BRPI0900276A2 - processo de purificação de imunoglobulina g (igg) a partir do soro ou plasma humano por cromatografia em gel (omega)-aminohexil-agarose ou (omega)-aminodecil- agarose - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE PURIFICAçãO DE IMUNOGLOBULINA G (lgG) A PARTIR DO SORO OU PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA EM GEL <sym>-AMINOHEXIL-AGAROSE OU <sym>-AMINODECIL-AGAROSE. O invento descreve um processo de purificação de imunoglobulina G (lgG) a partir do soro ou plasma humano por cromatografia negativa em gel co-aminohexil-agarose ou u-aminodecil-agarose. lgG com alto grau de pureza é obtida por cromatografia negativa realizando-se o seguinte procedimento: alimentação da coluna cromatográfica contendo o gel o-aminohexil-agarose ou n-aminodecil-agarose com soro ou plasma "in natura" ou diluído em tampão; lavagem da coluna com tampão e coleta das frações cromatográficas referentes às etapas de injeção e lavagem pois nestas frações encontra-se a lgG purificada; eluição com tampão de alta força iónica das proteínas adsorvidas na coluna cromatográfica, podendo-se utilizar esta fração para purificação de outras proteínas do soro ou plasma; regeneração da coluna com solução de hidróxido de sódio. As frações cromatográficas obtidas das etapas de alimentação e lavagem fornecem lgG com alto grau de pureza.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

"PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA G (IgG) A PARTIRDO SORO OU PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA EM GEL ω-AMINOHEXIL-AGAROSE OU ω-AMINODECIL-AGAROSE"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de purificação deimunoglobulina G (IgG), a partir de soluções brutas de soro ou de plasmasangüíneo humano ou animal, que resulta um alto grau de pureza. Esteprocesso pode também ser utilizado para isolar IgG a partir de frações quecontenham IgG produzidas durante o fracionamento de plasma sangüíneohumano, de soluções de sobrenadante de cultura celular de hibridomascontendo IgG monoclonal, de soluções de IgG obtidas a partir de extratosvegetais, ou a partir de outras fontes, produzidos pela tecnologia do DNArecombinante em células microbianas, animais, vegetais e em animais, leite eplantas transgênicas.

Fundamentos da Invenção

A imunoglobulina G (IgG), também denominada de anticorpo, é umaproteína sangüínea com papel importante na resposta imune humana e animalem reconhecer agentes estranhos ao organismo, ou seja, é uma proteína dedefesa produzida nos últimos estágios da resposta imune. A IgG possui massamolecular de 150 kDa, sendo composta de duas cadeias leves (massamolecular de 25 kDa cada) e duas cadeias pesadas (massa molecular de 50kDa cada) e pertence a um grupo relacionado a glicoproteínas (Holt et al., 2003).

A IgG pode ser obtida a partir do plasma ou soro sangüíneo humano ouanimal ou pode também ser produzida através da tecnologia de hibridomas -linhagens celulares produzidas pela fusão de mieloma com um linfócito -(anticorpos monoclonais) e da tecnologia do DNA recombinante (Roque et al., 2004).Cerca de 28 milhões de litros de plasma humano são fracionados, porano, no mundo para obtenção de hemoderivados de importância médico-farmacêutica (Burnouf, 2007). Estes hemoderivados são obtidos a fim de supriras necessidades de proteínas terapêuticas provenientes do plasma,especialmente albumina (cerca de 200 Kg/milhão de habitantes/ano), defatores de coagulação sangüínea (cerca de 2,3 Ul (Unidadelnternacional)/habitante/ano) e de imunoglobulina G (IgG) (cerca de 15Kg/milhão de habitantes/ano) (Hemoderivados, 2006).

A IgG é um produto chave dentre os hemoderivados provenientes dofracionamento do plasma humano, decorrente da sua crescente demanda emaplicações terapêuticas, tais como de imunodeficiências congênitas ouadquiridas (por ex., AIDS), de tratamento de deficiências seletivas deanticorpos (por ex., inflamações crônicas), de tratamento de doenças auto-imunes (por ex., púrpura trombocitopênica idiopática), de tratamento de algunstipos de câncer (por ex., leucemia linfocítica crônica) (Bernard et al., 1990,Kempf et al., 2007). Essas doenças requerem grandes doses de IgG para oseu tratamento, podendo chegar a várias gramas por paciente por ano(Bernard et al., 1990, Kempf et al., 2007). Como a demanda deimunoglobulinas é alta, os países que não as produzem em larga escalanecessitam importá-las (Hemoderivados, 2006).

Além das aplicações terapêuticas, a IgG (policlonal ou monoclonal) éuma proteína muito utilizada em kits de diagnósticos (Lu et al., 1996, Borjessonet al., 2004) e como Iigante em cromatografia de imunoafinidade parapurificação de proteínas e antígenos (Muronetz e Korpela, 2003). Para todas asaplicações descritas, é de suma importância a IgG com grau de purezaelevado.

A purificação da IgG humana consiste da separação desta proteína deoutras constituintes do plasma ou do soro humano. A albumina (AIb) é a maisabundante das proteínas do plasma ou soro (45 mg/mL), seguida da IgG (8 a18 mg/mL) (Andrade e Hlady, 1987). A IgG presente no plasma ou sorohumano ou no plasma ou soro animal é policlonal, contendo anticorpos deespecificidades muito diferentes.

Existem vários processos para isolamento da IgG humana, mas o maisempregado é o método descrito por Cohn et al. (1946) (fracionamento cometanol) ou este método com modificações (por exemplo, fracionamento cometanol seguido por cromatografia de troca iônica e filtração em gel) (Tanaka etal., 1998; Tanaka et al., 2000; Burnouf, 2007).

A combinação entre a técnica de precipitação tradicional do plasma poretanol seguida de métodos cromatográficos tem sido utilizada pelas indústriasde hemoderivados para isolar IgG e outras proteínas terapêuticas do plasma.Técnicas cromatográficas inseridas no processo de purificação após aprecipitação com etanol fazem com que a IgG seja obtida com um grau depureza mais elevado (segundo a ANVISA, D.O.U. - Diário Oficial da União;Poder Executivo, de 19 de maio de 2000, a IgG intramuscular deve apresentarpureza de 90% e a IgG endovenosa de 95%), pois são responsáveis porremover proteínas ou substâncias contaminantes que causam efeitoscolaterais, além de eliminar produtos químicos empregados para a inativaçãoviral da solução de IgG (Burnouf, 1995; Tanaka et al., 1998; Tanaka et al.,2000; Burnouf e Radosevich, 2001; Burnouf, 2007). Tais processos sãobaseados em técnicas envolvendo cromatografia de troca iônica (catiônica eaniônica), e como estes adsorventes não apresentam alta seletividade,necessita-se de etapas adicionais para eliminação dos contaminantes. Porexemplo, a cromatografia de permeação em gel é utilizada para obter-se, nofinal do processo, IgG com alto grau de pureza (Tanaka et al., 1998; Tanaka etal., 2000; Burnouf e Radosevich, 2001). As várias etapas de purificaçãorequeridas para aumento do grau de pureza da IgG diminuem o rendimento eaumentam o custo e o tempo do processo de purificação.

