BRPI0903009A2 - vesÍculas lipÍdicas de carotenàides, composiÇço, processo de preparaÇço de vesÍculas lipÍdicas de carotenàides e uso de vesÍculas lipÍdicas de carotenàides - Google Patents
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Abstract
VESÍCULAS LIPÍDICAS DE CAROTENOÍDES, COMPOSIÇçO, PROCESSO DE PREPARAÇçO DE VESÍCULAS LIPIDICAS DE CAROTENOÍDES E USO DE VESÍCULAS LIPÍDICAS DE CAROTENOÍDES. A presente invenção aplica-se nas áreas farmacêutica, cosmética, veterinária, biotecnológica, odontológica, médica, oncológica, radiofarmacêutica, agronômica, de terapia gênica, alimentícia, referindo-se à constituição de vesículas lipídicas de carotenóides em que ditos carotenóides representam a maior proporção molar da constituição da bicamada vesicular, bem como uma composição contendo ditas vesiculas lipidicas de carotenóides, processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides e uso.
Description
VESÍCULAS LIPÍDICAS DE CAROTENÓIDES, COMPOSIÇÃO, PROCESSO DEPREPARAÇÃO DE VESÍCULAS LIPÍDICAS DE CAROTENÓIDES E USO DEVESÍCULAS LIPÍDICAS DE CAROTENÓIDES
A presente invenção aplica-se nas áreas farmacêutica, cosmética, veterinária,biotecnológica, odontológica, médica, oncológica, radiofarmacêutica, agronômica, deterapia gênica, alimentícia, referindo-se à constituição de vesículas lipídicas decarotenóides em que ditos carotenóides representam a maior proporção molar daconstituição da bicamada vesicular.
ESTADO DA TÉCNICA
Lipossomos são estruturas esféricas compostas de bicamadas concêntricassimples ou múltiplas, resultantes da auto-associação de moléculas anfifílicas, tais comofosfolipídios, em um meio aquoso. Os grupos da cabeça polar são localizados nasuperfície das membranas, em contato com o meio, enquanto as cadeias de ácido graxoformam o centro hidrofóbico das membranas, protegido da água. Estas vesículas têmparte da fase aquosa no seu interior e, conseqüentemente podem capturar e segregarmoléculas polares; além disso, por causa das propriedades físico-químicas de seusconstituintes, podem também dissolver moléculas hidrofóbicas em suas bicamadas.Lipossomos podem ser preparados com muitos tamanhos diferentes, variando devesículas unilamelares pequenas (SUV - small unilamellar vesicles), cujo menordiâmetro pode ser de cerca de 20 nm, até vesículas unilamelares gigantes (GUV - giantunilamellar vesicles) com diâmetro de dezenas de micrômetros. Pertencendo à primeirageração de lipossomos, estão as vesículas multilamelares (MLV - multilamellar vesicles)com várias centenas de nanômetros em diâmetro (BANGHAM A.D., STANDISHM.M.,WATKINS J.C. Diffusion of univalent ions across Iamellae of swollen phospholipids.J. Mol. Biol. 13(1): 238, 1965), e as mais recentes vesículas unilamelares grandes (LUV- Iarge unilamellar vesicles), caracterizadas por volumes de captura alta, com diâmetroajustável (100 ou 200 nm) e tamanho reduzido por extrusão através de membranasespecíficas (SCHUBER F., KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: frommembrane models to gene therapy. Pure & Appl. Chem. 70 (1): 89-96, 1998.).
Em essência, os lipossomos são estruturas altamente versáteis cujaspropriedades podem ser moduladas por mudança nos parâmetros tais como tamanho,lamelaridade, composição das bicamadas, cargas e propriedades de superfície. Aquímica dos (fosfo) lipídios, que são os constituintes de lipossomos, permite planejaranálogos com novas propriedades e derivados a serem ligados à superfície dasvesículas. Lipossomos têm atraído um enorme interesse:i) Na pesquisa básica (Química e Biologia) como modelos de membrana, mastambém oferecem atraentes possibilidades para confinamento de reações químicas emvolumes muito pequenos,
ii) Como veículos para transporte de drogas e, recentemente, para transporte degenes,
iii) Em biotecnologia, indústria farmacêutica (desenvolvimento de formulaçõesantitumorais e vacinas baseadas em lipossomo) e em cosméticos (SCHUBER F.,KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: from membrane models to genetherapy. Pure & Appl. Chem. 70 (1): 89-96, 1998).
Os Iipossomos podem ser planejados racionalmente, resultando em Iipossomosnão reativos (estericamente estabilizados) (SLs)1 bem como Iipossomos polimórficos(catiônicos fusogênicos). Os SLs podem ser planejados para exibir reatividadeespecífica (direcionamento), enquanto Iipossomos polimórficos podem exibir altareatividade a ácidos nucléicos e membranas celulares. Devido a seu reduzidoreconhecimento e ataque pelo sistema imunológico, estes Iipossomos podem terutilidade em quimioterapia de câncer. Os Iipossomos polimórficos são promissores emterapia gênica devido à possibilidade da transfecção de DNA. Em paralelo, liberaçãomais eficiente e retenção de drogas dentro de Iipossomos (baseado em acúmulo ativoatravés de gradientes iônicos) têm contribuído para utilização desta nova geração deIipossomos (LASIC D.D., PAPAHADJOPOULOS D. Liposomes revisited. Science. 267:1275-1276, 1995).
Lipossomos estericamente estabilizados foram criados quando se soube queestabilização mecânica ou eletrostática não poderia formar Iipossomos com suficienteestabilidade em um ambiente biológico como a circulação sistêmica. Por isso, em SLs, abicamada lipídica contém glicolipídios ou mais recentemente, lipídios conjugados cometilenoglicol que forma uma barreira estérica externa à membrana. SLs matem-se nosangue até 100 vezes mais tempo que Iipossomos convencionais e podem, por isso,aumentar a eficácia farmacológica dos agentes encapsulados. Além disso, SLspermitem direcionar Iipossomos para células específicas através de ligante, porque sãomuito menos susceptíveis a ataque não específico que os convencionais. SLs ligados aanticorpos ou outros Iigantes são acumulados muito mais prontamente em células alvoque os Iipossomos convencionais (LASIC D.D., PAPAHADJOPOULOS D. Liposomesrevisited. Science. 267: 1275-1276, 1995).
Existem técnicas que provocam profundas mudanças no comportamentofarmacocinético das SLs (lipossomos não reativos, mas estericamente estabilizados). Ameia vida dos lipossomos convencionais no sangue, após injeção intravenosa, porexemplo, pode variar entre 2 horas e mais de 40 horas em humanos. Foramdescobertos Iipossomos de circulação longa que são capturados mais lentamente porfígado e baço, sendo direcionados passivamente para sítios tumorais, aumentando a"biodisponibilidade" de drogas antitumorais. Por exemplo, em certos tumores foramencontrados níveis de Iipossomos 25 vezes mais altos mesmo após vários dias dainjeção. Outra conseqüência deste fenômeno é o uso de SL para imagens (SCHUBERF., KICHLER A., BOECKLER C., FRISCH B. Liposomes: from membrane models togene therapy. Pure & Appl. Chem. 70 (1): 89-96, 1998).
O tumor sólido de carcinoma de cólon C26 em camundongos é praticamenteinsensível a tratamentos com doxorrubicina livre ou incorporada em Iipossomosconvencionais. Contudo, a administração de SLs contendo doxorrubicina (SL-Dox)resultou em completa remissão de tumores em tratamentos precoces e em melhoriassignificativas em tratamentos tardios. Em um modelo de tumor de carcinoma mamárioem camundongos, SL-Dox foi bem mais eficiente que Iipossomos convencionais ereduziu a incidência de metástases. SL-Dox pôde deter o crescimento de célulastumorais de pulmão humano em severa imunodeficiência combinada (SCID) decamundongos, enquanto doses equivalentes de doxorrubicina livres ou encapsuladasem Iipossomos convencionais, não foram eficazes (LASIC D.D., PAPAHADJOPOULOSD. Liposomes revisited. Science. 267: 1275-1276, 1995).
