BRPI0821998A2

BRPI0821998A2 - composições de imunomodulação e usos para a mesma.

Info

Publication number: BRPI0821998A2
Application number: BRPI0821998A
Authority: BR
Inventors: De Rose Robert; Kent Stephen; Peut Vivienne
Original assignee: Opal Therapeutics Pty Ltd
Priority date: 2008-01-16
Filing date: 2008-01-16
Publication date: 2019-08-27
Also published as: EP2231172A1; US20110008417A1; CA2711145A1; CN101951931A; JP2011509945A; AU2008348260A1; WO2009089568A1

Abstract

composições de imunomodulação e usos para a mesma esta invenção divulga as composições que consistem essencialmente em um polipeptídeo gag ou pelo menos em uma parcela disso, e opcionalmente células apresentando antígeno ou seus precursores, para tratar ou impedir as infecções lentivirais que incluem o tratamento ou a prevenção de doenças adquiridas relacionadas da imunodeficiência. em determinadas incorporações, as composições consistem essencialmente em uma pluralidade de sobreposição e/ou não - sobreposição de derivados peptídeos de um único polipeptídeo gag ou de polipeptídeos diferentes gag.

Description

COMPOSIÇÕES ISfíJNOMODULAOORAS E USOS DESTAS

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta. invenção está relacionada de forma geral à modulação de respostas imunes, Mais particularmente, a presente invenção está relacionada às composições que consistem basicamente em um polipeptídeo Gag ou pelo menos uma porção desta e, opcíonalmente, células apresentadoras de antígeno ou seus precursores, para o tratamento ou a prevenção de infecções lentivirais, incluindo o tratamento ou prevenção de doenças de imuncdeficiênoia adquirida relacionadas. Em certas modalidades. as composições consistem basicamente em diversos peptídeos superpostos e/ou não superpostos derivados de um único polipeptídeo Gag ou de polipeptídeo» Gag diferentes.

IS Detalhes bibliográficos de vazias publicações numericamente citadas neste pedido estão listados no final da descrição.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Imunoterapias eficazes para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) são necessárias. As terapias farmacolcgicas são para toda a vida com toxicidades significativas. Várias tentativas na imunetezapia do HIV com o usa de vacinas convencíonais têm sido até agora pouco imunogênicss e pouco· eficazes em experimentos humanos uso de células apresentadoras de antígeno profissionais cos», por exemplo,· células dendríticas, para a produção de imunoterapias para o HIV demonstrou eficácia em macacos e estudos-pi loto em humanos, mas se limita às instalações altamente espacial iradas Uma imunoterapia intermitente simples que reduz a necessidade de terapia antirretroviral ίΑκ’Γ) de longo prazo seria um avanço signif icativo no c r a t ame rí t o de Η X V.

Recentemente. foi desenvolvida uma imuncterapia pelos presentes inventores, que envolve o tratamento de células l mononucleares (PBMC) do sangue tocai nâo fracionada ou do sangue periférico com peptídeos superpostos derivados do vírus. Significativamente, essa imunoterapia simples_fdenominada QPAL ('‘Overlapping Peptide-pulsed Auto logons Leukocytes -= Leucócitos Autôlogos Pulsados com Peptideos 10 Superpostos},. produziu respostas imunes mediadas por células robustas contra infecções virais, incluindo infecções pelo KIV, em populações endogâmicas 'Ή A tecnologia OPAL possui varias vantagens, incluindo (1) não há necessidade de cultura, prolongada- -ex vivo de célula®: 15 apresentadoras de antígeno, '2) indução de respostas de célula T CC^f<õ e CDS' tanta às proteínas estruturais quanto reguladoras, e (3} fácil produção de antígenos peptídicos.

Os presentes inventores descobriram agora que, quando macacos rabo-de-porco são imunizados com células sanguíneas 20 frescas expostas aos peptídeos superpostos do vírus da imunodeficiência símia (SIV), não hã diferença na resultado viral final entre animais imunizados contra Gag isoladamente (''animais QPAL-Gag) e aqueles imunizados contra todo o protaoma do SXV {animais GPA.L-Al 1, o que 25 sugere que Gag isoladamente é um antígeno eficaz para imunoterapias com células Ί. Adicionalmente, foi verificado inesperadamente true as respostas Gag-especxficas de células T CD4 e CD8* em animais OPAL-Qag eram signi.ficativamente maiores do que aquelas nos animais OPAL All, apesar de uma 30 dose idêntica de peptídeos Gag superpostos. Isso sugere que

3/139 há uma compet içao antigênica entra peptídeos Ga<j e as outras proteínas do S.XV e que a indução de respostas de células T não-Gag irminodominaxites por vacinas de multiproteínas de Hiv pode lisátar o desenvolvimento de respostas de células T Gag~específicas terapêuticas ou profiláticas. Essas descobertas foram praticadas em •ovas composições e métodos para o tratamento ou a prevenção de infecções lentivirais# incluindo o tratamento e prevenção de doenças associadas àquelas infecções,

SÜMÃRSO DA INVENÇÃO ‘OTXS^s:>£jÚΦtí.ΓΙί’ϊΐ Ωγ·. Γ>1 HV^ncSo fornece métodos para o tratamento ou a prevenção de uma infecção por lent!vírus em um indivíduo. em que os métodos consistem basicamente no aumento no indivíduo do número de células apresentadoras de antígeno ou precursoras de células apresentadoras de antígeno,. que apresentam em sua superfície pelo manes um peptideo que compreende uma seqüência de aminoácidos que corresponde a uma porção de um polipeptídeo Gag. lesas células apresentadoras cie antígeno e seus precursores também são aqui denominadas 'células apresentadoras oe antígeno Gag-especiticas” e precursores da célula apresentadora de antígeno Gag-especifica, respectivamente. Células apresentadoras de antígeno· não limitantes incluem células dendrítieas, macrófagos e células de Langerhans.

Qualquer método adequado de aumento do número de cé1u1a s a pra sentado ra s de an tí gene Gag-espec Ϊ f ica s ou precursores no indivíduo é cont.emp.lado pela presente invenção.. Em algumas modalidades, o indivíduo .recebe a administração de um estimulador imune oue aumenta o número / X3 9 de céIvlas apresencsdoras de antigene cu precursores de células apresentadoras de antígeno, que apresentam em sua superfície pelo menos um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que corresponde a uma porção de um polipeptídeo Gag. Era exemplos 'ilustrativos desse tipo, o estimaiador imune está na forma de células apresentadoras de antígeno ou precursores, que foram colocadas em contato com uma composição que consiste basicamente em um polipeptídeo Gag ou pelo menos um peptídeo que compreende .10 uma seqüência de aminoácidos que corresponde a um polipeptídeo Sag per um período e sob condições suficientes para que o polipeptídeo Gag ou o(s) peptídeo(a), ou formas processadas do polipeptídeo Gag ou dois; peptídeois;> sejam apresentadas pelas células apresentadoras de antígeno ou 15 por seus precursores. Em outros exemplos ilustrativos, o estimulador imune está na forma de células apresentadoras de antígeno ou precursores da célula apresentadora de antígeno que contêm uma construção de ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um 20 polipeptídeo Gag ou pelo menos um peptídeo que compreende umes seqüência de aminoáeidos que cor responde a uma porção de um oollpeptideo Gag, em que a seqüência de nucleotídeos está conectada operaslonaImente a um elemento regulador que é openáves x^as celuxas apresentadoras ae antígeno ou em

true expressam G.ag . Ainda em outros exemplos ilustrativos, o estimulador imune está na forma de uma composição que consiste basicamente em pelo menos uma molécula de Gag ‘80 selecionada de um soli cent ideo Gao, um neptídeo cue

Adequadamente, o comprimento des peptideas é selecionado para aumentar a produção de uma resposta ds linfóeitos T citolítieos (por exemplo, peptídeos com cerca de 8 a cerca de XO aminoácidos de comprimento}, ou uma resposta de 5 linfócitos T auxiliares (helper; (por exemplo, peptídeos com cerca de 12 a cerca de 20 aminoácidos de comprimento} .

Em	algumas	modalidades,	as seqüências	peptídicas	são
derivadas de pela menus seres de 30,	31,	32,	33. 34.
36.	37,	38,	39,	4 0,	41, 4 2 ,	. 43, 44,	45.	46 ,	t If i	48. 49.	7\|9q.:::
10: 51.	50,	£3 ,	54 ,	55,	S3, £7.	. 58, 59,	:W,	61,	82,	63, 64,	85 ,
88 .	67,	β 8 ,	6 9,	7 0,	71, W,	73, 74,	75,	75,		78, 79,	•tlr·
81,	62,	83 ,	84 ,	85,	8 6 ,. 8 7 .	88, 89,	90.	91,,	92,	93, 94,	95.,
96,	97	f	SG,	99%	da	sequência	que	corre spande	ao

polipeptídeo Gag. Em modalidades específicas, cs diversos 15 peptideos compreendem peptideos de dois ou mais polipeptídeos Gag diferentes.

Consequentemente, em um aspecto relacionado, a presente invenção contempla métodos para o tratamento ou a prevenção de uma infecção por lentivírus em um indivíduo., 20 em que os métodos compreendem o aumento nc indivíduo do número de células apresentadoras de antígeno Gagespecí ficas ou de precursores da célula, apresentadora de antígeno Gag-específica, que apresentam em sua superfície pelo menos um peptides que compreende uma seqüência de 25 aminoácidos que corresponda a um,a porção de um polipeptídeo Gag, em que as células apresentadoras de antígeno Gagespecíficas ou os precursores da célula apresentadora de antígeno Gag~específica são produzidos por contato das células apresentadoras de antígeno ou de precursores da 30 célula apresentadora de antígeno com uma composição que consiste basicamente em diversos peptídeos por um período e sob condições suficientes para que os pept.idees, ou as formas processadas dos peptídeos, sejam apresentados pelas células apresentadoras de antígeno ου pelos precursores em 5 sua superfície, em que os peptideos individuais da composição compreendem porções diferences de uma seqüência de aminoácidos que correspondem a um polipeptídeo Gag e, c-pcíonalmente , exibem Identidade ou similaridade de seqüência parcial para pelo menos outro peptídeo doa 10 diversos peptideos. Em algumas modalidades, o indivíduo recebe a administração das células apresentadoras de antígeno Gag~espedficas ou -dos precursores da célula apresentadora de antígeno Gag-especifica. Em outras modalidades< o indivíduo recebe a administração da 1 s c ompwi ç ão .>

Outro aspecto da presente invenção fornece composições para o tratamento ou a prevenção de uma infecção por lentivírus, em que as composições consistem basicamente era células apresentadores de antígeno Gag-especi ficas ou 20 precursores da célula apresentadora de antígeno Gag~ especifica, como descrito de forma .ampla acima, ou de pelo menos uma molécula de Gag selecionada de um polipeptídeo Gag, um peptídeo que compreende unia seqüência que corresponde a uma porção de um polipeptídeo Gag e uma 2S construção de ácido nucléico que expressa G«g, como descrito de forma, ampla acima. Em algumas modalidades, cada molécula de Gag está em forma partículada·

Em um aspecto relacionado, a invenção fornece processos para a produção de células apresentadoras de 30 antígeno para o tratamento ou a prevenção de uma infecção por lentivirus, Esses processes geralmente compreendem o contato de células apresentadoras de antígeno era de precursores da célula ax?resentadora de antígeno coo uma composição que consiste basicamente em pelo menos uma S molécula da Gag selecionada da um polipeptídeo Gag, um peptídeo que compreende uma seqüência que corresponde a uma porção de um polipeptídeo Gag e uma construção de ácido nucléico que expressa Gag, como descrito de forma ampla acima, por um período e sob condições suficientes para que 10 pelo menos um peptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos que corresponde a uma porção de um polipeptídeo Gag seja apresentado pelas células apresentadoras de. antígeno ou por seus precursores em sua superfície. Adequadamente, quando são usados precursores, os precursores são cultivados por um período e sob condições suficientes para diferenciar as células apresentadoras de antígeno dos precursores...

Em algumas modalidades, cada molécula de Gag é colocada em contato com uma população substancialmente 20 purificada de células apresentadoras de antígeno ou seus precursores. Em outras modalidades, moléculas individuais de Gag são colocadas em contato com uma população heterogênea de células apresentadoras de antígeno ou seus precursores. Nessas modalidades, a população heterogênea de 2 5 células pode ser sangue ou. células mo.ucnuclsares do sangue periférico. Tipicamente, as células apresentadoras de antígeno ou seus precursores são selecionados de monócitos, macrófagos. células da linhagem mielóide, células B, células dendríticas ou células de Langerhans. Ainda em 30 outras modalidades» a{s) molécula(a) de Gag é colocada em eoncato com uma população não cultivada de células apresentadoras de antigeno ou seus precursores. Consequentemente, a população não cultivada pode ser homogênea ou heterogênea, cujos exemplos ilustrativos 5 incluem sangue total, sangue fresco ou frações deste como,.

por exemplo, ses lim.itação, células Mnonuclearss do sangue periférico, frações de células brancas do sangue total, concentrada de hemáaias, sangue irradiado, células dendríticas, monõoitos, macrófagos, neutróflios, linfócitos, células natural killer e células T natural killer. Em algumas modalidades, a população não cultivada que é colocada em contato com a(s) molécula(s) de Gag não foi submetida as condições de ativação.

As células apresentadoras de antigeno Gag-específicas descritas de forma ampla aoima. também são úteis para a produção de linféuitcs, incluindo linfócitos T e linfócitos B> para a modulação de uma resposta imune a um polipeptídeo Gag. Consequentemente, ainda em out.ro aspecto , a invenção fornece métodos para a produção de linfócitos sensibilizados por Gag, em que os métodos geralmente compreendem o oentato de uma população de linfócitos, ou de seus precursores, com uma célula apresentadora de antigeno Gag-específioa, como descrito de forma ampla acima, por um. período e sob condições suficientes para sensibilizar os 2 5 linrócitos parti que respondam ao polipeptídeo Gag.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção engloba métodos para o tratamento ou a prevenção de uma infecção por lentivírus em um indivíduo. Esses métodos ge.ralme.nte compreendem a administração ao indivíduo de um estimulado^' 30 imune, coma descrito de forma ampla acima, eu de linfócitos

11/133 sensibilizados por Gag, como descrito de forma ampla acima, em uma quantidade que é eficaz para tratar ou evitar a infecção per lentívírus. Em algumas modalidades, α estímulador imune cu os linfócitos sensibilizados per Gag 5 são administrados sistemicamente, tipicamente por injeção.

Em um aspecto relacionado, a invenção fornece métodos para o tratamento ou a prevenção de uma doença cia imunodeficiência adquirida em um indivíduo. Esses métodos geralmente compreendem a administração ao indivíduo de um 10 estimulador imune, como descrito de forma ampla acima, ou de li.nf6c.itos sensibilizados por Gag, como descrito de forma ampla acima, em uma quantidade que é eficaz para tratar ou evitar a doença.

Ainda em outro aspecto, a invenção contempla o uso de um estimulador imune, como descrito de forma ampla acima, ou de linfócitos sensibilizados por Gag, como descrito de forma ampla acima, para o tratamento eu prevenção de uma condição selecionada de uma infecção por lentivirus e uma doença de imunodeficiência adquirida. Em algumas 20 modalidades, o uso compreende preparação de um medicamenta que é adequado ao tratamento ou ã prevenção daquela condição

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESESÍHOS

A Figura 1 ê uma representação gráfica que ilustra a 25 imunogenicidade de células T da vacinação com OPAL. Células

T CD4 (a) e CD 8 (b) específicas para Gag do SIV que expressam I.FN--y foram estudadas ao longo do tempo por coloração de citocina intracelular. É mostrada a média ± erro padrão de grupos de vacina comparados com animais não 3C vacinados de controle (círculos), As vacinações primarias oom OPAL de macacos (setas, 4^X, 5^s, 8^s e 19 ^s semanas após infecção por SIV^sJ eons is ti ram em PBMC autelegas pulsadas com peptídeos superpostos de 15mer de Gag de S1V (OPAL-Gag, triângulos) ou peptídeos que englobam todas as 9 proteínas do SIV ÍOPAL-A11, quadrados;. As vacinações iniciais foram dadas sob a cobertura de tratamento ant ir retroviral (ART) , Gs animais receberam reforço com imuxioterapia com OPAL nos mesmos grupos randomisados, sent ART, nas 1.942 ^a e 42 ^a semanas. &a 12* semana, duas semanas após a ultima vacinação, células T CD4 (c) e CD8 (d) para pools de peptídeos superpostos que englobam Gag de ÔIV, Env, Pol ou proteínas reguladoras/aceasórias combinadas (Nef, Tat, Rev, Vii, Vpx, Vpr ÍReg] ) foram testadas em todos os animais por coloração de citocina iatraceiular. Além disso, as respostas para um epitopo de cèiula 1’ Cbís para ssag qs biV KPv íorani âvsiiàoss por um tetramero Mane -A* 10/KP9. r mostrada a média + erro padrão de grupos de vacina, juntamente com cs valores p do teste t 2-sided < 0,10. (e) respostas de células T CD8 específicas para Gag de SIV estavam relacionadas inversamente com as respostas de células T CD8 à soma de respostas a nao-Gag (Env ·* Pol -í- proteína reguladora) ao longo ele todos cs 21 anrmaxs vivos imunizados com ORAL. Os animais com >50% de respostas de células T CD8 ao pool combinado tiveram respostas totais de 50,4% e 54,8%, primariamente ao Env (80,1% s 84,2%. respectívamente). Ê mostrada a correlação da classificação de Spearman.

A f^!igur& 2 é uma representação gráfica que mostra a eficácia da imanoterapia com ORAL. A terapia antirretroviral (ART; foi retirada .na 10^s semana, apôs a última vacinação, e (a) ENA do SIV ησ plasma acompanhado Os 26 animais que controlaram a viremia com ART estão ilustrados com média ± erro padrão de grupos de vacina. ífc) Ê mostrada a sobrevida dos animais vacinados e de controle.

A Figura .3 é uma representação gráfica que ilustra imunogenicidade de células T não-Gag da vacinação com OPAL.

Células T CD4* e CDS’ SlV-específicas que expressam ΙΡΝ-γ foram estudadas ao longo do tempo por coloração de citocina intracelular a© Env (a, b) , Pol Ic, d) e a um pool de 10 peptfdec-s superp-ost.cs que englobam proteínas reguladoras/acessórias .combinadas (RTNVW, e, £j . É mostrada a medra t erro padrão de grupos de vacina comparados com animais não vacinados de controle (círculos) , Quatro vacinações iniciais foram dadas nas 4“~ 15 10* semanas e um segundo conjunto de 3 imunizações dado nas

36*-42 ⁴ s eman as >

ã Figura 4 é uma representação grafica que mostra uma comparação entre animais cora respostas de células T CDS' ao Env e ao Gag. Seis responsivos apenas ao Bnv, 3 responsivos 20 apenas ao Gag, 3 animais com respostas de células T CD3 específicas tanto ao Env quanto ao Gag e 7 controles não vacinados foram estudados quanto: A. À carga viral. B. Aos níveis de células T CD4 periféricas. 0. Gráfico de sobrevida que mostra 2 de 6 animais responsivos apenas ao 25 Env submetidos à eutanásia por volta da -44* semana, 0 de 3 responsivos ao Gag submetidos ã eutanásia por volta da 64“ semana, 2 de 3 animais com respostas específicas tanto ao Env quanto ao Gag submetidos ã eutanásia por volta da 44“ semana e 7 de 11 animais de controle submetidos ã eutanásia 36 por volta da 64* semana pós - infecção. Nenhum animal é?a.naA*10 ραβίtivo incluída. Uma última observação efetuada para análise foi usada para contagens de células T VL e CD4¹ e:n qua os animais foram submetidos à eutanásia scutes Qél t3.4 * .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA JHVENÇÃO

1. Definições

A menos crua definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado ccmumente compreendido per: aqueles habilitados na técnica à qual a invenção partenoe. Embora quaisquer métodos e materiais simii ares ou equivalentes aqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, são descritos métodos e materiais preferidos. Para os objetivos da presente invenção,, os termos seguintes s a r ão defi ni dos abai no.

Os artigos o, a, um e uma são aqui usados para se rar.erirem a um ou mais ce m ^!,ou seja, a pelo menos um? dc objeto gramatical do artigo. Como exemplo,, um elemento significa um elemento ou mais de um elemento,

G termo cerca de significa uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varia em até 30, 25, 20. 15, 10, 9, δ, 7, 6, 5, 4, .3, 2. ou 1% para uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de termo condições de ativação refere-se às condições de tratamento que levas? à expressão da cada um de CD2, CD83, CD14. MHC classe Ϊ, MHC classe XI e TW-0. em um nível ou atividade funcional que resulta de uma condição de

80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,

95, 96, 97, 98, 99% de similaridade ou identidade para pelo menos uma porção do antígeno-alvo, termo quantidade eficaz, no contexto de modulação 5 de uma resposta imune ou de tratamento ou prevenção de uma •doença ou condição, significa a administração daquela quantidade de composição a. um indivíduo necessitado, em uma dose única ou como parte de uma série, que seja eficaz para aquela modulação, tratamento ou prevenção, .A quant idade 10 eficaz ira variar, dependendo da saúde e da condição física do indivíduo a ser tratado., do grupo taxonômico de indivíduo a ser tratado, da formulação da composição, da avaliação da situação médica e de outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade caia em uma faixa 16 rei ativamente ampla que poda ser determinada por meio de experimentos de rotina.

