BRPI0914416B1 - Método para produzir uma planta transgênica - Google Patents

Abstract

métodos e dispositivos para melhorar a eficiência do uso da água pelas plantas a invenção se refere aos métodos para produção de um fenótipo desejado em uma planta por manipulação de expressão gênica dentro da planta. o método se refere aos dispositivos que inibem o nível da expressão ou atividade do gene pk220, onde um fenótipo desejado é obtido, tal como, eficiência melhorada do uso da água em relação a uma planta de controle do tipo silvestre. a invenção também se refere às sequencias e construções de ácido nucléico úteis, a tais métodos e aos métodos para geração e isolamento de plantas apresentando expressão ou atividade de pk220 diminuída.

Description

REFERÊNCIA AOS PEDIDOS CORRELATOS

[001]Este pedido reivindica o benefício do US número de série 61/132.067, depositado em 13 de junho de 2008, o conteúdo do mesmo sendo incorporado ao presente documento como referência, em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002]A invenção se refere ao campo da biologia molecular das plantas e se refere às plantas transgênicas possuindo fenótipos novos, métodos de produção de tais plantas e polinucleotídeos e polipeptídeos úteis em tais métodos. Mais especifi-camente, a invenção se refere à inibição de uma proteína cinase e plantas transgê- nicas possuindo atividade da proteína cinase inibida.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[003]A água é essencial para a sobrevivência, crescimento e reprodução das plantas. A assimilação de dióxido de carbono pela fotossíntese está diretamente li-gada a perda de água através dos estômatos. A produtividade da colheita que está proximamente ligada à produção da biomassa depende da eficiência do uso da água pela planta (WUE) especialmente nas condições limitadas de água (Passioura 1994 e Sinclair 1994, em Physiology and Determination of Crop Yield). A eficiência do uso da água no período de crescimento da planta pode ser calculada como uma taxa da biomassa produzida por unidade de água transpirada (Sinclair 1994). Medições ins-tantâneas da eficiência do uso da água podem também ser obtidas como a taxa de assimilação de dióxido de carbono para transpiração usando medições de troca de gás (Farquhar and Sharkey 1994, em Physiology and Determination of Crop Yield). Uma vez que existe uma correlação próxima entre a produtividade da colheita e a eficiência do uso da água, foram feitas muitas tentativas de estudar e entender esta relação entre os componentes genéticos envolvidos. De modo a maximizar a produ-tividade e o rendimento de uma colheita, foram feitos esforços para tentar melhorar a eficiência do uso da água pelas plantas (Condon e outros, 2002, Araus e outros, 2002, Davies e outros, 2002). Uma eficiência do uso da água mais alta pode ser ob-tida tanto por aumento da produção da biomassa e assimilação de dióxido de carbo-no quanto pela redução da perda da água de transpiração. Transpiração reduzida, especificamente sob condições de água sem limitação pode ser associada a uma taxa reduzida de crescimento e portanto, produtividade de colheita reduzida. Isto apresenta um dilema de como aperfeiçoar a produtividade da colheita e rendimento em condições limitadas de água porém também mantendo a mesma sob condições não limitadas de água ou irrigada (Condon e outros, 2002).

[004]Os aperfeiçoamentos com relação à eficiência do uso da água, atual-mente, vêm usando métodos de reprodução de plantas, pelo que, as variedades de alta eficiência do uso da água foram cruzadas com as variedades mais produtivas, porém com eficiência mais baixa do uso da água na tentativa de aperfeiçoamentos no rendimento da colheita sob condições limitadas de água (Condon e outros, 2002, Araus e outros, 2002). Abordagens de locais de traços quantitativos (QTL) para iden-tificar os componentes da eficiência do uso da água foram os métodos mais comuns historicamente usados (Mian e outros, 1996, Martin e outros, 1989, Thumma e outros, 2001, Price e outros, 2002) e mais recentemente foram feitas tentativas para construir plantas aperfeiçoadas por dispositivos genéticos moleculares.

[005]O primeiro gene associado à eficiência do uso da água foi o ERECTA. O gene ERECTA foi primeiro identificado como um gene funcionando no desenvol-vimento da inflorescência e morfogênese do órgão. (Torii e outros, 1996). Mais tarde foi verificado, por mapeamento de QTL, que ele era o maior contribuinte para a efici-ência da transpiração, definida como água transpirada por dióxido de carbono assi-milado, um indicador oposto à eficiência do uso da água em Arabidopsis (Masle e outros, 2005). ERECTA codifica uma cinase semelhante a receptor de repetição rica em leucina putativa (LRR-RLK). O mecanismo regulador de LRR-RLK ainda está por ser entendido embora tenham sido sugeridos devido, pelo menos em parte, os efeitos na densidade do estômato, expansão da célula epidérmica, proliferação da célula mesófila e contato célula-a-célula. A eficiência da transpiração normal foi restaurada mediante complementação usando ERECTA do tipo silvestre em eracta mutante. Contudo, não se sabe se a superexpressão de ERECTA na Arabidopsis transgê- nica resultará na eficiência de transpiração reduzida ou eficiência melhorada do uso da água. É o único relatório mostrando uma cinase semelhante a receptor de planta envolvida na eficiência da transpiração ou eficiência do uso da água.

[006]Outro gene de Arabidopsis implicado na eficiência do uso da água é o gene HARDY, encontrado através da classificação fenotípica de uma biblioteca mu-tante alvejada de ativação (Karaba e outros, 2007). A superexpressão de HARDY no arroz resultou em eficiência do uso da água aperfeiçoada por melhora da assimila-ção fotossintética e redução da transpiração. O arroz transgênico com expressão aumentada de HARDY exibiu biomassa de broto aumentada sob ótimas condições de água e biomassa de raiz aumentada sob condições limitadas de água. A supe- rexpressão de HARDY em Arabidopsis resultou em folhas mais espessas com mais células mesófilas e na biomassa da folha do arroz aumentada além de células da folha em feixe. Estas modificações contribuíram para atividade fotossintética e efici-ência melhoradas (Karaba e outros, 2007).

[007]As proteínas cinases são uma grande família de enzimas que modifi-cam proteínas por adição de grupos fosfato (fosforilação). As proteínas cinases constituem cerca de 2% de todos os genes eucarióticos, muitos dos quais mediam a resposta das células eucarióticas aos estímulos externos. Todas as proteínas cina- ses de subunidade simples contêm um domínio catalítico comum próximo ao término carboxila, enquanto o término amino desempenha um papel regulador.

[008]As cinases semelhantes a receptor das plantas são serina/treonina pro-teínas cinases com um peptídeo de sinal previsto no término amino, uma região de transmembrana simples e um domínio de cinase citoplásmico. Existem mais de 610 RLKs potencialmente codificados em Arabidopsis (Shiu and Bleecker 2001). As ci- nases semelhantes a receptores frequentemente fazem parte de uma cascata de sinalização. Elas interpretam sinais extracelulares, através da ligação de ligante e fosforilam alvos em uma cascata de sinalização que por sua vez afeta os processos celulares a jusante, tal como, expressão gênica (Hardie 1999).

[009]A identificação dos genes que podem ser manipulados para prover ca-racterísticas benéficas é altamente desejável. Assim, muitos são os dispositivos e métodos de utilização os genes identificados para afetas as características desejá-veis. A cinase semelhante a receptor identificada como At2g25220 na base de dados TAIR é uma serina/treonina cinase e um elemento da grande família de genes das cinases semelhantes a receptor com mais de 600 elementos na Arabidopsis (Shiu e outros, 2001). Contudo, exceto para anotação da sequência como uma ci- nase nenhuma função ou papel para o gene At2g25220 foi revelado. Na presente invenção, um gene de alta eficiência do uso da água (HWE) foi identificado o qual quando sua expressão ou atividade é inibida resulta em fenótipos benéficos, tais como, aperfeiçoamento do acúmulo de biomassa em relação à água utilizada. Isto ocorre sob ambas as condições não limitadas e limitadas de água e garante melhor crescimento e portanto, maior produtividade das plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010]Esta invenção se baseia na descoberta de uma mutação no gene PK220 que resulta em uma planta com um fenótipo alterado, tal como, por exemplo, eficiência melhorada do uso da água, tolerância à estiagem aumentada, sensibilida-de reduzida a temperaturas frias e inibição reduzida de crescimento das sementeiras em condições de nitrogênio baixo em comparação às plantas sem mutação.

[0011]Mais especificamente, a invenção se refere à identificação de uma planta mutante que compreende uma mutação no gene PK220 também referido no presente documento como gene HWE. O gene PK220 é uma proteína cinase seme-lhante ao receptor. A inibição da expressão ou atividade do gene PK220 nas plantas provê fenótipos benéficos, tais como, eficiência melhorada do uso da água em uma planta. O fenótipo de eficiência do uso da água aperfeiçoada resulta em plantas possuindo tolerância a estiagem aperfeiçoada.

[0012]Em um aspecto, a invenção provê um método para produção de uma planta transgênica, por transformação de uma planta, uma cultura de tecido de plan-ta ou uma célula de planta com um vetor contendo um construto de ácido nucléico que inibe a expressão ou atividade de um gene PK220 para obter uma planta, cultu-ra de tecido ou célula de planta com expressão ou atividade de PK220 diminuída e crescimento da planta ou regeneração de uma planta a partir da cultura de tecido de planta ou célula de planta, onde é produzida uma planta possuindo eficiência melhorada do uso da água.

[0013]Consequentemente, a presente invenção provê um método para pro-dução de uma planta possuindo uma propriedade aperfeiçoada, onde o método in-clui a inibição da expressão ou atividade de um gene PK220 endógeno, onde uma planta é produzida possuindo um fenótipo vantajoso ou propriedade aperfeiçoada. Em uma modalidade específica, a presente invenção provê um método para produ-ção de plantas possuindo eficiência melhorada do uso da água, onde o método inclui geração de plantas transgênicas e modificação do genoma das plantas usando os métodos descritos no presente documento.

[0014]Eficiência do uso da água se refere a uma taxa entre as quantidades da biomassa produzidas por unidade de água transpirada quando medida gravime- tricamente e a razão da taxa fotossintética para a taxa de transpiração quando me-dida usando quantificação de troca de gás de uma folha ou broto. Conforme usado no presente documento, o termo "eficiência melhorada do uso da água" se refere a uma eficiência do uso da água pela planta que é 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 ou mais vezes maior em comparação à eficiência do uso da água de uma planta do tipo silvestre correspondente. Por exemplo, uma planta possuindo eficiência melhorada do uso da água em comparação a uma planta do tipo silvestre pode ter 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60 % 70%, 75% ou mais eficiência do uso da água em com-paração à planta do tipo silvestre correspondente.

[0015]Os métodos da invenção envolvem inibição ou redução da expressão ou atividade de um gene endógeno tal como, PK220, onde a planta é produzida possuindo um fenótipo vantajoso ou propriedade aperfeiçoada, tal como, eficiência aumentada do uso da água. Em um aspecto, a invenção prove um método para pro-dução de uma planta possuindo eficiência aumentada do uso da água em relação a uma planta do tipo silvestre, por introdução no interior da célula da planta de umta construto de ácido nucléico que inibe ou reduz a expressão ou atividade de PK220. Por exemplo, uma planta possuindo eficiência aumentada do uso da água em rela-ção a uma planta do tipo silvestre é produzida por a) provisão de um construto de ácido nucléico contendo um promotor operavelmente ligado a um construto de ácido nucléico que inibe a atividade de PK220; b) inserção do construto nucléico em um vetor; c) transformação de uma planta, cultura de tecido ou uma célula de planta com o vetor para obter uma planta, cultura de tecido ou célula de planta com atividade de PK220 diminuída; d) crescimento da planta ou regeneração da planta da cultura de tecido ou célula de planta, onde é produzida uma planta possuindo eficiência do uso da água diminuída em relação a uma planta do tipo silvestre. O construto inclui um promotor tal como, um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um promotor induzível. Preferivelmente, o promotor específico de tecido é um promotor de raiz. Um promotor induzível é um promotor induzível de estiagem.

[0016]O termo "construto de ácido nucléico" se refere a uma sequência gê- nica de comprimento pleno ou porção da mesma, onde uma porção possui preferi-velmente pelo menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100 ou 150 nucleotídeos de comprimento ou seu complemento. Alternativamente, pode ser um oligonucleotídeo, de filamento simples ou duplo e constituído de DNA ou RNA ou um duplexo DNA-RNA. Em uma modalidade específica, o construto de ácido nucléico contém a sequência do gene PK220 de comprimento pleno ou uma porção da mesma, onde a porção da sequência de PK220 possui pelo menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, ou 150 nucleotídeos de comprimento ou seu complemento.

[0017]A invenção também provê uma planta transgênica possuindo um ge- nótipo vantajoso ou propriedade aperfeiçoada, tal como, eficiência melhorada do uso da água, produzida pelos métodos descritos no presente documento.

[0018]Em outro aspecto a invenção provê uma planta possuindo uma muta-ção que não ocorre naturalmente em um gene PK220 onde a planta diminuiu a ex-pressão ou atividade de PK220 e a planta melhorou a eficiência do uso da água em relação a um controle do tipo silvestre. A expressão ou atividade diminuída de PK220 se refere a uma redução de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 ou 75 vezes ou mais, no DNA, RNA ou nível de proteína de um gene PK220 em comparação ao PK220 do tipo silvestre ou uma redução de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 ou 75 vezes na atividade de PK220 em comparação a atividade de PK220 do tipo silvestre. A atividade de PK220 inclui, porém não está limitada a atividade de cinase nos resíduos de aminoácido de serina e/ou treonina dos polipeptídeos do substrato, onde participa nas reações de fosforilação.

[0019]A invenção provê, adicionalmente, uma semente transgênica produzi-da por planta(s) transgênica(s) da invenção, onde a semente produz planta possuin-do um fenótipo vantajoso ou propriedade aperfeiçoada, tal como, por exemplo, efici-ência melhorada do uso da água em relação à planta do tipo silvestre.

[0020]Em outra modalidade, a invenção provê ácidos nucléicos para expres-são dos ácidos nucléicos em uma célula de planta de modo a produzir uma planta transgênica possuindo um fenótipo vantajoso ou propriedade melhorada, tal como, eficiência melhorada do uso da água.

[0021]Sequências exemplares codificando um gene PK220 do tipo silvestre ou porção do mesmo que encontram uso nos aspectos da presente invenção são descritas nas SEQ ID NO's: 1, 7, 9, 11, 12, 13, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 153, 161 e 193. Sequências exemplares codificando um gene PK220 mutado são descritas nas SEQ ID NO's:3 e 5. Sequências exemplares que são úteis para construções de modo a infraregular a expressão ou atividade de PK220 são descritas nas SEQ ID NO's: 12, 13, 147, 149, 153, 161, 168 e 174. A invenção provê, adicionalmente, composições que contêm os ácidos nucléicos da invenção para expressão em uma célula de planta de modo a produzir as plantas transgênicas descritas no presente documento.

[0022]A menos que de outra forma definido, todos termos os técnicos e cien-tíficos empregados na presente invenção possuem o mesmo significado geralmente entendido por um versado na técnica a qual esta invenção se refere. Embora os mé-todos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos apropriados e materiais são descritos a seguir. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas no presente documento são incorporadas como referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo incluindo definições deverá ser seguido. Além disto, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

[0023]Outros aspectos e vantagens da invenção ficarão claros e estão en-globados pela descrição detalhada e reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0024]A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e cien- tíficos empregados possuem o mesmo significado geralmente entendido por um versado na técnica a qual esta invenção se refere. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos apropriados e materiais são descritos a seguir. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas no presente documento são incorporadas como referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo incluindo definições deverá ser seguido. Além disto, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

[0025]Para conveniência, antes da descrição adicional da presente inven-ção, determinados termos empregados no relatório descritivo, exemplos e reivindi-cações são definidos no presente documento. Estas definições devem ser lidas a luz do restante da revelação e como entendidas por uma pessoa de conhecimento co-mum na técnica.

[0026]Uma “sequência de promotor” ou “promotor” significa uma sequência de ácido nucléico capaz de induzir transcrição de uma sequência gênica operavel- mente ligada em uma célula de planta. Os promotores incluem, por exemplo, (porém não limitado) os promotores constitutivos, promotores específicos de tecido, tais co-mo, promotor de raiz, um promotor induzível, tal como, um promotor induzível de estiagem ou um promotor endógeno, tal como um promotor normalmente associado a um gene de interesse, isto é, um gene PK220.

[0027]O termo “cassete de expressão” significa um construto de vetor onde uma sequência gênica ou de ácido nucléico é transcrita. Adicionalmente o RNAm expresso pode ser traduzido em um polipeptídeo.

[0028]Os termos “expressão” e “superexpressão” são empregados intercam- biavelmente e significam a expressão de um gene, tal que, o transgene é expresso. O nível total da expressão em uma célula pode ser elevado em relação a uma célula do tipo ilvestre.

[0029]O termo “mutação que não ocorre naturalmente” se refere a qualquer método que introduz mutações ilves planta ou população de plantas. Por exem-plo, mutagênese química, tal como, metil sulfonato de etano ou ilve etílico do ácido metanossulfônico, mutagênese de ilvest rápida, DNA de inserção apresenta inser-ção de T-DNA ou métodos de mutagênese sítio-direcionada.

[0030]O termo “estresse de estiagem” se refere a uma condição onde o crescimento da planta ou produtividade é inibida em relação a uma planta onde a água não é limitada. O termo “estresse de estiagem” é usado como sinônimo e inter- cambiavelmente com o estresse de água em estiagem.

[0031]O termo “tolerância a estiagem” se refere a capacidade de uma planta de ilvestr uma planta do tipo ilvestre sob as condições de estresse de água em estiagem ou condições limitadas de água ou usar menos água durante o crescimen-to e desenvolvimento em relação a uma planta do tipo silvestre.

[0032]O termo “eficiência de uso da água” é uma expressão da razão entre as quantidades de biomassa produzida pela unidade de água transpirada quando medida gravimetricamente e a razão da taxa fotossintética para a taxa de transpiração quando medida usando quantificação de troca de gás de uma folha ou broto.

[0033]O termo “peso seco” significa tecido da planta que foi seco para remo-ver a maioria da água celular e é usado como sinônimo e intercambiavelmente com o termo biomassa.