Quando IgG (policlonal ou monoclonal) é destinada para finslaboratoriais ou diagnóstico, a sua purificação tem sido realizada sem pré-tratamento do soro humano ou animal (soro bruto diluído em tampão) ou dosobrenadante de cultura celular de hibridomas (IgG monoclonal) porcromatografia de afinidade, na maioria das vezes, com proteínas A ou Gimobilizadas.

Proteína A é um receptor Fc bacteriano encontrado na superfície daparede celular, ou secretado pela maioria das linhagens de Staphylococcusaureus e a proteína G é extraída da parede celular de um grupo de bactérias GStreptococus. As proteínas AeG são capazes de ligar-se à região Fc de IgGhumana e de vários animais, no entanto, com reatividades diferentes (Boyle eReis, 1987). A cromatografia utilizando proteínas A ou G como Iigante deafinidade é um método bem conhecido para purificação de IgG1 apresentandoalta especificidade (Boyle et al., 1993). Apesar da maioria dos estudosrealizados no âmbito de purificação de IgG empregando proteínas A ou Gterem se mostrado promissores, há restrições quanto a utilização destesligantes.

O alto custo limita sua utilização, além de requererem condições debaixo pH para a eluição da IgG adsorvida, provocando, em alguns casos,inativação desta, ou seja, a perda da sua atividade biológica. Além disso, asproteínas AeG apresentam outros inconvenientes, tais como toxicidade emcaso de desprendimento da matriz cromatográfica, perda da atividade biológicacom o tempo de utilização (acarretando em perda da capacidade doadsorvente) e a possibilidade de contaminação bacteriana durante aestocagem do adsorvente (Füglistaller, 1989; Blank et al., 2001). A proteína Aapresenta ainda a restrição de não adsorver a subclasse 3 de IgG humana, asubclasse 1 de rato, vaca e ovelha e as subclasses 2a e 2b de rato (Boyle et al,1993). Os géis ω-aminohexil-agarose e ω-aminodecil-agarose permitem apurificação de todas as subclasses de IgG1 no entanto, purifica asimunoglobulinas G de ponto isoelétrico entre 7,0 a 9,5.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção compreende, um processo de purificação de IgGcom alto grau de pureza, a partir da utilização de adsorventes de baixo custopara minimizar o número de etapas, e eliminar problemas da técnica decromatografia de afinidade tais como perda da capacidade do adsorvente como tempo de utilização, toxicidade em caso de desprendimento do Iigante damatriz cromatográfica, perda da atividade biológica da IgG devido a eluiçãorealizada em valores de baixo pH, estocagem do adsorvente com menorpossibilidade de contaminação bacteriana. Além disso, elimina-se com esteprocesso a combinação de técnicas de precipitação com etanol e cromatografiade troca-iônica, fornecendo um novo processo de purificação de IgG com bomrendimento, baixo custo e/ou alto grau de pureza. Empregam-se, para isso,adsorventes com Iigantes não biológicos imobilizados.

A presente invenção se baseia no processo de obtenção da IgG comalto grau de pureza purificando-a a partir de soluções de soro ou do plasmasangüíneo pela técnica de cromatografia negativa em géis de agarose compoliaminas imobilizadas. A cromatografia negativa, utilizada em nívellaboratorial por vários pesquisadores para purificação de diversasbiomoléculas, é uma técnica na qual a molécula de interesse é recuperada comalta pureza nas etapas de alimentação e lavagem da coluna, enquanto asdemais permanecem retidas na coluna cromatográfica (Petsch et al., 1998;Pitiot et al., 2001)

Como resultado deste processo, é obtida uma solução de IgG com altograu de pureza, na maioria dos casos acima 90%, e com rendimentos deprocesso variando de 20 a 93%. A principal vantagem da invenção está naobtenção de IgG com alto grau de pureza em uma única etapa, sem anecessidade de pré-tratamento do soro ou do plasma sangüíneo ou desoluções de sobrenadante de cultura celular de hibridomas ou de soluções deextratos vegetais. Além disso, faz-se uso de adsorventes de baixo custo, comligantes não biológicos imobilizados (poliaminas como ω-aminodecil, ω-aminohexil ou as outras citadas anteriormente). Estes adsorventes podem serregenerados após o procedimento cromatográfico e ser utilizados por muitosciclos de purificação de IgG1 processos não descritos no estado da técnica.Breve descrição das Figuras

A Figura 1(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgGhumana a partir do soro humano por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose em Hepes 25 mmol/L, pH 6,8. Volume de alimentação de1,5 mL de soro humano diluído vinte vezes (volume final de 30,0 ml_). Soluçãode soro a uma concentração de 3,09 mg/mL de proteína total. Total de proteínatotal injetada: 92,82 mg. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R)regeneração.

A Figura 1(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5% sob condiçõesnão redutoras das frações de alimentação, lavagem e eluição do experimentode purificação de IgG humana a partir do soro humano em gel ω-aminodecil-agarose: Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; 1-30: frações daalimentação; 31-36: frações da lavagem; 65-66: frações da eluição; M:marcador de IgG humana (Aventis-Behring).

A Figura 2(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgGhumana a partir plasma humano por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose, em Mops 25 mmol/L, pH 7,9. Volume do leito: 3,0 mL.Vazão: 0,5 mL/min. Frações coletadas: 1,0 mL. Volume de alimentação de 0,75mL de plasma humano diluído vinte vezes (volume final de 15,0 mL). Soluçãode plasma a uma concentração de 3,40 mg/mL de proteína total. Total deproteína total injetada: 51,0 mg. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E)eluição; (R) regeneração.

A Figura 2 (b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5%, amostras emcondições não-redutoras das frações de alimentação, lavagem, eluição eregeneração do experimento de purificação de IgG humana a partir do plasmahumano em gel ω-aminodecil-agarose: Faixas: HMW: marcador de alta massamolecular; 1-15: frações da alimentação; 16-22: frações da lavagem; 40-41:frações da eluição; 42: fração da regeneração; M: marcador de IgG humana(Aventis-Behring).

A Figura 3(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgG decoelho a partir de soro de coelho por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose em Hepes 25 mmol/L, pH 6,8.. Volume de alimentação de50 pL de soro de coelho diluído vinte vezes (volume final de 1,0 mL). Soluçãode soro a uma concentração de 2,70 mg/mL de proteína total. Total de proteínatotal injetada: 2,70 mg. Volume do leito: 2,0 mL. (I) Injeção da amostra; (L)lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

A Figura 3(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5% sob condiçõesnão redutoras das frações de alimentação, lavagem e de eluição doexperimento de purificação de IgG de coelho a partir de soro de coelho em gelω-amínodecil-agarose. Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; (I):amostra de injeção; 4-6: frações da lavagem; 10-11: frações de eluição; 20:fração de regeneração; M: marcador de IgG humana (Aventis-Behring).

