BRPI0902901B1 - bacteriófago e composição antibacteriana, alimento para animais, água potável, desinfetante, agente de limpeza e método para tratamento de doenças infecciosas compreendendo o mesmo - Google Patents

Abstract

BACTERIÓFAGO E COMPOSIÇÃO ANTIBACTERIANA, ALIMENTO PARA ANIMAIS, ÁGUA POTÁVEL, DESINFETANTE, AGENTE DE LIMPEZA E MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS COMPREENDENDO O MESMO. A presente invenção se refere a um novo bacteriófago, mais particularmente, um bacteriófago que tem uma atividade bactericida específica contra Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, ou Salmonella pullorum, a uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas, incluindo salmonelose e intoxicação alimentar por Salmonela causada pela Salmonella typhimurium, febre tifóide causada por Salmonella gallinarum, e diarréia branca bacilar causada por Salmonella pullorum, que compreende o bacteriófago como ingrediente ativo, e a um alimento para animais, água potável, agente de limpeza e desinfetante que compreendem o bacteriófago como ingrediente ativo.

Description

[Campo Técnico]

A presente invenção se refere a um novo bacteriófago, mais particularmente, um bacteriófago que tem uma atividade bactericida específica contra Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, ou Salmonella pullorum, a uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas, incluindo salmonelose e intoxicação alimentar por Salmonella causada pela Salmonella typhimurium, tifo aviário causado por Salmonella gallinarum, e pulurose causada por Salmonella pullorum, que compreende o bacteriófago como ingrediente ativo, e a um alimento para animal, água potável, agente de limpeza e desinfetante que compreendem o bacteriófago como ingrediente ativo.

[Estado da Técnica]

A Salmonella é um gênero da família Enterobacteriaceae, caracterizada como bactérias gram-negativas em forma de bastonetes, facultativamente anaeróbicas, não formadoras de esporos, e a maioria das linhagens se movem por flagelos. A Salmonella tem um teor de GC médio no genoma de 50-52%, que é similar ao da Escherichia coli e da Shigella. O gênero Salmonella é um microorganismo patogênico que provoca infecções em animais de fazenda, assim como em humanos. A Salmonella enterica, uma espécie da bactéria Salmonella, tem uma variedade de sorotipos, incluindo Gallinarum, Pullorum, Typhimurium, Enteritidis, Typhi, Choleraesuis, e derby (Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, Shigella, Salmonella. Em Murry PR, Baron EJ, e col. eds Manual of clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999;467-74 ; Ryan KJ. Ray CG (editores) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9). Delas, a Salmonella Gallinarum e a Pullorum são patógenos adaptados a aves, a Salmonella Typhi é um patógeno adaptado a humanos, a Salmonella Choleraesuis e a derby são patógenos adaptados a suínos, e a Salmonella Enteritis e a Typhimurium são patogênicas tanto para humanos quanto para animais. Cada sorotipo causa uma doença nessa espécie, resultando em sérios efeitos negativos para os criadores ou consumidores.

Uma doença dos pássaros domésticos causada pela bactéria Salmonella é o Tifo Aviário (FT), que é causado por um patógeno, Salmonella Gallinarum (daqui em diante, chamado de TA). O Tifo Aviário (FT) é uma doença septicêmico de pássaros domésticos, como galinhas e perus, e o desenvolvimento pode ser agudo ou crônico, com alta mortalidade. Recentemente, foi divulgado que o Tifo Aviário ocorre com frequência na Europa, América do Sul, África e no Sudeste Asiático, e sua incidência vem aumentando. Surtos do TA na Coréia vêm sendo registrados desde 1992 e as perdas econômicas causadas pela TA em galinhas poedeiras marrons são muito sérias (Kwon Yong-

Kook. 2000 annual report on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research & Quarantine Service. Março de 2001; Kim Ae-Ran e col., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent 5 stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347-353).

A pulurose também é causada por uma das bactérias Salmonella, a Salmonella Pullorum (daqui em diante chamada de SP). A pulurose ocorre em qualquer idade ou temporada, mas as galinhas mais jovens são particularmente io suscetíveis à doença. Durante o século passado, a pulurose como infecção transmitida pelo ovo afetou gravemente galinhas jovens com 1-2 semanas de idade ou mais jovens no mundo e na Coréia. Na década de 80, a ocorrência da doença diminuiu bastante. No entanto, a incidência voltou a aumentar na metade da década de 15 90 (Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research & Quarantine Service. March, 2001; Kim Ae-Ran e col., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 20 3 47-3 53).

Na Coréia, surtos de Tifo Aviário e Pulurose têm ocorrido com cada vez mais frequência desde a década de 90, causando prejuízos econômicos aos criadores. Por essa razão, uma vacina com SG atenuada viva vem sendo usada em frangos 25 para a prevenção do Tifo Aviário desde 2004 (Kim Ae-Ran e col., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347-353), ainda que sua eficácia seja duvidosa, e a vacina viva não possa ser usada em galinhas poedeiras por causa do risco de infecções transmitidas pelo ovo. Infelizmente, ainda não há estratégias preventivas comercialmente disponíveis contra a Pulurose, ao contrário do Tifo Aviário. Sendo assim, há uma necessidade urgente de novas formas de prevenção do Tifo Aviário e da Pulurose.

No entanto, a Salmonella Typhimurium (daqui em diante designada como ST) é um patógeno zoonótico que não apresenta especificidade pelo hospedeiro, ao contrário da SG ou da SP (Zoobises Report; Reino Unido 2003).

A ST é uma causa da salmonelose em aves, porcos e bovinos, etc. A salmonelose é provocada por bactérias Salmonella, uma infecção crônica ou aguda do trato digestivo em animais de fazenda, sendo seus principais sintomas febre, enterite e septicemia, ocasionalmente pneumonia, artrite, aborto, e mastite. A salmonelose ocorre em todo o mundo, e mais frequentemente durante os meses do verão (T.R. Callaway e col. Gastrointestinal microbial ecology and the safety of our food supply as related to Salmonella. J Anim Sci 2008.86:E163-E172). Em bovinos, sintomas típicos incluem perda de apetite, febre, diarréia marrom escura ou evacuação mucosa com sangue. A infecção aguda em calbos leva à morte rápida, e a infecção durante a gravidez leva à morte fetal devido à septicemia, resultando no aborto prematuro (www.livestock.co.kr). Em porcos, a salmonelose é caracterizada clinicamente por três síndromes principais - septicemia aguda, enterite aguda e enterite crônica. A septicemia aguda ocorre em porcos jovens com 2~4 meses de idade, e a morte geralmente ocorre dentro de 2~4 dias após o aparecimento dos sintomas. A enterite aguda ocorre durante o período de engordamento, e é acompanhada de diarréia, febre alta, pneumonia e sinais nervosos. A descoloração da pele pode ocorrer em alguns casos graves. A enterite crônica é acompanhada de diarréia contínua (www.livestock.co.kr).

Após ocorrer um surto de salmonelose em aves, porcos e bovinos, é difícil pará-lo com agentes terapêuticos. As razões são que a bactéria Salmonella apresenta forte resistência a vários fármacos e vive em células que são impermeáveis a antibióticos. Até agora, não existem métodos para tratamento eficaz da salmonelose provocada pela ST, incluindo antibióticos (www.lhca.or.kr).

Além dos animais de fazenda, a ST provoca infecções em humanos via produtos derivados de animais, levando à contaminação alimentar com salmonella. O consumo de produtos de origem animal infectados mal cozinhados (por exemplo, produtos derivados de carne, produtos derivados de aves, ovos e derivados) é uma causa da infecção humana. A contaminação alimentar por salmonela em humanos geralmente envolve o surgimento imediato de dor de cabeça, febre, dor abdominal, diarréia, náuseas e vômito. Os sintomas normalmente aparecem dentro de 6 a 72 horas após a ingestão do organismo, e podem persistir por até 4-7 dias ou até mesmo mais (NSW+HEALTH. 2008.01.14.).

