BRPI0914507A2

BRPI0914507A2 - vacina para lentivìrus baseada em vìrus recombinante vacinal da febre amarela

Info

Publication number: BRPI0914507A2
Application number: BRPI0914507-9A
Authority: BR
Inventors: Myrna Cristina Bonaldo; Ricardo Galler; David Ian Watkins; Jonah Bradley Sacha
Original assignee: Fundacao Oswaldo Cruz; Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2012-04-10
Also published as: US20120321655A1; EP2517726A4; WO2011075806A2; WO2011075806A3; EP2517726A2

Abstract

VACINA PARA LENTIVIRUS BASEADA EM VìRUS RECOMBINANTE VACINAL DA FEBRE AMARELA. A presente invenção se refere a um vírus atenuado recombinante vacinal da febre amarela que expressa seqüências heterólogas de um lentivírus o qual é usado como agente de imunização para induzir resposta imune contra os lentivírus.

Description

VACINA PARA LENTIVIRUS BASEADA EM VÍRUS RECOMBINANTE VACINAL DA FEBRE AMARELA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de uma vacina para lentivirus, e mais especificamente para lentivirus de primatas como o HIV (Virus da Imunodeficiência Humana) e SIV (Virus da Imunodeficiência Simia).

A presente invenção envolve o uso de virus recombinante vacinai da febre amarela 17D atenuado para^- a expressão de antigenos de HIV e SIV para imunização. A invenção proporciona esquemas de imunização usando virus da febre amarela expressando antigenos de HIV ou de SIV. Por exemplo, o virus recombinante pode ser usado em um protocolo "prime-boost" imunizando um indivíduo com um polinucleotideo recombinante ou uma vacina recombinante do Bacillus Calmette-Guerin (rBCG), que expressa um ou mais antigenos de HIV ou SIV, seguida pela dose reforço com o vírus recombinante da Febre Amarela 17D, que expressa um ou mais antigenos de HIV ou SIV.

Parte da matéria descrita foi desenvolvida com suporte financeiro do National Institutes of Health dos Estados Unidos da América, sob o número ROl AI076114. Assim, o governo norte-americano pode ter certos direitos na matéria técnica descrita.

FUNDAlffiNTOS DA ARTE

Nos 28 anos desde que os cientistas identificaram o vírus da imunodeficiência humana (HIV) como a causa da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) , ele se espalhou inexoravelmente, causando uma das mais devastadoras pandemias jamais registradas na história. Mais de 20 milhões de pessoas já morreram de AIDS e aproximadamente outras 33 milhões vivem infectadas com o HIV.

Entretanto, até o momento, nenhum dos regimes de vacinas para HIV avaliados em testes clínicos de eficácia puderam reduzir os índices de infecção ou de replicação do HIV.

Aspectos estruturais e a enorme variabilidade da glicoproteína de Envelope frustraram os esforços de indução ampla de anticorpos neutralizantes reativos contra o HIV [1]. Os investigadores concentraram então a sua atenção em vacinas baseadas em células. Τ. 0 teste recente de uma vacina recombinante baseada no vetor de adenovírusAd5 foi amplamente considerado como um importante teste deste conceito [3,4]. Infelizmente, os vacinados tornaram-se infectados em índices mais altos do os observados nos grupos controles [3].

Vários estudos revelaram o papel importante das células T CD+8 no controle das infecções do HIV, assim como nas infecções do vírus da imunodeficiência símia (SIV). Em concordância, são pesquisadas e desenvolvidas atualmente diferentes modalidades de vacinas indutoras de resposta por células CD8+ T de resposta efetora [5, 6, 7, 8].

Assim, também, é desejável que se desenvolvam novas abordagens para reduzir a incidência da infecção por HIV ou melhorar as conseqüências dessa infecção. Nesse aspecto as vacinas são particularmente importantes. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A matéria técnica presentemente descrita se refere a composições farmacêuticas que podem ser utilizadas como composições imunogênicas ou vacinas contra lentivirus, e mais especificamente como composições imunogênicas ou vacinas contra o HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) ou SIV (Vírus da Imunodeficiência Sírsí

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra curvas de crescimento viral em células Vero.

A Figura 2 mostra que o YF17D replica e induz anticorpos neutralizantes, células T CD8+ vírus-específicas e a ativação de células T CD8+ em macacos rhesus.

A Figura 3 mostra o estudo da infecção e imunogenicidade do vírus FA17D/SIVGag45-269 em macacos rhesus.

A Figura 4 mostra que a vacinação com rYFl7D/SIVGag45- 2 69 apresentou robusta expansão de respostas Gag- específicas em um macaco vacinado inicialmente com rBCG.

A Figura 5 mostra que o resultado da vacinação com rYF17D/SIVGacr45-269 de r01056.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As composições descritas incluem tipicamente um polinucleotídeo recombinante ou um painel de polinucleotídeos recombinantes. Polinucleotídeos adequados de HIV ou de SIV podem codificar pelo menos um fragmento de um polipeptídeo de HIV ou SIV incluindo Gag, Pol, Rev, Tat, Nef, Vif, Vpx, Vpr, Env, Vpu, (preferivelmente pelo menos um fragmento de Gag, Vif, e Nef). O polinucleotídeo recombinante ou painel de polinucleotideos recombinantes podem estar presentes em um vírus recombinante ou em um painel de vírus recombinantes que expressam polipeptídeos codificados pelos polinucleotideos recombinantes. As composições divulgadas podem ser utilizadas em métodos para induzir uma resposta imune contra HIV, que pode incluir HIV-I ou HIV-2, ou SIV (ex. , uma resposta baseada em célula T citotóxica (LTC) e opcionalmente, uma resposta humoral ou baseada em anticorpos.

As composições divulgadas podem incluir uma mistura de polinucleotideos recombinantes, que podem estar presentes em um vetor viral ou outro vetor de nucleotídeo como um plasmideo ou um vetor bifuncional (vetores "shuttle") . Tipicamente, os polinucleotideos estão presentes em vetores de expressão para expressar os polipeptídeos codificados pelos polinucleotideos. Vetores adequados podem incluir, mas não estão limitados a, vetores virais (ex., vírus recombinantes atenuados). A composição farmacêutica pode incluir ácido nucléico recombinante livre ou ácido nucléico recombinante envolvido em uma ou mais partículas de vírus (ex., partículas de vírus defectivo para replicação ou vírus atenuado). Por exemplo, os polinucleotideos recombinantes contemplados aqui podem estar presentes em um ou mais vírus recombinantes (ex., vírus recombinantes da febre amarela) e as composições podem incluir uma mistura de vírus recombinantes.

As composições podem incluir um polinucleotídeo ou um painel de polinucleotideos (ex., pelo menos cerca de 2-9 polinucleotideos) presentes em um ou mais vetores de expressão (ex., um vetor viral ou outro vetor de expressão, que codifiquem polipeptideo Gag completo ou um fragmento parte dele. Opcionalmente, as composições podem incluir um polinucleotideo ou um painel de polinucleotideos presentes em um ou mais vetores de expressão que codifiquem o polipeptideo Vif completo ou um fragmento parte dele.

Opcionalmente, as composições podem incluir um polinucleotideo ou um painel de polinucleotideos presentes em um ou mais vetores de expressão que codifiquem polipeptideo Nef completo ou um fragmento parte dele.

Opcionalmente, as composições podem incluir um polinucleotideo ou um painel de polinucleotideos presentes em um ou mais vetores de expressão que codifiquem polipeptideo Tat completo codificador ou um fragmento parte dele. Opcionalmente, as composições podem incluir um polinucleotideo ou um painel de polinucleotideos presentes em um ou mais vetores de expressão que codifiquem o polipeptideo Rev ou um fragmento parte dele. Opcionalmente, as composições podem incluir um polinucleotideo ou um painel de polinucleotideos presentes em um ou mais vetores de expressão que codifiquem o polipeptideo Pol completo ou um fragmento parte dele. Opcionalmente, as composições podem incluir um polinucleotideo ou um painel de polinucleotideos presentes em um ou mais vetores de expressão que codifiquem o polipeptideo Vpr completo ou um fragmento parte dele. Opcionalmente, as composições podem incluir um polinucleotideo ou um painel de polinucleotideos presentes em um ou mais vetores de expressão que codifiquem o polipeptideo Vpx completo ou um fragmento parte dele. Os polinucleotídeos ou painéis de polinucleotídeos podem codificar diferentes polipeptideos ou diferentes fragmentos de polipeptideos. Os polipeptideos ou fragmentos de polipeptideos codificados podem se sobrepor (ex., em cerca de 9-20 aminoácidos). Os fragmentos tipicamente estão na faixa de comprimento de 5-100 aminoácidos (ou a partir de 5-50, 10-50, 10-25, 5-15, ou 10-15 aminoácidos) e incluem pelo menos um epitopo do polipeptideo do qual o fragmento é derivado. Em algumas representações, um fragmento pode incluir um aminoácido N-terminal que normalmente não está presente no polipeptideo completo do qual o fragmento é derivado.

A composição farmacêutica pode compreender uma quantidade ou concentração efetiva dos polinucleotídeos recombinantes ou vírus recombinantes para induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica contra a infecção pelo HIV em humanos ou infecção por SIV em símios. Induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica pode incluir potencializar uma resposta CD8+ e/ou uma CD4+ a um ou mais epítopos de HIV ou SIV. Induzir uma resposta protetora pode incluir induzir imunidade esterilizante contra HIV ou SIV. Induzir uma resposta terapêutica pode incluir reduzir a carga viral de um indivíduo, por exemplo, como determinado pela medida da quantidade de vírus circulando antes e após administrar a composição. Em algumas representações, a carga viral é reduzida para menos de cerca de 10.000 vRNA cópias/ml (preferivelmente menos de cerca de 5.000 vRNA cópias/ml, mais preferivelmente menos de cerca de 2000 vRNA cópias/ml, mais preferivelmente ainda menos de cerca de 1500 vRNA cópias/ml, e mais pref erivelmente menos de cerca de 1000 vRNA cópias/ml) após pelo menos cerca de 3 meses após administração da composição. A indução de uma resposta terapêutica pode incluir o aumento da contagem de células T CD4+ do indivíduo (ex., em pelo menos 2 vezes, 3 vezes, ou 4 vezes) depois de, pelo menos, 3 meses da administração da composição.

São também divulgados métodos para induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica contra a infecção por HIV ou SIV através da administração das composições farmacêuticas divulgadas aqui (ex., como composições imunogênicas ou vacinas) a um indivíduo com necessidade delas, o que pode incluir um humano já tendo ou estando em risco de adquirir uma infecção por lentivírus.

Na forma em que é usada aqui, uma "vacina de ácido nucléico" ou vacina de DNA livre" refere-se a uma vacina que inclui um ou mais vetores de expressão que codificam epítopos de célula B e/ou célula T e proporcionam uma resposta imunoprotetora na pessoa que está sendo vacinada. Vacinas de ácido nucléico como definidas aqui, que podem incluir plasmídeos vetores de expressão, tipicamente não são encapsidados em uma partícula viral. A vacina de ácido nucléico é diretamente introduzida nas células do indivíduo que está recebendo o regime vacinai. Essa abordagem é descrita, por exemplo, em U.S Pat. Nos. 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; e WO 98/04720. Exemplos de tecnologia de administração baseadas em DNA podem incluir, administração de DNA puro ("naked DNA"), distribuição facilitada (ex., através do uso de bupivicaína, polímeros, ou peptideos) e administração em presença de complexo de lipidio catiônico ou lipossomas. Os ácidos nucléicos podem ser administrados utilizando administração balística (ex., como descrito em U,S. Pat. No. 5.204.253), por pressão (ex., como descrito em U.S. Pat. No. 5.922.687), ou eletroporação.

Os ácidos nucléicos utilizados nas composições e vacinas divulgadas aqui podem codificar uma ou mais proteínas virais ou porções de uma ou mais proteínas virais. Em algumas representações, os ácidos nucléicos podem codificar um epítopo (ex., um epítopo de célula T) que não seja parte de uma proteína funcional de HIV ou SIV conhecida ou que seja codificado por uma estrutura aberta de leitura aberta de HIV ou SIV alternativa (ex., um epítopo "críptico"). (Ver, por ex., Maness et. al., J. Exp. Méd. (2007), 204:2505-12; e Cardinaud et. Al., J. Exp. Méd. (2004), 199:1053-1063, que são incorporadas aqui em sua totalidade a título de referência). Um epítopo críptico pode estar localizado em uma estrutura aberta de leitura (ORF) que não é tipicamente observada sendo traduzida durante o curso da replicação viral de HIV ou SIV. Por exemplo, Maness et. al. divulga um epítopo críptico em SIVmac239 chamado de "cRW9" que está localizado na estrutura de leitura +2 relativa à ORF codificando a proteína de envelope. Esse epítopo críptico está localizado na mesma ORF que codifica exon 1 da proteína Rev mas está na direção da corrente da única junção conhecida do local do doador e assim não está prevista para ser traduzida sob circunstancias biológicas "normais". As composições farmacêuticas divulgadas aqui podem ser formuladas como vacinas para administração em um indivíduo com necessidade das mesmas. Essas composições podem ser formuladas e/ou administradas em dosagens e através de técnicas bem conhecidas pelos médicos levando em consideração fatores como idade, sexo, peso, e condição do paciente em particular, e a via de administração. As composições podem incluir veículos farmacêuticos, diluentes, ou excipientes como são conhecidos. Alem disso, as composições podem incluir preservativos (ex., agentes anti-microbianos ou anti-bactericidas como cloreto de benzalcônio) ou adjuvantes.

As composições farmacêuticas podem ser administradas profilaticamente ou terapeuticamente. Na administração profilática, as vacinas podem ser administradas em uma quantidade suficiente para induzir CD8 + , CD4+, e/ou respostas de anticorpos para proteção contra a infecção. Em aplicações terapêuticas, as vacinas são administradas a um paciente em uma quantidade suficiente para induzir um efeito terapêutico (ex., CD8+, CD4+, e/ou respostas de anticorpos para os antígenos de HIV ou SIV ou epítopos codificados pelos polinucleotídeos da composição, que cura ou pelo menos suspende parcialmente ou retarda os sintomas e/ou complicações da infecção por HIV ou SIV (i.e., uma "dose terapeuticamente efetiva") .

As composições divulgadas aqui podem incluir polinucleotídeos recombinantes ou vírus recombinantes que codificam e expressam polipeptídeos de HIV ou SIV completos ou seus fragmentos. Na forma utilizada aqui, um "minigene" codifica apenas uma parte de um gene. Por exemplo, um minigene para HIV Gag pode codificar apenas 5-100 aminoácidos do polipeptideo Gag (ou 5-50, 10-50, 5-25, 10- 25, 5-15, ou 10-15 aminoácidos) . Minigenes que codificam apenas uma parte de um gene são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 12/022.530, depositado em 30 de janeiro de 2008, que reivindica o beneficio do Pedido Provisório U.S. No. 60/898.644, depositado em 31 de janeiro de 2007, cujos conteúdos estão incorporados em sua totalidade a titulo de referência. Por exemplo, um minigene para HIV Gag pode codificar um fragmento de Gag que inclui apenas 5-100 aminoácidos do polipeptideo Gag (ou 5-50, 10-50, 5-25, 10- 25, 5-15, ou 10-15 aminoácidos). Em algumas representações, o polinucleotideo recombinante ou virus recombinantes podem codificar e expressar um fragmento de polipeptideo de SIV como divulgado na Tabela 1 ou um fragmento correspondente de um polipeptideo de HIV.

Tabela 1. Seqüências de aminoácidos epitopo-especificas.

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Em algumas representações, o polinucleotideo recombinante ou vírus recombinantes podem compreender um "minigene" de SIV ou HIV e expressar um fragmento de um polipeptídeo de SIV ou um fragmento correspondente de um polipeptídeo de HIV como divulgado nas Tabelas 2-6.

