BRPI0903009B1

BRPI0903009B1 - CAROTENOID LIPID VESICULES, COMPOSITION, CAROTENOID LIPID VESICULES PREPARATION PROCESS AND USE OF CAROTENOID LIPID VESICULES

Info

Publication number: BRPI0903009B1
Application number: BRPI0903009-3A
Authority: BR
Inventors: Terezinha De Jesus Andreoli Pinto; Irene Satiko Kikuchi; Míriam Cristina Sakuragui Matuo; Telma Mary Kaneko; Rafael Teruiti De Oliveira Takamoto
Original assignee: Universidade De São Paulo - Usp
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2019-09-17
Also published as: BRPI0903009A2; BRPI0903009B8

Abstract

vesículas lipídicas de carotenoídes, composição, processo de preparação de vesículas lipidicas de carotenoídes e uso de vesículas lipídicas de carotenoídes. a presente invenção aplica-se nas áreas farmacêutica, cosmética, veterinária, biotecnológica, odontológica, médica, oncológica, radiofarmacêutica, agronômica, de terapia gênica, alimentícia, referindo-se à constituição de vesículas lipídicas de carotenóides em que ditos carotenóides representam a maior proporção molar da constituição da bicamada vesicular, bem como uma composição contendo ditas vesiculas lipidicas de carotenóides, processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides e uso.carotenoid lipid vesicles, composition, process for preparing carotenoid lipid vesicles and use of carotenoid lipid vesicles. The present invention is applicable in the pharmaceutical, cosmetic, veterinary, biotechnological, dental, medical, oncological, radiopharmaceutical, agronomic, gene therapy and food fields, referring to the constitution of carotenoid lipid vesicles in which said carotenoids represent the largest proportion. molar composition of the vesicular bilayer as well as a composition containing said carotenoid lipid vesicles, process for preparing carotenoid lipid vesicles and use.

Description

VESÍCULAS LIPÍDICAS DE CAROTENOIDES, COMPOSIÇÃO, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE VESÍCULAS LIPÍDICAS DE CAROTENOIDES E USO DE VESÍCULAS LIPÍDICAS DE CAROTENOIDES [001] A presente invenção aplica-se nas áreas farmacêutica, cosmética, veterinária, biotecnológica, odontológica, médica, oncológica, radiofarmacêutica, agronômica, de terapia gênica, alimentícia, referindo-se à constituição de vesículas lipídicas de carotenoides em que ditos carotenoides representam a maior proporção molar da constituição da bicamada vesicular.CAROTENOID LIPID VESICLES, COMPOSITION, CAROTENOID LIPID VESICULES PREPARATION AND CAROTENOID LIPID VESICLES [001] This invention applies in the pharmaceutical, cosmetic, veterinary, oncological, oncology, dentistry, oncology, oncology, oncology, oncology, oncology, oncology, oncology, oncology, oncology, oncology , of gene therapy, food, referring to the constitution of lipid vesicles of carotenoids in which said carotenoids represent the largest molar proportion of the constitution of the vesicular bilayer.

ESTADO DA TÉCNICA [002] Lipossomos são estruturas esféricas compostas de bicamadas concêntricas simples ou múltiplas, resultantes da auto-associação de moléculas anfifílicas, tais como fosfolipídios, em um meio aquoso. Os grupos da cabeça polar são localizados na superfície das membranas, em contato com o meio, enquanto as cadeias de ácido graxo formam o centro hidrofóbico das membranas, protegido da água. Estas vesículas têm parte da fase aquosa no seu interior e, consequentemente podem capturar e segregar moléculas polares; além disso, por causa das propriedades físico-químicas de seus constituintes, podem também dissolver moléculas hidrofóbicas em suas bicamadas. Lipossomos podem ser preparados com muitos tamanhos diferentes, variando de vesículas unilamelares pequenas (SUV - small unilamellar vesicles), cujo menor diâmetro pode ser de cerca de 20 nm, até vesículas unilamelares gigantes (GUV - giant unilamellar vesicles) com diâmetro de dezenas de micrômetros. Pertencendo à primeira geração de lipossomos, estão as vesículas multilamelares (MLV - multilamellar vesicles) com várias centenas de nanômetros em diâmetro (BANGHAM A.D., STANDISH M.M. WATKINS J.C. Diffusion of univalent ions across lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 13(1): 238, 1965), e as mais recentes vesículas unilamelares grandes (LUV - large unilamellar vesicles), caracterizadas por volumes de captura alta, com diâmetro ajustável (100 ou 200 nm) e tamanho reduzido por extrusão através de membranas específicas (SCHUBER F., KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: from membrane models to gene therapy. Pure & Appl. Chem. 70 (1): 89-96, 1998.).STATE OF THE TECHNIQUE [002] Liposomes are spherical structures composed of single or multiple concentric bilayers, resulting from the self-association of amphiphilic molecules, such as phospholipids, in an aqueous medium. The polar head groups are located on the membrane surface, in contact with the medium, while the fatty acid chains form the hydrophobic center of the membranes, protected from water. These vesicles have part of the aqueous phase inside and, consequently, they can capture and secrete polar molecules; in addition, because of the physicochemical properties of their constituents, they can also dissolve hydrophobic molecules in their bilayers. Liposomes can be prepared in many different sizes, ranging from small unilamellar vesicles (SUV - small unilamellar vesicles), whose smallest diameter can be around 20 nm, to giant unilamellar vesicles (GUV - giant unilamellar vesicles) with a diameter of dozens of micrometers . Belonging to the first generation of liposomes, there are multilamellar vesicles (MLV - multilamellar vesicles) with several hundred nanometers in diameter (BANGHAM AD, STANDISH MM WATKINS JC Diffusion of univalent ions across lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 13 ( 1): 238, 1965), and the most recent large unilamellar vesicles (LUV - large unilamellar vesicles), characterized by high capture volumes, with adjustable diameter (100 or 200 nm) and reduced size by extrusion through specific membranes (SCHUBER F., KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: from membrane models to gene therapy. Pure & Appl. Chem. 70 (1): 89-96, 1998.).

[003] Em essência, os lipossomos são estruturas altamente versáteis cujas propriedades podem ser moduladas por mudança nos parâmetros tais como tamanho, lamelaridade, composição das bicamadas, cargas e propriedades de superfície. A química dos (fosfo) lipídios, que são os constituintes de lipossomos, permite planejar análogos com novas propriedades e derivados a serem ligados à superfície das vesículas.[003] In essence, liposomes are highly versatile structures whose properties can be modulated by changing parameters such as size, lamellarity, composition of the bilayers, charges and surface properties. The chemistry of (phospho) lipids, which are the constituents of liposomes, allows to plan analogues with new properties and derivatives to be attached to the surface of the vesicles.

Lipossomos têm atraído um enorme interesse:Liposomes have attracted enormous interest:

Petição 870190072735, de 29/07/2019, pág. 7/32Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 7/32

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i) Na pesquisa básica (Química e Biologia) como modelos de membrana, mas também oferecem atraentes possibilidades para confinamento de reações químicas em volumes muito pequenos, ii) Como veículos para transporte de drogas e, recentemente, para transporte de genes, iii) Em biotecnologia, indústria farmacêutica (desenvolvimento de formulações antitumorais e vacinas baseadas em lipossomo) e em cosméticos (SCHUBER F., KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: from membrane models to gene therapy. Pure & Appl. Chem. 70 (1): 89-96, 1998).i) In basic research (Chemistry and Biology) as membrane models, but also offer attractive possibilities for confining chemical reactions in very small volumes, ii) As vehicles for drug transport and, recently, for gene transport, iii) In biotechnology, pharmaceutical industry (development of antitumor formulations and liposome-based vaccines) and cosmetics (SCHUBER F., KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: from membrane models to gene therapy. Pure & Appl. Chem. 70 (1): 89-96, 1998).

[004] Os lipossomos podem ser planejados racionalmente, resultando em lipossomos não reativos (estericamente estabilizados) (SLs), bem como lipossomos polimórficos (catiônicos fusogênicos). Os SLs podem ser planejados para exibir reatividade específica (direcionamento), enquanto lipossomos polimórficos podem exibir alta reatividade a ácidos nucléicos e membranas celulares. Devido a seu reduzido reconhecimento e ataque pelo sistema imunológico, estes lipossomos podem ter utilidade em quimioterapia de câncer. Os lipossomos polimórficos são promissores em terapia gênica devido à possibilidade da transfecção de DNA. Em paralelo, liberação mais eficiente e retenção de drogas dentro de lipossomos (baseado em acúmulo ativo através de gradientes iônicos) têm contribuído para utilização desta nova geração de lipossomos (LASIC D.D., PAPAHADJOPOULOS D. Liposomes revisited. Science. 267: 1275-1276, 1995).[004] Liposomes can be rationally planned, resulting in non-reactive (sterically stabilized) liposomes (SLs), as well as polymorphic liposomes (fusogenic cationics). SLs can be designed to exhibit specific reactivity (targeting), while polymorphic liposomes can exhibit high reactivity to nucleic acids and cell membranes. Due to their reduced recognition and attack by the immune system, these liposomes may be useful in cancer chemotherapy. Polymorphic liposomes are promising in gene therapy due to the possibility of DNA transfection. In parallel, more efficient release and drug retention within liposomes (based on active accumulation through ionic gradients) have contributed to the use of this new generation of liposomes (LASIC DD, PAPAHADJOPOULOS D. Liposomes revisited. Science. 267: 1275-1276, 1995).

[005] Lipossomos estericamente estabilizados foram criados quando se soube que estabilização mecânica ou eletrostática não poderia formar lipossomos com suficiente estabilidade em um ambiente biológico como a circulação sistêmica. Por isso, em SLs, a bicamada lipídica contém glicolipídios ou mais recentemente, lipídios conjugados com etilenoglicol que forma uma barreira estérica externa à membrana. SLs matem-se no sangue até 100 vezes mais tempo que lipossomos convencionais e podem, por isso, aumentar a eficácia farmacológica dos agentes encapsulados. Além disso, SLs permitem direcionar lipossomos para células específicas através de ligante, porque são muito menos susceptíveis a ataque não específico que os convencionais. SLs ligados a anticorpos ou outros ligantes são acumulados muito mais prontamente em células alvo que os lipossomos convencionais (LASIC D.D., PAPAHADJOPOULOS D. Liposomes revisited. Science. 267: 1275-1276, 1995).[005] Sterically stabilized liposomes were created when it was known that mechanical or electrostatic stabilization could not form liposomes with sufficient stability in a biological environment such as systemic circulation. Therefore, in SLs, the lipid bilayer contains glycolipids or, more recently, lipids conjugated to ethylene glycol which forms a steric barrier external to the membrane. SLs kill in the blood up to 100 times longer than conventional liposomes and can therefore increase the pharmacological effectiveness of encapsulated agents. In addition, SLs allow liposomes to be targeted to specific cells via ligand, because they are much less susceptible to non-specific attack than conventional ones. SLs linked to antibodies or other ligands are accumulated much more readily in target cells than conventional liposomes (LASIC D.D., PAPAHADJOPOULOS D. Liposomes revisited. Science. 267: 1275-1276, 1995).

[006] Existem técnicas que provocam profundas mudanças no comportamento farmacocinético das SLs (lipossomos não reativos, mas estericamente estabilizados). A meia vida dos lipossomos convencionais no sangue, após injeção intravenosa, por exemplo, pode variar entre 2 horas e mais de 40 horas em humanos. Foram descobertos[006] There are techniques that cause profound changes in the pharmacokinetic behavior of SLs (non-reactive but sterically stabilized liposomes). The half-life of conventional liposomes in the blood, after intravenous injection, for example, can vary between 2 hours and more than 40 hours in humans. Were discovered

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3/21 lipossomos de circulação longa que são capturados mais lentamente por fígado e baço, sendo direcionados passivamente para sítios tumorais, aumentando a “biodisponibilidade” de drogas antitumorais. Por exemplo, em certos tumores foram encontrados níveis de lipossomos 25 vezes mais altos mesmo após vários dias da injeção. Outra consequência deste fenômeno é o uso de SL para imagens (SCHUBER F., KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: from membrane models to gene therapy. Pure & Appl. Chem. 70(1):89-96, 1998).3/21 long-circulating liposomes that are captured more slowly by the liver and spleen, being passively directed to tumor sites, increasing the “bioavailability” of antitumor drugs. For example, in certain tumors, liposome levels were found 25 times higher even after several days of injection. Another consequence of this phenomenon is the use of SL for images (SCHUBER F., KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: from membrane models to gene therapy. Pure & Appl. Chem. 70 (1): 89-96 , 1998).