A Figura 4(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgGhumana a partir de solução de proteínas de extrato de soja orgânica em ω-aminodecil-agarose, em Hepes 25 mmol/L, pH 6,8. Volume do leito: 2,0 mL.Vazão: 0,5 mL/min. Frações coletadas: 1,0 mL. Volume de injeção de 1,0 mLde extrato de soja com "spiking" de 20 μί de IgG humana (concentração de IgGna solução de extrato de soja de 0,91 mg/mL). Total de proteína total injetada:5,35 mg.. (I) injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

A Figura 4(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5% sob condiçõesnão-redutoras das frações de injeção, lavagem e eluição do experimento depurificação de IgG humana a partir de solução de proteínas de extrato de sojaorgânica em gel ω-aminodecil-agarose. Faixas: HMW: marcador de alta massamolecular; I: amostra de injeção; L: "pool" das frações 3 a 8 da lavagem; E:"pool" das frações 34 a 36 da eluição e R: "pool" das frações 50 a 51 daregeneração; M marcador de IgG (Aventis Behring).

A Figura 4(c) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 12,5% sob condiçõesnão-redutoras das frações de injeção, lavagem e eluição do experimento depurificação de IgG humana a partir de solução de proteínas de extrato de sojaorgânica em gel ω-aminodecil-agarose. Faixas: LMW: marcador de baixamassa molecular; I: amostra de injeção; L: "pool" das frações 3 a 8 da lavagem;E: "pool" das frações 34 a 36 da eluição e R: "pool" das frações 50 a 51 daregeneração.

A Figura 5(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgGhumana a partir do soro humano por cromatografia negativa em gel ω-aminohexil-agarose em Hepes 25 mmol/L pH 6,8. Volume de alimentação de1,5 mL de soro humano diluído vinte vezes (volume final de 30,0 mL). Soluçãode soro a uma concentração de 3,29 mg/mL de proteína total. Total deproteína total injetada: 97,28 mg. (I) injeção da amostra; (L) lavagem; (E)eluição; (R) regeneração.

A Figura 5(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5% sob condiçõesnão redutoras das frações de alimentação, lavagem e da eluição doexperimento de purificação de IgG humana a partir do soro humano em gel ω-aminohexil-agarose. Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; 6-30:frações de alimentação;31-38: frações da lavagem; 60-62: frações da eluição;R: fração da regeneração; M: marcador de IgG humana (Aventis Behring).

A Figura 6(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgGhumana a partir plasma humano por cromatografia negativa em co-aminohexil-agarose, em Mops 25 mmol/L, pH 7,9. Volume do leito: 3,0 mL. Vazão: 0,5mL/min. Frações coletadas: 1,0 mL. Volume de alimentação de 0,75 mL deplasma humano diluído vinte vezes (volume final de 15,0 mL). Solução deplasma a uma concentração de 3,40 mg/mL de proteína total. Total de proteínatotal injetada: 51,03 mg. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R)regeneração.

A Figura 6(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5%, sob condiçõesnão-redutoras das frações de alimentação, lavagem e eluição do experimentode purificação de IgG humana a partir do plasma humano em gel ω-aminohexil-agarose. Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; I: amostra deplasma humano; 6-15: frações de alimentação; 16-22: frações de lavagem; 42-43: frações de eluição; R: fração de regeneração; M: marcador de IgG humana(Aventis-Behring).

Descrição Detalhada da Invenção

Os exemplos aqui descritos tem o intuito somente de exemplificaralgumas das inúmeras formas de realização da invenção, e portanto devem serencarados de forma ilustrativa, e não restritiva.A presente invenção refere-se a um processo de purificação de IgG coma utilização de adsorventes de baixo custo. Dentro do âmbito deste invento, otermo imunoglobulina G refere-se a imunoglobulinas G policlonais (origemhumana e animal) e monoclonais (provenientes de cultura de células dehibridomas), bem como as obtidas por via da tecnologia do DNA recombinante,produzidas em células microbianas, de inseto, animais ou vegetais ou emplantas transgênicas. E também IgG policlonal adicionada como "skiping" emextrato de grãos de soja.

Os materiais compreendendo IgG a ser purificada incluem, semlimitações, soro e/ou plasma sangüíneo e/ou bruto, sobrenadante de culturacelular (contendo anticorpos monoclonais) ou soluções de extratos vegetaiscontendo IgG1 sendo tais expressões intercambiáveis e com o intuito dedesignar uma solução compreendendo IgG.

No presente documento a Imunoglobulina G é denominada IgG;Tris(hidroximetil) aminometano é denominado Tris-HCI; Bis[2-hidroxietil]amino-tris[hidroximetil]metano é denominado Bis-Tris-HCI; Ácido [3-N-morfolino]propanosulfônico é denominado Mops; Ácido [Ν-2-hidroxietilpiperazina] N'-2-etanolsulfônico é denominado Hepes, Ácido [Ν-2-hidroxietilpiperazina] N'-3-propanolsulfônico é denominado Hepps; Ácido [2-N-morfolino] etanosulfônico édenominado MES; Ácido [piperazina] N,N'-bis-2-etanosulfônico é denominadoPipes; Fosfato de sódio é denomindo fosfato; acetato de sódio é denominadoacetato; 1,4 butanodiol diglicidil éter é denominado bisoxirano; albumina édenominada de Alb e transferrina é denominada de Trf.

O resultado surpreendente obtido pela invenção está na obtenção deIgG com alto grau de pureza em uma única etapa, sem a necessidade de pré-tratamento do soro ou do plasma sangüíneo, soluções de sobrenadante decultura celular de hibridomas contendo IgG monoclonal ou de soluções de IgGobtidas a partir de extratos vegetais.

Os géis utilizados no processo de purificação podem ser de agarosereticulada (2, 4 ou 6%) ou não reticulada para uso em equipamentos de baixaou de média pressão, mas preferencialmente com 4% de reticulação. Gel esteque pode ser ativado com reagentes de ativação como brometo de cianogênio(CNBr)1 epicloridrina, bisoxirano, periodato, glutaraldeído, cloreto de tosila oude tresila ou carbonildiimidazol, mas preferencialmente com bisoxirano (1,4butanoldiol diglicidil éter). As poliaminas a serem imobilizadas no gel deagarose para atuarem como Iigantes da cromatografia negativa podem ser ω-aminohexil, co-aminooctil, ω-aminodecil ou ω-aminododecil, maspreferencialmente ω-aminohexil ou ω-aminodecil. As poliaminas se diferemcom relação ao número de carbonos da cadeia alifática, ou seja, 6 carbonospara aminohexil, 8 carbonos para aminooctil, 10 carbonos para aminodecil e 12carbonos para aminododecil. A interação entre o Iigante poliamina e asproteínas do soro ou plasma sangüíneo são do tipo carga-carga ou carga-dipolo, podendo ainda ocorrer pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicascom a cadeia alifática da poliamina.

Preferencialmente usa-se géis contendo poliaminas com 6 e 10carbonos, pois as mesmas fornecem um grau de pureza mais elevado e melhorrendimento. A vantagem do uso das poliaminas está na obtenção de IgG comalta pureza em uma única etapa (em geral, com bom rendimento) e, alémdisso, de obter IgG em pHs em torno do fisiológico, miniminzando a perda deatividade da proteína alvo.