G termo vetor de expressão significa qualquer elemento genético autônomo capaz de dirigir a síntese de uma proteína codificada pelo vetor. Essas vetores de 70 expressão são conhecidos por profissionais na técnica,

O termo gene'-', como aqui usado, refere-se a qualquer e todas as regiões codificadores distintas do genoma da célula, bem como regiões não cod.ifIsadoras e reguladoras associadas. □ termo gene também significa os polipeptídeos específicos que codificam o quadro de leitura aberta, íntrone, e seqüências de nucleotídeos não codif Isadoras ' e adjacentes envoi vidas na regulação da expressão. .A esse respeito, o gene pode ainda compreender sinais como, por exemplo, promotores, intensiíicadores, 30 sinais de terminação e/ou poliadenilação que estão

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O termo ’'modulação significa aumento ou diminuição, direta ou indiretamente, da resposta imune de nm indivíduo. Em certas modalidades, “modulação significa que uma respasca desejada/selecionada é mais eficiente (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 4v%, 50%, 60% ou mais), mais rápida (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 4 0%, 50%, 60% ou mais) , maior eis magnitude (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou mais) e/ou mais facilmente induzida (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 5C>%, 60% ou suais) do que na ausência de um antígeno ou se o antígeno fosse usado isoladamente.

C) termo ''oper-acionalmente conectado ou operacíonalmente ligado, como aqui usado., significa a colocação de um gene estrutural sob o controle regulatório de um ulemente regulador, incluindo, sem limitação, um promotor, que entào controla a transcrição e, opcicnalmente, tradução do gene. Na construção de combinações de promotor heterólogo/gene estrutural, pretere-se ger a1ment e pos rc ionax a sequência genetica ou o promotor em uma distancia do sítio de início da transcrição gênica que e aproximadamente igual ã distância entre aquela seqüência genética ou promotor e o gene true controla em seu ambiente natural; cu seja, o gene do qual a sequência genética ou o promotor é derivado, Como é conhecido na técnica, pede ser acomodada alguma variação nessa distância sem perda de função. Similarmente, o posicionamento preferido de um elemento da seqüência reguladora com controle é definido pelo posicionamento do elemento em seu ambiente natural; ou seja, os genes dos quais é derivado.

Qs termos paciente, indivíduo, hospedeiro'·' ou indivíduo, aqui usados de forma intercambiável, referem5 se a qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo vertebrado, e ainda mais particuiarmente a um indivíduo mamífero, para o qual se deseja a terapia ou profilaxia. Animais vertebrados adequadas que estão incluídos no escopo da invenção incluem, sem limitação, qualquer membro do subfilo Chordata, incluindo primatas, roedores (por exempla, camn.ndongos , ratos, porquinhos - da·- índia) , lagomorfos ípor example, coelhos, lebres}, bovinos (por exemplo, gado), ovinos (por exemplo, carneiros}, caprinos {por exemplo, cabras) , suínos ípor exemplo, porcos) equinos: (por exemplo, cavalos), caninos {por exemplo, cães), felinos {por exemplo, gatos), aves (por exemplo, galinhas, parus, patos, gansos, pássaros de estimação como, par exemplo, canários, periquitos etc.), mamíferos marinhos {por exemplo, golfinhos, baleias), répteis {por exemplo, cobras, sapos, lagartos etc.} e peixes. Um indivíduo preferido é um primata (por exempla, um ser humano, macaco, chimpanzé) que necessite de tratamento ou profilaxia para uma condição ou doença. No entanto, será subentendido que os termos mencionados anteriormsnte não implicam na presença de sintomas.

Q termo veículo farmaoeuticamente aceitável significa um enchimento, diluente ou substância de enoapsulaçao sólida ou líquida que pode ser usado com segurança na administração tópica ou sistêmica.

Polipeptídeo, peptídeo e proteína são aqui usados de forma intercambiável para se referirem a um polímero de resíduos de amãncácidos e às variantes s análogos sintéticos do mesmo, üessa forma, esses termos ss aplicam aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais 5 resíduos de aminoácidos são um. aminoácido sintético de ocorrência não natural, por exemplo, um análogo químico de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, além de polímeros de. aminoácidos de ocorrência natural.

As referências aqui feitas a um promotor devem ser consideradas em sen contexto mais amplo e incluem as secüénoias reguladox'as da transcrição de um gene genômico clássico , incluindo a 1ATA box que é necessária para iniciação precisa da transcrição, com ou sem uma .sequência CCAAT box e elementos reguladores adicionais (ou seja, sequências de ativação,- intensif icadoree e silenciadores acima) que alteram a expressão gênica em resposta aos estímulos do desenvolvimento e/ou ambientais, ou de uma forma tecido-especifica ou tipo de céiula-específica. üm promotor é normalmente, mas não necessariamente, posicionado acima ou Ά, de um gene estrutural, cuja expressão ele regula. Além disso, os elementos reguladores que compreendem um promotor estão normalmente posicionados em até 2 k.h do sítio de início da transcrição do gene. Promotores preferidos de acordo com a invenção podem conter cópias adicionais de um ou mais elementos reguladores específicos para aumentar ainda, mais a expressão em uma célula, e/ou para alterar o momento da expressão de um gene estruturai ao qual esta operacionalmente conectado.

Os termos polipeptídeo purificado ou peptídeo our if içado” significam mie o nol inept ideo ou pent ideo é substancialmente .livre da material celular ou de outras <· proteínas contaminastes da fonte da célula ou do tecido da qual o polipeptídeo ou peptídeo ê derivado, ou substancislmente livre de precursores químicos ou de outras 8 substâncias químicas quando sintetizado quiraicamente.

“Substancialmente livre significa que uma preparação de um polipeptídeo ou peptídeo Gag da invenção é pelo menos 10% pura.. Em certas modalidades, a preparação de polipeptídeo ou peptídeo Gag possui menos do que cerca de 30%, 25%, 20%, 10 15%, lí)% e, desejavelmente, 5% (por peso seco;· de proteína não peptídeo (aqui também denominada uma proteína contarainante), ou de precursores químicos ou substâncias químicas não pentídicas. A invenção inclui preparações isoladas ou .purificadas de pule menos 0,01,· 0,1, 1,0 e 10 15 miligramas em peso seco.

G termo '’polinuolectídec recombinante, como aqui usado, refere-se a um polinuoleafidea formado in vitro pela manipulação de ácido nucléico em uma forma não encontrada normalmente na natureza. Por exemplo, o polinucleotídeo 20 recombinante pode estar na forma de um vetor de expressão.

Geralmente, esses vetares de expressão incluem ácido nucléico regulador da transcrição e tradução ligado operacionalmente a seqüência de nuclear, ideas.

t ermo “pol ipept í deo recombí n an t e s i gni f i aa um polipeptidea feito com o usa de técnicas recombinantes, ou seja, por meio da expressão de um pol inucleot ideo r e c omb1aanteG termo elemento regulador ou seqüência reguladora'⁷ significa seqüências de ácidos nucléicos (por exemplo, DNA) 3C necessárias à expressão de uma seqüência cadificadoxa liqada ooeracion&lmente es uma célula hospedeira o particular. As sequências reguladoras que são adequadas às células procariótioas, por exemplo, incluem um promotor e, opcionalmente, uma sequência de atuação cis como, por exemplo,, uma sequência operadora e um sítio de ligação de ribossomo, Sequências de controle que são adequadas às células eucarióticas incluem promotores, sinais de poliadenilação. intensificadores da transcrição, intensificadores da tradução, seqüências líderes ou de rastreamsn.to que modulam a estabilidade do m.R&A, bem como í CPJSS <λΧΛ?^Γ,7Ι:.Ο.Π3.ϊΠ U*B p.>?OÓUt.O codificado por um polinucleotídeo transcrito a um compartimento intracelular dentro de uma célula ou ao a mb iest e ex t race1u1a r.

Os termos ’'identidade de sequência e -'identidade'' são aqui usados de forma intercambiável para se referirem ao QraTnO. ΠΟ C[WSJ. Sàü .1QKiiV..L Ct;í S CQiU ν.·>Β nucleotideo~por-nuclectídec ou com base em aminoácido-poraminoacido ao longo de uma janela de comparação. Dessa forma, uma percentagem de identidade de sequência é calculada por comparação de duas seqüências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucléico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I? ou o resíduo de aminaâeido adêntroo spor exemplo, Ala, Pro. dar, Thr, Gly, Vai, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, .His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições compatíveis, dividindo-se o número de posições oompatíveis pelo número total de. uosições na janela de eomriaxação (ou seja, o tamanho da janela} , e multiplicando-sa o resultado por LOG- para gerar a percentagem de identidade de seqüência. Paira os objetivos da presente invenção, o termo identidade de sequência serâ subentendido para significar percentagem de compatibilidade calculada pelo programa de computador

DMASIS (Versão 2.5 para Windows; disponível por Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South fían Francisco, Califórnia, EUA.) usando parâmetros-padrão usados no manual de referência que acompanha o software.

Os termos similaridade de seqüência e similaridade são aqui 'asados de forma intercambiável para se referirem à percentagem dc número de aminoácidos que sao Idênticos ou cons t i tuem substit uições conservadora a de f in idas na Iabala 1 infra. A similaridade pode ser determinada com o uso de programas de comparação de seqüências como, por exemplo, GAP í Dever aux e cais. 1984, Nucleic Acids Research 12, 387395). Dessa forma, sequências de um comprimento similar ou subatanciaImente diferente em relação àquelas aqui citadas podem ser comparadas por inserção de lacunas (gaps) no alinhamento, essas lacunas sendo determinadas, por exemplo, pelo algoritmo de comparação usado por GAP.

Os termos usados para descrever relacionamentos ds seqüências entre dois ou mais polinucleotídeos ou. polipeptídeos incluem ''seqüência de referência, janela de 2E comparação, -'identidade de seqüência, ^percentage® de identidade de seqüência e identidade substancial, Uma seqüência de referência possui pele- manos 2.2, mas frequentemente 15 a 18 e frequentemente pelo menos 25 unidades monomericas, inclusive de nucleotídeos c resíduos 30 de aminoácidos, de comprimento. Como cada um de dois

Puoi. Acids J?es. 25: 3.389. Uma discussão detalhada de análise de sequências pode ser encontrada na Unidade 19.3 de Ausubel e cols., Current Protocols in Molecular Biology*John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capitulo 15.

O termo população substancialmente purificada e semelhantes significa cue mais do oue cerca de 80%, norma Imente mais do que cerca de 901, .norma Imente mais do que cerca de 98%, tipicamente mais do que cerca de 98%, e mais tipicamente 'mais do que cerca de 999 das células na posulação são células apresentadoras de antígeno de um tipo escolhido.

G termo tratamento significa pelo menos uma melhora, dos sintomas associados à condição patológica que aflige o hospedeiro, em que a melhora é usada em um sentido amplo para se referir pelo menos a uma redução na magnitude de um parâmetro, por exemplo, sintoma, associado â condição patológica que está sendo tratada, por exemplo, o numero de partículas virais per sangue unitário. nessa forma, tratamento também inclui situações nas quais a condição patológica, ou gelo menos sintomas a ela associados, são completamente inibidos, por exemplo, tem a. arca ocorrência evitada, ou interrompidos, por exemplo, terminados, da tal. forma que o hospedeiro não sofra mais da condição oatolóoica, ou pelo menos dos sintomas sue caracteriaam a condição patológica.<

removida de um animal a incubada ou processada sob condições que não resultam no crescimento ou expansão das desprezível das células (por exemplo, um aumento de menos do que cerca de 50%, 4Q%, 30%, 20%, 15%, 10%. 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0,2% ou 0,1% o número de células, quando comparado com o número de células no começo da incubação ou processamento). Em certas modalidades desejáveis, a população de células (ou a única célula? é incubada ou processada sob condições que apoiam a manutenção das células in vitro,

G termo “vetor significa uma molécula de ácido nucléico, adequadamente uma molécula de ONA derivada, por exemplo, de um plasmídeo, bacteriófago ou vírus de planta, na qual uma sequência de ácido nucléico pode ser inserida ou clonada. íJm vetor prefcrivelmente contém um ou mais sítios de restrição únicos, e pode ser capas de replicação 15 autônoma em uma célula hospedeira definida, incluindo uma célula ou tecido-alvo ou uma célula progenitora ou tecido desta, ou ser integrável com o genoma do hospedeiro definido, de tal forma que a seqüência clonada seja re.pr.odutível, Consequentemente, o vetor pode ser um vetor 20 que se replica autonoma.me.nte, on seja, um vetor que exista como uma entidade extracromossômica, cuja replicação e independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo linear ou circulai:' fechado, um elemento extracromossômico, um minícromossomo ou um cromossomo 25 artificial, O vetor pode conter qualquer meio para .assegurar a autc-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser aquele que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado nc genoma e /replicado junto ccm oís) cromossomo -s) no qual foi integrado. Cm sistema de vetores 30 pode compreender um único vetor ou plasmideo, deis ou mais

g e r j. f Ά r i c o

pró - G.P	s progen.ipciet ina
sxv	- vírus da imunodeficiência símia
	fator de transformação do crescimento

eta

^Π^ΤΤ·?	fat or de necrose tumoral
1ό· -ii VT. ii'i'i -i 71. <X >Swt,	- carga viral
	~ cartIculas vi rue-11ke

3. Composições imunomoduladoras baseadas em antígeno

Gag len.tivira.1

A presente

invenção se baseia, em parte, na descoberta

surpreendente de que não há diferença no resultado viral final entre animais imunizados contra Gag de SIV isoladamente e animais imunizados contra todo o proteoma do

SIV. AdicIonaImente. foi verificado inesperadamente que a imuniração contra Gag de S1V. bem corto com outros antigenos da SIV, indue respostas imunodominantes de células T n§o·

Gag. o que pode limitar o dessnvol.vime.ntc de respostas de células T Gag-específieas terapêuticas ou profilátioas. Com base nessas observações, os inventores propõem que a terapia ou profilaxia lentiviral era um indivíduo não p r e c 1 s a v 1 s a r va c i ,n a s 1 e n t i v 1 r a 1. s ra u 11 .i ρ r o t e 1 n a s maxímamente amplas. mas, em vez disso, ser obtida basicamente por auraanto do número de células apresentadoras de antígeno ou precursores da célula apresentadora de antígeno· {também aqui denominadas, respectivamente, células apresentadoras de antígeno Gag-específicas ou precursores da célula apresentadora de antígeno Gag-espeoífica) no indivíduo, que apresentam pelo menos um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que corresponde a uma porção de um polipeptídeo Gag. .Dessa forma, a presente .invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de uma infecção por lent!virus em um indivíduo, em que os métodos consistem basicamente no aumente do número de células apresentadoras de antígeno Gag-específicas ou precursores no ifídi.víduo.

Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um «stimulation imune que aumenta o número de células apresentadoras de antígeno Gag-específicas ou precursores destas. Por exemplo, o estímulador imune pode consistir basicamente em um polipeptídeo Gag ou pele; menos um peptídeo (aqui também denominado um peptídeo Gag} que compreende uma seqüência de aminoãcidos que corresponde a uma porção de um polipeptídeo Gag. Alternativamente, o estímulador imune pode consistir basicamente em uma construção de ácido nucléico que compreende uma seqüência codificadora peita um polipeptídeo Gag ou pelo monos urn peptldec Gag, ligada upexaoionalmente a uma seqüência reguladora. Em outros exemplos ilustrativos, o eatimulador imune consists basicamente em células apresentadoras de antígeno Gag-uspeeíficas autólogas ou alogênicas ou seus precursores. Células apresentadoras de antígeno não iimitant.es incluem células dendríticas. macrôfagos e Cd. 'ki.í S lacLTlCj & OX&H S >

Em exemplos ilustrativos, portanto, o número de células apresentadoras de antíqeno Gao-esoecíficas ou de precursores da célula apresentadora de antígeno Gagespecífica pode ser aumentado por;

{1a dm i n i s t. ra ç a o a o i nd 1 v í d u o d a s c é 1 u 1 a s apresentadoras de antígeno ou de seus precursores (por exemplo, células apresentadoras de antígeno autõlogas cu precursores do indivíduo ou de células apresentadoras de antígeno alogênicas ou de seus precursores de um doador histocompatível}, que foram colocadas em contato (por exempio, ex vivo ou i.a vivo com uma composição que consiste basicamente em um. polipeptídeo Gag ou pelo menos um pept.ídeo que compreende uma sequência de amincácidos que corresponde a um polipeptídeo Gag, per um período e .sob condições suficientes para que o polipeptídeo Gag ou. o(s,^!peptides{O, ou formas processadas do polipeptídeo Gag ou do(s) peptfdeoís). seja apresentado pelas células apresentadoras de antígeno ou por seus precursores;

(2? administração ao indivíduo das células apresentadoras de antígeno ou de seus precursores (per exemplo, células apresentadoras de antígeno autólogas ou precursores do indivíduo ou células apresentadoras de antígeno alogênioas ou precursores de urn deader histocompativel). que contêm uma construção de ácido nucléico (aqui. também denominada uma construção de ácido nucléico que expressa -Gag) que compreende uma sequência de 5 nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Gag ou pelo menos um peptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos que corresponde a uma porção de um polipeptídeo Gag, em que a seqüência de nucleotídeos está conectada operacionalmente a um promotor que é operável nas células apresentadoras de 10 antígeno ou em seus precursores;

(3) administração ao indivíduo de uma composição que consiste basicamente em pelo menos uma molécula de Gag selecionada de um polipeptídeo Gag. um peptídeo que compreende uma sequência que corresponde a uma porção de. um 15 polipeptídeo Gag e uma construção de ácido nucléico que expressei Gag. A molécula de Gag pode estar em forma solúvel ou partlculada.

3.1 Polipeptídeos e peptídeos Gag

Ã presente invexxçáo contempla o uso de polipeptídeos 20 Gag de comprimento total, bem como de peptídeos (aqui também denominados peptídeos Gag) que compreendem seqüências de aminoácidos que correspondem âs porções de polipeptídeos Gag de comprimento total, para a produção de célula apresentadora de antígeno Gag“específica ou seus 25 precursores, Peptídeos ilustrativos compreendem pelo inenos

cerca de 5, 6,	7 ,· S,	9, 10	11, 1.2 _f 13, 14,	15,	16, 17, 18,
Ό:._ί: 2b, 21, 2 2	,· 23,	24, :	25, 3 0, 40, .50,	50,	70, 50, 70,
10 v, 120, 150-	W>	400	ou 500 resíduas	de	aminoácidos
contíguos, ou	quase	até	o número total	de	a m i η o á c i do s

presentes em um polipeptídeo Gag de comprimento total.

Tipicamente,· as peptideas Gag são de um tamanho adequado que possa ser processado e/ou apresentado por células apresentadoras de antígeno ou seus precursores. Diversos fatores podam influenciar a escolha do tamanho do peptídeo. Por exemplo., o tamanho de um peptídeo pode ser escolhida de tal modo que ele inclua, ou cor.responda ao tamanha de, epitopes de célula T CDV, epitopos de célula T CD5' e/ou epitopos de célula S, e suais exigências de processamento. Os profissionais na técnica reconhecerão true epitapos de célula T CDS restritos à classe I possuem tipicamente entre 8 e 10. resíduos de aminoácidos de comprimento e,. se colocados próximos a resíduos flanqueadores nâo naturais, esses epítopos podem geralmente exigir 2 a 3 resíduos de aminoácidos flanqueadores naturais para assegurar que sejam eficientemente processados e apresentados. .Epítopos de célula T CD4^: restritos à classe II normalmente variam entre 12 e 25 resíduos de aminoácidos de comprimento e podem não precisar de resíduos flanqueadores naturais para um processamento proteolítico eficiente, embora se acredite que resíduos flanqueadores naturais possam participar. Outra característica importante de epítopos restritos à classe II é que eles geralmente contêm um núcleo de 9-3.0 resíduos de aminoácidos no meio que se ligam espeeifIcamente ás moléculas MHC da classe II uom sequências flanqueadoras em um doe lados desse núcleo que estabilizam a ligação por associação com estruturas conservadas em um dos lados de antígenos de MHC da classe II. de ums forma independente da seqüência. Dessa forma, a região funcional de epítopos restritos à classe II possui comprimento tipicamente de menos de cerca de 15 resíduos de aminoácidos. 0 tamanho de epítopos lineares de célula S e dos fatores que efetuam ssti processamento,, como epítopos rest i'it os a classe II, é bem variável, embora esses epítopos frequentemente tenham tamanho menor do que 15 resíduos de aminoácidos. A partix' do que foi apresentado anteriormente, é vantajoso, mas não essencial, qua o tamanho do peptídeo seja de pelo menos 5, 7, 8, .9, 10, 11, 2.2, 1.3, 14, 15, 20, 25, 30 resíduos de aminoácidos. Adequadamente, o tamanho do peptídeo ê de, no máximo, cerca de 500, 200, 100, 00, 60, 50, 40 resí duos de aminoácidos, Em algumas modalidades, o tamanho do peptídeo á sufleientemente grande para minimizar a perda de epítopos de célula i e/ou csj céiuia B. Em outras mouaxmaoes, o tamanho co peptídeo e suiicxents para apresentação ροζ uma célula apresentadora de antígeno de um epitopo de célula T e/ou de um epitopo de célula B contido dentro do peptídeo, Em um exemplo ilustrativo desse tipo, o tamanho do peptídeo é de cerca de 15 resíduos de aminoácidos.