Lipossomos de bicamada simples são geralmente preparados por um dos doismétodos de sonicação: um probe de alta energia é imerso diretamente numa dispersãoaquosa de fosfolipídios ou pela dispersão de fosfolipídio em um frasco de vidrosuspenso em um banho ultrassônico de baixa energia. Ambos os procedimentosproduzem vesículas de cerca de 25 nm de diâmetro, consistindo de uma concha debicamada fosfolipídica simples. Contudo, a técnica apresenta várias desvantagens comoa sonicação em alta energia causar oxidação e degradação do fosfolipídio, emborapossa ser minimizada por controle rigoroso, e também pode danificar moléculas dosoluto a ser encapsulado. Outra desvantagem é a dificuldade em preparar grandesquantidades de Iipossomos (BATZRI S., KORN E.D. Single bilayer liposomes preparedwithout sonication. Biochim. Biophys. Acta. 298: 1015-1019, 1973).
Devido a estas limitações pelo preparo de Iipossomos por sonicação, Batzri eKorn (BATZRI S., KORN E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication.Biochim. Biophys. Acta. 298: 1015-1019, 1973) desenvolveram um dos mais simplesmétodos para obtenção de Iipossomos que é o método chamado injeção etanólica. Estatécnica permite obter Iipossomos com bicamada simples, não distinguíveis daquelesobtidos por sonicação. A suspensão diluída pode ser facilmente concentrada porultrafiltração, não levando à degradação ou oxidação do fosfolipídio utilizado (BATZRIS., KORN E.D. Single bilayer Iiposomes prepared without sonication. Biochim. Biophys.Acta. 298: 1015-1019, 1973).
Quanto à encapsulação de drogas, compostos dissolvidos no mesmo etanolcomo o lipídio, são relativamente bem encapsulados, enquanto substâncias hidrofílicasapresentam baixa compartimentalização, como ocorreu com carboxifluoresceína notrabalho de Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtainedby the ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993). Porém, estes mesmosautores relataram como vantagem da injeção etanólica, a possibilidade de encapsulartanto substâncias hidrofílicas como lipofílicas.
O peso molecular e raio das vesículas produzidas pelo método de injeção podedepender da velocidade de injeção, concentração de lipídio no tampão e no álcool, e opH e osmolalidade do tampão. Kremer et al (KREMER J.M.H., VANDER ESKER M.W.J.,PATHMAMANOHARAN C., WIERSEMA P.H. Vesicles of variable diameter prepared bya modified injection method. Biochemistry. 16: 3032-3935, 1977) mostraram que avelocidade de injeção não influenciou o peso molecular ou o raio das partículas lipídicas.
Pons et al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained bythe ethanol injection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) detectaram que aconcentração de lipídios é o principal fator que influencia o tamanho das vesículas.Hauser (HAUSER H. Methods of preparation vesicles: assessment of their suitability fordrug encapsulation. Trends Pharm. Sei. 3: 274-277, 1982) havia estabelecido que ainjeção de soluções etanólicas de fosfolipídios originava vesículas do tipo SUV (comalguns agregados de SUV), com tamanho variando entre 30 e 60 nm. Porém, Pons et al(PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanolinjection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) obtiveram não apenas SUVs, mastambém vesículas intermediárias e grandes, dependendo da concentração lipídica. Ponset al (PONS M., FORADADA M., ESTERLRICH J. Liposomes obtained by the ethanolinjection method. Int. J. Pharm. 95: 51-56, 1993) concluíram que, variando aconcentração de lipídio, o método oferece a possibilidade de obter vesículas debicamada simples de diferentes raios de maneira reprodutível e confiável.
Lipossomos foram propostos e demonstrados por Gregoriadis e colaboradores(GREGORIADIS G. Engineering Iiposomes for drug delivery: progress and problems.Trends in Biotechnology 13: 527-537, 1995) na década de 1970 por terem capacidadepara carrear drogas e utilizaram enzimas, drogas anticâncer e antimicrobianos para tal.Muitos estudos têm sido desenvolvidos para sistemas de entrega de drogas devido àconsiderada natureza inócua dos componentes Iipossomais (que são lipídios nãotóxicos, não imunogênicos, biodegradáveis), e a versatilidade da estrutura do sistema.
Existem trabalhos que mostram que carotenóides podem ser carreados porsistemas Iipossomais tradicionais para melhorar a própria permeabilidade das vesículascarreadoras (SOCACIU C., LAUSCH C., DIEHL H.A. Carotenoids in DPPC vesicles:membrane dynamics. Spectrochimica Acta Part A 55: 2289-2297, 1999) como trabalhosdemonstrando a utilização de carotenóides como ingredientes ativos com atividadeantioxidante (SILVA C.R., ANTUNES L.M.G., BIANCHI M.L.P. Antioxidant action of bixinagainst cisplatin-induced chromosome aberrations and Iipid peroxidation in rats.Pharmacological Research. 43(6): 561-566, 2001), efeito protetor contra radiação eelementos mutagênicos e indução de sistema citocromo P450 (De-Oliveira A.C.A.X.,SILVA I.B., MANHÃES-ROCHA D.A., PAUMGARTEN F.J.R. Induction of Iivermonooxygenases by annatto and bixin in female rats. Braz. J. Med. Biol. Res. 36(1):113-118, 2003).
Bixina (cis-bixina, CAS 6983-79-5) é o principal pigmento solúvel em óleo dassementes de Bixa orellana L. É um carotenóide desprovido de atividade de pró-vitaminaA com dois grupos carboxílicos, um dos quais é o metiléster (Figura 1 A). A hidrólisedeste grupo metil éster dá um ácido dicarboxílico correspondente, a norbixina (Figura 1B), que é um pigmento do anato solúvel em soluções aquosas alcalinas. Os extratos deanato, bem como seus constituintes carotenóides principais bixina e norbixina, têm sidoamplamente empregados como aditivos coloríficos em alimentos, drogas e cosméticos(De-Oliveira A.C.A.X., SILVA I.B., MANHÃES-ROCHA D.A., PAUMGARTEN F.J.R.Induction of Iiver monooxygenases by annatto and bixin in female rats. Braz. J. Med.Biol. Res. 36(1): 113-118, 2003). No norte e nordeste do Brasil é extensivamenteutilizado como um condimento de alimentos, conhecido como 'colorau' ou 'colorífico'(De-Oliveira A.C.A.X., SILVA I.B., MANHÃES-ROCHA D.A., PAUMGARTEN F.J.R.Induction of Iiver monooxygenases by annatto and bixin in female rats. Braz. J. Med.Biol. Res. 36(1): 113-118, 2003).
As sementes de B. orellana têm sido utilizadas na medicina popular brasileirapara preparar poções afrodisíacas bem como remédios para tratar febres, inflamações,doenças parasíticas e na Jamaica, remédios populares para tratar diabetes mellitus(PAUMGARTEN F.J.R., DE-CARVALHO R.R., ARAÚJO I.B., PINTO F.M., BORGESO.O., SOUZA C.A.M., KURIYAMA S.N. Evaluation of the developmental toxicity ofannatto in the rat. Food and Chemical Toxicology. 40: 1595-1601, 2002).
