doença de Newcastle para avaliar o nível da produção de gama-interferon (ChIFN γ). A medição de gama- interferon de frango é realizada por densidade ótica (O.D.) com o uso de um kit ELISA. O nível da produção de ChIFN γ indica o nível da estimulação de esplenócitos em pássaros vacinados, indicando assim os níveis da imunidade mediada pela célula (Figura 2).
[042]Além disso, a vacinação ocular de aves de acordo com a presente invenção foi demonstrada no Exemplo 3 abaixo para resultar em efeitos surpreendentemente altos sobre a imunidade mediada pela célula. Sem qualquer limitação, o efeito positivo da quitosana na imunidade específica mediada pela célula, por exemplo, foi evidenciado contra o vírus de doença de Newcastle, durante a administração ocular. Foi mostrado que os resultados da produção de ChIFN γ no grupo de CEVAC® VITAPEST L e o CEVAC® VITAPEST L com o grupo de quitosana (Figura 3). CEVAC®
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VITAPEST L com o grupo de quitosana. Foi mostrado como tendo um nível de imunidade mediado por célula mais alto do que o grupo de CEVAC® VITAPEST L entre a segunda e a quinta semana pós-vacinação de frangos SPF. Esta diferença foi estatisticamente significativa na semana 2.
[043]Além disso, demonstrou-se que a administração ocular de vacina com a quitosana como adjuvante induziu uma persistência mais longa da cepa do vírus da vacina em tecidos de frangos, tanto em frangos SPF como em crias de galinhas poedeiras convencionais (Figura 4). Como mostrado no Exemplo 2 abaixo, a presença do vírus de doença de Newcastle após a vacinação ocular de frangos SPF foi avaliada por experimentos de PCR em tempo real em vários órgãos, isto é, conjuntiva, pulmão, traquéia, duodeno, pâncreas, tonsilas cecais e baço coletados nas semanas 1 e 5 após vacinação ocular dos frangos.
[044]A replicação do vírus da cepa da vacina foi avaliada nestes vários órgãos primeiro em frangos SPF. Na primeira pós-vacinação de semana de frangos SPF, o mesmo nível da replicação viral do vírus da vacina de CEVAC® UNI L e do vírus da vacina de CEVAC® VITAPEST L na conjuntiva, pulmão e baço foi observado. O vírus da vacina de CEVAC® UNI L duplicado essencialmente na traquéia, com uma diferença estatisticamente significativa com CEVAC® VITAPEST L. O vírus da vacina de CEVAC® VITAPEST L duplicado essencialmente no trato digestivo, tal como duodeno, pâncreas e tonsilas cecais, com uma diferença estatisticamente significativa com CEVAC® UNI L. Na semana 5 após vacinação ocular dos frangos, ambas as cepas do vírus da vacina foram duplicadas na conjuntiva mas só um frango foi positivo no grupo de CEVAC® UNI L. O vírus da vacina de CEVAC® VITAPEST L duplicado em outros órgãos também mas não CEVAC® UNI L.
[045]Similarmente, o Requerente evidenciou na persistência da cepa do vírus da vacina em crias de galinhas poedeiras convencionais. Particularmente, foi mostrado que o nível da replicação é mais alto no grupo de CEVAC® UNI L na primeira semana a após vacinação ocular dos frangos. Quando a quitosana é usada como adjuvante, o vírus é isolado em mais órgãos e por um período de tempo mais longo. Na semana 5, após vacinação ocular dos frangos, as duas cepa do vírus da vacina são isoladas somente na conjuntiva de algumas galinhas poedeiras convencionais vacinadas (Figura 5).
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13/27 [046]Finalmente, o requerente demonstrou no Exemplo 4 abaixo que a imunidade humoral induzida por várias vacinas em aves poedeiras domésticas não foi realçada ao contrário do sendo geralmente observado em mamíferos, mostrando assim um efeito distintivo específico da composição de vacina com a quitosana quando administrado em aves via a rota ocular.
[047]A invenção é ilustrada, mas sob nenhum modo limitada, pelos seguintes Exemplos.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Materiais e Métodos
Exemplo 1.1: Frangos [048]Frangos SPF Leghorn e galinhas poedeiras convencionais brancas (SSL: venda ligada ao sexo) foram incubados de ovos fornecidos por Lohmann Valo (Cuxhaven, Alemanha) e chocadeira Wijverkens (Halle, Bélgica), respectivamente. Os ovos de poedeiras convencionais foram obtidos de um grupo criador de 28 semanas que recebeu o seguinte planejamento de vacinação ND: vacinação em 4 e 8 semanas de idade com Clone de NOBILIS 30 (Intervet) seguido por uma intensificação em 16 semanas de idade com NOBILIS Newcavac (vacina inativada, Intervet). Após incubação, todos os pássaros foram mantidos em isoladores com nível de biossegurança 3 (BSL3) e os experimentos nos animais foram conduzidos sob a autorização e a supervisão dos Comitês de biossegurança e bioéticas no Instituto de Pesquisa Veterinário e Agroquímico, de acordo com as regulações nacionais e européias.