De acordo com um relatório da CDC (The Centers for Disease Control and Prevention, EUA), 16% dos surtos de intoxicação alimentar humana entre 2005 e 2008 foram atribuídos à bactéria Salmonella, e 18% delas à ST {Salmonella Typhimurium). Com respeito à intoxicação alimentar com salmonella em humanos entre 1973 e 1984, os veículos alimentícios envolvidos na transmissão foram, ao que consta, frango (5%), bife (19%), carne de porco (7%), laticínios (6%) e carne de peru (9%). Entr 1974 e 1984, o teste de contaminação bacteriana em frangos durante o processo de abate apresentou 35% ou mais de incidência de salmonella. Em 1983, a salmonella foi isolada em 50,6% dos frangos, 68,8% dos perus, 60% dos gansos, 11,6% dos porcos e 1,5% dos bifes. Além disso, um estudo realizado em 2007 divulou que a salmonella foi encontrada em 5,5% das carnes cruas de ave e 1,1% das carnes cruas de porco. Em particular, foi revelado que a ST normalmente provinha de carne de porco, carne de ave e bife contaminados (www.cdc.gov (Centers for Disease Control and Prevention (CDC)). Uma avaliação de risco realizada pela FAO e pela WHO em 2002 observou que a incidência humana da salmonelose transmitida por ovos e carne de aves parecia ter uma relação linear com a prevalência observada da Salmonella em aves. Isso sugere que, reduzindo-se a prevalência da Salmonella em aves, a incidência da salmonelose em humanos cairia de modo correspondente (Salmonella control at the source; World Health Organization. International Food Safety Authorities Network (INFOSAN) Information Note No. 03/2007). Recentemente, temores acerca da segurança alimentar foram impulsionados pelos surtos de salmonella de produtos variados como amendoins, espinafre, tomates, pistaches, pimentas, e, mais recentemente, massa de cookie (Jane Black and Ed O’Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8, 2009).

Por essas razões, as infecções com Salmonella devem ser relatadas na Alemanha (§6 e §7 da lei Alemã sobre prevenção de doenças infecciosas, Infektionsschutzgesetz). Entre 1990 e 2005, o número de casos registrados oficialmente diminuiu de aproximadamente 200.00 casos para aproximadamente 50.000. Estima-se que, a cada cinco pessoas na Alemanha, uma seja portadora da Salmonella. Nos EUA, há aproximadamente 40.000 casos de infecção por Salmonella relatados todo ano (en.wikipedia.org/wiki/Salmonella#cite note-2).

Portanto, há uma necessidade urgente de controlar a ST, que provoca a salmonelose em animais e humanos. Os esforços colaborativos da USD A e da FDA levaram ao desenvolvimento de uma série de estratégias eficazes para a prevenção da salmonelose, que causa aproximadamente 1 milhão de casos de doenças de origem alimentar nos Estados Unidos. Na Dinamarca, estimativas conservadoras de uma análise de custo— benefício comparando os custos de controle da Salmonella no setor de produção com os custos gerais de saúde pública da salmonela indicam que as medidas de controle da Salmonella fizeram com que a sociedade Dinamarquesa economizasse US$ 14,1 milhões no ano de 2001 ((Salmonella control at the source. World Health Organization. International Food Safety Authorities Network(INFOSAN) Information Note No. 03/2007).

Um bacteriófago é um tipo especial de vírus que apenas infecta e destrói bactérias, e é capaz de auto-replicação apenas dentro de uma bactéria hospedeira. Um bacteriófago consiste de material genético sendo DNA ou RNA de fita simples ou dupla envolvido por uma cápsula protéica. Há três formas básicas estruturais de bacteriófagos: uma cabeça icosaédrica (com vinte faces) com uma cauda, uma cabeça icosaédrica sem uma cauda, e uma forma filamentosa. Os bacteriófagos são classificados com base em sua estrutura morfológica e seu material genético. Baseado em sua estrutura de cauda, os bacteriófagos contendo uma cabeça icosaédrica e fita dupla, DNA linear como seu material genético são divididos em três famílias: Myoviridae, Siphoviridae, e Podoviridae que são caracterizadas por caudas contráteis, longa não-contráteis e curtas não-contráteís, respectivamente. Os bacteriófagos contendo uma cabeça icosaédrica sem uma cauda e RNA ou DNA como seu material genético são divididos com base em seu formato de cabeça e componentes, e a presença de uma cápsula. Os bacteriófagos filamentosos tendo DNA como seu material genético são divididos com base em seu tamanho, forma, cápsula, e componentes de filamentos (H.W. Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter e col. Bacteriophages biology and application; CRC press).

Durante a infecção, um bacteriófago se liga a uma bactéria e insere seu material genético dentro das célula. Após isso, um bacteriófago segue um dentre dois ciclos de vida, lítico ou lisogênico. Os bacteriófagos líticos assumem o controle do mecanismo da célula para produzir componentes de fagos. Eles então destroem ou provocam a lise da célula liberando novas partículas de fagos. Os bacteriófagos lisogênicos incorporam seu ácido nucléico no cromossomo da células hospedeira e se replicam com ele como uma unidade, sem destruir a célula. Sob certas condições, os fagos lisogênicos podem ser induzidos a seguirem um ciclo lítico (Elizabeth Kutter e col. Bacteriophages biology and application. CRC press).

Após a descoberta dos bacteriófagos, apostou-se fortemente no seu uso para a terapia de doenças infecciosas. No entanto, quando os antibióticos de amplo espectro entraram em uso comum, os bacteriófagos foram vistos como desnecessários por terem um espectro alvo específico. Contudo, o uso impróprio e excessivo dos antibióticos resultou no aumento das preocupações sobre a resistência aos antibióticos e os efeitos nocivos dos antibióticos residuais em alimentos (Cislo, M e col. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183; Kim sung-hun e col.,

Bacteriophage; New Alternative Antibiotics, biological research information center, BRIC). Em particular, os promotores de crescimento antimicrobianos (AGPs), adicionado à ração animal para melhorar o crescimento, são conhecidos por induzirem resistência a antibióticos, e, portanto, recentemente foi introduzida a proibição do uso dos AGPs. Na União Européia, o uso de todos os promotores de crescimento antimicrobiano (AGPs) foi banido desde 2006. A Coréia proibiu o uso de alguns AGPs em 2009, e está considerando restrições sobre o uso de todos os AGPs em meados de 2013-2015.

Essas preocupações crescentes acerca do uso de antibióticos levou ao ressurgimento do interesse em bacteriófagos como uma alternativa aos antibióticos. 7 bacteriófagos para controle daE.co/z O157:H são revelados na Patente US 6,485,902 (requerida em 2002 - Use of bacteriophages for control of Escherichia coli 0157). 2 bacteriófagos para controle de vários microorganismos são revelados na Patente US 6,942,858 (requerida por Nymox em 2005). Muitas empresas vêm trabalhando energicamente no desenvolvimento de vários produtos usando bacteriófagos. O sistema de alimentos EBI (Europa) desenvolveu um aditivo alimentar para prevenir a intoxicação alimentar causada pelos monocitogenes da Listéria, denominados Listex-P100, que é o primeiro produto bacteriófago aprovado pela US FDA. Um produto baseado em fagos, LMP- 102, também foi desenvolvido como um aditivo alimentar contra os monocitogenes da Listéria, aprovado como GRAS (em geral considerado seguro). Em 2007, um enxágue baseado em fago produzido pela OmniLytics foi desenvolvido para prevenir a contaminação por E.coli 0157 do bife durante o abate, aprovado pela Food Safety and Inspection Service (FSIS) da USDA. Na Europa, o fago NCIMB 30008 de Clostridium sporogenes e o fago NCIMB 30008 de Clostridium tyrobutiricum foram registrados como um conservante de alimentos contra a contaminação por Clostridium de alimentos em 2003 e 2005, respectivamente. Tais estudos mostram que a pesquisa sobre bacteriófagos para uso como antibióticos contra patógenos zoonóticos em produtos de origem animal está atualmente em andamento.

No entanto, a maioria dos estudos de biocontrole de fagos têm se focado no controle da E.coli, Listeria, e Clostridium. A salmonela é também um patógeno zoonótico, e os danos causados por esse patógeno são simbólicos. Como mencionado acima, visto que a ST tem uma resistência a múltiplos fármacos, um teste de resistência antimicrobiano a nível nacional foi realizado na Coréia sob um Decreto de Execução da Lei de Prevenção de Doenças Contagiosas (Ordem Executiva 16961), um regulamento de Execução da Lei de Prevenção de Doenças Contagiosas (Ministry of Health and Welfare’s Order 179), e a Organização do Instituto Nacional de Saúde (Ordem Executiva 17164). Logo, há a necessidade de desenvolver bacteriófagos para controle da Salmonela.