Várias sequências de polipeptídeos Gag e suas sequências codificadores correspondentes são conhecidas na técnica, que podem ser usadas para a preparação de polipeptídeos e peptídees Gag purificados, sintéticos ou recombinantes ou sua sequência codifIsadora. Sequências de polipeptídeo Gag ilustrativas podem ser obtidas por quaisquer bases de dados disponíveis publicamente, incluindo GenSank, EMBL e S^XSSPRQT. Por exemplo, seqüências de polipeptídeo Gag de H1V--1 representativas são disponíveis no GenBank. sob os seguintes números de acesso: AAB0403 6, AAB0 3744, ÂAB5 9 2 75, AAÃ4485 3, AAB 0 4036, AAB502 88, AAA44987 e Seoüênoias não .limitantes de

37/139 , polipeptídeo Gag de HIV-2 estão disponíveis no GenBank sob os seguintes nümeroa de acesso: AABGOllf, AAA75S4 0,.

A A Ã4 3 9 3.2, ÂAB 0 0 74 5 .. AAB 0 0 7 6 3 , AAB 013 51 e AÃÃ4 3 9 41 ,

Adicion&lmente# sequências de polipeptídeo Gag de SIV ilustrativas estão disponíveis no GenBank sob os seguintes números de acesso: AAA919QS.. AAA91913, AAA47558, AAA91922# AAA747M, ΆΑΑ47632, AAB59905, ΑΑΛ91930 e AABS97S9,

Seqüências de polipeptídeo Gag de FIV ilustrativas estão disponíveis no GenBank sob os seguintes números de. acessot

AAB59935# AAA43075 e AAB09309, Um exemplo não limitanta da seqüências de polipeptídeo Gag de BI7 está disponível, no GenBank sob número de acesso ΑΛΑ91270. Seqüências de polipeptídeo Gag de E1AV ilustrativas estão disponíveis no GenBank sob os seguintes números de acesso; ΑΛΒ59851 e

ΛΑΆ.4 3 003. Exemplos não limitantes de seqüências de polipeptídeo Gag de Visna estão disponíveis no GenBank sob os seguintes números de acesso; ΑΆΑ17520, &A&48353,

AAA48358, AAA.1752 3 e ΛΑΑ17528. Uma seqüência representativa do polipeptídeo Gag de CAEV está disponível no GenBank sob número de acessa AAA91825. Sequências ilustrativas do polipeptídeo Gag de lentivírus ovino estão disponíveis no GenBank sob os seguintes números de acesso: ΑΑΆ66811 e AAÀM773, .deve-se entender, no entanto# que a presente invenção não se limita a qualquer aminoáeído ou seqüências de ácidos nuclei cos de Gag específicas e. se estende amplamente a quaisquer polipeptídeo» Gag nativos ou recombinants» ou suas seqüências codificadores.

Em modal idades específicas, diversos peptideos são usados para preduz ir as células apresentadoras de antígeno 3ü Gag-específicas cu seus precursores, em que os peptídeos individuais compreendem porções diferentes de uma sequência de aminoácidos que correspondem a um polipeptídeo Gag e, opcionalmente, exibem identidade ou similaridade de seqüência parcial para pelo menos outro peptídeo dos diversos peptídeos, A identidade ou similaridade de seqüência parcial está tipicamente contida em ume ou em ambas as extremidades de um peptídeo individual, Em uma modalidade, há pele menos 4, 5., 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50 resíduos de aminoácidos contíguos em uma ou em ambas as extremidades de um pentideo individual, cuja seqüência é idêntica ou similar a uma sequência de aminoácidos contida dentro de pelo menos outro dos pentideas. Em modalidades alternativas, há menos de 500, 100, 50,. 40,. 30 resíduas de aminoácidos contíguos em uma ou em ambas as extremidades de um peptídeo individual, cuja seqüência é idêntica ou similar a uma seqüência de aminoáoidos contida dentro de pelo menos outro dos peptrüeos. Essa ''superposição ce sequenexas é vantajosa para evitar ou de algum modo reduzir a perda de quaisquer epitopos potenciais contidos dentro de um polipeptídeo Gag. Em exemplos específicos aqui revelados, a superposição de seqüências ê de 11 .resíduos de aminoácidos.

Em certas modalidades, o tamanho dos peptídeos individuais é de cerca de 14 cai 15 resíduos de aminoácidos e a superposição de seqüências em uma ou em ambas as extremidades de um peptídeo individual e de cerca de 11 resíduos de aminoácidos. No entanto, será subentendido que outros tamanhos de peptídeo adequados e tamanhas da superposição de seqüências são contempladas pela presente invenção, o que pode ser facilmente verificado por aqueles habilitados na técnica»

Tipicamente, quando os peptídeos possuem similaridade de seqüência parcial, suas sequências normalmente diferirão em uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras 5 e/ou não conservadoras. Substituições conservadoras estão listadas na Tabela 1. Substituições' conservadoras ou não conser/aâoras podem corresponder aos ροϊimorfismos dentro de Ga.g. A esse respeito, é sabido qua pol.i.pept ideas Gag polimórficcs são expressos por diferentes cepas ou alados 10 virais. Dessa forma, quando houver regiões polimõrficas em Gag, é geralmente, desejável usar can juntes adicionais de peptídeos que cubram a variação no resíduo de aminoácido no s í t .i o po 1.1 mó r f i c o .

Ê vantajoso, mas não necessário, utilizar toda a 15 seqüência de um po.lipept5.deo Gag para a produção de d 1. ve rs? os pep t ídeos a uperpos tos . Tip icamen te, pe 1 o menos

33 0	, 31,	3 2	, 33, 34	, 35, 36, 37,	38,	39, 40,	41,	42. 43,
4 4 ,	4 5 ,	46,	47,	4 8 ,	49, 50, 51, 52	, 53,	54, 55,	58,	57, 58,
39,	8 o,	éi.	a 2,	8 3 ,	84, 55, 88, 67	> 68,	89, 70,	71,	72, 73,
2 0 74,	7 5,	76,	77,	78 ,	79, 80, 81, 82	, 83,	84, 85,	86,	87, 88,
89,	90,	91,	92 .	. 93,	94, 95, 96,	97, 98, 99%	da seqüênci a

que correspondem a um polipeptídeo Gag são usados para produzir os peptídeos superpostos. Ko entanto, será subentendido que, quanto mais informação de seqüência de um 25 polipeptideo Gag que e utilizada para produzir os peptídeos superpostos, maior será a cobertura da população da parentes dos peptídeos superpostos como um imunõgeno.

Adequadamente, nenhuma informação de seqüências do polipeptídeo Gag é excluída >'por exemplo, por causa de uma 30 ausência aparente de epitopes imunoiõgicos, na medida em

40/139 que epitopes mais raros ou. subdominantes podem ser inadvertidamence perdidos)< Se necessário, seqüências hipervaxiáveís dent.ro de um polipeptídeo Gag podem ser excluídas da construção de um conjunto de peptídeos 5 superpostos, ou conjuntas adicionais de peptídeos que cobrem as regiões polimórficas podem ser construídos e administradas. Seqüências peptí.dicaa podem incluir seqüências adicionais que não são derivadas de um polipeptídeo Gag. Essas seqüências adicionais podem ter várias funções, incluindo aumento da. solubilidads, estabilidade ou imunogenicidade au facilitaçao da purificação. Tipicamente, essas seqüências adicionais estão contidas em uma ou em asabas as extremidades de um respectivo peptídeo.

Peptídeos superpostos podem ser projetados com base em qualquer seqüência de aminoácidos Gag adequado, cujos exemplos: ilustrativos estão listados acima e nas Tabelas ·* e 5. Peptídeo superposta representativa para a modulação da resposta imune ao vírus da imunodeficiência símia (SIV) e/ou aa STV-HIV-1 quimêrica (SHIV), ambos sabidamente modelos adequadas para o vírus HIV-1 patogênico em seres humanos, pede ser baseada em ama ou mais das seqüências de polipeptídeos Gag apresentadas nas Tabelas 2 e 3 infra.

Gs polipeptídeos e peptídeos Gag podem ser preparados 25 por qualquer procedimento conhecido por aqueles habilitados na. técnica. Por exempla, peptídeos Gag podem ser sintetizados oonveniexitemente por utilização de síntese em solução ou síntese em fase sólida, como descrito, por example, no Capítulo Sí de Atherton e Shephard {1985, Solid 2 ij pha s e P e p t i d s S y n t he s 1 s : A P r a c 11 c a 1 App r a a ch . X RL P r e s s,

Oxford) e em Roberge e eels. (1955, Science 265; 202). As sínteses podem, empregar, por exemplo, químicas de t·· bu tiloxi carbon! 1 (f-K$oc) ou 0 - f luore.ni.lmet iloxí carbmni.l íFmoc) iveja o Capítulo 9.1 de Coligar, e cols., Current 5 Protocols in Protein Science”, John Wiley & Sons, Inc.

1999·· 1957; Stewart e Young, 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2‘ Edição Pierce Chemical Co., Rockford, Ill,- e Atherton e Shephard, supras) . Em modalidades específicas, os peptídeos individuais são solubilixados em DMSO (pox 10 exemplo, OMSO 100¾ pu.ro) em concentração elevada {1 mg de peptídeo/10-·30 u.l de DMSO) , de tai forma que grandes pools de peptl'.dees não contenham quantidades excessivas de DMSC· quando pulsados em células. Em certas modalidades vantajosas, um ou mais conjuntos de peptídeos, em forma 15 solúvel, são colocados em um único recipiente para administração conveniente (por exemplo, um tubo ou frasco de sasxgue para pronta rein fusão) a um indivíduo, e esses recipientes também sào contemplados pela presente invenção.

Alternativamente, um polipeptídeo ou peptideo Gag pode ser preparada par um procedimento que inclui, as etapas de:

(a) preparação de uma construção da ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptidee ou peptidea Gag, em qua a sequência de nucleotídeas está ligada operate! ona Imente a uma seqüência 25 reguladora; (b; introdução da construção de ácido nucléico em uma célula hospedeira adequada; ícI cultivo da célula hospede ira para expressar a sequência cie núcleotfdecs; e íd) isolamento dc polipeptídeo ou peptídeo Gag. A construção de .ácido nucléico está tipicamente na forma de 3 0 um veto?;· de expressão. Por exemplo, o wt >r de expressão pode ser um vetor extracromossômica autc-replleante como, por exemplo, um plasmfdec, ou usi vetor que se integra no genoma de um hospedeiro. Tipicamente,. a seqüência reguladora inclui, sem limitação, seqüências promotoras,.

seqüências lideres ou sinalizadoras, sítios de ligação de ri.bos.soma, seqüências de início e de parada da transcrição, seqüências de início e terminação da tradução, e sequências intensifIsadoras ou auivadoras. Promotores constitutivos ou indutíveis, como conhecidos na técnica, são contemplados 10 pela invenção.. Os promotores podem ser promotores de ocorrência natural, ou promotores híbridos que combinam elementos de mais de um promotor, A sequência reguladora geralmente será adequada â célula hospedeira usada para expressão. Vários tipos de vetores de expressão apropriados 15 e pol inucleot ídeos .regul adores adequados são conhecidos na técnica para diversas células hospedeiras. Em certas modalidades, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionava! para permitir a seleção de células hospedeiras transfarmadas< Genes de seleção são bem conhecidos na .20 técnica e irão variar cost a célula hospedeira usada. Em outras modalidades, o vetor de expressas também; inclui uma sequência de ácido nucléico que codifica um parceiro de fusão, de tal. forma que o polipeptídeo ou peptídeo Gag seja expresso como um polipeptídeo de fusão com o parceiro de 22 fusão. A principal vantages; de parceiros de fusão é que eles ajudam na identificação e/ou purificação do polipeptídeo de fusão. Parceiros de fusão exemplares incluem. sem limitação, glutat lona ··£·· transferase (GST) , porção Ec de IgG humana, proteína de ligação de maltose

2 (MBP) e hexahistidina (HISJ , que são particularmente úteis psra o isciamenta do polipeptídeo de fusão por eramatograf ia por afinidade, A film de purificar o polipeptídeo de fusão por cromatogzafia por afinidade, matrizes relevantes para cromatografia por afinidade são resinas conjugadas à glutationa, amilose e níquel ou cobalto, respeetivamente, Muitas dessas matrizes estão disponíveis em forma de kit', por exemplo, α sistema QIAexpress¹* (Qiagen) util com parceiros de fusão (His_s) , e o sistema, de purificação Pharmaeia GST, Em uma modalidade preferida, o pelinucleotXdeo recombinants e expresso no vetor comercial pFLAG'**. Tantajosamente, os parceiros de fusão também possuam sítios de divagem de protease, por exemplo, para o Fator X«, Trombina e inteínas (introns de proteína; ., que permitem que a protease relevante efetue a digestão parcial do polipeptídeo de fusão da invenção e, dessa forma, libere o polipeptídeo ou peptídeo Gag recombinante deste, 0 polipeptídeo os peptídeo Gag liberado pode então ser isolado do parceiro de fusão por separação cromatográfica subsequente, Parceiros de fusão de acordo com a invenção também incluem em seu escopo tags de eprtopo, que sao n-ormaimente sequências peptxdicas curtas para as quais um anticorpo específico estã disponível. Exemplos bem conhecidas de tags de epitepo para os quais •x.·>»,· Φ' -í .>'> /\ ex .·’·> Ayx- ·» ·*ί · ·«?*> üt 7 f·*· ·%· S' ..**: Ύ 1 VK·+> Λ •«Xi.*a biWi íwxs· Λ. xl‘ x*. u- X ,4< z_v· wxZ< vÇ-çxM x >Λ\.· ··'· .1. wc;**’.. χ.·<

disponíveis incluem rags de c-Myc, vírus da. influenza, hemaglutinina e FLAG,

A etapa de introdução da construção de ácido nucléico na célula hospedeira pode ser obtida usando qualquer técnica adequada, incluindo transfecção e transformação,

Esses métodos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Os peptídeos da invenção podem ser produzidos por cultivo de unia célula hospedeira transformada com a construção sintética,. As condições adequadas à expressão de proteína irão variar com a escolha do vetor de expressão e da célula hospedeira. Isso é facilmente constatado por aqueles habilitados na técnica por maio de experimentação de rotina. Células hospedeiras adequadas ã expressão podem ser procarióticas ou eucariôticas. Uma célula hospedeira preferida para expressão de ura polipeptídeo de acordo com a invenção é uma bactéria. A bactéria usada pode ser Escheríchia cell, Aiternativamente, a célula hospedeira pode ser uma célula de inseto como» por exemplo, células SF9, que podem ser utilizadas com um sistema de expressão es baculovírus.

Os arainoáoidos dos polapeptidees ou peptídeos Gag podem ser de ocorrência não natural, ou de ocorrência natural. Exemplos de aminoácidos não naturais e derivados durante, a síntese peptídioa incluem, sem limitação, o uso de doido 4aminobutírico, ácido 6-aminohexanóicc, ácido 4amina-.3 -hidróxi 5 f enilpentsnóicc, ácida 4 ~amino- 3 “hidróxi 6 - met il.heptanóico. t -butilglicina, norleucina, norvalina, fen.ilgli.cina, ornitina. sarcosina, 2-tienil alanina e/ou X>isômsrcs de aminoácidos. Uma lista dos aminoácidos não naturais contemplados pela presente invenção é mostrada na Tabela: S .

A invenção também contempla a modificação dos polipeptídeos e peptídeos Gag com o uso de técnicas comuns da biologia molecular, de modo a alterar sua resistência à degradação pxoteclítlca ou para otimizar as propriedades de solubilidade ou torná-los mais adequados como um agente imunogêuico,

3.2 Construções de ácido nucléico que expressara Gag para terapia gênica

Em modalidades específicas, construções de ácido nucléico que compreendem seqüências codificadores de Gag operacionalmente conectadas a nm elemento regulador são usadas para produzir as células apresentadoras de antígeno Gag-específicas., eomo forma de terapia gênica, Λ terapia 10 gênica refere-se â terapia realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nucléico expressado eu passível de expressão. Nessas modal idades da invenção, as construções de ácido xiucléico produzem ssu(s) polipeptídeo(s) ou pept ideo (a) Gag codi f icaco (s )· em cêIulae apresentadoras de 15 antígeno e, dessa forma, medeiam o efeito terapêutico ou prof11 Stico decsj ado.

Qualquer um doa métodos para terapia gênica disponíveis na técnica pode ser usado de acordo com a presente invenção. Métodos exemplares são descritos abaixo, 20 Para revisões gerais dos métodos da terapia gênica, veja Goldspiel e cols,, 'Clinical Pharmacy 12: 482-505 (1353; ; Viu e Viu, Blotherapy 3: 87-95 (1921) ; Tolstoshev, Ann. Rev, Pharmacol. Toxicol. 32: 573-895 (19.93); Mulligan, Science 260: 926-932 (19.93); e Morgajx a Anderson, Ann. Rev.

Siooòem, 62; 191-217 {1993}; TIBTE’CHll (5)-. 155-215 (maio de 1993). Métodos comumente conhecidos na técnica da tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel e cola,, eds?., ''Current Protocols in Molecular Eiology , John Vii ley & Sons, ΝΎ (19.93); e

2 Kriegler, ''Gene Transfer and Expression, A Laboratory

Manual'*· _f: Bt-dchtep PWW·, N¥ (1:99ç): , liberação das de â o i do nuc1é i e o em células obt ida apresentadoras de antígeno ou precursores poda diretamente por exposição de construção de ácido nucléico ou primeiro as células apreaentr.sdQ.ras de antígeno ou com a construção de ácido t ra n s p1ant ando a s células pre cursorss t raus f ormados abordagens sãa conhecidas>

gênica ín

Como descrito, ser (Inéxí, ou sintéticos operaclona1ment e promotor j que apresentadoras um paciente t ra n s f ormando se e depois de antígeno ou no paciente.

Essas duas respec t ivament e, como terapia exemplo, na Patente expressão de ácidas nucléicos um

U..5. hr naturais tipicamente nucleico nar ma1mente incorporando-s e obtida ligando-se ou indutivel}, em um vetor de expressão e introduzindo-se o vetor era uma célula hospedeira adequada. Vetores' típicos contêm term.·, nado nas da transcrição da expressão opc1onaImente que contêm .1 ndependent e, cassete exemplo, sistemas e tradução, seqüências de iniciação da tradução, e promotoras ütais para a regulação do ácido nucléico em compreendem cassetes pelo menos uma particular. Cs vetores de expressão genéricas seqüência terminadora sequências que permitem replicação da eucariotas au procariotas,. ou em ambos (par ve t o r e s sh u t i I e) , marcadores de s e 1 e ç ã o pa r a vet or es podem ser adequados ã integração em pracariotas, eucariotas, ou preferivelmente em ambas. Veja Giliman e

Mature, 325.' ”’31-734; Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152, .Academic Press, Inc., Sen Diego, Calif. (Serger}; Same rook e eds. (1989} , Molecular Cloning · A Laboratory Manual (.2' Edição) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, M.Y., (Eambrook;; e F.M, Ausubel e cals., Current Protocols in Molecular Biology, eds., Current Protocols', um empreendimento conjunto entre Greene euoxisning Associates, Inc. e conn wiiey -u Sons, Inc., (1994 Supplement) (Ausubel)·

Vetores de expressão que contêm elementos reguladores de vírus eucaríóticos como, por exemplo, retrovirus, são tipicamente usados para expressão de sequências de ácidos nuoléicos em células eucarióticas. Vetores de SV^iO incluem pSVT7 e pMT2. Vetores derivados de vírus do papiloma bovino inc 1 D δ V * X M TI* (A < ó st.T.i va dc^;3 óo v.í'ru$ Sdss v.&â.ri

Barr incluem pHEEO e p2CS. Outros vetores exemplares incluem pMSG, pAV009/A+, pMTOÍO/Av, pMAM.neo-5, baculovirus pDSVE, e qualquer outro vetor que permita a expressão de proteínas sob a direção do promotor precoce de SV-40, promottir tardio de SV-40, promotor de metalotioneína, promotor do vírus de tumor mamário murídeo, promotor do vírus: do sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, ou outros promotores comprovadamente eficazes para expressão em células imaaariocxcas.

Krnbiira diversos vetores oossam ser usados, deve-se observar que vetores viraie de expressão são úteis para modificação de células eucarièticas por causa da alta eficiência com a qual os vetores virais transfectam células-alvo a se integram no genama da célula-alvo. Vetores.; de expressão desse tipo ilustrar ivas podem ser derivadas de seqüências de DBA viral, inc.lui.ndO, sem limitação, adenovirus, vírus adenoaasociados, vírus do herpes-simplex e retrovirus como, por exemplo, retrovirus B, C e Π, além de espumavirus e len.tiv.irus modificados. Vetores de. expressão adequados à transi seção de. células animais são descritos, por exemplo, por Wu e Ataai (2000, Ou.rr. Opin. Biotechnol. 11 (2) , 205-208}, Vigna e Naldini 10 (0000, J. Gane éfed. 2(5), 3C8-316), Kay e cala, (2001, Nat.