Exemplo 1.2: Vacina, adjuvante e cepa de provocação.
[049]CEVAC® VITAPEST L atenuou a vacina e a quitosana (hidrocloreto de quitosana) o adjuvante foi fornecido por Ltd de CEVA-PHYLAXIA Veterinary Biologicals Co (Hungria). A vacina é baseada no assintomático a cepa de PHY.LMV.42 (Meszaros J. Aerosol-vaccination contra a doença de Newcastle. Deut Tierarztl Woch 1991; 98:117-164; Meszaros J, Szemeredi M, Tamasi G. Immunization de frangos de um dia contra doença de Newcastle. Vet de Acta 1992 Suspenso; 40:121 -127), pertencendo a genótipo I (Czegledi A, Ujvari D, Somogyi E, Wehmann E, Werner O, categoria de tamanho de genoma de Lomniczi B. Third de aves paramyxovirus sorotipo 1 (vírus de doença de Newcastle) e implicações evolutivas. Vírus Res 2006; 120:36-48). A batelada de vacina foi reconstituída na salina tamponada pelo fosfato (tampão de PBS)
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14/27 para adquirir 1 dose em 50 μΙ, que corresponde a = 106 EiDõo/dose. O hidrocloreto de quitosana é um sal de cloreto de um heteropolissacarídeo binário não ramificado consistindo das duas N-acetil-D-glicosamina unidades e D-glicosamina. Foi obtido pela desacetilação parcial da quitina que normalmente leva a um grau da desacetilação de 70 por cento a 95 por cento. A quitosana foi dissolvida no tampão de PBS em uma concentração final de 0,5% (w/v) e foi usada para reconstituir e diluir a vacina à concentração final. A cepa de Chimalhuacan NDV usada para o desafio foi isolada no México (Calderon NL, Galindo-Muniz F, Ortiz M, Lomniczi B, Fehervari T, MÃO ESQUERDA de Paasch. Trombocitopenia em Doença de Newcastle: avaliação hematológica e estudo histológico de tutano de osso. Vet de Acta 2005 Suspenso; 53 (4):507-513) e pertence ao genótipo da Classe II V. É uma cepa de viscerotrópico de velogênico com um ICPI de 1,89. A inoculação ocular Oculo-nasal ou direta de 105 EID50 desta cepa induz 100% da mortalidade dentro de 3-6 dias em SPF e frangos de grelha comerciais maternalmente imunes desafiados dentro de 3 para 6 semanas da idade (observação pessoal).
Exemplo 1.3: Mitógenos e antígenos NDV [050]Os mitógenos forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina (Iono) foram comprados da Sigma (Bélgica). Os antígenos de revocação de NDV foram preparados da cepa NDV de La Sota como anteriormente descrito (Lambrecht B, Gonze M, Meulemans G, van den Berg T. Assessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection of chicken interferon-gamma in response to mitogen and recall Newcastle disease viral antigen stimulation. Avian Path 2004; 33:343-350) e glicoproteínas (gp-NDV) denominadas NDV.
Exemplo 1.4: Quantificação da distribuição no tecido e da replicação da vacina cepa [051]As amostras de tecidos foram coletadas da conjuntiva da pálpebra inferior que foi mostrada ser mais suscetível ao NDV (Nakamura K, Ohta Y, Abe Y, Imai K, Yamada M. Pathogenesis da conjuntivite causada por vírus de doença de Newcastle em frangos livres patógenos específicos. Caminho de aves 2004; 33 (3):371-376) traquéia, pulmão, baço, pâncreas, duodeno e tonsilas cecais e manteve-se congelado até o processamento. A distribuição de tecido e a replicação da cepa de vacina de CEVAC® VITAPEST L foram determinadas por QRRT-PCR específico para CEVAC®
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VITAPEST L que permite o descobrimento de 102 EID50 por reação (104·18 EID50 por 20 mg de tecido). Os resultados foram expressos como o título da cepa de vacina por 20 mg de tecido. A qualidade da amostra e o procedimento de extração de RNA foi validada pelo uso de α-actina aviária como gene protetor como descrito por Van Borm S et al., A universal avian endogenous real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction control and its application to avian influenza diagnosis and quantification. Avian Dis 2007;51:213-220.
Exemplo 1.5: Quantificação da imunocompetência e da imunidade específica NDV mediada pela célula [052]A imunocompetência e a imunidade específica NDV mediada pela célula foram investigadas pela ativação antigênica mitogênica e NDV de linfócitos de baço respectivamente. Resumidamente, os baços foram assepticamente removidos dos frangos e os esplenócitos foram isolados e ativados por mitógenos (0,1 pg/ml PMA/Iono), como o controle positivo da ativabilidade de esplenócitos ex vivo, ou NDV antígenos de rechamado (gp-NDV) (1 pg/ml). As respostas celulares foram expressas como a densidade ótica (O.D.) os valores e uma O.D. igual a ou maior do que 0,1 foram considerados como evidência de ativação significativa.