[Revelação] [Problema Técnico]

De modo a solucionar os problemas, incluindo a resistência ao antibiótico devido ao uso incorreto ou abusivo dos antibióticos, os efeitos nocivos dos antibióticos residuais em alimentos, e os problemas gerados pelo uso de antibióticos de amplo espectro, os presentes inventores isolaram, a partir de fontes naturais, um novo bacteriófago de Salmonella tendo uma atividade bactericida específica contra a Salmonella, que causa as principais doenças em animais de fazendo, e identificaram suas propriedades morfológicas, bioquímicas e genéticas. Os presentes inventores descobriram que o bacteriófago tem uma atividade bactericida específica contra a Salmonella typhimurium (SR), Salmonella gallinarum (SG) e a Salmonella pullorum (SP) sem afetar as bactérias benéficas, e excelente resistência a ácido, calor e ambiente seco, podendo assim ser aplicado às composições que podem ser usadas para a prevenção ou tratamento da salmonelose animal causada pela Salmonella typhimurium, intoxicação alimentar por Salmonella causada por produtos contaminados de origem animal, e doenças infecciosas causadas pela Salmonella gallinarum ou Salmonella pullorum, em particular, Tifo Aviário, tal como aditivo de ração animal e água potável para animais, desinfetantes para celeiros, e agentes de limpeza para produtos derivados de carne, consumando assim a presente invenção.

[Solução Técnica]

A presente invenção tem por objetivo oferecer um novo bacteriófago tendo atividade bactericida contra Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum ou Salmonella pullorum.

Outro objetivo da presente invenção é oferecer uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum ou Salmonella pullorum, compreendendo o bacteriófago como ingrediente ativo, em particular, uma composição para a prevenção ou tratamento das doenças infecciosas que é usada como antibiótico.

Ainda outro objetivo da presente invenção é oferecer uma ração animal e água potável compreendendo o bacteriófago como ingrediente ativo.

Ainda outro objetivo da presente invenção é oferecer um desinfetante e agente de limpeza, compreendendo o bacteriófago como ingrediente ativo.

Ainda outro objetivo da presente invenção é oferecer um método para prevenção ou tratamento da salmonelose animal causada pela Salmonella typhimurium ou a intoxicação alimentar por Salmonella causada por produtos de origem animal contaminados, usando a composição que compreende o bacteriófago como ingrediente ativo.

Ainda outro objetivo da presente invenção é o de oferecer um método para prevenção ou tratamento de doenças infecciosas, Tifo Aviário ou Pulurose causados Salmonella gallinarum e pela Salmonella pullorum.

[Efeitos Vantajosos]

O novo bacteriófago da presente invenção tem uma atividade bactericida específica contra Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, e Salmonella pullorum, e excelente resistência a ácido, calor e ambiente seco. Sendo assim, ele pode ser usado na prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella typhimurium. Salmonella gallinarum ou Salmonella pullorum, inclusive da salmonelose, intoxicação alimentar por Salmonella, Tifo Aviário ou Pulurose, e também utilizado no controle da Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum e da Salmonella pullorum. [Descrição dos Desenhos] A FIG. 1 é uma fotografia de microscopia de elétrons de ΦCJ2, em que ΦCJ2 pertence ao morfotipo da família Siphoviridae, caracterizado por pelo capsídio isométrico e pela cauda longa não-contrátil; A FIG. 2 é o resultado do SDS-PAGE do bacteriófago ΦCJ2 isolado, em que os padrões protéicos do bacteriófago são ilustrados, incluindo uma proteína principal de aproximadamente 40 kDa e outras proteínas de aproximadamente 65 kDa, 17 kDa, e 15 kDa (Vide o padrão pré-cortado blue plus 2 prestained (Invitrogen) usado como marcador); A FIG. 3 é o resultado do PFGE do bacteriófago ΦCJ2 isolado, mostrando o tamanho total do genoma de aproximadamente 43 kbp (padrão de tamanho de DNA de 5 kbp (Bio-rad) como marcador de tamanho); A FIG. 4 é o resultado da PCR, realizada usando cada conjunto de iniciadores do DNA genômico de ΦCJ2, em que 5 (A; amplificação PCR usando o conjunto de iniciadores das SEQ ID NOs. 4 e 5, B: amplificação PCR usando o conjunto de iniciadores das SEQ ID NOs. 6 e 7, C; amplificação PCR usando o conjunto de iniciadores das SEQ ID NOs. 8 e 9), cada uma das pistas A, B e C mostra um produto PCR de aproximadamente 1 kbp; io A FIG. 5 é o resultado do teste de resistência a ácido no bacteriófago ΦCJ2, mostrando o número de bacteriófagos sobreviventes ao pH 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,0, e 9,0, em que o bacteriófago ΦCJ2 retém sua infectividade ao pH 2,5, mas perde totalmente sua infectividade 15 ao pH 2,1, se comparado ao controle; A FIG. 6 é o resultado do teste de resistência ao calor no bacteriófago ΦCJ2, mostrando o número de bacteriófagos sobreviventes a 37, 45, 53, 60, 70 e 80°C e um ponto de tempo de 0, 10, 30, 60, 120 min, em que o bacteriófago 20 ΦCJ2 retém sua infectividade mesmo após a incubação a 60°C por 2 horas, mas perde totalmente sua infectividade após incubação a 70°C por 10 min; A FIG. 7 é o resultado do teste de resistência a ambiente seco no bacteriófago ΦCJ2, realizado a 60°C por 120 25 min usando um secador a vácuo (SVD), em que as alterações nos títulos virais antes e após a secagem foram comparadas para examinar a estabilidade relativa, e demonstrou-se que a infectividade do fago não diminui; A FIG. 8 é o resultado de um estudo de toxicidade oral de dose única do ΦCJ2 em ratos, mostrando as alterações no peso corporal (o; grupo controle macho tratado com a solução mista de 20 mM de Tris-HCl e 2 mM MgCl2, •; grupo teste macho tratado com 1 x 10 pfu de ΦCJ2, ■: grupo controle fêmea tratado com a solução mista de 20 mM Tris-HCl e 2 mM de MgCl2, □; grupo teste fêmea tratado com 1 x 10 pfu de ΦCJ2), em que nenhuma alteração significativa no peso corporal foi observada mesmo após 14 dias; e A FIG. 9 é o resultado de um estudo de toxicidade intravenosa de dose única do ΦCJ2 em ratos, mostrando as alterações no peso corporal (o; grupo controle macho tratado com a solução mista de 20 mM de Tris-HCl e 2 mM MgCl2, •; grupo teste macho tratado com 1 x 10 pfu de ΦCJ2, ■; grupo controle fêmea tratado com a solução mista de 20 mM Tris-HCl e 2 mM de MgCl2, □; grupo teste fêmea tratado com 1 x 10 pfu de ΦCJ2), em que nenhuma alteração significativa no peso corporal foi observada mesmo após 14 dias.

[Melhor Modo]

De acordo com um aspecto, a presente invenção se refere a um novo bacteriófago tendo atividade bactericida específica contra Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum ou Salmonella pullorum.

O bacteriófago da presente invenção pertence ao morfotipo da família Siphoviridae, caracterizado pelo capsídeo isométrico e pela cauda não-contrátil, e tem um tamanho de genoma total de 43 kbp e uma proteína estrutural principal com 5 um tamanho de 40 kDa.

Especificamente, o bacteriófago da presente invenção tem a capacidade de infectar seletivamente a Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum e a Salmonella pullorum, a saber a especificidade da espécie. io O bacteriófago da presente invenção geneticamente possui um tamanho de genoma total de 43 kbp, e pode incluir uma ou mais moléculas de ácido nucléico selecionadas dentre o grupo que consiste das SEQ ID NOs. 1, 2 e 3 dentro do genoma inteiro, de preferência moléculas de ácido 15 nucléico representadas pelas SEQ ID NOs. 1 a 4 dentro do genoma inteiro.

Quando o bacteriófago da presente invenção é sujeito à PCR usando um ou mais conjuntos de iniciadores selecionados dentre o grupo que consiste das SEQ ID NOs. 4 e 5, 20 as SEQ ID NOs. 6 e 7, e as SEQ ID NOs. 8 e 9, cada produto da PCR tem um tamanho de aproximadamente 1 kbp. De preferência, quando a PCR é realizada usando todos os conjuntos de iniciadores, cada produto da PCR tem um tamanho de aproximadamente 1 kbp. 25 Como usado aqui, o termo "molécula de ácido nucléico" abrange moléculas de DNA (gDNA e cDNA) e RNA, e o termo nucleotídeo, como a unidade estrutural básica dos ácidos nucléicos, abrange nucleotídeos naturais e análogos de açúcar ou base modificada dos mesmos.

O genoma do bacteriófago da presente invenção 5 codifica uma proteína estrutural principal com tamanho de 40 kDa.