Tabela 2. Fragmentos de Proteina Gag de SIV e HIV

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Tabela 3. Fragmentos de Proteína Vif de SIV e HIV

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Tabela 4. Fragmentos de Proteína Nef de SIV e HIV

<table>table see original document page 14</column></row><table> Tabela 5. Fragmentos de Proteína Tat de SIV e HIV

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Tabela 6. Fragmentos de Proteína Rev de SIV e HIV

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Um minigene de SIV ou minigene de HIV podem codificar um polipeptideo compreendendo um fragmento de um polipeptideo de SIV ou HIV e compreender ainda uma metionina N-terminal. Um minigene de SIV ou minigene de HIV podem incluir seqüências de códons que são otimizadas para expressão (ex., em animal, organismo ou virus recombinante como contemplado aqui). Minigenes de SIV exemplares que incluem seqüências de códons otimizadas para expressão pelo virus da febre amarela estão na Tabela 7.

Tabela 7. Minigenes Seqüência-Ofcimizados

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Os vetores virais, bactérias recombinantes, e ácidos nucléicos utilizados nas composições e vacinas divulgadas aqui podem codificar uma ou mais proteínas de HIV ou SIV ou porções de uma ou mais proteínas de HIV ou SIV. Em algumas representações, os ácidos nucléicos podem codificar um epítopo (ex., um epítopo de célula T) que não é parte de uma proteína funcional de HIV ou SIV conhecida ou que é codificada por uma estrutura aberta de leitura de HIV ou SIV alternativa (i.e., um epítopo "criptico"). (Ver, por ex., Maness et. al. , J. Exp. Med. (2007), 204:2505-12; e Cardinau et. al., J. Exp. Med. (2004), 199:1053-1063, que são incorporadas aqui em sua totalidade a título de referência). Um epítopo criptico pode estar localizado em uma fase aberta de leitura (ORF) que não seja tipicamente observada, sendo alternativamente traduzida durante o curso da replicação viral de HIV ou SIV. Por exemplo, Maness et. al. divulga um epítopo criptico em SIVmac239 chamado de "cRW9" que está localizado na estrutura de leitura +2 em relação à ORF codificando a proteína envelope. Esse epítopo criptico está localizado na mesma ORF que codifica o exon 1 da proteína Rev, mas se encontra no lado 3' ("downstream") do sítio doador de processamento ("donor splicing site") e assim não seria esperado que fosse traduzido em condições biológicas "normais".

Qualquer um dos vetores convencionais utilizados para expressão em células eucarióticas pode ser utilizado para imunizar diretamente um indivíduo com ácido nucléico. Vetores de expressão contendo elementos regulatórios dos vírus eucarióticos podem ser utilizados em vetores de expressão eucariótica (ex., vetores contendo SV40, CMV, ou promotores ou intensificadores retrovirais). Vetores exemplares incluem aqueles que expressam proteínas sob a direção de tais promotores como o promotor precoce do SV40, o promotor tardio do SV40, promotor de metalotioneína, promotor de citomegalovírushumano, promotor de vírus tumoral mamário de murino, e promotor de virus de sarcoma de Rdus. Quantidades industriais .visando o uso terapêutico e profilático de DNAi plasmidial podem ser produzidas, por exemplo, pela fermentação em E. coli, ,seguido de purificação. Alíquotas- do banco de células de trabalho são utilizadas para inocular um meio de crescimento, e crescido até a saturação em frascos de agitação ou um bioreator de acordo com técnicas bastante conhecidas. 0 DNA plasmidial pode ser purificado utilizando tecnologias de bioseparação padrão tais como as resinas detroca iônica de fase sólida. Se necessário, o DNA pode ser isolado; das formas aberta circular e linear utilizando gel eletroforese ou outros métodos.

O DNA plasmidial purificado, pode ser preparado para injeção utilizando uma variedade de formulações, como por ex. DNA llofilizado que pode ser reconstituído em solução: salina estéril tamponada com, fosfato (PBS). O DNA purificado podè ser introduzido em um indivíduo através de qualquer método apropriado, por ex. administração intramuscülar (IM) ou intradérmica (ID.

Para maximizar os efeitos imunoterápicos das vacinas de DNA, métodos alternativos para formular DNA. plasmidial purificado podem ser desejáveis. Uma variedade de métodos foi descrita, e novas técnicas podem se tornar disponíveis.

Por exemplo, lip.ídios catiônicós podem ser usados na formúlação da composição farmacêutica divulgada aqui (ex. como descrito era WO 93/24640; U.S.tat. Nò. 5.279.833; e WO 91/06309). Compostos protetores, interativos, de, não condensação. (PINC) podem ser usados 'na formulação da composição farmacêutica divulgada aqui (ex., glicolipidios, lipossomas fusogênicos, e peptideos).

O termo "vetor" se refere a alguns meios através dos quais o ácido nucléico pode ser introduzido em um organismo hospedeiro ou em um tecido hospedeiro. Existem vários tipos de vetores incluindo virus, plasmideos, bacteriófagos, cosmideos e bactérias. Da forma usada aqui, um "virus recombinante" ou "vetor viral" refere-se ao ácido nucléico viral recombinante. que foi modificado geneticamente para expressar um polipeptideo heterólogo (ex., um polipeptideo de HIV ou um fragmento dele). O ácido nucléico viral recombinante tipicamente inclui elementos cis-acting para a expressão do polipeptideo heterólogo. O ácido nucléico viral recombinante tipicamente é capaz de ser empacotado em um virus que é capaz de infectar uma célula hospedeira. Por exemplo, o ácido nucléico viral recombinante pode incluir elementos cis-acting para empacotamento. Tipicamente, o vetor viral não é capaz de replicação ou é atenuado. Um "virus recombinante atenuado" refere-se a um virus que foi geneticamente alterado por modernos métodos biológicos moleculares, tornando-o menos virulento do que o tipo selvagem, tipicamente pela mutação ou deleção de genes específicos. Por exemplo, o ácido nucléico viral recombinante pode não ter um gene essencial para a produção eficiente ou essencial para a produção do vírus infeccioso.

O ácido nucléico viral recombinante pode funcionar como um vetor para uma proteína retroviral imunogênica pelo fato do ácido nucléico viral recombinante compreender ácido nucléico exógeno. O vírus recombinante pode ser introduzido em um humano vacinado por métodos padrão para a vacinação de vacinas vivas. Uma vacina viva como contemplada aqui pode ser administrada em, por exemplo, cerca de IO4 a IOts unidades de partículas virais/dose, ou IO0 a IO3 pfu/dose.

As reais dosagens dessa vacina podem ser prontamente determinadas por qualquer especialista no campo das vacinas.

Numerosas espécies de vírus podem ser utilizadas como os vetores de vírus recombinantes para a composição farmacêutica divulgada aqui. Um vírus recombinante preferível para uma vacina viral é o vírus da vacina da febre amarela (ex., 17-D ou similar).

Em algumas representações, bactérias ou micobactérias atenuadas recombinantes podem ser utilizadas como vetores nas composições farmacêuticas e vacinas divulgadas aqui (ex., Bacillus, Shigella, Salmonella, Listeria ou Yersinia, bactérias atenuadas recombinantes). Vetores de vacina bacteriana recombinante são descritos em Daudel et. al., "Use of attenuated bactéria as delivery vectors for DNA vaccines", Expert Review of Vaccines, Volume 6, Número 1, Fevereiro de 2007, pp. 97-110(14); Shata et al., "Recent advances with recombinant bacterial vaccine vectors", Molec. Med. Today (2000), Volume 6, Numero 2, 1 de fevereiro de 2000, páginas 66-71; Clare & Dougan, "Live Recombinant Bacterial Vaccines", Novel Vaccination Strategies, 16 de abril de 2004 (Editor Stefan H.E. Kaufman); Gentaschev et al., "Recombinant Attenuated Bactéria for the Delivery of Subunit Vaccines", Vaccine, Volume 19, Números 17-19, 2\ e|e {pa^ço de 2001, paginas 2621-2628; Garmory et al., "The Use of Iive attenuated bactéria as a delivery system for heterologous antigens", J. Drug Target. 2003;11 (8-10): 471-9; U.S. Patent No. 6.383.496; e U.S. Patent No. 6.923.958 (que estão todas incorporadas aqui em sua totalidade a titulo de referência).

Em algumas representações, a bactéria ou micobactéria recombinante é o Bacilo Calmette-Guérin recombinante (ou Bacilo Calmette-Guérin, BCG) . 0 BCG é uma cepa atenuada do bacilo da tuberculose bovina vivo, Mycobacterium bovis, que perdeu a sua virulência em humanos sendo especialmente cultivado em um meio artificial durante anos. 0 uso de um BCG recombinante (rBCG) que expresse o Gag de HIV-I códon- otimizado para a imunização de camundongos em um regime de "prime-boost" tem sido descrito. Promkhatkaaew D. et al., "Prime-boost immunization of códon optimized HIV-I CRF01_AE Gag in BCG with recombinant vaccinia virus elicits MHC class I and II immune responses in mice", Immunol Invest. 2009;38 (8) :762-79.

As composições incluídas no regime de vacina como contemplado aqui podem ser co-administradas ou administradas seqüencialmente com outra vacina antigênica imunológica ou em composições terapêuticas, incluindo um adjuvante, um agente biológico ou químico dado em combinação com ou fusionado geneticamente a um antígeno para aumentar a imunogenicidade do antígeno. Agentes terapêuticos adicionais podem incluir, mas não estão limitados ao ligante de interleucina-2 (IL-2) ou CD40 em uma quantidade que seja suficiente para ainda potencializar a célula T CD8+, célula T CD4+, e respostas de anticorpos. Essas outras composições também podem incluir antigenos purificados do virus de imunodeficiência ou da expressão de tais antigenos por um segundo sistema de vetor recombinante que é capaz de produzir composições terapêuticas adicionais.

A composição farmacêutica divulgada aqui pode ser distribuida através de uma variedade de vias. Típicas vias de distribuição incluem administração parenteral (ex., distribuição intradérmica, intramuscular ou subcutânea). Outras vias incluem administração oral, intranasal, intravaginal e intraretal. A composição farmacêutica pode ser formulada para distribuição intranasal ou pulmonar. Formulações das composições farmacêuticas podem incluir formulações líquidas (ex., para administração oral, nasal, anal, vaginal, etc., incluindo suspensões, xaropes, ou elixires) e preparações para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (ex., administração injetável) tais como suspensões estéreis ou emulsões.

Na forma utilizada aqui, o termo "adjuvante" se refere a um composto ou mistura que aumenta a resposta imune a um antígeno. Um adjuvante pode servir como um depósito de tecido que libera lentamente o antígeno e também como um ativador do sistema linfóide que aumenta não- especificamente a resposta imune. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregados incluem adjuvante MPL-TDM (Lipídio A monofosforil/dicorinomicolato de trealose sintética, ex., disponível em GSK Biologicals). Outro adjuvante apropriado é o adjuvante imunoestimulatório AS021/AS02 (GSK). Esses adjuvantes imunoestimulatórios são formulados para promover uma forte resposta de célula T e incluem QS-21, uma saponina de saponaria Quillay, o ligante TL4, um lipidio A monofosforil, juntamente em um lipidio ou veiculo lipossômico. Outros adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes copolimero de bloco não iônico (ex., CRL1005), fosfatos de alumínio (ex., A1P04), R-848 (um adjuvante tipo Thl), imiquimod, PAM3CYS, poly (I:C), loxoribina, adjuvantes humanos potencialmente úteis como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum, oligodeoxinucleotideos CpG (ODN), antigenos derivados da toxina da cólera (ex., CTAl-DD), adjuvantes lipopolissacarídeos, adjuvante de Freund completo, adjuvante de Freund incompleto, saponina, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substancias de superfície ativa como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo ou hidrocarbono em água (ex., MF59 disponível em Novartis Vaccines ou Montanide ISA 720), keyhole limpet hemocianinas, e dinitrofenol.

As composições farmacêuticas divulgadas aqui podem compreender também ou adicionalmente pelo menos um composto quimioterápico antiviral. Exemplos não-limitadores podem ser selecionados em pelo menos um do grupo consistindo de gamaglobulina, amantadina, guanidina, benzimidazol hidróxido, interferons, interleucina-16, tiosemicarbazonas, metisazonas, rifampicina, ribavirina, análogos de pirimidina (ex., AZT e/ou 3TC), análogos de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, dideoxynucleosídeos, inibidores de protease (ex., saquinavir; indinavir; ritonavir; AG 1343; e VX-2/78), quimiocinas, tais como RANTES, MIPlx ou MIPlb ou ganciclovir.

Na forma utilizada aqui, um "regime de vacinação prime-boost" se refere a um regime no qual é administrado em um indivíduo uma primeira composição uma ou mais vezes (ex., duas ou três vezes com cerca de 2, 3, ou 4 semanas entre as administrações) e, então, após um determinado período de tempo (ex., cerca de duas semanas, cerca de 4 semanas, cerca de dois meses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco meses, cerca de seis meses, ou mais), é administrada ao indivíduo uma segunda composição, que pode ser a mesma ou diferente da primeira composição. A segunda composição também pode ser administrada mais de uma vez, com pelo menos 2, 3, ou 4 semanas entre as administrações. Em algumas representações, é administrada a um indivíduo uma primeira composição compreendendo o vírus da febre amarela 17D recombinante expressando um ou mais polipeptídeos de HIV, SIV, ou seus fragmentos, ou rBCG expressando um ou mais polipeptídeos de HIV, SIV, ou seus fragmentos. Subseqüentemente, é administrada ao indivíduo uma segunda composição compreendendo o vírus da febre amarela 17D recombinante expressando um ou mais polipeptídeos de HIV, SIV ou seus fragmentos, DNA codificando um ou mais polipeptídeos de HIV, SIV ou seus fragmentos, ou rBCG expressando um ou mais polipeptídeos de HIV, SIV, ou seus fragmentos. A primeira composição e a segunda composição podem ser a mesma ou diferentes. As composições farmacêuticas divulgadas aqui podem ser distribuídas a indivíduos em risco de infecção por HIV ou SIV ou a indivíduos que já estão infectados com HIV ou SIV. De modo a avaliar a eficácia da vacina, a resposta imune pode ser avaliada medindo-se a indução de respostas CD8+ e anticorpos para epítopos em particular. Respostas de célula T CD8+ podem ser medidas, por exemplo, usando coloração de tetrâmeros de PBMC fresco ou cultivado, testes ELISPOT ou usando testes de citotoxicidade funcional, que são bastante conhecidos dos especialistas e são descritos aqui.

Respostas de anticorpos podem ser medidos por testes conhecidos como o ELISA. Contagens de título ou carga viral e célula T CD4 + após a imunização podem ser medidas em indivíduos que já estão infectados. Por exemplo, indivíduos podem demonstrar uma diminuição da carga viral e um aumento na contagem de célula CD4+ após a imunização (ex., um aumento na contagem da célula CD4 + de pelo menos 2, 3, ou 4 vezes em relação ao nível anterior à imunização).

A invenção será agora descrita mais detalhadamente com referência a determinadas representações da invenção.

Em algumas representações dos vírus recombinantes contemplados aqui, o vírus é um vírus da vacina da febre amarela projetado para expressar um polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heterólogo pode incluir um polipeptídeo de HIV (HIV-1 ou HIV-2), um polipeptídeo de SIV ou um fragmento dos mesmos (ex., um fragmento consistindo de pelo menos 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 ou 200 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo Gag de HIV ou um polipeptídeo Gag de SIV) . Em outras representações, o polipeptideo heterólogo é um polipeptídeo com pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência com um polipeptideo de HIV, um polipeptídeo de SIV ou um fragmento do mesmo (ex., um fragmento consistindo de pelo menos 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, ou 200 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo Gag de HIV ou um polipeptídeo Gag de SIV). Seqüências para cepas de HIV-I e muitos genes de cepas de HIV-I (incluindo o gene para o polipeptídeo Gag) estão publicamente disponíveis em GenBank, ex., as seqüências disponíveis sob os números de acesso: NC_

001802; EU293448, EU293447, EU293446, EU293445, EU293444,

FJ195091, FJ195090, FJ195089, FJl95088, FJ195087, FJl95086,

EU884501, EU786681, EU786680, EU786679, EU786678, EU786677,

EU786676, EU786675, EU786674, EU786673, EU786672, EU786671,

EU786670, EU697909, EU697908, EU697 907, EU697906, EU697 905,

EU697904, U71182, EU69324, EU8 61977, FJ213783, FJ213782,

FJ213781, FJ2137 80, AB428562, AB428561, AB428560, AB428559,

AB428558, AB428557, AB428556, AB428555, AB428554, AB428553,

AB428552, AB428551, DQ2 95195, DQ295196, DQ295194, DQ295193,

DQ295192, EU446022, EU735540, EU735539, EU735538, EU735537,

EU735536, EU735535, EU110097, EU110096, EU110095, EU110094,

EU110093, EU110092, EÜ110091, EU110090, EU110089, EU110088,

EU110087, EU110086, EU110085, AF193277, AF193276, AF049337,

EU541617, EU220698, EF469243, DQ912823, DQ912822, EU000516,

EU000515, EU000514, EU000513, EU000512, EU000511, EU000510,

EU000509, EU000508, EU000507; e EU884500; cujas inscrições

no GenBank estão aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência. Isolados primários e de campo de HIV estão disponíveis pelo National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) que contratou o Quality Biological (Gaithersburg, MD.) para tornar essas cepas disponíveis. Cepas também estão disponíveis pela World Health Organization (WHO), Genebra, Suíça. Em uma representação preferível, o polipeptídeo selecionado possui uma seqüência consenso como determinada pela comparação de três ou mais cepas de HIV. Como divulgado aqui, os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de HIV ou um polipeptídeo de SIV podem ser "otimizados" para expressão em um ambiente celular humano ou ambiente celular símio, respectivamente. Assim, o uso de polinucleotídeos que especificamente incluem genes de HIV que são códon- otimizados para expressão em um ambiente celular humano é contemplado aqui. Genes gag de HIV sintéticos otimizados são descritos em U.S. Patent No. 6.696.291.