Destaca-se que deve ser observado que a invenção pode ser aplicada aoutros anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo os obtidos a partir deoutras fontes, produzidos pela tecnologia do DNA recombinante em célulasmicrobianas, animais, vegetais e em animais, leite e plantas transgênicas.

Processo de purificação de IgG

A cromatografia negativa consiste na passagem de uma solução dealimentação contendo a proteína a separar (neste caso IgG), injetada na colunacromatográfica, sendo que as moléculas que tem afinidade pelo Iiganteimobilizado (neste caso as poliaminas aminohexil, aminooctil, aminodecil ouaminododecil) são retidas no adsorvente, enquanto que a proteína alvo (nestecaso IgG) passa pela coluna sem ou com pouca interação. A não-retenção damolécula alvo (IgG) durante a etapa de alimentação e lavagem do adsorvente(passagem do mesmo tampão utilizado na etapa de alimentação(compreendendo tampões de 10 a 100 mmol/L, preferencialmente a 25 mmol/L,podendo ser utilizado o tampão selecionado dentre: Tris -HCI1 Bis-Tris-HCI1Mops1 Hepes1 Mes1 Hepps, Pipes1 fosfato e acetato, sendo que o pH dependedo tampão utilizado, desde que esteja na sua respectiva faixa tamponante)para eliminação de proteínas presentes nos poros ou retidas no espaçointersticial do gel) representa a principal e única etapa da purificação, na qual amolécula não retida (neste caso a IgG) é eliminada da coluna cromatográfica.Caso as proteínas adsorvidas na coluna sejam produtos de interesse, elaspodem ser recuperadas através do enfraquecimento das interações proteína-ligante, variando-se as condições do meio através da aplicação de um tampãoespecífico (tampão de dessorção que pode ser o mesmo tampão utilizado naetapa de alimentação acrescido de NaCI, podendo ser utilizado de 100 mmol/La 1,5 mol/L de NaCI, preferencialmente 1,0 mol/L). Caso as proteínasadsorvidas na coluna não forem produtos de interesse, estes podem serdescartados na etapa de regeneração do adsorvente utilizando-se solução dehidróxido de sódio a 25 ou 50mmol/L.

Na presente tecnologia o processo de purificação de IgG usandoadsorvente de baixo custo por cromatografia negativa compreende o seguinteprocedimento:

a) Diluir o soro ou plasma sangüíneo com tampão de adsorção (mesmoutilizado para equilibrar a coluna cromatográfica). Pode-se utilizar também soroou plasma bruto, soluções que contenham IgG obtidas em etapas defracionamento do plasma por precipitação com etanol. Pode-se ainda usarsobrenadante de cultura celular (contendo anticorpos monoclonais) ousoluções de extratos vegetais contendo IgG;

b) Injetar a solução de soro ou plasma diluído em tampão (sem pré-tratamento) e lavar com tampão a coluna cromatográfica empacotada com afase estacionária poliamina-agarose (pode ser utilizado preferencialmente co-aminodecil-agarose ou ω-aminohexil-agarose). Pode-se injetar de 10 a 20vezes o volume da coluna com a solução de soro ou plasma diluído em tampão(diluído 5, 10, 20, 30 ou 50 vezes);

c) Coletar as frações cromatográficas referentes à etapa de injeção elavagem. Nestas frações encontram-se IgG purificada;

d) Eluir as proteínas adsorvidas na fase estacionária com tampão dealta força iônica (elevada concentração de NaCI, podendo ser utilizado de 100mmol/L a 1,5 mol/L, preferencialmente 1,0 mol/L);

e) Opcionalmente, regenerar a coluna com solução de hidróxido desódio a 25 ou 50 mmol/L.

O processo de purificação de IgG compreende o uso de uma colunacromatográfica de baixa ou média pressão disponível comercialmente. Acoluna cromatográfica pode ser de plástico, aço ou vidro com dimensões de 5,0mm a 1,0 m de diâmetro interno e 5 a 200 cm de comprimento, sendo para apresente invenção concretização preferencialmente de 10 mm de diâmetrointerno e 10 cm de comprimento. A coluna é utilizada para o empacotamentodo adsorvente (fase estacionária). Podem ser utilizados os adsorventescontendo Iigantes imobilizados selecionados dos grupo de poliaminasaminohexil, aminooctil, aminodecil e aminododecil, como: ω-aminodecil-agarose, ou ω-aminooctil-agarose ou ω-aminohexil-agarose ou ω-aminododecil-agarose, para a presente invenção preferencialmente o ω-aminodecil-agarose e o ω-aminohexil-agarose, ambos com grau de reticulaçãoda agarose compreendendo 2 a 6%, preferencialmente 4%, podendo tambémusar agarose não reticulada. Os géis de agarose podem ser ativados paraposterior imobilização da poliamina com reagentes epoxi selecionados dentre:epicloridrina, 1,4 butanodioldiglicidil éter, 1,4 etanodioldiglicidil éter, 1,4propanodioldiglicidil éter, preferencialmente 1,4 butanodioldiglicidil éter,preferencialmente o 1,4 butanodioldiglicidil éter. Os géis de agarose podemainda ser ativados com outros reagentes tais como brometo de cianogênio(CNBr), glutaraldeído, periodato, cloreto de tosila ou de tresila oucarbonildiimidazol. Pode-se também, após ativação do gel acoplarcovalentemente braços espaçadores compreendendo moléculas com 8 a 14átomos, preferencialmente 10 a 12 átomos. Neste presente invento, osadsorventes utilizados tinham espaçadores de 12 átomos e foram adquiridoscomercialmente, da marca Sigma-Aldrich (EUA). Estes adsorventes podem,caso se queira ser preparados em laboratório.

Em seguida, a coluna cromatográfica é acoplada a qualquer tipo desistema cromatográfico de baixa pressão que seja composto de uma bombaperistáltica, um monitor de absorbância a 280 nm, um coletor de frações e umregistrador.

Após o acoplamento da coluna cromatográfica no sistemacromatográfico, a mesma deve ser equilibrada com o tampão de adsorçãocompreendendo 10 a 100 mmol/L, preferencialmente a 25 mmol/L, podendo serutilizado o tampão selecionado dentre:Tris-HCI (tris(hidroximetil) aminometano),Bis-Tris-HCI (Bis[2-hidroxietil]amino-tris[hidroximetil]metano), Mops (ácido [3-N-morfolino] propanosulfônico), Hepes (ácido [Ν-2-hidroxietilpiperazina] N'-2-etanolsulfônico) Mes (ácido [2-N-morfolino] etanosulfônico), Hepps (ácido [N-2-hidroxietilpiperazina] N'-3-propanolsulfônico, Pipes (ácido [piperazina] Ν,Ν'-bis-2-etanosulfônico), fosfato de sódio e acetato de sódio, sendo que o pHdepende do tampão utilizado, desde que esteja na sua respectiva faixatamponante. A corrente de saída da coluna é conectada a um monitor demedida de absorbância a 280 nm. Finalizada a etapa de equilíbrio da coluna, osoro ou plasma, diluído de 5 a 50 vezes (por exemplo), preferencialmente vintevezes no tampão de adsorção, é alimentado na coluna cromatográfica com auma vazão de cerca de 0,1 a 3,0 mL/min, preferencialmente 0,5 mL/min(correspondente a uma velocidade superficial de 38,2 cm/h). Esta vazão podeser aumentada ou diminuída, de acordo com a reticulação da agarose utilizada.