Além disso, o bacteriófago da presente invenção tem as propriedades bioquímicas de resistência a ácido e calor, em que ele pode reter estavelmente sua infectividade em uma ampla io faixa de ambientes de pH, do pH 2,5 ao pH 9,0, e em um ambiente de alta temperatura de 37°C a 60°C. Além disso, o bacteriófago da presente invenção tem resistência ao ambiente seco para manter estavelmente sua infectividade, mesmo após a secagem sob alta temperatura. Tais propriedades de resistência ao 15 ácido, calor e ambiente seco permitem a aplicação do bacteriófago da presente invenção sob várias condições de temperatura e pH na produção de composições profiláticas ou terapêuticas para doenças em animais causadas pela ST, SG e SP ou doenças humanas causadas pelo animal contaminado. 20 Os presentes inventores coletaram amostras residuais em abatedouros de frangos, e isolaram delas o bacteriófago da presente invenção tendo uma atividade bactericida específica contra a ST, SG e SP e as características acima, que foi designado como o Bacteriófago ΦCJ2 e depositado 25 no Korean Culture Center of Microorganisms (361-221, Honje 1,

Sudaemun, Seoul) em 17 de Dezembro de 2008 sob o número de acesso KCCM10976P.

De acordo com o Exemplo específico da presente invenção, os presentes inventores coletaram amostras residuais em abatedouros de galinhas para isolar bacteriófagos que causam a lise da célula hospedeira ST, e eles confirmaram que os bacteriófagos são capazes de causar a lisa da SG e da SP, especificamente (Tabela 1). Além disso, eles examinaram o bacteriófago (ΦCJ2) sob um microscópio eletrônico, e descobriram que ele pertence ao morfotipo da família Siphoviridae (FIG. 1).

Além do mais, os padrões protéicos do bacteriófago ΦCJ2 também foram analisados, revelando uma proteína estrutural maior com um tamanho de aproximadamente 40 kDa (FIG. 2).

Em adição, o tamanho do genoma total do bacteriófago ΦCJ2 também foi analisado, revelando que ele tem um tamanho de genoma total de aproximadamente 43 kbp (FIG. 3). Os resultados da análise dos seus aspectos genéticos mostraram que o bacteriófago inclui sequências de ácido nucléico representadas pelas SEQ ID NOs. 1 a 3 dentro do genoma total (Exemplo 6). Com base nesses resultados, comparou-se a similaridade genética com outras espécies. Descobriu-se que o bacteriófago apresentou pouquíssima similaridade genética com os bacteriófagos conhecidos, indicando que o bacteriófago se trata de um novo bacteriófago (Tabela 2). Mais particularmente, o conjunto de iniciadores específico ao ΦCJ2, em particular, as

SEQ ID NOs. 4 e 5, as SEQ ID NOs. 6 e 7, e as SEQ ID NOs. 8 e 9, foi usado para realizar a PCR. Verificou-se que cada produto da PCR tem um tamanho de aproximadamente 1 kbp (FIG. 4).

Além disso, quando o SG e o SP foram infectados com ΦCJ2, as placas de fago (zona clara no ágar macio criado pela lise da célula hospedeira de um bacteriófago) apresentaram o mesmo tamanho e turbidez.

Além disso, a estabilidade do ΦCJ2 foi examinada sob várias condições de temperatura e pH, revelando que o ΦCJ2 mantém estavelmente sua infectividade em uma ampla faixa de ambientes de pH, desde o pH 2,5 ao pH 9,0 (FIG. 5) e em um ambiente de alta temperatura de 37°C a 60°C (FIG. 6), e mesmo após a secagem sob alta temperatura a 60°C durante 120 minutos (FIG. 7). Esses resultados indicam que o bacteriófago ΦCJ2 da presente invenção pode ser prontamente aplicado a vários produtos para o controle da Salmonela.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por um ou mais selecionados dentre o grupo que consiste de Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum e Salmonella pullorum, compreendendo o bacteriófago como ingrediente ativo.

Em um concretização preferida, a composição terapêutica pode incluir um antibiótico.

O bacteriófago da presente invenção tem uma atividade bactericida específica contra Salmonella typhimurium,

Salmonella gallinarum e Salmonella pullorum, e, portanto, pode ser usado para a finalidade de prevenir ou tratar doenças causadas por essas bactérias. De preferência, exemplos das doenças causadas pela Salmonella typhimurium podem incluir salmonelose ou intoxicação alimentar por Salmonela, exemplos das doenças causadas por Salmonella gallinarum podem incluir Tifo Aviário, e exemplos das doenças causadas pela Salmonella pullorum podem incluir a Pulurose, sem se limitar às mesmas.

Como usado aqui, o termo "salmonelose" se refere a sintomas causados pela infecção por salmonela, incluindo febre, dor de cabeça, diarréia e vômito, a saber, doenças causadas por bactérias do gênero Salmonela, que é definido por duas formas clínicas - uma forma septicêmica aguda que lembra a febre tifoide e uma gastroenterite aguda, incluindo enterite, intoxicação alimentar e septicemia aguda.

Como usado aqui, o termo "prevenção" significa todas as ações em que a doença é restrita ou retardada pela administração da composição. Como usado aqui, o termo "tratamento" se refere a todas as ações em que a doença apresenta uma melhora ou foi modificada favoravelmente pela administração da composição.

A composição da presente invenção compreende ΦCJ2 de 5 x 10 a 5 x 10 pfu/mL, de preferência 1 x 106 a 1 x IO10 pfu/mL.

A composição da presente invenção pode adicionalmente incluir um veículo farmaceuticamente aceitável, e ser formulada junto com o veículo para obter alimentos, remédios e aditivos alimentares.

Como usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um veículo ou diluente que não causa irritação significativa em um organismo e não anula a atividade biológica e as propriedades do composto administrado. Para a formulação da composição em uma preparação líquida, um veículo farmaceuticamente aceitável que seja estéril e biocompatível pode ser empregado, tal como uma solução salina, água estéril, solução de Ringer, soro fisiológico tamponado, solução de infusão de albumina, solução de dextrose, solução e maltodextrina, glicerol e etanol. Esses materiais podem ser usados sozinhos ou em qualquer combinação. Se necessário, outros aditivos convencionais podem ser adicionados, tais como antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos, entre outros. Além disso, diluentes, dispersantes, surfactantes, aglutinantes e lubrificantes podem ser adicionalmente adicionados à composição para preparar formulações injetáveis, tais como soluções aquosas, suspensões e emulsões, ou formulações orais, tais como pílulas, cápsulas, grânulos ou comprimidos.

As composições profiláticas ou terapêuticas da presente invenção podem ser aplicadas ou pulverizadas na área aflingida, ou administradas por vias orais ou parenterais. A administração parenteral pode incluir administração intravenosa, intraperitonial, intramuscular, subcutânea ou tópica.

A dosagem adequada para aplicação, pulverização, ou administração da composição da presente invenção dependerá de uma variedade de fatores, inclusive o método de formulação, o modo de administração, a idade, peso, sexo, condição e dieta do paciente ou animal sendo tratado, o tempo de administração, a via de administração, a taxa de excreção e sensibilidade de reação. O médico ou veterinário conhecedor da técnica pode determinar prontamente e prescrever a quantidade eficaz necessária da composição.

Exemplos das formas de dosagem oral adequadas para a composição da presente invenção incluem comprimidos, pastilhas, pastilhas expectorantes, suspensões aquosas ou emulsivas, pó ou grânulos, emulsões, cápsulas duras ou macias, xaropes ou elixires. Para formulação tais como comprimidos e cápsulas, é útil um aglutinante como lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose ou gelatina, um excipiente, tal como fosfato de dicálcio, um desintegrante, tal como amido de milho ou amido de batata doce, um lubrificante, tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearilfúmarato de sódio, ou cera de polietileno glicol. Para cápsulas, um veículo líquido, tal como um lipídeo, pode ser adicionalmente usado além dos compostos mencionados acima.

Para administração não-oral, a composição da presente invenção pode ser formulada em injeções para as vias subcutânea, intravenosa ou intramuscular, supositórios ou sprays inaláveis via o trato respiratório, tais como aerossóis. Preparações de injeções podem ser obtidas pela dissolução ou suspensão da composição da presente invenção, junto com um estabilizante ou tampão, em água, e acondicionando a solução ou suspensão em ampolas ou frascos unitários. Para sprays, tal como aerossol, um propelente para borrifar um concentrado disperso em água ou pó umectante pode ser usado em combinação com um aditivo.