[0034]O termo “nulo” é definido como parente segregado de uma linhagem transgênica que perdeu o transgene inserido e é portanto usado como uma linhagem de controle.

[0035]Várias abreviaturas padrão foram usadas através de toda a revelação, tais como, g, grama; WT, tipo silvestre; DW, peso seco; QUE, eficiência do uso da água; d, dia.

[0036]O termo "hwe116" significa uma planta possuindo uma mutação em um gene PK220.

[0037]O gene HWE é referido como uma sequência gênica de PK220 e uma proteína codificada pelo gene PK220 é referida como um polipeptídeo ou proteína de PK220. Os termos HWE e PK220 são sinônimos.

[0038]O termo “ácido nucléico de PK220” se refere a pelo menos uma porção de um ácido nucléico de PK220. De modo semelhante, o termo “proteína de PK220” ou “polipeptídeo de PK220” se refere a pelo menos uma porção do mesmo. Uma porção possui pelo menos 21 nucleotídeos de comprimento com relação a um ácido nucléico e uma porção de uma proteína ou polipeptídeo possui pelo menos 7 aminoácidos. O termo “AtPK220” se refere a um gene PK220 de Arabidopsis thalian, o termo "BnPK220" se refere ao gene PK220 de Brassica napus.

[0039]A invenção se baseia, em parte, na descoberta das plantas que pos-suem uma propriedade agronômica aperfeiçoada, por exemplo, eficiência melhorada do uso da água, tolerância a estiagem aumentada, sensibilidade reduzida à tempe-ratura fria e inibição reduzida do crescimento das sementeiras em condições de ni-trogênio baixo em relação a um controle do tipo silvestre. O gene responsável pelo fenótipo benéfico foi determinado e mostrado como sendo um gene PK220 inibido.

[0040]Os métodos para produção de uma planta, incluindo uma planta mu-tante, uma planta transgênica ou planta modificada geneticamente, possuindo efici-ência melhorada do uso da água são revelados no presente documento. Especifi-camente, a invenção identifica um gene PK220 no qual, quando a expressão ou ati-vidade do gene PK220 é inibida é obtida uma planta possuindo um fenótipo benéfi-co.

Determinação da homologia entre duas ou mais sequencias

[0041]Para determinar a porcentagem de homologia entre duas sequências de aminoácido ou entre dois ácidos nucléicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, intervalos que podem ser introduzidos em cada uma das sequências sendo comparadas para alinhamento ótimo entre as sequen- cias). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos nas posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são então comparados. Quando a posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequencia, então as moléculas são homólogas naquela posição (isto é, conforme empregado no presente documento, “homologia” do aminoácido ou ácido nucléico é equivalente a “identidade” do amino- ácido ou ácido nucléico).

[0042]A homologia da sequência de ácido nucléico pode ser determinada como o grau de identidade entre duas sequencias. A homologia pode ser determina-da usando programas de computador conhecidos na técnica, tais como, software GAP fornecido pelo pacote de programas GCG. Vide, Needleman and Wunsch (1970). Uso do software GCG GAP com os ajustes que se seguem para comparação da sequência de ácido nucléico: penalidade de criação de GAP (intervalo) de 5,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,3, a região de codificação das sequências de ácido nucléico análogo referidas acima exibe um grau de identidade preferivelmente de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99% com a porção de codificação da sequência da sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO:1.

[0043]O termo “identidade de sequencia” se refere a um grau no qual duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são idênticas em uma base de resí-duo por resíduo em uma região específica de comparação. O termo “porcentagem de identidade da sequencia” é calculado pela comparação de duas sequências ali-nhadas otimamente sobre aquela região de comparação, determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucléico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U, ou I, no caso dos ácidos nucléicos) ocorre em ambas sequências para render o nú-mero de posições emparelhadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na região de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade da se- quencia. O termo “identidade substancial” conforme empregado no presente docu-mento indica uma característica de uma sequência de polinucleotídeo, onde o poli- nucleotídeo compreende uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade, preferivelmente pelo menos 85% de identidade e frequentemente 90 a 95% de iden-tidade da sequencia, mais geralmente pelo menos 99% de identidade de sequência quando comparada a uma sequência de referência em uma região de comparação. O termo “porcentagem de resíduos positivos” é calculada por comparação de duas sequências otimamente alinhadas naquela região de comparação, determinando o número de posições nas quais as substituições de aminoácido idênticas e conserva-doras conforme definidas acima, ocorrem em ambas as sequências para render o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na região de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem dos resíduos po-sitivos.

Inibição da expressão de PK220 endógeno e atividade

[0044]Um aspecto da invenção se refere aos dispositivos e métodos de inibi-ção ou redução da expressão e atividade do gene PK220, opcionalmente, resultando na inibição ou redução da expressão ou atividade da proteína de PK220. O termo “expressão da proteína de PK220) engloba ambos estes níveis de inibição ou redu-ção. A expressão ou atividade de PK220 reduzida se refere a uma redução de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, ou 75 ou mais vezes, no nível do DNA, RNA ou da proteína de um gene PK220 em comparação ao PK220 do tipo silvestre, ou uma redução de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 ou 75 vezes na atividade da proteína de PK220, em comparação à atividade de PK220 do tipo selvagem. A atividade da proteína de PK220 inclui, porém não está limitada à atividade de cinase nos resíduos de aminoácido de serina e treonina dos polipeptídeos de substrato, onde a mesma participa das reações de fosforilação. Os métodos para medir a atividade de serina/treonina cinase são conhecidos dos versados na técnica.

[0045]Existem vários métodos conhecidos dos versados na técnica para ob-tenção de tal inibição que efetuam uma variedade de etapas em uma via de expres-são gênica, por exemplo, regulação transcricional, regulação pós transcricional e transducional. Tais métodos incluem, porém não estão limitados aos métodos de antisenso, construções RNAi, incluindo todas as construções de grampo e constru-ções RNAi úteis para inibição por metilação ou inibição de DNA direcionado ao RNAds por degradação ou inibição de transdução pelo RNAm, microRNA (RNAmi) incluindo tecnologias de RNAmi artificial (RNAami) (Schwab e outros, 2006), muta- gênese e métodos de TILLING, técnicas de mutagênese específica ao sítio in vivo e abordagens de inibição dominante/negativa.

[0046]Um método preferido para inibição de gene envolve inibição de RNA (RNAi) também conhecido como construções de grampo. Uma porção do gene a inibir é usada e clonada em uma direção de sentido ou antisenso possuindo um es- paçador separando as porções de sentido e antisenso. O tamanho das porções de gene seria constituído de pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento e o espaça- dor pode ser tão pequeno como possuindo 13 nucleotídeos (Kennerdell e Carthew, 2000) de comprimento e podendo ser uma sequência de íntron, uma sequência de codificação ou de não codificação.

[0047]O antisenso é uma abordagem comum, onde o gene alvo ou uma por-ção do mesmo é expressa em uma orientação antisenso resultando na inibição da expressão ou atividade gênica endógena. As porções de antisenso não precisam ser um gene de comprimento pleno nem ser 100% idênticas. Contanto que o antisenso seja pelo menos 70% ou mais idêntico ao gene alvo endógeno e apresente pelo me-nos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, ou 150 nucleotí- deos de comprimento. Preferivelmente, será obtida uma inibição de 50 nucleotídeos de comprimento ou mais .

[0048]As sequências codificando um gene PK220 do tipo selvagem ou por-ção do mesmo que são úteis na preparação das construções para inibição de PK220 incluem, por exemplo, SEQ ID NO's: 1, 7, 9, 11, 12, 13, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 153, 161 e 193. Sequências exemplares que são úteis para construções de infrarregulam a expressão ou atividade de PK220 são descritas na SEQ ID NO's: 12, 13, 147, 149, 153, 161, 168 e 174.

[0049]Quando se emprega uma estratégia de antisenso da infrarregulação, a inibição da atividade do gene endógeno pode ser seletivamente alvejada no gene ou genes de escolha por seleção apropriada de um fragmento ou porção para expressão de antisenso. A seleção de uma sequência que está presente na sequência gê- nica alvo e não está presente nos genes correlatos (gene não alvejado) ou é inferior a 70% dos conservados nas sequências não alvo resulta na especificidade da inibição do gene.

[0050]Alternativamente, a inibição de RNAami pode ser usada para inibir a expressão e atividade gênica em uma maneira mais específica que em outros méto-dos de RNAi. Em contraste ao RNAsi que requer um pareamento perfeito entre o RNA pequeno e o RNAm alvo, RNAami permite até 5 não pareados com mais de 2 pareamentos consecutivos. O construto de RNAami precisa satisfazer determinados critérios descritos em Schawab e outros (2006). Isto provê um método para infrarre- gular uma expressão ou atividade de gene alvo usando uma porção gênica compre-endida de pelo menos 21 nucleotídeos de PK220.

[0051]Inibição dominante/negativa é análoga à inibição competitiva das rea-ções bioquímicas. A expressão de um polipeptídeo mutante ou modificado que não possui funcionalidade plena compete com o polipeptídeo do tipo silvestre ou endó- geno, pelo que, reduzindo a atividade total do gene/proteína. Por exemplo, uma pro-teína expressa pode se ligar a um complexo de proteína ou subunidade de enzima para produzir um complexo não funcional. Alternativamente, a proteína expressa pode se ligar o substrato, porém não possui atividade para realizar a função nativa. A expressão de níveis suficientes de proteína não ativa reduzirão ou inibiram a função total.

[0052]A expressão dos genes PK220 que produzem uma proteína de PK220 que possui atividade deficiente pode ser usada para infrarregulação dominan- te/negativa da atividade gênica. Isto é análogo a inibição competitiva. Um polipeptí- deo de PK220 é produzido podendo, por exemplo, ser associado ou se ligar a uma molécula alvo, porém não possuindo atividade endógena. Um exemplo de um PK220 inativo é a sequência AtPI220 isolada do mutante hwe116 e revelada como SEQ ID NO:3. Uma molécula alvo pode ser uma proteína de interação de uma sequência de ácido nucléico. Desta maneira a proteína de PK220 endógeno é efetivamente diluída e as respostas a jusante serão atenuadas.

[0053]A mutagênese sítio-específica in vivo está disponível, pelo que pode- se introduzir uma mutação em um genoma de células para criar uma mutação espe-cífica. O método, conforme essencialmente descrito em Dong e outros, (2006) ou Publicação de Pedido de Patente US número 20060162024 se refere aos métodos de reparo do gene direcionado ao oligonucleotídeo. Alternativamente, podem ser usados oligonucleotídeos de RNA/DNA quiméricos essencialmente conforme des-crito em Beetham (1999). Consequentemente, um códon de parada prematuro pode ser gerado no gene endógeno das células, pelo que produzindo um mutante nulo específico. Alternativamente, a mutação pode interferir com a recomposição do transcrito inicial, pelo que, criando um RNAm não traduzível ou um RNAm que pro-duz um polipeptídeo alterado que não possui atividade endógena. Mutações preferí-veis que resultam em perda ou redução da expressão ou atividade de PK220 inclu- em uma conversão de C em T na posição de nucleotídeo 874 quando se enumera de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou 3 ou uma mutação de nucleotídeo que resulta em uma alteração de aminoácido de uma Leucina (L) códon (CTT) para uma Fenilalani- na (F) códon (TTT) na posição de aminoácido 292 quando se enumera de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou 4.

[0054]TILLING é um método de isolamento das mutações em um gene co-nhecido a partir de uma população mutagenizada SEM. A população é classificada por métodos essencialmente conforme descrito em (Greene e outros, 2003).

[0055]Outras estratégias de inibição do gene ficarão claras aos versados na técnica incluindo aquelas não discutidas no presente documento e aquelas desen-volvidas no futuro.

Identificação dos homólogos de AtPK220

[0056]Os homólogos de PK220 de Arabidopsis thaliana (AtPK220) foram identificados usando ferramentas de busca de sequência da base de dados, tais como, a Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul e outros, 1990 and Altschul e outros,. 1997). Os programas de análise de sequência tblastn ou blastn foram empregados usando a matriz de classificação BLOSUM-62 (Henikoff and He- nikoff, 1992). A saída de um relatório BLAST provê uma classificação que leva em conta o alinhamento de resíduos semelhantes ou idênticos e quaisquer intervalos necessários a fim de alinhar as sequencias. A matriz de classificação avalia uma classificação para alinhamento de qualquer par possível de sequencias. Os valores P refletem quantas vezes uma classificação tem a chance de ocorrer. Classificações mais altas são preferidas e um limite de valor P baixo é preferido. Estes são os crité-rios de identificação da sequencia. O programa de análise de sequência tblastn foi usado para questionar uma sequência de polipeptídeo contra seis modos de trans- duções das sequências em uma base de dados de nucleotídeo. Hits com um valor P inferior a -25, preferivelmente inferior a -70, e mais preferivelmente inferior a -100, foram identificados como sequências homólogas (critérios de sequência seleciona-dos exemplares). O programa de análise de sequência blastn foi usado para questi-onar uma sequência de nucleotídeo contra uma base de dados de nucleotídeo. Nes-te caso também, classificações mais altas foram preferidas e um valor P de limite preferido foi inferior a -13, preferivelmente inferior a -50 e mais preferivelmente infe-rior a -100.

[0057]Um gene PK220 pode ser isolado através das técnicas de amplificação de PCR padrão. O uso de iniciadores para regiões conservadas de um gene PK220 e amplificação de PCR produz um fragmento ou cópia de comprimento pleno do gene desejado. O molde pode ser DNA, genômico ou uma biblioteca de DNAc ou RNA ou RNAm para uso com técnicas de PCR de transcriptase inversa (RtPCR). Regiões conservadas podem ser identificadas usando ferramentas de comparação de sequencia, tais como, BLAST ou CLUSTALW, por exemplo. Iniciadores apropriados foram usados e descritos em qualquer lugar neste pedido.

[0058]Alternativamente, um fragmento de uma sequência de um gene PK220 é radiomarcado 32P por sensibilização aleatória (Sambrook e outros,1989) e usado para classificar uma biblioteca genômica da planta (os polinucleotídeos de teste exemplares). Como um exemplo, o DNA total da planta de Arabidopsis thalia- na, Nicotiana tabacum, Lycopersicon pimpinellifolium, Prunus avium, Prunus cera- sus, Cucumis sativus, ou Oryza sativa foi isolado de acordo com Stockinger e outros (Stockinger e outros, 1996). Aproximadamente, 2 a 10 μg de cada amostra de DNA são digeridos com restrição, transferidos par membrana de náilon (Micron Separa-tions, Westboro, Mass) e hibridizados. As condições de hibridização são: 42°C em 50% de formamida, 5X SSC, 20 mM tampão fosfato 1X Denhardt's, 10% de sulfato de dextrano e 100 μg/mL de DNA de esperma de arenque. Quatro lavagens de es- tringência baixa em temperatura ambiente em 2X SSC, 0,05% de sarcosila de sódio e 0,02% de pirofosfato de sódio são realizadas antes das lavagens de estringência alta a 55°C em 0,2 vezes SSC, 0,05% de sarcosila sódio e 0,01% de pirofosfato de sódio. Lavagens de estringência alta são realizadas até nenhuma contagem ser de-tectada na depuração total de acordo com Walling e outros (Walling e outros, 1988). Isolados positivos são identificados, purificados e sequenciados. Outros métodos estão disponíveis para hibridização, por exemplo, a solução de hibridização Expres- ssHyb™ disponível na Clonetech.

Vetores de Expressão Recombinante de PK220 e Células Hospedeiras

[0059]Outro aspecto da invenção se refere aos vetores, preferivelmente ve-tores de expressão contendo um ácido nucléico codificando uma proteína de PK220, um gene PK220 ou sequência genômica ou porções da mesma e seus análogos homólogos. Conforme usado no presente documento, o termo vetor de expressão inclui vetores que são projetados para prover transcrição da sequência de ácido nu- cléico. As sequências transcritas podem ser designadas para inibirem a expressão ou atividade endógena de uma atividade gênica endógena correlacionando-se à se-quência transcrita. Opcionalmente, o ácido nucléico transcrito não precisa ser tradu-zido, porém ao invés disto inibe a expressão gênica endógena como na metodologia de infrarregulação de antisenso ou estrutura de grampo. Alternativamente, o ácido nucléico transcrito pode ser traduzido em um produto de polipeptídeo ou proteína. O polipeptídeo pode ser um mutante ou variante modificada de comprimento não pleno da proteína endógena. Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo” que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular dentro da qual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, onde segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira dentro da qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos possuindo uma origem bacteriana de repli- cação). Outros vetores são integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução dentro da célula hospedeira, e pelo que são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disto, determinados vetores são capazes de direci-onar a expressão dos genes a qual eles são operativamente ligados. Tais vetores são referidos no presente documento como “vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinantes estão fre-quentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados intercambiavelmente como o plasmídeo é a forma mais comumente usada do vetor. Contudo, a invenção de destina a incluir tais outras for-mas de vetores de expressão, tais como, vetores virais ou vetores de transformação de planta, binários ou de outra forma, que servem a funções equivalentes.

[0060]Os vetores de expressão recombinante da invenção compreendem um ácido nucléico da invenção em uma forma apropriada para expressão do ácido nu- cléico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão re- combinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, isto é, operativamente li-gadas à sequência de ácido nucléico a ser expressa. Dentro de um vetor de expres-são recombinante “operativamente ligado” significa que a sequência de nucleotídeo de interesse é ligada à(s) sequencia(s) reguladora(s) em um modo que permite que a expressão da sequência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcri- ção/tradução in vitro ou uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célu-la hospedeira).

[0061]O termo “sequência reguladora” inclui promotores, melhoradores e ou-tros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel (1990). Sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nuleotídeo em muitos tipos de célula hospedeira e aquelas que dirigem a expressão da sequência de nucleotídeo apenas em determinadas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras específicas de tecido) ou promo-tores induzíveis (por exemplo, induzidos em resposta aos fatores abióticos, tais como, condições ambientais, aquecimento, estiagem, estado do nutriente ou estado fisiológico da célula ou biótico, tal como sensível ao agente patogênico). Exemplos de promotores apropriados incluem, por exemplo, promotores constitutivos, promoto-res induzíveis de ABA, promotores específicos de tecido e promotores induzíveis abiótico ou biótico. Será apreciado pelos versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores, tais como, escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível desejado de expressão da proteína, bem como, timing e local da expressão, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para desta forma produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteína de fusão ou peptídeos, codificados por ácidos nucléicos conforme descrito no presente documento (por exemplo, proteínas de PK220, formas mutan- tes de proteínas de PK220, proteínas de fusão, etc.).