Exemplo 1.6: Quantificação do NDV humoral específico e da imunidade local mediada por anticorpo [053]A imunidade humoral específica NDV foi avaliada pelo teste de inibição da hemoaglutinação (HI) e por IgG específico para NDV, IgA e IgM ELISAs. A imunidade mediada por anticorpo local ao NDV foi medida nas lágrimas, pulmão, bile e duodeno por ELISA.
Exemplo 1.7: Quantificação de excreção orofaríngea e da cloaca da cepa de NDV de provocação [054]Os esfregaços de algodão orofaríngeo e da cloaca foram imersos em 1 ml do tampão de amostragem de Infusão de Coração e Cérebro (37 g dissolvidos em 1 litro de água destilada) (Becton Dickinson Benelux, Bélgica) complementado com antibióticos (10.000 IU/ml de penicilina, 2 mg/ml de estreptomicina, 1 mg/ml dd gentamicina e 650 pg/ml de canamicina). Os esfregaços foram mantidos em -80 °C até a análise adicional. Para a análise quantitativa pela reação de cadeia de polimerase por transcrição reversa em tempo real (QRRT-PCR), o RNA foi extraído de 50 pl de
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16/27 esfregaços imersos que se usou o kit MagMAX 96 AI/ND RNA viral Ambion (Applied Biosystems, Lennik, Bélgica) em um processador magnético de partícula King-Fisher (Thermo Científico) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA purificado foi eluído em 50 pl de tampão de eluição.
[055]O número de cópias genéticas matrizes da cepa de provocação de Chimalhuacan NDV foi determinado pela reação de cadeia de polimerase quantitativa por transcrição reversa em tempo real (QRRT-PCR) como descrito em cima com modificações menores. Resumidamente, após uma etapa de transcrição reversa inicial e uma etapa de Taq-ativação de partida quente, 50 ciclos (95°C de 15 segundos, 54°C de 34 segundos, 72°C de 10 segundos) foram executadas em um Termociclador Applied Biosystems 7500 de PCR em tempo real. Os iniciadores (M+4100 e M 4220) e sondas de MGB-Taqman (M+4169FAM-TAMRA) influíram no gene Matriz e foram sintetizados por Eurogentec (Liège, Bélgica). O título viral de cada amostra foi determinado em relação uma curva padrão consistindo de RNA viral total da cepa de Chimalhuacan NDV. Esta curva padrão esteve incluída em cada corrida. O limiar de sensibilidade de NDV QRRT-PCR específico para a cepa de Chimalhuacan NDV (R 2 = 0,998, Eficiência = 94,17%) foi determinado em 101 EID50 por reação, baseada em resultados da curva padrão. Ele significa que as reações QRRT-PCR são 102·7 EID50 acima completamente comparáveis por ml de esfregaços e comparações quantitativas possíveis. Os resultados foram expressos como o título da cepa de provocação por ml de esfregaços.
[056]Além disso, a qualidade da amostra e o procedimento de extração de RNA foi validado pelo uso de α-actina aviária como descrito por Van Borm S et al. A universal avian endogenous real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction control and its application to avian influenza diagnosis and quantification. Avian Dis 2007;51:213-220.
Exemplo 1.8: Projeto Experimental [057]Dois experimentos semelhantes foram conduzidos em frangos SPF (Experimentos I e II). 105 frangos SPF de um dia da idade, foram divididos em três grupos de 35 em isoladores BSL-3. Dois grupos foram vacinados no mesmo dia, pela rota oculo-nasal com uma dose única da vacina de CEVAC® VITAPEST L adjuvada ou não com a quitosana de 0,5 %, respectivamente. Os experimentos semelhantes são
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17/27 conduzidos pela administração ocular direta (dados não mostrados). O terceiro grupo permaneceu não vacinado e serviu do grupo de controle negativo. Pós-vacinação de dois dias (p.v.) os pintos foram humanamente sacrificados para retirar o sangue, a bile e o duodeno. De 1 a 5 semanas p.v., em intervalos semanais, as lágrimas foram coletadas e os mesmos animais foram escolhidos para coleta de sangue, baço, bile e duodeno. Nas semanas 1 e 5, a conjuntiva, a traquéia, o pulmão, o pâncreas e os tonsilas cecais foram adicionalmente retirados em um dos experimentos. Nas semanas 3 e 5, a lavagem do pulmão foi coletada de frangos adicionais de cada grupo após eutanásia por injeção de Nembutal (CEVA Santé Animale). Cinco pássaros por grupo foram usados em cada etapa de tempo. No experimento II, as lágrimas, o sangue, o baço, a bile e o duodeno foram escolhidos em 2, 3, 4 e 5 semanas p.v.