Como usado aqui, o termo "antibiótico" se refere a qualquer fármaco que é aplicado a animais com o intuito de eliminar patógenos, e é usado aqui como um termo geral para antissépticos, agentes bactericidas e agentes antibacterianos. Os animais são mamíferos, inclusive humanos. O bacteriófago da presente invenção, ao contrário dos antibióticos convencionais, tem alta especificidade pela Salmonela de modo a matar os patógenos específicos sem afetar as bactérias benéficas, e não induz resistência, fazendo com que seu ciclo de vida seja relativamente longo.

De acordo com uma concretização específica da presente invenção, estudos de toxicidade intravenosa e oral de dose única e estudos de toxicidade em bactérias entéricas normais foram realizados para avaliar sua segurança em ratos. Quando um estudo de toxicidade oral de dose única foi realizado a um nível de dose de 1 x 10 pfú de ΦCJ2, não houve sinais clínicos acentuados ou morte animal (Tabelas 4 e 5). Quando um estudo de toxicidade intravenosa de dose única foi realizado a um nível de dose de 1 x 1012 pfú de ΦCJ2, também não houve sinais clínicos acentuados ou morte animal (Tabelas 6 e 7, e FIG. 9).

Quando um estudo de toxicidade em bactérias entéricas normais foi realizado pela diluição em série de 1 x 1011 pfu/ml de ΦCJ2, foi descoberto que o crescimento das bactérias entéricas não foi inibido mesmo a uma dose máxima de ΦCJ2 (Tabela 8), indicando sua segurança.

Além disso, quando galinhas infectadas pelo SF foram alimentadas com um alimento suplementado com ΦCJ2, o grupo tratado com ΦCJ2 apresentou um índice de proteção significativamente maior do que o do grupo não-tratado (Tabela 9), sugerindo que ΦCJ2 tem eficácia de prevenção e tratamento na infecção pelo SG.

De acordo com ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a um alimento animal ou água potável para animais, compreendendo o bacteriófago como ingrediente ativo.

Os antibióticos aditivos alimentares nas indústrias de pesca e criação de animais são usados com a finalidade de prevenir infecções, mas levam a um aumento nas linhagens resistentes das bactérias, e os antibióticos residuais nos produtos de origem animal podem ser ingeridos por humanos, contribuindo para a resistência ao antibiótico em patógenos humanos e para a disseminação das doenças. Além disso, uma vez que há uma variedade de antibióticos aditivos alimentares, a emergência global crescente de linhagens resistentes a múltiplos fármacos se torna uma preocupação séria. Portanto, o bacteriófago da presente invenção pode ser usado como um antibiótico aditivo alimentar mais correto do ponto de vista ecológico e capaz de solucionar os problemas anteriores.

O bacteriófago da presente invenção pode ser preparado separadamente como um aditivo alimentar, e então adicionado ao alimento animal, ou adicionado diretamente ao alimento animal. O bacteriófago da presente invenção pode estar contido no alimento animal como um líquido ou em uma forma seca, de preferência em um pó seco. O processo de secagem pode ser realizado por secagem por exposição ao ar, secagem natural, secagem por pulverização, e liofilização, sem se limitar aos mesmos. O bacteriófago da presente invenção pode ser adicionado como uma forma de pó em uma quantidade de 0,05 a 10% em peso, de preferência 0,1 a 2% em peso, com base no peso do alimento animal. O alimento animal também pode incluir outros aditivos convencionais para a conservação a longo prazo, além do bacteriófago da presente invenção.

O aditivo alimentar da presente invenção pode adicionalmente incluir outros microorganismos não-patogênicos. Os microorganismos adicionais podem ser selecionados dentre um grupo que consiste de Bacillus subtilis que pode produzir protease, lipase e invertase, a linhagem Lactobacillus sp. tendo a capacidade de decompor compostos orgânicos e atividade fisiológica sob condições anaeróbicas, fungos filamentosos como o Aspergillus oryzae (J AnimalSci 43: 910-926, 1976) que aumenta o peso dos animais domésticos, melhora a produção do leite e auxiliar na digestão e capacidade de absorção dos alimentos, e leveduras, como a Saccharomyces cerevisiae (J Anim Sei 56:735-739, 1983).

O alimento compreendendo o ΦCJ2 da presente invenção pode incluir alimentados baseados em vegetais, como grãos, nozes, subprodutos alimentares, alga marinha, fibra, subprodutos de fármacos, óleo, amido, farinha de milho e subprodutos de grãos, e alimentos baseados em animais, como proteínas, minerais, gordura, proteína de célula única, zooplâncton e resíduos alimentares, sem se limitar aos mesmos.

O aditivo alimentar compreendendo o ΦCJ2 da presente invenção pode incluir aglutinantes, emulsificantes e conservantes para a prevenção da deterioração da qualidade, aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, aromatizantes, nitrogênio não-protéico, silicates, agentes tamponadores, agentes corantes, extratos e oligossacarídeos para melhorara a eficiência do processo, e outras pré-misturas alimentares, sem se restringir aos mesmos.

Além disso, o suprimento de água potável misturada com o bacteriófago da presente invenção pode reduzir o número de bactérias Salmonela no intestino dos animais, obtendo assim animais livres de Salmonela.

De acordo com ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a um desinfetante ou agente de limpeza, compreendendo o bacteriófago como ingrediente ativo.

O desinfetante compreendendo o bacteriófago como ingrediente ativo pode ser utilizado como um desinfetante alimentar valioso, destinado à prevenção da intoxicação alimentar. Especificamente, na indústria de alimentos, ele pode ser usado como um desinfetante de alimentos ou aditivo alimentar para prevenir infecções pela salmonela, e na indústria de criação de animais, ele também pode ser usado para a produção de animais livres de Salmonela. De modo a remover a Salmonela, o desinfetante pode ser usado em usinas de tratamento de águas residuais, e também em celeiros de aves, abatedouros, áreas contaminadas e outras instalações de produção, sem se limitar aos mesmos.

Além disso, o agente de limpeza compreendendo o bacteriófago como ingrediente ativo pode ser aplicado à pele contaminada, às penas e a outras partes contaminadas do corpo de animais vivos de modo a remover a Salmonela.

De acordo com ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum ou Salmonella pullorum, usando o bacteriófago que tem uma atividade bactericida específica contra a Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, ou a Salmonella pullorum.

De acordo com ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum ou Salmonella pullorum, usando a composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, ou pela Salmonella pullorum.

A composição da presente invenção pode ser administrada a animais em uma formulação farmacêutica ou como um componente do alimento animal ou em sua água potável, de preferência administrada pela mistura no alimento animal ou como um aditivo alimentar.

A composição da presente invenção pode ser administrada de uma forma típica por qualquer via, tais como as vias oral ou parenteral, em particular, oral, retal, tópica, intravenosa, intraperitonial, intramuscular, intraarterial, transdérmica, intranasal e de inalação.

O método para tratamento das doenças da presente invenção inclui a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição da presente invenção. Ficará óbvio aos versados na técnica que a dose diária total deve ser determinada mediante a avaliação médica apropriada feita por um médico. A quantidade terapeuticamente eficaz para os pacientes pode variar dependendo de vários fatores bem conhecidos na técnica médica, incluindo o tipo e grau da resposta a ser alcançada, a condição do paciente, tal como idade, peso corporal, estado de saúde, sexo e dieta, tempo e via de administração, a taxa de secreção da composição, o período de tempo da terapia, composições concretas de acordo com se outros agentes são usados ou não, etc.