[0062]Os vetores de expressão recombinante da invenção podem ser proje-tados para expressão de genes PK220, proteínas de PK220 ou suas porções nas células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os genes PK220 ou proteínas de PK220 podem ser expressos nas células bacterianas, tais como, Escherichia coli, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovirus), células de levedura, células de planta ou células de mamíferos. Células hospedeiras apropriadas são discutidas a seguir em Goeddel (1990). Alternativamente, o vetor de expressão re- combinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, usando as sequên-cias reguladoras de promotor de T7 e polimerase T7.

[0063]Em uma modalidade, um ácido nucléico da invenção é expresso nas células das plantas usando um vetor de expressão de planta. Exemplos de sistemas de vetores de expressão de planta incluem plasmídeo de indução de tumor (Ti) ou porção do mesmo encontrado em Agrobacterium, DNA do vírus mosaico da couve flor (CaMV) DNA e vetores. Tais como, pBI121.

[0064]Para expressão nas plantas, o cassete de expressão recombinante conterá além dos ácidos nucléicos de PK220, uma região promotora que funciona em uma célula de planta, um sítio de iniciação de transcrição (se a sequência de codificação para transcritos faltar um) e opcionalmente uma sequência de termina- ção/poliadenilação de transcrição. A região de terminação/poliadenilação pode ser obtida do mesmo gene que a sequência de promotor ou pode ser obtida de genes diferentes. Sítios únicos da enzima de restrição nas extremidades 5’ e 3’ do cassete são tipicamente incluídos para facilitar a inserção em um vetor pré-existente.

[0065]Exemplos de promotores apropriados incluem promotores de vírus de planta, tais como o promotor de 35S do vírus mosaico da couve flor (CaMV) (Odell e outros, 1985), promotores de genes tais como, actina de arroz (McElroy e outros, 1990), ubiquitina (Christensen e outros, 1992; pEMU (Last e outros, 1991), MAS (Velten e outros,1984), H3 histona de milho (Lepetit e outros, 1992); e Atanassvoa e outros, 1992), o promotor 5’- ou 3’- derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaci- ens, o promotor de Smas, o promotor de desidrogenase de álcool cinamílico (Patente US número 5.683.439), o promotor de Nos, o promotor de rubisco, o promotor de GRP1-8, o promotor de ALS, (WO 96/30530), um promotor sintético, tal como, os promotores de Rsyn7, SCP e UCP, ribulose-1,3-difosfato carboxilase, promotores específicos de frutas, promotores de choque térmico, promotores específicos de se-mente e outras regiões de iniciação de transcrição dos vários genes de plantas, por exemplo, incluindo as várias regiões de iniciação de opina, tais como, por exemplo, octopina, manopina e nopalina. Em alguns casos, um promotor associado ao gene de interesse (por exemplo, PK220) pode ser usado para expressar um construto al-vejando o gene de interesse, por exemplo, o promotor de AtPK220 nativo (PpK). Elementos reguladores adicionais que podem ser conectados a uma sequência de ácido nucléico codificando PK220 para expressão nas células de planta incluem terminadores, sequências de poliadenilação e sequências de ácido nucléico codifi-cando peptídeos de sinal que permitem localização dentro de uma célula de planta ou secreção da proteína da célula. Tais elementos reguladores e métodos para adi-ção ou troca destes elementos com os elementos reguladores do gene PK220 são conhecidos e incluem, porém não estão limitados às regiões de terminação e/ou po- liadenilação 3’, tais como aquelas do gene de nopalina sintase (nos) de Agrobacte-rium tumefaciens (Bevan e outros, 1983); o gene de inibidor II de proteinase de batata (PINII) (Keil e outros, 1986) e desta forma incorporados como referência) e An e outros (1989); e o gene de CaMV 19S (Mogen e outros, 1990).

[0066]Sequências de sinal de planta incluindo, porém não limitadas às se-quências de DNA/RNA codificando peptídeo de sinal que alvejam proteínas para a matriz extracelular da célula de planta (Dratewka-Kos e outros, 1989) e o gene de extensão Nicotiana plumbaginifolia (De Loose e outros, 1991), ou peptídeos de sinal que alvejam proteínas para o vacúolo como o gene de esporamina de batata dose (Matsuoka e outros, 1991) e o gene de lecitina de cevada (Wilkins e outros, 1990), ou sinais que fazem com que as proteínas sejam secretadas, tal como aquela de PRIb (Lund e outros, 1992), ou aquelas que alvejam proteínas para os plastídeos, tais como aquelas da enoil-ACP redutase de semente de colza (Verwoert e outros, 1994) são úteis na invenção.

[0067]Em outra modalidade, o vetor de expressão recombinante é capaz de direcionar a expressão do ácido nucléico preferivelmente em um tipo de célula espe-cífico (por exemplo, elementos reguladores específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucléico). Os elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica. Por exemplo, o promotor associado a uma sequência de co-dificação identificada na base de dados TAIR como At2g44790 (P4790) é um promotor específico de raiz. Especialmente úteis em conexão com os ácidos nucléicos da pre sente invenção são os sistemas de expressão que são operáveis em plantas. Estes incluem sistemas que estão sob controle de um promotor específico de tecido, bem como aqueles que envolvem promotores que são operáveis em todos os tecidos de planta.

[0068]Os promotores específicos de órgãos são bem conhecidos. Por exem-plo, o gene de calcona sintase-A (van der Meer e outros, 1990) ou o promotor de diidroflavonol-4-redutase (dfr) (Elomaa e outros, 1998) direcionam a expressão nos tecidos florais específicos. Também está disponível o promotor de patatina classe I sendo transcricionalmente ativado apenas no tubérculo de batata e podendo ser usado para alvejar a expressão gênica no tubérculo (Bevan, 1986). Outro promotor específico de batata é o promotor de amido sintase ligada ao grânulo (GBSS) (Visser e outros, 1991).

[0069]Outros promotores específicos de órgãos apropriados para um órgão alvo desejado podem ser isolados empregando procedimentos conhecidos. Estas sequências de controle são geralmente associadas aos genes unicamente expres-sos no órgão desejado. Em uma planta superior típica, cada órgão possui milhares de RNAms que estão ausentes de outros sistemas de órgãos (revisto em Goldberg, 1986).

[0070]O sistema de expressão resultante ou cassete é ligado ou de outra forma construído para ser incluído em um vetor recombinante que é apropriado para transformação da planta. O vetor pode conter também um gene marcador selecioná- vel pelo qual as células de planta transformadas podem ser identificadas na cultura. O gene marcador pode codificar resistência ao antibiótico. Estes marcadores incluem resistência a G418, higromicina, bleomicina, canamicina e gentamicina. Alterna-tivamente, o gene marcador pode codificar um gene de tolerância ao herbicida que provê tolerância aos herbicidas do tipo glifosinato ou glifosato. Após transformação das células de planta, aquelas células possuindo o vetor serão identificadas por sua capacidade de se desenvolverem em um meio contendo o antibiótico ou herbicida específico. Sequências de replicação, de origem bacteriana ou viral, também são incluídas para permitir que o vetor seja clonado em um hospedeiro bacteriano ou de fago, preferivelmente estando incluída uma ampla faixa hospedeira de origem proca- riótica de replicação. Um marcador selecionável para bactérias também estaria inclu-ído para permitir seleção de células bacterianas portando o construto desejado. Tais marcadores procarióticos selecionáveis apropriados também incluem resistência aos antibióticos, tais como, canamicina ou tretraciclina.

[0071]Outras sequências de DNA codificando funções adicionais podem também estar presentes no vetor, como é conhecido na técnica. Por exemplo, no caso das transformações de Agrobacterium, as sequências de T-DNA também serão incluídas para transferência subsequente aos cromossomas da planta.

[0072]Outro aspecto da invenção se refere às células hospedeiras dentro das quais um vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Os termos “célula hospedeira” e “célula hospedeira recombinante” são usados intercambi- avelmente no presente documento. Fica entendido que tais termos se referem não apenas a uma célula individual, porém também à progênie ou progênie em potencial de tal célula. Uma vez que determinadas modificações podem ocorrer nas gerações que se sucedem devido tanto à mutação quanto influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula de origem, porém ainda está incluída no es-copo do termo conforme empregado no presente documento. O DNA do vetor pode ser introduzido nas células procarióticas ou eucarióticas através de técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Conforme empregado no presente do-cumento, os termos “transformação” e “transfecção” se referem a uma variedade de técnicas reconhecidas na arte para introdução de ácido nucléico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira.

[0073]Uma célula hospedeira da invenção, tal como uma célula procariótica ou eucariótica na célula pode ser usada para produzir (isto é, expresso) um polipep- tídeo da invenção codificado em um quadro aberto de leitura de um polinucleotídeo da invenção. Consequentemente, a invenção provê adicionalmente métodos para produção de um polipeptídeo usando as células hospedeiras da invenção. Em uma modalidade, o método compreende cultura da célula hospedeira da invenção (na qual um vetor de expressão recombinante codificando um polipeptídeo da invenção foi introduzido) em um meio apropriado, tal que, o polipeptídeo é produzido. Em outra modalidade, o método compreende adicionalmente o isolamento do polipeptídeo do meio ou da célula hospedeira.

[0074]Vários tipos de célula podem atuar como célula hospedeira apropriada para expressão de um polipeptídeo codificado por um quadro aberto de leitura em um polinucleotídeo da invenção. As células hospedeiras de planta incluem, por exemplo, células de planta que poderiam funcionar como hospedeiros apropriados para a expressão de um polinucleotídeo da invenção incluem células epidérmicas, mesófila e outros tecidos de crescimento e tecidos vasculares nas folhas, caules, órgãos florais e raízes de uma variedade de espécies de planta, tais como, Arabi- dopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Brassica napus, Zea mays, Oryza sativa, Gos- sypium hirsutum e Glycine max.

[0075]A expressão dos ácidos nucléicos de PK220 codificando uma proteína de PK220 que não é completamente funcional pode ser usada em um método de inibição dominante/negativo. Um polipeptídeo variante de PK220 ou porção do mesmo é expresso em uma planta, tal que, ele possui funcionalidade parcial. O poli- peptídeo variante pode ter, por exemplo, a capacidade de se ligar a outras moléculas, porém não permite atividade apropriada do complexo, resultando na inibição total da atividade de PK220.

Células de Plantas Transformadas e Plantas Transgênicas

[0076]A invenção inclui um protoplasto, célula de plantas, tecido de planta e planta (por exemplo, monocoto ou dicoto) transformados com um ácido nucléico de PK220, um vetor contendo um ácido nucléico de PK220 ou um vetor de expressão contendo um ácido nucléico de PK220. Conforme usado no presente documento, “planta” inclui não apenas uma planta integral, porém também uma porção da mesma (isto é, células e tecidos incluindo, por exemplo, folhas, caules, brotos, raízes, flores, frutos e sementes).

[0077]A planta pode ser qualquer planta do tipo incluindo, por exemplo, es-pécies dos gêneros Arabidopsis, Brassica, Oryza, Zea, Sorghum, Brachypodium, Miscanthus, Gossypium, Triticum, Glycine, Pisum, Phaseolus,, Lycopersicon, Trifoli-um, Cannabis, Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Ono- brychis, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digi-talis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Lolium, Avena, Hordeum, Secale, Picea, Caco e Populus.

[0078]A invenção também inclui células, tecidos incluindo, por exemplo, fo-lhas, caules, brotos, raízes, flores, frutos e sementes e a progênie derivada da planta transformada.

[0079]Vários métodos para introdução de genes estranhos nas plantas são conhecidos e podem ser usados para inserir um gene em uma planta hospedeira, incluindo protocolos de transformação de planta biológicos e físicos (Vide, por exemplo, Miki e outros, (1993) "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-88; e Andrew Bent em, Clough SJ and Bent AF, (1998) "Floral dipping: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana'). Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira e incluem métodos de transfecção química, tais como, transformação de fosfato de cálcio, polietileno glicol (PEG), transferência de gene medida por microor-ganismo, tal como, Agrobacterium (Horsch e outros, 1985), eletroporação, transfor-mação de protoplasma, microinjeção, imersão de flor e bombardeamento biolítico.

Transformação mediada por Agrobacterium

[0080]O método mais amplamente utilizado para introdução de um vetor de expressão nas plantas se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacte-rium tumefaciens e A. rhizogenes que são bactérias patogênicas da planta que transformam geneticamente as células da planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tume- faciens e A. rhizogenes, respectivamente, portam genes sensíveis para transforma-ção gênica de plantas (vide, por exemplo, Kado, 1991). As descrições dos sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência de gene mediada por Agrobacterium são providas em Gruber e outros. (1993) e Moloney e outros, (1989).

[0081]Plantas Arabidopsis transgênicas podem ser produzidas facilmente pelo método de imersão de plantas com flores em uma cultura de Agrobacterium com base no método de Andrew Bent em, Clough SJ and Bent AF, 1998. Imersão floral: um método simplificado para transformação mediada por Agrobacterium de Arabidopsis thaliana. As plantas do tipo silvestre crescem até a planta ter ambos de-senvolvido as flores e aberto as flores. As plantas são invertidas por 1 minuto em uma solução de cultura de Agrobacterium portando o construto de gene apropriado. As plantas são então deixadas na horizontal em uma bandeja e mantidas cobertas por dois dias para manter a umidade e então colocadas de pé e ensacadas para continuar o crescimento e desenvolvimento de sementes. A semente madura é co-lhida em quantidade.

Transferência direta de gene

[0082]Um método geralmente aplicável de transformação de planta é a transformação mediada por microprojéteis, onde o DNA é transportado na superfície dos microprojéteis medindo cerca de 1 a 4 μm. O vetor de expressão é introduzido nos tecidos da planta com um dispositivo biolítico que acelera os microprojéteis para velocidades de 300 a 600 m/s o que é suficiente para penetrar nas paredes e mem-branas da célula de planta (Sanford e outros, 1993; Klein e outros, 1992).

[0083]A transformação da planta pode também ser obtida pelo método Aero-sol Beam Injector (Injetor de Feixe em Aerossol) (ABI) descrito na Patente US número 5.240.842, Patente US número 6.809.232. A tecnologia de feixe em aerossol é usada para acelerar partículas úmidas ou secas em velocidades que permitem que as partículas penetrem nas células vivas. A tecnologia de feixe em aerossol emprega a expansão a jato de um gás inerte conforme ele passa de uma região de pressão de gás mais alta para uma região de pressão de gás mais baixa através de um orifício pequeno. O gás de expansão acelera gotículas em aerossol contendo moléculas de ácido nucléico para serem introduzidas dentro de uma célula ou tecido. As partículas aceleradas são posicionadas para impactarem um alvo preferido, por exemplo, uma célula de planta. As partículas são construídas como gotículas de um tamanho suficientemente pequeno, de modo que a célula sobrevive à penetração. A célula ou tecido transformado se desenvolve para produzir uma planta por técnicas padrão conhecidas dos versados na técnica.

Regeneração dos transformantes

[0084]O desenvolvimento ou regeneração de plantas tanto dos protoplastos de planta simples ou vários explantes é bem conhecido na técnica (Weissbach and Weissbach, 1988). Este processo de regeneração e crescimento inclui, tipicamente, as etapas de seleção das células transformadas, cultivo daquelas células individuali-zadas através de estágios comuns de desenvolvimento embrionário através do es-tágio de plantinha com raiz. Os embriões e sementes transgênicos são regenerados de forma semelhante. Os brotos com raiz transgênicas resultantes são após isto plantados em um meio de crescimento de planta apropriado, tal como solo.

[0085]O desenvolvimento ou regeneração das plantas contendo o gene es-tranho, exógeno, que codifica um polipeptídeo de interesse introduzido por Agrobac-terium de explantes de folha pode ser obtido pelos métodos bem conhecidos na téc-nica, tal como descritos (Horsch e outros, 1985). Neste procedimento os transfor- mantes são cultivados na presença de um agente de seleção e em um meio que in-duz a regeneração dos brotos na cepa de planta sendo transformada conforme des-crito (Fraley e outros, 1983). Especificamente a Patente US número 5.349.124 (rela-tório descritivo incorporado ao presente documento como referência) fornece deta-lhes da criação de células de alface e plantas transformadas geneticamente resul-tando das mesmas, expressando proteínas de cristal híbridas conferindo atividade inseticida contra larvas de lepidópteros a tais plantas.

[0086]Este procedimento produz, tipicamente, brotos dentro de dois a quatro meses e aqueles brotos são então transferidos para um meio de indução de raiz apropriado contendo o agente seletivo e um antibiótico para prevenir o crescimento bacteriano. Os brotos que apresentam raízes na presença de agente seletivo para formar plantinhas são então transferidos para o solo ou outros meios de modo a permitir a produção de raízes. Estes procedimentos podem variar dependendo da cepa de planta específica empregada, tais variações sendo bem conhecidas na téc-nica.

[0087]Preferivelmente, as plantas regeneradas são polinizadas propriamente para prover plantas homozigotas transgênicas ou pólen obtido das plantas regene-radas é cruzado em plantas de crescimento por semente de linhagens agronomica- mente importantes, preferivelmente congênitas. De modo contrário, o pólen das plantas destas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada usando métodos bem conhecidos dos versados na técnica.

[0088]Uma planta transgênica preferida é um segregado independente e po- de transmitir o construto de gene PK220 para sua progênie. Uma planta transgênica mais preferida é homozigota para construto gênico e transmite aquele construto gê- nico para todas as descendências de cruzamento sexual. A semente de uma planta gênica pode crescer no campo ou na estufa e plantas transgênicas sexualmente maduras resultantes são de polinização apropriada para gerar plantas de progênie verdadeira. A progênie destas plantas se transforma em linhagens de reprodução verdadeiras que são avaliadas quanto à expressão diminuída do gene PK220.