[058]Dois experimentos adicionais também foram conduzidos em crias de galinhas poedeiras convencionais (Experimentos III e IV). Com um dia da idade, as crias de 90 galinhas poedeiras convencionais foram destinadas a 3 grupos de 30 pintos cada um em isoladores BSL-3. No mesmo dia, dois grupos foram vacinados como anteriormente descrito; o terceiro grupo permaneceu não vacinado e serviu do grupo de controle negativo. A organização de experimento do experimento III foi semelhante para experimentar I, exceto que a lavagem do pulmão foi coletada só em 5 semanas p.v. No experimento IV, as lágrimas, o sangue, o baço, a bile e o duodeno foram escolhidos em 2, 3, 4 e 5 semanas p.v.. Em 5 semanas da idade, 10 frangos de cada grupo foram desafiados com 105 EID5O/200 pl de Chimalhuacan NDV cepa pela rota oculo-nasal. Os pássaros foram individualmente identificados. Após desafio, os frangos foram monitorados diariamente para sintomas clínicos (o edema da cabeça, depressão, prostração e sinais nervosos) e mortalidade. O orofaríngeo e os esfregaços de cloaca foram tomados em 2, 4, pós-desafio de 7 e 10 dias (p.ch).. Em 11 dias p.d., os frangos sobreviventes foram eutanizado e as amostras de sangue foram coletadas. O baço e o duodeno foram tomados de 5 frangos por grupo.
Exemplo 1.9: Análise Estatística [059]As análises estatísticas foram executadas como anteriormente descrito usando softwares Minitag 13 e STATA 10 (programas estatísticos do Windows 2000) e as diferenças foram consideradas como significativas em P <0,05.
Exemplo 2: Distribuição de tecido e replicação de cepa de vacina
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18/27 [060]Todas as amostras de órgão mostraram o sinal de amplificação positivo (Ct <40) para o controle de amplificação endógeno com α-actina, validando a sua qualidade adequada e pureza de RNA.
[061]O vírus de CEVAC® VITAPEST L foi detectado em todas as amostras de órgão dos frangos SPF vacinados em 1 semana p.v. (Tabela 1). Em 5 semanas p.v., a cepa de vacina só foi detectada na conjuntiva, pulmão, baço, duodeno, pâncreas e tonsilas cecais de alguns frangos. Quando a quitosana foi usada, a cepa de vacina era mais freqüentemente detectada; contudo, não houve nenhuma diferença estatística entre os títulos virais. Uma semana após a vacinação das crias de um dia de galinhas poedeiras convencionais, a cepa de vacina de CEVAC® VITAPEST L esteve presente em várias amostras de conjuntiva, traquéia e duodeno (Tabela 1). Quando a vacina foi adjuvada com a quitosana, ela também foi detectada em algum pulmão, baço e amostras de tonsila cecal. No entanto, nas camadas convencionais vacinadas, as freqüências de detecção e os títulos foram inferiores a aqueles considerados em frangos SPF vacinados. Em 5 semanas p.v., a replicação do vírus da vacina ainda pode ser detectada na conjuntiva.
Tabela 1: Detecção do vírus da vacina após a vacinação de crias de um dia de SPF e de galinhas poedeiras convencionais com a vacina de CEVAC® VITAPEST L com ou sem adjuvante de quitosana (experimentos I e III, respectivamente).
| Exp. | Semana p.v. | Tecidos | Grupos a | ||
| Negativo | VITAPEST | VITAPEST Quitosana | |||
| I | 1 | Conjuntiva b | 0 / 5 B | 5 / 5 A | 5 / 5 A |
| (SPF) | c | < 4.18 | 8.12 ± 0.91a | 8.13 ± 0.22a | |
| Traqueia | 0 / 5 B | 5 / 5 A | 5 / 5 A | ||
| < 4.18 | 7.89 ± 1.07a | 7.93 ± 0.84a | |||
| Pulmão | 0 / 5 B | 5 / 5 A | 5 / 5 A | ||
| < 4.18 | 6.45 ± 1.19a | 6.18 ± 0.27a | |||
| Baço | 0 / 5 A | 4 / 5 A | 4 / 5 A | ||
| < 4.18 | 6.97 ± 0.68a | 6.41 ± 0.65a | |||
| Duodeno | 0 / 5 B | 5 / 5 A | 5 / 5 A |
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| < 4.18 | 8.77 ± 1.47 | 8.83 ± 1.76 | ||
| Pancreas | 0 / 5 B | 5 / 5 A | 5 / 5 A | |
| < 4.18 | 7.61 ± 0.64A | 7.36 ± 1.07A | ||
| Tonsilas | ||||
| cecais | 0 / 5 B | 3 / 5 AB | 5 / 5 A | |
| < 4,18 | 7,60 ± 2,06A | 8,08 ± 1,9A | ||
| 5 | Conjuntiva | 0 / 5 B | 5 / 5 A | 4 / 5 A |
| < 4,,18 | 4,99 ± 0,48A | 4,63 ± 0,30A | ||
| Traqueia | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 2 / 5 A | |
| < 4,18 | < 4,18 | 4,51 ± 0,11 | ||
| Pulmão | 0 / 5 A | 2 / 5 A | 0 / 5 A | |
| < 4,18 | 5,46 ± 1,50 | < 4,18 | ||
| Baço | 0 / 5 A | 1 / 5 A | 1 / 5 A | |
| < 4,18 | 4,50 | 6,29 | ||
| Duodeno | 0 / 5 A | 2 / 5 A | 3 / 5 A | |