Os vírus da febre amarela recombinantes contemplados aqui são preparados através da inserção da seqüência codificante para o polipeptídeo heterólogo no genoma do vírus da febre amarela ou um vetor capaz de replicação do vírus da febre amarela. Vírus da febre amarela adequados incluem cepas atenuadas como a YF17D. Locais de inserção adequados para a seqüência codificante do polipeptídeo heterólogo incluem locais entre as seqüências codificantes para as proteínas virais E e NSl. A seqüência codificante para o polipeptídeo heterólogo pode ser códon-otimizada com base na utilização do códon para o genoma do vírus da febre amarela.

Em outra representação dos vírus recombinantes contemplados aqui, o vírus é um vírus YF 17D vacinai modificado geneticamente que expressa aminoácidos 45-269 de SIVmac239Gag (rYFl7D/SIVGag45-269) e é preparado através da inserção de uma seqüência otimizada de códon baseada em genoma YF entre os genes que codificam as proteínas virais Ee NSl.

Em um exemplo, o antígeno utilizado para expressão pelo vírus da febre amarela 17D foi um fragmento de uma proteína Gag compreendendo os resíduos de aminoácidos 45 a 269. Gag é uma proteína precursora que quando processada pela protease viral gera as proteínas estruturais internas do virion maduro. A proteína Gag induz uma forte resposta imune protetora mediada pelas células T CD8+ em macacos rhesus e em menor escala em humanos. Essa resposta imune é muito importante já que pode proporcionar proteção para a infecção viral ou reduzir a carga viral e retardar o início da doença.

Em algumas representações, os seguintes critérios podem ser utilizados para selecionar um fragmento Gag para clonar e expressar na região E/NSldo genoma do vírus 17D. Primeiramente, a presença de epítopos de célula T CD8+ no polipeptídeo Gag pode ser levada em conta com base em estudos imunológicos em macacos rhesus. Além disso, a inserção do polipeptídeo Gag preferivelmente não deveria perturbar a translocação da proteína precursora de YF para o retículo endoplasmático bem como o seu processamento por proteases celulares e virais, desde que essas etapas ocorram durante a morfogênese e montagem do vírus. Dessa forma, preferivelmente o fragmento do polipeptídeo Gag não deveria ser hidrofóbico nem conter um motivo transmembrana, o que poderia romper ou desestabilizar significativamenre a correta topologia da membrana e processamento da proteína precursora. Como tal, o fragmento de polipeptideo Gag selecionado é hidrofilico e não inclui domínios transmembrana aparentes. Além disso, um motivo muito flexível, KESSIG, é fusionado ao C-terminal da seqüência Gag. Esse tipo de motivo está presente em todos os flavivírus e proteínas ligando o domínio III e a região de ancoragem ("stem anchor") da proteína E. Ele é um motivo muito flexível e foi usado aqui como uma seqüência separadora para conectar e afastar o fragmento Gag e as hélices alfa do domínio de ancoragem ("stem anchor") da proteína E do vírus da dengue 4 truncado no cassete recombinante.

Alem disso, as vacinas de vírus divulgadas presentemente diferem das vacinas de vírus do estado da arte no que elas utilizam uma estrutura de vetor atenuado e enfatizam a geração de respostas imunes celulares para epítopos virais específicos em determinadas proteínas. A estratégia de replicação do vírus vetor é a de maximizar a produção de antígenos em uma locação celular apropriada para induzir a resposta apropriada em termos de especificidade e magnitude.

A vacinação com uma única dose do vírus da febre amarela 17D atenuado causa uma infecção viral limitada e promove a geração de anticorpos neutralizantes bem como respostas de célula T que conferem imunidade protetora em mais de 95% dos vacinados proporcionando imunidade por mais de 30 anos. A vacina da febre amarela 17D é considerada como uma das mais bem sucedidas vacinas disponíveis. A produção da vacina é um processo bem estabelecido e desde 1937 mais de 540 milhões de doses foram utilizadas em humanos com a mínima incidência de efeitos colaterais severos [9,10].

Os presentes métodos são baseados na metodologia previamente desenvolvida por dois dos atuais inventores. A metodologia é descrita em W007051267 que é aqui incorporada a título de referência.

O método para a produção dos vírus recombinantes com seqüências de nucleotídeos codificando a totalidade ou parte das proteínas heterólogas, como descrito em W007051267, pode compreender as seguintes etapas:

(a) modificar as seqüências de nucleotídeos heterólogos de tal maneira que quando clonadas no vírus vetor, elas apresentem na região 5', nucleotídeos da extremidade 5' do gene NSl do vírus vetor ou seqüências funcionalmente equivalentes, e em sua extremidade 3' a totalidade ou parte da região do genoma de ancoragem ("stem anchor") da proteína E do vírus vetor ou seqüências funcionalmente equivalentes, que não comprometem a estrutura e a replicação do dito vírus vetor;

(b) inserir as seqüências heterólogas modificadas como descritas em (a) na região intergênica entre os genes codificadores da proteína estrutural E e da proteína NSl não-estrutural do vírus vetor;

(c) regenerar o vírus recombinante não-patogênico, tendo as seqüências heterólogas estavelmente integradas no genoma viral no ponto de inserção descrito em (b) e, expressar a seqüência heteróloga de tax maneira que a proteína correspondente induza uma resposta imune apropriada.

Assim, os inventores descobriram que a estratégia de inserção de E/NS1 pode ser aplicada para gerar vacinas recorabinantes contra lentivírus, particularmente o HIV (Virus da Imunodeficiência Humana).

Em uma representação de um vírus recombinante como contemplado aqui, um vírus recombinante atenuado é um vírus vacinai da febre amarela 17D expressando uma seqüência de seqüências SIVmac239 Gag que é utilizada como um vetor viral para gerar respostas de célula T CD8+ SlV-específicas no macaco rhesus. O modelo do macaco rhesus asiático foi empregado para validar a expressão de antígenos de HIV no vetor do vírus da febre amarela 17D, devido ao fato de que o modelo do macaco rhesus SlV-infectado reproduz em muitos aspectos a imunodeficiência que ocorre em humanos HIV- infectados. Primeiramente, varias cepas de SIV estão intimamente relacionadas àquelas do HIV-I e infectam as células T CD4+ causando um declínio em seus números ao longo do tempo. A infecção com SIV causa uma doença semelhante a AIDS na maioria dos macacos infectados por um ano pós-inoculação. Além disso, muitos genes de macacos que codificam proteínas importantes no sistema imune são similares aqueles de humanos. Equivalentes dos genes classe HLA, classe II e receptor de célula T (TCR) são encontrados no macaco. Ortólogos das localizações HLA-A, -B, -E e -F foram isolados nos macacos rhesus. Em ambas as infecções, as células T CD8+ selecionam a maior parte da variação de seaüência fora da Droteina enveloDe e o controle natural ar reDlicacão viral está associada a determinados alelos MHC-I 111.121 .

Conseauentemente, como aqui divulaado, a vacinacão dos macacos rhesus com diferentes formulações contendo o virus da febre amarela recombinante foi avaliada para determinar o uso potencial do vetor 17D no desenvolvimento de novas vacinas contra o HIV. O virus da febre amarela recombinante obtido expressa um fragmento Gag de SIVmac239 abrangendo os aminoácidos de 45 a 269. Gag é uma proteína precursora, e durante o curso da replicação viral passa por uma divisão proteolítica pela protease viral, o gue produz as proteínas estruturais internas do virion maduro. Foi determinado que múltiplas respostas Gag-especificas são importantes no controle da replicação do SIV. Isso pode ser devido as células infectadas que apresentam epítopos de células T CD8+ derivadas de Gag logo após a entrada viral. Células T CD8+ Gag-específicas reconhecem células infectadas até 2 horas pós-infecção. Após 6 horas de infecção, as células T CD8+ Gag-específicas eliminam as células infectadas, tanto antes quanto depois da integração do DNA pró-viral e da síntese da proteína viral. Essas descobertas demonstram que as células T CD8+ Gag-específicas não requerem infecção produtiva de células ou mesmo a síntese da proteína "de novo" para reconhecer as células como infectadas e elimina- las. Isso cria a possibilidade de que as células T CD8 + Gag-específicas poderiam ser muito mais importantes do que se imaginou anteriormente. De modo a alcançar os objetivos aqui divulgados., rorarr, usadas as seguintes seqüências: SEQ ID NO:1

MGARNSVLSGKKADELEKIRLRPNGKKKYMLKHWWAANELDRFGLAESLLENKEGCQK ILSVLAPLVPTGSENLKSLYNTVCVIWCIHAEEKVKHTEEAKQIVQRHLVVETGTTETM PKTSRPTAPSSGRGGNYPVQQIGGNYVHLPLSPRTLNAWVKLIEEKKFGAEWPGFQAL SEGCTPYDINQMLNCVGDHQAAMQIIRDIINEEAADWDLQHPQPAPQQGQLREPSGSDI AGTTSSVDEQIQWMYRQQNPIPVGNIYRRWIQLGLQKCVRMYNPTNILDVKQGPKEPFQ SYVDRFYKSLRAEQTDAAVKNWMTQTLLIQNANPDCKLVLKGLGVNPTLEEMLTACQGV GGPGQKARLMAEALKEALAPVPIPFAAAQQRGPRKTIKCWNCGKEGHSARQCRAPRRQG CWKCGKMDHVMAKCPDRQAGFLGLGPWGKKPRNFPMAQVHQGLMPTAPPEDPAVDLLKN YMQLGKQQREKQRESRXKPYKEVTEDLLHLNSLFGGDQ.

A SEQ ID NO: 2 é uma seqüência de aminoácidos da proteína recombinante Gag 45-269 clonada e expressa na região intergênica E/NS1 pelo vírus da febre amarela 17D. 0 fragmento Gag45-269 está ressaltado em cinza. SEQ ID NO:2

DQGSAINFGRGLAESLLENKEGCQKILSVLAPLVPTGSENLKSLYNTVCVIWCIHAEEK VKHTEEAKQIVQRHLVVETGTTETMPKTSRPTAPSSGRGGNYPVQQIGGNYVHLPLSPR TLNAWVKLIEEKKFGAEWPGFQALSEGCTPYDINQMLNCVGDHQAAMQIIRDIINEEA ADWDLQHPQPAPQQGQLREPSGSDIAGTTSSVDEQIQWMYRQQNPIPVGNIYRRWIQLK ESSIGTSLGKAVHQVFGSVYTTMFGGVSWMIRILIGFLVLWIGTNSRNTSMAMTCIAVG GITLFLGFTVGA

Onde as outras seqüências presentes em SEQ ID NO: 2 são seqüências do vírus da febre amarela e correspondem a: SEQ ID NO:3 - DQGSAINFGR

A SEQ ID NO: 3 é uma variação de 10 resíduos de aminoácidos da seqüência N-terminal da proteína NSl do vírus da febre amarela (DQGCAINFGK); posição do genoma no YF de 2453 a 2482) na qual foi introduzida uma mudança de aminiácido (cisteina para serina, ressaltado em cinza).

SEQ ID NO:4 - KESSIG

A SEQ ID NO: 4 é uma seqüência de aminoácidos correspondente tanto à seqüência de nucleotideos da posição 214 5 a 2164 do genoma do virus da febre amarela quanto ao motivo abrangendo os resíduos de aminoácidos 391 a 397 da proteína E do vírus da febre amarela.

SEQ ID NO:5 -

TSLGKAVHQVFGSVYTTMFGGVSWMIRILIGFLVLWIGTNSRNTSMAMTCIAVGGITLF LGFTVGA

A SEQ ID NO: 5 é uma variação dos últimos resíduos de aminoácidos -terminal da proteína E do vírus 4 da dengue (posição do genoma do vírus 4 da dengue de 2226 a 2423; GenBank AF326825). A SEQ ID NO: 5 inclui uma substituição relativa à seqüência original onde a seqüência terminal de aminoácidos VQA é alterada para VGA.

A SEQ ID NO:6 é uma seqüência nucleotídica (924 nucleotideos) do cassete de recombinante Gag45-269 clonado na região intergênica E/NS1 do vírus da febre amarela 17D.

O fragmento Gag 45-269 está ressaltado em cinza.

SEQ ID NO:6

5 ' GATCAAGGAAGCGCCATCAACTTCGGCCGAGGACTGGCTGAATCACTGCTGGAAAAC AAAGAAGGATGTCAGAAAATCCTGTCAGTGCTGGCTCCACTGGTGCCAACAGGATCAGA AAACCTGAAGTCACTGTACAACACAGTGTGTGTGATCTGGTGTATCCATGCTGAAGAAA AAGTGAAGCATACAGAAGAGGCCAAGCAGATCGTGCAGAGGCATCTGGTGGTGGAAACA GGGACAACAGAAACAATGCCAAAGACATCAAGGCCAACAGCTCCATCATCAGGAAGGGG GGGAAACTACCCAGTGCAGCAGATCGGAGGGAACTACGTGCATCTGCCACTGTCACCAA GGACACTGAACGCTTGGGTGAAACTGATCGAAGAAAAGAAATTTGGAGCTGAAGTGGTG CCAGGATTTCAGGCTCTGTCAGAAGGATGTACACCATACGACATCAACCAGATGCTGAA CTGTGTGGGAGATCATCAGGCTGCTATGCAGATCATTAGGGACATCATCAACGAAGAAG C T GCAGAT T GGGAT C TGCAACAT C CACAGC CAGC T CCACAGCAGGGACAGC T GAGGGAA C CAT CAGGAT CAGACAT T GC T GGAACAACAT CATCAGTGGAC GAACAGAT C CAG T G GAT GT ACAGGCAGCAGAAC C CAAT C CCAGT GGGAAACAT CT ACAGAAGAT GGAT CCAGC TGA AAGAGGGAAGCTCAATAGGAACATCATTGGGAAAGGCTGTGCACCAGGTTTTTGGAAGT GTGTAT ACAACCATGTTTGGAGGAGTCTCATGGATGATTAGAATCCTAATTGGGTTCTT AGTGTTGTGGATTGGCACGAACTCCAGGAACACTTCAATGGCTATGACGTGCATAGCTG TTGGAGGAATCACTCTGTTTCTGGGCTTCACAGTTGGCGCC 3'

A SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de 11. 785 nucleotideos do genoma do vírus recombinante levando o cassete Gag 45- 269, denominado de rYF17D/SIVGag45-269. SEQ ID NO:7 5'