Método para produção de plantas transgênicas

[0089]A invenção também engloba os métodos para produção de uma planta transgênica possuindo eficiência melhorada do uso da água, sensibilidade reduzida à temperatura fria e inibição redução do crescimento de sementeiras em condições de nitrogênio baixo em relação a uma planta do tipo silvestre. O método inclui intro-dução em uma ou mais células de planta de um composto que inibe ou reduz a ex-pressão ou atividade de PK220 na planta para gerar uma célula de planta transgêni- ca e regeneração de uma planta transgênica da célula transgênica. O composto po-de ser, por exemplo, (i) um polipeptídeo de PK220; (ii) um ácido nucléico de PK220, análogo, homólogo, ortólogo, porção, variante ou complemento do mesmo; (iii) um ácido nucléico que diminui a expressão de um ácido nucléico de PK220. Um ácido nucléico que diminui a expressão de um ácido nucléico de PK220 pode incluir pro-motores ou elementos melhoradores. O ácido nucléico de PK220 pode tanto ser en-dógeno quanto exógeno, por exemplo, um ácido nucléico de PK220 de Arabidoposis pode ser introduzido nas espécies Brassica ou milho. Preferivelmente, o composto é uma sequência de ácido nucléico de PK220 endógeno para as espécies sendo transformadas. Alternativamente, o composto é uma sequência de ácido nucléico de PK220 exógena em relação as espécies sendo transformadas e possuindo pelo me-nos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou mais de homologia em relação à sequência alvo endógena.

[0090]Nos vários aspectos a planta transgênica possui um fenótipo alterado em comparação a uma planta do tipo silvestre (isto é, não transformada). O fenótipo alterado significa que a planta possui uma ou mais características que são diferentes da planta do tipo silvestre. Por exemplo, quando a planta transgênica foi contatada com um composto que diminui a expressão ou atividade de um ácido nucléico de PK220, a planta possui um fenótipo, tal como, eficiência melhorada do uso da água, sensibilidade reduzida à temperatura fria e inibição reduzida do crescimento da se-menteira em condições de nitrogênio baixo em relação a uma planta do tipo silvestre.

[0091]A planta pode ser qualquer planta do tipo incluindo, por exemplo, es-pécies dos gêneros Arabidopsis, Brassica, Oryza, Zea, Sorghum, Brachypodium, Miscanthus, Gossypium, Triticum, Glycine, Pisum, Phaseolus,, Lycopersicon, Trifoli-um, Cannabis, Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Ono- brychis, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digi-talis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Lolium, Avena, Hordeum, Secale, Picea, Caco e Populus.

EXEMPLOS Identificação de mutante hwe116 de eficiência melhorada do uso da água

[0092]Um mutante de Arabidopsis EMS (base Columbia) foi identificado ini-cialmente como possuindo propriedades de tolerância a estiagem. O mutante foi tes-tado quanto a eficiência do uso da água sob condições ótimas e de estiagem. O re-sultado mostrou que a natureza tolerante a estiagem deste mutante se deve a sua eficiência melhorada do uso da água sob ambas as condições estressadas de água e condições ótimas de água. Assim este mutante é denominado hwe116.

Clonagem com base no mapeamento de hwe116

[0093]Uma população F2 foi gerada por cruzamento do mutante hwe116 com relação ao ecotipo Landsberg erecta (Ler) de Arabidopsis thaliana e a população resultante foi usada para clonagem com base no mapeamento por ensaio quanto a tolerância de estiagem e subsequentemente confirmando a presença de traço de eficiência melhorada do uso da água no mutante. A perda de água por unidade de peso seco das plantas F2 foi medida em um tratamento com estiagem de 5 dias e os dados foram normalizados quanto a análise QTL em relação ao mutante hwe116 e os dois ecotipos do tipo silvestre, Landsberg erecta e Columbia. Os tecidos de folha foram coletados de todas F2 e plantas de controle usadas nos experimentos de fenotipagem para genotipagem. Análise QTL foi conduzida usando MAPMAKER 3.0 e WinQTLCart 2.5. De modo a especificar adicionalmente as mutações dentro da máxima de QTL, endonuclease I de aipo (CEL I) foi empregada.

Detecção da mutação usando nuclease de CEL I

[0094]Endonuclease I de aipo (CEL I), cliva DNA com especificidade alta nos sítios de substituição de par de base o que cria um não emparelhamento entre alelos do tipo silvestre e de mutante e foi usada reportadamente para detecção de mutações nos mutantes EMS (Yang e outros, 2000; Oleykowski e outros, 1998).

[0095]Fragmentos de DNA de cerca de 5 kb foram ampliados por PCR otimi-zada usando hwe116 ou DNA genômico Columbia de origem como modelo. Quanti-dades iguais dos produtos ampliados foram misturadas em conjunto e então subme-tidas a um ciclo de desnaturação e recombinação para formar DNA heteroduplexo. A incubação com CEL I a 42°C por 20 minutos cliva o DNA heteroduplexo nos pontos de mutação e os fragmentos de DNA foram visualizados por eletroforese de gel aga-rose a 1% e coloração com brometo de etídio.

[0096]Empregando este método, um produto de PCR de 5 kb foi ampliado usando iniciadores de SEQ ID NO:102 e SEQ ID NO:104 e modelos: hwe116, e o tipo Columbia de controle. Os produtos da PC que formaram heteroduplexos resulta-ram em fragmentos menores (1,4 e 3,6 kb) após digestão de CEL I. Subfragmentos de sobreposição (cerca de 3 kb) foram ampliados usando iniciadores de SEQ ID NO:104 e SEQ ID NO:105 para definir mais estreitamente a localização da mutação. O subfragmento foi sequenciado e foi verificado que um nucleotídeo C havia sido mutado no nucleotídeo em hwe116.

[0097]A mutação de interesse foi identificada como uma conversão de C em T na posição de nucleotídeo 874 da SEQ ID NO’s: 1 e 3 o que resultou em uma alte-ração de aminoácido de um códon de Leucina (L) (CTT) em um códon de Fenilalani- na (F) (TTT) na posição 292 do aminoácido. O gene que abriga a mutação foi identi-ficado como uma Serina/Treonina proteína cinase (Ser/Thr PK). O gene do tipo sel-vagem foi identificado como sendo idêntico ao Número de Acesso ao Genbank At2g25220. Esta Ser/Thr proteína cinase é referida no presente documento como AtPK220 e a forma mutada identificada em hwe116 é referida como AtPK22OL292F.

Avaliação Transcricional

[0098]Análise Northern e RT-PCR indicam que o nível de expressão e tama-nho do transcrito do gene AtPK220 em hwe116 é alterado em relação ao controle do tipo silvestre.

Clonagem inicial das sequências parciais de AtPK22OL292F e AtPK220

[0099]Com base na anotação TAIR, sequências parciais de AtPK22OL292F (AtPK22OL292F(p)) e AtPK220 parcial (AtPK220(p)) foram ampliadas por RT-PCRs usando iniciadores de SEQ ID NO:106 e SEQ ID NO:107 que incluíram sítios de res-trição BamHI e PstI para clonagem e RNA modelo isolado de hwe116 e a planta de controle (Columbia), respectivamente). A sequência de nucleotídeo AtPK220L292F parcial resultante é mostrada como SEQ ID NO:5 e a sequência de aminoácido cor-respondente como SEQ ID NO:6. A sequência de nucleotídeo AtPK220 parcial resul-tante é mostrada como SEQ ID NO:7 e a sequência de aminoácido correspondente como SEQ ID NO:8.

Ensaio de atividade da cinase de uma proteína AtPK220L292F parcial ex-pressa em E.coli'

[00100]Os produtos da PCR foram digeridos com BamHI e PstI e inseridos no vetor de expressão: pMAL-c2 (New England Biolabs, Beverly, MA) para formar uma proteína de fusão na estrutura com o gene maIE para expressão da proteína de ligação de maltose: MBP-AtPK220L292F(p) e MBP-AtPK220(p). As proteínas de fu-são foram expressas no E.coli e purificada usando cromatografia de afinidade de amilose, conforme descrito pelo fabricante (New England Biolabs). As frações con-tendo as proteínas de fusão foram agrupadas e concentradas (Centriprep-30 con-centrator, Amicon). SDS-PAGE foi empregada para analisar o nível de expressão, tamanho e pureza das proteínas de fusão.

[00101]Ensaios de atividade foram realizados de acordo com (Huang e ou-tros, 2000). Mistura de ensaio de autofosforilação de cinase (30 μL) continham tam-pão de reação de cinase (50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgC12, 10 mM MnC12), 1 μCi [y-32P] ATP e 10 ng de AtPK220L292F(p) ou MBP-AtPK220(p) purificado. Para os ensaios de transfosforilação, proteína básica de mielina (3 μg) foi adicionada a cada ensaio. As reações foram iniciadas por adição das enzimas. Após incubação a tem-peratura ambiente por 30 minutos, as reações terminaram por adição de 30 μL de tampão de amostra Laemmli (Laemmli, 1970). As amostras foram aquecidas a 95°C por 5 minutos e então carregadas em um gel de SDS-poliacrilamida a 15%. Os géis foram coloridos com azul Coomassie R-250, então descoloridos e secos. As faixas rotuladas 32P foram detectadas usando película Kodak X-Omat AR.

[00102]A proteína de fusão MBP-AtPK220(p) do tipo silvestre foi capaz de fosforilar o substrato artificial no ensaio de atividade in vitro, indicando que o sistema de ensaio foi eficaz e a proteína de fusão MBP-AtPK220(p) foi capaz de atividade. Em contraste, a forma mutante de hwe116, MBP-AtPK220L292F(p), foi incapaz de catalisar a fosforilação do substrato modelo. Esta mutação de ponto simples é sufici-ente para abolir a atividade do gene AtPK220(p) de hwe116.

Isolamento da sequência de DNAc de comprimento pleno de AtPK220

[00103]A anotação de AtPK220 (At2g25220) na base de dados TAIR identifi-ca um códon de partida 5’, sinal de terminação e sequência 3’ UTR. A análise da porção 5’ da sequência anotada sugeriu uma sequência 5’ alternativa e localização de códon de partida. Para determinar a região 5’ dos genes AtPK220 e o provável códon de partida, SMART RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, CloneTech) foi realizada.

[00104]Um iniciador específico, SEQ ID NO:108, foi projetado para a RACE 5’ e rendeu um produto da PCR de 450 pares de base. Os dados de sequência obtidos do produto RACE 5’ de 450 pares de base indicaram que a anotação TAIR de AtPK220 estava faltando nos 186 pares de base de 5’ que incluíram 39 pares de base da sequência 5’ UTR e 147 pares de base da sequência de codificação. Um ín- tron de 324 pares de base, localizado 8 pares de base a montante de TAIR identificou que o códon de partida ATG de AtPK220 também estava faltando na anotação genômica em TAIR.

[00105]A compilação dos resultados de RACE 5’ e a anotação da base de dados TAIR rende o DNAc de comprimento pleno de AtPK220 (SEQ ID NO:9). A sequência foi determinada como sendo de 1.542 pares de base de comprimento, que incluiu 39 pares de base de 5’ UTR, 204 pares de base de 3’ UTR e 1.299 pares de base da região de codificação. A região de codificação de AtPK220 é identificada como SEQ ID NO: 1 e codifica uma proteína de 432 aminoácidos e é identificada como SEQ ID NO:2. A comparação de AtPK220 ao seu homólogo mais próximo, At4g32000, mostra que uma sequência adicional de 51 pares de base está presente em AtPK220, o que inclui a sequência de nucleotídeos 368-418 da SEQ ID NO:9. Esta sequência provê uma sequência alvo para construções de infrarregulação pro- jetadas para infrarregular especificamente o geneAtPK220 porém não os genes não alvejados, tais como At4g32000.

[00106]A análise da sequência de AtPK220 indica que Ser/Thr PK pertence à família da proteína cinase semelhante a receptor possuindo um peptídeo de sinal (1-29), um domínio extracelular (30-67), um domínio de transmembrana simples (68-88), um domínio de ligação de ATP (152-175 conforme determinado por Prosite) um domínio de sítio ativo de Ser/Thr proteína cinase (267-279 conforme determinado pelo método InterPro) e uma alça de ativação (289-298, 303-316).

Resgate do mutante hwel 16 por AtPK220

[00107]As construções para a expressão de AtPK220 do tipo silvestre foram geradas e transformadas no mutante hwe116. O construyo foi constitutivamente ex-presso de um promotor de CaMV 35S e referido como 35S-AtPK220.

35S-AtPK220

[00108]O par de iniciador SEQ ID NO:109 e SEQ ID NO:110 foi usado para ampliar um fragmento compreendendo o quadro aberto de leitura (ORF) de compri-mento pleno de AtPK220. O par de iniciador SEQ ID NO:111 e SEQ ID NO:110 foi usado para ampliar um fragmento compreendendo uma porção de ORF de AtPK220. Os fragmentos ampliados foram digeridos com enzimas de restrição SmaI e BamHI e clonados em um vetor pEGAD digerido com as mesmas enzimas de restrição. O fragmento compreendendo o quadro aberto de leitura de comprimento pleno de AtPK220 resultante da PCR e digestão de restrição subsequente é revelado como SEQ ID NO:10. O fragmento compreendendo uma porção de AtPK220 ORF resultante da PCR e digestão de restrição subsequente é revelado como SEQ ID NO:11.

[00109]O construto 35S-AtPK220 foi transformado em hwe116 de Arabi- dopsis. As linhagens transgênicas foram recuperadas e avançadas para linhagens homozigotas T3. Estas linhagens são testadas quanto a suas características de tole-rância a estiagem e eficiência do uso da água. O construto 35S-AtPK220 restaura os fenótipos do tipo silvestre.

Linhagens de nocauteamento de T-DNA e avaliação da fisiologia

[00110]Linhagens de SALK T-DNA de AtPK220 e dois genes homólogos próximos nos quais são identificadas como TAIR números de acesso AT4G32000 (SEQ ID NO:16) e AT5G11020 (SEQ ID NO:18) foram obtidas de ABRC e avançadas para homozigocidade. Elas estão listadas como se segue: AtPK220: SALK_147838; AtPK32000 (AT4G32000): SALK_060167, SALK_029937 e SALK_121979; AtPK11020 (AT5G11020): SAIL_1260H05.

[00111]A análise dos níveis de expressão gênica tanto por RT-PCR quanto por análise Northen demonstrou que os genes alvo nas linhagens de nocauteamento foram significativamente reduzidos ou completamente abolidos. Estas linhagens de nocauteamento foram usadas para avaliação fisiológica. Apenas a linhagem de no- cauteamento de AtPK220 (SALK_147838) mostrou tolerância a estiagem significante e eficiência melhorada do uso da água, indicando que AtPK220 é o gene alvo e responsável pelo fenótipo de eficiência do uso da água de hwe116. Os genes proximamente relacionados AT4G32000 e AT5G11020 não são funcionalmente redundantes e a inibição destes genes é insuficiente para gerar o fenótipo de hwe116.

Inibição da atividade da proteína para PK220 em Arabidopsis

[00112]A inibição da atividade gênica pode ser obtida por uma variedade de dispositivos técnicos, por exemplo, expressão de antisenso, construções de RNAi ou de grampo, mutagênese in vivo, abordagens negativas dominantes ou geração de população mutante e seleção de linhagens apropriadas por dispositivos de classifi-cação. São providos exemplos dos ditos dispositivos para produzir plantas possuindo expressão e ou atividade inibidas do gene PK220.

Infrarregulação de PK220 por RNAi

[00113]As construções foram projetadas para inibição de RNAi de PK220 usando construções de grampo (HP). As construções compreenderam 288 pares de base ou 154 pares de base da sequência de DNAc de AtPK220 para produzir construções referidas como (270)PK220 e (150)PK220. O fragmento de 288 pares de base (270)PK220 compreende 10 pares de base de sequência de íntron que foi incluída no iniciador da PCR durante construção destes produtos da PCR. As construções de vetor usando estes fragmentos podem ser obtidas para direcionar a expressão sob o controle de um promotor de escolha que ficará claro aos versados na técnica. Nestes exemplos, um promotor constitutivo (35S CaMV) ou o promotor de AtPK220 nativo (PPK) foi usado. Dois fragmentos ou porções do gene AtPK220 foram selecionadas, primeiro um fragmento de 288 pares de base At(270)PK220 (SEQ ID NO:13) e um segundo fragmento de 154 pares de base At(150)PK220 (SEQ ID NO:12) sendo selecionados de uma região divergente de AtPK220 em comparação ao seu homólogo mais próximo At4g32000.

35S-HP-At(270)PK220 e 35S-HP-At(150)PK220

[00114]As construções de grampo (HP) 35S-HP-At(270)PK220 e 35S-HP- At(150)PK220 foram geradas como se segue. Os fragmentos de sentido de (270)PK220 e (150)PK220 foram ampliados por RT-PCR usando pares iniciadores de SEQ ID NO:134/SEQ ID NO:115 e SEQ ID NO:114/ SEQ ID NO:115, respectivamente. Os produtos da PCR foram digeridos com SacI, e inseridos em um vetor binário pBI121tGUS no sítio Sacl, respectivamente. Os vetores resultantes foram então usados para subclonar os fragmentos de antisenso de (270)PK220 e (150)PK220 que eram derivados de produto de RT-PCR ampliados usando pares iniciadores de SEQ ID NO:112/SEQ ID NO:117 e SEQ ID NO:116/ SEQ ID NO:117, respectivamente. Ambos os produtos de vetor e PCR foram digeridos com BamHI e Xbal para subclonagem.

PPK-HP-At(270)PK220 e PpK-HP-At(150)PK220

[00115]As construções PpK-HP-At(270)PK220 e PpK-HP-At(150)PK220 fo- ram obtidas de 35SHP-At(270)PK220 ou 35S-HP-At(150)PK220 respectivamente por substituição da sequência de promotor de 35S por uma sequência de promotor de AtPK220 (SEQ ID NO:14). A sequência de promotor de 35S foi removida de 35S- HP-At(270)PK220 e 35S-HP-At(150)PK220 por digestão dupla de Hind III e Xba I. O plasmídeo linearizado foi então tratado com fragmento Klenow de DNA polimerase I para gerar extremidades cegas e autoligadas para formar um novo plasmídeo, no qual o sítio XbaI foi restaurado, enquanto o Hind III não foi. Por emprego deste sítio XbaI restaurado, um fragmento de DNA de Nhe I do promotor de AtPK220 foi clona- do a montante da sequência HP-At(270) e HP-At(150) para produzir os plasmídeos finais de PPK -HP-At(270)PK220 e PpK-HP-At(150)PK220. A sequência de promotor de AtPK220 (SEQ ID NO:14) foi ampliada por PCR a partir do genoma de Arabi- dopsis (Columbia) empregando pares iniciadores de SEQ ID NO:135/SEQ ID NO:136.