| < 4,18 | 5,19 ± 1,09a | 5,60 ± 0,26A | ||
| Pancreas | 0 / 5 A | 1 / 5 A | 3 / 5 A | |
| < 4,18 | 4,69 | 4,95 ± 0,37 | ||
| Tonsilas | ||||
| cecais | 0 / 5 A | 1 / 5 A | 3 / 5 A | |
| < 4,18 | 4,45 | 4,79 ± 0,34 | ||
| III 1 | Conjuntiva b | 0 / 5 A | 4 / 5 A | 4 / 5 A |
| (conv,) | c | < 2 | 5,90 ± 0,73A | 6,51 ± 1,33A |
| Traqueia | 0 / 5 A | 3 / 5 A | 1 / 5 A | |
| < 2 | 4,49 ± 0,04 | 5,24 | ||
| Pulmão | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 1 / 5 A | |
| < 2 | < 2 | 4,57 | ||
| Baço | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 1 / 5 A | |
| < 2 | < 2 | 5,16 | ||
| Duodeno | 0 / 5 A | 2 / 5 A | 0 / 5 A | |
| < 2 | 4,62 ± 0,58 | < 2 |
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| Pancreas | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 0 / 5 A |
| < 2 | < 2 | < 2 | |
| Tonsilas | |||
| cecais | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 1 / 5 A |
| < 2 | < 2 | 6,10 | |
| Conjuntiva | 0 / 5 A | 3 / 5 A | 4 / 5 A |
| < 2 | 5,66 ± 0,69a | 5,13 ± 0,62a | |
| Traqueia | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 0 / 5 A |
| < 2 | < 2 | < 2 | |
| Pulmão | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 0 / 5 A |
| < 2 | < 2 | < 2 | |
| Baço | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 0 / 5 A |
| < 2 | < 2 | < 2 | |
| Duodeno | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 0 / 5 A |
| < 2 | < 2 | < 2 | |
| Pancreas | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 0 / 5 A |
| < 2 | < 2 | < 2 | |
| Tonsilas | |||
| cecais | 0 / 5 A | 0 / 5 A | 0 / 5 A |
| < 2 | < 2 | < 2 |
a Dados foram determinados por QRRT-PCR em 20 mg de tecido no tempo determinado p.v.. Os dados sem superescrito comum diferenciam-se significativamente para este tecido (P <0,05 ou 0.017 com a correção Bonferroni). O atalho dos QRRT-PCR específico para a cepa de vacina de CEVAC® VITAPEST L foi determinado como 104·18 por 20 mg de tecido.
b Dados representam a freqüência (número de positivos / total testado) da detecção de vírus em 20 mg de tecido.
c Dados representam a média ± desvio padrão de log10 EID50 de NDV em 20 mg de tecido de frangos seguros.
Exemplo 3: Imunocompetência e imunidade específica mediada pela célula para o antígeno [062]Os resultados obtidos nos pontos de tempo de amostragem diferentes
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21/27 na ativação de esplenócitos com mitógenos PMA/Iono mostraram que todas as crias SPF e das galinhas poedeiras convencionais em cada grupo foram do mesmo modo imunocompetentes em cada um de quatro experimentos (O.D>. 0,1), validando a ativabilidade de células de baço. De fato, a quitosana não afetou a resposta imune celular, como evidenciado pela ausência de nenhuma diferença significativa entre dois grupos vacinados em experimentos I (Figura 6A) e IV (Figura 6B) em SPF e galinhas poedeiras convencionais, respectivamente. Esta imunocompetência inalterada, quando a vacina de ND vivo foi co-administrada com a quitosana, foi confirmada nos experimentos II e III (dados não mostrados).
[063]Em pintos SPF (experimento I), a cepa de CEVAC® VITAPEST L foi capaz de induzir uma ativação mensurável da imunidade específica mediada pela célula NDV dentro da 1a semana p.v. e o grupo vacinado diferenciou-se significativamente (P <0,05) do grupo de controle não vacinado da semana de 2â para frente (Figura 6A). Quando complementado com a quitosana, a imunização oculo-nasal com a vacina de CEVAC® VITAPEST L gerou uma resposta imune celular específica para o antígeno significativamente mais alta da semana 1 a semana 4 p.v. (P <0,05), como demonstrado pela produção de ChIFN aumentada de esplenócitos. O efeito positivo da quitosana na imunidade específica mediada pela célula em frangos SPF foi confirmado no experimento II (dados não mostrados).
[064]Em pintos de galinhas poedeiras convencionais (experimento IV), a imunidade NDV específica mediada pela célula foi observada em ambos os grupos vacinados da semana 3 p.v. (P <0,05) (Figura 6B). Esta resposta celular específica NDV é mais alta, embora não significativamente, quando a quitosana é co-administrada com o ND vacina viva, se comparado com a vacina de CEVAC® VITAPEST L inoculada sozinha. O mesmo resultado foi obtido no experimento III (dados não mostrados).