O volume de alimentação pode ser de 1 a 20 vezes o volume da colunacromatográfica, preferencialmente 10 vezes o volume da coluna. Durante aalimentação da coluna com soro ou plasma diluído, a solução de saída dacoluna contendo IgG purificada é coletada em tubos de ensaio de vidro ouplástico em um coletor de frações. Posteriormente a coluna é lavada, com omesmo tampão de adsorção, para eliminar a IgG não adsorvida que ficou retidafracamente nos interstícios do gel. Essa solução é também coletada em tubosde vidro ou plástico como descrito anteriormente. As demais proteínas do soroou plasma adsorvidas na fase estacionária podem ser recuperadas,dessorvendo-as pela alimentação da coluna com o tampão de adsorçãocontendo de 0,1 a 1,5 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), preferencialmente 1,0mol/L. As frações de saída são coletadas em tubos de ensaio em um coletor defrações. Finalmente, a fase estacionária é regenerada com uma solução deNaOH a 10 a 200 mmol/L, preferencialmente 50 mmol/L, seguido pela lavagemcom água ultrapura para que a coluna cromatográfica possa ser re-utilizada emum novo ciclo.

Resumindo, o procedimento do processo de purificação de IgG édescrito a seguir:

1) Equilíbrio da coluna cromatográfica com o tampão de adsorção(selecionado dentre os citados anteriormente);

2) Alimentação da solução de soro ou de plasma sangüíneo diluído emtampão de adsorção, ou de soluções de IgG adicionadas como "spiking" emextratos protéicos vegetais, em coluna cromatográfica contendo o gel deagarose com a poliamina imobilizada (preferencialmente ω-aminodecil-agaroseou ω-aminohexil-agarose). Nesta etapa obtém-se IgG com alto grau de pureza;

3) Lavagem da coluna cromatográfica com o tampão de adsorção com ointuito de remover as proteínas fracamente adsorvidas ou presentes nosinterstícios do gel. Nesta etapa também obtém-se IgG com alto grau de pureza;

4) Eluição das proteínas adsorvidas (dessorção) por aplicação detampão contendo alta força iônica (pode-se usar 1,0 mol/L de cloreto de sódioadicionado ao tampão de adsorção);

5) Opcionalmente, regeneração do adsorvente com solução de hidróxidode sódio de 10 a 200 mmol/L, seguida de lavagem da coluna com águaultrapura, para ser utilizado em um novo ciclo.

Para verificar os resultados do processo de purificação, procedimentosanalíticos foram realizados. As frações obtidas da cromatografia negativa parapurificação de IgG foram analisadas por SDS-PAGE, em gel de poliacrilamida a7,5% e 12,5% e sob condições desnaturantes e não redutoras, segundoprocedimento de Laemmli (1970) e coloração com nitrato de prata, conformeMorrissey (1981).

As frações cromatográficas foram analisadas por nefelometria visandodeterminar as quantidades das proteínas IgG, IGA, IgM, albumina (AIb) etransferrina (Trf) humanas, segundo procedimento descrito pelo fabricante donefelômetro Beckman Array 360 System (Beckman, EUA).

A quatidade de proteína toral presente nas frações cromatográficas enas amostras de injeção foi determinada pelo método colorimétrico de Bradford(1976), utilizando albumina do soro bovino (BSA) como proteínas de referência.

Exemplo 1

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonalhumana a partir do soro humano, por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose.

O soro humano foi diluído vinte vezes em tampão Hepes a 25 mmol/L,pH 6,8, denominado de adsorção. A coluna cromatográfica de vidro da marcaGE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm de diâmetro interno e 10 cm de altura)foi preenchida com 3,0 mL de gel ω-aminodecil-agarose e, em Seguidaj o gelfoi equilibrado com tampão de adsorção Hepes 25 mmol/L, pH 6,8 a uma vazãode 0,5 mL/min. Um volume de 1,5 mL de soro humano diluído vinte vezes emtampão de adsorção (volume final de 30,0 mL), a uma concentração inicial de3,09 mg/mL de proteína total, foi alimentado na coluna na mesma vazão. Asfrações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica dealimentação foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio.

A lavagem da coluna foi efetuada com o tampão de adsorção e asfrações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica delavagem também foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio.A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com o mesmo tampão deadsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), mantendo-sè o pHajustado em 6,8. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapacromatográfica de eluição foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos deensaio. Os resultados desta cromatografia negativa para purificação de IgGhumana em gel ω-aminodecil-agarose e a eletroforese SDS-PAGE paradeterminação da pureza das frações cromatográficas estão apresentados nasFiguras 1a e 1b.

Realizaram-se análises nefelométricas para determinar a concentraçãode IgG, IgA (imunoglobulina A), IgM (imunoglobulina M), Alb (albumina) e Trf(transferrina) e calcular a porcentagem de recuperação, pureza e o fator depurificação da IgG das frações cromatográficas coletadas e os resultados, estãoapresentados na Tabela 1. As análises foram realizadas agrupando-se ("pool")as frações cromatográficas referentes à purificação de IgG contidas na etapade alimentação (frações 1-26, eletroforese Figura 1b), "pool" das frações 27-36referentes as etapas de alimentação e lavagem (eletroforese Figura 1b) e"pool" das frações da etapa de eluição (frações 65 e 66, Figura 1b).

Tabela 1: Massa de proteínas obtida por nefelometria referente ao "pool" dasfrações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir dosoro humano por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose

Purificação

<table>table see original document page 17</column></row><table>

a PT: proteína total, dosagem pelo método de Bradford, 1976.b Pureza: razão entre a massa de IgG e a massa de proteína total χ 100c FP: Fator de purificação, razão entre a pureza do material na etapa indicada e a pureza domaterial injetado

*n.d.: abaixo do limite de detecção do aparelho (0,93 mg/dL para IgG1 0,62 mg/dL para Alb,1,11 mg/dL para IgA1 0,69 mg/dL para IgM e 0,35 mg/dL para TrT),

Neste exemplo é mostrado que a IgG obtida nas frações não retidas de1 a 26 desta cromatografia foram consideradas eletroforeticamente puras.Tem-se que, do total de IgG alimentada na coluna, 92,7% da IgG foi purificadapela cromatografia negativa com grau de pureza de 98% (baseado nasanálises nefelométricas de IgG1 IgA1 IgM1 albumina e transferrina) em gel ω-aminodecil-agarose (frações de 1 a 36). Essa porcentagem foi calculada comoa razão entre a massa de IgG obtida na etapa de alimentação e lavagem(Tabela 1) e a massa de IgG contida no material inicial injetado vezes 100. Osvalores de pureza que constam na Tabela 1 para as frações de alimentaçãoestão acima de 100%, pois o método de Bradford, que é um método utilizadopara determinação de proteína total, subestima a concentração de IgG nestasfrações, uma vez que elas estão com grau de pureza elevado. O método deBradford apresenta grande variação de resposta, dependendo da proteínadosada, sendo que para Alb a apresenta a maior sensibilidade (Hammond eKruger, 1988).