Sabe-se que as folhas de B. orellana exibem um efeito inibitório contra Neisseriagonorrhoea, e os extratos de folha, uma significativa atividade antimicrobiana contralinhagens padrões de bactérias Gram positivas incluindo Bacillus subtilis, Streptococcusfaeealis e Staphylococcus aureus. Um recente estudo de extratos voláteis apresentouvários mono e sesquiterpenos (GALINDO-CUSPINERA V., WESTHOFF D.C., RANKINS.A. Antimicrobial properties of commercial annatto extracts against selectedpathogenic, Iactic acid, and spoilage microorganisms. J. Food Protection. 66 (6): 1074-1078, 2003), e outros compostos solúveis em água (GALINDO-CUSPINERA V.,RANKIN S.A. Bioautography and chemical characterization of antimicrobial compound(s)in commercial water-soluble annatto extracts. J. Agric. Food Chem. 53(7): 2524-2529,2005) com atividades antimicrobianas. Contudo, não foram encontrados relatos deatividade antimicrobiana por compostos isolados de B. orellana devido à dificuldade emseparar os componentes dos extratos.
Os corantes obtidos do urucum (Bixa orellana L.) têm sido utilizados há muitosanos principalmente nas áreas cosmética e alimentícia. Os corantes são encontradosrecobrindo a superfície externa das sementes de urucum e são constituídos na suamaioria (cerca de 80%) de α-bixina que é um monometilester do ácido carboxílico da a-norbixina (FERREIRA V.L.P., TEIXEIRA NETO R.O., MOURA S.C.S.R., SILVA M.S.Cinética da degradação da cor de solução hidrossolúvel comercial de urucum,submetida a tratamentos térmicos. Ciênc. Tecnol. Aliment. 19(1):37-42, 1999).
Vários países têm proibido o uso de um número de corantes alimentíciossintéticos e a maioria dos corantes naturais além da questão de aparência, têmimportância na melhoria para a saúde, ocorrendo grande demanda por alimentos esuplementos contendo uma dose eficaz destes corantes (REDDY M.K., ALEXANDER-LINDO R.L., NAIR M.G. Relative inhibition of Iipid peroxidation, cyclooxygenaseenzymes.and human tumor cell proliferation by natural food colors. J. Agric. Food Chem.53: 9268-9273, 2005). Reddy et al (REDDY M.K., ALEXANDER-LINDO R.L., NAIR M.G.Relative inhibition of Iipid peroxidation, cyclooxygenase enzymes.and human tumor cellproliferation by natural food colors. J. Agric. Food Chem. 53: 9268-9273, 2005)demonstraram que bixina em combinação com Iicopeno e β-caroteno não tiveramimpacto esperado na melhoria da saúde, porém, a inibição da peroxidação lipídica,enzimas da ciclooxigenase e proliferação de células tumorais foi significativa.
A presente invenção tem como objetivo elucidar o baixo custo e a facilidade noprocesso de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides que tem comocomponente principal uma matéria prima de baixa toxicidade, mesmo em dosagensaltas, que é bastante abundante no Brasil e de baixo custo. Com isso, o processo torna-se um incentivo para a indústria nacional aprimorar as técnicas de extração, purificaçãoe preparação do composto como um insumo mais nobre para a indústria farmacêutica,além dos já aplicados para indústria cosmética e de alimentos.
DESCRIÇÃO RESUMIDA
A presente invenção trata de vesículas lipídicas de carotenóides em que ditoscarotenóides representam a maior proporção da constituição da bicamada vesicular. Ainvenção trata ainda de composição contendo ditas vesículas lipídicas de carotenóides,processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides e uso.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção trata de vesículas lipídicas de carotenóides em que ditoscarotenóides representam a maior proporção da constituição da bicamada vesicular, suacomposição, seu processo de preparação e uso.
De acordo com a invenção, os carotenóides utilizados nas vesículas lipídicaspodem ser selecionados entre bixina, zeaxantina, luteína, criptoxantina, alfa-caroteno,beta-caroteno, sendo preferencialmente bixina. Opcionalmente, ditas vesículas lipídicaspodem ser constituídas de carotenóides isolados e únicos, misturas de carotenóides,outros lipídios (carotenóides ou não carotenóides), colesterol, sal de colesterol,fosfolipídios, glicolipídios, lipídios conjugados, outros ligantes.
A norbixina é um tipo de carotenóide que pode participar da composiçãoestrutural da vesícula, e também possui uma ação farmacológica sozinha. A norbixinatambém forma emulsões devido à capacidade tensioativa. A vantagem é que a norbixinaé solúvel em água e pode dispersar compostos insolúveis ou pouco solúveis em águaquando adicionamos estes compostos diretamente na mistura de norbixina em água.
Não há artigos ou patentes que apresentem vesículas preparadas com mais que1% de carotenóides em relação à vesícula preparada, pois foram utilizadas comoadjuvantes para melhorar estabilidade das vesículas. De acordo com a presenteinvenção, a vesícula é preparada a partir de carotenóides, opcionalmente, pode conteroutro lipídio (carotenóide ou não-carotenóide), com função adjuvante ou para sítio dirigirpara algum tecido específico do organismo. A vantagem da vesícula ser preparada apartir de carotenóides é que o custo e os efeitos adversos são muito baixos, e algunslipídios são caríssimos, principalmente os sintéticos, como o N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamoniometilsulfato (DOTAP).
As vesículas lipídicas de carotenóides, segundo a presente invenção,apresentam carotenóides na concentração de 0,001 a 100 milimolares (mM),preferencialmente entre 0,01 a 10 mM, mais preferencialmente 0,01 a 1,0mM; e bixinatambém na concentração de 0,001 a 100 milimolares (mM), preferencialmente entre0,01 a 10 mM, mais preferencialmente 0,01 a 1,0mM. Essas vesículas caracterizam-sepor apresentarem-se sob a forma de lipossomos, podendo esses serem unilamelar oumultilamelar. Esse mesmo Iipossomo é caracterizado por apresentar-sepreferencialmente no tamanho entre 100 e 200 nm, mais preferencialmente 151,9 ± 0,9nm, podendo variar desde 20 nm a1500nm, conforme as condições de preparação comopresença de eletrólitos, outras estruturas moleculares não eletrolíticas, velocidade deagitação, solventes utilizados, temperatura, concentração dos lipídios, etc.
A estrutura molecular do carotenóide bixina (Figura 1 A) mostrou-se muitosimilar a alguns lipídios comumente utilizados para preparação de lipossomos, poisapresentam regiões com caráter polar e cadeia longa apoiar, por exemplo, odioctadecildimetilamônio (DODA), N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamoniometilsulfato (DOTAP). O composto não é solúvel em água, sendo muitodifundida sua solubilização em solventes orgânicos. Seu caráter hidrofóbico apresentavantagens para interagir com compostos com o mesmo caráter, sendo uma estruturainteressante para formar vesículas. A utilização de bixina como principal composto parapreparar vesículas lipídicas nunca foi demonstrada talvez devido à dificuldade emsolubilizar em solventes aquosos.
O carotenóide bixina tem sido estudado sob aspecto toxicológico e não temmostrado efeitos tóxicos, apresentando ser muito promissor como carreador de drogastambém por esta característica. Paumgarten et al (PAUMGARTEN F.J.R., DE-CARVALHO R.R., ARAÚJO I.B., PINTO F.M., BORGES O.O., SOUZA C.A.M.,KURIYAMA S N. Evaluation of the developmental toxicity of annatto in the rat. Food andChemical Toxicology. 40: 1595-1601, 2002) não detectaram nenhuma evidência detoxicidade tanto em ratas como em suas proles quando administraram uma quantidadede 500 mg ou mais de annato (28% de bixina)/ kg de peso/ dia por via oral. Este valor (>140 mg de bixina/kg de peso/dia) determinado em ratos é pelo menos 2153 vezes oconsumo diário aceitável preconizado pela Organização Mundial da Saúde (0,065 mg debixina/kg peso/dia) para humanos. Assim observa-se que o carotenóide, produto natural,compete em eficiência com formulações comerciais.