[007] O tumor sólido de carcinoma de cólon C26 em camundongos é praticamente insensível a tratamentos com doxorrubicina livre ou incorporada em lipossomos convencionais. Contudo, a administração de SLs contendo doxorrubicina (SL-Dox) resultou em completa remissão de tumores em tratamentos precoces e em melhorias significativas em tratamentos tardios. Em um modelo de tumor de carcinoma mamário em camundongos, SL-Dox foi bem mais eficiente que lipossomos convencionais e reduziu a incidência de metástases. SL-Dox pôde deter o crescimento de células tumorais de pulmão humano em severa imunodeficiência combinada (SCID) de camundongos, enquanto doses equivalentes de doxorrubicina livres ou encapsuladas em lipossomos convencionais, não foram eficazes (LASIC D.D., PAPAHADJOPOULOS D. Liposomes revisited. Science. 267: 1275-1276, 1995).[007] The solid C26 colon carcinoma tumor in mice is practically insensitive to treatments with free doxorubicin or incorporated into conventional liposomes. However, administration of SLs containing doxorubicin (SL-Dox) resulted in complete remission of tumors in early treatments and significant improvements in late treatments. In a mouse mammary carcinoma tumor model, SL-Dox was much more efficient than conventional liposomes and reduced the incidence of metastases. SL-Dox was able to halt the growth of human lung tumor cells in severe combined immunodeficiency (SCID) of mice, while equivalent doses of free or encapsulated doxorubicin in conventional liposomes were not effective (LASIC DD, PAPAHADJOPOULOS D. Liposomes revisited. Science. 267: 1275-1276, 1995).

[008] Lipossomos de bicamada simples são geralmente preparados por um dos dois métodos de sonicação: um probe de alta energia é imerso diretamente numa dispersão aquosa de fosfolipídios ou pela dispersão de fosfolipídio em um frasco de vidro suspenso em um banho ultrassônico de baixa energia. Ambos os procedimentos produzem vesículas de cerca de 25 nm de diâmetro, consistindo de uma concha de bicamada fosfolipídica simples. Contudo, a técnica apresenta várias desvantagens como a sonicação em alta energia causar oxidação e degradação do fosfolipídio, embora possa ser minimizada por controle rigoroso, e também pode danificar moléculas do soluto a ser encapsulado. Outra desvantagem é a dificuldade em preparar grandes quantidades de lipossomos (BATZRI S., KORN E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochim. Biophys. Acta. 298: 1015-1019, 1973).[008] Single bilayer liposomes are generally prepared by one of two sonication methods: a high-energy probe is immersed directly in an aqueous dispersion of phospholipids or by dispersing phospholipid in a glass bottle suspended in a low-energy ultrasonic bath. Both procedures produce vesicles of about 25 nm in diameter, consisting of a simple phospholipid bilayer shell. However, the technique has several disadvantages such as high energy sonication causing oxidation and degradation of phospholipid, although it can be minimized by strict control, and can also damage molecules of the solute to be encapsulated. Another disadvantage is the difficulty in preparing large amounts of liposomes (BATZRI S., KORN E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochim. Biophys. Acta. 298: 1015-1019, 1973).

[009] Devido a estas limitações pelo preparo de lipossomos por sonicação, Batzri e[009] Due to these limitations due to the preparation of liposomes by sonication, Batzri and

Kom (BATZRI S., KORN E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication.Kom (BATZRI S., KORN E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication.

Biochim. Biophys. Acta. 298: 1015-1019, 1973) desenvolveram um dos mais simples métodos para obtenção de lipossomos que é o método chamado injeção etanólica. Esta técnica permite obter lipossomos com bicamada simples, não distinguíveis daqueles obtidos por sonicação. A suspensão diluída pode ser facilmente concentrada por ultrafiltração, não levando à degradação ou oxidação do fosfolipídio utilizado (BATZRI S.,Biochim. Biophys. Minutes. 298: 1015-1019, 1973) developed one of the simplest methods for obtaining liposomes, which is the method called ethanolic injection. This technique allows to obtain liposomes with simple bilayer, not distinguishable from those obtained by sonication. The diluted suspension can be easily concentrated by ultrafiltration, not leading to degradation or oxidation of the phospholipid used (BATZRI S.,

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KORN E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochim. Biophys. Acta. 298: 1015-1019, 1973).KORN E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochim. Biophys. Minutes. 298: 1015-1019, 1973).

[010] Quanto à encapsulação de drogas, compostos dissolvidos no mesmo etanol como o lipídio, são relativamente bem encapsulados, enquanto substâncias hidrofílicas apresentam baixa compartimentalização, como ocorreu com carboxifluoresceína no trabalho de Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993). Porém, estes mesmos autores relataram como vantagem da injeção etanólica, a possibilidade de encapsular tanto substâncias hidrofílicas como lipofílicas.[010] As for the encapsulation of drugs, compounds dissolved in the same ethanol as lipid, are relatively well encapsulated, while hydrophilic substances have low compartmentalization, as occurred with carboxyfluorescein in the work of Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanol injection method, Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993). However, these same authors reported as an advantage of ethanol injection, the possibility of encapsulating both hydrophilic and lipophilic substances.

[011] O peso molecular e raio das vesículas produzidas pelo método de injeção pode depender da velocidade de injeção, concentração de lipídio no tampão e no álcool, e o pH e osmolalidade do tampão. Kremer et al (KREMER VANDER ESKER M.W.J.,[011] The molecular weight and radius of the vesicles produced by the injection method may depend on the speed of injection, lipid concentration in the buffer and alcohol, and the pH and osmolality of the buffer. Kremer et al (KREMER VANDER ESKER M.W.J.,

PATHMAMANOHARAN C., WIERSEMA P.H. Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection method. Biochemistry. 16: 3032-3935, 1977) mostraram que a velocidade de injeção não influenciou o peso molecular ou o raio das partículas lipídicas.PATHMAMANOHARAN C., WIERSEMA P.H. Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection method. Biochemistry. 16: 3032-3935, 1977) showed that the injection speed did not influence the molecular weight or the radius of the lipid particles.

[012] Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) detectaram que a concentração de lipídios é o principal fator que influencia o tamanho das vesículas. Hauser (HAUSER H. Methods of preparation vesicles: assessment of their suitability for drug encapsulation. Trends Pharm. Sei. 3: 274-277, 1982) havia estabelecido que a injeção de soluções etanólicas de fosfolipídios originava vesículas do tipo SUV (com alguns agregados de SUV), com tamanho variando entre 30 e 60 nm. Porém, Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained bythe ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) obtiveram não apenas SUVs, mas também vesículas intermediárias e grandes, dependendo da concentração lipídica. Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) concluíram que, variando a concentração de lipídio, o método oferece a possibilidade de obter vesículas de bicamada simples de diferentes raios de maneira reprodutível e confiável.[012] Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) found that the concentration of lipids is the main factor that influences the size of the vesicles. Hauser (HAUSER H. Methods of preparation vesicles: assessment of their suitability for drug encapsulation. Trends Pharm. Sci. 3: 274-277, 1982) had established that the injection of ethanolic solutions of phospholipids gave rise to SUV-type vesicles (with some aggregates SUV), ranging in size from 30 to 60 nm. However, Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) obtained not only SUVs, but also large and intermediate vesicles, depending on the lipid concentration. Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) concluded that, by varying the lipid concentration, the method offers the possibility of obtaining simple bilayer vesicles of different radii in a reproducible and reliable way.

[013] Lipossomos foram propostos e demonstrados por Gregoriadis e colaboradores (GREGORIADIS G. Engineering liposomes for drug delivery: progress and problems.[013] Liposomes were proposed and demonstrated by Gregoriadis and collaborators (GREGORIADIS G. Engineering liposomes for drug delivery: progress and problems.

Trends in Biotechnology 13: 527-537, 1995) na década de 1970 por terem capacidade para carrear drogas e utilizaram enzimas, drogas anticâncer e antimicrobianos para tal.Trends in Biotechnology 13: 527-537, 1995) in the 1970s as they were able to carry drugs and used enzymes, anticancer and antimicrobial drugs to do so.

Muitos estudos têm sido desenvolvidos para sistemas de entrega de drogas devido à considerada natureza inócua dos componentes lipossomais (que são lipídios não tóxicos, não imunogênicos, biodegradáveis), e a versatilidade da estrutura do sistema.Many studies have been developed for drug delivery systems due to the considered innocuous nature of the liposomal components (which are non-toxic, non-immunogenic, biodegradable lipids), and the versatility of the system structure.

Petição 870190072735, de 29/07/2019, pág. 10/32Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 10/32

5/21 [014] Existem trabalhos que mostram que carotenoides podem ser carreados por sistemas lipossomais tradicionais para melhorar a própria permeabilidade das vesículas carreadoras (SOCACIU C., LAUSCH C., DIEHL H.A. Carotenoids in DPPC vesicles: membrane dynamics. Spectrochimica Acta Pari A 55: 2289-2297, 1999) como trabalhos demonstrando a utilização de carotenoides como ingredientes ativos com atividade antioxidante (SILVA C.R., ANTUNES L.M.G., BIANCHI M.L.P. Antioxidant action of bixin against cisplatin-induced chromosome aberrations and lipid peroxidation in rats. Pharmacological Research. 43(6): 561-566, 2001), efeito protetor contra radiação e elementos mutagênicos e indução de sistema citocromo P450 (De-Oliveira A.C.A.X., SILVA I.B., MANHÃES-ROCHA D.A., PAUMGARTEN F.J.R. Induction of liver monooxygenases byannatto and bixin in female rats. Braz. J. Med. Biol. Res. 36(1): 113118, 2003).5/21 [014] There are studies showing that carotenoids can be carried by traditional liposomal systems to improve the permeability of carrier vesicles (SOCACIU C., LAUSCH C., DIEHL HA Carotenoids in DPPC vesicles: membrane dynamics. Spectrochimica Acta Pari A 55: 2289-2297, 1999) as studies demonstrating the use of carotenoids as active ingredients with antioxidant activity (SILVA CR, ANTUNES LMG, BIANCHI MLP Antioxidant action of bixin against cisplatin-induced chromosome aberrations and lipid peroxidation in rats. Pharmacological Research. 43 (6): 561-566, 2001), protective effect against radiation and mutagenic elements and induction of cytochrome P450 system (De-Oliveira ACAX, SILVA IB, MORHÃES-ROCHA DA, PAUMGARTEN FJR Induction of liver monooxygenases byannatto and bixin in female rats Braz. J. Med. Biol. Res. 36 (1): 113118, 2003).

[015] Bixina (cis-bixina, CAS 6983-79-5) é o principal pigmento solúvel em óleo das sementes de Bixa orellana L. É um carotenoide desprovido de atividade de pró-vitamina A com dois grupos carboxílicos, um dos quais é o metiléster (Figura 1 A). A hidrólise deste grupo metil éster dá um ácido dicarboxílico correspondente, a norbixina (Figura 1 B), que é um pigmento do anato solúvel em soluções aquosas alcalinas. Os extratos de anato, bem como seus constituintes carotenoides principais bixina e norbixina, têm sido amplamente empregados como aditivos coloríficos em alimentos, drogas e cosméticos (De-Oliveira A.C.A.X., SILVA I.B., MANHÃES-ROCHA D.A., PAUMGARTEN F.J.R. Induction of liver monooxygenases by annatto and bixin in female rats. Braz. J. Med. Biol. Res. 36(1): 113-118, 2003). No norte e nordeste do Brasil é extensivamente utilizado como um condimento de alimentos, conhecido como ‘colorau’ ou ‘colorífico’ (De-Oliveira A.C.A.X., SILVA I.B., MANHÃES-ROCHA D.A., PAUMGARTEN F.J.R. Induction of liver monooxygenases byannatto and bixin in female rats. Braz. J. Med. Biol. Res. 36(1): 113118, 2003).[015] Bixin (cis-bixin, CAS 6983-79-5) is the main oil-soluble pigment in the seeds of Bixa orellana L. It is a carotenoid devoid of pro-vitamin A activity with two carboxylic groups, one of which is methylester (Figure 1 A). The hydrolysis of this methyl ester group gives a corresponding dicarboxylic acid, norbixin (Figure 1 B), which is an anate pigment soluble in alkaline aqueous solutions. Anato extracts, as well as their main carotenoid constituents, bixin and norbixin, have been widely used as color additives in food, drugs and cosmetics (De-Oliveira ACAX, SILVA IB, MANHÃES-ROCHA DA, PAUMGARTEN FJR Induction of liver monooxygenases by annatto and bixin in female rats. Braz. J. Med. Biol. Res. 36 (1): 113-118, 2003). In the north and northeast of Brazil it is extensively used as a food flavoring, known as' paprika 'or' colorific '' (De-Oliveira ACAX, SILVA IB, MANHÃES-ROCHA DA, PAUMGARTEN FJR Induction of liver monooxygenases byannatto and bixin in female rats Braz. J. Med. Biol. Res. 36 (1): 113118, 2003).

[016] As sementes de B. orellana têm sido utilizadas na medicina popular brasileira para preparar poções afrodisíacas bem como remédios para tratar febres, inflamações, doenças parasíticas e na Jamaica, remédios populares para tratar diabetes mellitus (PAUMGARTEN F.J.R., DE-CARVALHO R.R., ARAÚJO I.B., PINTO F.M., BORGES[016] B. orellana seeds have been used in Brazilian folk medicine to prepare aphrodisiac potions as well as remedies to treat fevers, inflammations, parasitic diseases and in Jamaica, folk remedies to treat diabetes mellitus (PAUMGARTEN FJR, DE-CARVALHO RR, ARAÚJO IB, PINTO FM, BORGES

0.0., SOUZA C.A.M., KURIYAMA S.N. Evaluation of the developmental toxicity of annatto in the rat. Food and Chemical Toxicology. 40: 1595-1601, 2002).0.0., SOUZA C.A.M., KURIYAMA S.N. Evaluation of the developmental toxicity of annatto in the rat. Food and Chemical Toxicology. 40: 1595-1601, 2002).