Agora, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, esses exemplos são apenas para fins ilustrativos, e a invenção não deve se limitar a esses Exemplos. [Modo para a Invenção] Exemplo 1: Isolamento do Bacteriófago de Salmonela 1-1. Triagem do Bacteriófago e Isolamento do Bacteriófago Único 50 mL de amostra de um abatedouro de frangos e efluente residual foram transferidas para um tubo de centrífuga, e centrifugados a 4000 rpm por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado usando um filtro de 0,45 μm. 18 mL do líquido filtrado da amostra foram misturados com 150 μl de meio de cultura de agitação ST (OD60o=2) e 2 mL do meio 10 X Luria- Bertani (daqui em diante chamado de meio LB, triptona 10 g; extrato de levedura 5 g; NaCl 10 g; volume final até 1 L). A mistura foi cultivada a 37°C por 18 horas e o meio de cultura foi centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi filtrado usando um filtro de 0,2 μm. 3 mL de ágar a 0,7% (p/v) e 150 μl do meio de cultura de agitação ST (OD600=2) foram misturados, e colocados na placa LB, trocados para um meio sólido. 10 μl do líquido filtrado da cultura foram espalhados sobre o mesmo, e cultivados por 18 horas a 37°C (utilizou-se ágar a 0,7% como o "ágar de superfície", e a titulação do lisado de fagos foi realizada no ágar de superfície, chamado de método de revestimento de ágar macio). O meio de cultura de amostra contendo o lisado de fagos foi diluído, e misturado com 150 μl de meio de cultura de agitação ST (OD60o=2), seguido do método de revestimento de ágar macio, de modo que placas únicas fossem obtidas. Uma vez que uma única placa representa um bacteriófago, de modo a isolar os bacteriófagos únicos, uma placa foi adicionada a 400 μl de solução de SM (NaCl, 5,8; MgSO47H2O, 2 g; 1 M Tris-Cl 5 (pH7,5), 50 mb; H2O, volume final até 1 L), e deixada por 4 horas à temperatura ambiente para isolar os bacteriófagos únicos. Para purificar o bacteriófago em grandes quantidades, 100 μl do sobrenadante foram obtidos da solução de bacteriófago único, e misturados com 12 mL de ágar a 0,7% e 500 μl do meio de 10 cultura de agitação ST, seguido do método de revestimento de ágar macio na placa LB (diâmetro de 150 mm). Quando a lise foi terminada, 15 mL da solução de SM foram adicionados à placa. A placa foi suavemente agitada por 4 horas à temperatura ambiente para eluir os bacteriófagos a partir do ágar de superfície. 15 A solução SM contendo os bacteriófagos eluídos foi recuperada, adicionando-se clorofórmio a 1% de um volume final, misturada bem por 10 minutos. A solução foi centrifugada a 4000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante obtido foi filtrado usando um filtro de 0,2 μm, e armazenado no refrigerador. 20 1-2. Lotes em grande escala do bacteriófago Os bacteriófagos selecionados foram cultivados em grandes quantidades usando ST. O ST foi cultivado sob agitação, e uma alíquota de 1,5 X 1010 cfú (unidade formadora de colônia) foi centrifugada a 4000 rpm por 10 minutos, e o 25 precipitado foi ressuspenso em 4 mL de solução SM. O bacteriófago de 7,5 X 107 pfú (unidade formadora de placa) foi inoculado ao mesmo (MOI: multiplicidade de infecção=0,005), e deixado a 37°C por 20 minutos. A solução foi inoculada em 150 mL de meio LB, e cultivada a 37°C por 5 horas. Adicionou-se clorofórmio a 1% de um volume final, e a solução de cultura foi agitada por 20 minutos. Adicionou-se a DNase I e a RNase A a uma concentração final de 1 μg/mL, respectivamente. A solução foi deixada a 37°C por 30 minutos. Adicionou-se NaCl e PEG (polietileno glicol) a uma concentração final de 1 M e 10% (p/v), respectivamente, deixados a 4°C por 3 horas adicionais. A solução foi centrifugada a 4°C e 12000 rpm por 20 minutos para descartar o sobrenadante. O precipitado foi ressuspenso em 5 mL de solução SM, e deixado à temperatura ambiente por 20 minutos. 4 mL de clorofórmio foi adicionado a ela e misturado bem, seguido de centrifugação a 4°C e 4000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi filtrado usando um filtro de 0,2 μm, e o bacteriófago foi purificado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de glicerol (densidade: 40%, glicerol a 5% a 35.000 rpm e 4°C por 1 hora). O bacteriófago purificado foi designado como o Bacteriófago ΦCJ2, e ressuspenso em 300 μL de solução SM, seguido de titulação. O bacteriófago ΦCJ2 foi depositado no Centro de Cultura Coreano de Microoiganismos (361-221, Honje 1, Seodaemun, Seoul) em 17 de dezembro de 2008, sob o número de acesso KCCM10976P. Exemplo 2: Examinação da infecção pelo ΦC J2 da Salmonela Para examinar a atividade lítica dos bacteriófagos selecionados em outras espécies de Salmonela, bem como na ST, foram realizadas tentativas de infecção cruzada com outras espécies de Salmonela, Como resultado, o ΦCJ2 não infectou a SE (Salmonella enterica Serotype Enteritis), a SC (Salmonella enterica Serotype Choleraesuis), a SD (Salmonella enterica Serotype Derby) e a SA (Salmonella enterica subsp. Arizonae), SB (Salmonella enterica subsp. Bongori). Quando as tentativas de infecção cruzada foram feitas com outras espécies de Salmonela que não a linhagem ATCC14028 da ST, a atividade lítica foi 40% ou inferior, ao contrário da SG e da SP. Esse resultado sugere que o ΦCJ2 é um bacteriófago específico à SG e à SP (vide o Exemplo 11). Os resultados são apresentados na Tabela 1 a seguir, o bacteriófago ΦCJ2 que foi produzido usando SG como uma célula hospedeira apresentou o mesmo tamanho de placa e turbidez de placa, e os mesmos padrões protéicos e tamanho de genoma que os produzidos usando a ST como célula hospedeira. [Tabela 1]

<infecção pelo ΦCJ2 da Salmonela> * ATCC : The Global Bioresource Center * SGSC : salmonella genetic stock center Exemplo 3: Examinação da Morfologia do Bacteriófago ΦC J2 O ΦCJ2 purificado foi diluído em solução de gelatina a 0,01%, e então fixado em solução de glutaraldeído a 2,5%. Após a amostra ser colocada sobre uma placa de mica revestida com carbono (ca.2,5 X 2,5 mm) e adaptada por 10 minutos, ela foi lavada com água destilada estéril. O filme de carbono foi montado em uma grade de cobre, e corado com acetato de uranila a 4% por 30-60 segundos, seco e examinado sob o microscópio eletrônico de transmissão JEM-1011 (80kV, ampliação de X 120.000 ~ X 200.000). Como resultado, revelou- se que o ΦCJ2 purificado tem características morfológicas incluindo uma cápsula isométrica e uma cauda não-contrátil longa, como mostra a <FIG. 1> indicando que ele pertence ao morfotipo da família Siphoviridae. Exemplo 4: Análise do Padrão Protéico do Bacteriófago ΦC J2 15 μl da solução de ΦCJ2 purificada (título de 1011 pfu/mL) foram tratados com 3 μl da solução de amostra SDS 5X, e aquecidos por 5 minutos. A proteína total do ΦCJ2 foi corrida em gel Bis-Tris NuPAGE a 4-12% (Invitrogen), e então o gel foi corado com azul coomassie por 1 hora à temperatura ambiente. Como mostra a <FIG. 2>, os padrões protéicos mostraram que uma faixa de aproximadamente 40 kDa foi observada como uma proteína principal, e faixas de aproximadamente 65 kDa, 17 kDa, e 15 kDa também foram observadas. Exemplo 5: Análise do Tamanho do DNA Genômico Total do Bacteriófago ΦCJ2 O DNA genômico foi isolado do ΦCJ2 purificado por ultracentrifiigação. Especificamente, ao meio de cultura de ΦCJ2 purificado, adicionou-se EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético (pH 8,0)), proteinase K e SDS (dodecil sulfato de sódio) a uma concentração final de 20 mM, 50 μg/mL, e 0,5% (p/v), respectivamente, e deixados a 50°C por 1 hora. Uma quantidade igual de fenol (pH 8,0) foi adicionada e misturada bem, seguido de centrifugação a 12000 rpm e à temperatura ambiente por 10 minutos. O sobrenadante foi misturado bem com uma quantidade igual de PC (fenol:clorofórmio=l:l), seguido de centrifugação a 12000 rpm e à temperatura ambiente por 10 minutos. O sobrenadante foi misturado bem com uma quantidade igual de clorofórmio, seguido de centrifugação a 12000 rpm e à temperatura ambiente por 10 minutos. Novamente, ao sobrenadante, adicionou-se 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M e dois volumes de etanol frio a 95%, sendo deixado a -20°C por 1 hora. Após a centrifugação a 0°C e 12000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi totalmente removido, e o precipitado de DNA foi dissolvido em 50 μl TE (Tris-EDTA (pH 8,0)). O DNA extraído foi diluído 10 vezes, e sua absorbância foi medida a OD26O’ Após carregar 1 μg do DNA genômico total em PFGE a 1% (eletroforese em gel de campo pulsado), a eletroforese foi realizada com um sistema BIORAD PFGE programa 7 (faixa de tamanho de 25 a 100 kbp; rampa de tempo de troca 0,4-2,0 segundos, formato linear; tensão direta 180 V; tensão inversa 120 V) à temperatura ambiente por 20 horas. Como mostra a <FIG. 3>, ΦCJ2 tinha um tamanho de DNA genômico de aproximadamente 43 kbp. Exemplo 6: Análise Genética do Bacteriófago ΦCJ2 Para analisar os aspectos genéticos do ΦCJ2 purificado, 5 μg do DNA genômico de ΦCJ2 foram tratados com a enzima de restrição E’coR V. O vetor pCL (Promega) foi digerido com Sma I, e tratado com CIP (fosfatase alcalina intestinal bovina). O DNA genômico digerido e o vetor foram misturados em uma razão de 3:1, e ligados a 16°C por 5 horas. O produto de ligação foi transformado em DH5α de E.coli. As células transformadas foram colocadas numa placa LB contendo espectinomicina e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D- galactopiranosídeo) para seleção em azul/branco, de modo a selecionar três colônias. A colônia selecionada foi cultivada com agitação em um meio de cultura contendo espectinomicina por 16 horas. Em seguida, os plasmídeos foram extraídos usando um kit de purificação de plasmídeo (Promega). A clonagem dos plasmídeos foi confirmada por PCR usando um conjunto e iniciadores de Ml 3 direto e M13 reverso, e os fragmentos de inserção de 1 kpb ou mais foram selecionados, e sua sequência de base foi analisada usando o conjunto de iniciadores de Ml3 direto e M13 reverso. Como mostram as SEQ ID NOs. 1, 2 e 3, o tamanho foi de aproximadamente 3,1 kpb, 1,8 kbp e 800 bp, respectivamente. A similaridade de sequência foi analisada usando um programa NCBI blastx, e os resultados são apresentados na Tabela 2 a seguir. Como mostra a Tabela 2 a seguir, ΦCJ2 apresentou similaridade de sequência de 90% com BPKS7gpO7 do fago KS7 de salmonela e com a proteína capsidial de SETP3 na sequência direta da SEQ ID NO. 1. A sequência inversa da SEQ ID NO. 1 também apresentou 75% e 66% de similaridade de sequência com BPKS7gpO4 e SPSV3_gp41 do fago KS7 de salmone e o fago SET3, respectivamente. NA SEQ ID NO. 2, a sequência direta apresentou 91% de similaridade de sequência com a proteína hipotética SPSV3_gpO2 do fago SETP3 de salmonela, e a sequência inversa apresentou 94% de similaridade de sequência com a proteína do componente de cauda do fago SETP3 de salmonela. A sequência da SEQ ID NO. 3 também apresentou 69% de similaridade de sequência com BPKS7gp41 do fago KS7 de salmonela e com a DNA polimerase do fago SETP3. A análise de sequência de base das SEQ ID NOs. 1, 2 e 3 pelo programa NCBI blastn resultou em 60-70% de similaridade de sequência com o fago KS7 e SETP3 da salmonela. No entanto, elas não são totalmente idênticas uma à outra, sugerindo que o ΦCJ2 é um novo bacteriófago que infecta a salmonela. [Tabela 2] <Comparação da similaridade de sequência do ΦCJ2 com outros bacteriófagos>