Exemplo 4: Imunidade humoral e local mediada por anticorpo [065]A indução da imunidade de humoral nos frangos SPF vacinados foi registrada desde a 1a semana p.v. por ELISA IgM específico mas só da semana de 2â p.v. pelo teste de inibição de hemoaglutinação bem como por ELISAs IgG e IgA específicos (Tabela 2), com títulos por meio de estatística diferentes dos frangos não vacinados. O perfil do específico NDV HI e títulos de anticorpo de IgG obtidos em crias de galinhas poedeiras convencionais corresponde ao declínio da imunidade passiva
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22/27 maternalmente derivada até a 4a semana da idade e um ativo progressivo resposta imune primária induzida pela vacina detectável da 5a semana p.v. (tabela 2). Nem NDV IgA nem IgM específicos puderam ser detectados no soro de animais convencionais (dados não mostrados). A quitosana não mostrou nenhum efeito de adjuvante sobre a resposta imune humoral nem em crias SPF nem em crias de galinhas poedeiras convencionais, como demonstrado pela ausência de qualquer diferença estatisticamente significativa nos títulos entre dois grupos vacinados.
Tabela 2: Imunidade humoral após a vacinação de crias de um dia de SPF e de galinhas poedeiras convencionais com a vacina CEVAC® VITAPEST L com ou sem adjuvante de quitosana (experimentos I e III, respectivamente).
| Exp. | Resposta humoral | Tempo p,v, | Grupos | ||
| Negativo | VITAPEST | VITAPEST + Quitosana | |||
| I HI | 2 dias | 2,00 ± 0,00a | 2,20 ± 0,45a | 2,50 ± 0,71a | |
| (SPF) | 1 semana | 2,50 ± 0,58a | 2,67 ± 0,58a | 2,60 ± 0,55a | |
| 2 sema- | |||||
| nas | 2,40 ± 0,55B | 8,40 ± 2,30a | 7,80 ± 3,49a | ||
| 3 sema- | |||||
| nas | 2,00 ± 0,00B | 8,00 ± 2,00a | 7,00 ± 1,22a | ||
| 4 sema- | |||||
| nas | 2,20 ± 0,45B | 7,80 ± 0,84a | 8,00 ± 1,22a | ||
| 5 sema- | |||||
| nas | 2,00 ± 0,00B | 7,40 ± 1,52a | 6,40 ± 1,34a | ||
| 0,080 ± | 0,085 ± | 0,061 ± | |||
| IgG | 2 dias | 0,050A | 0,048a | 0,050a | |
| 1 | 0,053 ± | 0,085 ± | 0,034 ± | ||
| semana | 0,026a | 0,040a | 0,006a | ||
| 2 sema- | 0,036 ± | 1,297 ± | 1,255 ± | ||
| nas | 0,006B | 0,284a | 0,305a | ||
| 3 sema- | 0,032 ± | 1,559 ± | 1,410 ± | ||
| nas | 0,007B | 0,081a | 0,070AB |
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| 4 sema- | 0,054 | ± | 1,605 | ± | 1,548 | ± | ||
| nas | 0,026b | 0,102a | 0,125a | |||||
| 5 sema- | 0,078 | ± | 1,354 | ± | 1,527 | ± | ||
| nas | 0,015b | 0,462a | 0,267a | |||||
| 0,073 | ± | 0,090 | ± | 0,079 | ± | |||
| IgM | 2 dias | 0,018a | 0,032a | 0,008a | ||||
| 1 | 0,126 | ± | 0,748 | ± | 0,559 | ± | ||
| semana | 0,016b | 0,384a | 0,194a | |||||
| 2 sema- | 0,157 | ± | 1,557 | ± | 1,422 | ± | ||
| nas | 0,043b | 0,233a | 0,251a | |||||
| 3 sema- | 0,169 | ± | 0,950 | ± | 0,891 | ± | ||
| nas | 0,043b | 0,392a | 0,330a | |||||
| 4 sema- | 0,309 | ± | 1,227 | ± | 0,872 | ± | ||
| nas | 0,073b | 0,153a | 0,254ab | |||||
| 5 sema- | 0,381 | ± | 1,248 | ± | 0,915 | ± | ||
| nas | 0,149b | 0,455a | 0,288ab | |||||
| 0,057 | ± | 0,054 | ± | 0,054 | ± | |||
| igA | 2 dias | 0,010a | 0,007a | 0,003a | ||||
| 1 | 0,057 | ± | 0,211 | ± | 0,160 | ± | ||
| semana | 0,006b | 0,098a | 0,088ab | |||||
| 2 sema- | 0,112 | ± | 1,031 | ± | 0,565 | ± | ||
| nas | 0,039c | 0,285a | 0,174b | |||||
| 3 sema- | 0,103 | ± | 0,429 | ± | 0,471 | ± | ||
| nas | 0,031b | 0,213a | 0,148a | |||||
| 4 sema- | 0,140 | ± | 0,420 | ± | 0,447 | ± | ||
| nas | 0,065a | 0,218a | 0,519a | |||||
| 5 sema- | 0,140 | ± | 0,292 | ± | 0,236 | ± | ||
| nas | 0,029a | 0,146a | 0,146a | |||||
| III | HI | 2 dias | 10,40 ± 1,52a | 9,60 ± 0,89a | 10,40 ± 0,55a | |||
| (conv,) | 1 semana | 9,80 ± 1,30a | 9,20 ± 0,45a | 9,20 ± 0,84a |