P4790-HP-At(270)PK220

[00116]De modo a infraregular especificamente AtPK220 endógeno, um promoter forte de raiz P4790 foi identificado e encontrado como sendo altamente ex-pressos nas raízes de Arabidopsis, especificamente na endoderme, periciclo e este- la. O promotor de P4790 está associado a uma sequência de codificação identificada como At2g44790 e as características de expressão de P4790 são semelhantes aque-las da expressão de AtPK220 do tipo silvestre. O P4790 foi usado para substituir o promotor de 35S constitutivo em 35S-HPAt(270)PK220. O promotor de At2g44790 foi ampliado usando DNA genômico de Arabidopsis (Col) como modelo e iniciadores SEQ ID NO:151 e SEQ ID NO:152. O fragmento de promotor ampliado possui o comprimento de 1.475 pares de base a direita a montante do códon de partida ATG de At2g44790 de acordo com a anotação TAIR. O fragmento P4790 de 1.475 pares de base é identificado na SEQ ID NO:150. Os sítios de restrição Hind III e Xba I foram introduzidos na extremidade 5' e 3' do fragmento do promotor pelo projeto do iniciador. A sequência de promotor foi então usada para substituir o promotor de 35S nos plasmídeos 35S-HPAt(270)PK por digestão dupla HindIII/Xbal, que resultou nas construções finais de pBI-P4790-HP-At(270)PK.

Infrarregulação de BnPK220 em Brassica usando RNAi 35S-HP-Bn(340)PK

[00117]Para infrarregular o homólogo de AtPK220 nas espécies Brassica, um construto de grampo foi obtida usando um fragmento de 338 pares de base de BnPK220 (SEQ ID NO;153) como as porções de sentido e antisenso, e pBI300tGUS como o vetor. Dois pares iniciadores de SEQ ID NO:154 e SEQ ID NO:155; e SEQ ID NO:156 e SEQ ID NO:157 com sítios de restrição únicos foram projetados de acordo com a sequência de BnPK220. Um fragmento da PCR de 338 pares de base de comprimento foi ampliado usando DNAc de Brassica napus como o modelo e os dois pares iniciadores, respectivamente. O fragmento SacL foi então inserido no pBI300tGUS no sítio Sacl a montante do espaçador tGUS em uma orientação de antisenso. O plasmídeo resultante foi subsequentemente usado para clonagem de um fragmento de XbaI-BamI em uma orientação de sentido nos sítios Xbal e BamHI. O vetor pBI121tGUS foi modificado dentro do gene marcador selecionável de NPT II e denominado pBI300. O gene NPT II no vetor pBl121 contém uma mutação de ponto (G para T na posição 3.383, alteração de aminoácido E182D). De modo a restaurar o gene com sua versão WT, o fragmento NheI-BstBl (posições 2715-3648) foi substituído com o fragmento de NheI-BsbI correspondente, a partir do plasmídeo pRD400 (PNAS, 87:3435-3439, 1990; Gene, 122:383-384, 1992).

P4790-HP-Bn(340)PK

[00118]O promotor de P4790 de At2g44790 foi usado para controlar a expres-são de um construto de grampo para infrarregular BnPK220 endógeno em Brassica. O plasmídeo de 35S-HP-Bn(340)PK foi digerido com HindIII e Xbal para substituir o promotor de 35S pelo promotor de P4790.

Infrarregulação de PK220 por antisenso

[00119]O construto AtPK220-antisenso-35S foi obtido por infrarregulação da expressão de AtPK220 via antisenso. O fragmento de antisenso foi gerado usando PCR e o par de iniciador SEQ ID NO:106/SEQ ID NO:113. O produto sintetizado foi digerido com BamHI e XbaI para render uma sequência de 1.177 pares de base compreendendo 1.160 pares de base de AtPK220 (SEQ ID NO:11). Estavam incluídos na extremidade 5’ 10 pares de base da sequência de íntron e na extremidade 3’, 7 pares de base da sequência 3’UTR, que foram retidos dos iniciadores da PCR. O fragmento de 1.177 pares de base foi clonado em uma orientação de antisenso em relação ao promotor de 35S em pBI121w/oGUS em BamHI e Xbal.

Infrarregulação de PK220 por AmiRNA

[00120]Um construto artificial de microRNA (amiRNA) foi capaz de infrarre- gular a expressão de AtPK220 em Arabidopsis. Um fragmento do DNA genômico de Arabidopsis contendo gene microRNA319a (SEQ ID NO:148), foi ampliado por PCR usando DNA genômico (Col) de Arabidopsis como modelo e iniciadores listados co-mo SEQ ID NO:141 e SEQ ID NO:142. A estrutura de miR319a foi então usada para construir amiRPK220 (SEQ ID NO:149), onde um fragmento de 21 pares de base do gene miRNA319a em ambas as orientações de antisenso e sentido foi substituído por um fragmento de DNA de 21 pares de base de AtPK220 usando PCR recombi- nante. Três pares iniciadores: SEQ ID NO:141 / SEQ ID NO:144; SEQ ID NO:143 / SEQ ID NO:146 e SEQ ID NO:145 / SEQ ID NO:142 foram projetados para o cons- truto. O produto da PCR final foi digerido com BamHI e Xbal, e subsequentemente clonados em pBI121 sem GUS para transformação em Arabidopsis ou outras espé-cies de planta de escolha.

Inibição de PK220 através de estratégica negativo dominante 35S-AtPK22OL292F

[00121]Para a expressão de uma sequência não funcional de AtPK220, o AtPK22OL292F de hwe116 foi ampliado por PCR por RT-PCR usando iniciadores a frente e reversos SEQ ID NO:118 e SEQ ID NO:110. O produto PCR foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Xbal (SEQ ID NO:121) e ligado dentro do vetor binário pBI121 sem GUS. A sequência SEQ ID NO:121 compreende o quadro aberto de leitura de AtPK22OL292F (SEQ ID NO:3) e um adicional de 3 pares de base na extremidade 5’ e 7 pares de base na extremidade 3’ que são derivados das sequências de UTR (SEQ ID NO:121). O construto final, 35S-AtPK22OL292F, foi usado para gerar plantas transgênicas Arabidopsis e Brassica que avançaram para homozigotas por avaliação fisiológica. Adicionalmente, o vetor é usado para transformar uma espécie de planta de escolha e pode ser um dicoto ou monocoto.

P4790-AtPK22OL292F

[00122]O fragmento HindIII-Xal do promoter de raiz P4790 foi usado para substituir o promotor de 35S em pBI300, e então a sequência de AtPK22OL292F foi colocada a jusante de P4790 por digestão com Xbal e BamHI para gerar um construto negativo dominante de P4790-driven. O plasmídeo resultante foi então usado para transformação de Brassica. Adicionalmente, o vetor é usado para transformar uma espécie de planta e pode ser um dicoto ou monocoto.

Infrarregulação de homólogos a AtPK220 em uma espécie monocoto usando RNAi PBdURQ-HP-Bd(272)PK

[00123]Um cassete de expressão foi construído e inserido em duas estrutu-ras de vetor diferentes, a primeira estando dentro dos sítios Pacl-Ascl de pUCAP e a segunda estando dentro dos sítios Pacl-Ascl de pBF012. pBF012 é idêntico ao pBINPLUS/ARS exceto que o cassete NPTII acionado por Ubi3 de batata foi excisa- do através da digestão de Fsel seguido por autoligação.

[00124]PK220 de Brachypodium distachyon (BdPK220) foi ampliado usando combinações de iniciador SEQ ID NO:158 (bWET Xbal F) mais SEQ ID NO:159 (bWET BamHI R) apresentando sítios Xal ou BamHI respectivamente nos iniciadores e SEQ ID NO:158 (bWET Xbal F) mais SEQ ID NO:160 (bWET ClaI R) apresentando sítios Xbal ou ClaI respectivamente nos iniciadores. Os produtos da PCR foram dige-ridos com as enzimas de restrição indicadas fornecendo um fragmento de 272 pares de base (SEQ ID NO:161).

[00125]A sequência espaçadora de grampo BdWx íntron 1 (SEQ ID NO:164), foi ampliada com os iniciadores de SEQ ID NO:162 (bWx BamHI F) mais SEQ ID NO:163 (bWx ClaI R) apresentando sítios BamHI ou ClaI respectivamente nos iniciadores e digerida com as enzimas de restrição indicadas. O gene Wx de B. distachyon Wx é homólogo ao gene ceroso de arroz GBSS, embora os íntrons mos-trem pouca conservação.

[00126]Os três fragmentos foram ligados em conjunto dentro do sítio XbaI de pUCAP MCS resultando em uma sequência BdWx íntron 1 sendo flanqueada por sequências alvo de Bd(272)PK220 em orientações opostas. O promotor de ubiquiti- na de B. distachyon (BdUBQ) contém um sítio interno BamHI, de modo que o cassete de RNAi foi ampliado com iniciadores SEQ ID NO:200 (bWET BamHI extremidade 1) e SEQ ID NO:165 (bWET BamHI extremidade 2) que criam extremidades coesivas de BamHI sem a necessidade de digestão de BamHI. O fragmento BamHI de RNAi foi então ligado no interior do sítio BamHI de pUCAP já contendo o promotor de BdUBQ e o terminador de BdUBQT resultando no clone intermediário pBF067. A inserção completa de pBF067 foi ampliada com SEQ ID NO:166 (BdUBQ Pvul F) e SEQ ID NO:167 (BdUBQT PacI R), digerida com Pvul e PacI e subsequentemente ligada no interior do sítio PacI dos vetores pUCAP ou pBF012 já contendo um marcador selecionável de NPTII mutante direcionado por BdGOS2 nos sítios Ascl-Pacl, resultando em pBF108 e pBF109, respectivamente. Este gene NPTII mutante é geral-mente encontrado nos vetores de fechamento. Existe apenas uma diferença de par de base simples do tipo silvestre.

[00127]Este cassete se encontra nos sítios PacI-AscI de pUCAP para o vetor de vaivém/bombardeamento pBF108 e nos sítios Pac-AscI de pBF012 para o vetor binário pBF109.

PBdUBQ-HP-Pv(251)PK

[00128]Um cassete de expressão foi construído e inserido em duas estrutu-ras de vetor diferentes, a primeira sendo no interior dos sítios PacI-AscI de pUCAP e a segunda no interior dos sítios PacI-AscI de pBF012. Um fragmento de Panicum virgatum PK220 apresentando 251 pares de base de comprimento (Pv(251)PK220) e identificado como SEQ ID NO:168 foi ampliado usando as combinações de iniciador de SEQ ID NO:169 (PvWET XbaI F) mais SEQ ID NO:170 (PvWET BamHI R) e SEQ ID NO:169 (PvWET XbaI F) mais SEQ ID NO:171 (PvWET ClaI R). Os produtos da PCR foram digeridos com as enzimas de restrição indicadas. Não existe informações sobre sequências relacionadas ao PvWx íntron 1, de modo que o BdWx íntron 1 foi usado como sequência espaçadora neste construto. Esta sequência foi ampliada com iniciadores de SEQ ID NO:162 (bWx BamHI F) mais SEQ ID NO:163 (bWx ClaI R) e digerida com enzimas de restrição indicadas.

[00129]Os três fragmentos foram então ligados em conjunto no interior do sí-tio Xbal de pUCAP MCS resultando na sequência de BdWx íntron 1 sendo flanquea-da pelas sequências alvo de Pv(251)PK220 nas orientações opostas. Nenhuma se-quência de promotor de PvUBQ estava disponível, assim o promotor BdUBQ e ter- minador são usados neste construto. O promotor de BdUBQ contém um sítio BamHI interno, assim o cassete de RNAi foi ampliado com iniciadores de SEQ ID NO:172 (PvWET BamHI extremidade 1) e SEQ ID NO:173 (PvWET BamHI extremidade 2) que criam extremidades coesivas BamHI, sem a necessidade de digestão de BamHI. O fragmento BamHI de RNAi foi então ligado no interior do sítio BamHI de pUCAP já contendo o promotor de BdUBQ e o terminador de BdUBQT resultando no clone intermediário pBF152. A inserção completa de pBF152 foi ampliada com SEQ ID NO:166 (BdUBQ Pvul F) e SEQ ID NO:167 (BdUBQT PacI R), digerida com Pvul e PacI e subsequentemente ligada no interior do sítio PacI dos vetores pUCAP ou pBF012 já contendo NPTII do tipo silvestre mutante direcionado por BdGOS2 nos sítios Ascl-Pacl, resultando em pBF169 e pBF170, respectivamente.

PsbuBQ-HP-Sb(261)PK

[00130]Foi construído um cassete de expressão e inserido no interior de du-as estruturas de vetor diferentes, a primeira sendo no interior dos sítios PacI-AscI de pUCAP e a segunda no interior dos sítios PacI-AscI de pBF012. Um fragmento de Sorghum bicolor PK220 (SbPK220) apresentando 261 pares de base de comprimento (Sb(261)PK220) e identificado como SEQ ID NO:174 foi ampliado usando as combinações de iniciador de SEQ ID NO:175 (SbWET XbaI F) mais SEQ ID NO:176 (SbWET BamHI R) e SEQ ID NO:175 (SbWET XbaI F) mais SEQ ID NO:177 (SbWET ClaI R). Os produtos da PCR foram digeridos com as enzimas de restrição indicadas para fornecer um fragmento Sb(261)PK220. A sequência espaçadora de grampo, SbWx íntron 1 (SEQ ID NO:178), foi ampliada com iniciadores de SEQ ID NO:179 (SbWx BamHI) mais SEQ ID NO:180 (SbWx C1aI R) e digerida com as enzimas de restrição indicadas. Os três fragmentos foram então ligados em conjunto dentro do sítio XbaI de pUCAP MCS resultando na sequência SbWx íntron 1 sendo flanqueada pelas sequências alvo SbWET nas orientações opostas. As extremida-des coesivas BamHI foram adicionadas ao cassete RNAi através de ampliação com os iniciadores de SEQ ID NO:181 (SbWET BamHI extremidade 1) e SEQ ID NO:182 (SbWET BamHI extremidade 2). O fragmento BamHI RNAi foi então ligado ao sítio BamHI de pUCAP já contendo o promotor de SbUBQ e o terminador de SbUBQT resultando no clone intermediário pBF151. A inserção completa pBF151 foi ampliada com a SEQ ID NO:192 (SbUBQ Pvul F) e a SEQ ID NO:167 (BdUBQT PacI R), dige-rida com Pvul e PacI e subsequentemente ligada ao sítio PacI dos vetores pUCAP ou pBF012 já contendo NPTII do tipo silvestre acionado por BdGOS2 nos sítios Ascl- Pacl resultando em pBF158 e pBF171, respectivamente.

[00131]Um promotor de SbGOS2 que foi identificado da sequência do ge- noma do sorgo foi ampliado e usando o par de iniciador SEQ ID NO:184 (SbGOS2 HindIII F) e SEQ ID NO:185 (SbGOS2 HindIII R) um fragmento de 1.000 pares de base de GOS2, identificado como SEQ ID NO:183 foi ampliado com PCR e clonado usando os sítios de restrição HindIII.

[00132]Um promotor de SbUBQ que foi identificado da sequência do geno- ma do sorgo foi ampliado e usando o par de iniciador SEQ ID NO:187 (SbUBQ Pstl F) e SEQ ID NO:188 (SbUBQ Pstl R) um fragmento de 1.000 pares de base do promotor UBQ, identificado como SEQ ID NO:186, foi ampliado por PCR e clonado usando os sítios de restrição Pstl.

[00133]Um terminador de SbUBQ que foi identificado da sequência do ge- noma do sorgo foi ampliado e usando o par de iniciador SEQ ID NO:190 (SbUBQT KpnI F) e SEQ ID NO:191 (SbUBQT KpnI R) um fragmento de 239 pares de base do terminador UBQ, identificado como SEQ ID NO:189, foi ampliado com PCR e clona- do usando os sítios de restrição KpnI.

RNAi de Miscanthus giganteus (MgPK220)

[00134]As construções de expressão projetadas para infrarregular através de uma estratégia de grampo podem ser desenvolvidas seguindo a mesma estratégia conforme descrita acima, resultando em um construto que pode compreender os seguintes elementos, um cassete marcador selecionável BdGOS2-wtNPTII-BdUBQT e um cassete BdUBQ-(MgPK220 grampo-RNAi)-BdUBQT em um vetor de escolha, tal como, pUCAP e pBF012

Isolamento e Clonagem do Promotor de AtPK220

[00135]O promotor de AtPK220 foi isolado usando uma abordagem de PCR usando DNA genômico (ecotipo Columbia) de Arabidopsis como modelo. O iniciador 5’, SEQ ID NO:119, foi projetado próximo ao gene adjacente e o iniciador 3’, SEQ ID NO:120, localizado 25 pares de base a jusante do códon de partida ATG do gene AtPK220. O produto ampliado foi digerido com BamHI e SmaI e clonado em pBI101. O fragmento digerido, SEQ ID NO:14, possuía 1.510 pares de base de comprimento. O construto resultante foi denominado PAtPK220-GUS.

Análise da atividade do promotor de AtPK220 empregando ensaio GUS

[00136]PAtPK220-GUS foi transformado nas plantas Arabidopsis usando imersão da flor e as plantas transgênicas foram avançadas para homozigosidade T3. Vários tecidos incluindo sementeiras novas e folhas, caules, flores, síliquas e raízes de plantas florescendo T3 foram coletadas, coloridas em solução X-Gluc a 37°C por toda noite, descoloridas com solução de etanol e examinadas sob microscópio. Os resultados mostraram que o promotor de AtPK220 foi expresso principalmente na células da endoderme e periciclo do tecido de raiz e foi também encontrado nos tri-comas das folhas e revestimento de semente das sementes em desenvolvimento. A observação de que a expressão de PAtPx220-GUS foi suprimida por estresse de água foi significativa.