Med. 7(1), 33-40), Athanasopoulos, a cola. (2000, Int. J”. Mol. Med. 6(4), 363-375} e Walther e Stein (2000, Drugs 00 (2j , 249-271}

A porção codíficadora de Gag do vetor de expressão IS pode compreender uma seqüência de ocorrência natural ou uma variante desta, que foi criada geneticamente com o uso de técnicas reccmbinanr.es. Sm um exemplo de uma variante, a composição de. códons de um polinucleotídeo codificador de antígeno é modificada para permitir a expressão aumentada 2 0 dc antígeno em uma célula ou tecido-alvo de escolha com o uso da mébodos coma apresentados em detalhe nas Publicações Internacionais WO .99/02694 e WO 00/42215. Resumidamente, esses métodos se baseiam na observação de que as eficiências de tradução de diferentes oódons variam entre 25 células ou tecidos diferentes e que essas diferenças podem ser exploradas, junto com a composição de códons de um gene, para regular a expressas da u.m.a proteína em um tipo de célula ou tecido em particular. Dessa forma, para a construção de palinucleotídeos com códons otimisedos, pelo 30 menos um códon existente de um palinucleotídeo parente é substituído com um coaon sinonxmo que possui uma eiicxencxa de tradução mais elevada em uma célula ou teci.do-al vo do que o cõdon existente que ele substitui. Embora seja desejável substituir todos os oõdons existentes de uma molécula de ácido nucléico parente cem codons sinônimos que possuam aquela eficiência de tradução mais elevada, isso não é necessário, pois a expressão aumentada pode ser obtida ate. mesmo com substituição parcial. Adequadamente, a e tapa de a ubs t i t u i. ç ã o a f e. t a 5 %, 10 %, 15%, 2 0 %, 2 S % , 3 ü % , mais preferivelmente 35%, 40%, Sü%, 60%, 70% ou mais des cgdons existentes de um polinucieotíUeo parente, vetor de expressão é compatível com a célula apresentadora de antígeno ou precursor na qual é introduzido, de tal forma que o polinucleotídec? codificador de antigens seja passível de expressão naquela célula ou precursor. 0 vetor de expressão é introduzido na célula acresentadora de antíceno ou seu precursor cor aualouer í ο oãxt..1 cu 13.ir cio vetor de expressão e da célula anresentadora de antiqeno emnraoada. Esses maios de introdução são bem conhecidos nc?r aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, a introdução pode ser efetuada pelo uso de contato (por exemplo, no caso de vetores virais;, eletroporação, transformação, transduçao, conj ugação ou pareamento tr iparental, transí seção, fusão de me'ctbrana de infecção coa? lipídeos catiônicos, bombardeamento em alta velocidade com microprojéteis revestidos com £?NA, incubação cost precipitado de fosfato de cãlcio-DNA, miuroinjução direta em células únicas, e semelhantes. Outros métodos também estão disooníveis e são conhecidos wo.r aqueles habilitados na técnica. Alternativamente, os vetores são introduzidos por meio de lipídeos catic-nicas, por exemplo, Iipoescmos. Esses lipossomos estão disponíveis comercialmente (por exemple, Lipofectin% Lipof ectamine^:!,í, e semelhantes, fornecidos por Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) <

Em outras modal idades, a construção de ácido nuclêico é introduzida em células apresentadoras de antígeno ou seus precursores por sua administração ligada a um ligante 10 sujeito a endocitose mediada por receptor (veja, por exemplo, Wu e Wu, u. Biol. Chem, 262: 4429-4432 (1987)) (que poda ser usada em tipos de célula-alvo que expressam especificamente os receptores;· etc. Ainda em outras modalidades, podem; ser formados complexos de ácido IS nucléico-ligante nos quais o ligants compreende um peptídeo fusogênico viral para a ruptura de endossemos, permitindo a construção de ácido nuclêico para evitar a degradação líscssomica, Ainda em outras modalidades, a construção da âcidc nncléico pode ser direcionada i.n vivo para captação a 20 expressão célula-específless, por direcionamento a um receptor específico (veja, por exemplo, Publicações PCT (40 92/0618G datada de 16 de abril de 1992 (Wu e cols,); WO 92/22635 datada de 2.3 de dezembro de 1992 (Wilson e coin.);

WO 92/20316 datada de 26 de novembro de 1992 (Findeis e 2E cols.;; WO 093/14188 datada de 22 de julho de 1993 (Clarke e cols.); e WO 93/20221 datada de 14 de outubro de 1993 (Young;), Alternativamente, o ácido nuclêico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro da DNA da célula hospedeira para expressão, por recombinaçáo 3 0 homóloga (Koller e Smithies. Proc. Asti. Acad. Sci. (7SA 86:

8.932-8.935 (1989); Zij1SCXa e coin., «ature 342; 435-438 (190)} ,:

Qutra abordagem para a terapia gênios envolve a transferência da construção de ácido nuclérco as células em cultura da tecido, o que normalmente ínclu.i a transferência de um marcador sslecíonável para as células. As células sâo então colocadas sob seleção para isolar aquelas células que foram recolhidas e estão expressando o gene transferido, Essas células são então liberadas a um paciente. Nessa modalidade, a construção de ácido nucléico é introduzida em células apresentadoras de antígeno ou seus precursores antes da administração in vivo das células recombinantes resultantes. Essa. introdução pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, ix7.clui.ndo, cam limitação, transfecçâo, eletroporação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacteriófago contendo as sequências de ácidos nucleicos, fusão de células, transferência gênica mediada por cromossomo,, transferência gênica mediada por microcelula, fusão de esferoolasto etc.

Várias metodologias são conhecidas na técnica para a introdução da genes estranhos em células (veja, por exemplo, Loefflers e 8s.hr, Heth, êmzymol. 217; 599-518 (1993;; Cohen e cole., Metò. Ehaymol. 31; G1S-644 i1923);

Cline, Phar.mac. 'hher. 29 t 99-92 (1985); e podem ser usadas 25 de acordo com a presente invenção, desde crua as funções de desenvolvimento e fisiológicas das células receptoras não sejam rompidas. A técnica deve permitir a transferência estável do ácido nuoléico à célula, de tal medo que o ácida nucléico seja passível de expressão pela célula e 3ü preferivelmente herdável e passível de expressão por sua pro.le de células. As células recambinantes resultante?! podem str liberadas a um paciente por vários métodos conhecidos na técnica. Células apresentadoras de antígeno recxxnbinantes são administradas tipicamente por via : íntravenosa»

3,3 Modalidades de partículas

Em algumas modalidades, oi s) polipeptideo(s) ou peptídeo(s) Gag, como descrito de forma ampla na Seção 3.1_#ou as construções de ácido nucléico que expressas; Gag, como 10 descritas de forma ampla na Seção 3,2 (aqui também denominadas “estimuladores imunes ou “estimuladares imunes de Gag} , são fornecidos em forms; particulada (aqui também denominadas partículas de Gag}. Essas modalidades são par ticularmente vantajosas para 1iberação dos sstimuladores 15 imunes âs células apresentadoras de antígeno ou aos seus precursores,· ex vivo ou in vivo, já que as partículas são recolhidas preferencialmente (por exempla, par endocitose ou fagocitase; par essas células. Diversas partícuias podem ser usadas na invenção, incluindo, sem limitação,.

v 1 ipca somos , mice. Ias , par tícuias 1 ipí di cas, partí cuias cerâmicas/inorgânicas e partículas poliméricas, a são tipicamente selecionadas de nanopartículas e micropartícuias. As partículas são dimensionadas adequadamente para fagoal toes ou endocitose por células 2S apresentadoras de antígeno ou seus precursores.

Células apresentadoras de antígeno incluem tipos de células apresentadoras de antígeno tanto profissionais quanto facultativas. Células apresentadoras de antígeno profissionais incluem, sem limitação, macrófagos, 30 monócitas. linfóoitas B, células da linhagem mielôíde, í no 1 α i ndo precursors s monoc í t i coa gr anui oc í t icos DC, células de Kupffer da zuno de marginal, microglia, células T, células de Langerhans e células dendríticas, incluindo células dendríticas de intsxdígitaçãa e células dendríticas £ foliculares. Exemplos de células apresentadoras de antígeno facultativas incluem, sem limitação, células T ativadas, astrócitos, células falículares, endotélio e fíbroblastos.

Em algumas modal.idades, a célula apresentadora de antígeno é selecionada de monôcitos, macrófagos, linfócitos B, células: da linhagem mielôide, células dendríticas ou células de Langerhans. Em modal idades específicas, a célula apresentadora de antígeno expressa CDllc e inclui uma célula dendrítica. Era exemplos ilustrativos, as partículas possuem uma dimensão ôe menos do que cerca de 100 pm, mais adequadamente na faixa de menos eu igual a cerca de 500 nm, embora as partículas possam ser tão grande quanto cerca de pm, e tão pequenas quanto poucos nm. Lipassomos consistem basicamente em uma bicamada de fosfolipídeo que forma uma pequena concha ao redor de um núcleo aquoso.

Vantagens incluem a. lipof.il ioidade das camadas externas que ’’mimetizam as camadas externas da membrana de células e que são recolhidas da forma relativamente fácil por diversas células, Veíeuloa poliméricos tipicamente consistem em miorc/nanoesfaras e micro/nanocãpsulas formadas de polímeros biocompatíveis, que são biodegradáveis (por exemplo, ácido polilético) ou não biodegradáveis (por exempla, acetato de etilenovinila). Algumas das vantagens dos dispositivos pollméricos são a facilidade de fabricação a a alta capacidade de carga, a 3Q variação de tamanhos, de um diâmetro de nanometre a míoron,

54/139 bem como a liberação controlada e o perfil de degradação.

ãm algumas modalidades, as partínulas compreendem uma molécula de ligação de antígeno em sua superfície, que é imunointerativa com um marcador crus é expresse· em níveis mais elevados em células apresentadoras de antígeno (por exemplo, células dendrítioas} dc- que em células não apresentadoras de antígeno. Marcadores ilustrativos desse tipo incluem MGL, DCL-l, DEC-205, macrófago manose R, DCSIGN ou outros receptores específicos para DC ou mielóide ílectina) como, por exemplo, revelado por Hawiger e cols. (2001, J. Exp. Afed.. 194, 755), Kato e sois. 2003, J. Bid. Chem. 278. 34,035; , Benito e cola. <2004, u. Am, Che.m, Esc, 126, 16.355), Schjetne, e oo.ls. (2002, 2n.t. Immunol. 14, 1.423! e van Vliet e cols., 2006. Mat. Immunol. Sep 24; [Epu-b anterior â impressão]; {van Vliet e cols.. Immunobiology 2005, 211.-. 577 -585}.

As partículas podem ser preparadas a partir de uma combinação do(s) estimulador{es) imune{s), e um tensostivo, excipiente ou material polímérioo. Em algumas modalidades, as partículas são biodegradáveis e biocompatíveis e, opcionalmente, são capazes de se biodegradar em uma taxa controlada para a liberação de um agente terapêutico ou diagnostico. As partículas podam ser feitas de diversos materiais. Podem ser usados materiais tanto inorgânicos quanto ox'ganicos. Materiais poliméricos e não poliméricos, por exemplo, ácidos graxas, podem ser usados. Outros materiais adequados incluem,. sera limitação, gelatina, oolietileno olicol, trealulose, dextrana & guitosana. Partínulas com tempos de degradação e de liberação que variam de seaundos a meses oodem ser oroietadas e fabricadas, com base em fatores coiao, por exemplo# ο material da partÍ cula,

3.3.1 Partículas poliméricas

Partículas polimarinas podem ser forcadas a partir de qualquer polímero, copolímero ou mistura biocompatível e desejávelmente biodegradável, Os polímeros podem ser adaptado» para otimizar diferentes características da partícula, incluindo: 1} interações entre os estimuiadoras imunes a serem liberados e o polímero para fornecer 10 estabilização dos est i mui adores· imunes e retenção da atividade apas liberação; 11} taxa de degradação do polímero e# dessa forma# taxa de perfis de liberação do agente; iii) características da superfície e capacidades de direcionamento por meio de modificação ..química; e iv) 15 poroeidade da partícula.

Polímeros de erosão de superfície como, por exemplo, polianidridos, podem ser usados para formar as partículas. Por exemplo, {jolianidridos como, por exemplo., polifípcarboxifenoxi>-hexano anforido], (PCPH) podem ser usados.

Polianidridos- .biodegradáveis sãe descritas na Patente U.S. M 4.,857,311..

Em outras modalidades, polímeros de erosão em massa, tais como aqueles baseados em poliésteres, incluindo poli(hidróxi ácidos} ou poli(ésteres}, podem ser usadas.

Por exemplo, ácido poliglicólico (KJA), ácida poiilático iPLA} , ou copolímeros destes,, pedem ser usados para, .formar as partículas.. O poliéster também pode ter um grupo cam carga ou funcionalizável. por exemplo, um aminaâoido. Em exemplos ilustrativas, partículas com propriedades de 30 liberação controlada podem ser formadas de poli (ácido D,L· lático) e/ou polí (ácido D, L-látíca-co-glícólico) (*'PLGA } que incorporam um tensoativo como, por exemplo, DPFC,

Outros polímeros incluem poli(alquiloianoacrilatoa), pol iamidas, pol icarbonatos, pol ial qu 11 en.es como, por exemplo, polietileno, polipropileno, poli(etileno glicolj, poliíóxido de etilsno), poli(tereitalato de etileno;, compostos de polivinila como, por exemplo, álcools poliviní 11 oos. éteres de polivinila e éstieres de polivinila, polímeros de ácidos acrílico e metacrílíco, 0 celuloses e outros polissacarídeos, e peptídeos ou proteínas, ou copolímeros ou misturas destes. Polímeros podem ser selecionados ou modificados para terem .as taxas apropriadas de estabilidade e degradação ín vi vo para diferentes aplicações de liberação controlada da fármaco.

Em algumas modalidades, as partículas são formadas por copolímeros de enxerto de pollester funciona?s.izado, como descrito em Hrkach e cols, (1995, Macromolecules, 28: 4,3<5--4.739; e Poly (L-Lactic ac id-co ~ arai no acid.? Graft Copol Imers c Zá Class of Functional Biodegradable

Biomaterials era Hydrogels and Biodegradable Polymers for Bioapplications, AC'S .Symposium Perles N⁴ 627, Raphael M, Otten.br its e cols., Eds., American Chemical Society. Capítulo 8, pp, 93-101, 1996).

Materiais diferentes de polímeros biodegradáveis podem S ser usados para formar as partículas. Materiais adequados incluem vários polímeros não biodegradáveis e vários excipientes. As partículas também podem ser formadas somente pelo estimulador imune (ou estimuladores imunes) e íw Xs· . V

G P&rGlorias calí^éricas nadem ser preparadas cam a usa

estimulador imune (estimuiadoree imunes) ,. seja em forma solúvel ou disperso como partículas finas, é adicionado à solução de polímero, e a mistura é suspensa em uma fase 5 aquosa que contém um agente tensoativo como, por exemplo, poli(álcool vinílico}. A fase aquosa pode ser, por exemplo, uma concentração de poli(álcool vinílico) 1% p/v em água destilada. A emulsão resultante á agitada até que a maior parte co solvente oxganrco evapore, serranoc mrcroesteras 10 sólidas, que podem ser lavadas com água e secas de um dia para o outro em um liofilisador. Microesferas com tamanhos ientre 1 e 1.000 pm) e morfologias diferentes podem ser

A remoção do solvente foi projetada primariamente para lê ser usada com polímeros menos estáveis, por exemplo, os polianidrrdos, desse. método, o agente ê disperso ou dissolvido em uma solução de um polímero selecionado em um solvente orgânico volátil como cloreto de metíleno. A mistura é então suspensa em óleo, por exemplo, óleo de 20 silicone, por agitação, para formar uma emulsão, Dentro da 24 heras, o solvente se difunde na fase oleosa e as gotínulas da emulsão endurecem em microesferas sólidas de polímero. Diferentemente do método de micrnencapsulação por derretimento a quente descrito, por exemplo, em Mathiowits 25 e cols. (1987, Reactive Polymers, t: 275), esse método pode ser usado para a produção de microesferas a partir de polímeros com pontos de fusão elevados e uma ampla gania de pesos moleculares.. Microesferas que possuem um diâmetro, por exemplo, entre um e 300 qm, podem ser obtidas com esse 3 0 p TGCH cl Ι'.τπ^'ΐϊΊ; o..

Com alguns sistemas poliméricos, partícuias políméricas preparadas com o use de uma técnica de emulsão simples ou dupla variam em tamanho, dependendo des tamanho das gotículas, Se as gotículas em emulsões água-em-ôleo não 5 são de um tamanho adequadamente pequeno para formar partículas com a faixa de tamanho desejada, gotículas menores podem ser preparadas, por exemplo, por sonificaçâo ou homogeneização da, emulsão, ou pela adição de tensoativos.

Se as partículas preparadas por qualquer um dos métodos acima possuem uma faixa de tamanho fora da faixa desejada, as partículas podem ser dimensionadas, por exemplo, com o use da uma peneira, e posteriormente separadas de acordo com a densidade com o uso de técnicas 15 conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

As partículas polimér.icas podem ser preparadas por atomiaaçao. Métodos de atomização como, por exemplo, aquele revelado em PCT WO 96/09814 por Sutton e Johnson, revelam a preparação de micropartínulas esféricas lisas de um 20 material hidrossolüvel com pelo menos 90% das partículas possuindo um tamanho médio entre 1 e .10 pm.

3.3.2 Partículas cerâmicas

Partículas cerâmicas também podem ser usadas para liberar os estimuiadores imunes da invenção. Essas 25 partículas são tipicamente preparadas com o uso de processos similares ao processo bem conhecido de sol-gel e normalmente exigem condições simples e temperatura ambiente, como descrito, por exemplo, em Brinker e ools. (Sol--Gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel 30 Processing; .Academic Press: Jan Diego, 1990, p~00), e

Avoir e cols. (1994, Chem. Mater. 6, 1695). Partículas cerâmicas podem ser preparadas com tamanho, formato e pc-rosidade desejados, e são extremamente estáveis. Essas partículas também protegem eficasmente moléculas? inativadas {polipeptídeos. fãrmacos etc.; contra desuatur&ção induzida por pH a temperatura extremos (Jain e cols., 19.98, C. A/n. Chem. Soe. 120, 11.092-11.095). Além disso, suas super!leias podem ser facilmente funcionalizadas com diferentes grupos (Lal e cols., 2000, Chem. Mater. 12,

2.832-2.839; Hadley e cols., 1990, Langmuir, 6, 792-891) e, portanto,. podem ser anexadas a diversos anticorpos monoclonais e a outros ligantes a fim de direcioná-los aos 1 oc a 1 s -d e s e j a d o s í n ví v o.

Várias partículas cerâmicas foram descritas para, a liberação i.n vivo da cargas contendo agente ativo. Por exemplo, a Patente Britânica 1.590.874 revela. a incorporação de component e.s biologicamente ativos em uma matriz de sol-gel.. Ά Publicação Internacional. WO 97/4 5367 revela xerogéis de silica dissolvíveis de forma controlável.

preparados por meio de um processo de sol-gel, no qual um agente biologicamente ativo é incorporado por impregnação em partículas pré-sinterizadas (1 a 500 qm) ou discos. A Publicação Internacional WG 0050349 revela fibras de silica .biodegradáveis de forma controlável preparadas por meio de

5 um processo de sol-gel, no qual um agente biologicamente ativo é incorporado durante a síntese da fibra. A Publicação do Pedido de Patente U.S. 20040180998 descreve nanopartícuias cerâmicas nas quais uma substância broativa e capturada. As nanopartícalas cerâmicas são feitas por

0 formação- de uma composição micelar do corante. O material ceramic© e adicronaao a composição tnicsiar e as nanopart .icul as cerâmicas são precipitadas pior hidrôlise alcalina. A Publicação do Pedido de Patexite U.£. 22050123611 revela partículas cerâmicas de liberação controlada que compreendem um material ativo disperso da forma substancialmente homogênea por todas as partículas. Essas partículas são preparadas por mistura de ura tensoativo com um solvente apolar pars; preparar uma solução de micela reversa; (b) dissolução de um precursor' de gel, um catalisador, um agente de condensação e um material ativo solúvel em um solvente polar para preparar uma solução precursora; (c) combinação da solução de micela reversa e da solução precursora para fornecer uma emulsão; e (d) condensação do precursor na emulsão. A Publicação dc Pedido de Patente U.S. 20062210334 revela substâncias bioativas de adsorção em partículas cerâmicas que compreendem um ôxido metálico (por- exemplo, oxido de titânio, õxido de zircônio, óxido de escândio, óxido de sério e ôxido de ítrio} por evaporação, Kortesuo e cole. /2050, ínt. J. P.óar.m. Maio 20; 200(2}: 22 3-2201 revelam um método de atomização para produzir partículas esféricas de silica gel com uma faixa de tamanho de partícula estreita para liberação controlada da fármacos como, por exemplo, citrato de toremife.no a HC1 de dexmedetomidine . Wang a cols. (2006, l.nr... u. Pharm. 300(1-2}.- 160-167} desci'evem a combinação de adsorçâo por micropartícuias porosas de CaCQ₂e encapsulaçao per psucuiss mum camadas us potj.e.i.atronto para liberação de substâncias bioativas.

3.3.3 hipussosios

82/139

(1992, Hioohim. Biophys. Acha 1.104, 35-101.); Lee a cols.