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24/27 sema- nas
6,80 ± 1,30a
7,20 ± 0,84a
7,40 ± 1,14a sema- nas
5,40 ± 0,89b
6,80 ± 0,45a
5,20 ± 0,45b sema- nas
4,20 ± 1,30a
4,60 ± 0,89a
5,20 ± 0,84a sema-
IgG
3,00 ± 0,00b
4,80 ± 0,45a
5,60 ± 0,55a nas
| 1,637 | ± | 1,421 | ± | 1,555 | |
| 2 dias | 0,045a | 0,025a | 0,080a | ||
| 1 | 1,565 | ± | 1,551 | ± | 1,503 |
| semana | 0,094a | 0,100a | 0,108a | ||
| 2 sema- | 1,505 | ± | 1,434 | ± | 1,434 |
| nas | 0,121a | 0,085a | 0,070a | ||
| 3 sema- | 1,250 | ± | 1,364 | ± | 1,241 |
| nas | 0,377a | 0,097a | 0,137a | ||
| 4 sema- | 0,659 | ± | 0,766 | ± | 0,931 |
| nas | 0,556a | 0,383a | 0,506a | ||
| 5 sema- | 0,143 | ± | 1,036 | ± | 1,080 |
| nas | 0,212b | 0,215a | 0,160a |
Os dados representam a média ± desvio padrão de log2 recíproco de diluição de soro e valores da absorbância determinados por HI e ELISA testa, respectivamente, no tempo determinado p.v. (n = 5). As amostras de soro foram diluídas 1:100. A média ± desvio padrão em pontos de tempo sem superescrito comum diferencia-se significativamente (P <0,05).
[066]O efeito da quitosana na imunidade lacrimal mediada por anticorpo de frangos SPF (Figura 7A) e galinhas poedeiras convencionais (Figura 7B) foi altamente variável e as diferenças entre os frangos vacinados com CEVAC® VITAPEST L com ou sem quitosana (w/o) não foram estatisticamente significativas em cada ponto de tempo. A variação semelhante nos efeitos do adjuvante de quitosana foi observada para a imunidade mediada por anticorpo associado com pulmão, biliar e duodenal de frangos SPF (Tabela 3, a Figura 8A e 8A, respectivamente). Em crias de galinhas
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25/27 poedeiras convencionais, NDV o anticorpo de IgG específico de origem maternal foi detectado na 1a semana na bile (Figura 9B) e da 1a até a 5a semana da idade no duodeno (Figura 9B). Em 5 semanas p.v., a resposta de IgG duodenal foi significativamente mais alta nos grupos vacinados, indicando um ativo progressivo resposta imune primária induzida pela vacina no trato digestivo. A co-administração de quitosana com a vacina ND viva não tem nenhum efeito significativo sobre a imunidade mediada por anticorpo duodenal.
Tabela 3: Imunidade mediada por anticorpo pulmonar após a vacinação de frangos SPF de um dia com a vacina de CEVAC® VITAPEST L com ou sem adjuvante de quitosana (experimento I).
| Resposta humoral | Semana p,v, | Grupos | |||||
| Negativo | VITAPEST | VITAPEST Quitosana | + | ||||
| 0,258 | ± | 0,433 | ± | 0,335 | ± | ||
| IgA | 3 | 0,012a | 0,327A | 0,040A | |||
| 0,319 | ± | 0,505 | ± | 0,662 | ± | ||
| 5 | 0,078A | 0,191a | 0,487A | ||||
| 0,098 | ± | 0,619 | ± | 0,429 | ± | ||
| IgG | 3 | 0,011A | 0,304A | 0,059A | |||
| 0,055 | ± | 0,300 | ± | 0,358 | ± | ||
| 5 | 0,013a | 0,411A | 0,393A | ||||
| 0,323 | ± | 0,385 | ± | 0,282 | ± | ||
| IgM | 3 | 0,014a | 0,206A | 0,017a | |||
| 0,328 | ± | 0,508 | ± | 0,399 | ± | ||
| 5 | 0,043A | 0,127a | 0,165a |
Os dados representam a média ± desvio padrão de valores da absorbância determinados por ELISA no tempo determinado p.v. (n = 5). As amostras de lavagem do pulmão foram não diluídas para IgA/G e IgM, respectivamente. A média ± desvio padrão em pontos de tempo sem superescrito comum diferencia-se significativamente (P <0,05).
[067]Esta resposta de anticorpo sistêmica e local inalterada para a vacina de ND vivo co-administrada com a quitosana foi confirmada tanto em crias SPF como em
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26/27 crias de galinhas poedeiras convencionais nos experimentos repetidos II e IV (dados não mostrados).