AGTAAATCCTGTGTGCTAATTGAGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAGTTGCTAGGCAATA AACACATTTGGATTAATTTTAATCGTTCGTTGAGCGATTAGCAGAGAACTGACCAGAAC ATGTCTGGTCGTAAAGCTCAGGGAAAAACCCTGGGCGTCAATATGGTACGACGAGGAGT TCGCTCCT T GT C AAAC AAAAT AAAAC AAAAAAC AAAAC AAAT T GGAAAC AGAC C T GGAC CTTCAAGAGGTGTTCAAGGATTTATCTTTTTCTTTTTGTTCAACATTTTGACTGGAAAA AAGATCACAGCCCACCTAAAGAGGTTGTGGAAAATGCTGGACCCAAGACAAGGCTTGGC TGTTCTAAGGAAAGTCAAGAGAGTGGTGGCCAGTTTGATGAGAGGATTGTCCTCAAGGA AACGCCGTTCCCATGATGTTCTGACTGTGCAATTCCTAATTTTGGGAATGCTGTTGATG ACCGGTGGAGTGACCTTGGTGCGGAAAAACAGATGGTTGCTCCTAAATGTGACATCTGA GGACCTCGGGAAAACATTCTCTGTGGGCACAGGCAACTGCACAACAAACATTTTGGAAG CCAAGTACTGGTGCCCAGACTCAATGGAATACAACTGTCCCAATCTCAGTCCAAGAGAG GAGCCAGATGACATTGATTGCTGGTGCTATGGGGTGGAAAACGTTAGAGTCGCATATGG TAAGTGTGACTCAGCAGGCAGGTCTAGGAGGTCAAGAAGGGCCATTGACTTGCCTACGC ATGAAAACCATGGTTTGAAGACCCGGCAAGAAAAATGGATGACTGGAAGAATGGGTGAA AGGCAACTCCAAAAGATTGAGAGATGGTTCGTGAGGAACCCCTTTTTTGCAGTGACGGC TCTGACCATTGCCTACCTTGTGGGAAGCAACATGACGCAACGAGTCGTGATTGCCCTAC TGGTCTTGGCTGTTGGTCCGGCCTACTCAGCTCACTGCATTGGAATTACTGACAGGGAT TTCATTGAGGGGGTGCATGGAGGAACTTGGGTTTCAGCTACCCTGGAGCAAGACAAGTG TGTCACTGTTATGGCCCCTGACAAGCCTTCATTGGACATCTCACTAGAGACAGTAGCCA TTGATAGACCTGCTGAGGCGAGGAAAGTGTGTTACAATGCAGTTCTCACTCATGTGAAG ATTAATGACAAGTGCCCCAGCACTGGAGAGGCCCACCTAGCTGAAGAGAACGAAGGGGA CAATGCGTGCAAGCGCACTTATTCTGATAGAGGCTGGGGCAATGGCTGTGGCCTATTTG GGAAAGGGAGCATTGTGGCATGCGCCAAATTCACTTGTGCCAAATCCATGAGTTTGTTT GAGGTTGATCAGACCAAAATTCAGTATGTCATCAGAGCACAATTGCATGTAGGGGCCAA GCAGGAAAATTGGAATACCAGCATTAAGACTCTCAAGTTTGATGCCCTGTCAGGCTCCC AGGAAGTCGAGTTCATTGGGTATGGAAAAGCTACACTGGAATGCCAGGTGCAAACTGCG GTGGACTTTGGTAACAGTTACATCGCTGAGATGGAAACAGAGAGCTGGATAGTGGACAG ACAGTGGGCCCAGGACTTGACCCTGCCATGGCAGAGTGGAAGTGGCGGGGTGTGGAGAG AGATGCATCATCTTGTCGAATTTGAACCTCCGCATGCCGCCACTATCAGAGTACTGGCC CTGGGAAACCAGGAAGGCTCCTTGAAAACAGCTCTTACTGGCGCAATGAGGGTTACAAA GGACACAAATGACAACAACCTTTACAAACTACATGGTGGACATGTTTCTTGCAGAGTGA AATTGTCAGCTTTGACACTCAAGGGGACATCCTACAAAATATGCACTGACAAAATGTTT TTTGTCAAGAACCCAACTGACACTGGCCATGGCACTGTTGTGATGCAGGTGAAAGTGTC AAAAGGAACCCCCTGCAGGATTCCAGTGATAGTAGCTGATGATCTTACAGCGGCAATCA ATAAAGGCATTTTGGTTACAGTTAACCCCATCGCCTCAACCAATGATGATGAAGTGCTG ATTGAGGTGAACCCACCTTTTGGAGACAGCTACATTATCGTTGGGAGAGGAGATTCACG TCTCACTTACCAGTGGCACAAAGAGGGAAGCTCAATAGGAAAGTTGTTCACTCAGACCA TGAAAGGCGTGGAACGCCTGGCCGTCATGGGAGACACCGCCTGGGATTTCAGCTCCGCT GGAGGGTTCTTCACTTCGGTTGGGAAAGGAATTCATACGGTGTTTGGCTCTGCCTTTCA GGGGCTATTTGGCGGCTTGAACTGGATAACAAAGGTCATCATGGGGGCGGTACTCATAT GGGTTGGCATCAACACAAGAAACATGACAATGTCCATGAGCATGATCTTGGTAGGAGTG ATCATGATGTTTTTGTCTCTAGGAGTTGGGGCGGATCAAGGAAGCGCCATCAACTTCGG CCGAGGACTGGCTGAATCACTGCTGGAAAACAAAGAAGGATGTCAGAAAATCCTGTCAG TGCTGGCTCCACTGGTGCCAACAGGATCAGAAAACCTGAAGTCACTGTACAACACAGTG TGTGTGATCTGGTGTATCCATGCTGAAGAAAAAGTGAAGCATACAGAAGAGGCCAAGCA GATCGTGCAGAGGCATCTGGTGGTGGAAACAGGGACAACAGAAACAATGCCAAAGACAT CAAGGCCAACAGCTCCATCATCAGGAAGGGGGGGAAACTACCCAGTGCAGCAGATCGGA GGGAACTACGTGCATCTGCCACTGTCACCAAGGACACTGAACGCTTGGGTGAAACTGAT CGAAGAAAAGAAATTTGGAGCTGAAGTGGTGCCAGGATTTCAGGCTCTGTCAGAAGGAT GTACACCATACGACATCAACCAGATGCTGAACTGTGTGGGAGATCATCAGGCTGCTATG CAGATCATTAGGGACATCATCAACGAAGAAGCTGCAGATTGGGATCTGCAACATCCACA GCCAGCTCCACAGCAGGGACAGCTGAGGGAACCATCAGGATCAGACATTGCTGGAACAA CATCATCAGTGGACGAACAGATCCAGTGGATGTACAGGCAGCAGAACCCAATCCCAGTG GGAAACATCTACAGAAGATGGATCCAGCTGAAAGAGGGAAGCTCAATAGGAACATCATT GGGAAAGGCTGTGCACCAGGTTTTTGGAAGTGTGTATACAACCATGTTTGGAGGAGTCT CATGGATGATTAGAATCCTAATTGGGTTCTTAGTGTTGTGGATTGGCACGAACTCCAGG AACACTTCAATGGCTATGACGTGCATAGCTGTTGGAGGAATCACTCTGTTTCTGGGCTT CACAGTTGGCGCcGATCAAGGATGCGCCATCAACTTTGGCAAGAGAGAGCTCAAGTGCG GAGATGGTATCTTCATATTTAGAGACTCTGATGACTGGCTGAACAAGTACTCATACTAT CCAGAAGATCCTGTGAAGCTTGCATCAATAGTGAAAGCCTCTTTCGAAGAAGGGAAGTG TGGCCTAAATTCAGTTGACTCCCTTGAGCATGAGATGTGGAGAAGCAGGGCAGATGAGA TTAATACCATTTTTGAGGAAAACGAGGTGGACATTTCTGTTGTCGTGCAGGATCCAAAG AATGTTTACCAGAGAGGAACTCATCCATTTTCCAGAATTCGGGATGGTCTGCAGTATGG TTGGAAGACTTGGGGTAAGAACCTTGTGTTCTCCCCAGGGAGGAAGAATGGAAGCTTCA 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TCTGCTGGTTGGAGGCCTCAATGCTCTTGGACAACATGGAGGTGAGGGGTGGAATGGTC

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A SEQ ID NO: 8 é uma seqüência precursora da poliproteina do vírus rYF17D/SIVGag45-269. A proteína recombinante está ressaltada em cinza.

SEQ ID NO:8

SGRKAQGKTLGVNMVRRGVRSLSNKIKQKTKQIGNRPGPSRGVQGFIFFFL FNILTGKK ITAHLKRLWKML DPRQGLAVLRKVKRWAS LMRGL S SRKRRS H DVLTVQ FLILGMLLMT GGVTLVRKNRWLLLNVTSEDLGKTFSVGTGNCTTNILEAKYWCPDSMEYNCPNLSPREE PDDIDCWCYGVENVRVAYGKCDSAGRSRRSRRAIDLPTHENHGLKTRQEKWMTGRMGER QLQKIERWFVRNPFFAVTALTIAYL VGSNMTQRWIALLVLAVGPAYSAHCIGITDRDF IEGVHGGTWVSATLEQDKCVTVMAPDKPSLDISLETVAIDRPAEARKVCYNAVLTHVKI NDKCPSTGEAHLAEENEGDNACKRTYSDRGWGNGCGLFGKGSIVACAKFTCAKSMSLFE VDQTKIQYVIRAQLHVGAKQENWNTSIKTLKFDALSGSQEVEFIGYGKATLECQVQTAV DFGNS YIAEMETESWIVDRQWAQDLTLPWQSGSGGVWREMHHLVEFEPPHAATIRVLAL GNQEGSLKTALTGAMRVTKDTNDNNLYKLHGGHVSCRVKLSALTLKGTS YKICT DKMFF VKNPTDTGHGTWMQVKVSKGTPCRIPVIVADDLTAAINKGILVTVNPIASTNDDEVLI EVNPPFGDSYIIVGRGDSRLTYQWHKEGSSIGKLFTQTMKGVERLAVMGDTAWDFSSAG GFFTSVGKGIHTVFGSAFQGLFGGLNWITKVIMGAVLIWVGINTRNMTMSMSMILVGVI MMFLSLGVGADQGSAINFGRGLAESLLENKEGCQKILSVLAPLVPTGSENLKSLYNTVC VIWCIHAEEKVKHTEEAKQIVQRHLVVETGTTETMPKTSRPTAPSSGRGGNY PVQQIGG

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Outras seqüências apropriadas para preparar os vírus da febre amarela recombinantes contemplados aqui incluem seqüências correspondentes em HIV (ex., polipeptideo Gag completo ou um fragmento do mesmo). Por exemplo, o polipeptideo heterólogo expresso pelos vírus recombinantes da febre amarela recombinantes contemplados aqui podem compreender um fragmento da SEQ ID NO: 9, ou uma proteína relacionada (ex., uma proteína tendo pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da identidade da seqüência de aminoácidos para SEQ ID NO:9). SED ID NO:9

MGARASVLSG GKLDKWEKIR LRPGGKKTYQ LKHIVWASRE LERFAVNPGL LETGGGCKQI LVQLQPSLQT GSEELKSLYN AVATLYCVHQ GIEVRDTKEA LDKIEEEQNK SKKKAQQAAA DTGNSSQVSQ NYPIVQNLQG QMVHQAISPR TLNAWVKVIE EKAFSPEVIP MFSALSEGAT PQDLNTMLNT VGGHQAAMQM LKETINEEAA EWDRLHPAHA GPNAPGQMRE PRGSDIAGTT STLQEQIGWM TSNPPVPVGE IYKRWIILGL NKIVRMYSPV SILDIRQGPK EPFRDYVDRF YKTLRAEQAS QDVKNWMTET LLVQNANPDC KTILKALGPA ATLEEMMTAC QGVGGPSHKA RILAEAMSQV TSPANIMMQR GNFRNQRKTI KCFNCGKEGH LARHCRAPRK KGCWKCGREG HQMKDCTERQ ANFLGKIWPS HKGRPGNFLQ SRPEPTAPPE ESFRFGEETT TPPQKQEPLP SQKQETIDKD LYPLASLKSL FGNDPSLQ

Um fragmento, como contemplado aqui, pode incluir pelo menos 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 100, ou 200 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:9. Em uma representação, o fragmento compreende os aminoácidos 45-269 da SEQ ID NO:9. O polipeptideo heterólogo pode ainda compreender uma seqüência de aminoácidos terminal compreendendo KESSIG.

EXEMPLOS

A presente invenção será agora descrita em detalhes através dos exemplos apresentados abaixo. Deve-se ressaltar que a invenção não está limitada a esses exemplos, mas que também inclui variações e modificações dentro dos limites nos quais ela funciona.

Exemplo 1: Propriedades de proliferação em células Vero do rYFl7D/SIVGag45-269 recombinante

A capacidade de crescimento do vírus rYF17D/SIVGag45- 269 recombinante foi avaliada e comparada a dois outros vírus, vacina de YF 17DD e YF17D/G1/2 T3, (o último correspondendo ao vírus vetor parental, isto é inserção heteróloga). Foram realizados três experimentos

independentes de crescimento de virus em monòcamadas de células Vero. Todos os experimentos foram realizados em baixo MOI de 0,02 com densidades de células Vero de 62.500 células por cm'.

O vírus recombinante rYF17D/SIVGag45-269 apresentou uma taxa de crescimento mais baixa comparada aos vírus da vacina 17D e teve seu pico em 72 horas pós-infecção exibindo um título de 6.61 + 0,23 IoglO PFU/ml. A Figura 1 mostra curvas de crescimento viral em células Vero. As células foram infectadas tanto com o YF 17D controle (losangos cinza) quanto com os vírus YF17D/G1/2T3 (quadrados pretos) ou o vírus recombinante rYF17D/SIVGag45- 269 (triângulos cinza em MOI de 0,02). Cada ponto de tempo representa o título médio obtido desses três experimentos em separado com os respectivos desvios padrão. A Tabela 8 abaixo mostra as curvas de crescimento viral em células Vero. Títulos virais (IoglO PFU/ml) são mostrados em cada ponto de tempo. Os picos de crescimento viral estão em negrito.

TABELA 8

<table>table see original document page 48</column></row><table> Exemplo 2 - Estudos imunológicos preliminares da infecção pelo virus da vacina YF17D em macacos rhesus Mamu-A*01 positivos.

Primeiramente, o virus da vacina YF 17D foi utilizado para infectar quatro macacos Mamu-A*01 positivos. O virus da vacina replicou nesses quatro animais e induziu anticorpos neutralizantes em todos os quatro macacos até duas semanas após a vacinação. (Tabelas 9 e 10). Para monitorar a resposta imune da célula T CD8+ contra o YF17D, seu proteoma foi verificado para a presença de peptídeos que pudessem se ligar ao Mamu-A*01 utilizando algoritmos (MHC Pathway) [14]. Os 52 peptideos YF17D-derivados mais prováveis para se ligar a Mamu-A*01 com base em sua afinidade prevista para essa molécula de MHC classe I foram sintetizados. IFNy ELISPOT foi utilizado para examinar esses peptideos em animais YFl7D-infectados e quatro peptideos Mamu-A*01-ligação: 17D 7844 (LTPVTMAEV; LV91285- 1293), 17D 7846 (VSPGNGWMI; VI93250-3258), 17D 7850 (MSPKGISRM; MM92179-2187), e 17D 7858 (TTPFGQQRVF; TFl02853-2863) foram reconhecidos in vivo (Fig. 2A).

Utilizando um protocolo anteriormente publicado [15], a ativação da célula T CD8+ em todos os quatro animais também foi observada (Figs. 2B e 2C) . Assim, como foi anteriormente observado, o virus da vacina YF17D replica em macacos rhesus indianos [16] e induz anticorpos neutralizantes, respostas de célula T CD8+ Mamu-A*01- restrito especificas da febre amarela, e a ativação da célula T CD8+. A Figura 2 mostra que o YF17D replica e induz anticorpos neutralizantes, células T CD8+ virus- especificas e a ativação de células T CD8 + em macacos rhesus.