[017] Sabe-se que as folhas de B. orellana exibem um efeito inibitório contra Neissería gonorrhoea, e os extratos de folha, uma significativa atividade antimicrobiana contra linhagens padrões de bactérias Gram positivas incluindo Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis e Staphylococcus aureus. Um recente estudo de extratos voláteis[017] B. orellana leaves are known to exhibit an inhibitory effect against Neissería gonorrhoea, and leaf extracts, a significant antimicrobial activity against standard Gram positive bacteria strains including Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis and Staphylococcus aureus. A recent study of volatile extracts

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6/21 apresentou vários mono e sesquiterpenos (GALINDO-CUSPINERA V., WESTHOFF D.C., RANKIN S.A. Antimicrobial properties of commercial annatto extracts against selected pathogenic, lactic acid, and spoilage microorganisms. J. Food Protection. 66 (6): 1074-1078, 2003), e outros compostos solúveis em água (GALINDO-CUSPINERA V., RANKIN S.A. Bioautography and chemical characterization of antimicrobial compound(s) in commercial water-soluble annatto extracts. J. Agric. Food Chem. 53(7): 2524-2529, 2005) com atividades antimicrobianas. Contudo, não foram encontrados relatos de atividade antímicrobiana por compostos isolados de B. orellana devido à dificuldade em separar os componentes dos extratos.6/21 presented several mono and sesquiterpenes (GALINDO-CUSPINERA V., WESTHOFF DC, RANKIN SA Antimicrobial properties of commercial annatto extracts against selected pathogenic, lactic acid, and spoilage microorganisms. J. Food Protection. 66 (6): 1074-1078 , 2003), and other water-soluble compounds (GALINDO-CUSPINERA V., RANKIN SA Bioautography and chemical characterization of antimicrobial compound (s) in commercial water-soluble annatto extracts. J. Agric. Food Chem. 53 (7): 2524 -2529, 2005) with antimicrobial activities. However, there were no reports of antimicrobial activity by compounds isolated from B. orellana due to the difficulty in separating the components from the extracts.

[018] Os corantes obtidos do urucum (Bixa orellana L.) têm sido utilizados há muitos anos principalmente nas áreas cosmética e alimentícia. Os corantes são encontrados recobrindo a superfície externa das sementes de urucum e são constituídos na sua maioria (cerca de 80%) de α-bixina que é um monometilester do ácido carboxílico da anorbixina (FERREIRA V.L.P., TEIXEIRA NETO R.O., MOURA S.C.S.R., SILVA M.S. Cinética da degradação da cor de solução hidrossolúvel comercial de urucum, submetida a tratamentos térmicos. Ciênc. Tecnol. Aliment. 19(1):37-42, 1999).[018] The dyes obtained from annatto (Bixa orellana L.) have been used for many years mainly in the cosmetic and food areas. The dyes are found covering the external surface of annatto seeds and are mostly constituted (about 80%) of α-bixin which is an anhydrixin carboxylic acid monomethylester (FERREIRA VLP, TEIXEIRA NETO RO, MOURA SCSR, SILVA MS Color degradation kinetics of commercial water-soluble annatto solution, submitted to heat treatments. Ciênc. Tecnol. Aliment. 19 (1): 37-42, 1999).

[019] Vários países têm proibido o uso de um número de corantes alimentícios sintéticos e a maioria dos corantes naturais além da questão de aparência, têm importância na melhoria para a saúde, ocorrendo grande demanda por alimentos e suplementos contendo uma dose eficaz destes corantes (REDDY M.K., ALEXANDERLINDO R.L., NAIR M.G. Relative inhibition of lipid peroxidation, cyclooxygenase enzymes.and human tumor cell proliferation by natural food colors. J. Agric. Food Chem. 53: 9268-9273, 2005). Reddy et al (REDDY M.K., ALEXANDER-LINDO R.L., NAIR M.G. Relative inhibition of lipid peroxidation, cyclooxygenase enzymes,and human tumor cell proliferation by natural food colors. J. Agric. Food Chem. 53: 9268-9273, 2005) demonstraram que bixina em combinação com licopeno e β-caroteno não tiveram impacto esperado na melhoria da saúde, porém, a inibição da peroxidação lipídica, enzimas da ciclooxigenase e proliferação de células tumorais foi significativa.[019] Several countries have banned the use of a number of synthetic food dyes and most natural dyes, besides the appearance issue, are important in improving health, with great demand for foods and supplements containing an effective dose of these dyes ( REDDY MK, ALEXANDERLINDO RL, NAIR MG Relative inhibition of lipid peroxidation, cyclooxygenase enzymes.and human tumor cell proliferation by natural food colors. J. Agric. Food Chem. 53: 9268-9273, 2005). Reddy et al (REDDY MK, ALEXANDER-LINDO RL, NAIR MG Relative inhibition of lipid peroxidation, cyclooxygenase enzymes, and human tumor cell proliferation by natural food colors. J. Agric. Food Chem. 53: 9268-9273, 2005) demonstrated that bixin in combination with lycopene and β-carotene had no expected impact on improving health, however, inhibition of lipid peroxidation, cyclooxygenase enzymes and tumor cell proliferation was significant.

[020] A presente invenção tem como objetivo elucidar o baixo custo e a facilidade no processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenoides que tem como componente principal uma matéria prima de baixa toxicidade, mesmo em dosagens altas, que é bastante abundante no Brasil e de baixo custo. Com isso, o processo torna-se um incentivo para a indústria nacional aprimorar as técnicas de extração, purificação e preparação do composto como um insumo mais nobre para a indústria farmacêutica, além dos já aplicados para indústria cosmética e de alimentos.[020] The present invention aims to elucidate the low cost and ease in the process of preparing carotenoid lipid vesicles, whose main component is a raw material of low toxicity, even at high dosages, which is quite abundant in Brazil and low cost. With this, the process becomes an incentive for the national industry to improve the techniques of extraction, purification and preparation of the compound as a more noble input for the pharmaceutical industry, in addition to those already applied to the cosmetic and food industries.

DESCRIÇÃO RESUMIDASHORT DESCRIPTION

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7/21 [021] A presente invenção trata de vesículas lipídicas de carotenoides em que ditos carotenoides representam a maior proporção da constituição da bicamada vesicular. A invenção trata ainda de composição contendo ditas vesículas lipídicas de carotenoides, processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenoides e uso.7/21 [021] The present invention deals with carotenoid lipid vesicles in which said carotenoids represent the largest proportion of the constitution of the vesicular bilayer. The invention also deals with a composition containing said carotenoid lipid vesicles, process for preparing carotenoid lipid vesicles and use.

DESCRIÇÃO DETALHADA [022] A presente invenção trata de vesículas lipídicas de carotenoides em que ditos carotenoides representam a maior proporção da constituição da bicamada vesicular, sua composição, seu processo de preparação e uso.DETAILED DESCRIPTION [022] The present invention deals with carotenoid lipid vesicles in which said carotenoids represent the largest proportion of the constitution of the vesicular bilayer, its composition, its preparation and use process.

[023] De acordo com a invenção, os carotenoides utilizados nas vesículas lipídicas podem ser selecionados entre bixina, zeaxantina, luteína, criptoxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno, sendo preferencial mente bixina. Opcionalmente, ditas vesículas lipídicas podem ser constituídas de carotenoides isolados e únicos, misturas de carotenoides, outros lipídios (carotenoides ou não carotenoides), colesterol, sal de colesterol, fosfolipídios, glicolipídios, lipídios conjugados, outros ligantes.[023] According to the invention, the carotenoids used in lipid vesicles can be selected from bixin, zeaxanthin, lutein, cryptoxanthin, alpha-carotene, beta-carotene, being preferably bixin. Optionally, said lipid vesicles can consist of isolated and unique carotenoids, mixtures of carotenoids, other lipids (carotenoids or non-carotenoids), cholesterol, cholesterol salt, phospholipids, glycolipids, conjugated lipids, other ligands.

[024] A norbixina é um tipo de carotenoide que pode participar da composição estrutural da vesícula, e também possui uma ação farmacológica sozinha. A norbixina também forma emulsões devido à capacidade tensioativa. A vantagem é que a norbixina é solúvel em água e pode dispersar compostos insolúveis ou pouco solúveis em água quando adicionamos estes compostos diretamente na mistura de norbixina em água.[024] Norbixin is a type of carotenoid that can participate in the structural composition of the vesicle, and also has a pharmacological action alone. Norbixin also forms emulsions due to its surfactant capacity. The advantage is that norbixin is water-soluble and can disperse insoluble or sparingly water-soluble compounds when we add these compounds directly to the mixture of norbixin in water.

[025] Não há artigos ou patentes que apresentem vesículas preparadas com mais que 1% de carotenoides em relação à vesícula preparada, pois foram utilizadas como adjuvantes para melhorar estabilidade das vesículas. De acordo com a presente invenção, a vesícula é preparada a partir de carotenoides, opcionalmente, pode conter outro lipídio (carotenoide ou não-carotenoide), com função adjuvante ou para sítio dirigir para algum tecido específico do organismo. A vantagem da vesícula ser preparada a partir de carotenoides é que o custo e os efeitos adversos são muito baixos, e alguns lipídios são caríssimos, principalmente os sintéticos, como o N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,Ntrimetilamoniometilsulfato (DOTAP).[025] There are no articles or patents that present vesicles prepared with more than 1% of carotenoids in relation to the prepared vesicle, as they were used as adjuvants to improve vesicle stability. According to the present invention, the vesicle is prepared from carotenoids, optionally, it can contain another lipid (carotenoid or non-carotenoid), with adjuvant function or to direct to some specific tissue of the organism. The advantage of the vesicle being prepared from carotenoids is that the cost and adverse effects are very low, and some lipids are very expensive, especially synthetic ones, such as N- (1- (2,3-dioleoyloxy) propyl) -N , N, Ntrimethylamoniomethylsulfate (DOTAP).

[026] As vesículas lipídicas de carotenoides, segundo a presente invenção, apresentam carotenoides na concentração de 0,001 a 100 milimolares (mM), preferencialmente entre 0,01 a 10 mM, mais preferencial mente 0,01 a 1,0mM; e bixina também na concentração de 0,001 a 100 milimolares (mM), preferencialmente entre 0,01 a 10 mM, mais preferencialmente 0,01 a 1,0mM. Essas vesículas caracterizam-se por apresentarem-se sob a forma de lipossomos, podendo esses serem unilamelar ou multilamelar. Esse mesmo lipossomo é caracterizado por apresentar-se preferencialmente no tamanho entre 100 e 200 nm, mais preferencialmente 151,9 + 0,9[026] Carotenoid lipid vesicles, according to the present invention, present carotenoids in the concentration of 0.001 to 100 millimolar (mM), preferably between 0.01 to 10 mM, more preferably 0.01 to 1.0 mM; and bixin also at a concentration of 0.001 to 100 millimolar (mM), preferably between 0.01 to 10 mM, more preferably 0.01 to 1.0 mM. These vesicles are characterized by being in the form of liposomes, which can be unilamellar or multilamellar. This same liposome is characterized by being preferably in size between 100 and 200 nm, more preferably 151.9 + 0.9

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8/21 nm, podendo variar desde 20 nm a1500nm, conforme as condições de preparação como presença de eletrólitos, outras estruturas moleculares não eletrolíticas, velocidade de agitação, solventes utilizados, temperatura, concentração dos lipídios, etc.8/21 nm, ranging from 20 nm to 1500nm, depending on the preparation conditions such as the presence of electrolytes, other non-electrolytic molecular structures, agitation speed, solvents used, temperature, lipid concentration, etc.

[027] A estrutura molecular do carotenoide bixina (Figura 1 A) mostrou-se muito similar a alguns lipídios comumente utilizados para preparação de lipossomos, pois apresentam regiões com caráter polar e cadeia longa apoiar, por exemplo, o dioctadecildimetilamônio (DODA), N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,Ntrimetilamoniometilsulfato (DOTAP) . O composto não é solúvel em água, sendo muito difundida sua solubilização em solventes orgânicos. Seu caráter hidrofóbico apresenta vantagens para interagir com compostos com o mesmo caráter, sendo uma estrutura interessante para formar vesículas. A utilização de bixina como principal composto para preparar vesículas lipídicas nunca foi demonstrada talvez devido à dificuldade em solubilizar em solventes aquosos.[027] The molecular structure of the carotenoid bixin (Figure 1 A) was shown to be very similar to some lipids commonly used for the preparation of liposomes, as they have regions with polar character and long chain supporting, for example, dioctadecyldimethylammonium (DODA), N - (1- (2,3-dioleoyloxy) propyl) -N, N, Ntrimethylamoniomethylsulfate (DOTAP). The compound is not soluble in water, and its solubilization in organic solvents is very widespread. Its hydrophobic character has advantages for interacting with compounds with the same character, being an interesting structure to form vesicles. The use of bixin as the main compound to prepare lipid vesicles has never been demonstrated, perhaps due to the difficulty in solubilizing in aqueous solvents.