Exemplo 7: Construção da sequência de iniciadores específica do ΦC J2 Para identificar o ΦCJ2, iniciadores específicos do ΦCJ2 foram construídos com base nas SEQ ID NOs. 1,2 e 3. A PCR foi realizada usando cada conjunto de iniciadores das SEQ ID NOs. 4 e 5, SEQ ID NOs. 6 e 7 e SEQ ID NOs. 8 e 9. 0,1 μg do DNA genômico do bacteriófago e 0,5 pmol do iniciador foram adicionados à pré-mistura (Bioneer), e o volume final foi ajustado a 20 μl. A PCR foi realizada com 30 ciclos de desnaturação; 94°C 1 min, anelamento; 53°C 1 min, e polimerização; 72°C 1 min. Quando as SEQ ID NOs. 4 e 5, SEQ ID NOs. 6 e 7 e as SEQ ID NO. 8 e 9 foram usadas como um conjunto de iniciadores, todos os produtos da PCR tiveram um tamanho de aproximadamente 1 kpb. Os resultados são apresentados na <FIG. 4>. Exemplo 8: Teste de Estabilidade do pH em Bacteriófagos Para testar a estabilidade do ΦCJ2 em um ambiente de pH baixo, como o estômago de galinhas, o teste de estabilidade foi realizado em uma ampla faixa de pH (pH 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9,7,4,8,2,9,0). Várias soluções de pH (Tampão acetato de sódio (pH 2,1, pH 4,0, pH 5,5, pH 6,4)), Tampão citrato de sódio (pH2,5,pH 3,0, pH 3,5), Tampão fosfato de sódio (pH 6,9, pH 7,4), Tris-HCl (pH 8,2, pH 9,0)) foram preparadas a uma concentração de 2 M. 100 μl da solução de pH foram misturados com uma quantidade igual de solução de bacteriófago (1,0 X 1011 pfu/mL) à concentração de cada solução de pH a 1 M, e deixadas à temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi diluída em série, e 10 μl de cada amostra diluída foram cultivados a 37°C por 18 horas pelo método de revestimento de ágar macio, e a titulação dos lisados de fagos foi realizada. As alterações nos títulos de acordo com a diferença do pH foram comparadas para examinar a estabilidade relativa. Os resultados mostraram que o bacteriófago não perdeu sua infectividade e manteve a estabilidade no pH 2,5. No entanto, ele perdeu sua infectividade ao pH 2,1. Os resultados são apresentados na <FIG. 5>. Exemplo 9: Teste de Estabilidade Térmica em Bacteriófagos Para testar a estabilidade do bacteriófago ao calor gerado durante o processo de formulação quando usado como aditivo alimentar, o seguinte experimento foi realizado. 200 μl da solução de ΦCJ2 (1,0 X 10" pfú/mL) foram deixados a 37°C, 45°C, 53°C, 60°C, 70°C e 80°C por 0 min, 10 min, 30 min, 60 min, e 120 min, respectivamente. A solução de reação foi diluída em série, e 10 μl de cada amostra diluída foram cultivados a 37°C por 18 horas pelo método de revestimento de ágar macio, e a titulação dos lisados de fagos foi realizada. As alterações nos títulos de acordo com a temperatura e o tempo de exposição foram comparadas para examinar a estabilidade relativa. Os resultados mostraram que o bacteriófago reteve sua infectividade após incubação a 60°C por 2 horas. No entanto, o bacteriófago perdeu rapidamente sua infectividade após a incubação a 70°C ou mais durante 10 minutos. Os resultados são apresentados na <FIG. 6>. Exemplo 10: Teste de Estabilidade em Condição Seca em Bacteriófagos Para testar a estabilidade dos bacteriófagos sob a condição seca durante o processo de formulação quando usados como aditivo alimentar, o seguinte experimento foi realizado. Com base nos resultados do teste de estabilidade térmica, o experimento foi realizado sob condições de secagem em alta temperatura (a 60°C por 120 min). 200 μl da solução de ΦCJ2 (1,0 X 1011 pfu/mL) foram secos usando um Speed vacuum (Speed - Vacuum Concentrator 5301, Eppendorf). O precipitado obtido foi completamente ressuspenso em uma quantidade igual de solução SM a 4°C por um dia. A solução de reação foi diluída em série, e 10 μl de cada amostra diluída foram cultivados a 37°C por 18 horas pelo método de revestimento de ágar macio, e a titulação dos lisados de lagos foi realizada. As alterações nos títulos antes e após a secagem foram comparadas para examinar a estabilidade relativa. Os resultados mostraram que sua atividade não foi reduzida. Os resultados são apresentados na <FI G. 7>. Exemplo 11: Examinação da Infecção por Bacteriófagos da linhagem do Tipo Selvagem A atividade lítica do bacteriófago ΦCJ2 foi testada para cada 20 linhagens da SG e SP coreana tipo selvagem, isolada pelo Laboratory of Avian Diseases, College of Veterinary Medicine, Seoul National University, além da SG (SG SGSC2293), SP (SP SGSC2295) e ST (ST ATCC14028) usadas na presente invenção. 150 μl de cada meio de cultura de agitação de linhagem (OD6oo=2) foram misturados, e 10 μl da solução de ΦCJ2 (1010 pfu/mL) foram cultivados a 37°C por 18 horas pelo método de revestimento de ágar macio, e a formação de placas foi examinada. Foi verificado que o bacteriófago ΦCJ2 apresentou 100% de atividade lítica na SG e na SP tipo selvagem. Os resultados são apresentados na Tabela 3 a seguir. Sua atividade lítica sobre 20 linhagens da ST tipo selvagem também foi examinada, revelando que o bacteriófago ΦCJ2 apresentou 80% de atividade lítica (não apresentada na Tabela 3 a seguir). Sendo assim, o resultado sugere que o ΦCJ2 é um bacteriófago sendo específico à SG, SP e ST. [Tabela 3] <Atividade lítica sobre a SG, SP e ST tipo selvagem>