Exemplo 2

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonalhumana a partir do plasma humano, por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose.

O plasma humano foi diluído vinte vezes em tampão Mops a 25 mmol/L,pH 7,9. Este tampão foi chamado de tampão de adsorção. A colunacromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm dediâmetro interno e 10 cm de altura) foi preenchida com 3,0 mL de gel ω-aminodecil-agarose e, em seguida, equilibrada com tampão de adsorção Mopsa 25 mmol/L, pH 7,9, a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 0,75 mL deplasma humano diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volume final de15,0 mL), a uma concentração inicial de 3,40 mg/mL de proteína total, foialimentado na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída dacoluna referentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas emvolumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada como tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes àetapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com omesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio(NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 7,9. As frações da corrente de saída dacoluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas emvolumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. Os resultados da cromatografianegativa para purificação de IgG humana em gel ω-aminodecil-agarose e aeletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das fraçõescromatográficas estão apresentados nas Figuras 2a e 2b e na Tabela 2.

Tabela 2: Massa de proteínas obtida por nefelometria referente ao "pool" dasfrações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir doplasma por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose em Mops 25mmol/L pH 7,9.

<table>table see original document page 19</column></row><table>

a PT: Proteína total, dosada pelo método de Bradford, 1976

b Pureza: razão entre a massa de IgG e a massa de proteína total χ 100c FP: Fator de purificação, razão entre a pureza do material na etapa indicada e a pureza domaterial injetado

Vi.d.: abaixo do limite de detecção do aparelho (0,93 mg/dl_ para IgG, 0,62 mg/dL para Alb,1,11 mg/dL para IgA1 0,69 mg/dL para IgM e 0,35 mg/dL para Trf).

Neste exemplo é mostrado que a IgG obtida nas frações não retidas de3 a 10 desta cromatografia foram consideradas eletroforeticamente pura. Tem-se que, do total de IgG alimentada na coluna, 77% da IgG foi purificada comgrau de pureza de 96% (baseado nas análises nefelométricas de IgG1 IgA1 IgM1albumina e transferrina) pela cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose a partir do plasma humano (frações de 3 a 22). Essa porcentagem foicalculada como a razão entre a massa de IgG obtida na etapa de alimentaçãoe lavagem (Tabela 2) e a massa de IgG contida no material inicial injetadovezes 100. Os valores de pureza que constam na Tabela 2 para as frações dealimentação estão acima de 100%, pois o método de Bradford1 que é ummétodo utilizado para determinação de proteína total, subestima aconcentração de IgG nestas frações, uma vez que elas estão com grau depureza elevado. O método de Bradford apresenta grande variação de resposta,dependendo da proteína dosada (Hammond e Kruger, 1988), sendo que paraAlb a apresenta a maior sensibilidade.

Exemplo 3

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonal decoelho a partir do soro de coelho, por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose.

O soro de coelho foi diluído vinte vezes em tampão Hepes a 25 mmol/L,pH 6,8. Este tampão foi chamado de tampão de adsorção. A colunacromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm dediâmetro interno e 10 cm de altura), foi preenchida com 2,0 ml_ de gel ω-aminodecil-agarose e, em seguida, equilibrada com tampão de adsorçãoHepes 25 mmol/L, pH 6,8 a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 50 μΙ_ desoro de coelho diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volume final de 1,0mL), a uma concentração inicial de 2,70 mg/mL de proteína total, foi alimentadana coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída da colunareferentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas em volumesde 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada com otampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes àetapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com omesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio(NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 6,8. As frações da corrente de saída dacoluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas emvolumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. Os resultados da cromatografianegativa para purificação de IgG de coelho em gel ω-aminodecil-agarose e aeletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das fraçõescromatográficas estão apresentados nas Figuras 3a e 3b e na Tabela 3.

Volume do leito: 2,0 mL. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição;(R) regeneração.

Tabela 3: Massa de proteínas totais referente ao "pool" das frações das etapascromatográficas da purificação de IgG de coelho a partir de soro de coelho porcromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose.

<table>table see original document page 21</column></row><table>

a Dosagem pelo método de Bradford, 1976.

Neste exemplo é mostrado que 0,04 mg de IgG de coelho foi purificadapela cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose. Essa massa deproteína foi calculada com base na medida de proteína total. A IgG obtida nasfrações não retidas de 4 a 6 desta cromatografia foram consideradaseletroforeticamente puras.

Exemplo 4Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonalhumana adicionada como "spiking" em extrato protéico de grãos de sojaorgânica, por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose.

Os grãos de soja orgânica da marca Jasmine (PR, Brasil), lote 402,foram moídas a seco utilizando um micro moinho de facas (Tecnal TE - 648,Brasil). A farinha de soja foi peneirada utilizando-se a fração passante empeneira de abertura de 0,50 mm. Em seguida, a farinha de soja foidesengordurada utilizando-se hexano (Merck, Alemanha), a 60°C, em aparelhotipo Soxhlet, conforme descrito por Robic (2005). Um volume de 400 ml_ dehexano foi usado para 100 g de farinha de soja durante 6 horas e a mesma foiretirada do aparelho e deixada no dessecador à temperatura ambiente durante8 horas para evaporação do hexano. Após o desengorduramento, a extraçãodas proteínas de soja foram efetuadas em um béquer de 250 ml_, adicionando-se 5,0 g de farinha de soja desengordurada que foram agitados com 100 mL detampão fosfato de sódio 50 mmol/L pH 7,0 por 30 min, a 20°C. Utilizou-seagitador mecânico modelo Q-251D (IKA Labortechnic, Alemanha) comimpelidor do tipo pás inclinadas (4 cm de diâmetro e inclinação de 45°,construído pela Kroma, Brasil) a uma rotação de 500 rpm por 30 min. Asuspensão foi centrifugada a 10.000 g por 20 min a 5 0C em uma centrífuga(5804R, Eppendorf, Alemanha). O sobrenadante foi removido, filtrado emmembrana com diâmetro de poro de 3 pm (Inlab, Brasil), trocado o tampãopara Hepes 25 mmol/L a pH 6,8 e a esta solução foi acrescido IgG humana naconcentração de 50 mg/mL ("spiking").