A Tabela 9 mostra a replicação de YF17D durante os primeiros 10 dias após a vacinação com duas diferentes doses, como medido por Q-PCR utilizando iniciadores YF17D- especificos. A Tabela 10 mostra o titulo dos anticorpos neutralizantes determinados em 2 e 5 semanas após a vacinação com YF17D. Na Figura 2A, o PBMC fresco de vacinados (100.000 células/poço) foram usados em testes IFN-y ELISPOT [17] para avaliar as respostas de célula-T contra o YF17D. Quatro epitopos (17D 7844, 17D 7846, 17D 7850, e 17D 7858)- previstos para se ligar a Mamu-A*01 como definido pelo algoritmo (MHC Pathway)- foram selecionados para estudos posteriores. A Figura 2B apresenta a identificação de células T CD8+ ativadas após a vacinação com YF17D baseada na expressão dos marcadores de proliferação e pró-apoptóticos Ki-67 e Bcl-2 [15]. Células sangüíneas integrais foram marcadas com anticorpos contra CD3 e CD8, e então permeabilizadas, e subseqüentemente marcadas com os anticorpos Bcl-2 e Ki-67-específicos. Os gráficos de citometria de fluxo foram centralizados em Iinfócitos CD3+ e CD8+. A Figura 2C mostra a cinética de expressão de Ki-67 e Bcl-2 em células T após a vacinação com YF17D.

Exemplo 3 - Imunogenicidade de rYF17D/SIVGag45-269 em macacos rhesus

Na etapa seguinte, o vírus da vacina YF17D foi projetado para expressar os aminoácidos 45-269 de SIVmac239Gag (rYF17D/SIVGag45-269) inserindo-se uma seqüência otimizada do códon de febre amarela entre os genes codificando as proteínas virais E e NSl. Esse vírus recombinante replicou e induziu anticorpos neutralizantes em camundongos (dados não mostrados). A construção rYF17D/SIVGag4 5-2 69 foi então testada em seis macacos rhesus indianos Mamu-A*01 positivos. Foi observada a replicação viral de rYFl7D/SIVGag45-269 em cinco desses seis macacos (Tabela 12) . Anticorpos neutralizantes foram evidentes em duas semanas pós-vacinação (Tabela 12) . Uma única vacinação com rYF17D/SIVGag45-269 induziu células T CD8+ antígeno-específicas em cinco dos seis macacos Mamu- A*01 positivos (Fig. 3A-C). Esse vírus recombinante induziu também a ativação da célula T CD8+ na maioria dos animais vacinados (Fig. 3D) . 0 sexto macaco (r04091) requereu uma dose de reforço 28 dias após a primeira vacinação para induzir células T CD8+ específicas (dados não mostrados e Fig. 3A-C). Não foram detectadas diferenças em respostas imune vacina-induzidas entre o grupo de animais vacinados com YF17D ou com rYF17D/SIVGag45-269. Houve, entretanto, uma considerável variabilidade de animal para animal. 0 animal r02034 vacinado com YF17D exibiu ativação maciça de célula T CD8'+ (um pico de 35% no 12° dia; Fig. 2C) , provavelmente induzida pelos altos níveis de replicação viral (16.800 cópias/ml no 5o dia; Tabela 9). A comparação de respostas de anticorpos neutralizantes em 2 e 5 semanas após a vacinação em animais vacinados com YF17D ou rYF17D/SIVGag45-269 não mostrou diferenças detectáveis na capacidade dessas duas vacinas de induzir anticorpos neutralizantes (Tabelas 10 e 12). Também foi difícil detectar diferenças nas respostas de célula T CD8+ YF17D- especificas induzidas por essas duas vacinas. 0 pico das respostas de célula T CD8+ Mamu-A*01-restritas contra o YF17D variou de quase não detectável (r02110 no 24° dia; Fig. 2A) a 400 SFCs/10° PBMC (r04113 no 12° dia; Fig. 2A) . Enquanto dois dos animais vacinados com rYF17D/SIVGag45-269 não criaram respostas de célula T CD8+ contra peptideos de YF17D reconhecidos por Mamu-A*01, em quatro deles houve este tipo de resposta (Fig. 3A-C) , com SFCs/10ó PBMC variando de 50 a 200. Em quase todos os animais vacinados com rYF17D/SIVGag45-269, as respostas Gag CM9-específicas (pico em 50-750) foram mais elevadas do que aquelas geradas contra os epítopos de YF17D Mamu-A*01-restritos (pico em 0- 200), sugerindo que o vírus recombinante replicou de maneira estável in vivo. Dessa forma, o vírus YF17D recombinante replicou e induziu tanto os anticorpos neutralizantes vírus-específicos quanto células T CD8+ que não eram aparentemente diferentes daquelas induzidas somente pelo YF17D.

A Figura 3 mostra que o rYF17D/SIVGag45-269 replica e induz anticorpos neutralizantes, células T CD8+ vírus- específicas e a ativação de células T CD8+ em macacos rhesus. A Tabela 11 que mostra a replicação de rYF17D/SIVGag45-269 durante os primeiros 10 dias após a vacinação com duas doses diferentes, como medido por Q-PCR utilizando iniciadores YF17D-específicos. A Tabela 12 mostra o título de anticorpos neutralizantes determinado em 2 e 5 semanas após a vacinação com rYF17D/SIVGag45-269. Na Figuxa 3A PBMC frescos de animais vacinados (100.00 células/poço) foram utilizados em testes ELISPOT-IFN-γ para avaliar respostas de célula T contra o vetor YF17D e a inserção SIV Gag (45-269). Respostas YF17D-específicas foram medidas usando os mesmos epitopos descritos na Figura 2. Para respostas SIV Gag-especificas, foram usadas 6 conjuntos de peptideos de 15-mers e com uma sobreposição de 11-mers, que cobre toda a extensão da inserção Gag 45-269 de SIVmac239. Além disso, foram medidas respostas Mamu- A*01-restritas contra os epitopos GagCM9181-189 dominante e GagQI9254-262 subdominante. 0 pico das respostas de célula T CD8+ em r04091 é mostrado em 10 dias após uma segunda administração de rYF17D/SIVGag (2.0 χ IO5 PFU) , que foi dada no 28° dia após a vacinação inicial. A Figura 3D mostra a cinética de expressão de Ki-67 e Bcl-2 em células T CD8+ após a vacinação com rYF17D/SIVGag45-269, como descrito na Figura 2.

Exemplo 4 - Imunização de macacos rhesus com uma dose inicial (prime) de Mycobacterivna bcrris BCG recombi nante seguida de uma dose reforço ("boost") do vírus rYF17D/SIVGag45—269

A maioria dos vetores virais são geralmente mais eficientes após uma dose inicial com DNA ou rBCG [18, 19, 20, 21] . Assim, dois macacos que tinham sido primados com proteínas SIV expressando rBCG (Fig. 4A) tiveram uma dose de reforço. Não foi detectada nenhuma resposta SIV- especifica após qualquer uma das duas doses iniciais de vacinação rBCG. Infelizmente, foi observado apenas um nivel baixo de replicação de rYF17D/SIVGag45-269 no 5o dia pós- vacinação em um dos animais rBCG-primados (r01108, 7 cópias/ml; Tabelas 13). Ambos os animais, no entanto, geraram anticorpos neutralizantes em 2 semanas pós- vacinação (Tabela 14). Felizmente, foram detectadas

respostas de célula T CD8+ de alta freqüência no macaco Mamu-A*01 positivo (r01056) após uma dose de reforço com rYF17D/SIVGag45-269 (Figs. 4B e 4C) . A dose de reforço induziu ativação maciça de células T CD8+ no animal Mamu- A*01 positivo r01056 com pico em 35% 17 dias após a vacinação (Figs. 4B e 4C) . 3,5% das células T CD8+ desse animal responderam ao epitopo Mamu-A*01 GagCM9181-189 no 17° dia após a vacinação (Figs. 4B e 4C) . Essas células T CD8+ sintetizaram IFN γ, TNFa, MIP-Ιβ e desgranularam (Fig. 4C e dados não mostrados).

Assim, uma dose inicial de rBCG seguida de uma dose reforço da febre amarela 17D recombinante induziu células T CD8+ antigeno-especificas polifuncionais.

As células T CD8+ induzidas por vacina podem ser de memória central (TCM) ou de memória efetora (TEM). Esses dois subconjuntos de células T CD8+ diferem em marcadores de função e superfície [22]. Doses de reforço repetidas levam as células T CD8+ em direção ao subconjunto TEM [22] . Conseqüentemente, foi avaliado se uma dose inicial de rBCG seguida de uma dose reforço de rYF17D/SIVGag45-269 induzia células T CD8+ que eram TCM ou TEM. A marcação revelou que as células T CD8+ SlV-específicas eram em sua maior parte TEM já que a maioria delas eram CD28+ (Fig. 5A) . Foi recentemente sugerido que TEM residindo nas mucosas pode efetivamente controlar a infecção após desafio de dose baixa com SIVmac239 [23]. Em seguida, as células T CD8+ rYF17D/SIVGag45-269- induzidas foram testadas para determinar se poderiam reconhecer células T CD8+ viralmente infectadas. Foi mostrado que células T CD8+ marcam para tetrâmeros e produzem citocinas após a estimulação com peptideos sintéticos. Nenhum desses testes, no entanto, respondem se essas células T CD8+ podem reconhecer células infectadas SIV e reduzir a replicação viral. Assim, um teste recentemente desenvolvido [24] foi utilizado para determinar se células T CD8+ induzidas por vacina podem reduzir a replicação viral em células T CD4+. Linfócitos (GagCM9181-189) escolhidos de tetrâmero(-) foram incubados por 48 horas com células T CD4+ infectadas SIVmac239 expressando Mamu-A*01. O número de células T CD4+ que expressaram SIV Gag e a quantidade de virus na cultura sobrenadante foram avaliados. As células T CD8+ induzidas por vacina reduziram a replicação viral até o mesmo ponto que aquele visto por células T CD8+ SlV-especificas purificadas de três macacos rhesus SIVmac239-infectados incluindo um macaco rhesus controlador de elite 95061 (Fig. 5B).

Assim, em um aspecto dos métodos presentemente divulgados, é importante que a rBCG tenha induzido uma resposta de célula T CD8+ de alta freqüência após uma dose reforço de rYF17D/SIVGag45-269. Essas células T CD8+ alcançaram freqüências que eram similares àquelas induzidas por uma dose inicial de rBCG seguida de uma dose reforço de Ad5 [19]. Mesmo sem o beneficio da dose inicial de rBCG, os níveis das células T CD8+ induzidas por uma única vacinação de rYF17D/SIVGag45-269 foram equivalentes àqueles inauziao.- pela nossa melhor vacina SIV.. SIVmac239ANef. 0 YF17D recombinante gerou uma media de 195 (variação de 100-750) SFC/10 6 PBMC (N=6), considerando que SIVmac239ANef induziu 238 (variação de 150-320) SFC/10° PBMC (N=3) [25]. E também possível que quaisquer recombinantes YF17D/HIV irão replicar melhor em humanos do que replicaram em macacos rhesus e assim, induzir respostas imunes mais robustas. A rBCG mostrou ser mais eficaz em humanos [26, 27, 28, 29] e pode ser mais útil em induzir respostas de células T em humanos do que ocorreu em nosso limitado estudo com os macacos rhesus.

A Figura 4 mostra que a vacinação com rYF17D/SIVGag45- 269 induziu uma robusta expansão de respostas Gag- específicas em um macaco rBCG-primado. A Figura 4A mostra o esquema de vacinação. Dois macacos rhesus foram imunizados com rBCG intradérmica (i.d.) (2xl05 CFU), rBCG oralmente (10a CFU), e rYF17D/SIVGag4 5-269 subcutânea (2xl05 PFU) em intervalos de seis meses. A rBCG foi projetada para expressar 18 minigenes contendo seqüências de Gag, Viff Nef, Ver, e Tat de SIVmac239. (Ver Tabelas 2-6, Proteínas l(a), 2(a), 3(a), 4(a), 6(a), 8(a), 12(a), 13(a), 14 (a), 15(a), 17(a), 18(a), 19(a), 20(a), 21(a), 22(a), 23(a), e 24 (a)). A Tabela 13 mostra a replicação do rYFl7D/SIVGag45- 269 durante os primeiros 10 dias após a vacinação, como medido por Q-PCR utilizando iniciadores YF17D-específicos. A Tabela 14 mostra o título de anticorpos neutralizantes determinado em 2 e 5 semanas após a vacinação com rYFl7D/SIVGag45-269. A Figura 4B mostra a cinética da ativação da célula T CD8+ (como descrito na Figura 1) e a expansão das células T CD8+ CM9181-189-específicas em r01056, após a vacinação com rYF17D/SIVGag45-269. Na Figura 4C pode-se ver que a vacinação com rYF17D/SIVGag45-269 induz respostas de célula T CD8+ robustas contra GagCM9181- 189 em r01056. A ativação da célula T CD8+ (Ki-67+/Bcl-2-) para a linha de base e 13υ dia é mostrada. Respostas GagCM9181-189-específicas foram medidas por marcação de tetrâmero, marcação de citocina intracelular com anticorpos contra ΜΙΡ-Ιβ e IFN-γ, e.ELISPOT-IFN-γ.

A Figura 5 ilustra que a vacinação de r01056 com rYF17D/SIVGag45-269 proporciona células T CD8+ especificas de Gag CM9181-18 9 de memória efetora que suprime a replicação viral em alvos CD4+. A Figura 5A mostra a freqüência de células T CD8+ especificas para tetrâmero positivo de GagCM9181-189 em r01056 agrupado em linfócitos CD3+CD8+. Na Figura 5B uma comparação na expressão de CD28 e CD95 em células positivas de tetrâmero mostra um fenótipo de memória efetora polarizado. A Figura 5C mostra que células T CD8+ especificas de GagCM9181-189 ex-vivo de r01056 inibe a replicação viral de células T CD4+ infectadas por SIVmac239. Células T CD8 + especificas para GagCM9181-189 dos três animais positivos Manu-A*01 infectados com SIV e r01056 vacinados com rYF17D/SIVGag45- 269 foram testados para suas habilidades em suprimir a replicação viral em células T CD4+ infectadas por SIV [24].

Quarenta e oito horas após a incubação de várias amostras contendo diferentes relações de células T CD4+ infectadas por SIV e células T CD8+ especificas de GagCM9191-189, o sobrenadante destas amostras foi removido e medido para as cópias de RNA viral por mililitro por Q- PCR. Nenhuma supressão foi observada quando os efetores foram incubados com alvos CD4+ de animais negativos de Manu-A*01. rh2021 foi infectado com SIVmac239 (carga viral ~ 10 5 νRNA cópias/ml) contendo mutações em 8 epitopos restritos de Manu-B*08 como parte de outro estudo [30] . r01080 foi vacinado com um regime DNA/Ad5 expressando gag, Rev, Tat e Nef, e depois infectado com SIVmac239 (carga viral ~ IO3 vRNA cópias/ml) [31] . r95061 foi vacinado com um regime de DNA/MVA . contendo Gag CM9181-189 e depois desafiado com SIVmac239 (carga viral não detectável) [32] .

A partir do exposto acima, é reconhecido que o virus vacinai atenuado da febre amarela 17D expressando Gag de SIVmac239, conforme aqui descrito, proporcionou excelente respostas de imunização.