* fonte da SG/SP: Laboratory of Avian Diseases, College of Veterinary Medicine, Seoul National LJniversity * SGSC: salmonella genetic stock center Exemplo 12: Teste de Toxicidade dos Bacteriófagos Para avaliar a segurança do ΦCJ2 em ratos, foram realizados estudos de toxicidade. Foram realizados estudos de toxicidade intravenosa e oral e estudo de toxicidade sobre as bactérias entéricas normais. Para examinar a toxicidade aguda em ratos e a taxa de mortalidade por administração oral única, realizou-se um estudo de toxicidade oral de dose única. Ratos machos e fêmeas (12 ratos para cada) com 7 semanas de idade, livres de patógenos específicos (SPF) foram deixados em jejum um dia antes da administração do ΦCJ2. No dia da administração, 1 X1012 pfu de ΦCJ2 foi administrado a ratos machos e fêmeas (6 ratos para cada) via oral, e uma solução mista de 20 mM de Tris-FICl e 2 mM de MgCl2 foi administrada oralmente a 6 ratos como um grupo controle, após 4 horas, para iniciar a realimentação. No dia da administração, os ratos foram examinados 30 min após a administração, e a cada 4 horas. Durante 14 dias, os sinais clínicos foram examinados e gravados uma vez por dia. Como resultado, não houve morte animal, e sinais clínicos devido à toxicidade do ΦCJ2 não foram observados. Os resultados são ilustrados nas Tabelas 4 e 5. As alterações no peso corporal foram medidas e registradas antes da administração, e 1,3,7, 10 e 14 dias após a administração. Como mostra a FIG. 8, não houve alterações significativas no peso corporal, se comparado ao grupo controle. Os resultados indicam que o ΦCJ2 não induz perda de apetite ou sinais tóxicos que causem alterações no peso corporal. Os ratos sobreviventes foram submetidos à autópsia e examinados quanto a lesões graves. Nenhuma anormalidade grave foi observada. [Tabela 4] 5 <Incidência de morte após a administração oral do ΦCJ2>

[Tabela 5] <Sinais clínicos após a administração oral do ΦCJ2>

aOs valores são expressos como o número de io animais mortos/número total de animais. bOs valores são expressos como o número de animais com sinais clínicos/número total de animais. Para examinar a toxicidade do bacteriófago no sangue, realizou-se um estudo de toxicidade intravenosa de dose única. Ratos 15 machos e fêmeas (10 ratos para cada) com 7 semanas de idade, livres de patógenos específicos (SPF) foram sujeitos ao experimento.. No dia da administração, administrou-se 1 X IO12 pfu de ΦCJ2 às veias de cauda laterais de ratos machos e fêmeas (5 ratos para cada) usando uma seringa de 3 mL, e uma solução mista de 20 mM de Tris-HCl e 2 mM de MgCl2 foi administrada nas veias de cauda laterais de 5 ratos como um grupo controle. Sob as mesmas condições como um estudo de toxicidade oral, a morte animal e os sinais clínicos, as alterações no peso corporal e o resultado da necropsia foram examinados, como mostram as Tabelas 6 e 7 e a FIG. 9, respectivamente. Durante o período experimental, não houve morte animal, e os sinais clínicos devido à toxicidade do ΦCJ2 não foram observados. Além disso, não houve alterações significativas no peso corporal, se comparado ao gmpo controle. Os resultados indicam que o ΦCJ2 não induz toxicidade. Além do mais, os ratos sobreviventes foram submetidos à autópsia e examinados quanto a lesões graves. Nenhuma anormalidade grave foi observada. [Tabela 6] <Incidência de morte após a administração intravenosa doΦCJ2>

[Tabela 7] <Sinais clínicos após a administração intravenosa do ΦCJ2>

aOs valores são expressos como o número de animais mortos/número total de animais. b Os valores são expressos como o número de animais com sinais clínicos/número total de animais. Para examinar a toxicidade do ΦCJ2 em bactérias entéricas normais, 9 espécies de bactérias entéricas normais, identificadas em diretrizes de teste de toxicidade para fármacos animais, (Bacteroides fragilis (ATCC25285), Bacteroides ovatus (ATCC8483), Fusobacterium prausnitzii (ATCC 27766), Bifidobacterium Longum(KACC 20597, ATCC15697), Clostridium perfringens (ATDD13124), Peptococcus anaerobius (ATCC27337), Enterococcus faecalis (KACC 11304, ATCC35308), Lactovacillus acidophilus (KACC12419, ATCC 4356), Escherichia coli (KACC 10005, ATCC 35607)) foram submetidas ao estudo de toxicidade. 1 x 1011 pfii/mL de ΦCJ2 foram diluídos em série e 100 μl da diluição foram divididas em alíquotas em uma placa de 96 poços. Em seguida, os meios de cultura de 9 espécies foram adicionados à placa, e cultivados sob as condições predetemfinadas por 18-48 horas. A densidade celular foi medida para determinar a concentração inibitória mínima. Foi verificado que o crescimento das bactérias entéricas não foi inibido mesmo à concentração máxima do ΦCJ2, representado na Tabela 8. Os resultados indicam que o ΦCJ2 não afeta as bactérias entéricas normais. [Tabela 8]

Exemplo 13: Teste de Eficácia em Bacteriófagos De modo a avaliar a eficácia do ΦCJ2 na prevenção e tratamento da ST, SG e SP, o teste de eficácia foi realizado em galinhas. 20 poedeiras marrons (1 dia de idade) foram divididas em 10 grupos de teste com 10 poedeiras (grupo tratado com ΦCJ2 + grupo desafiado não-tratado 1). Por 1 semana, as galinhas do teste foram alimentadas com alimento suplementado 5 com 107 pfu de ΦCJ2 (por g) e água potável suplementada com IO7 pfu de ΦCJ2 (por mL). Em 1 semana, 106 cfu de SG0197 (por galinha) e 107 pfu (MOI=10) de cada fago foram misturados com 500 μl de TSB, e deixados em gelo por 1 hora ou menos, seguido de administração oral. A taxa de mortalidade foi 10 examinada por 2 semanas. As galinhas sobreviventes foram sujeitas à necropsia e examinadas quanto a lesões graves, e as bactérias foram isoladas. Como mostra a <Tabela 9>, foi descoberto que o grupo tratado com ΦCJ2 apresentou uma taxa de proteção significativamente maior (P<0,05) 15 do que o grupo não-tratado. [Tabela 9] <Teste de eficácia do ΦCJ2 em galinhas>

[Aplicabilidade Industrial]

O bacteriófago da presente invenção tem uma atividade bactericida específica contra a Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum e a Salmonella Pullorum sem afetar bactérias benéficas, e excelente resistência a ácido, calor e 5 condição seca, podendo assim ser aplicado às composições que podem ser usadas para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum e pela Salmonella pullorum, em particular, salmonelose, intoxicação alimentar por Salmonela, Tifo Aviário e 10 Pulurose, e aplicado a substancias terapêuticas, antibióticos, alimento para animais, água potável para animais, desinfetantes e agentes de limpeza.

Claims (5)

1. - Composição para a inibição ou tratamento de doenças infecciosas causadas por um ou mais selecionados dentre o grupo que consiste de Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum e Salmonella pullorum, caracterizada pelo fato de que compreendeum bacteriófago isolado, que é depositado sob o número de acesso KCCM10976P, tendo uma atividade bactericida específica contra Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum ou Salmonella pullorum como ingrediente ativo e veículo farmaceuticamente aceitável.

2. - Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a doença infecciosa causada pela Salmonella typhimurium é a salmonelose ou intoxicação alimentar por Salmonela, a doença infecciosa causada pela Salmonella gallinarum é o Tifo Aviário, e a doença infecciosa causada pela Salmonella Pullorum é a pulurose.

3. - Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é um antibiótico.

4. - Alimento para animais ou água potável, caracterizado pelo fato de que compreende um bacteriófago conforme definido na reivindicação 1.

5. - Desinfetante ou agente de limpeza, caracterizado pelo fato de que compreende um bacteriófago conforme definido na reivindicação 1.

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