A coluna cromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C10/10 (10 mm de diâmetro interno e 10 cm de altura) foi preenchida com 2,0mL de gel ω-aminodecil-agarose e, em seguida, foi equilibrada com tampão deadsorção Hepes 25 mmol/L, pH 6,8 a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de1,0 mL de extrato de grãos de soja orgânica contendo IgG humana policlonal(20 μl de uma solução de IgG a 50 mg/mL) a uma concentração inicial de 5,35mg/mL de proteína total, foi alimentada na coluna na mesma vazão. As fraçõesda corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica dealimentação foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. Alavagem da coluna foi efetuada com o tampão de adsorção e as frações dacorrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de lavagemtambém foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio e,posteriormente, agrupadas em um único frasco de vidro, formando um "pool". Aeluição das proteínas adsorvidas foi realizada com o mesmo tampão deadsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), mantendo-se o pHajustado em 6,8. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapacromatográfica de eluição foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos deensaio. As frações de eluição foram agrupadas em um único frasco de vidro,formando um "pool". Os resultados da cromatografia negativa para purificaçãode IgG humana adicionada ("spiking") em solução protéica de extrato de soja,em gel ω-aminodecil-agarose e as eletroforeses SDS-PAGE para determinaçãoda pureza das frações cromatográficas estão apresentados nas Figuras 4a, 4be 4c e na Tabela 4.

Tabela 4: Massa de proteínas obtida pelo método de Bradford e nefelometriareferente ao "pool" das frações das etapas cromatográficas da purificação deIgG humana a partir de extrato protéico de grãos de soja com "spiking" de IgGhumana por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose em Hepes 25mmol/L pH 6,8.

<table>table see original document page 23</column></row><table>

a PT: proteína total, massa determinada pelo método de Bradford, 1976

b massa determinada por nefelometriac Μ: massa de IgG em cada etapa dividida pela massa de IgG inicial no processo χ 100d Massa de IgG do "pool"dividida pela massa de proteína total do "pool" χ 100

Neste exemplo é mostrado que 26,9% da IgG humana foi purificada comgrau de pureza de 96% (baseado nas análises nefelométricas de IgG, IgA1 IgM1albumina e transferrina) na fração de lavagem pela cromatografia negativa emgel ω-aminodecil-agarose a partir de solução de proteínas de extrato de soja.Essa porcentagem foi calculada como a razão entre a massa de IgG obtida naetapa de alimentação (Tabela 4) e a massa de IgG contida no material inicialinjetado vezes 100. A IgG obtida na fração de lavagem desta cromatografia foiconsiderada eletroforeticamente de alta pureza, podendo ser observado traçosde proteína da soja.

Exemplo 5

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonalhumana a partir do soro humano, por cromatografia negativa em gel ω-aminohexil-agarose.

O soro humano foi diluído vinte vezes em tampão Hepes a 25 mmol/L,pH 6,8. Este tampão foi chamado de tampão de adsorção. A colunacromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm dediâmetro interno e 10 cm de altura), foi preenchida com 3,0 mL de gel ω-aminohexil-agarose e, em seguida, foi equilibrada com tampão de adsorçãoHepes a 25 mmol/L, pH 6,8, a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 1,5 mLde soro humano diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volume final de30,0 mL), a uma concentração inicial de 3,29 mg/mL de proteína total, foialimentada na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída dacoluna referentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas emvolumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada como tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes àetapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com omesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio(NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 6,8. As frações da corrente de saída dacoluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas emvolumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. As frações de eluição foram agrupadasem um único frasco de vidro, formando dois "pools". Os resultados dacromatografia negativa para purificação de IgG humana em gel co-aminohexil-agarose e a eletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das fraçõescromatográficas estão apresentados nas Figura 5a e 5b e na Tabela 5.Tabela 5: Massa de proteínas obtida por nefelometria referente ao "pool" dasfrações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir dosoro humano por cromatografia negativa em gel ω-aminohexil-agarose.

<table>table see original document page 25</column></row><table>

a Proteína Total: Dosagem pelo Método de Bradford, 1976.

b Pureza: Pureza: razão entre a massa de IgG e a massa de proteína total χ 100

c FP: Fator de purificação, razão entre a pureza do material na etapa indicada e a pureza domaterial injetado

*n.d.: abaixo do limite de detecção do aparelho (0,93 mg/dL para IgG, 0,62 mg/dL para Alb11,11 mg/dL para IgA, 0,69 mg/dL para IgM e 0,35 mg/dL para Trf).

Neste exemplo é mostrado que a IgG obtida nas frações não retidas de1 a 38 desta cromatografia foi considerada eletroforeticamente pura. Tem-seque, do total de IgG alimentada na coluna, 76,8% da IgG foi purificada pelacromatografia negativa com grau de pureza de 100% (baseado nas análisesnefelométricas de IgG1 IgA1 IgM1 albumina e transferrina) em gel ω-aminohexil-agarose a partir do soro humano. Essa porcentagem foi calculadacomo a razão entre a massa de IgG obtida nas etapas de alimentação elavagem (Tabela 5) e a massa de IgG contida no material inicial injetado vezes100. Os valores de pureza que constam na Tabela 5 para as frações dealimentação e lavagem estão acima de 100%, pois o método de Bradford, queé um método utilizado para determinação de proteína total, subestima aconcentração de IgG nestas frações, uma vez que elas estão com grau depureza elevado. O método de Bradford apresenta grande variação de resposta,dependendo da proteína dosada, sendo que para Alb a apresenta a maiorsensibilidade (Hammond e Kruger1 1988).

Exemplo 6

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonalhumana a partir do plasma humano, por cromatografia negativa em gel ω-aminohexil-agarose.

O plasma humano foi diluído vinte vezes em tampão Mops a 25 mmol/L,pH 7,9. Este tampão foi chamado de tampão de adsorção. A colunacromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm dediâmetro interno e 10 cm de altura) foi preenchida com 3,0 mL de gel ω-aminohexil-agarose e, em seguida, foi equilibrada com tampão de adsorçãoMops a 25 mmol/L, pH 7,9, a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 0,75mL de plasma humano diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volumefinal de 15,0 mL), a uma concentração inicial de 3,40 mg/mL de proteína total,foi alimentada na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída dacoluna referentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas emvolumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada como tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes àetapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com omesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio(NaCI)1 mantendo-se o pH ajustado em 7,9. As frações da corrente de saída dacoluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas emvolumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. As frações de eluição foram agrupadasem um único frasco de vidro, formando dois "pools". Os resultados dacromatografia negativa para purificação de IgG humana em gel co-aminohexil-agarose e a eletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das fraçõescromatográficas estão apresentados nas Figuras 6a e 6b e na Tabela 6.Tabela 6: Massa de proteínas obtida por nefelometria referente ao "pool" dasfrações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir doplasma humano por cromatografia negativa em gel ω-aminohexil-agarose.

<table>table see original document page 27</column></row><table>

aPT: Proteína total, dosada pelo método de Bradford, 1976

b Pureza: Pureza: razão entre a massa de IgG e a massa de proteína total χ 100

0 FP: Fator de purificação, razão entre a pureza do material na etapa indicada e a pureza domaterial injetado

*n.d.: abaixo do limite de detecção do aparelho (0,93 mg/dL para IgG1 0,62 mg/dL para Alb11,11 mg/dL para IgA1 0,69 mg/dL para IgM e 0,35 mg/dL para Trf).