[028] O carotenoide bixina tem sido estudado sob aspecto toxicológico e não tem mostrado efeitos tóxicos, apresentando ser muito promissor como carreador de drogas também por esta característica. Paumgarten et al (PAUMGARTEN F.J.R., DECARVALHO R.R., ARAÚJO I.B., PINTO F.M., BORGES O.O., SOUZA C.A.M., KURIYAMA S.N. Evaluation of the developmental toxicity of annatto in the rat. Food and Chemical Toxicology. 40: 1595-1601, 2002) não detectaram nenhuma evidência de toxicidade tanto em ratas como em suas proles quando administraram uma quantidade de 500 mg ou mais de annato (28% de bixina)/kg de peso/ dia por via oral. Este valor (S 140 mg de bixina/kg de peso/dia) determinado em ratos é pelo menos 2153 vezes o consumo diário aceitável preconizado pela Organização Mundial da Saúde (0,065 mg de bixina/kg peso/dia) para humanos. Assim observa-se que o carotenoide, produto natural, compete em eficiência com formulações comerciais.[028] Carotenoid bixin has been studied from a toxicological point of view and has not shown toxic effects, showing great promise as a drug carrier also due to this characteristic. Paumgarten et al (PAUMGARTEN FJR, DECARVALHO RR, ARAÚJO IB, PINTO FM, BORGES OO, SOUZA CAM, KURIYAMA SN Evaluation of the developmental toxicity of annatto in the rat. Food and Chemical Toxicology. 40: 1595-1601, 2002) did not detect no evidence of toxicity in both rats and their offspring when they administered an amount of 500 mg or more of annate (28% bixin) / kg body weight / day orally. This value (S 140 mg bixin / kg body weight / day) determined in rats is at least 2153 times the acceptable daily consumption recommended by the World Health Organization (0.065 mg bixin / kg body weight / day) for humans. Thus it is observed that carotenoid, a natural product, competes in efficiency with commercial formulations.

[029] Porém, outro tipo de inovação encontrado, foi a interação de vesículas aniônicas, pois bixina resulta em vesículas com potencial de carga negativa e ainda tem potencial de interagir com células com membranas de carga negativa. Foi demonstrado que deve existir outro tipo de interação que é mais forte que a simples atração eletrostática, portanto, apesar de casos clássicos como relatado, por exemplo, por Campanhã et al (CAMPANHA M.T.N., MAMIZUKA E.M., CARMONA-RIBEIRO A.M. Interactions between cátionic liposomes and bactéria: the physical-chemistry of the bactericidal action. J. Lipid Res. 40: 1495-1500, 1999), em que vesículas catiônicas como os de DODAB, que interagem com membranas de bactérias com carga negativa por atração eletrostática, as vesículas de bixina têm potencial de carga negativa que também interagem com membranas de bactérias por outro tipo de interação, a chamada[029] However, another type of innovation found was the interaction of anionic vesicles, since bixin results in vesicles with negative charge potential and still has the potential to interact with cells with negative charge membranes. It has been shown that there must be another type of interaction that is stronger than simple electrostatic attraction, therefore, despite classic cases as reported, for example, by Campanhã et al (CAMPAIGN MTN, MAMIZUKA EM, CARMONA-RIBEIRO AM Interactions between cationic liposomes and bacterium: the physical-chemistry of the bactericidal action. J. Lipid Res. 40: 1495-1500, 1999), in which cationic vesicles such as those from DODAB, which interact with membranes of negatively charged bacteria by electrostatic attraction, the vesicles of bixin have a negative charge potential that also interact with bacterial membranes through another type of interaction, the so-called

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9/21 hidrofóbica e que já foi demonstrado em outros trabalhos (KIKUCHI I.S., CARMONARIBEIRO A.M. Interactions between DNA and cationic liposomes. J. Phys. Chem. B. 104: 2829-2835, 2000).9/21 hydrophobic and which has been demonstrated in other works (KIKUCHI I.S., CARMONARIBEIRO A.M. Interactions between DNA and cationic liposomes. J. Phys. Chem. B. 104: 2829-2835, 2000).

[030] A invenção aqui descrita atribuiu ao carotenoide bixina o papel principal de componente carreador enquanto no máximo, artigos apresentam seu papel como coadjuvantes. Hara et al (HARA Μ., YAMANO Y., SAKAI Y., KODAMA E., HOSHINO T., ITO Μ., MIYAKE J. Stabilization of liposomal membranes by carotenoids: zeaxanthin, zeaxanthinglucoside and thermozeaxanthin. Material Science and Engineering C. 28:274279, 2008) demonstraram estabilização de membranas lipossomais por outros carotenóides, a zeaxantina e seus derivados numa mistura com lipídios classicamente utilizados como dipalmitoil fostatidilcolina (DPPC), enquanto que na presente invenção, não foi utilizado qualquer tipo de lipídio ou outro componente com suposta função estabilizadora de membrana.[030] The invention described here attributed to the carotenoid bixin the main role of carrier component while, at most, articles present their role as adjuvants. Hara et al (HARA Μ., YAMANO Y., SAKAI Y., KODAMA E., HOSHINO T., ITO Μ., MIYAKE J. Stabilization of liposomal membranes by carotenoids: zeaxanthin, zeaxanthinglucoside and thermozeaxanthin. Material Science and Engineering C. 28: 274279, 2008) demonstrated stabilization of liposomal membranes by other carotenoids, zeaxanthin and its derivatives in a mixture with lipids classically used as dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), whereas in the present invention, no type of lipid or other component was used with supposed membrane stabilizing function.

[031] A aplicação de vesículas de bixina ou outros carotenóides está intimamente ligada à incorporação de componentes como os óleos essenciais em seu interior, bem como, à incorporação de outros adjuvantes de difícil dispersão nas formulações, como fármacos insolúveis em água como a anfotericina B e miconazol e outros de difícil manipulação como antineoplásicos, radiofármacos, hormônios, vacinas. Em todos os casos, são observados além do custo, a redução na dosagem aplicada ao paciente, uma vez que a entrega da droga ao sítio de ação deve ser mais eficiente, reduzindo também os possíveis efeitos colaterais inerentes ao fármaco carreado. Os carotenóides prestamse também ao efeito estético, dando coloração ou efeito de partículas dispersas nas formulações, conforme tamanho e concentrações a serem introduzidas nas formulações. A grande vantagem é que elementos como óleos essenciais podem permanecer mais tempo nas vesículas e ter efeito mais duradouro na formulação devido a este efeito “protetor”, de confinamento, dificultando evaporação dos compostos ativos.[031] The application of bixin vesicles or other carotenoids is closely linked to the incorporation of components such as essential oils inside, as well as the incorporation of other adjuvants that are difficult to disperse in the formulations, such as water-insoluble drugs such as amphotericin B and miconazole and others that are difficult to manipulate, such as antineoplastic agents, radiopharmaceuticals, hormones, vaccines. In all cases, in addition to the cost, the reduction in the dosage applied to the patient is observed, since the delivery of the drug to the site of action must be more efficient, also reducing the possible side effects inherent to the drug carried. Carotenoids also lend themselves to the aesthetic effect, giving color or dispersed particles effect in the formulations, according to the size and concentrations to be introduced in the formulations. The great advantage is that elements such as essential oils can remain in the vesicles longer and have a longer lasting effect on the formulation due to this “protective”, confinement effect, hindering evaporation of the active compounds.

[032] As vesículas de bixina também podem ser utilizadas em formulações “antienvelhecimento” como incorporar compostos considerados antioxidantes, protetores solares, etc., devido à molécula da bixina poder ser mais ávida por radicais livres e ser “atacada” antes que as substâncias incorporadas em seu interior sejam atingidas também, pois a molécula da presente invenção apresenta características que facilitam sua oxidação (duplas ligações) ou degradação (por radiação ultravioleta). O fato das interações hidrofóbicas serem mais intensas explica também o tipo de interação entre o fármaco anfotericina B, citado como preferencial quando carreado, e as moléculas de bixina, explicitando que não são apenas partículas positivas que possam interagir com[032] Bixin vesicles can also be used in "anti-aging" formulations such as incorporating compounds considered antioxidants, sunscreens, etc., because the bixin molecule may be more avid for free radicals and be "attacked" before the substances incorporated inside are also affected, because the molecule of the present invention has characteristics that facilitate its oxidation (double bonds) or degradation (by ultraviolet radiation). The fact that hydrophobic interactions are more intense also explains the type of interaction between the drug amphotericin B, cited as preferred when carried, and the bixin molecules, explaining that they are not just positive particles that can interact with

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10/21 membranas de carga negativa. Portanto, característica que poderia ser desvantajosa pode ser utilizada como uma vantagem em certas formulações.10/21 negatively charged membranes. Therefore, a feature that could be disadvantageous can be used as an advantage in certain formulations.

[033] Nas áreas médica e farmacêutica, as formulações de bixina e/ou norbixina (com fármacos incorporados) podem ser mobilizadas nas superfícies de equipos médicos.[033] In the medical and pharmaceutical fields, bixin and / or norbixin formulations (with incorporated drugs) can be mobilized on the surfaces of medical equipment.

[034] Dessa forma, de acordo com a presente invenção, as vesículas lipídicas de carotenoides apresentam três funções, uma função carreadora, na qual a vesícula atua como carreadora de componentes em seu interior, como por exemplo, óleos essenciais, corantes, fármacos, ácidos nucléicos, antineoplásicos, radiofármacos, vacinas, anticorpos, preferencial mente o fármaco anfotericina B, produzindo uma atividade de potencializar o efeito seja ele efeito químico, físico, biológico, farmacológico, etc, do componente carreado; uma função de princípio ativo, na qual a vesícula por si tem uma ação que produz uma atividade como atividade antimicrobiana, preferencialmente sobre bactérias Gram negativas e Gram positivas, antitumoral, antibiótica, antilipidêmica, antioxidante, antiinflamatória, antiglicemiante; e uma função carreadora e de princípio ativo concomitantemente. As três funções desempenhadas pelas vesículas são muito importantes, pois artigos citam tais atividades utilizando a bixina solubilizada em solventes apoiares e não na forma de vesículas.[034] Thus, according to the present invention, the carotenoid lipid vesicles have three functions, a carrier function, in which the vesicle acts as a carrier for components inside, such as, for example, essential oils, dyes, drugs, nucleic acids, antineoplastics, radiopharmaceuticals, vaccines, antibodies, preferably the amphotericin B drug, producing an activity to enhance the effect, be it chemical, physical, biological, pharmacological effect, etc., of the carrier component; an active principle function, in which the vesicle itself has an action that produces an activity such as antimicrobial activity, preferably on Gram negative and Gram positive bacteria, antitumor, antibiotic, antilipidemic, antioxidant, anti-inflammatory, anti-glycemic; and a carrier and active principle function concurrently. The three functions performed by vesicles are very important, as articles mention such activities using bixin solubilized in non-vesicle solvents and not in the form of vesicles.

[035] A presente invenção trata ainda de uma composição farmacêutica que emprega vesículas lipídicas de carotenoides como parte integrante dessa composição. As vesículas lipídicas de carotenoides são constituídas em maior proporção de carotenoides. Esses carotenoides são selecionados entre bixina, zeaxantina, luteína, criptoxantina, alfacaroteno, beta-caroteno, preferencial mente bixina. A composição emprega ainda conservante, fragrância, umectante, emoliente, espessante, outros ativos. Essa composição compreende a seguinte fórmula farmacêutica e as faixas preferenciais, de acordo com a invenção, que estão descritas abaixo na Tabela 1:[035] The present invention also deals with a pharmaceutical composition that employs carotenoid lipid vesicles as an integral part of that composition. Carotenoid lipid vesicles are made up of a greater proportion of carotenoids. These carotenoids are selected from bixin, zeaxanthin, lutein, cryptoxanthin, alpha carotene, beta-carotene, preferably bixin. The composition also uses preservative, fragrance, humectant, emollient, thickener, other assets. This composition comprises the following pharmaceutical formula and the preferred ranges, according to the invention, which are described below in Table 1:

Dispersão contendo Bixina lipossomal Dispersion containing liposomal Bixin 60% 60% Glicerina Glycerin 5% 5% Extratos aquosos vegetais Aqueous plant extracts 15% 15% Óleo de oliva Olive oil 14% 14% Estearato de glicerila Glyceryl stearate 4% 4% Carboximetilcelulose Carboxymethylcellulose 1,5% 1.5% Conservante Preservative 0,25% 0.25% Fragrância Fragrance 0,25% 0.25%

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11/2111/21

TABELA 1 [036] A presente invenção contempla ainda um processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenoides em que ditos carotenoides representam a maior proporção molar da constituição da bicamada vesicular. Esses carotenoides podem ser escolhidos entre bixina, zeaxantina, luteína, criptoxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno, etc., sendo preferencialmente bixina. As vesículas lipídicas de carotenoides podem se apresentar como estruturas unilamelares ou multilamelares.TABLE 1 [036] The present invention also contemplates a process of preparing lipid vesicles of carotenoids in which said carotenoids represent the largest molar proportion of the constitution of the vesicular bilayer. These carotenoids can be chosen from bixin, zeaxanthin, lutein, cryptoxanthin, alpha-carotene, beta-carotene, etc., being preferably bixin. Carotenoid lipid vesicles can present as unilamellar or multilamellar structures.