Porém, outro tipo de inovação encontrado, foi a interação de vesículas aniônicas,pois bixina resulta em vesículas com potencial de carga negativa e ainda tem potencialde interagir com células com membranas de carga negativa. Foi demonstrado que deveexistir outro tipo de interação que é mais forte que a simples atração eletrostática,portanto, apesar de casos clássicos como relatado, por exemplo, por Campanhã et al(CAMPANHA M.T.N., MAMIZUKA E.M., CARMONA-RIBEIRO A.M. Interactions betweencationic Iiposomes and bactéria: the physical-chemistry of the bactericidal action. J. LipidRes. 40: 1495-1500, 1999), em que vesículas catiônicas como os de DODAB, queinteragem com membranas de bactérias com carga negativa por atração eletrostática,as vesículas de bixina têm potencial de carga negativa que também interagem commembranas de bactérias por outro tipo de interação, a chamada hidrofóbica e que já foidemonstrado em outros trabalhos (KIKUCHI I.S., CARMONA-RIBEIRO A.M. Interactionsbetween DNA and cationic liposomes. J. Phys. Chem. B. 104: 2829-2835, 2000).
A invenção aqui descrita atribuiu ao carotenóide bixina o papel principal decomponente carreador enquanto no máximo, artigos apresentam seu papel comocoadjuvantes. Hara et al (HARA M., YAMANO Y., SAKAI Y., KODAMA E., HOSHINO T.,ITO M., MIYAKE J. Stabilization of Iiposomal membranes by carotenoids: zeaxanthin,zeaxanthinglucoside and thermozeaxanthin. Material Science and Engineering C. 28:274-279, 2008) demonstraram estabilização de membranas Iipossomais por outroscarotenóides, a zeaxantina e seus derivados numa mistura com lipídios classicamenteutilizados como dipalmitoil fostatidilcolina (DPPC), enquanto que na presente invenção,não foi utilizado qualquer tipo de lipídio ou outro componente com suposta funçãoestabilizadora de membrana.
A aplicação de vesículas de bixina ou outros carotenóides está intimamenteligada à incorporação de componentes como os óleos essenciais em seu interior, bemcomo, à incorporação de outros adjuvantes de difícil dispersão nas formulações, comofármacos insolúveis em água como a anfotericina B e miconazol e outros de difícilmanipulação como antineoplásicos, radiofármacos, hormônios, vacinas. Em todos oscasos, são observados além do custo, a redução na dosagem aplicada ao paciente,uma vez que a entrega da droga ao sítio de ação deve ser mais eficiente, reduzindotambém os possíveis efeitos colaterais inerentes ao fármaco carreado. Os carotenóidesprestam-se também ao efeito estético, dando coloração ou efeito de partículas dispersasnas formulações, conforme tamanho e concentrações a serem introduzidas nasformulações. A grande vantagem é que elementos como óleos essenciais podempermanecer mais tempo nas vesículas e ter efeito mais duradouro na formulação devidoa este efeito "protetor", de confinamento, dificultando evaporação dos compostos ativos.
As vesículas de bixina também podem ser utilizadas em formulações"antienvelhecimento" como incorporar compostos considerados antioxidantes, protetoressolares, etc., devido à molécula da bixina poder ser mais ávida por radicais livres e ser"atacada" antes que as substâncias incorporadas em seu interior sejam atingidastambém, pois a molécula da presente invenção apresenta características que facilitamsua oxidação (duplas ligações) ou degradação (por radiação ultravioleta). O fato dasinterações hidrofóbicas serem mais intensas explica também o tipo de interação entre ofármaco anfotericina B, citado como preferencial quando carreado, e as moléculas debixina, explicitando que não são apenas partículas positivas que possam interagir commembranas de carga negativa. Portanto, característica que poderia ser desvantajosapode ser utilizada como uma vantagem em certas formulações.
Nas áreas médica e farmacêutica, as formulações de bixina e/ou norbixina (comfármacos incorporados) podem ser mobilizadas nas superfícies de equipos médicos.
Dessa forma, de acordo com a presente invenção, as vesículas lipídicas decarotenóides apresentam três funções, uma função carreadora, na qual a vesícula atuacomo carreadora de componentes em seu interior, como por exemplo, óleos essenciais,corantes, fármacos, ácidos nucléicos, antineoplásicos, radiofármacos, vacinas,anticorpos, preferencialmente o fármaco anfotericina B, produzindo uma atividade depotencializar o efeito seja ele efeito químico, físico, biológico, farmacológico, etc, docomponente carreado; uma função de princípio ativo, na qual a vesícula por si tem umaação que produz uma atividade como atividade antimicrobiana, preferencialmente sobrebactérias Gram negativas e Gram positivas, antitumoral, antibiótica, antilipidêmica,antioxidante, antiinflamatória, antiglicemiante; e uma função carreadora e de princípioativo concomitantemente. As três funções desempenhadas pelas vesículas são muitoimportantes, pois artigos citam tais atividades utilizando a bixina solubilizada emsolventes apolares e não na forma de vesículas.
A presente invenção trata ainda de uma composição farmacêutica que empregavesículas lipídicas de carotenóides como parte integrante dessa composição. Asvesículas lipídicas de carotenóides são constituídas em maior proporção decarotenóides. Esses carotenóides são selecionados entre bixina, zeaxantina, luteína,criptoxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno, preferencialmente bixina. A composiçãoemprega ainda conservante, fragrância, umectante, emoliente, espessante, outrosativos. Essa composição compreende a seguinte fórmula farmacêutica e as faixaspreferenciais, de acordo com a invenção, que estão descritas abaixo na Tabela 1:
<table>table see original document page 11</column></row><table>TABELA 1
A presente invenção contempla ainda um processo de preparação de vesículaslipídicas de carotenóides em que ditos carotenóides representam a maior proporçãomolar da constituição da bicamada vesicular. Esses carotenóides podem ser escolhidosentre bixina, zeaxantina, Iuteina1 criptoxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno, etc., sendopreferencialmente bixina. As vesículas lipídicas de carotenóides podem se apresentarcomo estruturas unilamelares ou multilamelares.
Para o processo de preparação de estruturas vesiculares de bixina, foi exploradaa sua solubilidade em etanol à temperatura ambiente e posterior adição à água, gota agota, sob agitação por turbilhonamento ou com auxílio de barras magnéticas também àtemperatura ambiente, permitindo estabilização das estruturas pelas interações dasmoléculas de água com porção polar das moléculas de bixina. A organização emformato de vesículas esféricas é devida também pelas interações hidrofóbicas entre ascadeias longas apolares das moléculas da própria bixina.
O processo emprega também técnicas selecionadas entre sonicação, injeção desolvente orgânico, extrusão, solubilização em solventes apolares com evaporação,dispersão da camada seca com outros solventes hidrossolúveis ou aquosos,mobilização dos carotenóides em superfícies de nano partículas, preferencialmente atécnica de injeção de solvente orgânico, além de outros métodos conhecidos na área depreparação de lipossomos.
O processo básico de preparação das vesículas lipídicas apresenta as seguintesetapas:
a. solubilização do carotenóide em solvente orgânico;
b. adição de solução obtida na etapa (a) em água, gota a gota, sob agitação;
c. obtenção da vesícula lipídica de carotenóide.
Segundo a presente invenção, o processo mencionado acima pode conter aindaetapas intermediárias de acordo com a solubilidade dos componentes a seremcarreados. Quando o componente a ser carreado for insolúvel em água, o processo depreparação das vesículas lipídicas apresenta as seguintes etapas:
a. solubilização do carotenóide em solvente orgânico;
b. solubilização em solvente orgânico de componentes insolúveis em água aserem carreados;
c. mistura da solução obtida na etapa (a) com a solução obtida na etapa (b);
d. adição da solução obtida na etapa (c) em água, gota a gota, sob agitação;
e. obtenção da vesícula lipídica de carotenóide.Quando o componente a ser carreado for solúvel em água, o processo depreparação das vesículas lipídicas apresenta as seguintes etapas:
a. solubilização do carotenóide em solvente orgânico;
b. solubilização em água ou solvente aquoso de componentes solúveis emágua a serem carreados;
c. mistura da solução obtida na etapa (a), gota a gota, à solução obtida naetapa (b), sob agitação;
d. obtenção da vesícula Iipidica de carotenóide.