O acima descrito é ilustrativo da presente invenção, e não é para ser interpretado como limitativo da mesma. A invenção é definida pelas reivindicações que se seguem. Tabela 9

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Tabela 10

<table>table see original document page 59</column></row><table> <table>table see original document page 60</column></row><table> <table>table see original document page 61</column></row><table> REFERÊNCIAS

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<110> Fundação Oswaldo cruz e outros

<120> vacina para Lentivirus Baseada em Virus Recombinante vacinai da Febre Amarela

<130> P1719

<140> PI <141> 2009-12-23

<160> 9

<170> Patentin version 3.3

<210> 1 <211> 510 <212> PRT

<213> Simian immunodeficiency virus <220>

<221> misc_feature <222> (489)..(489)

<223> xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1

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<212> PRT

<213> Simian immunodeficiency virus

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Ala Ala Asp Trp Asp Leu Gln His Pro Gln Pro Ala Pro Gln Gln Gly 180 185 190 Gln Leu Arg Glu Pro Ser Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ser 195 200 205

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<213> Yellow fever virus

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<213> Dengue vi rus type 4 <400> 5

Thr Ser Leu Gly Lys Ala Val His Gln vai Phe Gly Ser vai Tyr Thr 1 5 10 15

Thr Met Phe Gly Gly vai Ser Trp Met Ile Arg Ile Leu lie Gly Phe 20 25 30 Leu vai Leu Trp Ile Gly Thr Asn ser Arg Asn Thr Ser Met Ala Met 35 40 45

Thr Cys Ile Ala Val Gly Gly Ile Thr Leu Phe Leu Gly Phe Thr Val 50 55 60

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<210> 6 <211> 924 <212> DNA

<213> Simian immunodeficiency virus <400> 6

gatcaaggaa gcgccatcaa cttcggccga ggactggctg aatcactgct ggaaaacaaa 60

gaaggatgtc agaaaatcct gtcagtgctg gctccactgg tgccaacagg atcagaaaac 120

ctgaagtcac tgtacaacac agtgtgtgtg atctggtgta tccatgctga agaaaaagtg 180

aagcatacag aagaggccaa gcagatcgtg cagaggcatc tggtggtgga aacagggaca 240

acagaaacaa tgccaaagac atcaaggcca acagctccat catcaggaag ggggggaaac 300

tacccagtgc agcagatcgg agggaactac gtgcatctgc cactgtcacc aaggacactg 360

aacgcttggg tgaaactgat cgaagaaaag aaatttggag ctgaagtggt gccaggattt 420

caggctctgt cagaaggatg tacaccatac gacatcaacc agatgctgaa ctgtgtggga 480

gatcatcagg ctgctatgca gatcattagg gacatcatca acgaagaagc tgcagattgg 540

gatctgcaac atccacagcc agctccacag cagggacagc tgagggaacc atcaggatca 600

gacattgctg gaacaacatc atcagtggac gaacagatcc agtggatgta caggcagcag 660

aacccaatcc cagtgggaaa catctacaga agatggatcc agctgaaaga gggaagctca 720

ataggaacat cattgggaaa ggctgtgcac caggtttttg gaagtgtgta tacaaccatg 780

tttggaggag tctcatggat gattagaatc ctaattgggt tcttagtgtt gtggattggc 840

acgaactcca ggaacacttc aatggctatg acgtgcatag ctgttggagg aatcactctg 900

tttctgggct tcacagttgg cgcc 924

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<213> Simian immunodeficiency virus <400> 7

agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60 acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaacat 120 gtctggtcgt aaagctcagg gaaaaaccct gggcgtcaat atggtacgac gaggagttcg 180 ctccttgtca âacaaaataa aacaaaaaac aaaacaaatt ggaaacagac ctggaccttc 240 aagaggtgtt caaggattta tctttttctt tttgttcaac attttgactg gaaaaaagat 300 cacagcccac ctaaagaggt tgtggaaaat gctggaccca agacaaggct tggctgttct 360 aaggaaagtc aagagagtgg tggccagttt gatgagagga ttgtcctcaa ggaaacgccg 420 ttcccatgat gttctgactg tgcaattcct aattttggga atgctgttga tgaccggtgg 480 agtgaccttg gtgcggaaaa acagatggtt gctcctaaat gtgacatctg aggacctcgg 540 aaaaacattc tctgtgggca caggcaactg cacaacaaac attttggaag ccaagtactg 600 gtgcccagac tcaatggaat acaactgtcc caatctcagt ccaagagagg agccagatga 660 cattgattgc tggtgctatg gggtggaaaa cgttagagtc gcatatggta agtgtgactc 720 agcaggcagg tctaggaggt caagaagggc cattgacttg cctacgcatg aaaaccatgg 780 tttgaagacc cggcaagaaa aatggatgac tggaagaatg ggtgaaaggc aactccaaaa 840 gattgagaga tggttcgtga 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gagtactggc cctgggaaac caggaaggct ccttgaaaac 1740 agctcttact ggcgcaatga gggttacaaa ggacacaaat gacaacaacc tttacaaact 1800 acatggtgga catgtttctt gcagagtgaa attgtcagct ttgacactca aggggacatc 1860 ctacaaaata tgcactgaca aaatgttttt tgtcaagaac ccaactgaca ctggccatgg 1920 cactgttgtg atgcaggtga aagtgtcaaa aggaaccccc tgcaggattc cagtgatagt 1980 agctgatgat cttacagcgg caatcaataa aggcattttg gttacagtta accccatcgc 2040 ctcaaccaat gatgatgaag tgctgattga ggtgaaccca ccttttggag acagctacat 2100 tatcgttggg agaggagatt cacgtctcac ttaccagtgg cacaaagagg gaagctcaat 2160 aggaaagttg ttcactcaga ccatgaaagg cgtggaacgc ctggccgtca tgggagacac 2220 cgcctgggat ttcagctccg ctggagggtt cttcacttcg gttgggaaag gaattcatac 2280 ggtgtttggc tctgcctttc aggggctatt tggcggcttg aactggataa caaaggtcat 2340 catgggggcg gtactcatat gggttggcat caacacaaga aacatgacaa tgtccatgag 2400 catgatcttg gtaggagtga tcatgatgtt tttgtctcta ggagttgggg cggatcaagg 2460 aagcgccatc aacttcggcc gaggactggc tgaatcactg ctggaaaaca aagaaggatg 2520 tcagaaaatc ctgtcagtgc tggctccact ggtgccaaca ggatcagaaa acctgaagtc 2580 actgtacaac acagtgtgtg tgatctggtg tatccatgct gaagaaaaag tgaagcatac 2640 agaagaggcc aagcagatcg tgcagaggca tctggtggtg gaaacaggga caacagaaac 2700 aatgccaaag acatcaaggc caacagctcc atcatcagga agggggggaa actacccagt 2760 nragcagatc ggagggaact acgtgcatct gccactgtca ccaaggacac tgaacgcttg 2820 ggtgaaactg atcgaagaaa agaaatttgg agctgaagtg gtgccaggat ttcaggctct 2880 gtcagaagga tgtacaccat acgacatcaa ccagatgctg aactgtgtgg gagatcatca 2940 ggctgctatg cagatcatta gggacatcat caacgaagaa gctgcagatt gggatctgca 3000 acatccacag ccagctccac agcagggaca gctgagggaa ccatcaggat cagacattgc 3060 tggaacaaca tcatcagtgg acgaacagat ccagtggatg tacaggcagc agaacccaat 3120 cccagtggga aacatctaca gaagatggat ccagctgaaa gagggaagct caataggaac 3180 atcattggga aaggctgtgc accaggtttt tggaagtgtg tatacaacca tgtttggagg 3240 agtctcatgg atgattagaa tcctaattgg gttcttagtg ttgtggattg gcacgaactc 3300 caggaacact tcaatggcta tgacgtgcat agctgttgga ggaatcactc tgtttctggg 3360 cttcacagtt ggcgccgatc aaggatgcgc catcaacttt ggcaagagag agctcaagtg 3420 cggagatggt atcttcatat ttagagactc tgatgactgg ctgaacaagt actcatacta 3480 tccagaagat cctgtgaagc ttgcatcaat agtgaaagcc tctttcgaag aagggaagtg 3540 tggcctaaat tcagttgact cccttgagca tgagatgtgg agaagcaggg cagatgagat 3600 taataccatt tttgaggaaa acgaggtgga catttctgtt gtcgtgcagg atccaaagaa 3660 tgtttaccag agaggaactc atccattttc cagaattcgg gatggtctgc agtatggttg 3720 gaagacttgg ggtaagaacc ttgtgttctc cccagggagg aagaatggaa gcttcatcat 3780 agatggaaag tccaggaaag aatgcccgtt ttcaaaccgg gtctggaatt ctttccagat 3840 agaggagttt gggacgggag tgttcaccac acgcgtgtac atggacgcag tctttgaata 3900 caccatagac tgcgatggat ctatcttggg tgcagcggtg aacggaaaaa agagtgccca 3960 tggctctcca acattttgga tgggaagtca tgaagtaaat gggacatgga tgatccacac 4020 cttggaggca ttagattaca aggagtgtga gtggccactg acacatacga ttggaacatc 4080 agttgaagag agtgaaatgt tcatgccgag atcaatcgga ggcccagtta gctctcacaa 4140 tcatatccct ggatacaagg ttcagacgaa cggaccttgg atgcaggtac cactagaagt 4200 gaagagagaa gcttgcccag 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tgggcctgtg tgcatttctg gcaacccgca tatttgggcg 5100 aaggagtatc ccagtgaatg aggcactcgc agcagctggt ctagtgggag tgctggcagg 5160 actggctttt caggagatgg agaacttcct tggtccgatt gcagttggag gactcctgat 5220 gatgctggtt agcgtggctg ggagggtgga tgggctagag ctcaagaagc ttggtgaagt 5280 ttcatgggaa gaggaggcgg agatcagcgg gagttccgcc cgctatgatg tggcactcag 5340 tgaacaaggg gagttcaagc tgctttctga agagaaagtg ccatgggacc aggttgtgat 5400 gacctcgctg gccttggttg gggctgccct ccatccattt gctcttctgc tggtccttgc 5460 tgggtggctg tttcatgtca ggggagctag gagaagtggg gatgtcttgt gggatattcc 5520 cactcctaag atcatcgagg· aatgtgaaca tctggaggat gggatttatg gcatattcca 5580 gtcaaccttc ttgggggcct cccagcgagg agtgggagtg gcacagggag gggtgttcca 5640 cacaatgtgg catgtcacaa gaggagcttt ccttgtcagg aatggcaaga agttgattcc 5700 atcttgggct tcagtaaagg aagaccttgt cgcctatggt ggctcatgga agttggaagg 5760 cagatgggat ggagaggaag aggtccagtt gatcgcggct gttccaggaa agaacgtggt 5820 caacgtccag acaaaaccga gcttgttcaa agtgaggaat gggggagaaa tcggggctgt 5880 cgctcttgac tatccgagtg gcacttcagg atctcctatt gttaacagga acggagaggt 5940 gattgggctg tacggcaatg gcatccttgt cggtgacaac tccttcgtgt ccgccatatc 6000 ccagactgag gtgaaggaag aaggaaagga ggagctccaa gagatcccga caatgctaaa 6060 gaaaggaatg acaactgtcc ttgattttca tcctggagct gggaagacaa gacgtttcct 6120 cccacagatc ttggccgagt gcgcacggag acgcttgcgc actcttgtgt tggcccccac 6180 cagggttgtt ctttctgaaa tgaaggaggc ttttcacggc ctggacgtga aattccacac 6240 acaggctttt tccgctcacg gcagcgggag agaagtcatt gatgccatgt gccatgccac 6300 cctaacttac aggatgttgg aaccaactag ggttgttaac tgggaagtga tcattatgga 6360 tgaagcccat tttttggatc cagctagcat agccgctaga ggttgggcag cgcacagagc 6420 tagggcaaat gaaagtgcaa caatcttgat gacagccaca ccgcctggga ctagtgatga 6480 atttccacat tcaaatggtg aaatagaaga tgttcaaacg gacataccca gtgagccctg 6540 gaacacaggg catgactgga tcctggctga caaaaggccc acggcatggt tccttccatc 6600 catcagagct gcaaatgtca tggctgcctc tttgcgtaag gctggaaaga gtgtggtggt 6660 cctgaacagg aaaacctttg agagagaata ccccacgata aagcagaaga aacctgactt 6720

tatattggcc actgacatag ctgaaatggg agccaacctt tgcgtggagc gagtgctgga 6780 ttgcaggacg gcttttaagc ctgtgcttgt ggatgaaggg aggaaggtgg caataaaagg 6840 gccacttcgt atctccgcat cctctgctgc tcaaaggagg gggcgcattg ggagaaatcc 6900 caacagagat ggagactcat actactattc tgagcctaca agtgaaaata atgcccacca 6960 cgtctgctgg ttggaggcct caatgctctt ggacaacatg gaggtgaggg gtggaatggt 7020 cgccccactc tatggcgttg aaggaactaa aacaccagtt tcccctggtg aaatgagact 7080 gagggatgac cagaggaaag tcttcagaga actagtgagg aattgtgacc tgcccgtttg 7140 gctttcgtgg caagtggcca aggctggttt gaagacgaat gatcgtaagt ggtgttttga 7200 aggccctgag gaacatgaga tcttgaatga cagcggtgaa acagtgaagt gcagggctcc 7260 tggaggagca aagaagcctc tgcgcccaag gtggtgtgat gaaagggtgt catctgacca 7320 gagtgcgctg tctgaattta ttaagtttgc tgaaggtagg aggggagctg ctgaagtgct 7380 agttgtgctg agtgaactcc ctgatttcct ggctaaaaaa ggtggagagg caatggatac 7440 catcagtgtg ttcctccact ctgaggaagg ctctagggct taccgcaatg cactatcaat 7500 gatgcctgag gcaatgacaa tagtcatgct gtttatactg gctggactac tgacatcggg 7560 aatggtcatc tttttcatgt ctcccaaagg catcagtaga atgtctatgg cgatgggcac 7620 aatggccggc tgtggatatc tcatgttcct tggaggcgtc aaacccactc acatctccta 7680 tgtcatgctc atattctttg tcctgatggt ggttgtgatc cccgagccag ggcaacaaag 7740 gtccatccaa gacaaccaag tggcatacct cattattggc atcctgacgc tggtttcagc 7800 ggtggcagcc aacgagctag gcatgctgga gaaaaccaaa gaggacctct ttgggaagaa 7860 gaacttaatt ccatctagtg cttcaccctg gagttggccg gatcttgacc tgaagccagg 7920 agctgcctgg acagtgtacg ttggcattgt tacaatgctc tctccaatgt tgcaccactg 7980 gatcaaagtc gaatatggca acctgtctct gtctggaata gcccagtcag cctcagtcct 8040 ttctttcatg gacaagggga taccattcat gaagatgaat atctcggtca taatgctgct 8100 ggtcagtggc tggaattcaa taacagtgat gcctctgctc tgtggcatag ggtgcgccat 8160 gctccactgg tctctcattt tacctggaat caaagcgcag cagtcaaagc ttgcacagag 8220 aagggtgttc catggcgttg ccaagaaccc tgtggttgat gggaatccaa cagttgacat 8280 tgaggaagct cctgaaatgc ctgcccttta tgagaagaaa ctggctctat atctccttct 8340 tgctctcagc ctagcttctg ttgccatgtg cagaacgccc ttttcattgg ctgaaggcat 8400 tgtcctagca tcagctgcct tagggccgct catagaggga aacaccagcc ttctttggaa 8460 tggacccatg gctgtctcca tgacaggagt catgaggggg aatcactatg cttttgtggg 8520 agtcatgtac aatctatgga agatgaaaac tggacgccgg gggagcgcga atggaaaaac 8580 tttgggtgaa gtctggaaga gggaactgaa tctgttggac aagcgacagt ttgagttgta 8640 taaaaggacc gacattgtgg aggtggatcg tgatacggca cgcaggcatt tggccgaagg 8700 gaaggtggac accggggtgg cggtctccag ggggaccgca aagttaaggt ggttccatga 8760 gcgtggctat gtcaagctgg aaggtagggt gattgacctg gggtgtggcc gcggaggctg 8820 gtgttactac gctgctgcgc aaaaggaagt gagtggggtc aaaggattta ctcttggaag 8880 agacggccat gagaaaccca tgaatgtgca aagtctggga tggaacatca tcaccttcaa 8940 ggacaaaact gatatccacc gcctagaacc agtgaaatgt gacacccttt tgtgtgacat 9000 ^ggagagtca tcatcgtcat cggtcacaga gggggaaagg accgtgagag ttcttgatac 9060 tgtagaaaaa tggctggctt gtggggttga caacttctgt gtgaaggtgt tagctccata 9120 catgccagat gttcttgaga aactggaatt gctccaaagg aggtttggcg gaacagtgat 9180 caggaaccct ctctccagga attccactca tgaaatgtac tacgtgtctg gagcccgcag 9240 caatgtcaca tttactgtga accaaacatc ccgcctcctg atgaggagaa -tgaggcgtcc 9300 aactggaaaa gtgaccctgg aggctgacgt catcctccca attgggacac gcagtgttga 9360 gacagacaag ggacccctgg acaaagaggc catagaagaa agggttgaga ggataaaatc 9420 tgagtacatg acctcttggt tttatgacaa tgacaacccc tacaggacct ggcactactg 9480 tggctcctat gtcacaaaaa cctcaggaag tgcggcgagc atggtaaatg gtgttattaa 9540 aattctgaca tatccatggg acaggataga ggaggtcacc agaatggcaa tgactgacac 9600 aacccctttt ggacagcaaa gagtgtttaa agaaaaagtt gacaccagag caaaggatcc 9660 accagcggga actaggaaga tcatgaaagt tgtcaacagg. tggctgttcc gccacctggc 9720 cagagaaaag âgccccagac tgtgcacaaa ggaagaattt attgcaaaag tccgaagtca 9780 tgcagccatt ggagcttacc tggaagaaca agaacagtgg aagactgcca atgaggctgt 9840 ccaagaccca aagttctggg aactggtgga tgaagaaagg aagctgcacc aacaaggcag 9900 gtgtcggact tgtgtgtaca acatgatggg gaaaagagag aagaagctgt cagagtttgg 9960 gaaagcaaag ggaagccgtg ccatatggta tatgtggctg ggagcgcggt atcttgagtt 10020 tgaggccctg ggattcctga atgaggacca ttgggcttcc agggaaaact caggaggagg 10080 agtggaaggc attggcttac aatacctagg atatgtgatc agagacctgg ctgcaatgga 10140 tggtggtgga ttctacgcgg atgacaccgc tggatgggac acgcgcatca cagaggcaga 10200 ccttgatgat gaacaggaga tcttgaacta catgagccca catcacaaaa aactggcaca 10260 agcagtgatg gaaatgacat acaagaacaa agtggtgaaa gtgttgagac cagccccagg 10320 agggaaagcc tacatggatg tcataagtcg acgagaccag agaggatccg ggcaggtagt 10380 gacttatgct ctgaacacca tcaccaactt gaaagtccaa ttgatcagaa tggcagaagc 10440 agagatggtg atacatcacc aacatgttca agattgtgat gaatcagttc tgaccaggct 10500 ggaggcatgg ctcactgagc acggatgtaa cagactgaag aggatggcgg tgagtggaga 10560 cgactgtgtg gtccggccca tcgatgacag gttcggcctg gccctgtccc atctcaacgc 10620 catgtccaag gttagaaagg acatatctga atggcagcca tcaaaagggt ggaatgattg 10680 ggagaatgtg cccttctgtt cccaccactt ccatgaacta cagctgaagg atggcaggag 10740 gattgtggtg ccttgccgag aacaggacga gctcattggg agaggaaggg tgtctccagg 10800 aaacggctgg atgatcaagg aaacagcttg cctcagcaaa gcctatgcca acatgtggtc 10860 actgatgtat tttcacaaaa gggacatgag gctactgtca ttggctgttt cctcagctgt 10920 tcccacctca tgggttccac aaggacgcac aacatggtcg attcatggga aaggggagtg 10980 gatgaccacg gaagacatgc ttgaggtgtg gaacagagta tggataacca acaacccaca 11040 catgcaggac aagacaatgg tgaaaaaatg gagagatgtc ccttatctaa ccaagagaca 11100 agacaagctg tgcggatcac tgattggaat gaccaatagg gccacctggg cctcccacat 11160 ccatttagtc atccatcgta tccgaacgct gattggacag gagaaataca ctgactacct 11220 aacagtcatg gacaggtatt ctgtggatgc tgacctgcaa ctgggtgagc ttatctgaaa 11280 caccatctaa caggaataac cgggatacaa accacgggtg gagaaccgga ctccccacaa 11340 cctgaaaccg ggatataaac cacggctgga gaaccgggct ccgcacttaa aatgaaacag 11400 aaaccgggat aaaaactacg gatggagaac cggactccac acattgagac agaagaagtt 11460 gtcagcccag aaccccacac gagttttgcc actgctaagc tgtgaggcag tgcaggctgg 11520 gacagccgac ctccaggttg cgaaaaacct ggtttctggg acctcccacc ccagagtaaa 11580 aagaacggag cctccgctac caccctccca cgtggtggta gaaagacggg gtctagaggt 11640 tagaggagac cctccaggga acaaatagtg ggaccatatt gacgccaggg aaagaccgga 11700 gtggttctct gcttttcctc cagaggtctg tgagcacagt ttgctcaaga ataagcagac 11760 ctttggatga caaacacaaa accac 11785