[037] Para o processo de preparação de estruturas vesiculares de bixina, foi explorada a sua solubilidade em etanol à temperatura ambiente e posterior adição à água, gota a gota, sob agitação por turbilhonamento ou com auxílio de barras magnéticas também à temperatura ambiente, permitindo estabilização das estruturas pelas interações das moléculas de água com porção polar das moléculas de bixina. A organização em formato de vesículas esféricas é devida também pelas interações hidrofóbicas entre as cadeias longas apoiares das moléculas da própria bixina.[037] For the process of preparing bixin vesicular structures, its solubility in ethanol was explored at room temperature and later added to water, drop by drop, under swirling agitation or with the aid of magnetic bars also at room temperature, allowing stabilization of structures by the interactions of water molecules with the polar portion of bixin molecules. The organization in the form of spherical vesicles is also due to the hydrophobic interactions between the long chains supporting the molecules of the bixin itself.

[038] O processo emprega também técnicas selecionadas entre sonicação, injeção de solvente orgânico, extrusão, solubilização em solventes apoiares com evaporação, dispersão da camada seca com outros solventes hidrossolúveis ou aquosos, mobilização dos carotenoides em superfícies de nano partículas, preferencialmente a técnica de injeção de solvente orgânico, além de outros métodos conhecidos na área de preparação de lipossomos.[038] The process also uses techniques selected from sonication, organic solvent injection, extrusion, solubilization in non-evaporating solvents, dispersion of the dry layer with other water-soluble or aqueous solvents, mobilization of carotenoids on nanoparticle surfaces, preferably the injection of organic solvent, in addition to other known methods in the area of liposome preparation.

[039] O processo básico de preparação das vesículas lipídicas apresenta as seguintes etapas:[039] The basic process of preparing lipid vesicles has the following steps:

a. solubilização do carotenoide em solvente orgânico;The. solubilization of carotenoid in organic solvent;

b. adição de solução obtida na etapa (a) em água, gota a gota, sob agitação;B. adding the solution obtained in step (a) in water, drop by drop, under stirring;

c. obtenção da vesícula lipídica de carotenoide.ç. obtaining the carotenoid lipid vesicle.

[040] Segundo a presente invenção, o processo mencionado acima pode conter ainda etapas intermediárias de acordo com a solubilidade dos componentes a serem carreados. Quando o componente a ser carreado for insolúvel em água, o processo de preparação das vesículas lipídicas apresenta as seguintes etapas:[040] According to the present invention, the process mentioned above may also contain intermediate steps according to the solubility of the components to be carried. When the component to be carried is insoluble in water, the process of preparing the lipid vesicles has the following steps:

b. solubilização em solvente orgânico de componentes insolúveis em água a serem carreados;B. solubilization in organic solvent of water-insoluble components to be carried;

c. mistura da solução obtida na etapa (a) com a solução obtida na etapa (b);ç. mixing the solution obtained in step (a) with the solution obtained in step (b);

d. adição da solução obtida na etapa (c) em água, gota a gota, sob agitação;d. adding the solution obtained in step (c) in water, drop by drop, with stirring;

Petição 870190072735, de 29/07/2019, pág. 17/32Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 17/32

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e. obtenção da vesícula lipídica de carotenoide.and. obtaining the carotenoid lipid vesicle.

[041] Quando o componente a ser carreado for solúvel em água, o processo de preparação das vesículas lipídicas apresenta as seguintes etapas:[041] When the component to be carried is soluble in water, the process of preparing the lipid vesicles has the following steps:

b. solubilização em água ou solvente aquoso de componentes solúveis em água a serem carreados;B. solubilization in water or aqueous solvent of water-soluble components to be carried;

c. mistura da solução obtida na etapa (a), gota a gota, à solução obtida na etapa (b), sob agitação;ç. mixing the solution obtained in step (a), drop by drop, with the solution obtained in step (b), with stirring;

d. obtenção da vesícula lipídica de carotenoide.d. obtaining the carotenoid lipid vesicle.

[042] Os componentes a serem carreados pela vesícula podem ser óleos essenciais, corantes, fármacos, ácidos nucléicos, anticorpos, antineoplásicos, radiofármacos, vacinas e adjuvantes, preferencialmente o fármaco anfotericina B.[042] The components to be carried by the vesicle may be essential oils, dyes, drugs, nucleic acids, antibodies, antineoplastics, radiopharmaceuticals, vaccines and adjuvants, preferably the amphotericin B drug.

[043] De acordo com os processos de preparação, o solvente orgânico utilizado foi selecionado entre clorofórmio, dimetilsulfóxido, éter, alcoóis como etanol e metanol, preferencialmente o etanol, na concentração preferencial de 20%. O etanol foi o solvente utilizado para o processo, pois além de ser um solvente barato, possui baixa toxicidade, e é facilmente eliminado da preparação por processo diálise ou evaporação.[043] According to the preparation processes, the organic solvent used was selected from chloroform, dimethyl sulfoxide, ether, alcohols such as ethanol and methanol, preferably ethanol, in the preferred concentration of 20%. Ethanol was the solvent used for the process, because in addition to being an inexpensive solvent, it has low toxicity, and is easily eliminated from the preparation by dialysis or evaporation.

[044] A preparação de bixina da presente invenção foi baseada na técnica de preparação de lipossomos a partir de injeção em soluções aquosas de preparações prévias de lipídios em solventes orgânicos. Todas as operações mencionadas no processo podem ser realizadas à temperatura ambiente e não necessitam que o carotenoide atinja o seu ponto de fusão, 198 °C, algo que seria necessário em preparações do tipo vortexação com subsequentes passagens por membranas filtrantes com nanoporos, o que encarecería o custo da preparação. Possíveis resquícios de etanol, utilizado na primeira solubilização de bixina, podem ser eliminados por diálise simples por membranas de celulose, utilizando água como meio coletor.[044] The bixin preparation of the present invention was based on the technique of preparing liposomes from injection into aqueous solutions of previous preparations of lipids in organic solvents. All operations mentioned in the process can be performed at room temperature and do not require the carotenoid to reach its melting point, 198 ° C, something that would be necessary in vortexing preparations with subsequent passages through nanopore filter membranes, which would be more expensive. the cost of preparation. Possible traces of ethanol, used in the first solubilization of bixin, can be eliminated by simple dialysis by cellulose membranes, using water as a collecting medium.

[045] Os processos de preparação das vesículas lipídicas de carotenoides e a incorporação de drogas podem ser realizados em ambiente com controle de contaminação. Opcionalmente, o produto final pode passar por processo de esterilização por meio de membranas filtrantes esterilizantes de acordo com o tamanho das vesículas formadas e de forma seletiva.[045] The processes for preparing the carotenoid lipid vesicles and the incorporation of drugs can be carried out in an environment with contamination control. Optionally, the final product can undergo a sterilization process by means of sterilizing filter membranes according to the size of the vesicles formed and selectively.

[046] A presente invenção trata também do uso de vesículas lipídicas de carotenoides nas áreas farmacêutica, cosmética, veterinária, biotecnológica, odontológica, oncológica, radiofarmacêutica, agronômica, de terapia gênica, alimentícia, como carreadora de óleos essenciais, corantes, fármacos, ácidos nucléicos, anticorpos antineoplásicos, radiofármacos, vacinas, e outros adjuvantes e uso “per si” como princípio ativo em[046] The present invention also deals with the use of carotenoid lipid vesicles in the pharmaceutical, cosmetic, veterinary, biotechnological, dental, oncological, radiopharmaceutical, agronomic, gene therapy, food areas, as carriers of essential oils, dyes, drugs, acids nucleic acids, antineoplastic antibodies, radiopharmaceuticals, vaccines, and other adjuvants and use “per se” as an active ingredient in

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13/21 composições farmacêuticas, veterinárias, cosméticas, biotecnológicas, odontológicas, médicas, oncológicas, radiofarmacêuticas, agronômicas, para terapias gênicas.13/21 pharmaceutical, veterinary, cosmetic, biotechnological, dental, medical, oncological, radiopharmaceutical, agronomic compositions for gene therapies.

[047] A seguir, exemplos para melhor ilustrar a invenção, contudo estes não possuem o intuito de restringir a invenção aqui descrita.[047] The following are examples to better illustrate the invention, however these are not intended to restrict the invention described here.

EXEMPLOS [048] O corante bixina obtido do urucum (Bixa orellana L.) foi utilizado para desenvolvimento de uma preparação lipossomal e a anfotericina B foi o fármaco modelo para incorporação neste sistema. Foram realizados ensaios in vitro para demonstrar eficácia deste novo sistema a partir de caroteno de origem natural, enquanto lipossomos tradicionais utilizam lipídios (não carotenoides) ora sintéticos ora naturais. Resultados mostraram eficácia na inibição de Candida albicans, bem como, desempenho melhor que produtos comerciais como Ambisome e Amphocil.EXAMPLES [048] The bixin dye obtained from the annatto (Bixa orellana L.) was used to develop a liposomal preparation and amphotericin B was the model drug for incorporation in this system. In vitro tests were carried out to demonstrate the effectiveness of this new system based on carotene of natural origin, while traditional liposomes use lipids (non-carotenoids), either synthetic or natural. Results showed efficacy in inhibiting Candida albicans, as well as, better performance than commercial products such as Ambisome and Amphocil.

1. Materiais e métodos [049] Matérias-primas de bixina, norbixina e anfotericina B foram obtidas do mercado e ensaios para determinação de pureza e teor também foram realizados. Demais reagentes utilizados foram todos de grau analítico. Ambisome® e Amphocil® foram obtidas do mercado. O microrganismo Candida albicans ATCC 10231 foi obtido da coleção do Instituto Adolfo Lutz. Meios de cultura Sabouraud Dextrose Agar e meio n° 19, foram da marca Difco. Todos os materiais foram esterilizados por autoclavação, calor seco ou filtração por membrana esterilizante.1. Materials and methods [049] Raw materials of bixin, norbixin and amphotericin B were obtained from the market and tests to determine purity and content were also carried out. All other reagents used were all analytical grade. Ambisome® and Amphocil® were obtained from the market. The microorganism Candida albicans ATCC 10231 was obtained from the collection of the Instituto Adolfo Lutz. Culture media Sabouraud Dextrose Agar and medium n ° 19, were from Difco brand. All materials were sterilized by autoclaving, dry heat or sterilizing membrane filtration.

Preparação de lipossomos de bixina [050] Quantidade suficiente de bixina foi pesada e solubilizada diretamente em etanol para preparar solução a 5 mM (BX-ETOH). Material foi filtrado por papel de filtro e adicionado, com agitação e gota a gota em água na proporção de 1:10 para obtenção de dispersão a 0,5 mM.Preparation of bixin liposomes [050] Sufficient amount of bixin was weighed and solubilized directly in ethanol to prepare a 5 mM solution (BX-ETOH). Material was filtered through filter paper and added, with agitation and drop by drop in water in the proportion of 1:10 to obtain dispersion at 0.5 mM.

Preparação de anfotericina B [051] Foi preparada solução estoque de anfotericina B pela solubilização direta em dimetilsulfóxido (DMSO), isto é, 10.000 pg de ingrediente ativo/mL (solução ANFODMSO) e seguida de diluição de 10 vezes em etanol (solução ANFO-ETOH).Preparation of amphotericin B [051] Amphotericin B stock solution was prepared by direct solubilization in dimethyl sulfoxide (DMSO), that is, 10,000 pg of active ingredient / mL (ANFODMSO solution) and followed by a 10-fold dilution in ethanol (ANFO- ETOH).

i) Preparo de dispersão em solução tampão B10 (fosfato) [052] Foram preparadas dispersões contendo 10 pg/mL e 20 pg/mL de anfotericina B em solução tampão n° 10, pela diluição da solução ANFO-ETOH diretamente em tampão. A solução tampão n° 10 corresponde à solução de fosfato de potássio 0,2 M, pH 10,5 e constante na The United States Pharmacopeia 32. United States Pharmacopeial Convention. Rockville, vol. 1,p. 88, 2009.i) Preparation of dispersion in buffer B10 (phosphate) [052] Dispersions containing 10 pg / mL and 20 pg / mL of amphotericin B in buffer No. 10 were prepared by diluting the ANFO-ETOH solution directly in buffer. Buffer solution No. 10 corresponds to the 0.2 M potassium phosphate solution, pH 10.5 and contained in The United States Pharmacopeia 32. United States Pharmacopeial Convention. Rockville, vol. 1, p. 88, 2009.

ii) Preparo de anfotericina lipossomalii) Preparation of liposomal amphotericin

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14/21 [053] Volumes adequados das soluções de ANFO-ETOH e BX-ETOH foram misturados para obtenção de preparações 10 vezes mais concentradas que a desejada. Desta, foram adicionados e sob agitação, gota a gota em água na proporção de 1:10. A partir desta última preparação, pode-se fazer diluições seriadas em água ou outro diluente aquoso sem perdas das características das estruturas obtidas.14/21 [053] Adequate volumes of ANFO-ETOH and BX-ETOH solutions were mixed to obtain preparations 10 times more concentrated than desired. Of this, they were added and under agitation, drop by drop in water in the proportion of 1:10. From this last preparation, it is possible to make serial dilutions in water or other aqueous diluent without losing the characteristics of the structures obtained.

Preparação dos produtos comerciais [054] Tanto Ambisome como Amphocil foram reconstituídos com água e realizadas diluições adequadas com o mesmo diluente para obter concentrações finais de 10 e 20 pg/mL de ingrediente ativo.Preparation of commercial products [054] Both Ambisome and Amphocil were reconstituted with water and appropriate dilutions were made with the same diluent to obtain final concentrations of 10 and 20 pg / mL of active ingredient.