Os componentes a serem carreados pela vesícula podem ser óleos essenciais,corantes, fármacos, ácidos nucléicos, anticorpos, antineoplásicos, radiofármacos,vacinas e adjuvantes, preferencialmente o fármaco anfotericina B.
De acordo com os processos de preparação, o solvente orgânico utilizado foiselecionado entre clorofórmio, dimetilsulfóxido, éter, alcoóis como etanol e metanol,preferencialmente o etanol, na concentração preferencial de 20%. O etanol foi osolvente utilizado para o processo, pois além de ser um solvente barato, possui baixatoxicidade, e é facilmente eliminado da preparação por processo diálise ou evaporação.
A preparação de bixina da presente invenção foi baseada na técnica depreparação de Iipossomos a partir de injeção em soluções aquosas de preparaçõesprévias de lipídios em solventes orgânicos. Todas as operações mencionadas noprocesso podem ser realizadas à temperatura ambiente e não necessitam que ocarotenóide atinja o seu ponto de fusão, 198 0C, algo que seria necessário empreparações do tipo vortexação com subseqüentes passagens por membranas filtrantescom nanoporos, o que encareceria o custo da preparação. Possíveis resquícios deetanol, utilizado na primeira solubilização de bixina, podem ser eliminados por diálisesimples por membranas de celulose, utilizando água como meio coletor.
Os processos de preparação das vesículas lipídicas de carotenóides e aincorporação de drogas podem ser realizados em ambiente com controle decontaminação. Opcionalmente, o produto final pode passar por processo deesterilização por meio de membranas filtrantes este ri Iizantes de acordo com o tamanhodas vesículas formadas e de forma seletiva.
A presente invenção trata também do uso de vesículas lipídicas de carotenóidesnas áreas farmacêutica, cosmética, veterinária, biotecnológica, odontológica,oncológica, radiofarmacêutica, agronômica, de terapia gênica, alimentícia, comocarreadora de óleos essenciais, corantes, fármacos, ácidos nucléicos, anticorposantineoplásicos, radiofármacos, vacinas, e outros adjuvantes e uso "per si" comoprincípio ativo em composições farmacêuticas, veterinárias, cosméticas,biotecnológicas, odontológicas, médicas, oncológicas, radiofarmacêuticas, agronômicas,para terapias gênicas.
A seguir, exemplos para melhor ilustrar a invenção, contudo estes não possuemo intuito de restringir a invenção aqui descrita.
EXEMPLOS
O corante bixina obtido do urucum (Bixa orellana L.) foi utilizado paradesenvolvimento de uma preparação Iipossomal e a anfotericina B foi o fármaco modelopara incorporação neste sistema. Foram realizados ensaios in vitro para demonstrareficácia deste novo sistema a partir de caroteno de origem natural, enquanto Iipossomostradicionais utilizam lipídios (não carotenóides) ora sintéticos ora naturais. Resultadosmostraram eficácia na inibição de Candida albicans, bem como, desempenho melhorque produtos comerciais como Ambisome e Amphocil.
1. Materiais e métodos
Matérias-primas de bixina, norbixina e anfotericina B foram obtidas do mercado eensaios para determinação de pureza e teor também foram realizados. Demaisreagentes utilizados foram todos de grau analítico. Ambisome® e Amphocil® foramobtidas do mercado. O microrganismo Candida albicans ATCC 10231 foi obtido dacoleção do Instituto Adolfo Lutz. Meios de cultura Sabouraud Dextrose Agar e meio n°19, foram da marca Difco. Todos os materiais foram esterilizados por autoclavação,calor seco ou filtração por membrana esterilizante.
Preparação de Iipossomos de bixina
Quantidade suficiente de bixina foi pesada e solubilizada diretamente em etanolpara preparar solução a 5 mM (BX-ETOH). Material foi filtrado por papel de filtro eadicionado, com agitação e gota a gota em água na proporção de 1:10 para obtençãode dispersão a 0,5 mM.
Preparação de anfotericina B
Foi preparada solução estoque de anfotericina B pela solubilização direta emdimetilsulfóxido (DMSO), isto é, 10.000 pg de ingrediente ativo/mL (solução ANFO-DMSO) e seguida de diluição de 10 vezes em etanol (solução ANFO-ETOH).
i) Preparo de dispersão em solução tampão B10 (fosfato)
Foram preparadas dispersões contendo 10 pg/mL e 20 pg/mL de anfotericina Bem solução tampão n° 10, pela diluição da solução ANFO-ETOH diretamente emtampão. A solução tampão n° 10 corresponde à solução de fosfato de potássio 0,2 M,pH 10,5 e constante na The United States Pharmacopeia 32. United StatesPharmacopeial Convention. Rockville, vol. 1,p. 88, 2009.
ii) Preparo de anfotericina IipossomalVolumes adequados das soluções de ANFO-ETOH e BX-ETOH forammisturados para obtenção de preparações 10 vezes mais concentradas que a desejada.Desta, foram adicionados e sob agitação, gota a gota em água na proporção de 1:10. Apartir desta última preparação, pode-se fazer diluições seriadas em água ou outrodiluente aquoso sem perdas das características das estruturas obtidas.
Preparação dos produtos comerciais
Tanto Ambisome como Amphocil foram reconstituídos com água erealizadas diluições adequadas com o mesmo diluente para obter concentrações finaisde 10 e 20 pg/mL de ingrediente ativo.
Preparação de Candida albicans
Uma alçada de cerca de 1 μί do microrganismo foi transferida para superfície deágar do meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar e deixada em incubação a 30 0C por48 horas. No dia do ensaio, a superfície com microrganismos foi lavada com 5 mL desolução salina a 0,9% e 1 mL da suspensão foi transferida para 99 mL de meio decultura n° 19. Um volume de 8 mL do meio inoculado foi transferido para placas de Petrie deixadas para solidificar. Templates de aço inox foram transferidos para a superfíciede cada uma destas placas de Petri imediatamente antes de aplicar as amostras.
Em cada orifício dos templates, foram aplicados 50 pL de cada amostra edeixados por 2 horas em repouso à temperatura ambiente, antes de submeter àincubação a 30 0C por 24-48 horas e então, fazer leitura dos halos de inibição.
Estatística
Para os ensaios, foram utilizados número de réplicas n=10 e pelo menos 3 testesindependentes. Os valores apresentados são valores médios e análise estatística foiaplicada pela análise de variância (ANOVA). Os valores médios foram consideradossignificativamente diferentes para P<0,05.
2. Avaliação de atividade antimicrobiana de bixina e norbixina
Preparação de Iipossomos de bixina
Dispersões de bixina foram preparadas conforme descrito anteriormente nasconcentrações de 0,1 a 1,0 mM, sendo que amostras mais diluídas foram preparadaspor diluição em água a partir da preparação a 1,0 mM.
Preparação de solução de norbixina
Soluções de Norbixina foram preparadas por simples solubilização em água nasconcentrações variando de 0,1 a 1,0 mM, sendo que amostras mais diluídas forampreparadas por diluição em água a partir da preparação a 1,0 mM.
Preparação de inóculos de bactérias
Foram desafiados os microrganismos citados na farmacopéia americana (USPXXXII): Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escheriehia eoli ATCC 8739, Pseudomonasaeruginosa ATCC 9027.