Hass e cols. ίPuhi icação do Pedida de Patente U.S. 200502323845, Kisak e cols. {Publicação da Pedido de Patente U.S. 20050260260) e Smyth-Templeton e cols. (Puniicaçao no rsaidc de Patente U.i>. ,ívü&üzv4«6í>} .

Ad ici onalme nt e,. pode ser feita referência a Copeland e cols. {2005, .Immunol. Cell. Biol. 83: 98-1055, que fizeram uma revisão sobre formalaçòes partícaladas à base de lipfdeos para a liberação de antiqeno, s a Bramwell a cols. ,200^, Cm t. .’<ev, Thar. .Drug? Carrier ,?7yst. 22 '.25 : 151-21.4;

2006, w. Pharm, Pharmacol. 58(6): 717-728), que revisaram sistemas de iiosrsçãQ part-xcuiados para vacmas, mclulndo métodos para a preparação de lipoesomcs carregados com proteína. Muitas formulações lipossÔmicas que utilizam diversos componentes lipídieos diferentes foram usadas em

0 vários experimentos de cultura de células .in vitro e em animais. Foram identificados parâmetros que determinam as propriedades nposscmmas e des são reiatauns na literatura, por exemplo, por tea e ooi.s< >, 13?.>o, áiocüiüí. Bíopòyo. Acts. '1.103, X35-X97); üiu e cols. (1992, Hioohim.

Biophyn. Acta, 1.104, 95-101); e Wang e cols. {1959, S i ochem. 28, 0 ..5 0 8 - 9 514

Resumidamente< os lipídeos da escolha (e qualquer bioativo orgânico-solúvel), dissolvidos em um solvente orgânico, são misturados e secos no fundo de um tubo de vidro sob vácuo. A. película de lipídeo é reidratada com o

ou colesterol para aumentar a eficiência da encapsulate ou para aumentai a estabilidade etc. Um gradiente de pH transmembrane é criado por ajuste dc pH do meio extravehicular até 7,5 por adição de um agente de alcalinização. Um estimuladox imune de Gag pode ser subsequentemente capturado por adição de uma solução do estime lade-r imune em pequenas alíquotas à solução de vesículas, em uma temperature.’ elevada, para permitir o acúmulo do estimulador imune dentro des lipossomas.

Outras partículas a base de lipídeos adequadas à liberação dos estimuladores imunes da presente invenção como, por exemplo, niossemos, são descritas por Copeland e cols. *2005, Immunol. Cell, Βϊοΐ. 83; 95-105).

3.3.4, Partículas balísticas

Os estimuladores imunes da presente invenção podem ser anexade-s (por exemplo, por revestimento ou conjugação) ou de algum outro modo associados a partículas adequadas ao uso em liberação sem agulha ou balística (biolístíca). Partículas ilustrativas para liberação balística são descritas, por exemplo, em: Publicações Internacionais- WQ 02/101412; WO 02/100380; WO 02/43774; WO 02/19989; WO 01/533829; WO 01/83528; WO 00/63385; WO 00 /28.385; WO 00/19982; WO 99/01168; WO 98/10750; e WO .97/484 85. Deve-se entender, nc> entente, que essas partículas têm sen uso limitado a um dispositivo de liberação balística e podem ser administradas de algum, outro modo per qualquer técnica alternativa (per exemple, liberação por injeção ou por micrcagulha) por meio da qual as partículas sejam liberáveis às células imunes.

Os estimuladoxes Imunes podem ser revestidos ou guimicamente acopladas a partículas transportadoras (por exemplo, transportadores centrais) com o uso üe diversas metodologias conhecidas na técnica. Partículas transportadoras são selecionadas de materiais que possuem uma densidade adequada na faixa de tamanhos de partícula tipicamente usados para 'liberação intracelular. 0 tamanho ótimo da partícula transportadores, evidentemente. dependerá do dlâme t rq das cê 1 ulas - a 1. vo . Part í cu 1 as 1.1.ustra11 vas possues; um tamanha que varia de cerca de 0,0.1 a cerca de 2 50 um, de cerca de 10 a. cerca de 150 um, e da cerca de 20 a cerca de 60 qm; e uma densidade de partícula que varia de cerca de 0,1 a. cerca de .25 g/cm\ e uma densidade de massa de cerca de 0,5 a cerca de 3,0 g/cm\ ou maior. Partículas não 1imitantes des sa t ipo incluem par c íou1as me tálicas como. por exemplo, partículas transportadoras da t ung s t ê n i o, o u r o, p 1 a t .i η a e 1 r í d i o . P a r t í c u 1 a s d e tungstênio são facilmente disponíveis em tamanhos médios de 0,5 a 2.0 pm de diâmetro. Partículas de ou.ro ou oura microcrista lino {por exemplo, pó de ouro Al 57 0, disponível, por Engelhard Corp,, East Newark, N,J.) também podem ser usadas. Partículas de ouro fornecem uniformidade nu tamanho {disponível por .Alpha Chemicals em tamanhos de partícula de 1 - ,5 um, ou sisponivôl por Líegussa, South . N,U.

em uma gama du tamanhos de partícula que inclui 0,95 pm) e baixa toxicidade. Ouro microcristalino fornece uma xLi’ífeu<1<ΐ <1.1 < t''1 na faixa de 0,1--5 um. A ãrea de superfície irregular do oura microcristalino permite um revestimenta altamente eficiente com as agentes ativas da presente invenção.

Sãc- conhecidos e foram descritos muitas métados sara.

65/139 adsorção, acoplamento ou alguma outra forma de anexação de moléculas hicatrvas {por exemplo, moléculas hidrofílicas como, por exemplo, proteínas e ácidas nucleicoo) em partículas como, por exemplo, partículas de ouro ou 5 tungstênis, Em exemplos ilustrativos, esses métodos combinam uma quant idade predeterminada de ouro ou tungstênio com as moléculas bloativas, CaCl? e espermidina, Em outros exemplos, etanol é usado para precipitar as moléculas bioativas em partículas de curo ou tuugstênio 1Q (veja, por exemplo, Gumar e cols. , 2 004, Phys, .Meu. Bid.

43: 3.603-3.512;. A solução resultante é adequadamente turbilhonada oont inuamente durante o procedimento de revestimento para assegurar a uniformidade da mistura de reação. Após adesão das moléculas bloativas, as partículas 15 podem ser transferidas. por exemplo, para membranas adequadas, deixando-se que sequem antes do uso, revestidas sobre superficies de um módulo ou cassete de amostra, ou carregadas em um cassete de liberação para uso em instrumentos específicos de liberação mediada por 3 0 partículas..

As composições formuladas podem ser adequadamente preparadas como partículas usando técnicas padronizadas, por exemplo, por evaporação simples (secagem ao ar), secagem a vácuo, atomização, secagem por congelamento 25 (licfilização), secagem por atomização-congelamento, revestimento por pulverização, precipitação, formação de partículas por fluido supercrítico, e semelhantes. Se desejado, as partículas resultantes podem ser aprimoradas com o uso das técnicas descritas na Publicação 3 G I nt e rna c i onal WO 9 7,/ 4 8485.

g 7 /13 9

3.3 x 5 Tensoa1ivos

Tensoalives que podem ser incorporados em partículas ixicluem f os f ogl 1 cerídeos < Fosfogl i cerí decs exemplares incluem fesfatidilcolinas, por exemplo, o teusoativo de ocorrência natural. , L-α-fosf atidilcolina dipalmítoil (DPPC;. Os tensoativos vantajusamente melhorara as propriedades da superfície, por exemplo, por redução de interações partícula-partícula, e podem tornar a superfície das partículas menos adesivas. ΰ uso de tensc-ativas lí) sndôgenos ao pulmão pode evitar & necessidade do uso de t e n s o a t, z vo s na o 11 s s o à o g i co s.

O fornecimento de tensaativo nas superfícies das partículas pode reduzir a tendência das partículas parca se aglomerarem era função de interações como, por exemplo, 15 interações eletrostáticas, forças de Vau der Waals e ação capilar. .A presença do tensoativo na superfície da partícula pode fornecer rugosidade aumentada da superfície (aspereza) , aumentando, dessa forma, a aerossolização por redução da área de superfície disponível para interação 2 0 ínt í ma part íeul a - part í sul a .

Os tensoativos conhecidos na técnica pudera ser usados, incluindo qualquer tensoatívo de ocorrência natural. Outros tensoativos exemplares incluem dif osf a t idi 1 glicurol {DPPGj í hexadeuanol; áleoois graxos como, por exemplo..

2.5 polietileno glicol (PEG); poliuxietilenu-9· lauri 1 éter; um aside graxo tensoauivo, por exemple, ácido palmítico cu ácido uléícu; tr ideate de serbitano (Span 85) ; glicocolato; surfastina; um poloxâmero; um éster de ácido eosrlxí » Dor , t.*s £1 o.l&&tx> cie SOX'L·.1 t&HO C ?0 tiloxapol e um fosfolipídeo.

3.4 Modalidades de células apresentadoras de antigene

Em algumas modalidades, o estimulador imune que é usado par aumentar o número de células apresentadora» de antígenc Gag-específicaa n.o indivíduo é uma célula apresentadora de antígeno ou seu precursor, que é obtida do indivíduo a ser tratado (ou seja, uma célula apresentadora de antigeno autóloga ou precursor) ou de um doador que seja MHC-compatível ou não compatível com o indivíduo (ou seja, uma célula apresentadora de a.ntígeno alogênicai . .10 Desejavelmente, o doador ê histocompatívei com o indivíduo.

Nessas modalidades# uma célula apresentadora de antfgeno Gag-específica ou precursor* é produzida por contato da célula apresentadora de antígeno ou precursor cora íii um polipeptídeo Gag ou um peptídeo Gag, como descrito, por 15 exemplo, na Seção 3.1, que esta adequadamsnte em forma solúvel ou em forma particulada, como descrito, por exemplo, na Seção 3.3, ou com (li) uma construção de ácido nucléico que expressa Gag, corão descrito, por exemplo, na

Seção 3.2, que está adequadamente em forma solúvel, ou em 20 forma particulada, como descrito, por exemplo, na Seção

3,3, em uma quantidade e por um período suficiente para que um peptídeo Gag seja apresentado pela célula apresentadora de antígeno ou precursor em sua superfície,

3.4.1 Fontes de células apresentadoras de antígsnc e seus precursores

As células apresentadoras de antígeno ou seus precursores podem ser isoladas por métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, A fonte dessas células irá deferir, dependendo da célula apresentadora de antígeno 30 necessária para a modulação de uma resposta imune especificada. Nesse contexto, a célula apresentadora de antígeno pode ser selecionada de células dendríticas, macrófagos. monócitos e outras células da linhagem mieloide.

Tipicamente, precursores de células apresentadoras de antígeno podem ser isolados de qualquer tecido, mas são mais facilmente isolados dc· sangue, sangue umbilical -ou medula óssea íSurg a cols,, 2001, Exp. ífematol. 29, 1.2891.294; ãheng e cais., 2000, J. ííematotner. .Stem Pai 2 Hes.

9, 459--4 64) . Também é possível obter precursores adequados de tecido;¹.? doentes como, por exemplo, tecido ou fluido sinovial reumatóide após biópsia ou punçao articular í Th ornas e co1s. , 19 94 a, J. I uaaI. 153, 4,016 -4.0 28; Thomas e cois., 1994b, Arthritis Rheum. 37(4}) . Outros 15 exemplos incluem, sem limitação, fígado, baço, coração, rim, intestino e amfdala í'Lu e cols., 1994, ü. £xp. Mad, 179, 1.823-1.834; McIlroy e COÍS., 2001, Blood .97, 3.4703.477; vremec e cols., 2000, J. Immunol. 159, 565-573; Hart e Fabre, 1981. J. Sxp. *íed. 154 (2), 347-361,- Hart e

McKenzie, 1988, d, .EXp, Med. 168(1}, 157-170; Pa vii e co.ls., .1990,. .Immunology 70 {1} , 40-47}.

Leucõcitos isolados diretamence de tecido constituem uma fonte importante de precursores da célula apresentadora da antígeno. Tipicamente, esses precursores só podam se 25 diferenciar em células apresentadoras d.e antígeno por cultivo na presença ou ausência de vários fatores de crescimento. De acordo com a prática da presente invenção, ss células apresentadoras de antígeno também podem assim se diferenciar de misturas brutas ou de preparações parcial ou 30 substancialmente purificadas de precursores. Leucócitos podem ser ccnvenientemente purificados do sangue ou da medula óssea por centrifugaçao por gradients de densidade usando, por exemplo, Ficoll Hypaque, o que elimina neutrófilos e células vermelhas (células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs) , ou por lise em cloreto de amónio de células vermelhas (leucócitos ou células sanguíneas brancas). Muitos precursores de células apresentadoras de antígeno estão presentes no sangue periférico como mondeitos não-proliferantes, que podem, ser diferenciados em. células apresentadoras de antígeno específicas, incluindo macrófagos e oé'lu.la.s dandríticas, por cultivo na presença de oitccinas específicas.

Precursores derivados de tecidos como., por exemplo, precursores de células dendritioas teciduais ou de células de Langerhans, são tipicamente obtidos por trituração de tecido (por exemplo, camada basal da epiderme) e sua digestão com colagenase ou dispase, seguida por separação por gradiente de densidade, ou seleção de precursores com base em sua expressão de marcadores da superfície celular. Por exemplo,, precursores de célula de Langerhans expressam moléculas CD1, bem como HLA-DR, e podem ser purificadas desse modo.

Em algumas modalidades, o precursor da célula apresentadora de; antígeno é um precursor de macrófagos.. Geralmente, essas precursores pedem ser obtidos de. mondei tos de qualquer fonte e podem ser diferenciados em •macrófagos por incubação prolongada na presença de meio e fator estimulante de colônia. de macrófagos (M-CEP· íErickson-Miliar s cols,, 1590, Tnt. J, Cell Cloning 8, 346-3 55; Metcalf e Burgess, 1982, J, Cell, .Physiol,, Ill,

72/0'9 periférico íGarderet a cols., 2001, J, Hamatother. Stem Cell Res. 10, 5.83-597). Monôcitos também podem ser purificados por técnicas de imunoafinidade, incluindo seleção imunomagnétiea, separação por citometria de fluxo ou panning (?$xakí. a cols., 2001, supra; Battye e Shortman, 1991, Curr, t)p.O. .Immunol. 3, 238-241), com anti corpos anti.-CD14 para obter células CDláhi. Os números (e, portanto, o rendimento) de monôcitcs circulantes podem ser aumentados pelo uso In vivo de várias citocinas, incluindo GM-CSF (Groopman e cola., 1987, *V, .Engl, <7. Med. 317, 593598; Hill e COlS. , 1995, v. haukoc. 8.3.O.Í . 58, 834-642) . Monôcitos podem ser diferenciados, em células dendrítlcas ροζ' incubação prolongada na presença de GM-CSF e IL-4 (Romani e cols., 1994, J. kxp. áíed. 180, 83-93; Romani e sois., 1998, supra) . Uma comb inação de GM-CSF e IL-4 em uma concentração de cada um entra cerca de 209 a cerca de 2,000 ü/ml, mais preferivelmente entre cerca de 500 a cerca de 1.000 ü/ml a, ainda mais preferivelmente, entre cerca de 500 ÍJ/ml (GM-CSF) e 1.000 U/ml (11..-4), produz quantidades significativas de células dendrftioas imaturas, ou seja, células dendríticas fagocíticas de captura de antígeno, Outras citocinas que promovem a diferenciação de monccitcs em células dendzítiaas fagocíticas de captura de antígeno 1nc1uem, por exemplo, 1L-13.

Células·'· tronco CD34*;

Células dendríticas também podem ser geradas a partir de precursores CD34^: derivados da medula óssea na presença de GM-CSF, fator TNFu j célula - tronco (SCF, c-kitt), ou QMCSF, IL-4 z flt3L (Rai e ccds., 2702, Jnt, J. (lucol . 20,

Células dendr í.t í cas também podem ssr geradas a partir de precursores de neutrólilos do sangue periférico na presença de GM-CSF, XL-4 e TNFu (Kelly e ecus., 2001, Cell. Mol < Biol. (Mojsy··le-gr<á;jd} 47, 43-54; Oehler e cols<, 1998, J<

S Exp. Med, 187, 1.019-1.028;. Deve-se observar que células dendríticas também podert ser geradas, can- c· uso de métodos similares, de células de leucemia mielõide aguda íOehler e sais·., 2000_; Αββ<· Hemac-O-I ♦ 19, 35a-02?·.

Precursores de DC tecidual e outras fontes de precursores de APC;

75/139 celular CD13 e CD33 (Thomas a cols., 1993b, J'. Immunol. 151(12), 8.840-8.852}. Um segundo subconjunto, desprovido de CU14, CD19, CD56 e CD3, conhecido como precursores plasmocítôides de células dendríticas, não expressa CD11c, mas expressa CD123 (cadeia de IL-3R) e HLA.-DR (Farkas a cols., 2001, Am. u. Pathol, 15 9, 237-24 3; Grcuard e cols., 1997. <7. Exp. Mad. 185, 1.101-1.111; Rissoan e COlS., 1999, Science 283.. 1.193-1.185). A maioria dos precursores circulantes CD llc de células dendríticas é HL.A~DR\; no entanto, alguns precursores podem ser H.LA-DR' . A ausência de expressão de MHC da classe II foi claramente demonstrada para precursores da células dendríbicas do sangue peritèrico ídel Hoyo e cois., 2099, nature 4.ιο, 1.04 81..04:/) .

Opcion&lmente, precursores de células dendrítioas

CD33'CD14’ⁿ~ ou CDllc*HLA~ DR⁺, marcador de linhagemnegativos, descritos acima podem ser diferenciados em casulas apresenc actor as ue antxgeno macs maouras por incubação por 18-35 h em meio de cultura ou em meio condicionado de mondeitos (Thomas e cols., 1993b, supra; Thomas e Lipsk-y, 1994, <1. immune!. 193, 4016-40^8) (O’boherty e cols., 1993, supra). Alternativamente, após incubação de células não T do sangue periférico ou de PBMCs não purificadas, as células dendríticas maduras do sangue perxrerico suo caraoterizaoas por oaz.xa dens.í.dace e, portanto, podem ser puri.fic?;das em gradientes de densidade, incluindo metrizamída e Nycodenz (Freudenthal e Steixunan, 1990, Proc. .Nat.1. Acad. Pci . d.D.A. 87, 7.85/8--7.702 ; Vremec e Shortman, 1997, J. l.mmu.ao.1. 159, .589-573} . ou por anticorpos monocionais específicos como, por exemplo, »ei?;

76/139 limitação, o mAh CMPE-44 (Fesrnley a cols?., 1999, Blood 93, 728-7 36; Vuckovic e cols.. 1998, Exp. A’ematol. 26, 1.2551,264). Células dendríticas plasmccitóides podem ser purificadas diretamente do sangue periférico com base em marcadores da superfície celular, e depois incubadas .na presença de IL-3 <Qzouaxd e cols., 199'7, supra; Rxssoan e cols. , 1999,- supra) . Alternativamente, DCs plasmocítóides podem ser derivadas da gradientes de densidade c-u seleção por CMRr-44 de células incubadas do sangue periférico, como d escr11o a cima..

Em geral, para células dendríticas geradas a partir de qualquer precursor, quando incubadas na presença de fatores de ativação como, por exemplo, aitoc.in.aa derivadas da monócitos, 1ipcpolissacarideo e repst içoes CpG contendo

DBA, cítocinas como, por exemplo, ΤΝΕ-α, II.-6, IFN-u, IL-β, ce i ulas neox o t *css, reaaerênc ia, h act e r i a s .i nts iras, componentes da membrana, RUA ou polilC, células dendríticas imaturas, se toxnarao ativadas tuxark. 20«^, i>sukcc .

Biol,, 71,- 388-400; Hacker e cods., 2002, Immunology 105, 2 4 5-2 61; Ka i s ho e Ak i r a, 2 0 0 2 < Ei cc h i m. B1 oph y «. A c t a 1.599, 1-1.3; Kcski o cols., 2001,. Crít. Rev. Immunol. 21, 179-189;. Esse ,processo de ativação de células dendríticas está inibido na presença de inibidores da NF-κΒ (O'Sullivan e Thc-ma s, 20 0 2, .J.. 1 mmuno 1. 168, 5.4 91-5,4 9 8) >

Em algumas modalidades,, populações não cultivadas de. podem ser introduzidas no indivíduo.. que não foram submetidas às condições de ativação. Exemplos ilustrativos da população não cultivada de células apresentadoras de antígeno ou de seus precursores incluem sangue total, sangue fresco ou frações deste coísg, por exemplo, sem limitação, células ínononucleares do sangue periférico (PMBC), frações de células brancas do sangue total, concentrado de hemáoias, sangue irradiado, células dendríticas, mondeitos, macrófagos, neutróflies, linfócitos, células natural killer e células T natural killer. Em modalidades especificas. a população não cuitivaca ue células apresentanoraa ue antígeno é selecionada de sangue ou PMSCs recém-isolados. Em outras modalidades, a população não cultivada de células apresentanoras de antígeno é uma pepuxaçao neurótica ou apoptõtioa, Gessa terms, a população não cultivada de células pode ser colocada em contato com antígeno e subsequentemente submetida às condições neuróticas, que levam a um trauma irreversível das células (por exemplo, choque osmótico ou exposição a um veneno químico como, por exemplo, glutaraldeídoj, em que as células são caracterizadas par edema acentuado das mitocôndrias e citoplasma, seguido por destruição da célula e autôlise. Alternativamente, a população não cultivada de células pede ser colocada em contato com uma molécula bioativa da invenção e subsequentemente submetida às condições apoptõticas. Células que expressam ou apresentam antígeno podem ser induzidas a passar por apeptoae in vitro ou in vivo usando vários métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, infecção viral, irradiação com .i.ua ultravioleta, radiaçao gama, esterco, nes, fxxaçao ί,ραζ exemplo, com glutaraldeído? , citooinas ou por privação das células do doador de nutrientes no meio de cultura de células. Estados de evolução cem o tampo podem estabelecer

78/139 períodos de incubação suficientes para i-iduçao ótima de apoptose em uma população de células. Por exemplo, monócitos infectados com vírus Influenza começam a expressar marcadores precoces para apoptose por volta de 6 5 horas apôs infecção. Exemplos de marcadores: específicos para apoptose incluem Anexina V, células TUNEIi, laddering de DNA e captação de iodeto de propício..