Preparação de Candida albicans [055] Uma alçada de cerca de 1 μΙ_ do microrganismo foi transferida para superfície de ágar do meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar e deixada em incubação a 30 °C por 48 horas. No dia do ensaio, a superfície com microrganismos foi lavada com 5 mL de solução salina a 0,9% e 1 mL da suspensão foi transferida para 99 mL de meio de cultura n° 19. Um volume de 8 mL do meio inoculado foi transferido para placas de Petri e deixadas para solidificar. Templates de aço inox foram transferidos para a superfície de cada uma destas placas de Petri imediatamente antes de aplicar as amostras.Preparation of Candida albicans [055] A range of about 1 μΙ_ of the microorganism was transferred to the agar surface of Sabouraud Dextrose Agar culture medium and left in incubation at 30 ° C for 48 hours. On the day of the test, the surface with microorganisms was washed with 5 ml of 0.9% saline and 1 ml of the suspension was transferred to 99 ml of culture medium No. 19. An 8 ml volume of the inoculated medium was transferred for Petri dishes and left to solidify. Stainless steel templates were transferred to the surface of each of these Petri dishes just before applying the samples.

[056] Em cada orifício dos templates, foram aplicados 50 pL de cada amostra e deixados por 2 horas em repouso à temperatura ambiente, antes de submeter à incubação a 30 °C por 24-48 horas e então, fazer leitura dos halos de inibição.[056] In each template hole, 50 pL of each sample were applied and left for 2 hours at room temperature, before being incubated at 30 ° C for 24-48 hours and then reading the inhibition halos .

Estatística [057] Para os ensaios, foram utilizados número de réplicas n=10 e pelo menos 3 testes independentes. Os valores apresentados são valores médios e análise estatística foi aplicada pela análise de variância (ANOVA). Os valores médios foram considerados significativamente diferentes para P<0,05.Statistics [057] For the tests, number of replicates n = 10 and at least 3 independent tests were used. The values presented are average values and statistical analysis was applied by analysis of variance (ANOVA). The mean values were considered significantly different for P <0.05.

2. Avaliação de atividade antimicrobiana de bixina e norbixina2. Evaluation of antimicrobial activity of bixin and norbixin

Preparação de lipossomos de bixina [058] Dispersões de bixina foram preparadas conforme descrito anteriormente nas concentrações de 0,1 a 1,0 mM, sendo que amostras mais diluídas foram preparadas por diluição em água a partir da preparação a 1,0 mM.Preparation of bixin liposomes [058] Bixin dispersions were prepared as previously described in concentrations of 0.1 to 1.0 mM, with more diluted samples being prepared by diluting in water from the 1.0 mM preparation.

Preparação de solução de norbixina [059] Soluções de Norbixina foram preparadas por simples solubilização em água nas concentrações variando de 0,1 a 1,0 mM, sendo que amostras mais diluídas foram preparadas por diluição em água a partir da preparação a 1,0 mM.Preparation of norbixin solution [059] Norbixin solutions were prepared by simple solubilization in water in concentrations ranging from 0.1 to 1.0 mM, with more diluted samples being prepared by diluting in water from the preparation at 1.0 mM.

Preparação de inóculos de bactérias [060] Foram desafiados os microrganismos citados na farmacopéia americana (USPPreparation of bacterial inoculum [060] The microorganisms mentioned in the American pharmacopoeia (USP) were challenged

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XXXII): Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.XXXII): Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.

[061] Uma alçada de cerca de 1 μΙ_ de cada microrganismo foi transferida para superfície de ágar do meio de cultura Tryptic Soy Agar (TSA) e deixada em incubação a 35 °C por 24 horas. No dia do ensaio, a superfície com microrganismos foi lavada com 5 mL de solução salina a 0,9% e 1 mL da suspensão foi transferida para 99 mL de solução salina a 0,9%. Foi feita contagem de cada suspensão por diluições seriadas em tubos contendo 9 mL de salina (diluição até 10-8). Cada 1 mL das 3 últimas diluições foram plaqueadas em duplicata.[061] A range of about 1 μΙ_ of each microorganism was transferred to the agar surface of the Tryptic Soy Agar (TSA) culture medium and left in incubation at 35 ° C for 24 hours. On the day of the test, the surface with microorganisms was washed with 5 ml of 0.9% saline and 1 ml of the suspension was transferred to 99 ml of 0.9% saline. Each suspension was counted by serial dilutions in tubes containing 9 mL of saline (dilution to 10-8). Each 1 mL of the last 3 dilutions were plated in duplicate.

Determinação da atividade antímicrobiana [062] Cada preparação de bixina e norbixina na quantidade de 9 mL foi deixada em interação com 1 mL de cada inóculo por uma hora à temperatura ambiente. Após este período, 1 mL de cada amostra foi transferida para placa de Petri (em triplicata). Um volume de 15 mL de meio Tryptic Soy Agar (TSA) foi adicionado para cada uma das placas e homogeneizado. Após solidificação, cada amostra foi levada à incubação a 35 °C e a contagem realizada após 48 horas.Determination of antimicrobial activity [062] Each preparation of bixin and norbixin in the amount of 9 mL was left in interaction with 1 mL of each inoculum for one hour at room temperature. After this period, 1 mL of each sample was transferred to a Petri dish (in triplicate). A 15 ml volume of Tryptic Soy Agar (TSA) medium was added to each plate and homogenized. After solidification, each sample was incubated at 35 ° C and counting performed after 48 hours.

2. Resultados e discussão [063] O uso de carotenoides tem sido amplamente explorado nas indústrias alimentícia e cosmética como agentes corantes e em alguns casos, como na Agropecuária e Piscicultura, como suplemento alimentar. Devido à natureza apoiar de muitos carotenoides, artigos acadêmicos têm explorado o seu transporte por sistemas de carreamento conhecidos como nanopartículas, entre os quais, lipossomos e outros sistemas coloidais. Não foram encontrados trabalhos utilizando bixina e norbixina, os carotenoides alvos deste trabalho, com a função de carreadores, porém, alguns trabalhos citam como ingrediente ativo para ser carreado por sistemas tradicionais como lipossomos (SOCACIU C., LAUSCH C., DIEHL H.A. Carotenoids in DPPC vesicles: membrane dynamics. Spectrochimica Acta Part A 55: 2289-2297, 1999).2. Results and discussion [063] The use of carotenoids has been widely explored in the food and cosmetic industries as coloring agents and in some cases, as in Agriculture and Fish Farming, as a food supplement. Due to the supporting nature of many carotenoids, academic articles have explored their transport by carrier systems known as nanoparticles, including liposomes and other colloidal systems. No studies were found using bixin and norbixin, the target carotenoids of this work, with the function of carriers, however, some works cite as an active ingredient to be carried by traditional systems such as liposomes (SOCACIU C., LAUSCH C., DIEHL HA Carotenoids in DPPC vesicles: membrane dynamics, Spectrochimica Acta Part A 55: 2289-2297, 1999).

[064] Bixina foi solubilizada em etanol e em seguida, adicionada gota a gota em água, produzindo estruturas vesiculares, como pode ser comprovada pelas Figuras 2 (Ae B) e 3 (A e B). Na Figura 2 A observa-se o interior do microscópio onde foram aplicadas as lâminas de silício com as amostras e na Figura 2 B observa-se as vesículas de bixina sobre lâmina de silício. Na Figura 3 observa-se vesículas de bixina sob microscopia eletrônica de varredura, onde em A observa-se as vesículas vazias, e em B as vesículas de bixina com o fármaco anfotericina B. Essas são imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura. Uma gota equivalente a um volume de cerca de 100 pL foi aplicada diretamente sobre a superfície de uma lâmina de silício e levada ao microscópio[064] Bixin was solubilized in ethanol and then added dropwise in water, producing vesicular structures, as can be seen in Figures 2 (A and B) and 3 (A and B). Figure 2 A shows the inside of the microscope where the silicon sheets were applied with the samples and in Figure 2 B, the bixin vesicles on silicon slide. Figure 3 shows bixin vesicles under scanning electron microscopy, where in A the empty vesicles are observed, and in B the bixin vesicles with the drug amphotericin B. These are images obtained by scanning electron microscopy. A drop equivalent to a volume of about 100 pL was applied directly to the surface of a silicon slide and taken to the microscope

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16/21 e as amostras foram observadas sob vácuo. O tamanho das partículas sem o fármaco foi medido no aparelho ZetaPlus Zeta_Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Co.), equipado com laser de 570 nm e ângulo luminoso de 90° e apresentou diâmetro médio de 151,9 + 0,9 nm (Figura 4) e Potencial Zeta de -14,30 + 0,95 mV, um potencial negativo conforme esperado devido à natureza aniônica do carotenoide. A Figura 4 ilustra a distribuição por tamanho das vesículas de bixina em nanômetros.16/21 and the samples were observed under vacuum. The particle size without the drug was measured in the ZetaPlus Zeta_Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Co.), equipped with a 570 nm laser and a 90 ° light angle and had an average diameter of 151.9 + 0.9 nm (Figure 4) and Zeta Potential of -14.30 + 0.95 mV, a negative potential as expected due to the anionic nature of the carotenoid. Figure 4 illustrates the size distribution of bixin vesicles in nanometers.

[065] Anfotericina B foi o fármaco de escolha para avaliar a capacidade de incorporação de drogas não solúveis em água nas vesículas de bixina. A anfotericina B apresenta comportamento anfifílico devido às porções apoiar e polar do anel lactônico e comportamento anfotérico devido à presença de grupos carboxila e aminas ionizáveis, tornando o composto pouco solúvel em solventes aquosos. A carga negativa da bixina pode interagir com o grupo amino positivo da anfotericina B formando um complexo e a estabilidade sendo reforçada pelas interações hidrofóbicas entre as porções apoiares dos compostos.[065] Amphotericin B was the drug of choice to assess the ability to incorporate non-water-soluble drugs into bixin vesicles. Amphotericin B shows amphiphilic behavior due to the supporting and polar portions of the lactonic ring and amphoteric behavior due to the presence of ionizable amine and carboxyl groups, making the compound poorly soluble in aqueous solvents. The negative charge of bixin can interact with the positive amino group of amphotericin B forming a complex and stability being reinforced by hydrophobic interactions between the supportive portions of the compounds.

[066] O espectro óptico (Figura 5) foi obtido para caracterizar a agregação da anfotericina B na formulação de bixina. Foi utilizado espectrofotômetro Thermo Electron, modelo Nicolet Evolution 100, na região de 300 a 450 nm. O espectro foi obtido à temperatura ambiente (25 °C) no tempo máximo de até 1 hora após preparação das formulações. Na Figura 5 A, o espectro típico de anfotericina B solubilizada no seu melhor solvente, isto é, DMSO e Metanol, enquanto na Figura 5 B, um espectro característico do fármaco nas vesículas lipídicas como aqueles obtidos por Fujii et al (FUJII G., CHANG J.AE., COLEY T., STEERE B. The formation of Amphotericin B ion channels in lipid bilayers. Biochemistry. 36: 4959-4968, 1997) que utilizaram fosfatidilcolina (HSPC), colesterol (Chol) e diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG).[066] The optical spectrum (Figure 5) was obtained to characterize the aggregation of amphotericin B in the formulation of bixin. A Thermo Electron spectrophotometer, model Nicolet Evolution 100, was used in the region from 300 to 450 nm. The spectrum was obtained at room temperature (25 ° C) within a maximum time of up to 1 hour after preparation of the formulations. In Figure 5 A, the typical spectrum of amphotericin B solubilized in its best solvent, that is, DMSO and Methanol, while in Figure 5 B, a characteristic spectrum of the drug in lipid vesicles such as those obtained by Fujii et al (FUJII G., CHANG J.AE., COLEY T., STEERE B. The formation of Amphotericin B ion channels in lipid bilayers. Biochemistry. 36: 4959-4968, 1997) that used phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol (Chol) and distearoylphosphatidylglycerol (DSPG) .

[067] Diferente do artigo de Silva et al (SILVA C.R., ANTUNES L.M.G., BIANCHI M.L.P. Antioxidant action of bixin against cisplatin-induced chromosome aberrations and lipid peroxidation in rats. Pharmacological Research. 43(6): 561-566, 2001), não foi possível dissolver bixina em etanol mais água destilada (1:9), mesmo que imediatamente antes dos experimentos. Foi constatado que a norbixina, outro composto da Bixa orellana, é que é passível de dissolução em solventes aquosos e na mistura citada, apresentando perfis diferentes de formulações com bixina.[067] Unlike the article by Silva et al (SILVA CR, ANTUNES LMG, BIANCHI MLP Antioxidant action of bixin against cisplatin-induced chromosome aberrations and lipid peroxidation in rats. Pharmacological Research. 43 (6): 561-566, 2001), it was not possible to dissolve bixin in ethanol plus distilled water (1: 9), even if immediately before the experiments. It was found that norbixin, another compound of Bixa orellana, is capable of being dissolved in aqueous solvents and in the aforementioned mixture, presenting different profiles of formulations with bixin.