Uma alçada de cerca de 1 μΙ_ de cada microrganismo foi transferida parasuperfície de ágar do meio de cultura Tryptic Soy Agar (TSA) e deixada em incubação a35 °C por 24 horas. No dia do ensaio, a superfície com microrganismos foi lavada com 5mL de solução salina a 0,9% e 1 mLda suspensão foi transferida para 99 ml_ de soluçãosalina a 0,9%. Foi feita contagem de cada suspensão por diluições seriadas em tuboscontendo 9 mL de salina (diluição até 10-8). Cada 1 mL das 3 últimas diluições foramplaqueadas em duplicata.
Determinação da atividade antimicrobiana
Cada preparação de bixina e norbixina na quantidade de 9 mL foi deixada eminteração com 1 mL de cada inóculo por uma hora à temperatura ambiente. Após esteperíodo, 1 mL de cada amostra foi transferida para placa de Petri (em triplicata). Umvolume de 15 mL de meio Tryptic Soy Agar (TSA) foi adicionado para cada uma dasplacas e homogeneizado. Após solidificação, cada amostra foi levada à incubação a 35cC e a contagem realizada após 48 horas.
2. Resultados e discussão
O uso de carotenóides tem sido amplamente explorado nas indústrias alimentíciae cosmética como agentes corantes e em alguns casos, como na Agropecuária ePiscicultura, como suplemento alimentar. Devido à natureza apoiar de muitoscarotenóides, artigos acadêmicos têm explorado o seu transporte por sistemas decarreamento conhecidos como nanopartículas, entre os quais, Iipossomos e outrossistemas coloidais. Não foram encontrados trabalhos utilizando bixina e norbixina, oscarotenóides alvos deste trabalho, com a função de carreadores, porém, algunstrabalhos citam como ingrediente ativo para ser carreado por sistemas tradicionais comoIipossomos (SOCACIU C., LAUSCH C., DIEHL H.A. Carotenoids in DPPC vesicles:membrane dynamics. Spectroehimica Aeta PartA 55: 2289-2297, 1999).
Bixina foi solubilizada em etanol e em seguida, adicionada gota a gota em água,produzindo estruturas vesiculares, como pode ser comprovada pelas Figuras 2 (A e B)e 3 (A e B). Na Figura 2 A observa-se o interior do microscópio onde foram aplicadasas lâminas de silício com as amostras e na Figura 2 B observa-se as vesículas debixina sobre lâmina de silício. Na Figura 3 observa-se vesículas de bixina sobmicroscopia eletrônica de varredura, onde em A observa-se as vesículas vazias, e em Bas vesículas de bixina com o fármaco anfotericina B. Essas são imagens obtidas pormicroscopia eletrônica de varredura. Uma gota equivalente a um volume de cerca de100 μl foi aplicada diretamente sobre a superfície de uma lâmina de silício e levada aomicroscópio e as amostras foram observadas sob vácuo. O tamanho das partículas semo fármaco foi medido no aparelho ZetaPIus Zeta_Potential Analyzer (BrookhavenInstruments Co.), equipado com laser de 570 nm e ângulo luminoso de 90° e apresentoudiâmetro médio de 151,9 ± 0,9 nm (Figura 4) e Potencial Zeta de -14,30 ± 0,95 mV, umpotencial negativo conforme esperado devido à natureza aniônica do carotenóide. AFigura 4 ilustra a distribuição por tamanho das vesículas de bixina em nanômetros.
Anfotericina B foi o fármaco de escolha para avaliar a capacidade deincorporação de drogas não solúveis em água nas vesículas de bixina. A anfotericina Bapresenta comportamento anfifílico devido às porções apoiar e polar do anel lactônico ecomportamento anfotérico devido à presença de grupos carboxila e aminas ionizáveis,tornando o composto pouco solúvel em solventes aquosos. A carga negativa da bixinapode interagir com o grupo amino positivo da anfotericina B formando um complexo e aestabilidade sendo reforçada pelas interações hidrofóbicas entre as porções apolaresdos compostos.
O espectro óptico (Figura 5) foi obtido para caracterizar a agregação daanfotericina B na formulação de bixina. Foi utilizado espectrofotômetro Thermo Electron,modelo Nicolet Evolution 100, na região de 300 a 450 nm. O espectro foi obtido àtemperatura ambiente (25 °C) no tempo máximo de até 1 hora após preparação dasformulações. Na Figura 5 A, o espectro típico de anfotericina B solubilizada no seumelhor solvente, isto é, DMSO e Metanol, enquanto na Figura 5 B, um espectrocaracterístico do fármaco nas vesículas lipídicas como aqueles obtidos por Fujii et al(FUJII G., CHANG J.AE., COLEY T., STEERE B. The formation of Amphotericin B ionchannels in Iipid bilayers. Biochemistry. 36: 4959-4968, 1997) que utilizaramfosfatidilcolina (HSPC), colesterol (ChoI) e diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG).
Diferente do artigo de Silva et al (SILVA C.R., ANTUNES L.M.G., BIANCHIM.L.P. Antioxidant action of bixin against cisplatin-induced chromosome aberrations andIipid peroxidation in rats. Pharmacological Research. 43(6): 561-566, 2001), não foipossível dissolver bixina em etanol mais água destilada (1:9), mesmo queimediatamente antes dos experimentos. Foi constatado que a norbixina, outro compostoda Bixa orellana, é que é passível de dissolução em solventes aquosos e na misturacitada, apresentando perfis diferentes de formulações com bixina.
Enquanto que a maioria dos pesquisadores tem dispersado bixina em solventesorgânicos, como DMSO, o que limitaria a aplicação em sistemas biológicos, a presenteinvenção mostra a possibilidade e vantagens de formulações aquosas, desde que naforma de vesículas. Apesar da prévia utilização de etanol para solubilização da bixina eposterior mistura em água, a quantidade deste álcool (etanol até 20%) não mostrouinterferência sobre o sistema testado, isto é, não inibiu crescimento de Candidaalbicans.
Os teores de bixina e norbixina foram determinados por espectrofotometria ecomparação com coeficiente de absorção de 2826 em clorofórmio a 470 nm e 3473 emKOH 0,5% a 453 nm, respectivamente, conforme artigo de Tocchini e Mercadante(TOCCHINI L., MERCADANTE A.Z. Extração e determinação, por CLAE, de bixina enorbixina em coloríficos. Ciên. Tecnol. Aliment. 21(3): 310-313, 2001).
Determinação de halo de inibição para C. albicans e comparação com formulaçõescomerciais
Foram avaliadas concentrações de 10 a 20 pg/mL de anfotericina B em bixina0,5 e 1,0 mM. Controles para DMSO e etanol nas proporções utilizadas durante apreparação das formulações foram testadas e não apresentaram formação de halo deinibição. Controles para os carotenóides também foram testadas sem adição de fármacoe também não apresentaram formação de halo de inibição, demonstrando que bixinasozinha não interfere na inibição do halo de inibição. Porém, conforme Figuras 6 e 7,bixina potencializa efeito da anfotericina B, uma vez que este fármaco foi testado apósdiluição em solvente ideal, no caso, DMSO e metanol, seguido de diluição em soluçãotampão de fosfato, conforme preparação da Farmacopéia Americana (The United StatesPharmacopeia 32. United States Pharmacopeial Convention. Rockville, vol. 1,p. 88,2009), onde a Figura 6 ilustra Placa de Petri contendo amostras com seus halos deinibição, onde A é Anfo 20 pg/mL em B-10, B é Anfo 10 pg/mL em BX 0,5 mM, C é Anfo20 pg/mL em BX 0,5 mM, D é Anfo 10 pg/mL em B-10, E é Ambisome 20 pg/mL e F éAmbisome 10 pg/mL, e a Figura 7 ilustra o diâmetro dos halos de inibição em funçãodas amostras de anfotericina B na forma de gráfico. De acordo com essa figura (Fig. 7)observa-se uma comparação entre as preparações de anfotericina B em soluçãotampão de fosfato (Anfo B10), em preparações Iipossomais de bixina (BX) e Ambisome(Figura 7 A) e Amphocil (Figura 7 B).