3.4,2 Liberação ex vivo de polipeptídeo ou ácido nucléico

XO Estinaladores imunes de Gag da invenção podem ser liberados em- células apresentadoras de antígeno cm várias formas, incluindo ácidos nuclei cos e polipeptídeos,. que podem ser solúveis ou particulados. A quantidade de estimulador imune de Gag a ser colocada em contato ecm r céxulas apr esentaooras da antrgsno poce ser determmaoa emp ir i cament e por aquelas nahxmacos na técnica. As células apresentadoras de antígeno devem ser expostas ac estimulador imune de Gag por um período de tempo suficiente para que essas células apresentem, peptídeos Gag em .sua 20 superfície para a. modulação· de células T. Em algumas modalidades· vantajosas, as células apresentadoras de antígeno são incubadas na presença de polipeptídeo Gag ou peptídeo Gag por menos dc que cerca de 48, 38, 24, 12, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 horas ou até mesmo por menos de cerca de

60, 50, 40, 30. 20_; 15··, 1(1, 9, 8, 7, .g-, 5, 4, 3 ou 2minutos. O tempo e a dose de polipeptídeo ou peptídeos necessários para que as células opcionalmente processem e apresentem peptídeos Gag podem ser determinados usando protocolos pulse-oiass nos quais a exposição ao antígeno

0 Gao é seguida por um neríodo de lavagem e exnosíção a um s13ema de leitura, por exemplo, células T reativas ao antígeno. Após a determinação do tempo e da dose ótimos necessários para que as células expressem os peptideas Gag em sua superfície, pode ser usado um protocolo para preparar as células e antígeno Gag para indução de respostas imunogênicas, Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, a esse respeito, que a duração de tempo necessária para que uma célula apresentadora de antígeno apresente um antígeno em sua superfície pode variar, dependendo do antígeno cu da forma de antígeno empregada, sua dose, e da célula apresentadora de antígeno empregada, bem como das; condições sob as quais a carga de antígeno é efetuada. Esses parâmetros podem ser determinadas par aqueles habilitadas na técnica com α uso de procedimentos tie rotina. A ermencia da sensmniraçao das cèiuiâs apresentadoras de antígeno pode ser determinada testando-se a atividade cítotóxíea da célula T in vitro ou com o uso de células apresentadoras de antígeno camo alvos da CTLs , Outros métodos conhecidos pelas profissionaís na técnica que podem detectar a presença de peptídeo Gag na superfície de células apresentadoras de antígeno apõe exposição a um antígeno Gag também são contemplados pela invenção ei V í 3?**· ξ^.Π tí.

Normalmente, cerca de 0,1 a 2 0 ug/ml de antígeno Gag (por exemplo, antígeno peptídíco Gag) a ceres de 110 milhões de células apresentadoras de antígeno são adequados à produção de células apresentadoras de antígeno sensibilizadas antígeno-específicas. Tipicamente, as células apresentadoras de antígeno são incubadas cam antígeno por cerca de 1 a 6 h a 37^CC, embora também seja possível expor as células apresentadoras de antígeno ao antígeno Gag pela duração da incubação com um ou mais fatores de crescimento, Como determinado previamante pelos presentes inventores, a apresentação .bem sucedida de antígeno peptídíoo pode ser obtida com o uso de períodos de incubação bem mais curtos (por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40. 50 minutos··) com o uso de antígeno em uma c one en t r a ç ã o de c e r c a d a 10 ·· 2 0 pg / m 1 Se desejado, todas; ou uma porção das células apresentadoras de antígeno podou; ser congeladas em uma solução oriopreservante apropriada, até elas serem necessárias. Por exemplo, as células podem ser diluídas em us meio apropriado, por exemplo,, um que contenha 10% de soro autólogo ;· 10% de dimstilsulfóxido em uma soltxção salina camponada com fosfato. Em cartas modalidades, as células são conservadas em uma. forma desidratada.

Em algumas modalidades, a liberação de antígeno Gag exõgenc a. uma célula apresentadora, de antígeno poda ser aumentada por métodos conhecidos pelos profissionais na técnica. Por exemplo, foram desenvolvidas varias estratégias diferentes para liberação de antígeno exógeno à via de processamento endógena de células apresentadoras de antígeno, especiaImente células dendrítíeas, Esses métodos incluem a .inserção de antígeno em lipossomos sensíveis ao p.H íEh.ou e Huang, 1.994, Immunorneihods 4, 229-235), lisa osmõcica de pinossomos apôs captação pinocítioa de antígeno solúvel (Pioore e cols., 1998, Cell 54, 777-735), acoplamento de antígenos a adjnvant.es potentes (Aichele e coin., 1990, J. Exp. Mod., 171, 1.815-1.820; Gao e cols., 1991, J, Immunol., 147, 3.258--.3.273; Schulz e cols., 1991,

Proc. Mar. 1 , Aaau. Sol. IAS.A,, 83, 991 -993; Kuzu a cals'.,

199 3., Aura. J. Immunol, 23, 1,397-1.490; e Jondal e cols., 1995, immunity 5, 295-302), exossomos (Eitvogel e cols.,

I9 9 8 Na t. Med. «, 594- 6 0 0; 2 0 0 2, Na t. Rev. Immuno I < 2, 5 6 9 5 79), e liberação de antígeno por células apoptoticae (Albert a cals., 1998, Nature 392, 86-89; Albert, e cals.,

1998, Nature Ned, 4, 1.321-1.324; e nas Publicações .Internacionais WO 99/42564 e WO 91/85207), Bactérias reeombinantes (por exemplo, E. coll) ou células hospedeiras 10 mamíferas transíestadas podem ser pulsadas em células dendríticas (como antigens partieulads ou corpos apoptótioos, respectivamsnte) para liberação de antígeno.

Uni sistema de liberação desse tipo pode ser combinado logicamente com uma substância para a inibição de NF-k», 15 por exemplo, um plasmídeo que codifica ΣκΒα dominante negativo (Pai e cols., 20v2, J, Vírol. 76, 1,914-1,921).

Partículas vírus 1 ike (VLPs) quimêricas recombinant es também .foram usadas como veículos para liberação de antígeno betorolego exógeno à via de processamento de MHC 20 da classe I de uma linhagem de células dendríticas (Bachmann e cola,, 1996, Eur. Jt Immunol,, 26(11), 2,5952 .. 60 0 ) .

Alternativamente, ou em adição» um antígeno pode ser ligada, au de algum outro modo associado, a uma citolisina 25 para aumentar a transferência do antígeno no oitosol de uma célula apresentadora. de antígeno da invenção para liberação ã via de MHC da classe I. c:irolisinas exemplares incluem compostos de saponins como, por exemple, Complexo.s de Estimulação Imune contendo saponina (T.SCOMs) (veja, por exemplo, Cox e Coulter, 1997, Vaccine 15(3), 248-256 a

Patente ü,S. N* ¢,352.697), fosfolipases (veja, por exemplo, Camílli e cola., 1991, J. Exp. Med, 17 3, 751, 7545, toxinas formaderas de pores (por exemplo, uma alfatoxina), citolisinas naturais de bactérias gram-posit, iva a, por exemplo, listeriolisina O (LLO, por exemplo, Mengaud e cole., 198«, Infect. Immun. 56, 765-772 e Portnoy e cols., 1992, Infect. Immun, 69, 2.710-2.717), estreptolisina O (SXjO, por exemplo, Palmer e cols., 1998, Biochemistry 37(8), 2.378-2.383) e perfringolisina 0 (PFO, por exemplo,

Ross John e cols., Cell 89(6), 68 6-692) . Quando a célula apresentadora de antigens é fagossômica, citolisinas ativadas por ácido podem ser vantajosamente usadas. Por exemplo# 1isterioiisina exibe maior habilidade para formação de poros em pH levemente ácido ias condições de pH 15 dentro dc fagossomo), facilitando, dessa forma, a liberação do conteúdo do vaoúolo (incluindo fagossomc e endossam-o) ao oitoplasma (veja, por exemplo, Portnoy e cais,, 1992, Infact, Immun. 60, 2.710 - 2,717} ,

A oitolisina pode ser fornecida junto com um polipeptídeo ou peptídeo Gag na forma de uma composição única ou pode ser fornecida como- uma composição separada, para contato das células apresentadoras de antfgeno, Em uma 'modalidade, a citolisina é fundida ou de algum outro modo ligada ao polipeptídeo ou peptídeo Gag, em que a fusão ou 25 ligação permite a liberação do polipeptídeo ou peptídeo Gag ac citosol da célula apresentadora, de antfgeno. Em outra modalidade,, a cítolisina e o polipeptídeo ou peptídeo Gag são fornecidos na forma de um veículo de liberação como, por exemplo, sem limitação, um lipossomo ou um veículo de liberação microbiano selecionada de vírus, bactéria ou levedura. Adequadamente, guando o veicula de liberação é um veículo de liberação microbiano, o vereulo de liberação é não virulento. Em uma modalidade preferida desse tipo, o veíoulo de liberação é uma bactéria não virulenta coma, por 5 exemplo, descrito por Portnoy e cols. na Patente U.S. l-o

6.287.S55, que compreende um primeiro palinucleotídeo que codifica uma citolisina funcional não secretada ligada aperacienalmente a uma seqüência reguladora que expressa a citolisina na bactéria, e um segundo polinucleotfdeo que 10 codifica, o polipeptídeo ou peptideo Gag. Citolisinas não secretadas podem ser fornecidas por vários mecanismos, por exempla, ausência de uma seqüência sínalizadora funcional, um micróbio com secreção incompetente, por exemplo, micróbios que possuem lesões genéticas (por exemple, uma 18 mutação d.a seqüência sinal Isadora funcional) , ou micróbios envenenados etc. Uma ampla variedade de bactérias não patogênicas não virulentas pode ser usada; micróbios preferidas são capas relativamente bem caracterizadas, particularmente cepas laboratoriais de E. coli, por 20 exemplo, MC4100, MC1061, DHSrx etc. Outra» bactérias que podam ser criadas geneticamente para a invenção incluem cepas não patogênicas, nau virulentas, bem caracterizadas, de Listeria monocytogenes, Ehdgella flexneri, micobactérias, Salmonella. Bacillus subtilís etc. Em uma 28 modalidade particular, as bactérias são atenuadas para serem não replicantes, não integrativas no genoraa da célula hospedeira e/ou não móveis inter- ou intracelularmente.

Qs veículos de liberação descritos acima, bem como os veículos partieulados descritos, por exemplo, na Seção 3.3, 30 podam ser usados para liberar um ou mais polipeptidees e/ou

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1984, Academic Press). Xaso inclui resecting com células sanguíneas vermelhas de carneiro, passagem através de colunas da lã ds náilon ou aderência plástica para eliminar células? aderentes, seleção imunomagnêtica ou por citometria S de fluxo usando anticorpos monoclonais apropriados conhecidos na técnica.

A preparação de linfócitos T é colocada em contato com as célu.las apresentadoras de antigeno Gag-específicaa da invenção por um período de tempo adequado para

1Q sensibilização dos linfócitos T ao antigeno ou antígenos Gag apresentadas por aquelas células apresentadoras de antigeno. Esse período será preferivelmente de pelo manos cerca de 1 dia, e até cerca de 5 dias.

rm algumas modalidades, uma população de células apresentadoras de antigeno Gag-específloas é cultivada na presença de uma população heterogênea de linfócitos T, que é obtida adequadamente do sangue periférico, junto com diversas pept .ideas Gag da invenção. Essas células são cultivadas por um período de tempo s sob condições suficientes para que os peptídeos, ou suas formas processadas, sejam apresentados pelas células apresentadoras de antigeno; e para que ss células apresentadoras de antigeno sensibilizem uma suhpopulação dos linfócitcs T para que respondam ao antigeno Gag.

S. Terapia ou profilaxia ã base de eélulaa

As células apresentadoras· de antigeno Gag-especificas descritas na Seção 3.4 e os linfócitos sensibilizados por Gag descritos na Seção 4 podem ser admixxistrados a um paciente, isoladamente ou em combinação, para a modulação 30 de uma- resposta imune, especialmente para a modulação de uma resposta imune a um polipeptídeo Gag. Essas composições à base de células são úteis, portanto, para o tratamento ou a prevenção de uma infecção per lentivírus ou condição associada. As células da invenção podem ser introduzidas em um paciente por qualquer meio {pox' exemple, injeção) que produza a resposta imune desejada a um antígeno ou grupo de antígenos. As células podem ser derivadas do paciente íou seja, células autõlogas) ou de um indivíduo ou indivíduos que sejam ou não compatíveis (ou .seja, alogênicas) com o paciente. Tipicamente, células autólogas são injetadas de volta no paciente do qual as células-· fonte foram obtidas, Q local da injeção pode ser subeutâneo, intraperitoneal, mtramuseular, mtradexmxco, xntravenoso ou xntralxnfòxde. As células podem ser administradas a um paciente que jã sofre de uma doença ou condição ou que esteja predisposto a uma doença ou condição em número suficiente para tratar ou evitar ou aliviar os sintomas da doença ou condição. C número de céxuxas injetadas no paexente que necessita do tratamento ou profilaxia pode variar, dependendo, entre outros, do antígeno ou antígenos e do tamanho do indivíduo. Esse número pode variar, por exemplo, entre cerca, de 10' s lC^iA. e normalmente entre cerca de 10' e 10’ células (por exempla, na forma de sangue,. PMBC ou células; dend.rítioas ou 1 ’i í ÓC ΐ V OS ^:X^: i a i.) <·. ΡΟίΙτ^ϊΤϊ 5JRT £β 1 v 3.Ϊ St'.

únicas ou múltiplas (2, 3, 4 ou 5, das células com números de células a padrão sendo selecionadas pelo medico responsável pelo tratamento. As células devem ser administradas em um veículo farmaceuticaments aceitável, que seja atcxíco para as células e para o indivíduo. Esse veículo node ser o meio de crescimento no oual as células cresceram, ou qualquer meio de tampenamento adequado como,, por exemplo., solução salina tamponada com fosfato. As células podem ser administradas isoladamente ou como uma terapia auxiliar em conjunto com outras substâncias terapêuticas conhecidas na técnica para o tratamento ou prevenção de respostas imunes indesejadas, por exemplo, sem 1 i m 1.1 ação < gl icccor t i cóides, me t o t rexat .o, D ~ pen i c í .1 am i na, hidroxicioroquinasais de ouro, sulfasalazine, inibidores de TNF-alfa ou interleucina-l, e/ou outras formas de imunoterapia específica..

5. Terapia e profilaxia

Os polipeptídeos e peptídeos Gag descritos nas Seções

3.1, e as construções de ácido nucléico que expressam Gag descritas na Seção .3.2, bem. como as partículas de Gag descritas na Seção 3.3 e as células apresentadoras de antígeno Gag-específicas descritas na Seção 3.4 e os linfócitos sensibilizados per Gag descritos na Seção 4 (e.stimuladores imunes ou estimuladores imunes de Gag”), podem ser usados isoladamente ou juntos com ingredientes ativos para o tratamento ou profilaxia de infecções lentiviraís, incluindo o tratamento de doenças ou condições associadas ao Xentivírus como, por exemplo, sem limitação, doenças de imunodeficiência adquirida. Esses estimuXadores imunes podem ser administrados a um paciente isoladamente, cu em composições nas quais são misturados oom um veículo e/ou diluents adequado farmaceuticamente aceitável, ou um adjuvants.

Portanto, a invenção engloba métodos para o tratamento ou a prevenção de uma infecção por Xentivírus, que necessita dessa tratamento de uma quantidade eficaz de pelo menos ura estiraulador imune de Gag, como descrito de forma ampla acima. Em algumas modalidades, os métodos consistem basicamente na administração a um indivíduo que possui uma 5 infecção por lentívírus, ou em risco de ter uma infecção per lentívírus, de um estímulador Imune de Gag em uma quantidade eficaz para aumentar o numero de células apresentadoras de antígeno Gag-específicas ou de seus precursores para, dessa forma, tratar ou evitar a infecção 10 gor lentivírus.

Consequentemente, os métodos: da presente invenção são adequados ao tratamento de indivíduos que possuem uma infecção lent!viral; que estejam em risco de contrair uma infecção lentiviral;' e que foram tratados para uma infecção 15 lentiviral, mas true apresentaram rec.id.iva. Esses indivíduos incluem, sem limitação, indivíduos cora sistemas iraunológicos saudáveis, intactos, mas que estão era risco para se tornarem infectados pelo HxV (indivíduos em risco*). Indivíduos em risco incluem, sem limitação, indivíduos que têm uma probabilidade maior do que a população geral de se tornarem infectados pelo Hiv,

Indivíduos era risco para se tornarem infectados pelo üiv incluem, sem limitação, indivíduos em risco para infecção pelo H.IV em função da atividade sexual com indivíduos 2 5 infectados nelo HIV; usuários: ds: fármacos intravsnosos;

indivíduos: que podem ter sido expostos a sangue infectado pelo MIV, produtos sanguíneos, ou a outros fluidos corporais contaminados pelo HXV,- e bebes que estão sendo amamentadas por mães: infectadas pelo Hiv. Indivíduos adequados ao tratamento incluam indivíduos infectados: cora, ou em risco de se tornarem infectados com, HIV-1 e/ou HIV-2 e/ou HIV-3, ou qualquer variante destes. Indivíduos adequados ao tratamento com os métodos da invenção também incluem indivíduos que possuem uma infecção lenti. viral refrataria ac tratamento com outras terapias antivirals.

Em modalidades específicas, os métodos são usados para tratar ou evitar uma doença associada ao lentlvírus {por exemplo, uma doença de imunodeficiência adquirida como, por exemplo, AIDS) e, dessa forma., a presente invenção também se estende aos métodos de tratamento ou prevenção de uma doença» associada ao lentivírus em um indivíduo, em que os métodos geralmente envolvem a administração ao indivíduo de um estimulador imune de Gag, como descrito de forma ampla acima, em uma quantisàds que e éticas para tratar ou evitar a doença.

^;Jm estimulador imune de Gag é administrado a um indivíduo com o uso de qualquer método disponível e via adequada à liberação de fãrmacos, incluindo métodos i.u vivo e ex vivo, oem como viss de .admznistraçao sistêmicas e localizadas. Técnicas para formulação e administração podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton., Pa., última edição, vias adequadas podem incluir, por exemplo, administração via enteral foot exemplo. oral ou retal; . ti'ansmucosa ou intestinal; liberação parenteral, incluindo injeções intramusculares, subcutãneas> íntramedulares, bem como injeção int ratecal, i ntravent r icu1ar diret a, intravenosa, intraperi tonexl, intranasal ou ixrtra-ccular. Para injeção, que constitui. uma modalidade desejável da presente invenção, os estimuladores imunes da presente invenção podem ser formulados em soluções agucsas, tipicamente em tampões f isiologioamente compatíveis como, por exemplo, solução de Hanks, solução de Ringer ou. tampão de soro fisiológico, Para administração transnucosa, são usados 5 penetrantes apropriadas à barreira a ser permeada na formulação, Esses penetrantes sãa geralmente conhecidos na técnica. A injeção intramuscular e subcutãnea é adequada, por exemplo, para administração de composições imunogênicas, vacinas e vacinas de DNA. Em cartas modalidades da presente, invenção, os estimuladores imunes são administrados por via intravenosa.

Q<s estimuladores imunes de Gag pedem ser formuladas facilmente com o uso de veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas 15 à administração oral. Esses veículos permitem que os compostos da invenção sejam formuladas em formas de dosagem como, pior exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, caldos, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. Esses 20 veículos podam ser selecionados de açucares, amidos, celulose e seus derivados, malte, gelatina, talco, sulfato de cálcio, óleos vegetais, olees sintéticas, pclidis, ácido algínxco, soluções tampouadas com fosfato, emulsifinances, solução salina isatônlaa e ãgua sem pirogênio.

As formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosss dos campostos ativos em forma hidrossolüvel. Adieicoalmente< suspensões das compostas ativos podem ser preparadas como suspensões oleosas de injeção apropriadas. Solventes ou veiculas 30 lipofílicos adequadas incluem óleos graxas como, par

92/139 exemplo, oleo de gergelim, ou ésteres sintéticos de ãcido g r axo, por e x e mp I o, o 1 e a t o d e e t .1.1 a o u t r i g li. c e r 1 d e o s, o u 1 ipcssomos. Suspensões aquosas de in jeção pedem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, por exemplo, carboximetil celulose sódica, sorbitol ou dextrana. Opcíonalmente, a suspensão também pode conter estabilisentes adequados ou agentes que aumentem a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas,

As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas: cor combi nação dos; compostos ativos com um excipiente sólido, opcíonalmente trituração de mistura resultante, e processamento da mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para se obter comprimidos ou núcleos de drãgess. Excipientes adequados são, em particular,. enchimentos como, por exemplo, açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose como, por exemplo, amido da milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma txagaoanto, metil celulose. hidroxipropilmetil celulose, carboximetilcelulose sódica e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser aoicIonaaos agentes ce oesxntegraçao como, por exempxo, a polivinil pirrolidona entrecrutada, ágar ou ácido algínico ou um sal deste como, per exemplo, alglnato de sódio. Essas composições podem ser preparadas por qualquer um dos métodos de farmácia, mas todos os métodos incluem a etapa da associar um ou mais agentes terapêuticos, como descritos acima, com o veículo que constitui um ou mais ingredientes necessaries. Em geral, as composições farmacêuticas da presents invenção podem ser fabricadas de uns? forma conhecida, por exempla, por meio de processos conveneionais de mistura, dissolução, granulaçao, produção de drágeas, η r V:i.ç^çdG.., em^lsrf —- o a çã o, encap&uxaçao, cam usa oü r J·. lü.f .1.1 X.2dÇdbü.’«

Núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos adequados. Para esse finalidade, podam ser usadas .soluções concentradas fie açúcar, qua podem opcionalmente conter goma arábica, talco, poli, vinil pirrolidona, gel de carbopol, 10 oolietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de 1 a c a, a s o 1 v e n.t e s o r g â n i o o s o u m i s t u x a s s o 1 ve n t e s adequadas. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revest: i men tos de drágeas para identificação ou para caracterização de diferentes combinações de doses 15 dc composco ativo.

Substâncias farmacêuticas que podem ser usadas oralment.e incluem cápsulas push-f.it feitas de gelatina, bem como cápsulas macias, lacradas, feitas de gelatina e um plastifleante como, por exemplo, glicerol ou sorbitol. As 20 cápsulas push-fit podem conter os ingredientes ativos misturados com. enchimento como, por exemplo, lactose, 11gantes corno, por exemp1o, am idos, e/ou 1úbr1ficantes como, por exemplo, talco ou estearato de magnés.io s, one lona Imente, estabilizar,tes. Sm cápsulas macias,. os compostos ativas podem estar dissolvidas ou suspensas em líquidos adequados coma, por exemplo, óleos graxes, parafina líquida ou poliet.ilano glicóis líquidos. Além disso, podem ser aoíuionadas esrabí.ilsantes..

As formas de dosagem dos estimuladores imunes de Gag 30 da invenção também oodem incluir a injeção ou implantação de d . st οε 1ti vos de 1i t ex ação cor'd; r cl ada pro ) e t Aldos esppcJ v'afssntf· para assa finalidade ou outras formas de implantes modificados para atuarem adicionalmente dessa forma. A liberação controlada de um agente da invenção pode 5 ser efetuada por seu revestimento, por exemplo, com polímeros hidxofdbicos incluindo resinas acr*ílicaa, ceras, álcoois alifâtiCGS superiores, ácido polilâtioc- e poliglicõlico< e certos derivados de celulose como, por exemp 1 o, hi d roxi prop! 1 me t i 1 ce 1 u.l. ose , Al ém di s so, a liberação controlada pode ser efetuada pela utilização de ostras matrizes de polímeiO, lipossomos e/ou microesferas.

Os estimuladores imunes de Gag da invenção (por exemplo.. polipsptídeos e peptídeos Gag) podem ser fornecidos como sais com contra-íons farmaceuticamente 15 compatíveis. Sais farmaceuticamente compatíveis podem ser formados com muitos ácidos, incluindo, sem limitação, ácido clorídrico, sulfúrico, acêtico, lãtico, tartárico, málico, succínico etc. Qs sais tendem a ser mais solúveis em solventes açuosos ou em outros solventes protonicos que são 20 as formas de base livre correspondentes.

Al terna t ivamente, pode - se admini strar um. est imulador imune de Gag de uma forma, local em vez de sistêmica., por exemplo, por main de injeção do composto diretamente em um tecido, freqüentemente em uma formulação de depósito ou de 23 liberação sustentada. Além disso, pode-se administrar o estimulador imune em um sistema de liberação direcionada de fãrmaccs. por exemplo., em um lipossomo revestido com anticorpo tecido-especffico, como descrito, por exemplo., na Seção 3.3. Os lipossomos serão direcionados e recolhidos 3 0 se 1 et ivamente pelo t. ec 1 do.

Composições farmacêuticas adequadas ao uso na presente invenção incluam composições nas quais os ingredientes ativos estão contidos em uma quant idade eficaz para se obter seu objetivo desejado. A dosa de. agente administrada 5 a um paciente deve ser suficiente para efetuar uma resposta benéfica no paciente ao longo do tempo como, por exemplo, u ma r e du ç ã ο η o s s in t orna s assoei ad o s à c ond.í ç ãc ♦ A quantidade do estimulador imune (ou dos es ti aval adores imunes) a ser administrada pode depender do indivíduo a ser 10 tratado, inclusive da idade, do sexo, do peso e da condição da saude gerai deste. A. esse respeito., quantidades precisas do estimulador imune (ou dos estimuladores imunes) para administração dependerão das avaliação do prof issional responsável. Ea determinação da quantidade eficaz do 15 estimulador irnune a ser administrada no tratamento ou profilax.ia. da condição, o médico pode avaliar os níveis teciduais de um antígeno-alvo, e a progressão da doença ou condição. Em qualquer caso., aqueles habilitados na técnica podem determinar facilmente dosagens adequadas des 20 estimaladores imunes da invenção.

Para qualquer composto usado no método da invenção, a dose eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células ou modelos animais. A toxicidade e a eficácia terapêutica dos estimuladores 25 imunes da invenção podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padronizados em culturas de células ou em animais experimentais, por exemplo, para determinação da ía dose letal çnra 50¾ da população) e cia EIA;; (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A proporção 30 de dose entre cs efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice / 1 t erapeut. icc, e ela pode ser expressa como a proporção LD^/ED^. Compostos que exibem índices terapêuticos grandes são preteridos. Os dados obtidos nesses ensaios de cultura de células e estudos animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagens para uso em seres humanes. A dosagem dessas compostos se situa preferiveImente dentro de ursa faixa de concentrações circulantes que incluem a ΕΓχ^ com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa, dependendo da forma, de dosagem empregada e da via de administração utilizada, A forrou.! ação, a via de administração e a dosagem exatas podem ser escolhidas pelo médico responsável à luz da condição do paciente (veja, por exemplo, ‘Fingí e cais., 1975, em The Pharmacological Basis of Therapeutics, Capítulo 1, página

A quant idade e c- intervalo da dosagem podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis plasmáticos do{s) composto(s) ativo(s) que sejam suficientes para manter efeitos de redução de Gag- ou efeitos true atenuam a infecção por lentivírus ou doença ou condição associada. Dosagens normais para c- paciente para, administração sistêmica variam de 1-2.000 mq/dia, comumente de 1-250 mg/dia, e tipicamente de 10-150 mg/dia, Definidas em termos de peso corporal do paciente, dosagens normais variam de 0,02-25 mg/kg/dia, comumente de 0,02-3 rag/kg/dia, tipicamente de 0,2-1,5 mg/kg/dia. Definidas em termos de areas de superfície corporal do paciente, dosagens normais variam de. 0,5-1.200 mg/m''/dia, comumente d.e 0,5-150 mg/mh/dia, tipicamente de 5-100 mg/m/dia,

Era alaumas modalidades, é administrada uma dose única de um eiícimuladox· imune de Gag. Em outras modalidades, são administradas múltiplas doses de um estimulados imune.

Quando são administradas múltiplas dose» ao longo de um período de tempo, um estimulador imune é administrado duas 5 vezes ao dia íqid) , diariamente (qd) , em dias alternados íqod) , a cada três dias, crês vezes ροχ· semana itiw) ou duas vezes por semana (biw) ao longo de um; período de tempo. Em exemplos ilustrativos, um escimulador imune e administrado qid, qd, qod, tiw ou biw ao longo cie um 0 período de um dia a cerca de 2 anos) ou mais. Adequa damente, um estimulador imune é administrado em qualquer uma das frequências mencionadas anteriormente por uma semana, duas semanas, um mês, dois meses, seis mesas, nm ano ou doas anos, ou mais, dependendo de vários fatores.

.Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um estimulador imune s aquela que reduz a carga de lentivírus em um indivíduo tratado em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca cie 20%, pelo menus cerca de 302, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de

60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca cue 90%, ou pelo menos cerca dc 95% ou mais, comparada com a carga de lentivizus do indivíduo não t ratado com o esti mu1ador 1mune.

Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um

5 estimulador imu.ua de Gag é aquela que aumenta a contagem cie células T CD4' em um indivíduo em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 4 0%, pelo menu» cerca de 5 9%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca cie .30 8 9%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 190%, pelo menc-s cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 veses, nele menos oures de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou -mais,, comparada com a contagem de células T CD4^: do indivíduo não tratado com o estimaiador imune.

Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um estimeiador imune de Qag é aquela que restaura a contagem de células T CD4^: para dentro- da faixa da normalidade. No sangue humano, o número de células T CD4' que é considerado .0 como dentro da faixa da normalidade a normal e de cerca de 600 a cerca de 1.300 células T CD4\/mm’^: de sangue.

O tratamento ou a prevenção de uma infecção por lentivírus inclui, sem limitação, a redução da probabilidade de infecção por lentivírus, redução da .5 disseminação do lentivírus a partir de uma célula infectada a uma célula suscetível, a redução da carga, viral em um indivíduo infectado por lentivírus, a redução de uma quantidade de polipeptídec(s) codificado pelo vírus em um indivíduo infectado por lentivírus e o aumento da contagem ’O de células T CD4^! em um indivíduo infectado por lent!vírus.

Qualquer um entre diversos métodos pode ser usado para determinar se um método de tratamento/profilático é eficaz. Por exemplo, métodos para determinar se os métodos da. invenção são eficazes na redução da carga de lentivírus, >5 e/ou de tratamento de uma infecção por lent ivírus, são qualquer teste para indícios de infecção por lentivírus, incluindo, sem limitação, a medida da carga viral, por exemplo, por medida de quant.id.ade de lent, ivírus em uma amostra biológica, por exemplo, com o uso de uma reação em 30 cadeia de polimeraae (PCR) com iniciadores específicos para > 99/139 uma sequência de polinuoleotídeos de lentivírus; detecção e/ou medida de um polipeptídeo codificado por lexrti vírus, por exemplo, p24, gp!20, transcriptase reversa, usando, por exemplo, um ensaio imunológico corto, por exemplo, um ensaio S imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) com um anticorpo específico para o polipeptídeo; e medida da contagem das células T CDá.supd no indivíduo. Métodos de teste de uma infecção por lentivírus (ou quaisquer indícios associados a uma infecção por lent!vírus) são conhecidos na técnica, e 10 foram descritos em diversas publicações como, por exemplo, HIV Protocols (Methods in Molecular Medicine'··', 17) K.L. Michael e J.H. Kim, eds . (199.9) Humana Press.

A. partir do que foi apresentado anteriormente, será observado que os agentes da invenção podem ser usados como 15 composições imunomoduladoras terapêuticas ou profilátieas ou vacinas. Consequentemente, a invenção se estende à produção de composições imuncmoduladoras -que contêm como compostos ativos um ou mais dos estimuladoras Imunes de Gagás invenção> Qualquer procedimento adequado é contemplado 2C> para a produção dessas vacinas. Procedimentos exemplares .incluem, por exemplo, aqueles descritos em '-.New Generation Vaccines (1997, Levine e cols., Marcel Dekker, Inc. Nova York, Basel Hong Kong).

Composições imunomoduladoras de acordo com a presente invenção podem conter um diluents ou excipiente fisiologicamexite aceitável cerno, per exemplo, agua, solução salina tamponada com fosfato e solução salina. Elas também podem incluir um adjuvant®, como é ?oem conhecido na técnica. Adjuvant®» adequados incluem, sem limitação:

substâncias tenscat ivas como, por exemplo, hexadecilamina,

3.00/339 o c t a d e c i 1 a m i n a, é s t e r e s de oc t a de c .1 1 a m 1. no a c 1 do, isoleci t ina, brometo de dimet 11 di oc Ladeei lamôn io, N .· N·· dicoctadecil-Ν' , N' - bis (2-hidroxietil-propanodiamina) .< metoxihexadecilglioerol e poliois pluronicos; pellaminas como, por exemplo, pirano, sulfato de dextrana, poli 1C carbopol; peptídeos como, por exemplo, muramil dípeptídeo e derivados, dimetilglicina, tuftsina; emulsões oleosas; e géis minerais como, por exemplo, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio ou alums; linfooinas, QuilA e complexas de estimulação imune íISCOMS;.

As céiulâs apresencanaras oe antígeno Gag-especiticss da invenção ou seus precursores e linfócitos sensibilizados por Gag T gerados com as células apresentadoras de antígeno Gag-específicas, como descrito supra, podem ser usados como estimuladores imunes em composições imunomoduladoras para apl reações proriiaticas ou terapêuticas, Ett axgumas modalidades, as células apresentadoras de antígeno antígeno-específioas da invenção sâa úteis para a geração de grandes números de CTL CDS* ou CD4para transferência adotiva a indivíduos imunossuprimidos que. são incapazes de montar respostas imunes normais. Por exemplo, CTLs CDS sensibilizadas por (lag podem ser transferidas de forma adotiva para fins terapêuticos em indivíduos que sofrem de ums infecção lentiviral (Koup e cola., 1991, Jt xxp. Med,,

7. Terapias combinadas tm estimulador imune de Gag pode ser administrado a um indivíduo em combinação (par exemplo, na mesma formulação

101/1» ou era formalações separadas) com pelo menos um segundo agente terapêutico (terapia combinada} . O estimuladox’ imune pode ser administrado misturado com um segundo agente terapêutico ou pode ser administrado era uma formulação separada. Quando administrado em formulações separadas, um estimulador imune de Gag e um segando agente terapêutico podem ser administrados substancialmente de forma simultânea (por exemplo, dexxt.ro de até SO minutos, cerca de 50 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 5 minutos ou cerca de 1 minuta um da outro) ou separados no tempo por cerca as 1 nora, cerca gs 2 horas, oerca qs 4 noras, cerca de 6 horas, cerca de 10 horas, cerca de 12 horas, cerca de 24 noras, cerca de 36 horas ca: cerca de .’z noras, ou raars. Quantidades eficazes? de um agente terapêutico são como d a s c r i t a s a.c .ima .

Os agentes terapêuticos que podara ser administrados em terapia combinada, tais como tãrmacos axxtnrit lamatoi'ios, ant ivirai s, antifangicos, antiraicobaoteríanos, antibiõticos, «mefoioidas, trioomonocidas, analgésicos, an t i xxeop lási cos, arrt i - hiper tens ivos , ant irai crob ia.nus e / ou esterõides, para o tratamento de infecções virais, Era algumas modalidades, pacientes com uma infecção viral ou bacteríana são tratados com uma comb inação de um ou mais estimuladores ixtrunes de Gag com um ou mais dos seguintes-, antibióticos de beta - lactam, tetraciclinas, olcranfenicol, neomicina, gramicidins , bacitraoina, sulfonamidas, nitxofurazona, ácido nalidíxico, cortisone, hidrocortisona, bet ame t as ona ,· dexame t asou a, f luocor tol on a, pr edni sol ona, t r i amcinolona, indome t a c ina, sul.?. ndac, ao .·. c lov i r., amantadine, rimantadine, CD4 solúvel recombinante (rsCD4· , anticorpos anti-receptor {por exemplo, para rinovírus;, nevirapine, cidofovir ÍVistide⁵') , fosfcnoformato trissódico {Foscamet^!Κί) , famciclovir , penciclcvir, 5 valaciclovir, inibidores de ácido nucléico/replicaçâo, interferon, zidovudina (AZT, Retrovir”) , zidcvudina/1 amivudina ( Combi vir) , didancsina {didesoxiinosina, ddl, Videx”) , estavudina \tl4T, 2exit^!í*) , zalcitabina (didesoxicitosina, ddC, Hivid^txj , nevirapine vv’i£g&mune . .A-amiv.uai-n^... AagiiOvL ^: . .rn-^-a+ídoi.e^.. ,,de.

protease, saquinavir (Xnvirase™, FcrtovaseTM), ritonavir (Norvir”), nelfinavir (Viracept^*) , efavirenz {Sustiva¹*} , abacavir ízlagenTM), amprenavir {AgeneraseTM} indinavir (Crixivan⁷*) , ganciclovir, AzDU, delavirdina (Rescriptor⁴*} , 15 lopinavir/ritonavir (Kaletra), trizivir, rifampina, olacirorBicina, eritropoietina, fatores estimulantes de colônias: (G-CSF e GM-CSF} , inir-idores não nucleosídicos da transcriptase reversa, inibidores núcleosIdioos, adriamicina, fluoruracil, metotrexato, asparaginase e combinações destes. Agentes anti-HIV são aqueles na lista precedente que visum especificamente uma função de uma ou mais proteínas do HIV.

Em algumas modalidades, um estimuladcr imune de Gag é administrado em terapia combinada com dois cu mais agentes

5 anti-HIV. Por exemplo, um agente em questão pode ser administrado em terapia combinada com um, dois ou três inibidores núcleosídices da transcriptase reversa (per exemplo, Combivir, Epivir, Hivid, Retrovir, Videx, £erit, Ziagen etc.), Um estimulador imune da invenção pode ser 30 administrado eni terapia combinada com um ou dois inibidores não nucleosíôicos da transcriptase reversa (por exempla, Resariptor, Sustiva, Viramune etc.)< Um estimulador imune de Gag pede ser administrado em terapia combinada cara um ou deis inibidores de orar, ease (par exemplo, Aaenerase, Crxxivan, Fartovase, Xnvxrase, Kaletra, Narvir, Vxraaept etc,). Ura estimulador imune de Gag pode ser administrado sra terapia combinada com um inibidor de protease e um inibidor nucleosidico da transcriptase reversa, Um estímulador imune de Gag pode ser administrado em terapia combinada com ura ini.bido.r de protease, um inibidor nualeosídico da transcriptase reversa e ura inibidor não nuoleosídiao da transcriptase reversa. Um estrmulaoor imune ae Gag pode ser administrado em terapia combinada cam um inibidor de prateass e um inibidor não nucleosídioo da transcriptase reversa. Outras combinações de certo inibidor oura um ou mais de ura inibidor·· de protease, um inibidor nucleosídloo da transcriptase reversa e um inibidor não nucleosídico da transcriptase reversa são contempladas.

8. Métodos para avaliar a imunomadulaçao

A er.xcãcia ae uma imunização poda ser avariaua com o usa de qualquer técnica adequada, Λ capacidade de ura indivíduo para responder ao Gag poda ser determinada avaliando-se se aquelas células sensibilizadas que respondem ao Gag estas aumentadas em número, atividade e habilidade para detectar e destruir aquele antígeno ou células que apresentam aquele antígeno, A potência da resposta imune é medida por testes padronizados, que incluem; medida direta de linfócítos do sangue periférico por meios conhecidos na técnica; ensaias de citotaxicidade de oeiulas natural. xi.ij.6r (veia, uor exempla, íravmc.ralj

104/139

M, e cols. (1992, Immunol. Mach. 158: 19-34}, snsaios de proliferação celular (veja, por exemplo, Vollenweider, I. e Groseurth, P.J, ( 1993, ,7. Immunol. Meth. 149: 133--135} , imunoensaios de células imunes e subconjunion (veja, por exemp 1 o, Loe f f 1 e r, D. A., e col s. (1992, Cyt cm. 13: 169174}; Plvol tini, u._f e cols. (1992, Can. Immunol.

Immunorner. 34: 241-251; ; ou testes cutâneos para? imunidade mediada por células (veja, por exemplo, Chang, A.E. a cola. (1993, Cancer «es. 83; 1.043-1.050). Al ternat.ivamente, a eficácia da imunização pode ser monitorada com a utilização de uma ou mais técnicas, que incluem, sem limitação, coloração de tetrâmero de HLA da classe I - de PBMCs tanto frescas quanto estimuladas (veja, por exemplo, All.cn e cols., 2000, j, Immunol. 164(5}: 4.968-4.978), ensaios de proliferação (Allen e cols., supra; , ensaios ELISPG-T e coloração de citocina intracelular (Allen e cola., supra), ensaias ELISA - para respostas lineares de células B; e (Vestem blots de amostra de células que expressam as polinucleotIdeas sintéticos. Particularmente relevante serâ o perfil de citocina de células T ativadas por antigeno e, mais particularments, a produção e secreção de ΙΕΝ-γ, IL-2, Π..-4, ΙΪ..-5, IL-10, TGF-0 e INF-&.