Localização subcelular das proteínas de AtPK220 em Arabidopsis

[00137]A expressão de uma proteína de fusão de AtPK220-GFP do tipo sel-vagem de comprimento pleno em Arabidopsis transgênica foi empregada para en-contrar a localização subcelular da proteína nativa. O par de iniciador SEQ ID NO:109 e SEQ ID NO:110 produziu um fragmento que foi digerido com SamI e BamHI para render um fragmento compreendendo o quadro aberto de leitura de comprimento pleno de AtPK220 e é revelado como SEQ ID NO:10 e clonado a ju-sante, na estrutura, com a proteína fluorescente verde (GFP) em um plasmídeo pE- GAD nos sítios SmaI e BamHI. Adicionalmente, a sequência de codificação de AtPK220 foi ampliada usando um par de iniciador SEQ ID NO:198 e SEQ ID NO:199 e inserida a montante e na estrutura com GFP por digestão Agel do plasmídeo pE- GAD e o fragmento ampliado de AtPK220.

[00138]As construções 35S-GFP-AtPK220 e 35S-AtPK220-GFP foram trans- formadas em plantas Arabidopsis e plantas transgênicas homozigotas (tecidos de raiz) foram usadas para classificação visual do sinal GFP sob microscópio confocal. Fluorescência verde foi detectada ao longo da membrana plasmática, sugerindo que a proteína de AtPK220 estava associada à membrana plasmática nas raízes e que AtPK220 possivelmente funciona como um receptor cinase para detectar e transdu- zir sinais ambientais.

Isolamento de BnPK220 de Brassica napus por RACE 5' e 3'

[00139]Para isolar o gene homólogo de AtPK220 da canola, uma busca blast (BASTn) da Coleção de Nucleotídeo NCBI (nr/NT, et) e TIGR (DFCI) Brassica napus EST Database foi realizada usando a sequência de AtPK220. Com base nas se-quências com maior similaridade, um par de iniciadores, SEQ ID NO:122 e SEQ ID NO:123 foi designado e usado para ampliar por PCR um fragmento parcial de BnPK220. Ambos RNAm e DNA genômico isolados das folhas de Brassica foram usados como modelo para estas ampliações. Um fragmento de DNA de cerca de 500 pares de base foi obtido por PCR a partir do modelo de DNA genômico de canola. Análise da sequência deste produto da PCR mostrou que ele compartilha uma alta identidade com AtPK220 na sequência de nucleotídeo, bem como na organização do íntron.

[00140]Com base na sequência parcial de BnPK220, RACE 5' e 3' foi reali-zada para isolar o DNAc de BnPK220 de comprimento pleno. Para RACE 3’ um ini-ciador a frente, SEQ ID NO:124 e um iniciador a aninhado, SEQ ID NO:125, foram empregados. Para RACE 5' um iniciador reverso, SEQ ID NO:126 e seu iniciador aninhado, SEQ ID NO:127, foram determinados. DNAc pronto para RACE tanto para RACE 5’ quanto para 3’ foi fabricado de RNA isolado de folhas jovens de Brassica.

[00141]A RACE 5’ rendeu um DNA ampliado de cerca de 650 pares de base de comprimento e a RACE 3’ rendeu um DNA de cerca de 1 kb de tamanho. O se- quenciamento destes dois fragmentos da RACE mostrou similaridade de sequência alta com AtPK220. RNAm de comprimento pleno da sequência de BnPK220 foi reu-nido por combinação dos resultados da RACE 5’, fragmento de BnPK220 parcial e RACE 3’.

[00142]Um DNAc de BnPK220 de comprimento pleno foi ampliado por RT- PCR usando os iniciadores da PCR SEQ ID NO:128 e SEQ ID NO:129. Este DNAc compreende um ORF (quadro aberto de leitura) de 1.302 nucleotídeos (SEQ ID NO:25) e codifica uma proteína de 433 aminoácidos (SEQ ID NO:26). Outro DNAc de BnPK220 de comprimento pleno foi também ampliado por RT-PCR usando DNAc fabricado de B. napus. Este DNAc (SEQ ID NO: 193) é 98,6% idêntico à SEQ ID NO:25, e codifica uma proteína (SEQ ID NO:194) 99,3% idêntica à SEQ ID NO:26.

Isolamento de GmPK220 de comprimento pleno de soja por RACE 5’

[00143]Em uma busca Blastn da base de dados NCBI EST, um homólogo de AtPK220 foi encontrado como EST de soja (Glycine Max), CX709060.1. A partir deste homólogo, um grupo de unigene de 13 ESTs foi desenvolvido de uma base de dados de EST de soja. Uma contígua foi então montada destes 13 ESTs o que reveste a maior parte da sequência gênica.

[00144]A sequência de comprimento pleno de GmPK220 (SEQ ID NO:41) foi determinada por combinação dos resultados de RACE 5’ e RACE 3’ contíguas reu-nidas. A RACE 5’ foi realizada usando os iniciadores de SEQ ID NO:130 para PCR- RACE primária e SEQ ID NO:131 para PCR-RACE aninhada. A RACE 3’ foi realiza-da usando os iniciadores da SEQ ID NO:137 para PCR-RACE primária e SEQ ID NO:138 para PCR-RACE aninhada. GmPK220 codifica uma proteína conforme mos-trado na SEQ ID NO:42.

Isolamento da sequência de OsPK220 (arroz) por exploração da base de dados

[00145]O genoma do arroz (Oryza sativa, cultivar japonês) foi completamente seqüenciado e encontra-se disponível publicamente. O homólogo de AtPK220 no arroz foi determinado por busca BLAST de uma base de dados EST de arroz e por busca BLASTP de uma base de dados da sequência genômica. O alvo possuindo a classificação mais alta foi identificado como número de Acesso Os05g0319700.

[00146]Os05g0319700 é abreviado como OsPK220, e revelado como SEQ ID NO:59, que codifica uma proteína revelada como SEQ ID NO:60.

Isolamento da sequência ZmPK220 (milho)

[00147]Dois homólogos candidatos foram encontrados por busca BLAST da base de dados TIGR EST, uma um número de Acesso unigene TC333547 e o se-gundo número de Acesso C0439063.

[00148]O número de Acesso TC333547 apresenta 2.125 nucleotídeos de comprimento e contém um quadro aberto de leitura de 1.377 nucleotídeos (SEQ ID NO:77) codificando uma proteína de 458 aminoácidos (SEQ ID NO:78). Esta proteína traduzida possui comprimento pleno e é superior a proteína de AtPK220. O domínio de cinase de término C é altamente conservado entre a Arabidopsis e uma sequência de proteína do milho, contudo a sequência de término N é mais variável.

[00149]C0439063 é uma sequência EST curta não apresentando a sequên-cia de término 5’. A sequência faltante foi obtida utilizando-se os métodos da RACE. Dois iniciadores da RACE 5’ foram projetados com base no alinhamento entre AtPK220 e C0439063. O iniciador da RACE 5’ primária é a SEQ ID NO:132 e o inici-ador da RACE 5’ aninhada é a SEQ ID NO:133. A RACE 3’ foi também realizada usando os iniciadores da SEQ ID NO:139 para PRC-RAC primária e SEQ ID NO: 140 para PCR-RACE aninhada. A sequência de ZmPK220 (SEQ ID NO:79) foi montada com base na RACE 5’, resultados da RACE 3’ e sequências de C0439063 EST. A sequência de proteína correspondente foi listada como SEQ ID NO:80.

[00150]A análise da sequência mostrou que C0439063 possui similaridade de sequência mais alta com relação à OsPK220 de arroz que em relação à TC333547.

Isolamento da sequência de BdPK220 de Brachipodium distachyon (Rd)

[00151]Brachipodium é uma das plantas monocotiledôneas modelo para pesquisa genômica funcional. Uma contígua foi montada de ESTs ou GSSs de acesso público e ela cobre uma porção 3’ de BdPK220 de acordo com alinhamento homólogo. A RACE empregando iniciador de Bd81RAR1 (SEQ ID NO: 195) e iniciador de Bd81RAR2 (SEQ ID NO: 196) designados da contígua e usando DNAc de folha de Brachipodium produziu um fragmento único de cerca de 650 pares de base. A reunião da sequência de RACE e a contígua forneceu a sequência de BdPK220 de comprimento pleno (SEQ ID NO:24) que codifica uma proteína de 461 aminoáci- dos (SEQ ID NO: 197).

Determinação da sequência de GsPK220 (algodão) por exploração da base de dados

[00152]Uma busca BLAST de uma base de dados TIGR-EST de algodão (Gossypium) identificou um grupamento de sequência que recebeu número de Acesso TC79117, que apresenta alta similaridade com relação a AtPK220. Este gru-pamento possui dois ESTs de sobreposição, TC79117 que é referido no presente documento como GsPK220) e consiste em um quadro aberto de leitura de 1.086 nu- cleotídeos (SEQ ID NO:81). O maior quadro aberto de leitura codifica uma proteína de 361 aminoácidos (SEQ ID NO:82).

Fenótipo tolerante a estiagem de mutante hwe116 encontrado sob condições limitadas de água e eficiência melhorada do uso da água sob ambas condições de estiagem e condições ótimas

[00153]Plantas em dois grupos foram desenvolvidas (5 plantas por pote de 7,62 cm cheios com a mesma quantidade de mistura isenta de solo) sob condições ótimas em uma câmara de crescimento (22°C, 18 horas de luz, 150uE, 70% de umi-dade relativa) até o primeiro dia de floração (n = 6 por entrada por tratamento). Pri-meiro as flores de todas as plantas receberam a mesma quantidade de água (níveis ótimos) porém um grupo de plantas foi usado para tratamento ótimo e o outro para tratamentos com estiagem. No tratamento ótimo, os potes foram pesados diariamente para determinar a perda diária de água e então aguados novamente até os níveis ótimos. No tratamento com estiagem, os potes foram pesados diariamente para de-terminar a perda de água e deixados secar. As plantas foram colhidas nos dias 0, 2 e 4 dos tratamentos com estiagem e ótimo para determinações da biomassa do broto. Perda de água menor em relação ao peso seco do broto (DW) quando comparada ao controle, sob condições de estiagem, indica um fenótipo tolerante a estiagem. A razão de peso seco do broto acumulado para perda de água durante o período de tratamento provê uma medida da eficiência do uso da água (WUE). As plantas de hwe116 tiveram o florescimento retardado por 1 a 2 dias. A perda de água em relação à biomassa do broto foi significativamente inferior (em torno de 22%) no hwe116 em relação ao controle de origem sob condições de estiagem. Este resultado indica que o mutante é tolerante à estiagem. Foi verificado que sob condições ótimas a perda de água em relação ao DW do broto foi também significativamente inferior no mutante (em torno de 41%) em comparação ao controle de origem. Este resultado é consistente com fenótipo de eficiência do uso da água mais alta. Os cálculos da efi-ciência do uso da água mostraram que sob ambas condições de estiagem (Tabela 1) e condições ótimas (Tabela 2) o mutante hwe116 utiliza água de forma mais eficiente porque ele acumulou mais biomassa do broto com menos água (estiagem) ou a mesma quantidade de biomassa com menos água (ótima).Tabela 1. Eficiência do Uso da Água (WU E) sob condições de estiagemTabela 2. Eficiência do Uso da Água (WUE) sob condições ótimas

[00154]O resultado final da eficiência melhorada do uso da água no mutante é a biomassa DW de broto maior conforme mostrado na Tabela 3 (colhida no dia 4 a partir da primeira flor). Tabela 3. Biomassa DW de bro o final

O mutante hwe116 mantém teor de água no solo superior durante tratamento com estiagem, alcança condições de estresse de água mais tardias e mostra proteção do rendimento seguindo estresse de estiagem durante florescimento em relação às plantas de controle

[00155]Um experimento foi realizado com 5 plantas por pote de 10,16 cm cheios com a mesma quantidade de mistura isenta de solo. Plantas em dois grupos foram desenvolvidas (ótima e estiagem) sob condições ótimas em uma câmara de crescimento (22°C, 18 horas de luz, 150uE, 70% de umidade relativa) até o primeiro dia de flor (n = 9 por entrada e por grupo). Primeiro as flores de todas as plantas re-ceberam a mesma quantidade de água e adicionalmente a água foi retirada para as plantas do grupo tratadas com estiagem. O grupo ótimo foi aguado diariamente como anteriormente. Os potes no grupo tratado com estiagem foram pesados diariamente pelos 6 dias do tratamento para determinar o teor de água do solo. Após 6 dias de tratamento com estiagem as plantas foram irrigadas novamente e deixadas completar seu ciclo de vida como o grupo ótimo sob condições ótimas. Na maturidade as sementes foram colhidas de cada pote e o rendimento da semente foi deter- minado para as plantas com tratamento ótimo e com estiagem. Os resultados das alterações no teor de água do solo durante os tratamentos com estiagem foram de-terminados. O teor da água do solo foi medido como a porcentagem da quantidade inicial de água no pote. Os resultados indicam que o mutante era capaz de reter água nos potes por mais tempo e portanto o mesmo alcançou o nível de estresse (em torno de 25% do teor de água do solo) 1 dia mais tarde e murchou 1 dia mais tarde que o controle. Este tratamento causou uma redução no rendimento de 17% dos níveis ótimos no mutante, considerando-se que no controle a redução do rendimento foi de 41%. Portanto, o mutante demonstrou uma proteção do rendimento de 24% em relação ao controle, seguindo um tratamento com estiagem.

As sementeiras do mutante hwe116 mostraram menos sensibilidade ao es-tresse por frio

[00156]Dois grupos de plantas com 8 réplicas por entrada se desenvolveram com 3 plantas por pote de 7,62 cm em condições ótimas de 22°C e dias curtos para prolongar o desenvolvimento vegetativo e retardar a floração (10 horas de luz 150uE e 14 horas de escuro), 70% de umidade relativa em uma câmara de crescimento. Em 10 dias de idade (3 dias após o transplante das sementeiras no solo a partir de placas de ágar) o grupo de tratamento por frio foi colocado em uma câmara a 8°C para mais 11 dias de tratamento, enquanto o grupo ótimo foi mantido a 22°C. As plantas foram colhidas para determinações de peso seco do broto (DW) com 21 dias de idade. Os resultados são mostrados na Tabela 4. O mutante hwe116 apresentou sementeiras menores sob ótimas condições em relação aos controles, porém após exposição ao frio o DW do broto foi equivalente aquele de origem e como porcentagem de DW ótimo foi maior em relação a ambos os controles em 9 e 15% indicando que o crescimento do mutante não foi tão inibido pelo frio como o dos controles.Tabela 4. Peso seco do broto sob condições ótimas e no frio

O mutante hwe116 possui folhas mais espessas e teor de clorofila maior por área de folha. O mutante mostrou senescência retardada da folha e resistência ao estresse oxidativo

[00157]As plantas se desenvolveram 1 por pote de 7,62 cm sob condições ótimas de crescimento em uma câmara de crescimento (16 horas de luz, 300uE, 22°C, 70% de umidade relativa). No começo do florescimento, três discos de folha (86,6 μm2 cada) foram tomados de três folhas desenvolvidas completamente e mais novas e colocados em placas de petri contendo papel filtro com 5 uM de solução de dicloreto de N,N’-dimetil-4,4’-bipiridínio (paraquat) sob condições de luz de 150uE por 25 horas. Isto resultou no alvejamento da clorofila. As diferenças entre o mutante e os controles na extensão de alvejamento foram quantificadas por medição do teor de clorofila dos discos de folha. Um disco de folha foi também removido das folhas que não haviam sido expostas ao tratamento com paraquat e o teor ótimo da clorofila foi determinado. Estes discos foram também pesados. Os resultados mostraram que o mutante apresentava teor de clorofila total superior por área de superfície de folha (Tabela 5), contudo as folhas deste mutante são mais espessas (discos de folhas eram 15 a 24% mais pesados no mutante em comparação aos dos controles). O teor de clorofila por grama de tecido de folha fresca não foi, portanto, diferente. Não foram observadas diferença entre as razões de clorofila a para b entre o mutante e os controles. O mutante hwe116 mostrou resistência ao estresse oxidativo conforme indicado por teor de clorofila 5 a 7% maior seguindo-se o tratamento com paraquat (Tabela 5). A senescência da folha foi também retardada no mutante hwe116 (dados não mostrados).Tabela 5. Efeito de estresse oxidativo no teor de clorofila das folhas

O crescimento das sementeiras do mutante hwe116 mostrou menos inibição em meios contendo baixo teor de nitrogênio

[00158]Doze sementeiras cresceram em uma placa de ágar (6 placas por entrada) contendo meios de crescimento 1/2 MS com teor de nitrogênio ótimo (10 mM) ou baixo (0,3 mM). As placas foram colocadas em um recinto de crescimento com um período de luz de 18 horas (100uE) por 6 dias em uma posição vertical, então as placas foram colocadas horizontalmente e as sementeiras se desenvolveram por outros 4 dias antes dos brotos serem colhidos. O DW de broto de sementeira ponderado após 10 dias de crescimento foi calculado por placa. Os resultados são mostrados na Tabela 6. O DW de broto do mutante hwe116 desenvolvido sob condi-ções ótimas foi significativamente reduzido, porém quando se desenvolveu em baixo teor de nitrogênio não foram observadas diferenças. O DW do broto em baixo teor de nitrogênio no mutante foi 3 a 7% superior que nos controles quando comparado aos níveis ótimos de nitrogênio. Isto indica que o mutante pode apresentar melhor eficiência de uso do nitrogênio.Tabela 6. Efeito do nitrogênio no DW de broto de sementeiras

Mutante nocauteado de PK220 mostrou tendência tolerante a estiagem e eficiência melhorada do uso da água sob tratamento com estiagem

[00159]Linhagens de plantas obtidas no SALK Institute que foram nocautea- das no T-DNA no gene de AtPK220 (SALK 147838) foram desenvolvidas sob condi ções ótimas em uma câmara de crescimento (18 horas de luz, 150uE, 22°C, 60% de umidade relativa) até a primeira flor abrir (n=8 por entrada e por colheita). O trata-mento com estiagem começou aguando-se todas as plantas com a mesma quanti-dade de água e terminou com mais água adicional. Os potes foram pesados diaria-mente e as plantas foram colhidas para determinações de DW do broto nos dias 0, 2 e 4 do tratamento com estiagem. O resultado mostrou que a perda de água dos potes em 2 dias em relação ao DW do broto no dia 2 foi significativamente inferior (de 13%) para o mutante nocauteado e seu DW de broto foi também significativamente maior (de 24%) no dia 2 em comparação ao controle do tipo silvestre. Este resultado é consistente com o fenótipo tolerante a estiagem.