Foram realizados pelo menos 3 testes independentes e com número de réplicasnão menor que 5. Análises, Tabela 2 (Anexo), mostram que a formulação deanfotericina B e bixina é melhor que anfotericina sozinha (P<0,05) e melhor que asformulações comerciais como Ambisome e Amphocil. Ambisome é a formulaçãocomercial Iipossomal enquanto Amphocil é um complexo com colesterilsulfato de sódio.Estas duas últimas mostraram eficácia na inibição de crescimento da C. albicans,porém, não foram melhores que anfotericina B sozinha em solução tampão. A Tabela 2(Anexo) mostra a comparação entre as preparações de anfotericina e sua significância,segundo análise estatística ANOVA.Tanto na Figura 6 como na Figura 7, observa-se que a anfotericina napreparação Iipossomal de bixina apresenta halo de inibição melhor que os produtoscomerciais e a anfotericina B sozinha. Observa-se também que apesar da formação dohalo, a coloração típica da bixina (Figura 6) não acompanhou o diâmetro do halo.
Assim, é notório que a anfotericina B difundiu-se das vesículas para o meio de ágar,enquanto a vesícula permaneceu no local da aplicação. E ainda, o halo correspondenteao tamanho do orifício do template (cerca de 8 mm), apresenta-se translúcido como nopadrão, demonstrando que não houve crescimento de Candida albicans no local,enquanto se fosse positivo para crescimento, haveria turvação no local, como o foi parao local com aplicação apenas da formulação com bixina sem o fármaco (dado nãomostrado). Portanto, as vesículas de bixina não se difundiram pelo meio de ágar, mas ofármaco pôde ser liberado, o que é esperado numa formulação com eficiente sistema deentrega de droga.
Campanhã et al (CAMPANHA M.T.N., MAMIZUKA E.M., CARMONA-RIBEIROA.M. Interactions between cationic vesicles and Candida albicans. Journal of PhysicalChemistry B. 105: 8230-8236, 2001) e Lincopan et al (LINCOPAN N., MAMIZUKA E.M.,CARMONA-RIBEIRO A.M. In vivo activity of a novel amphotericin B formulation withsynthetic cationic bilayer fragments. J. Antimicrobial Chemotherapy. 52: 412-418, 2003)têm demonstrado eficácia de formulações de anfotericina B em fragmentos de bicamadacatiônica sintética de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e baseado nestasestruturas, a formulação com bixina mostra vantagens por formar vesículas e ser deorigem natural.
A Figura 8 ilustra a Curva de Candida albicans viáveis em função do tempo deinteração com preparações contendo anfotericina B, onde UFC/ml significa unidadesformadoras de colônias por mililitro, (-■-) Anfo_gli que significa anfotericina B emsolução de glicose 5%; (-O-) BX_anfo que significa anfotericina B em vesículas debixina; (-A-) Ambisome significa dispersão aquosa do produto comercial Ambisome; (-V-) Amphocil que significa dispersão aquosa do produto comercial Amphocil. Asconcentrações finais de anfotericina B nas preparações foram às seguintes para osgráficos: (a) 5 pg/mL; (b) 2,5 pg/mL; (c) 1 pg/mL. Nessa figura, observa-se queAnfotericina B quando disperso em solução de glicose a 5% tem a capacidade dediminuir a carga de C. albicans em 7 logs, assim como a formulação do fungicidaincorporado em vesículas de bixina e num tempo de interação de cerca de 2 horas. Asformulações comerciais como Ambisome e Amphocil com concentrações de anfotericinade 1, 2,5 e 5,0 pg/mL não conseguiram debelar totalmente as células da levedura,ocasionando um aumento crescente de células sobreviventes a partir de 18 horas apósinício da interação fungo-fungicida.
Tem-se como perspectiva que os Iipossomos de bixina tornem as formulaçõesmais baratas hoje comercializadas de vários medicamentos, como a anfotericina B quefoi o modelo estudado neste trabalho e cujo custo estimado para o tratamento por dia deum paciente de 70 kg nos Estados Unidos, era de 790 a 1316 dólares com Ambisome(TORRADO J.J., ESPADA R., BALLESTEROS M.P., TORRADO-SANTIGAGO S.Amphotericin B formulations and drug targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences.97(7): 2405-2425, 2008).
Foi avaliada atividade antimicrobiana de cada um dos compostos isoladamente:norbixina (Figura 9 A) e bixina (Figura 9 B), onde cada símbolo representa osmicrorganismos testados, conforme a seguir: (■) S. aureus, (·) E. coli e (A) P.aeruginosa. Assim como muitos artigos citam, norbixina que é o composto solúvel emágua, apresentou atividade antimicrobiana quando interagiu com S. aureus, umabactéria Gram positiva, enquanto os resultados obtidos com as vesículas de bixinaforam os mais surpreendentes. Foi demonstrado que este composto na forma devesículas dispersas em água apresenta atividade antimicrobiana sobre Gram negativostambém, como E. coli e P. aeruginosa, além de ação sobre o S. aureus (Gram positivo),nas concentrações testadas entre 1 e 0,5 mM do composto e de forma melhor ainda,não deixando células viáveis, enquanto norbixina deixou células viáveis residuais, o quedeixa possibilidade de proliferação após um tempo maior com depleção dos princípiosativos.
Observa-se que preparações de norbixina em água não conseguem diminuir acarga de bactérias Gram negativas, como ainda contribuem para crescimento de fungos,demonstrando inocuidade sobre células eucarióticas devido à presença de enzimas dosistema citocromo P450 que permitem a biotransformação em metabólitos inócuos.Portanto, bixina age por outro mecanismo que pode ser por interação das vesículas debixina sobre a membrana das células de bactérias, assim como sugerido por Campanhãet al. (CAMPANHÃ M.T.N., MAMIZUKA E.M., CARMONA-RIBEIRO A.M. Interactionsbetween cationic Iiposomes and bactéria: the physical-chemistry of the bactericidalaction. J. Lipid Res. 40: 1495-1500, 1999), podendo ser por oclusão das purinas ou açãosobre as proteínas de transporte das membranas, não permitindo trocas com o meioextracelular para depuração de metabólitos e/ou entrada de nutrientes, porém, havendoformação de uma camada de vesículas sobre a superfície das bactérias.
3. ConclusãoNa presente invenção, bixina mostrou ser capaz de formar vesículas quandoutilizada técnica de injeção etanólica em água, possibilitando incorporar drogas,inclusive de caráter apoiar como anfotericina B. Quando submetida isolada em teste invitro com Candida albicans, a preparação Iipossomal não apresentou formação de halode inibição, porém, em associação com anfotericina B, permitiu sua liberação einteração com a levedura, promovendo halo de inibição maior (P<0,05) que os produtoscomerciais, como Ambisome e Amphocil, quando foram testadas nas mesmasconcentrações finais do princípio ativo.
As vesículas de bixina apresentaram caráter aniônico, porém, podem se ligareletrostaticamente em regiões catiônicas de outros compostos. Por apresentarem umacadeia longa apoiar como os lipídios utilizados para preparação de lipossomos,permitem interações hidrofóbicas com regiões apolares de outros compostos, comoprincípios ativos de caráter apoiar.