[068] Enquanto que a maioria dos pesquisadores tem dispersado bixina em solventes orgânicos, como DMSO, o que limitaria a aplicação em sistemas biológicos, a presente invenção mostra a possibilidade e vantagens de formulações aquosas, desde que na forma de vesículas. Apesar da prévia utilização de etanol para solubilização da bixina e[068] While the majority of researchers have dispersed bixin in organic solvents, such as DMSO, which would limit the application in biological systems, the present invention shows the possibility and advantages of aqueous formulations, since in the form of vesicles. Despite the previous use of ethanol to solubilize bixin and

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17/21 posterior mistura em água, a quantidade deste álcool (etanol até 20%) não mostrou interferência sobre o sistema testado, isto é, não inibiu crescimento de Candida albicans.17/21 after mixing in water, the amount of this alcohol (up to 20% ethanol) did not show any interference on the tested system, that is, it did not inhibit the growth of Candida albicans.

[069] Os teores de bixina e norbixina foram determinados por espectrofotometria e comparação com coeficiente de absorção de 2826 em clorofórmio a 470 nm e 3473 em KOH 0,5% a 453 nm, respectivamente, conforme artigo de Tocchini e Mercadante (TOCCHINI L., MERCADANTE A.Z. Extração e determinação, por CLAE, de bixina e norbixina em coloríficos. Ciên. Tecnol. Aliment. 21(3): 310-313, 2001).[069] The contents of bixin and norbixin were determined by spectrophotometry and comparison with the absorption coefficient of 2826 in chloroform at 470 nm and 3473 in KOH 0.5% at 453 nm, respectively, according to an article by Tocchini and Mercadante (TOCCHINI L. , MERCADANTE AZ Extraction and determination, by HPLC, of bixin and norbixin in colorificants. Ciên. Tecnol. Aliment. 21 (3): 310-313, 2001).

Determinação de halo de inibição para C. a/b/canse comparação com formulações comerciais [070] Foram avaliadas concentrações de 10 a 20 pg/mL de anfotericina B em bixina 0,5 e 1,0 mM. Controles para DMSO e etanol nas proporções utilizadas durante a preparação das formulações foram testadas e não apresentaram formação de halo de inibição. Controles para os carotenoides também foram testadas sem adição de fármaco e também não apresentaram formação de halo de inibição, demonstrando que bixina sozinha não interfere na inibição do halo de inibição. Porém, conforme Figuras 6 e 7, bixina potencializa efeito da anfotericina B, uma vez que este fármaco foi testado após diluição em solvente ideal, no caso, DMSO e metanol, seguido de diluição em solução tampão de fosfato, conforme preparação da Farmacopéia Americana (The United States Pharmacopeia 32. United States Pharmacopeial Convention. Rockville, vol. 1 ,p. 88,2009), onde a Figura 6 ilustra Placa de Petri contendo amostras com seus halos de inibição, onde A é Anfo 20 pg/mL em B-10, B é Anfo 10 pg/mL em BX 0,5 mM, C é Anfo 20 pg/mL em BX 0,5 mM, D é Anfo 10 pg/mL em B-10, E é Ambisome 20 pg/mL e F é Ambisome 10 pg/mL, e a Figura 7 ilustra o diâmetro dos halos de inibição em função das amostras de anfotericina B na forma de gráfico. De acordo com essa figura (Fig. 7) observa-se uma comparação entre as preparações de anfotericina B em solução tampão de fosfato (Anfo B10), em preparações lipossomais de bixina (BX) e Ambisome (Figura 7 A) e Amphocil (Figura 7 B).Determination of inhibition halo for C. a / b / canse compared to commercial formulations [070] Concentrations of 10 to 20 pg / mL of amphotericin B in 0.5 and 1.0 mM bixin were evaluated. Controls for DMSO and ethanol in the proportions used during the preparation of the formulations were tested and showed no inhibition halo. Controls for carotenoids were also tested without the addition of drug and also did not show an inhibition halo, demonstrating that bixin alone does not interfere with inhibition of the inhibition halo. However, according to Figures 6 and 7, bixin potentiates the effect of amphotericin B, since this drug was tested after dilution in ideal solvent, in this case, DMSO and methanol, followed by dilution in phosphate buffer solution, as prepared by the American Pharmacopoeia ( The United States Pharmacopeia 32. United States Pharmacopeial Convention (Rockville, vol. 1, p. 88,2009), where Figure 6 illustrates Petri dishes containing samples with their inhibition halos, where A is Anfo 20 pg / mL in B -10, B is Anfo 10 pg / mL in 0.5 mM BX, C is Anfo 20 pg / mL in 0.5 mM BX, D is Anfo 10 pg / mL in B-10, E is Ambisome 20 pg / mL and F is Ambisome 10 pg / mL, and Figure 7 illustrates the diameter of the inhibition halos as a function of the amphotericin B samples in the form of a graph. According to this figure (Fig. 7) there is a comparison between the preparations of amphotericin B in phosphate buffer solution (Anfo B10), in liposomal preparations of bixin (BX) and Ambisome (Figure 7 A) and Amphocil (Figure 7 B).

[071] Foram realizados pelo menos 3 testes independentes e com número de réplicas não menor que 5. Análises, Tabela 2 (Anexo), mostram que a formulação de anfotericina B e bixina é melhor que anfotericina sozinha (P<0,05) e melhor que as formulações comerciais como Ambisome e Amphocil. Ambisome é a formulação comercial lipossomal enquanto Amphocil é um complexo com colesterilsulfato de sódio. Estas duas últimas mostraram eficácia na inibição de crescimento da C. albicans, porém, não foram melhores que anfotericina B sozinha em solução tampão. A Tabela 2 (Anexo) mostra a comparação entre as preparações de anfotericina e sua significância, segundo análise estatística ANOVA.[071] At least 3 independent tests were carried out with a number of replicates not less than 5. Analyzes, Table 2 (Annex), show that the formulation of amphotericin B and bixin is better than amphotericin alone (P <0.05) and better than commercial formulations like Ambisome and Amphocil. Ambisome is the commercial liposomal formulation while Amphocil is a complex with sodium cholesteryl sulfate. These last two showed efficacy in inhibiting the growth of C. albicans, however, they were no better than amphotericin B alone in buffer solution. Table 2 (Annex) shows the comparison between the amphotericin preparations and their significance, according to ANOVA statistical analysis.

Petição 870190072735, de 29/07/2019, pág. 23/32Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 23/32

18/21 [072] Tanto na Figura 6 como na Figura 7, observa-se que a anfotericina na preparação lipossomal de bixina apresenta halo de inibição melhor que os produtos comerciais e a anfotericina B sozinha. Observa-se também que apesar da formação do halo, a coloração típica da bixina (Figura 6) não acompanhou o diâmetro do halo. Assim, é notório que a anfotericina B difundiu-se das vesículas para o meio de ágar, enquanto a vesícula permaneceu no local da aplicação. E ainda, o halo correspondente ao tamanho do orifício do template (cerca de 8 mm), apresenta-se translúcido como no padrão, demonstrando que não houve crescimento de Candida albicans no local, enquanto se fosse positivo para crescimento, haveria turvação no local, como o foi para o local com aplicação apenas da formulação com bixina sem o fármaco (dado não mostrado). Portanto, as vesículas de bixina não se difundiram pelo meio de ágar, mas o fármaco pôde ser liberado, o que é esperado numa formulação com eficiente sistema de entrega de droga.18/21 [072] In both Figure 6 and Figure 7, it is observed that amphotericin in the liposomal preparation of bixin presents a halo of inhibition better than commercial products and amphotericin B alone. It is also observed that despite the formation of the halo, the typical coloring of the bixin (Figure 6) did not follow the diameter of the halo. Thus, it is clear that amphotericin B diffused from the vesicles to the agar medium, while the vesicle remained at the application site. Furthermore, the halo corresponding to the size of the template orifice (about 8 mm), is translucent as in the standard, demonstrating that there was no growth of Candida albicans at the site, while if it was positive for growth, there would be turbidity at the site, as it was for the site with application of only the formulation with bixin without the drug (data not shown). Therefore, the bixin vesicles did not diffuse through the agar medium, but the drug could be released, which is expected in a formulation with an efficient drug delivery system.

[073] Campanhã et al (CAMPANHA M.T.N., MAMIZUKA E.M., CARMONA-RIBEIRO A.M. Interactions between cationic vesicles and Candida albicans. Journal of Physical Chemistry B. 105: 8230-8236, 2001) e Lincopan et al (LINCOPAN N., MAMIZUKA E.M., CARMONA-RIBEIRO A.M. In vivo activity of a novel amphotericin B formulation with synthetic cationic bilayer fragments. J. Antimicrobial Chemotherapy. 52: 412-418, 2003) têm demonstrado eficácia de formulações de anfotericina B em fragmentos de bicamada catiônica sintética de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e baseado nestas estruturas, a formulação com bixina mostra vantagens por formar vesículas e ser de origem natural.[073] Campanhã et al (CAMPAIGN MTN, MAMIZUKA EM, CARMONA-RIBEIRO AM Interactions between cationic vesicles and Candida albicans. Journal of Physical Chemistry B. 105: 8230-8236, 2001) and Lincopan et al (LINCOPAN N., MAMIZUKA EM , CARMONA-RIBEIRO AM In vivo activity of a novel amphotericin B formulation with synthetic cationic bilayer fragments. J. Antimicrobial Chemotherapy. 52: 412-418, 2003) have demonstrated the efficacy of amphotericin B formulations in synthetic cationic bilayer fragments of dioctadecyldimethylammonium (DODAB) and based on these structures, the formulation with bixin shows advantages for forming vesicles and being of natural origin.

[074] A Figura 8 ilustra a Curva de Candida albicans viáveis em função do tempo de interação com preparações contendo anfotericina B, onde UFC/ml significa unidades formadoras de colônias por mililitro, (- -) Anfo_gli que significa anfotericina B em solução de glicose 5%; (-O-) BX_anfo que significa anfotericina B em vesículas de bixina; (-A-) Ambisome significa dispersão aquosa do produto comercial Ambisome; (-V-) Amphocil que significa dispersão aquosa do produto comercial Amphocil. As concentrações finais de anfotericina B nas preparações foram às seguintes para os gráficos: (a) 5 pg/mL; (b) 2,5 pg/mL; (c) 1 pg/mL. Nessa figura, observa-se que Anfotericina B quando disperso em solução de glicose a 5% tem a capacidade de diminuir a carga de C. albicans em 7 logs, assim como a formulação do fungicida incorporado em vesículas de bixina e num tempo de interação de cerca de 2 horas. As formulações comerciais como Ambisome e Amphocil com concentrações de anfotericina de 1, 2,5 e 5,0 pg/mL não conseguiram debelar totalmente as células da levedura, ocasionando um aumento crescente de células sobreviventes a partir de 18 horas após início da interação fungo-fungicida.[074] Figure 8 illustrates the viable Candida albicans curve as a function of the time of interaction with preparations containing amphotericin B, where CFU / ml means colony forming units per milliliter, (- -) Anfo_gli which means amphotericin B in glucose solution 5%; (-O-) BX_anfo meaning amphotericin B in bixin vesicles; (-A-) Ambisome means aqueous dispersion of the commercial product Ambisome; (-V-) Amphocil which means aqueous dispersion of the commercial product Amphocil. The final concentrations of amphotericin B in the preparations were as follows for the graphs: (a) 5 pg / mL; (b) 2.5 pg / ml; (c) 1 pg / ml. In this figure, it is observed that Amphotericin B when dispersed in a 5% glucose solution has the ability to decrease the load of C. albicans in 7 logs, as well as the formulation of the fungicide incorporated in bixin vesicles and in an interaction time of about 2 hours. Commercial formulations such as Ambisome and Amphocil with amphotericin concentrations of 1, 2.5 and 5.0 pg / mL were unable to completely eradicate yeast cells, causing an increasing increase in surviving cells after 18 hours after the start of the fungus interaction. -fungicide.

Petição 870190072735, de 29/07/2019, pág. 24/32Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 24/32

19/21 [075] Tem-se como perspectiva que os lipossomos de bixina tornem as formulações mais baratas hoje comercializadas de vários medicamentos, como a anfotericina B que foi o modelo estudado neste trabalho e cujo custo estimado para o tratamento por dia de um paciente de 70 kg nos Estados Unidos, era de 790 a 1316 dólares com Ambisome (TORRADO J.J., ESPADA R., BALLESTEROS M.P., TORRADO-SANTIGAGO S. Amphotericin B formulations and drug targeting. Joumal of Pharmaceutical Sciences. 97(7): 2405-2425, 2008).19/21 [075] It is expected that the bixin liposomes make the cheapest formulations currently commercialized for various drugs, such as amphotericin B, which was the model studied in this work and whose estimated cost for the treatment of a patient per day of 70 kg in the United States, it was from 790 to 1316 dollars with Ambisome (TORRADO JJ, ESPADA R., BALLESTEROS MP, TORRADO-SANTIGAGO S. Amphotericin B formulations and drug targeting. Joumal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7): 2405- 2425, 2008).