[00160]Os resultados mostraram que a eficiência do uso da água do mutante nocauteado foi maior que aquela do controle-WT como o mutante nocauteado foi capaz de acumular mais biomassa de broto nos 2 dias do tratamento enquanto usando a mesma quantidade de água como controle (Tabela 7);Tablela 7. Eficiência do uso da água sob tratamento com estiagem

Linhagens transgênicas do construto de 35S-HP-At(270)PK220 em Arabi- dopsis mostrou tolerância a estiagem

[00161]As plantas foram desenvolvidas (5 por pote de 7,62 cm e 8 potes por entrada por colheita) sob condições ótimas em uma câmara de crescimento (18 horas de luz, 150uE, 22°C, 60% de umidade relativa) até o primeiro dia de floração. O tratamento com estiagem começou aguando-se todos os potes com a mesma quan-tidade de água e cessação de irrigação adicional. Os potes foram pesados diaria-mente para determinações de perda de água e as plantas foram colhidas para de-terminação de biomassa do broto no dia 4 do tratamento com estiagem. Os resulta- dos (Tabela 8) mostraram que 11 das 13 linhagens transgênicas demonstraram um fenótipo tolerante a estiagem (possuindo uma perda de água menor nos 2 dias em relação a biomassa do broto no dia 4). Quatro destas linhagens mostraram um leve retardo no florescimento (1 dia) também como o mutante hwe116. A biomassa de broto final no dia 4 foi maior para a maioria das linhagens transgênicas em compara-ção ao WT (tipo silvestre) de controle. Estes resultados são indicativos de um fenóti- po tolerante a estiagem nas linhagens transgênicas infrarreguladas na expressão de PK220. Como exemplos, a redução no nível de expressão de AtPK220 para as três linhagens de desempenhos superiores: 65-4, 38-5 e 59-3, são 75%, 47% e 58%.Tabela 8. Tolerância a estiagem e DW de broto (dia 4) para linhagens trans- gênicas de 35S-HP-At(270)PK220 em relação ao tipo silvestre (WT) e o mutante hwe116 em reação ao controle de origem.

Tolerância a estiagem das linhagens transgênicas de 35S-HP-At(270)PK220 em Arabidopsis e eficiência melhorada do uso da água foram confirmadas

[00162]As linhagens transgênicas de 35S-HP-At(270)PK220 foram desen-volvidas com 5 por pote de 7,62 cm sob condições ótimas em uma câmara de cres-cimento (18 horas de luz, 150uE, 22°C, 60% de umidade relativa) até a primeira flo-ração (n = 8). O tratamento com estiagem foi iniciado em uma primeira flor aguando- se todos os potes com a mesma quantidade de água e cessação de irrigação adici-onal. Os potes foram pesados diariamente por 4 dias de tratamento com estiagem e as plantas foram colhidas nos dias 0, 2 e 4 de tratamento. Os resultados confirmaram que a perda de água em 2 dias em relação a biomassa do broto no dia 2 foi inferior em cinco linhagens transgênicas em relação aos controles, confirmando seu fenótipo tolerante a estiagem (Tabela 9). O DW do broto no dia 2 foi maior nas 5 das linhagens transgênicas.Tabela 9. Tolerância a estiagem e DW de broto para linhagens transgênicas de 35S-HP-At(27 0)PK220

[00163]A eficiência de uso da água foi maior que a dos controles durante 4 dias de tratamento com estiagem para três linhagens transgênicas e esta eficiência melhorada do uso da água se deveu a um acúmulo maior de DW do broto (Tabela 10).Tabela 10. Eficiência do uso da água entre 0 e 4 do tratamento com estia-gem em linhagens transgênicas de 35S-HP-At(270)PK220.

Linhagens transgênicas de 35S-HP-At(270)PK220 em Arabidopsis tiveram perda de água em relação a biomassa do broto e uma WUE melhorada sob condi-ções ótimas

[00164]Plantas de linhagens transgênicas de 35S-HP-At(270)PK220 65-7 e 59-5, WT Columbia, mutante hwe116 e as de origem foram desenvolvidas (5 por pote de 7,62 cm) sob condições ótimas em uma câmara de crescimento (22°C, 18 horas de luz - 200uE, 60% de umidade relativa) até a primeira flor (n = 8 por entrada, por colheita). Na primeira flor, todos os potes no grupo limitado de água foram aguados com a mesma quantidade de água (a um peso de pote de 120 g nos primeiros 4 dias e a 130 g pelos últimos 3 dias (conforme as plantas se desenvolviam mais elas necessitavam de mais água). Os potes foram pesados diariamente para determinar a perda de água diária e as plantas foram colhidas no dia 0 e no dia 7 deste tratamento. A eficiência do uso da água (WUE) foi calculada da razão de biomassa de broto acumulada para perda de água. Os resultados são mostrados na Tabela 11.Tabela 1. Eficiência do uso da água sob condições ótimas

[00165]Os resultados mostram que, sob condições ótimas de água as duas linhagens transgênicas e o mutante tiveram eficiência melhorada do uso da água.

Taxas de crescimento de transgênica 35S-HP-At(270)PK220 em Arabidopsis foram maiores que aquelas dos controles durante ambas condições ótimas e de água limitada

[00166]As plantas da linhagem transgênica 35S-HP-At(270)PK220 65-4 e WT Columbia foram desenvolvidas (5 por pote de 7,62 cm) sob condições ótimas em uma câmara de crescimento (22°C, 18 horas de luz - 150uE, 60% de umidade rela- tiva) até a primeira flor (n = 8 por entrada, por tratamento e por colheita). Na primeira flor, todos os potes no grupo limitado de água foram aguados com a mesma quanti-dade de água (a um peso de pote de 95 g), e a irrigação adicional foi parada por 2 dias. Foram necessários 2 dias para que o grupo de plantas de água limitada alcan-çasse cerca de 30% do teor de água do solo inicial (cerca de 55 g, peso total por pote), referido como pré-tratamento. Naquela época, o tratamento com água limitada foi iniciado (dia 0 do tratamento) e as plantas foram aguadas diariamente até um pe-so de pote total de 55 g por 3 dias, e até 65 g nos 4 dias seguintes (até dia 7 do tra-tamento). O grupo ótimo foi mantido sob condições ótimas por irrigação dos potes diariamente até 100 g do peso total do pote nos 2 dias de pré-tratamento, os primeiros 3 dias de tratamento e então até 130 g nos últimos 4 dias de tratamento (conforme as plantas cresceram elas precisaram de mais água). A perda de água diária dos potes foi medida para todas as plantas e as plantas em ambos os grupos foram colhidas nos dias 0, 1, 2, 3, 5 e 7 de tratamento para determinação de peso seco do broto. A perda de água em relação à biomassa do broto (fenótipo de tolerância a estiagem) foi calculada sobre os dois dias iniciais antes do início do tratamento, durante os primeiros 3 dias de tratamento e durante os últimos 4 dias de tratamento. Os resultados sob ambas condições de água ótima (Tabela 12) e água limitada (Tabela 13) são mostradas. A linhagem transgênica 65-4 perdeu menos água em relação à biomassa do broto que o WT (tipo silvestre) em ambas condições de água ótima e limitada. Sob condições de água limitadas, isto é consistente com o fenótipo de tolerância a estiagem melhorado.Tabela 12. Perda de água em g/DW de broto em g sob condições ótimasTabela 13. Perda de água em g/DW de broto em g e tolerância a estiagem(Como porcentagem de WT) sob condições de água limitada

[00167]As taxas de crescimento das plantas foram calculadas nos sete dias de ambos tratamentos. Os resultados mostraram que a linhagem transgênica 65-4 apresentou plantas maiores (até 24%) em relação ao tipo silvestre através de todo o tratamento sob ambas condições. A taxa de crescimento (peso seco do broto acu-mulado por dia nos 7 dias de tratamentos) foi ligeiramente maior que a linhagem transgênica sob ambas condições ótimas e de água limitada (63,3 e 21,3 mg bro- to/dia, respectivamente) que aquelas do controle WT (58,3 e 20,4 mg broto/dia, res-pectivamente).

A linhagem transgênica 35S-HP-At(270)PK220 de Arabidopsis e o mutante hwe116 se desenvolveram melhor sob condições limitadas de nitrogênio em relação aos controles

[00168]A linhagem transgênica 65-5 de 35S-HP-At(270)PK220, seu controle nulo segregado (nulo 65-1) e o tipo silvestre (WT) mais o mutante hwe116 e seu controle de origem foram analisados quanto as características de desenvolvimento da sementeira jovem sob condições de nitrogênio ótimas e limitadas. O teor do ni-trogênio se refere ao nitrogênio disponível para o crescimento das plantas, incluindo fontes de nitrato e amônio. As sementeiras se desenvolveram sobre placas de ágar (10 por placa e 5 placas por entrada e por tratamento) contanto tanto nutrientes óti-mos (incluindo 20 mM de nitrogênio) ou baixo teor de nitrogênio (limitante para o de-senvolvimento) (todos os nutrientes ótimos exceto nitrogênio sendo de 0,5 mM). As placas foram colocadas em uma câmara de crescimento com 18 horas de luz de 200 eu e 22°C. As sementeiras se desenvolveram por 14 dias antes de serem colhidas quanto a biomassa do broto (8 sementeiras) e determinações de clorofila (2 semen-teiras). Nas placas ótimas não foram detectadas diferenças na biomassa de broto média das sementeiras exceto para o mutante hwe116, conforme mostrado anteri- ormente apresentando DW de broto de sementeira ligeiramente menor (não signifi-cativo). Em nitrogênio baixo, o mutante hwe116 apresentou DW de broto de semen-teira significativamente maior e mostrou 30% menos inibição do crescimento quando comparado a sua origem. A linhagem transgênica 65-5 mostrou DW de broto ligei-ramente maior que os controles e era 5% a 7% menos inibida no crescimento que os controles (Tabela 14).Tabela 14. Efeito do nitrogênio no DW de broto de sementeira

[00169]O teor total de clorofila dos brotos de sementeiras desenvolvidos sob níveis baixos de N refletiu nos resultados DW do broto. O teor de clorofila está inti- mamente ligado ao N disponível e um dos maiores sintomas de deficiência de N nas plantas é a clorose da folha ou alvejamento. A Tabela 15 mostra que o teor da cloro-fila da linhagem transgênica 65-5 e do mutante hw116 foi menos reduzido que aque-le dos controles.Tabela 15. Efeitos do nitrogênio no teor total de clorofila do broto das semen-teiras

[00170]Estes resultados confirmaram que o mutante hwe116 se desenvolveu melhor em nitrogênio limitado e a linhagem transgênica mostrou a mesma tendência Portanto, a infrarregulação do gene PK220 nas plantas parece resultar em eficiência melhorada do uso do nitrogênio (acúmulo de mais biomassa por unidade de nitrogê-nio disponível).

A linhagem transgênica de 35S-HP-At(270)PK220 em Arabidopsis e o mu-tante hwe116 germinam mais rápido e possuem taxas maiores de germinação no frio

[00171]A germinação nas condições de frio (10°C) foi avaliada na linhagem transgênica 65-6 portando o construto 35S-HP-At(270)PK220 em relação ao controle de WT e aquela do mutante hwe116 em relação ao seu controle de origem em placas de ágar contendo meios ótimos de crescimento. Quatro placas por entrada com 30 sementes todas as foram preparadas e colocadas na câmara a 10°C, 18 horas de luz (200uE). A germinação (emergência do radícula) classificada como uma porcen-tagem das sementes viáveis, foi observada duas vezes ao dia por 5 dias começando no dia 5 a partir da colocação das sementes na placa (não houve germinação antes do dia 5). Uma vez que nenhuma alteração adicional foi observada na germinação, todas as placas foram colocadas em uma câmara a 22°C para verificar a viabilidade das sementes que não haviam germinado. Todas as entradas mostraram 98 a 100% de viabilidade da semente, o mutante hwe116 apresentou 94% de viabilidade. Os resultados da avaliação da germinação a 10°C (Tabela 16) indicam que a linhagem transgênica 65-5 germinou mais rápido que seu controle de WT. O mutante hwe116 apresentou taxas maiores de germinação no frio que seu controle de origem. Estes dados, em conjunto com a evidência de que o mutante cresce melhor sob condições frias são indicativos de um vigor maior da semente e da sementeira sob estresse por frio.T abela 16. Porcentagem de germinação de sementes viáveis a 10°C

Medições de troca de gás suportam WUE mais alta em 35S-HP- At(270)PK220 transgênica de Arabidopsis sob condições ótimas

[00172]Plantas de duas linhagens transgênicas e WT foram desenvolvidas em potes de 10,16 cm de diâmetro (uma por pote) sob condições ótimas em uma câmara de crescimento com 18 horas de luz (200uE), 22°C, 60% de umidade relativa. Oito dias do aparecimento da primeira flor aberta foram realizadas medições de troca de gás na folha mais jovem, completamente desenvolvida de 10 a 11 réplicas por entrada. As taxas de fotossíntese e transpiração foram medidas dentro da câmara de crescimento em condições de desenvolvimento de luz e temperatura ambientes e 400 ppm de dióxido de carbono usando Li-6400 e cubeta da folha de Arabi- dopsis. A eficiência de uso da água instantânea (WUE) foi calculada a partir da razão de fotossíntese para transpiração. Os resultados são mostrados na Tabela 17. A WUE nas linhagens transgênicas foi 11 e 18% maior que aquela do WT. Estes dados são consistentes com as medições de WUE por um período de alguns dias usando a razão de biomassa acumulada para perda de água na transpiração.Tabela 17. Fotossíntese (umol de dióxido de carbono/m2/s), transpiração (mmol H2O/m2/s) e QUE medidas sob condições , ótimas de desenvolvimento

A tolerância a estiagem de 35S-HP-At(270)PK220 transgênica em Arabi-dopsis resulta em rendimento de semente e proteção da biomassa seguindo-se es-tresse de estiagem

[00173]Plantas de duas linhagens transgênicas e o WT se desenvolveram (5 plantas por pote de 7,62 cm contendo quantidade igual de solo) sob condições óti-mas em uma câmara de crescimento (22°C, 18 horas de luz de 200uE, 60% de umi- dade relativa) até a primeira flor abrir. Na primeira flor o tratamento com estiagem foi aplicado à metade das plantas enquanto a outra metade foi mantida sob condições ótimas até a maturidade. O tratamento com estiagem consistiu na irrigação de todas as plantas ao mesmo nível de água saturada. As plantas foram então pesadas diari-amente para monitorar a perda de água dos potes e seu teor de água foi equalizado diariamente por irrigação de todos os potes ao nível do pote mais pesado. Como resultado, o teor de água do solo foi declinando e alcançou os níveis de estresse com plantas murchando no dia 4. As plantas foram mantidas naquele nível de es-tresse por mais 2 dias e no dia 6 todas as plantas foram aguadas novamente e man-tidas sob condições ótimas pelo restante de seu ciclo de vida. Na maturidade, ambas as plantas em condições ótimas e de estiagem foram colhidas para análise da semente e biomassa do broto. O impacto do estresse de estiagem em ambos rendi-mento de semente e biomassa de broto foi determinado por comparação das plantas tratadas na estiagem e ótimas. Os resultados são mostrados na Tabela 18. Sob condições ótimas o rendimento da semente e a biomassa de broto final das linha-gens transgênicas foi 7 a 10% maior em relação aquela do WT. Seguindo-se o es-tresse de estiagem durante a floração, a redução no rendimento da semente e a bi-omassa do broto não foram tão grandes nas plantas transgênicas como no WT, re-sultando em proteção do rendimento da semente de 5-7% e proteção da biomassa do broto de 4%. A proteção foi calculada como a diferença entre as transgênicas e WT no rendimento da semente ou biomassa do broto como porcentagem de ótimas.Tabela 18. Rendimento da semente e biomassa de broto final das plantas estressadas na estiagem e ótimas, n = 10

Superexpressão de AtPK220 do tipo silvestre em base de hwe116.2 pode restaurar fenótipo de WT

[00174]Plantas transgênicas de 35S-AtPK220 (em hwe116.2) se desenvol-veram (5 por pote de 7,62 cm) sob condições normais em uma câmara de cresci-mento conforme descrito acima, até a primeira flor abrir. O tratamento com estiagem foi aplicado por irrigação de todas as plantas ao mesmo nível saturado. Irrigação adicional foi interrompida. As plantas foram pesadas diariamente para determinar a perda de água diária e todas as plantas foram colhidas no quarto dia de tratamento quando então todas as plantas mostraram murcha. A perda de água em relação à biomassa final do broto foi empregada para calcular a tolerância a estiagem, onde aquela do WT foi presumida em 100%. Os dados são mostrados na Tabela 19. Três linhagens transgênicas mostraram uma redução na tolerância a estiagem a partir de níveis mutantes conforme indicado pela perda de água aumentada em relação à bi-omassa do broto. As três linhagens transgênicas também floresceram precocemente em relação à linhagem mutante e de modo semelhante à época em que as linhagens de WT floresceram. Estes resultados sustentam a conclusão de que a mutação gênica de AtPK220 em hwe116.2 é responsável pelos fenótipos alterados observa-dos e a expressão de um gene de WT restaura as características de WT de uma planta mutante.Tabela 19. Perda de água em relação à biomassa do broto e tolerância a estiagem, n = 8

Infrarregulação de AtPK220 com o promotor de AtPK220 (PpK) em Arabi- dopsis resulta em tolerância a estiagem melhorada das plantas

[00175]Plantas Arabidopsis de PPK-HP-At(270)PK220 se desenvolveram (5 por pote de 7,62 cm) sob condições ótimas em uma câmara de crescimento conforme descrito acima, até a primeira flor abrir. O tratamento com estiagem foi aplicado por irrigação de todas as plantas ao mesmo nível saturado. Irrigação adicional foi interrompida As plantas foram pesadas diariamente para determinar a perda de água diária e todas as plantas foram colhidas no quarto dia de tratamento (todas as plantas murcharam). A perda de água em relação à biomassa final do broto foi empregada para calcular a tolerância a estiagem, onde aquela do WT foi presumida em 100%. Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 20.Tabela 20. Perda de água em relação à biomassa do broto e tolerância a es-tiagem, n = 8

[00176]Uma das linhagens transgênicas, 14-04, mostrou tolerância a estia-gem significativamente maior em relação ao controle do tipo silvestre, conforme indi-cado pela perda de água menor em relação à biomassa do broto. Este resultado é sustentado pelos dados da linhagem 14-04 que mostraram inibição quase completa da expressão gênica de PK220. A expressão de AtPK220 foi reduzida em quase 96% nas raízes em comparação ao WT. Estes resultados indicam que a infrarregu- lação de PK220 nas raízes é suficiente para obter fenótipo de tolerância a estiagem significante e eficiência do uso da água presumivelmente melhorada.