Portanto, o que se pode esperar como alternativa para preparar vesículas debixina ou outros carotenóides semelhantes como zeaxantina, luteína, criptoxantina eoutros com estruturas próximas, é a utilização de um solvente orgânico adequado (depreferência, não tóxico ou que possa ser eliminado posteriormente por técnicas simplescomo diálise, evaporação ou bombeamento de gás inerte como nitrogênio), e depois,ser transferido gota a gota para soluções aquosas.<table>table see original document page 22</column></row><table>
Claims (38)
1. Vesículas lipídicas de carotenóides, caracterizadas por compreender carotenóidesem que ditos carotenóides representam a maior proporção molar da constituição dabicamada vesicular.
2. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 1, caracterizadas pelofato dos carotenóides representarem acima de 10% em proporção molar em relaçãoà constituição da bicamada vesicular.
3. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 1, caracterizadas pelofato dos carotenóides representarem acima de 50% em proporção molar em relaçãoà constituição da bicamada vesicular.
4. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 1, caracterizadas pelofato dos carotenóides serem selecionados entre bixina, zeaxantina, luteína,criptoxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno.
5. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 4, caracterizadas porcompreender preferencialmente bixina.
6. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 1, caracterizadas porapresentar-se sob a forma de lipossomo.
7. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 6, caracterizadas pelofato do lipossomo ser unilamelar ou multilamelar.
8. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicações 6 ou 7,caracterizadas pelo fato do lipossomo apresentar-se no tamanho de 20 nm a 1500nm, preferencialmente entre 100 e 200 nm, mais preferencialmente 151,9 ± 0,9 nm.
9. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 1, caracterizadas porapresentar o carotenóide na concentração de 0,001 a 100 milimolares (mM),preferencialmente entre 0,01 a 10 mM, mais preferencialmente entre 0,01 a 1,0 mMem relação à formulação Iipossomal total.
10. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 5, caracterizadas porapresentar a bixina na concentração de 0,001 a 100 milimolares (mM),preferencialmente entre 0,01 a 10 mM, mais preferencialmente entre 0,01 a 1,0 mMem relação à formulação Iipossomal total.
11. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 1, caracterizadas porapresentar função carreadora de componentes em seu interior.
12. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 1, caracterizadas porapresentar função de princípio ativo.
13. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 1, caracterizadas porapresentar função carreadora e de princípio ativo concomitantemente.
14. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 11, caracterizadas porcompreender componentes em seu interior como óleos essenciais, corantes,fármacos, ácidos nucléicos, antineoplásicos, radiofármacos, vacinas, anticorpos,adjuvantes, entre outros.
15. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 14, caracterizadas porcompreender preferencialmente, fármacos antimicrobianos como a anfotericina B.
16. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 11, caracterizadaspelo fato de apresentar atividade potencializadora do efeito biológico, farmacológico,químico, físico do componente carreado.
17. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 12, caracterizadaspelo fato de apresentar atividade como atividade antimicrobiana, antitumoral,antibiótica, antilipidêmica, antioxidante, antiinflamatória, antiglicemiante, entre outros.
18. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 17, caracterizadaspelo fato de apresentar preferencialmente atividade antimicrobiana, maispreferencialmente sobre bactérias Gram negativas e Gram positivas.
19. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicação 13, caracterizadaspelo fato de apresentar atividade potencializadora do efeito biológico, farmacológico,químico, físico do componente carreado e atividade antimicrobiana, antitumoral,antibiótica, antilipidêmica, antioxidante, antiinflamatória, antiglicemiante, entre outrosconcomitantemente.
20. Vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicações 1 a 19,caracterizadas por compreender opcionalmente carotenóides isolados e únicos,misturas de carotenóides, outros lipídios (carotenóides ou não carotenóides),colesterol, sal de colesterol, fosfolipídios, glicolipídios, lipídios conjugados, outrosligantes.
21. Composição caracterizada por compreender vesículas lipídicas de carotenóides,segundo reivindicações 1 a 20.
22. Composição, segundo reivindicação 21, caracterizada pelo fato das vesículaslipídicas de carotenóides serem compostas por carotenóides em que ditoscarotenóides representam a maior proporção molar em relação à constituição dabicamada vesicular.
23. Composição, segundo reivindicação 22, caracterizada pelo fato dos carotenóidesserem selecionados entre bixina, zeaxantina, luteína, criptoxantina, alfa-caroteno,beta-caroteno.
24. Composição, segundo reivindicação 23, caracterizada pelo fato do carotenóide serpreferencialmente bixina.
25. Composição, segundo reivindicação 22, caracterizada por compreender aindaglicerina, extratos aquosos vegetais, óleo de oliva, estearato de glicerila,carboximetilcelulose, conservante e fragrância.
26. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicações 1 a 20, caracterizado por empregar carotenóides em que ditoscarotenóides representam a maior proporção molar em relação à constituição dabicamada vesicular.
27. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicação 26, caracterizado pelo fato dos carotenóides serem selecionados entrebixina, zeaxantina, luteína, criptoxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno,preferencialmente bixina.
28. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicação 26, caracterizado por empregar técnicas escolhidas entre sonicação,injeção de solvente orgânico, extrusão, solubilização em solventes apolares comevaporação, dispersão da camada seca com outros solventes hidrossolúveis ouaquosos, mobilização dos pigmentos lipossolúveis em superfícies de nano partículas,além de outros métodos.
29. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicação 28, caracterizado pelo fato de empregar, preferencialmente a técnicade injeção de solvente orgânico.
30. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicação 26, caracterizado por compreender as seguintes etapas:a. solubilização do carotenóide em solvente orgânico;b. adição de solução obtida na etapa (a) em água, gota a gota, sobagitação;c. obtenção da vesícula lipídica de carotenóide.
31. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicação 30, caracterizado por compreender as seguintes etapas quando ocomponente a ser carreado for insolúvel em água:a. solubilização do carotenóide em solvente orgânico;b. solubilização de componentes insolúveis em água a serem carreados emsolvente orgânico;c. mistura da solução obtida na etapa (a) com a solução obtida na etapa (b);d. adição da solução obtida na etapa (c) em água, gota a gota, sobagitação;e. obtenção da vesícula lipídica de carotenóide.
32. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicação 30, caracterizado por compreender as seguintes etapas quando ocomponente a ser carreado for solúvel em água:a. solubilização do carotenóide em solvente orgânico;b. solubilização de componentes solúveis em água a serem carreados emágua ou solvente aquoso;c. mistura da solução obtida na etapa (a), gota a gota à solução obtida naetapa (b), sob agitação;d. obtenção da vesícula lipídica de carotenóide.
33. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicações 31 ou 32, caracterizado por compreender componentes a seremcarreados como óleos essenciais, corantes, fármacos, ácidos nucléicos, anticorpos,antineoplásicos, radiofármacos, vacinas, e adjuvantes, preferencialmente o fármacoanfotericina B..
34. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicações 30 a 32, caracterizado pelo fato do solvente orgânico ser clorofórmio,dimetilsulfóxido, éter, alcoóis como etanol e metanol, preferencialmente o etanol.
35. Processo de preparação de vesículas lipídicas de carotenóides, segundoreivindicação 34, caracterizado por empregar preferencialmente o etanol e naconcentração de até 20% da preparação final, sendo recomendável eliminá-lo porprocesso como diálise ou evaporação destes solventes orgânicos.
36. Uso de vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicações de 1 a 35,nas áreas farmacêutica, alimentícia, veterinária, cosmética, de pesquisa básica, debiotecnologia, odontológica, oncológica, radiofarmacêutica, agronômica, de terapiagênica.
37. Uso de vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicações de 1 a 35,como carreadora de óleos essenciais, corantes, fármacos, ácidos nucléicos,anticorpos, antineoplásicos, radiofármacos, vacinas e adjuvantes.
38. Uso de vesículas lipídicas de carotenóides, segundo reivindicações de 1 a 35,como princípio ativo em formulações farmacêuticas, veterinárias, cosméticas,biotecnológicas, odontológicas, oncológicas, radiofarmacêuticas, agronômicas, deterapia gênica.
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