Exemplo 5: A proteção e re-excreção após desafiam [068]Todos os frangos desafiados no grupo não vacinado mostraram sinais clínicos, que começaram em pós-desafio de 3 dias (d.p.d.) e morreram entre 4 e 6 d.p.d. Dois animais no grupo vacinado do CEVAC® VITAPEST L mostraram que os sinais clínicos e um morreram em 7 d.p.d.. Os frangos vacinados com CEVAC® VITAPEST L co-administrado com a quitosana não mostraram nem a morbidez específica nem a mortalidade durante o experimento.
[069]A atenuação do vírus de desafio começou em 2 d.p.d. no grupo de controle e todos os esfregaços orofaríngeo e de cloaca foram positivos em 4 d.p.d. (Tabela 4). Em cada ponto de tempo, a atenuação das rotas orofaríngea e cloaca foi reduzida pela vacinação. Além disso, o número de pássaros excretando no grupo que recebe o ND vacina viva co-administrada com a quitosana foi reduzido em comparação com o grupo que recebe a vacina sozinha. A excreção foi quase terminada em 7 d.p. ch. e completamente parou em 10 d.p.d..
Tabela 4: Atenuação da cepa de Chimalhuacan NDV após desafio de galinhas poedeiras convencionais vacinadas com a vacina de CEVAC® VITAPEST L com ou sem adjuvante de quitosana (experimento IV).
| Dias p.d. | Tecidos | Grupos a |
| Negativo | VITAPEST | VITAPEST + Quitosana |
Orofaringe b 7 / 10 B 1 / 10 AB / 10 A
3,74 ± 0,76 2,79 < 2,70
Cloaca / 10 A 0 / 10 A 0 / 10 A
| 3,57 | < 2,70 | < 2,70 | ||
| 4 | Orofaringe | 10 / 10 A | 6 / 10 A | 5 / 10 A |
| 4,56 ± 0,50 | ||||
| A | 3,99 ± 0,68a | 3,79 ± 0,12a | ||
| Cloaca | 10 / 10 A | 8 / 10 A | 6 / 10 A |
5,11 ± 0,78 A 3,72 ± 0,63B 3,78 ± 0,46B
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27/27
| 7 | Orofaringe | N.D. | 1 / 9 A | 1 / 10 A |
| 4,65 | 4,07 | |||
| Cloaca | N.D. | 1 / 9 A | 0 / 10 A | |
| 3,47 | < 2,70 | |||
| 10 | Orofaringe | N.D. | 0 / 9 A | 0 / 10 A |
| < 2,70 | < 2,70 | |||
| Cloaca | N.D. | 0 / 9 A | 0 / 10 A | |
| < 2,70 | < 2,70 |
a Dados são determinados por QRRT-PCR em 1 ml de esfregaços tomados no tempo determinado p.d.. Os dados sem superescrito comum diferenciam-se significativamente para este esfregaço (P <0,05 ou 0,017 com a correção Bonferroni). O atalho dos QRRT-PCR específico para a cepa de Chimalhuacan NDV foi determinado em 102·7 por esfregaços de ml. Os números totais de frangos testados foram reduzidos com o tempo por causa da mortalidade específica (ver a seção de resultados de detalhes).
N.D. = não determinado, devido à mortalidade específica.
b Dados representam a freqüência (número de positivos / total testado) da detecção de vírus em 1 esfregaços de ml.
Claims (11)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição de vacina adaptada à administração ocular em uma ave CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais antígenos do vírus de doença de Newcastle (NDV) e uma quantidade eficaz adjuvante de quitosana para imunizar a dita ave.
- 2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que é formulada para administração via colírios, spray ou aerossol.
- 3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o antígeno é um NDV vivo atenuado, um NDV morto inativado, um NDV recombinante, um NDV inteiro atenuado ou inativado ou recombinante, subunidades deste, ou uma combinação destes.
- 4. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a ave é selecionada a partir de aves criadas ou aves poedeiras ou galinha domesticadas, tais como frangos, perus, gansos, patos, faisões, codornizes ou pombos.
- 5. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que é para aumentar a imunidade mediada pela célula nas espécies aviárias e a persistência da vacina em tecidos de aves.
- 6. Uso da quitosana e de um antígeno do vírus de Doença de Newcastle (NVD) CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição de vacina para aumentar a resposta imune aviária mediada por célula e a persistência da vacina dentro dos tecidos aviários, em que a composição de vacina é formulada para administração ocular via colírios, borrifos ou aerossóis.
- 7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno é um NDV vivo atenuado, um NDV morto inativado, um NDV inteiro atenuado ou inativado, subunidades deste, ou uma combinação destes.
- 8. Kit de vacinação de aves CARACTERIZADO pelo fato de que compreendePetição 870180057403, de 03/07/2018, pág. 38/532/2 um dispositivo de distribuição adaptado para a liberação de colírio, spray ou aerossol e uma composição de vacina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
- 9. Kit de vacinação de aves, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dispositivo de distribuição é um aerossol, um spray ou um colírio.
- 10. Kit de vacinação de aves, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende reservatórios separados compreendendo uma quantidade eficaz de quitosana e um agente NDV, respectivamente.
- 11. Kit de vacinação de aves, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda instruções técnicas com informação sobre a administração e dosagem da composição de vacina.
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