A superexpressão de PK220 de Brassica napus no mutante hwe116 de Ara- bidopsis pode restaurar o fenótipo do WT

[00177]Plantas transgênicas de 35S-BnPK220 (em hwe116) mais dois con-troles nulos (segregaram parentes das linhagens transgênicas sem o transgene, por- tanto mutante hwe116) se desenvolveram (5 por pote de 7,62 cm) sob condições ótimas em uma câmara de crescimento conforme mencionado acima, até a primeira flor abrir. O tratamento com estiagem foi aplicado por irrigação de todas as plantas ao mesmo nível saturado. Irrigação adicional foi interrompida. As plantas foram pesadas diariamente para determinar a perda de água diária e todas as plantas foram colhidas no quarto dia de tratamento (todas as plantas murcharam. A perda de água em relação à biomassa final do broto foi empregada para calcular a tolerância a esti-agem, onde aquela do WT foi presumida em 100%. Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 21. Os resultados indicam que 6 linhagens tiveram uma redu-ção de 8% ou mais na tolerância a estiagem em comparação aos nulos (o background do mutante hwe116) e portanto a restauração em direção ao fenótipo do WT. Isto indica que BnPK220 é funcional e pode funcionar na Arabidopsis.Tabela 21. Perda de água em relação ao DW do broto e tolerância a estiagem, n = 8

Linhagens transgênicas de Brassica apresentando um construto de 35S- AtPK220L292F mostraram tolerância a estiagem e eficiência do uso da água maiores

[00178]A infrarregulação da atividade de PK220 endógeno foi demonstrada usando uma estratégia negativa dominante por expressão do alelo mutante do gene de AtPK220 em Brassica napus. Três linhagens transgênicas de Brassica napus possuindo gene mutante AtPK220L292F de Arabidopsis e uma linhagem de controle nulo (um parente segregado da linhagem transgênica faltando o transgene) por li-nhagem foram desenvolvidas em potes de 10,16 cm de diâmetro contendo quanti-dades iguais de mistura isenta de solo (Sunshine Professional Organic Mix #7) sob condições ótimas de 16 horas de luz (400 uE) e temperatura diurna de 22°C e notur-na de 18°C. No estágio da quarta folha, dois tratamentos foram aplicados. No trata-mento ótimo as plantas foram irrigadas até saturação e os potes foram cobertos com sacos plásticos para prevenir qualquer perda de água dos potes devido à evapora-ção. Estas plantas foram pesadas diariamente por 7 dias para determinar a perda de água dos potes devido à transpiração e a mesma quantidade de água foi adicionada de volta diariamente a cada pote para manter as plantas sob condições ótimas de água. No tratamento com estiagem todas as plantas foram irrigadas até níveis de saturação. Os potes foram cobertos com plástico e foram pesadas diariamente. Con-tudo estes potes foram irrigados diariamente ao nível dos potes mais pesados Este tratamento durou 7 dias com o teor da água do solo alcançando gradualmente os níveis de estresse. As plantas começaram a murchar por volta do dia 5. Ao final dos 7 dias ambos os grupos de plantas foram colhidos para determinação da biomassa do broto.

[00179]Medições de troca de gás foram realizadas nas plantas tratadas com estiagem de duas linhagens transgênicas mais seus nulos nos dias 3 e 4 do trata-mento. A fotossíntese e transpiração foram medidas na terceira folha sob condições de crescimento de estado firme de 400 uE de luz, 400 ppm de dióxido de carbono e 22°C usando Li-6400. A taxa de eficiência do uso da água (WUE) foi calculada partir da taxa de fotossíntese e transpiração. As plantas tratadas com estiagem foram usadas para calcular a tolerância à estiagem (como porcentagem de seus nulos). Isto foi realizado usando a taxa de perda de água por transpiração diária, cumulativa, entre os dias 3 e 7, em relação ao peso seco final do broto e sua normalização para os nulos (ajustado em 100%).

[00180]Os resultados da Tabela 22 indicam que as linhagens transgênicas tinham forte tendência a uma tolerância maior a estiagem. Isto foi um resultado da perda menor de água em relação ao peso seco do broto, um fenótipo presente tam-bém em condições ótimas.

[00181]Os dados de troca de gás (Tabela 23) mostraram que em ambos os dias 3 e 4 do tratamento com estiagem as plantas transgênicas apresentam WUE ligeiramente maior em relação aos controles (4 a 16%).

[00182]A eficiência do uso da água calculada da razão da fotossíntese para transpiração fornece apenas um ponto único de medição instantânea em relação à medição cumulativa no período de tratamento e como resultado pode ser de ampli-tude menor.

[00183]Concluindo, os dados com plantas transgênicas 35S-AtPK220L292F de Brassica indicam que a tecnologia de eficiência do uso da água é transferível pa-ra Brassica quando se emprega um gene AtPK220L292F de espécies heterólogas.Tabela 22. Perda de água entre os dias 3 e 7 em relação ao peso seco final do broto sob tratamento ótimo e com estiagem. Tolerância a estiagem (% de nulos apropriados), n = 8Tabela 23. Fotossíntese (μmol de dióxido de carbono/m2/s), Transpiração (mmol de H2O/m2/s) e WUE (Fotossíntese/Transpiração) nos dias 3 e 4 do tratamento com estiagem, n = 8 GRÁFICO DE REFERÊNCIA DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUENCIAS LITERATURA 1 .Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410. 2 .Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acid Res. 25: 3389-3402. 3 .An G, Mitra A, Choi HK, Costa MA, An K, Thornburg RW, Ryan CA. (1989) Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. Plant Cell 1: 115-122. 4 .Araus LJ, Slafer GA, Reynolds MP, Royo C (2002) Plant Breeding and drought in C3 cereals: What should we breed for? Annals of Botany 89: 925-940. 5 .Atanassvoa R, Chaubet N, Gigot C (1992) A 126 bp fragment of a plant histone gene promoter confers preferential expression in meristems of transgenic Arabidopsis. Plant Journal 2(3): 291-300. 6 .Beetham PR, Kipp PB, Sawycky XL, Arntzen CJ, May GD (1999) A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proceedings of the National Academy of Science USA, 96: 87748778. 7 .Bevan M, Barnes WM, Chilton MD (1983) Structure and transcription of the nopaline synthase gene region of T-DNA. Nucl. Acids Res. 12: 369-385. 8 .Bevan M, Barker R, Goldsbrough A, Jarvis M, Kavanagh T, Iturriaga G. (1986) The structure and transcription start site of a major potato tuber protein gene. Nucleic Acids Research 14: 4625-4636. 9 .Christensen AH, Sharrock RA, Quail PH. (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18: 675689. 10 .Condon AG, Richards RA, Rebetzke GJ, Farquhar GD (2002) Improving Intrinsic Water-Use Efficiency and crop yield. Crop Science 42:122-131. 11 .Davies WJ, Wilkinson S, Loveys BR (2002) Stomatal control by chemical signalling and the exploitation of this mechanism to increase water use efficiency in agriculture. New Phytol. 153: 449-460. 12 .De Loose M, Gheysen G, Tiré C, Gielen J, Villarroel R, Genetello C, Van Montagu M, Depicker A, Inzé D (1991) The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts. Gene 99: 95-100. 13 .Dong C, Beetham P, Vincent K, Sharp P (2006) Oligonucleotide-directed gene repair in wheat using a transient plasmid gene repair assay system. Plant Cell Reports 25: 457-465. 14 .Dratewka-Kos E, Rahman S, Grzelczak ZF, Kennedy TD, Murray RK, Lane BG (1989) Polypeptide structure of germin as deduced from cDNA sequencing. J. Biol. Chem. 264: 4896-4900. 15 .Elomaa P, Mehto M, Kotilainen M, Helariutta Y, Nevalainen L, Teeri TH (1998) A bHLH transcription factor mediates organ, region and flower type specific signals on dihydroflavonol-4-reductase (dfr) gene expression in the inflorescence of Gerbera hybrida (Asteraceae). The Plant Journal 16(1): 93-99. 16 .Farquhar GD and Sharky TD (1994) Photosynthesis and carbon assimilation (p187) in Physiology and Determination of Crop Yield, ASA, CSSA, SSSA, Madison Wisconsin USA. 17 .Fraley RT, Rogers SG, Horsch RB, Sanders PR, Flick JS, Adams SP, Bittner ML, Brand LA, Fink CL, Fry JS, Galluppi GR, Goldberg SB, Hoffmann NL, Woo SC (1983) Expression of bacterial genes in plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 80(15): 4803-4807. 18 .Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). 19 .Goldberg RB (1986) Regulation of plant gene expression. Philos Trans R Soc London Ser B 314: 343-353. 20 .Greene EA, Codomo CA, Taylor NE, HenikoffJG, Till BJ, Reynolds SH, Enns LC, Burtner C, Johnson JE, Odden AR, Comai L, Henikoff S (2003) Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Ara- bidopsis. Genetics 164(2):731-740. 21 .Gruber et al. "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick B. R. and Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pages 89-119. 22 .Hardie DG (1999) PLANT PROTEIN SERINE/THREONINE KINASES: Classification and Functions. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 50:97-131. 23 .Henikoff S, and HenikoffJG (1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919. 24 .Horsch R, Fry JE, Hoffmann N, Eichholtz D, Rogers S, Fraley RT (1985) A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227:12291231. 25 .Huang Y, Li H, Gupta R, Morris PC, Luan S, Kieber H. (2000) ATMPK4, an Arabidopsis homolog of mitogen-activated protein kinase, is activated in vitro by AtMEK1 through threonine phosphorylation. Plant Physiol. 122(4):1301-1310. 26 .Kado CI, Hooykaas PJ (1991) Molecular mechanisms of crown gall tumor- igenesis. Crit. Rev. Plant Sci. 10: 1-32. 27 .Karaba A, Dixit S, Greco R, Aharoni A, Trijatmiko KR, Marsch-Martinez N, Krishnan A, Nataraja KN, Udayakumar M, Pereira A (2007) Improvement of water use efficiency in rice by expression of HARDY, an Arabidopsis estiagem and salt tolerant gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 15270-15272. 28 .Keil M, Sanchez-Serrano J, Schell J, Willmitzer L (1986) Primary structure of a proteinase inhibitor II gene from potato (Solanum tuberosum). Nucl. Acids Res. 14: 5641-5650. 29 .Laemmli, UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227(259): 680-685. 30 .Last DI, Brettell RI, Chamberlain DA, Chaudhury AM, Larkin PJ, Marsh EL, Peacock WJ, Dennis ES (1991) pEmu: an improved promoter for gene expression in cereal cells Theor. Appl. Genet. 81 581-588. 31 .Lepetit M, Ehling M, Chaubet N, Gigot C (1992) A plant histone gene promoter can direct both replication-dependent and -independent gene expression in transgenic plants. Mol. Gen. Genet., 231: 276-285. 32 .Lund P, Dunsmuir P (1992) A plant signal sequence enhances the secretion of bacterial ChiA in transgenic tobacco. Plant Mol. Biol. 18: 47-53. 33 .McElroy D, Zhang W, Cao J, Wu R (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell 2(2): 163-171. 34 .Mian MAR, Bailey MA, Ashley DA, Wells R, Carter TE Jr, Parrott WA, Boerma HR (1996) Molecular markers associated with water use efficiency and leaf ash in soybean. Crop Sci. 36: 1252-1257. 35 .Martin B, Nienhuis J, King G, Schaefer A (1989) Restriction Fragment Length Polymorphisms Associated with Water Use Efficiency in Tomato. Science. 243(4899): 1725-1728. 36 .Masle J, Gilmore SR, Farquhar GD (2005) The ERECTA gene regulates plant transpiration efficiency in Arabidopsis. Nature 436: 866-870 37 .Matsuoka K, Nakamura K (1991) Propeptide of a precursor to a plant vacuolar protein required for vacuolar targeting. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 834838. 38 .Van der Meer IM, Spelt CE, Mol JN, Stuitje AR (1990) Promoter analysis of the chalcone synthase (chsA) gene of Petunia hybrida: a 67 bp promoter region directs flower-specific expression. Plant Molecular Biology 15(1): 95-109. 39 .Mogen BD, MacDonald MH, Graybosch R, Hunt AG (1990) Upstream se-quences other than AAUAAA are required for efficient messenger RNA 3'-end formation in plants. Plant Cell 2: 1261-1272. 40 .Moloney MM, Walker JM, Sharma KK (1989) High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Cell Reports 8: 238242. 41 .Needleman SB, Wunsch CD (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 48: 443-453. 42 .Odell JT, Nagy F, Chua NH (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313: 810-812. 43 .Oleykowski CA, Bronson Mullins CR, Godwin AK, Yeung AT (1998) Mutation detection using a novel plant endonuclease. Nucleic Acids Res. 26(20): 4597-4602. 44 .Sanford JC, Smith FD, Russell JA (1993) Optimizing the biolistic process for different biological applications. Methods Enzymol. 217: 483-509. 45 .Klein TM, Arentzen R, Lewis PA, Fitzpatrick-McElligott S (1992) Trans-formation of microbes, plants and animals by particle bombardment. Biotechnology 10: 286-291. 46 .Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 47 .Sinclair TR (1994) Limits to crop yield. in Physiology and Determination of Crop Yield, ASA, CSSA, SSSA, Madison Wisconsin USA. 48 .Price AH, Cairns JE, Horton P, Jones HG, Griffiths H (2002) Linking esti- agem-resistance mechanisms to estiagem avoidance in upland rice using a QTL ap-proach: progress and new opportunities to integrate stomatal and mesophyll re sponses. Journal of Experimental Botany 53: 989-1004. 49 .Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D (2006) Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis. Plant Cell 18(5): 11211133. 50 .Shiu SH, Bleecker AB (2001) Receptor-like kinases from Arabidopsis form a monophyletic gene family related to animal receptor kinases. Proc Nall Acad Sci U S A. 98(19): 10763-10768. 51 .Stockinger EJ, Mulinix CA, Long CM, Brettin TS, Iezzoni AF (1996) A linkage map of sweet cherry based on RAPD analysis of a microspore-derived callus culture population. J. Heredity 87: 214-218. 52 .Thumma BR, Naidu BP, Chandra A, Cameron DF, Bahnisch LM, Liu C (2001) Identification of causal relationship among traits related to estiagem resistance in Stylosanthes scabra using QTL analysis. Journal of Experimental Botany 52: 203-214. 53 .Torii KU, Mitsukawa N, Oosumi T, Matsuura Y, Yokoyama R, Whittier RF, Komeda Y (1996) The Arabidopsis ERECTA gene encodes a putative receptor protein kinase with extracellular leucine-rich repeats. Plant Cell. 8(4): 735-746. 54 .Velten J, Velten L, Hain R, Schell J (1984) Isolation of a dual plant promoter fragment from the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J. 3: 27232730. 55 .Verwoert II, Linden KH, Nijkamp HJ, Stuitje AR (1994) Developmental specific expression and organelle targeting of the Escherichia coli fabD gene, encoding malonyl coenzyme A-acyl carrier protein transacylase in transgenic rape and tobacco seeds. Plant Mol. Biol. 26: 189-202. 56 .Visser RG, Stolte A, Jacobsen E (1991) Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants. Plant Molecular Biology 17: 691-699. 57 .Walling LL, Chang YC, Demmin DS, Holzer FM (1988) Isolation, charac-terization and evolutionary relatedness of three members from the soybean multigene family encoding chlorophyll a/b binding proteins. Nucl. Acids Res. 16: 1047710492. 58 .Weissbach A and Weissbach H Eds. (1988) Methods for plant molecular biology. Academic Press (San Diego). 59 .Wilkins TA, Bednarek SY, Raikhel NV (1990) Role of propeptide glycan in post-translational processing and transport of barley lectin to vacuoles in transgenic tobacco. Plant Cell 2: 301-313. 60 .Yang B, Wen X, Kodali NS, Oleykowski CA, Miller CG, Kulinski J, Besack D, Yeung JA, Kowalski D, Yeung AT (2000) Purification, cloning, and characterization of the CEL I nuclease. Biochemistry. 39(13): 3533-3541.

Claims (6)

1. Método para produzir uma planta transgênica CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) transformação de uma planta, uma cultura de tecido de planta ou uma cé-lula de planta com um vetor compreendendo um construto de ácido nucléico que inibe a expressão ou atividade de um gene PK220 para obter uma planta, cultura de tecido ou uma célula de planta com expressão ou atividade de PK220 diminuída; e (ii) crescimento da dita planta ou regeneração de uma planta a partir da dita cultura de tecido de planta ou célula de planta, em que uma planta possuindo efici-ência melhorada do uso da água é produzida, em que: o dito construto de ácido nucléico compreende (a) uma sequência antisenso de um ácido nucléico que codifica o dito gene PK220, em que o dito gene PK220 é codificado por um ácido nucléico selecionado a partir das SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 11, 12, 13, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 153, 161 e 193, ou (b) uma sequência que codifica um gene PK220 mutado selecionado a partir das SEQ ID NOs: 3 e 5.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito construto de ácido nucléico compreende uma sequência antisenso de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PK220.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito construto de ácido nucléico compreende um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor específico de tecido.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito promotor específico de tecido é um promotor de raiz.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita sequência antisenso é SEQ ID NO: 149.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína codificada pelo dito gene PK220 possui atividade de quinase seri- na/treonina.