<210> 8 <211> 3718 <212> PRT

<213> Simian immunodeficiency virus <400> 8

Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met vai Arg 1 5 10 15

Arg Gly vai Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys Gln 20 25 30

Ile Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly vai Gln Gly Phe Ile Phe 35 40 45

Phe Phe Leu Phe Asn Ile Leu Thr Gly Lys Lys Ile Thr Ala His Leu 50 55 60

Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gln Gly Leu Ala Val Leu 65 70 75 80

Arg Lys Val Lys Arg vai Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser Ser 85 90 95

Arg Lys Arg Arg ser His Asp vai Leu Thr vai Gln Phe Leu Ile Leu 100 105 110

Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly vai Thr Leu vai Arg Lys Asn Arg 115 120 125 Trp Leu Leu Leu Asn vai Thr Ser Glu Asp Leu Gly Lys Thr Phe Ser 130 135 140

vai Gly Thr Gly Asn Cys Thr Thr Asn lie Leu Glu Ala Lys Tyr Trp 145 150 155 160

Cys Pro Asp Ser Met Glu Tyr Asn Cys Pro Asn Leu Ser Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Pro Asp Asp Ile Asp Cys Trp Cys Tyr Gly val Glu Asn vai Arg 180 185 190

vai Ala Tyr Gly Lys Cys Asp Ser Ala Gly Arg Ser Arg Arg Ser Arg 195 200 205

Arg Ala Ile Asp Leu Pro Thr His Glu Asn His Gly Leu Lys Thr Arg 210 215 220

Gln Glu Lys Trp Met Thr Gly Arg Met Gly Glu Arg Gln Leu Gln Lys 225 230 235 240

Ile Glu Arg Trp Phe vai Arg Asn Pro Phe Phe Ala vai Thr Ala Leu 245 250 255

Thr Ile Ala Tyr Leu Val Gly Ser Asn Met Thr Gln Arg Val vai Ile 260 265 270

Ala Leu Leu vai Leu Ala Val Gly Pro Ala Tyr Ser Ala His Cys Ile 275 280 285

Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His Gly Gly Thr Trp 290 295 300

vai Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys vai Thr Val Met Ala Pro 305 310 315 320

Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Glu Thr vai Ala Ile Asp Arg 325 330 335

Pro Ala Glu Ala Arg Lys vai Cys Tyr Asn Ala vai Leu Thr His Val 340 345 350

Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu Ala His Leu Ala Glu 355 360 365

Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr Tyr Ser Asp Arg Gly 370 375 380

Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile vai Ala Cys 385 390 395 400 Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu Phe Glu Val Asp Gln 405 410 415

Thr Lys Ile Gln Tyr vai Ile Arg Ala Gln Leu His vai Gly Ala Lys 420 425 430

Gln Glu Asn Trp Asn Thr Ser Ile Lys Thr Leu Lys Phe Asp Ala Leu 435 440 445

Ser Gly Ser Gln Glu Val Glu Phe Ile Gly Tyr Gly Lys Ala Thr Leu 450 455 460

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Glu Met Glu Thr Glu Ser Trp Ile vai Asp Arg Gln Trp Ala Gln Asp 485 490 495

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His His Leu vai Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala Thr Ile Arg Val 515 520 525

Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys Thr Ala Leu Thr Gly 530 535 540

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Lys Gly Thr ser Tyr Lys Ile Cys Thr Asp Lys Met Phe Phe vai Lys 580 585 590

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Ser Thr Asn Asp Asp Glu vai Leu Ile Glu vai Asn Pro Pro Phe Gly 645 650 655

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Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met 675 680 685 Lys Gly vai Glu Arg Leu Ala vai Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe 690 695 700

Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr 705 710 715 720

vai Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile 725 730 735

Thr Lys vai Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp vai Gly Ile Asn Thr 740 745 750

Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met 755 760 765

Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala Asp Gln Gly Ser Ala Ile Asn 770 775 780

Phe Gly Arg Gly Leu Ala Glu ser Leu Leu Glu Asn Lys Glu Gly Cys 785 790 795 800

Gln Lys Ile Leu ser Val Leu Ala Pro Leu vai Pro Thr Gly Ser Glu 805 810 815

Asn Leu Lys Ser Leu Tyr Asn Thr Val Cys vai Ile Trp Cys Ile His 820 825 830

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Leu Asn Ala Trp vai Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu 900 905 910

Val val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp 915 920 925

Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Val Gly Asp His Gln Ala Ala Met Gln 930 935 940

Ile Ile Arg Asp Ile Ile Asn Glu Glu Ala Ala Asp Trp Asp Leu Gln 945 950 955 960 His Pro Gln Pro Ala Pro Gln Gln Gly Gln Leu Arg Glu Pro Ser Gly 965 970 975

Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ser Val Asp Glu Gln Ile Gln Trp 980 985 990

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Trp Ile Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Thr Ser Leu Gly

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Lys Ala vai His Gln vai Phe Gly Ser vai Tyr Thr Thr Met Phe

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Gly Gly Val Ser Trp Met Ile Arg Ile Leu Ile Gly Phe Leu vai

1040 1045 1050

Leu Trp Ile Gly Thr Asn Ser Arg Asn Thr Ser Met Ala Met Thr

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Cys Ile Ala vai Gly Gly Ile Thr Leu Phe Leu Gly Phe Thr Val

1070 1075 1080

Gly Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu

1085 1090 1095

Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp Ser Asp Asp Trp

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Leu Asn Lys Tyr ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro vai Lys Leu Ala

1115 1120 1125

Ser Ile vai Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly Leu Asn

1130 1135 1140

Ser vai Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala Asp

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Glu Ile Asn Thr Ile Phe Glu Glu Asn Glu Val Asp Ile Ser Val

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Val Val Gln Asp Pro Lys Asn vai Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro

1175 1180 1185

Phe Ser Arg Ile Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp

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Gly Lys Asn Leu vai Phe Ser Pro Gly Arg Lys Asn Gly Ser Phe

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lie Ile Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro Phe Ser Asn Arg

1220 1225 1230 vai Trp Asn Ser Phe Gln Ile Glu Glu Phe Gly Thr Gly Val Phe

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Thr Thr Arg vai Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr Ile Asp

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Cys Asp Gly Ser Ile Leu Gly Ala Ala vai Asn Gly Lys Lys Ser

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Ala His Gly Ser Pro Thr Phe Trp Met Gly Ser His Glu vai Asn

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Gly Thr Trp Met Ile His Thr Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu

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Cys Glu Trp Pro Leu Thr His Thr Ile Gly Thr Ser vai Glu Glu

1310 1315 1320

Ser Glu Met Phe Met Pro Arg ser Ile Gly Gly Pro vai Ser Ser

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His Asn His Ile Pro Gly Tyr Lys vai Gln Thr Asn Gly Pro Trp

1340 1345 1350

Met Gln Val Pro Leu Glu vai Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr

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Ser Val lie Ile Asp Gly Asn Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr

1370 1375 1380

Arg ser Thr Thr Asp Ser Gly Lys vai Ile Pro Glu Trp Cys Cys

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Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro vai Ser Phe His Gly Ser Asp Gly

1400 1405 1410

Cys Trp Tyr Pro Met Glu Ile Arg Pro Arg Lys Thr His Glu Ser

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His Leu vai Arg Ser Trp vai Thr Ala Gly Glu Ile His Ala vai

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Pro Phe Gly Leu vai Ser Met Met Ile Ala Met Glu vai Val Leu

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Arg Lys Arg Gln Gly Pro Lys Gln Met Leu Val Gly Gly Val Val

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Leu Leu Gly Ala Met Leu vai Gly Gln vai Thr Leu Leu Asp Leu

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Asn Gly Gly Asp Ala Met Tyr Met Ala Leu Ile Ala Ala Phe ser 1505 1510 1515

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1760 1765 1770

Ala Leu Leu Leu vai Leu Ala Gly Trp Leu Phe His vai Arg Gly

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Ala Arq Arg Ser Gly Asp vai Leu Trp Asp Ile Pro Thr Pro Lys

1790 1795 1800

Ile Ile Glu Glu Cys Glu His Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Gly Ile

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Phe Gln Ser Thr Phe Leu Gly Ala Ser Gln Arg Gly Val Gly Val

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Ala Gln Gly Gly Val Phe His Thr Met Trp His vai Thr Arg Gly

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Ala Phe Leu vai Arg Asn Gly Lys Lys Leu Ile Pro Ser Trp Ala

1850 1855 1860

Ser Val Lys Glu Asp Leu Val Ala Tyr Gly Gly Ser Trp Lys Leu

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Glu Gly Arg Trp Asp Gly Glu Glu Glu vai Gln Leu Ile Ala Ala

1880 1885 1890

Val Pro Gly Lys Asn Val vai Asn Val Gln Thr Lys Pro Ser Leu

1895 1900 1905

Phe Lys vai Arg Asn Gly Gly Glu Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp

1910 1915 1920

Tyr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile Val Asn Arg Asn Gly

1925 1930 1935

Glu Val Ile Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Ile Leu vai Gly Asp Asn

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Ser Phe vai Ser Ala Ile Ser Gln Thr Glu vai Lys Glu Glu Gly

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Lys Glu Glu Leu Gln Glu Ile Pro Thr Met Leu Lys Lys Gly Met

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Thr Thr Val Leu Asp Phe His Pro Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg

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Ser Ala His Gly Ser Gly Arg Glu Val Ile Asp Ala Met Cys His 2045 2050 2055

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Asp Ile Pro Ser Glu Pro Trp Asn Thr Gly His Asp Trp Ile Leu 2135 2140 2145

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Lys Gly Pro Leu Arg Ile Ser Ala Ser Ser Ala Ala Gln Arg Arg 2240 2245 2250

Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Asn Arg Asp Gly Asp Ser Tyr Tyr 2255 2260 2265

Tyr ser Glu Pro Thr ser Glu Asn Asn Ala His His Val Cys Trp 2270 2275 2280 Leu Glu Ala Ser Met Leu Leu Asp Asn Met Glu Val Arg Gly Gly 2285 2290 2295

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Gln vai Ala Lys Ala Gly Leu Lys Thr Asn Asp Arg Lys Trp Cys 2345 2350 2355

Phe Glu Gly Pro Glu Glu His Glu Ile Leu Asn Asp Ser Gly Glu 2360 2365 2370

Thr vai Lys Cys Arg Ala Pro Gly Gly Ala Lys Lys Pro Leu Arg 2375 2380 2385

Pro Arg Trp Cys Asp Glu Arg vai Ser Ser Asp Gln Ser Ala Leu 2390 2395 2400

Ser Glu Phe Ile Lys Phe Ala Glu Gly Arg Arg Gly Ala Ala Glu 2405 2410 2415

vai Leu vai vai Leu Ser Glu Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Lys 2420 2425 2430

Gly Gly Glu Ala Met Asp Thr Ile Ser vai Phe Leu His Ser Glu 2435 2440 2445

Glu Gly Ser Arg Ala Tyr Arg Asn Ala Leu Ser Met Met Pro Glu 2450 2455 2460

Ala Met Thr Ile Val Met Leu Phe Ile Leu Ala Gly Leu Leu Thr 2465 2470 2475

Ser Gly Met vai Ile Phe Phe Met Ser Pro Lys Gly Ile ser Arg 2480 2485 2490

Met Ser Met Ala Met Gly Thr Met Ala Gly Cys Gly Tyr Leu Met 2495 2500 2505

Phe Leu Gly Gly Val Lys Pro Thr His Ile ser Tyr Val Met Leu 2510 2515 2520

Ile Phe Phe Val Leu Met Val vai Val Ile Pro Glu Pro Gly Gln 2525 2530 2535 Gln Arq Ser Ile Gln Asp Asn Gln vai Ala Tyr Leu Ile Ile Gly

2540 2545 2550

Ile Leu Thr Leu Val Ser Ala vai Ala Ala Asn Glu Leu Gly Met

2555 2560 2565

Leu Glu Lys Thr Lys Glu Asp Leu Phe Gly Lys Lys Asn Leu Ile

2570 2575 2580

Pro Ser ser Ala Ser Pro Trp Ser Trp Pro Asp Leu Asp Leu Lys

2585 2590 2595

Pro Gly Ala Ala Trp Thr vai Tyr vai Gly Ile vai Thr Met Leu

2600 2605 2610

Ser Pro Met Leu His His Trp Ile Lys vai Glu Tyr Gly Asn Leu

2615 2620 2625

Ser Leu Ser Gly Ile Ala Gln Ser Ala Ser Val Leu Ser Phe Met

2630 2635 2640

Asp Lys Gly lie Pro Phe Met Lys Met Asn lie Ser vai Ile Met

2645 2650 2655

Leu Leu vai Ser Gly Trp Asn Ser Ile Thr vai Met Pro Leu Leu

2660 2665 2670

Cys Gly Ile Gly Cys Ala Met Leu His Trp Ser Leu Ile Leu Pro

2675 2680 2685

Gly Ile Lys Ala Gln Gln Ser Lys Leu Ala Gln Arg Arg vai Phe

2690 2695 2700

His Gly vai Ala Lys Asn Pro vai Val Asp Gly Asn Pro Thr Val

2705 2710 2715

Asp Ile Glu Glu Ala Pro Glu Met Pro Ala Leu Tyr Glu Lys Lys

2720 2725 2730

Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Leu Ala Leu ser Leu Ala Ser vai Ala