[076] Foi avaliada atividade antimicrobiana de cada um dos compostos isoladamente: norbixina (Figura 9 A) e bixina (Figura 9 B), onde cada símbolo representa os microrganismos testados, conforme a seguir: () S. aureus, (·) E. coli e (Λ) P. aeruginosa. Assim como muitos artigos citam, norbixina que é o composto solúvel em água, apresentou atividade antimicrobiana quando interagiu com S. aureus, uma bactéria Gram positiva, enquanto os resultados obtidos com as vesículas de bixina foram os mais surpreendentes. Foi demonstrado que este composto na forma de vesículas dispersas em água apresenta atividade antimicrobiana sobre Gram negativos também, como E. coli e[076] Antimicrobial activity of each of the compounds was evaluated in isolation: norbixin (Figure 9 A) and bixin (Figure 9 B), where each symbol represents the tested microorganisms, as follows: () S. aureus, (·) E . coli and (Λ) P. aeruginosa. As many articles cite, norbixin, which is the water-soluble compound, showed antimicrobial activity when it interacted with S. aureus, a Gram positive bacterium, while the results obtained with bixin vesicles were the most surprising. It has been shown that this compound in the form of vesicles dispersed in water has antimicrobial activity on Gram negative as well, such as E. coli and

P. aeruginosa, além de ação sobre o S. aureus (Gram positivo), nas concentrações testadas entre 1 e 0,5 mM do composto e de forma melhor ainda, não deixando células viáveis, enquanto norbixina deixou células viáveis residuais, o que deixa possibilidade de proliferação após um tempo maior com depleção dos princípios ativos.P. aeruginosa, in addition to action on S. aureus (Gram positive), in the tested concentrations between 1 and 0.5 mM of the compound and even better, leaving no viable cells, while norbixin left residual viable cells, which leaves possibility of proliferation after a longer time with depletion of active ingredients.

[077] Observa-se que preparações de norbixina em água não conseguem diminuir a carga de bactérias Gram negativas, como ainda contribuem para crescimento de fungos, demonstrando inocuidade sobre células eucarióticas devido à presença de enzimas do sistema citocromo P450 que permitem a biotransformação em metabólitos inócuos. Portanto, bixina age por outro mecanismo que pode ser por interação das vesículas de bixina sobre a membrana das células de bactérias, assim como sugerido por Campanha et al. (CAMPANHA M.T.N., MAMIZUKA E.M., CARMONA-RIBEIRO A.M. Interactions between cationic liposomes and bactéria: the physical-chemistry of the bactericidal action. J. Lipid Res. 40: 1495-1500, 1999), podendo ser por oclusão das purinas ou ação sobre as proteínas de transporte das membranas, não permitindo trocas com o meio extracelular para depuração de metabólitos e/ou entrada de nutrientes, porém, havendo formação de uma camada de vesículas sobre a superfície das bactérias.[077] It is observed that norbixin preparations in water cannot decrease the load of Gram negative bacteria, as they still contribute to the growth of fungi, demonstrating innocuousness in eukaryotic cells due to the presence of enzymes from the cytochrome P450 system that allow biotransformation into metabolites innocuous. Therefore, bixin acts by another mechanism, which may be due to the interaction of bixin vesicles on the bacterial cell membrane, as suggested by Campanha et al. (MTN CAMPAIGN, MAMIZUKA IN, CARMONA-RIBEIRO AM Interactions between cationic liposomes and bacteria: the physical-chemistry of the bactericidal action. J. Lipid Res. 40: 1495-1500, 1999), which may be due to purine occlusion or action on the transport proteins of the membranes, not allowing exchanges with the extracellular medium for the clearance of metabolites and / or the entry of nutrients, however, with the formation of a layer of vesicles on the surface of the bacteria.

3. Conclusão [078] Na presente invenção, bixina mostrou ser capaz de formar vesículas quando utilizada técnica de injeção etanólica em água, possibilitando incorporar drogas, inclusive de caráter apoiar como anfotericina B. Quando submetida isolada em teste in vitro com Candida albicans, a preparação lipossomal não apresentou formação de halo de inibição,3. Conclusion [078] In the present invention, bixin has been shown to be able to form vesicles when using an ethanol injection technique in water, making it possible to incorporate drugs, including those of a support character such as amphotericin B. When submitted to an in vitro test with Candida albicans, liposomal preparation did not show an inhibition halo,

Petição 870190072735, de 29/07/2019, pág. 25/32Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 25/32

20/21 porém, em associação com anfotericina B, permitiu sua liberação e interação com a levedura, promovendo halo de inibição maior (P<0,05) que os produtos comerciais, como Ambisome e Amphocil, quando foram testadas nas mesmas concentrações finais do princípio ativo.20/21 however, in association with amphotericin B, allowed its release and interaction with yeast, promoting a greater inhibition halo (P <0.05) than commercial products, such as Ambisome and Amphocil, when they were tested in the same final concentrations as active principle.

[079] As vesículas de bixina apresentaram caráter aniônico, porém, podem se ligar eletrostaticamente em regiões catiônicas de outros compostos. Por apresentarem uma cadeia longa apoiar como os lipídios utilizados para preparação de lipossomos, permitem interações hidrofóbicas com regiões apoiares de outros compostos, como princípios ativos de caráter apoiar.[079] Bixin vesicles had an anionic character, however, they can bind electrostatically in cationic regions of other compounds. Because they have a long support chain like the lipids used to prepare liposomes, they allow hydrophobic interactions with support regions of other compounds, as supportive active principles.

[080] Portanto, o que se pode esperar como alternativa para preparar vesículas de bixina ou outros carotenoides semelhantes como zeaxantina, luteína, criptoxantina e outros com estruturas próximas, é a utilização de um solvente orgânico adequado (de preferência, não tóxico ou que possa ser eliminado posteriormente por técnicas simples como diálise, evaporação ou bombeamento de gás inerte como nitrogênio), e depois, ser transferido gota a gota para soluções aquosas.[080] Therefore, what can be expected as an alternative to prepare bixin vesicles or other similar carotenoids such as zeaxanthin, lutein, cryptoxanthin and others with similar structures, is the use of a suitable organic solvent (preferably non-toxic or that can later be eliminated by simple techniques such as dialysis, evaporation or pumping of inert gas such as nitrogen), and then be transferred dropwise to aqueous solutions.

Petição 870190072735, de 29/07/2019, pág. 26/32Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 26/32

21/21 21/21 Valor de P** P value ** CXI O CXI O h- 00 o 'dco CXI co H- 00 o 'dco CXI co 2,53967-® 2.53967-® (Ό 5 05 co_ (Ό 5 05 co_ 7.2007T® 7.2007T® σ> OO 00 CN σ> OO 00 CN 0,02874 0.02874 0,0079 0.0079 0,63366 0.63366 O CO O CXI co O CO O CXI co CO rCD o co co co CO rCD o co co co 2,94839-® 2.94839-® co CXI CXI O co CXI CXI O co 'd- 'do o co 'd- 'do o (X) AnfoB - anfotericina B. **Os expoentes representam que os valores devem ser multiplicados pelo fator 10 elevado ao respectivo expoente (Ex.: 1,1Γ⁵ representa 1,11 x 10'⁵). ***Significância para P<0,05. TABELA 2(X) AnfoB - amphotericin B. ** The exponents represent that the values must be multiplied by the factor 10 raised to the respective exponent (Ex .: 1.1Γ ⁵ represents 1.11 x 10 ' ⁵ ). *** Significance for P <0.05. TABLE 2 Amphocil (20 pg/mL) Amphocil (20 pg / mL) X X X X X X Amphocil (10 pg/mL) Amphocil (10 pg / mL) X X X X X X Ambisome (20 pg/mL) Ambisome (20 pg / mL) X X X X X X Ambisome (10 pg/mL) Ambisome (10 pg / mL) X X X X X X AnfoB em bixina lipossomal (20 pg/mL) AnfoB in liposomal bixin (20 pg / mL) X X X X X X X X AnfoB em bixina lipossomal (10 pg/mL) AnfoB in liposomal bixin (10 pg / mL) X X X X X X X X AnfoB em tampão B10 (20 pg/mL) AnfoB in buffer B10 (20 pg / mL) X X X X X X X X AnfoB em tampão B10 (10 pg/mL) AnfoB in buffer B10 (10 pg / mL) X X X X X X X X - - CXI CXI CO CO U5 U5 co co co co 05 05 o O - - CXI CXI co co

Petição 870190072735, de 29/07/2019, pág. 27/32Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 27/32

Claims

1. Carotenoid lipid vesicles, characterized by comprising carotenoids selected from bixin, zeaxanthin, lutein, cryptoxanthin, alpha-carotene, beta-carotene, in a molar ratio above 10% in relation to the constitution of the vesicular bilayer, in which said carotenoids present in the form of a liposome, at a concentration of 0.001 to 100 millimolar (mM).

Carotenoid lipid vesicles according to claim 1, characterized in that they preferably comprise between 0.01 to 10 mM, more preferably between 0.01 to 1.0 mM in relation to the total liposomal formulation.

Carotenoid lipid vesicles according to claim 1 or 2, characterized in that they preferably comprise bixin at a concentration of 0.001 to 100 millimolar (mM), preferably between 0.01 to 10 mM, more preferably between 0.01 to 1.0 mM, in relation to the total liposomal formulation.

4. Carotenoid lipid vesicles, according to claim 1, characterized by the fact that the liposome is unilamellar or multilamellar.

5. Carotenoid lipid vesicles, according to claims 1, 2 or 3, characterized in that the liposome has a size of 20 nm to 1500 nm, preferably between 100 and 200 nm, more preferably 151.9 ± 0 , 9 nm.

6. Carotenoid lipid vesicles, according to claim 1, characterized by having a component-carrying function within them.

7. Carotenoid lipid vesicles, according to claim 6, characterized in that they preferably comprise antimicrobial drugs such as amphotericin B.

8. Carotenoid lipid vesicles, according to claim 1, characterized by having an active principle function.

Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 28/32

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9. Carotenoid lipid vesicles, according to claim 8, characterized by the fact that it preferably presents antimicrobial activity, more preferably on Gram negative and Gram positive bacteria.

10. Carotenoid lipid vesicles, according to claim 1, 6 or 8, characterized by having a carrier function and active principle concomitantly.

11. Carotenoid lipid vesicles according to claims 1 to 10, characterized in that they optionally comprise isolated and unique carotenoids, mixtures of carotenoids, other lipids (carotenoids or non-carotenoids), cholesterol, cholesterol salt, phospholipids, glycolipids, conjugated lipids , other binders.

12. Composition, characterized by comprising the carotenoid lipid vesicles, as defined in claims 1 to 11.

13. Composition according to claim 12, characterized by the fact that the lipid vesicles are composed of carotenoids that represent the largest molar ratio in relation to the constitution of the vesicular bilayer.

14. Composition according to claim 22, characterized by the fact that carotenoids are selected from zeaxanthin, lutein, cryptoxanthin, alpha-carotene, beta-carotene, preferably bixin.

15. Composition according to claim 12, characterized in that it further comprises glycerin, aqueous vegetable extracts, olive oil, glyceryl stearate, carboxymethylcellulose, preservative and fragrance.

16. Process for the preparation of carotenoid lipid vesicles, defined in claims 1 to 11, characterized by comprising the following steps:

The. solubilization of carotenoid in organic solvent,

B. adding the solution obtained in step (a) in water, drop by drop, under stirring;

ç. obtaining the carotenoid lipid vesicle.

Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 29/32

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17. Process for the preparation of carotenoid lipid vesicles, according to claim 16, characterized by comprising the following steps, when the component to be carried is insoluble in water:

The. solubilization of carotenoid in organic solvent;

B. solubilization of water-insoluble components to be carried in organic solvent;

ç. mixing the solution obtained in step (a) with the solution obtained in step (b);

d. adding the solution obtained in step (c) in water, drop by drop, with stirring;

and. obtaining the carotenoid lipid vesicle.

18. Process for the preparation of carotenoid lipid vesicles, according to claim 16, characterized by comprising the following steps, when the component to be carried is soluble in water:

The. solubilization of carotenoid in organic solvent;

B. solubilization of water-soluble components to be carried in water or aqueous solvent;

ç. mixing the solution obtained in step (a), drop by drop to the solution obtained in step (b), with stirring;

d. obtaining the carotenoid lipid vesicle.

19. Process for the preparation of carotenoid lipid vesicles, according to claims 17 or 18, characterized in that it comprises components to be carried, preferably the amphotericin B drug.

20. Process for the preparation of carotenoid lipid vesicles, according to claims 17 or 18, characterized in that the organic solvent is chloroform, dimethyl sulfoxide, ether, alcohols, preferably ethanol.

Petition 870190072735, of 7/29/2019, p. 30/32

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21. Process for the preparation of carotenoid lipid vesicles, according to claim 17 or 18, characterized by preferentially using ethanol in the concentration of up to 20% of the final preparation, being eliminated by a process such as dialysis or evaporation of these organic solvents.

22. Use of carotenoid lipid vesicles, according to claims 1 to 21, characterized by being in the areas of pharmaceutical, food, veterinary, cosmetic, basic research, biotechnology, dental, oncological, radiopharmaceutical, agronomic, gene therapy.

23. Use of carotenoid lipid vesicles, according to claims 1 to 21, characterized by being a carrier of essential oils, dyes, drugs, nucleic acids, antibodies, antineoplastics, radiopharmaceuticals, vaccines and adjuvants.

24. Use of carotenoid lipid vesicles, according to claims 1 to 21, characterized by being an active ingredient in pharmaceutical, veterinary, cosmetic, biotechnological, dental, oncological, radiopharmaceutical, agronomic and gene therapy formulations.

25. Use of preparation of carotenoid lipid vesicles, according to claims 1 to 21, characterized by employing carotenoids in which said carotenoids represent the largest molar proportion in relation to the constitution of the vesicular bilayer.