Neste exemplo é mostrado que, do total de IgG alimentada na colunacromatográfica, 69,3% da IgG foi purificada pela cromatografia negativa comgrau de pureza de 100%(baseado nas análises nefelométricas de IgG1 IgA1lgM1 albumina e transferrina) em gel ω-aminohexil-agarose a partir do plasmahumano. Essa porcentagem foi calculada como a razão entre a massa de IgGobtida na etapa de alimentação e lavagem (Tabela 6) e a massa de IgG contidano material inicial injetado vezes 100. A IgG obtida nas frações não retidas de6 a 22 desta cromatografia foram consideradas eletroforeticamente de altapureza, podendo ser observado traços de proteína do plasma. Os valores depureza que constam na Tabela 6 para as frações de alimentação e lavagemestão acima de 100%, pois o método de Bradford, que é um método utilizadopara determinação de proteína total, subestima a concentração de IgG nestasfrações, uma vez que elas estão com grau de pureza elevado. O método deBradford apresenta grande variação de resposta, dependendo da proteínadosada, sendo que para Alb a apresenta a maior sensibilidade (Hammond eKruger, 1988).

Referências

Andrade D.; Hlady V.; Annals New York Academy of Science, 516, 158-172,1987.

Bernard, J.; levy, J.P.; Varet, B.; Clauvel, J.P.; Rain, J.D.; Sultan, Y.

Hématologie, Masson, Paris, p.193-267, 1990.Blank1 G.S.; Zapata, G.; Fahrner, R.; Milton, M.; Yedinak, C.; Knudsen, H.;

SchmeIzerC.; Bioseparation, 10, 65-71, 2001.Borjesson P.K.E.; Postema E.J.; de Bree R.; Roos J.C.; Leemans C.R.;

Kairemo K.J.A.; van Dongen G.A.M.S.; Oral Oncology1 40, 761-772, 2004.Boyle1 M.D.P.; Reis, K.J.; Bio/Technology, 5, 1987.

Bradford, M. M.; Analytical Biochem, v. 72, p. 248-254, 1976.Burnouf1 T.; J. Chromatogr B, 664, 3-15, 1995.

Burnouf, T.; Transfusion Medicine Reviews, 27, 101-117, 2007.Burnouf, T.; Radosevich, M.; Biochem Biophys Methods, 49, 575-586, 2001.

Cohn E.J.; Strong L.E.; Hughes Jr W.L.; Mulford D.J.; Ashworth J.N.; Melin M.;

Taylor H.L.; JAmerican Chem Soe, 68, 459-475, 1946.

Fuglistaller, P.; J Immunol Methods, 124, 171-177, 1989.

Hammond, J.B.; Kruger, N.J. The Bradford method for protein quantification. InMethods in Molecular Biology, New Protein Techniques, Vol 3, Walker, J.M.(ed.), Springer Verlag, NY, p. 25-33, 1988.

Hemoderivados, ANBIO, Associação Nacional de Biossegurança,www.anbio.org.br/pdf/2/tr07_hemoderivados.pdf, acessado em agosto 2006.Holt, L.J.; Herring1 C.; Jespers1 L.S.; Woolven, B.P.; Tomlinson, I.A., Trends

Biotechnol, 21, 484-490, 2003.Kempf, C.; Stucki, M.; Boschetti, N.; Biologicals, 35, 35-42, 2007.Laemmli, U.K. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.Lu B.; Smyth M.R.; OKennedy R.; Analyst, 121, R29-R32, 1996.

Morrissey, J.M.; Analytical Biochem, ν. 117, ρ. 307-310, 1981.

Muronetz V.I.; Korpela T.; J ChromatogrB, 790, 53-66, 2003.

Petsch, D.; Deckwer1 W.D; Anspach, F.B.; Legallais, C.; Vijayalakhimi, M.; JChromatogrB, 707, 1998, 121-130.

Pitiot, O.; Nedonchelle, E.; Legallais, C., Vijayalakshmi, Μ. Α., J Chromatogr Β,758,173-182,2001.

Robie, G. Soja como biorreator: estudo de extração e purificação de proteínarecombinante utilizando β-glucuronidase, Campinas: Faculdade de10 Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, 82p. Dissertação(Mestrado), 2005.

Roque, A.C.A.; Lowe, C.R.; Taipa, M.A.; Biotechnol Progress, v. 20, p. 639-654,2004.

Tanaka K., Sawatani E., Dias G.A., Shigueoka E.M., Campos T.C.X.B., NakaoH.C., Arashiro F.; Braz J Med Bio Res, 33, 27-30, 2000.

Tanaka K., Sawatani E., Shigueoka E.M., Campos T.C.X.B., Nakao H.C., DiasG.A., Fujta R.K., Arashiro F.; Braz J Med Bio Res, 31, 1375-1381, 1998.

Claims (18)

1. Processo de purificação de imunoglobulina G caracterizado porcompreender as etapas de:a) Diluir o material compreendendo IgG com tampão de adsorção;b) Injetar o material diluído em tampão e lavar com tampão a colunacromatográfica empacotada com a fase estacionária poliamina-agarose;c) Coletar as frações cromatográficas referentes à etapa de injeção elavagem;d) Eluir as proteínas adsorvidas na fase estacionária com tampão dealta força iônica; ee) Opcionalmente, regenerar a coluna com solução de hidróxido desódio.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelomaterial compreendendo IgG ser escolhido do grupo que compreende soroe/ou plasma sangüíneo e/ou bruto, sobrenadante de cultura celular,opcionalmente contendo anticorpos monoclonais do tipo IgG, soluções deextratos vegetais e combinações dos mesmos.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelomaterial ser soro e/ou plasma sangüíneo.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelotampão de adsorção ser escolhido do grupo que compreende Tris-HCI, Bis-Tris-HCI, Mops, Hepes, Mes, Hepps, Pipes, fosfato e acetato.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelaconcentração do tampão ser de 10 a 100 mmol/L.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelaconcentração ser 25 mmol/L.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peladiluição do material contendo IgG ser de até 50 vezes.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelapoliamina da fase estacionária ser escolhida do grupo que compreende ω-aminohexil, ω-aminooctil, ω-aminodecil, ω-aminododecil e combinações dasmesmas.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelapoliamina ser ω-aminohexil e/ou ω-aminodecil.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelaagarose compreender um grau de reticulação de 2 a 6%.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo graude reticulação ser 4%.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelaagarose ser não reticulada.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelovolume injetado ser de 10 a 20 vezes o volume da coluna cromatográficaempacotada.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelotampão de alta força iônica compreender de 100 mmol/L a 1,5 mol/L.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelotampão compreender aproximadamente 1,0 mol/L.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelotampão ser escolhido do grupo que compreende Tris-HCI, Bis-Tris-HCI, Mops,Hepes, Mes, Hepps, Pipes, fosfato e acetato.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelohidróxido de sódio estar em uma concentração de 25 a 50 mmol/L.

18. Imunoglobulina G purificada caracterizada por ser obtida por umprocesso descrito nas reivindicações 1 a 17.