2735 2740 2745

Met Cys Arg Thr Pro Phe Ser Leu Ala Glu Gly Ile vai Leu Ala

2750 2755 2760

Ser Ala Ala Leu Gly Pro Leu lie Glu Gly Asn Thr Ser Leu Leu

2765 2770 2775

Trp Asn Gly Pro Met Ala vai Ser Met Thr Gly vai Met Arg Gly

2780 2785 2790

Asn His Tyr Ala Phe vai Gly vai Met Tyr Asn Leu Trp Lys Met

2795 2800 2805 Lys Thr Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asn Gly Lys Thr Leu Gly Glu 2810 2815 2820

vai Trp Lys Arq Glu Leu Asn Leu Leu Asp Lys Arg Gln Phe Glu 2825 2830 2835

Leu Tyr Lys Arg Thr Asp Ile Val Glu vai Asp Arg Asp Thr Ala 2840 2845 2850

Arg Arg His Leu Ala Glu Gly Lys vai Asp Thr Gly Val Ala val 2855 2860 2865

Ser Arg Gly Thr Ala Lys Leu Arg Trp Phe His Glu Arg Gly Tyr 2870 2875 2880

vai Lys Leu Glu Gly Arg Val Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly 2885 2890 2895

Gly Trp Cys Tyr Tyr Ala Ala Ala Gln Lys Glu Val Ser Gly vai 2900 2905 2910

Lys Gly Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly His Glu Lys Pro Met Asn 2915 2920 2925

vai Gln Ser Leu Gly Trp Asn Ile Ile Thr Phe Lys Asp Lys Thr 2930 2935 2940

Asp Ile His Arg Leu Glu Pro vai Lys Cys Asp Thr Leu Leu Cys 2945 2950 2955

Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ser Ser vai Thr Glu Gly Glu Arg 2960 2965 2970

Thr vai Arg Val Leu Asp Thr Val Glu Lys Trp Leu Ala Cys Gly 2975 2980 2985

vai Asp Asn Phe Cys vai Lys vai Leu Ala Pro Tyr Met Pro Asp 2990 2995 3000

Val Leu Glu Lys Leu Glu Leu Leu Gln Arg Arg Phe Gly Gly Thr 3005 3010 3015

vai Ile Arg Asn Pro Leu Ser Arg Asn Ser Thr His Glu Met Tyr 3020 3025 3030

Tyr Val ser Gly Ala Arg ser Asn vai Thr Phe Thr Val Asn Gln 3035 3040 3045

Thr Ser Arg Leu Leu Met Arg Arg Met Arg Arg Pro Thr Gly Lys 3050 3055 3060 vai Thr Leu Glu Ala Asp Val Ile Leu Pro Ile Gly Thr Arg ser 3065 3070 3075

vai Glu Thr Asp Lys Gly Pro Leu Asp Lys Glu Ala Ile Glu Glu 3080 3085 3090

Arg vai Glu Arg Ile Lys ser Glu Tyr Met Thr Ser Trp Phe Tyr 3095 3100 3105

Asp Asn Asp Asn Pro Tyr Arg Thr Trp His Tyr Cys Gly ser Tyr 3110 3115 3120

vai Thr Lys Thr Ser Gly ser Ala Ala Ser Met vai Asn Gly val 3125 3130 3135

Ile Lys lie Leu Thr Tyr Pro Trp Asp Arg Ile Glu Glu Val Thr 3140 3145 3150

Arg Met Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg vai 3155 3160 3165

Phe Lys Glu Lys vai Asp Thr Arg Ala Lys Asp Pro Pro Ala Gly 3170 3175 3180

Thr Arg Lys Ile Met Lys vai Val Asn Arg Trp Leu Phe Arg His 3185 3190 3195

Leu Ala Arg Glu Lys Ser Pro Arg Leu Cys Thr Lys Glu Glu Phe 3200 3205 3210

Ile Ala Lys vai Arg Ser His Ala Ala Ile Gly Ala Tyr Leu Glu 3215 3220 3225

Glu Gln Glu Gln Trp Lys Thr Ala Asn Glu Ala vai Gln Asp Pro 3230 3235 3240

Lys Phe Trp Glu Leu vai Asp Glu Glu Arg Lys Leu His Gln Gln 3245 3250 3255

Gly Arg Cys Arg Thr Cys vai Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu 3260 3265 3270

Lys Lys Leu Ser Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile 3275 3280 3285

Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Leu 3290 3295 3300

Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp Ala Ser Arg Glu Asn ser Gly 3305 3310 3315

Gly Gly vai Glu Gly Ile Gly Leu Gln Tyr Leu Gly Tyr Val Ile 3320 3325 3330 Arg Asp Leu Ala Ala Met Asp Gly Gly Gly Phe Tyr Ala Asp Asp 3335 3340 3345

Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile Thr Glu Ala Asp Leu Asp Asp 3350 3355 3360

Glu Gln Glu Ile Leu Asn Tyr Met Ser Pro His His Lys Lys Leu 3365 3370 3375

Ala Gln Ala vai Met Glu Met Thr Tyr Lys Asn Lys Val vai Lys 3380 3385 3390

Val Leu Arg Pro Ala Pro Gly Gly Lys Ala Tyr Met Asp Val Ile 3395 3400 3405

Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly Ser Gly Gln Val vai Thr Tyr Ala 3410 3415 3420

Leu Asn Thr Ile Thr Asn Leu Lys vai Gln Leu lie Arg Met Ala 3425 3430 3435

Glu Ala Glu Met vai Ile His His Gln His vai Gln Asp Cys Asp 3440 3445 3450

Glu Ser Val Leu Thr Arg Leu Glu Ala Trp Leu Thr Glu His Gly 3455 3460 3465

Cys Asn Arg Leu Lys Arg Met Ala vai Ser Gly Asp Asp Cys val 3470 3475 3480

vai Arg Pro Ile Asp Asp Arg Phe Gly Leu Ala Leu Ser His Leu 3485 3490 3495

Asn Ala Met ser Lys Val Arg Lys Asp Ile Ser Glu Trp Gln Pro 3500 3505 3510

Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp Glu Asn vai Pro Phe Cys Ser His 3515 3520 3525

His Phe His Glu Leu Gln Leu Lys Asp Gly Arg Arg Ile vai vai 3530 3535 3540

Pro Cys Arg Glu Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Gly Arg vai Ser 3545 3550 3555

Pro Gly Asn Gly Trp Met Ile Lys Glu Thr Ala Cys Leu Ser Lys 3560 3565 3570

Ala Tyr Ala Asn Met Trp Ser Leu Met Tyr Phe His Lys Arg Asp 3575 3580 3585 Met Arg Leu Leu ser Leu Ala vai ser Ser Ala vai Pro Thr Ser 3590 3595 3600

Trp vai Pro Gln Gly Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Gly Lys Gly 3605 3610 3615

Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Glu Val Trp Asn Arg val 3620 3625 3630

Trp Ile Thr Asn Asn Pro His Met Gln Asp Lys Thr Met vai Lys 3635 3640 3645

Lys Trp Arg Asp vai Pro Tyr Leu Thr Lys Arg Gln Asp Lys Leu 3650 3655 3660

Cys Gly Ser Leu Ile Gly Met Thr Asn Arg Ala Thr Trp Ala ser 3665 3670 3675

His Ile His Leu Val Ile His Arg Ile Arg Thr Leu Ile Gly Gln 3680 3685 3690

Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr Leu Thr vai Met Asp Arg Tyr Ser Val 3695 3700 3705

Asp Ala Asp Leu Gln Leu Gly Glu Leu Ile 3710 3715

<210> 9

<211> 508

<212> PRT

<213> Human immunodeficiency virus

<400> 9

Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Lys Trp

15 10 15

Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Thr Tyr Gln Leu Lys 20 25 30

His Ile vai Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala vai Asn Pro 35 40 45

Gly Leu Leu Glu Thr Gly Gly Gly Cys Lys Gln Ile Leu Val Gln Leu 50 55 60

Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Lys Ser Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Ala Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Gly Ile Glu vai Arg Asp 85 90 95

Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys 100 105 110 Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly Asn Ser Ser Gln val 115 120 125

Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His 130 135 140

Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp vai Lys vai Ile Glu 145 150 155 160

Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu vai Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu ser 165 170 175

Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr vai Gly 180 185 190

Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu 195 200 205

Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Ala His Ala Gly Pro Asn Ala 210 215 220

Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr 225 230 235 240

Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro vai 245 250 255

Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys 260 265 270

Ile vai Arg Met Tyr ser Pro vai Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly 275 280 285

Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr vai Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 290 295 300

Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr 305 310 315 320

Leu Leu vai Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala 325 330 335

Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly 340 345 350

Val Gly Gly Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser 355 360 365

Gln vai Thr ser Pro Ala Asn Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg 370 375 380

Asn Gln Arg Lys Thr Ile Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His 385 390 395 400 Leu Ala Arg His Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys 405 410 415

Gly Arg Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn 420 425 430

Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe 435 440 445

Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg 450 455 460

Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gln Lys Gln Glu Pro Leu Pro 465 470 475 480

Ser Gln Lys Gln Glu Thr Ile Asp Lys Asp Leu Tyr Pro Leu Ala Ser 485 490 495

Leu Lys Ser Leu Phe Gly Asn Asp Pro Ser Leu Gln 500 505

Claims

1. Composição farmacêutica para infecção causada por lentivirus caracterizado por compreender: (a) um virus recombinante da febre amarela que expressa um polipeptídeo heterólogo compreendendo ao menos um fragmento de um polipeptídeo lentiviral; e, (b) um veículo farmacêutico; onde a composição compreende uma quantidade efetiva de um vírus recombinante da febre amarela para induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica contra a infecção causada por lentivirus.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polipeptídeo heterólogo compreender ao menos um fragmento do polipeptídeo Gag do HIV ou ao menos um fragmento do polipeptídeo Gag do SIV.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polipeptídeo heterólogo compreender ao menos um fragmento da SEQ ID NO:9.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o fragmento compreender ao menos 8, 9, -10, 20, 30, 40, 50, 100 ou 200 aminoácidos contínuos da SEQ ID NO: 9.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o fragmento compreender os aminoácidos -45-269 da SEQ ID NO:9.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polipeptídeo heterólogo compreender uma seqüência de aminoácido C-terminal compreendendo KESSIG.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vírus recombinante de febre amarela ser o YF17D.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vírus recombinante de febre amarela compreender uma seqüência codificante para o polipeptídeo heterólogo inserido entre as seqüências codificantes para o polipeptídeo E e polipeptídeo NSl.

9. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vírus recombinante de febre amarela compreender uma seqüência codificante para o polipeptídeo heterólogo que é otimizada segundo a freqüência do uso de códons do vírus da febre amarela.

10. Composição farmacêutica para infecção causada por lentivirus caracterizado por compreender uma mistura de vírus recombinantes de febre amarela, onde a mistura compreende: (a) um primeiro vírus recombinante de febre amarela que expressa um primeiro polipeptídeo heterólogo compreendendo ao menos um fragmento de um polipeptídeo Gag lentiviral; (b) um segundo vírus recombinante de febre amarela que expressa um segundo polipeptídeo heterólogo compreendendo ao menos um fragmento de um polipeptídeo Vif lentiviral; (c) um terceiro vírus recombinante de febre amarela que expressa um terceiro polipeptídeo heterólogo compreendendo ao menos um fragmento de um polipeptídeo Nef lentiviral; e, (d) um veículo farmacêutico, onde a composição compreende uma quantidade efetiva de uma mistura para induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica contra infecção lentiviral.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por o polipeptideo Gag ser o polipeptideo Gag de HIV, o polipeptideo Vif ser o polipeptideo Vif de HIV e o polipeptideo Nef ser o polipeptideo Nef de HIV.

12. Método para induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica contra HIV caracterizado por o método compreender administrar a composição definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 a um individuo que necessita da mesma.

13. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por compreender ainda administrar uma dose inicial da composição ("priming") antes de administrar a composição de qualquer uma das reivindicações 7 a 18, onde a dose inicial compreende um DNA que codifica um ou mais dos polipeptideos de HIV ou fragmentos do mesmo e/ou a dose inicial da composição compreende rBCG que expressa um ou mais dos polipeptideos de HIV ou fragmentos dos mesmos.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por a composição ser administrada em duas ou mais vezes subseqüentes, aguardando ao menos 4-12 semanas antes da administração subseqüente.

15. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por a resposta imune protetora ou terapêutica contra HIV incluir uma resposta de célula T CD4+ e/ou uam resposta em célula T CD8+.

16. Vacina para induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica contra HIV caracterizado por a vacina compreender: (a) um virus recombinante da febre amarela que expressa um polipeptídeo heterólogo compreendendo ao menos um fragmento de um polipeptídeo lentiviral; e, (b) um veículo farmacêutico; onde a composição compreende uma quantidade efetiva de um vírus recombinante da febre amarela para induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica contra a infecção causada por lentivirus.

17. Vacina para induzir uma resposta imune protetora ou terapêutica contra HIV caracterizado por a vacina compreender uma mistura de vírus recombinantes de febre amarela, a mistura compreendendo: (a) um primeiro vírus recombinante de febre amarela que expressa um primeiro polipeptídeo heterólogo compreendendo ao menos um fragmento de um polipeptídeo Gag lentiviral; (b) um segundo vírus recombinante de febre amarela que expressa um segundo polipeptídeo heterólogo compreendendo ao menos um fragmento de um polipeptídeo Vif lentiviral; (c) um terceiro vírus recombinante de febre amarela que expressa um terceiro polipeptídeo heterólogo compreendendo ao menos um fragmento de um polipeptídeo Nef lentiviral; e, (d) um veículo farmacêutico.

18. Fragmento de 45 a 2 69 da proteína Gag usado no desenho de um cassete heterólogo de SIV caracterizado por o fragmento compreender a SEQ ID N0:1.

19. Proteína recombinante de 4 5 a 2 69 aminoácidos da proteína Gag caracterizado por compreender a SEQ ID NO: 2.

20. Gene recombinante da proteína Gag 45-269 de SIV caracterizado por compreender a SEQ ID NO: 6.

21. Seqüência de nucleotídeo de vírus recombinante de febre amarela que expressa a proteína Gag 45 a 269 caracterizado por compreender a SEQ ID NQ: 7.

22. Precursor de proteína que codifica para a proteína os aminoácidos 45 a 269 da proteína Gag do vírus SIV caracterizado por compreender a SEQ ID NO: 8.

23. Método para produzir proteínas de lentivirus ou polipeptídeos relacionados caracterizado por o método compreender as etapas de: (a) introdução de ao menos um vetor ou um sistema vetor na célula hospedeira, o vetor ou o sistema vetor incluindo uma seqüência de ácido nucléico que codifica ao menos uma proteína imunogênica de lentivirus ou polipeptídeo relacionado, a seqüência de ácido nucléico possuindo ao menos 90% de identidade com seqüência definida como SED ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7 ou a proteína codificada possuindo ao menos 90% de identidade com as proteínas definidas pelas SEQ ID Nos: 1, 2, 8 ou 9 (ou ao menos 95%, -96%, 97% ou 99% de identidade com as seqüências mencionadas); (b) realização da expressão da seqüência de ácido nucléico na célula hospedeira; e, (c) produção da proteína antigênica codificada de lentivirus ou polipeptídeos relacionados dentro da célula hospedeira.

24. Método de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por compreender introduzir dois ou mais vetores ou sistemas vetores.

25. Método de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por o vetor ou sistema vetor incluir uma seqüência de ácido nucléico que codifica duas ou mais proteínas imunogênicas de lentivirus ou polipeptídeos relacionados.