.A atividade citotóxica de linfócitas T e, em particular, a habilidade de linfócitas T oltatôxicas para 25 serem induzidas ροζ células apresentadoras de antígeno, pode ser avaliada por qualquer técnica adequada conhecida por aqueles habilitados na técnica. ear exempla, uma amastra que compreende linfósitos T a serem testados quanta à atividade citotéxica é obtida, e as linfacitos T são 30 então expostos a células apresentadoras de antígeno

105/139 sensibilizadas por antígeno, que passaram a apresentar o antígeno. Após nm período de tempo apropriado, que pode ser determinado por avaliação da atividade citctóxica de uma população de linfócitos T de controle que sabidamente são capazes de serem induzidos para se tornarem células citotóxicas, os linfócitos T a serem avaliados são testados quanto à atividade citotóxica em um ensaio citotóxíco padroni zado.

O método de avaliação da atividade de CTL é psrticularmente útil na avaliação de capacidade de um indivíduo para gerar uma resposta citotóxica contra células que expressam antígenos tumorais ou vitais. Consequentemente, esse método é útil para avaliação da habilidade de um indivíduo para montar uma. resposta imune a. um câncer ou vírus. Por exemplo, podem ser empregados ensaios de Use de CTL com o uso de esplendeitos estimulados ou células mononucleares do sangue periférico (PBMC; em células revestidas com peptídeo ou infectadas com vírus recombinante com o uso de oélulas-alvo marcadas com ^:'^:C.r. Esses ensaios podem ser realizados usando, por exemplo, células de primates, camundcngo ou humanas (Allan e cols., supra). Além disso, a atividade de. CTL também pode ser medida em primates endogâmlcos com o uso de un» método de detecção ín vivo, que envolve a marcação de células autólogas {por exemplo, PMF3C) com um marcador opticamente detectãvel (por exemplo, um marcador ou corante fluorescente, quimíoluminsseente ou fosfcrescente ou visual) e o contato dessas células com um ou 'mais peptídeos Gag, como aqui revelados. Eles são escolhidos de forma que correspondam a um antígeno que é o alvo de uma resposta de

ΟΤΙ, sod costs esn um iniiivisuo, As células autólogas ssc infundidas no indivíduo e os línfócifcos do indivíduo são coletados após um período adequado para dar um tempo suficiente para que o sistema imunológico do indivíduo responda ãs células autoíogas (por exemplo, 10 minutos a 24 horas pós-infusão). Os linfócitos coletados são então analisados para identificar o numero ou a proporção de lin.fócitcs que contem ou de algum outro modo carregam o marcador optimamente detestável, o que representa uma 10 medida da resposta de CTL in vdvo ac antigene no indivíduo.

A fim de que a invenção possa ser facilmente compreendida e colocada em um efeito pratico, serão agora aescrxtas modalxdades prefex’xoas especxfxoas por' mero oos seguintes exemplos não limitastes.

EXPERIMENTAL

CONTROLE DR VIREMXA APÔS IMUNOTERAPIA DE MACACOS INFECTADOS

POR SXV COM SANGUE PULSADO COM PEPTÍDEO

A xmunoterapia com OPAL- foi estudada em macacos r abode-porco infectadas por SIV que recebem ART. Os macacos 20 rabo-de-poxca possuem uma evolução pelo menos equivalentemente patogênica de infecção por SIV em relação à dos modelos alternativos em macaco rhesus ”^:5·^ν. Trinta e seis macacos foram infectados com SIV^c·^ θ 3 semanas mais tarde o tratamento com os antirxetrovirais tenofovír e 25 emtricitabxna por 7 semanas foi iniciado. Os animais foram alocados aleatoriamente a 3 grupos estratificados par carga vrxal Uí.z &Χ. v pxasmat íca -ae umu ναι, , í^svA-òc· d.e ^.ane—α^χό (um gene de MKC da classe Ϊ que aumenta a VL em macacos rabo-de-porco infectados por SIV ''J , peso e sexo. Os 30 macacos furam imunizados 4 vasas seb um.a -cobertura de terapia antirretroviral Í4‘> V, 8 ^s,· 10^a semanas; com PBMCs autólogas frescas misturadas por 1 hora ex vivo com 10 ug/ml/peptídeo de 125 peptídeos superpostos de ISmer de Gag de SIV apenas (QPAL-Gagj > 823 peptídeos de SIV de ismer que transpõem todas as 9 proteínas do SÍV {OPAL-All; ou não imunizados. Qs macacos foram acompanhados por 28 semanas após interrupção da ART na 10* semana.

Todos os 36 macacas se tornaram infectadas após exposição ao RIV_!:„_sr..₅.:j₅. e tiveram uma VL de pico média de 7,1 log_:.,_:. cópias/ml.. Antes dês vacinação, 4 animais morreram durante infecção aguda por SIV com diarréia, desidratação, letargia, anorexia e perda de peso. As vacinações foram team toleradas, sem diferenças nos pesos médios, parâmetros de hematologia, ou observações clínicas em animais imunizados com OírAL camparados coas eontrores .<

Houve uma acentuaaa imunogemciaade de ceruias T CD4 e CL‘8 &1 v espec ü r ca apòs a posologia oe vacmaçao nos animais imunizados com OPAL. Respostas médias de células T CD4 e CD8 Gagespecíficas 2 semanas tipos a imunização final foram de 3,8% e 1,9¾ ue codas as células T CD4 e CDS , λ. \...S.p S v/ L· ά. V.íxÃ-X’U’X.’.O, UU . . X>^.á9’Px^S .> ittíla. v, células T CD4 e CDS Gag específicas 2 semanas após a imunização final foram de 0,84% e 0,37% no grupo de OPALAll e de 0,15% e 0,29% em controles (Figura la, b; . As células T Gag-específicas nos animais imunizado;·; com QPALAll, mas não nas animais de controle ou nos imunizados apenas com GPAL-Gag, tamteém tiveram respostas de células T elevadas a todas as outras proteínas do SIV. As respostas médias de C'D4/CD8 Env, Pol e proteína reguladora combinada respect ivament e. no grupo de OPAL-Al.I, comparadas com <0,4% para tcdas as respostas de CD4/8 aos antigenos nao-Gag era grupos de controle e OPAL-Gag (Figure 1c, d e Figure 3), Respostas de células T CDS’ mars tortes às proteínas nãcGag estavam relacionadas às respostas de células T CDB'' reduzidas ao Gag (Figura le), Dessa forma, embora um número maior de proteínas? do SIV fosse reconhecido nos animais imunizados com OPAL-All, as respostas de Gag eram reduzidas em comparação â imunização somente com peptídeos Gag. Embora todos os animais tenham se soro-convert, idos and» infecção por SIV, não ocorreu nenhum aumento significativo de respostas de anticorpos com ss vacinações com OPAL.

O período de 7 semanas de ART controlou VL até abaixo de 3,1 logio eópias/ml em 25 dos 3z animais restantes por volta da 1C* semana. Os 6 animais que não controlaram a viremia com ART tiveram VLs de pico maiores na 2^S semana (média * DP de ’7,74 ± 0,33, comparado cora 5,94 ± 0,52 para animais que controlaram a viremia com ART,, p < 0,001) e VL maior após retirada da ART (5,98 ± 0,53 vs 4,28 ± 0,90, p < 0,001). Q controle da VL provavelmente e importante na obtenção de resultados ótimos da imunoterapia de macacos infectados As análises finais primárias pré-definidas (por protocolo) da VL foram realizadas em animais que controlaram a viremia com ART (28 animais), embora os inventores também tenham analisado todos os 32 animais restantes por ajuste do controle da VL com ART.

A comparação final primária da VL entre os grupos de tratamento combinado com OPAL-All. e ORAL-Gag nas 10 semanas depois da retirada da ART foi 0,5 log;.,; cópias/ml mais baixa do cue cs controles (p ~ 0,054, Pioura 2, Tabela 7).

109/139

Cada grupo de vacinação (OPAL-A11 e OPAL~Gag) teve reduções muito similares na vl. a análise de todos os animais ajustada para controle da Vl.· com ART e estado de Mane-A^lí? demonstrou uma redução signifleante na VL em animais imunizados com OPAL, comparados com controles (Tabela 7) . Por volta de 6 meses apôs retirada da ART, a diferença média na VL entre grupos de controle e imunizados com OPAL foi de 0,93 log-, cópias/ml em 6 meses (p -= 0,02, Tabela '*> \ :

Para confirmar^- os tachados virolõgicos usando um ensaio da VL sensível independente, plasma congelado (1 ml} de 32* semana de estudo foi enviado ao National Cancer Institute (NCI) em Maryland, ESA. Dre M. .Piatak e J, Lifson gentilmente analisaram as amostras quanto ao RNA do SIV de forma cega usando am ensaio com um limite de quantificação de 1,5 logcópias/ml. Os ensaios da University of Melbourne e do NCI estavam intimamente correlacionados (r:::0_#97, p<0,901) e mostraram uma redução média quase idêntica na viremia nos vacinados comparados com controles nesse 'momento (0,82 vs 0,88 log·;;? cópias/ml, respect ivamente .;· ,

Para avaliar ainda mais a durabilidade do controle de SIV e da prevenção de doença com imunoterapia com OPAL, administramos um reforço em todos cs 32 animais nos mesmos grupas random!nados 3 vezes oom o procedimento idêntico (na 26‘, 3'9*, 42'* semanas) sem cobertura de ART e acompanhamos gs animais por mais 6 meses. A imunidade de células T STV~ específica estava aumentada noa animais imunizados similarmente em relação à vacinação primária (Figura 1). O controle viral foi mantido por todo o período de acompanhamento de pouco mais de 1 ano sem ART (Figura 2,

Tabela 7j

Doze dos 32 animais restantes desenvolveram AIDS incipiente e foram submetidos à eutanásia durante o 5 acompanhamento prolongado, incluindo todos os 6 animais que não controlaram a viremia com ART. Dos 6 animais sacrificados que não controlaram a viremia com ART, 5 estavam no grupo de controle s um no grupo de OíLAL-Gag (Figura 2; . A imunoterapia com OPAL resultou em um 10 benefício na sob.revi.da, analisando os 26 animais que controlaram a. viremia com ART íp - 0,053) ou todos os 32 animais, ajustado para estado de Afane-A*26 e controle da viremia, com ART (p ~ 0,02, Tabela ?) .

Co inventores; também compara r am as VL e. os níveis 15 perifeéricos de CD4 nos respcnsivos com OTL ao Env e Gag.

Foram feitas análises primárias nos animais dentro dos grupos de vacina para avaliar o efeito do ausento de células T Env- ou Gag-específicas por imunização terapêutica. Os animais Mane-A*10-positivos foram excluídos, considerando que todos esses animais montam respostas de CTLs Gag-específicas benéficas ao epitopo KP9.

Na verdade, os controles Mane-A *1-5-positivos nesse experimento tiveram uma VL média ao longo das 12 ^a-64⁴¹semanas pôs-infecção de 4,06 ± 0,42 log,.s cópias/ml, comparado com. 5,49 ± 0,35 log_iSS c6pías/ml para controles

Mane-A*lv~negativos (P ~ 0,024, analise da área sob a curva, com ponderação temporal».

Os responsivos com CTL apenas para Env mantiveram unia

VL média significatívamente maior entre as 12^-64⁴ semanas 30 nos-.infecção do que os animais com respostas cie céiuias T

CDS ’ apenas para Gag? excluindo os animais Mane-A*10posinvos {5.,05 t 0.,58 1οα·_::5 cópias/ml vs 3,65 ± 0.24 log;?; cõpias/ml, respectivamente, P == 0.089, Figura 4) . Houve uma diferença entre a VL média dos 6 responsivos apenas ao Env entre as 12⁴-64⁴¹ semanas pós-infecção e os ? animais de controle, ?4ane-A*20 negativos, não vacinados {5,05 e 0,88 logxí cópias/ml e 5,49 ± 0,35 log? o cópias ./ml, respectivaraente; Figura 4? .

Para abordar a especulação de que uma resposta ampla, multiproteinas, poder.ia ser benéfica, aqueles animais com respostas de células T CDS' tanto ao Env quanto ao Gag foram então incluídos nessas análise, A VI? para os 3 animais cora respostas tanto Env quanto Gag-específícas tiveram uma média de 5,01 ± 0,56 log_:.-_; cópias/ml entre as 12^-64⁸ semanas pôs·· infecção. Isso foi significativamente maior do qua os responsivos apenas ao Gag iP === 0,089} e não foi melhor do que os xesponsivos apenas ao Env.

Gs animais nesse experimento foram acompanhados por pouco mais de 1 ano cipós a ultima vacinação e. remoção da 20 ART, Isso permitiu uma anali.se oa cepleçao ue ceiuia T Cl?4' periférica e a sobrevida em animais que respondem apenas ao Env ou Gag, naqueles que respondem tanto ao Env quanto ao Gag e nos controles não vacinados. Houve ura amenta náo significativa dos níveis periféricos médios de CD4 nos 3 25 x'esponsivos apenas ao Gag versus os 6 responsivos apenas ao

Env entre as 12^κ-64.* semanas pós··infecção {23.42% t 4,22 e 27,44% i 3,92, resriectivamente, P ~ 0,547 Figura 4) , Os 3 animais que tiveram respostas de células T 3.09' tanto Env quanto Gag-esnecíficas tiveram ura nível periférico 'médio de .3 CD4 não significants, mas menor ac longo do mesmo período de tempo do quo os controles não vacinados íls,53% * 3,2 3 e 21,19% + 3,01, respect ivamente; Figura 4; .

Durante o acompanhamento, urn total de 6' animals vacinados e 6 controles dos 3.2 animais foi submetido a eutanásia com AIDS incipiente, incluindo perda de peso, deoleção de células T CD4' e trombooitopenia. Qs animais que respondem aos epitopos de célula T CD8' apenas ao Env progrediram para a .AIDS mais f requente inen te do que os animais com respostas de CTL ao Gag isoladamente (Figura A1;_í¥:: ^:K S

Em resumo, a imunoterapia com OPAL, com o uso de peptídeos Gag de SIV superpostos ou peptídeos que englobam todo o prot.eoma do SIV, foi altamente imunogênica e resultou em cargas vitais significativamente menores e um beneficio na sobrevída comparado com controles não vacinados. A eficácia virolôgica em macacos imunizados com OPAL foi durável por 12 'meses após término da ART. Qs presentes achados sobre a imunoterapia com OPAL furam observados aoesar da modelo de SI '4_aç^<-rabo de porco virulento estudado * e fornecem forte prova de principio para a promessa dessa técnica de imunoterapia.

A abordagem de imunoterapia com OPAL é mais simples do que outras imunoterapia» celulares, particularmente α uso de células dendríticas. O uso de DNA, bloqueio de CTLA-4 e abordagens baseadas em vetor viral também são agora promissores em estudes em macacos embora essas abordagens ainda não tenham sido traduzidas em estudos em humanos. Esse estudo adicionou peptídeos às PBMCs; no entanto, os presentea Invertores mostraram uma técnica ainda mais simples, e a adição de peptídeos ao sangue total ixa/io também é altamente imunogênioa, uma técnica que será mais amplamente aplicável ’.

Células T Cite vírus-específicas sãc tipicamente muito fracas era humanos infectadas pelo HIV ou macacos infectados pelo S1V; aumentos dramáticas dessas células foram induzidos pela iraunoterapia com OPAL e isso pode ser a .base de sua eficácia ^:Λ, Embora os presentes inverteres tenham medida primariamente células T produtoras de IFM-γ nesse estuda, exxsaios polifuncionais de XC?3 recentes sugerem que a iraunoterapia cora OPAL também pode induzir células T capares de também expressar ss citooinas TMF-α e IL-2, a quimisaina MIP13 e c marcador de degranulaçao CDIOVa. Os macacos de cantrole e os vacinadas foram tratadas com ART precoeemente (3 semanas após infecção?, α que. lsoli.rdam.unt e, está associada a um melhor resultado transitório em humanas. Na entanto, uma perda maciça de células T CD4* χία intestino até 1' semanas de infecção ^A’ e.

embora possa ser desafiador identificas' seres humanos tão precocemente após infecção, é aproximadamente nesse, momento que indivíduos cam HIV-1 se apresentam com infecção aguda, Uma redução de aproximadamente 1,0 log_ií: na VL resultaria em ura retardo substancial na doença progressiva por HIV em seres humanos e permite um período de tempo razoável sem a necessidade de reintroduzir AP.T18 caso esses achadas sejam confirmado?; em experimentos humanos. C cent role durável da viremia exibida pelos animais vacinados é interessante e consistente cora outros estudas recentes em macacos ^A\ sugerindo que a necessidade de reimunização pode não ser £: t?. ci n e Í $ í *

O cant.role da viremia foi similar pax'a os grupos de

OPAL-Gag e QPAL-All. Respostas de células T CD4 e CDS’ Gagespecíficas esn animals GPALGag foram 5,1 e 3,5 vezes maiores do que naqueles sniaiaia CPAL-A11, apesar cie uma dose idêntica de peptídeos Gag superpostas. Isso sugere competição antigênica entre peptídeos de Gag e as outras proteínas cio SIV. As respostas de células T CD8 Env~ específicas identificadas foram incapazes de ter um impacto significativo na replicaçâo viral ou progressão cia doença. Respostas ac Env (ou a outros nao-Gagl podem potencialmente inibir respostas de células T CuáF mais eficazes. Esse fenômeno ê realçado pela observação de que uma resposta de CTL Gag-específica esta relacionada ao controle da viremia, embora animara com respostas de células T CD8’ tanto Envquanto Gag-específicas não tenham tido um resultado melhor do que os responsivos apenas so Env ou aos controles não vacinados, tanto no controle da viremia quanto na prevenção de doença. A indução de respostas imunedominantes de células T não-Gag por vacinas de multiproteínas de HIV pode limitar o desenvolvimento de respostas de células T Gagespecíficas Um grande estuda cie ooha.rce em humanos deouiscrou que as respostas de células T Gag-específicas foram as mais eficazes no controle da viremia por HIV ^z:?. Considerados em conjunto, esses estudos sugerem que vacinas terapêuticas para o HIV podem não visar imunidade H1Vespecífica multiproteínas mazimamente ampla. A imunoterapia oom OPAL com peptídeos Gag prossegue em experimentos * $ í f)'CíOS á.RÍ. DClO HXV

Materiais e métodos

Animais

Macacos rabo-cls-purco j uvenis (Macaca nemestri na) .livres de retrovirus símio do tipo D foram estudados em protocolos aprovados por comissões de ética animal institucionais e. cuidados de acordo com as diretrizes do ‘'Australian National Health and Medica.! Research Council'··' .

Todos os macacos rabo-de-porco foram ripados para alelos de MHC da classe X por análise conformacional mediada por fita de referência, e a pz*esença de Mane-A*lü confirmada por PCR com iniciador sequência-específico, como descrito ‘‘'‘A Trinta e seis macacos foram injetados por via ixitravenosa 10 com 4 0 doses infecciosas de cultura de tecido de {gentilmente fornecido por R. Pal, Advanced Eiosciences, Kensington, MD) , como descrito províamente ^;··^Λλ, e randamizadas em 3 grupos de 12 animais (Q?AL-Gag. OPAL-All, Controles; 3 semanas mais tarde. A randomização foi 15 estratifiçada para carga viral de S1V de pico na 2^a semana, peso, sexo « o gene MHC I Afane-A*I0 (que sabidamente aumenta o controle imune de SIV;^b. Os animais receberam χχχ-feçaes su.ocutaneas de terapia antirrccroviruj. oupxa com tenofovir e emtricita.bi.na (gentilmente doada por Gilead, 20 Foster City, CA; ambos 30 mg/kg/animal) por 7 semanas a partir da 3* semana: diariamexxte a partir da 3' -5^a semanas pós-infecção e três vezes por semana a partir da 6^a-10* semanas, Sssa ART dupla controla a viremia na maioria dos macacos infectados pelo SIV o

Imunizações

Dois grupos de animais (OPA.T...-Gag e 0PAL-A.11) foram imunizados com ím-moterapia com OPAL usando PEMC, como descrito prevíamente. Resumidamente, células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas sobre Ficai1naaue de 18 ml de saxxgue {axxtxcoaoulano cam Na -nexsarma)

116/139

Todas as PEMC isoladas ina média 24 milhões de células'! foram suspensas em 0,5 ml de solução salina normal, ã qual um pool de 125 peptídeo» Gag de SlV^zjg ou 823 peptídecs que englobam todas as proteínas de SIV-^ss (Gag, Pol, Env, def, Vif, Tat, Rev, Vpr, Vpx) foi adicionado a 10 pg/ml de cada peptídeo dentro do pool. Os peptídeo» eram de 15-faers superpostos por 11 aminoácidos com >80% de pureza, gentilmente fornecidos pele programa repositório de reagents de AxvS oa NrH <números oe cataxogo u,<;04, 6^43, 6883, 6448-50, 6407, 8762, 6205). Para formar o pool dos peptídeos, cada frasco de 1 mg da peptídeo de ismer liofílizado foi solufeiiizado em 10-50 μΐ. de DMSO puro e adicionado em conjunto. A concentração dos pools de peptídeos Gag de SIV e All foi de 629 e 72 pg.Zml/’peptídeo, respectivamente. As PBMC pulsadas por peptídeo foram mantidas por i. n em um oanho-maria a 3 /ⁿt, turoalhonacaa suavemente a nada 15 minutos, e depois, sem, lavagem, reinfundidas IV no animal autólogo. Macacos de controle não receberem tratamento com vacina.

Ensaios de imunologia

Respostas imunes de céluias T CD4 s CD8 t?IVespeeíficas foram analisadas por expressão de ΙΕΝ-γ intracelular, como descrito previamente ^::í< Resumidamente, 200 μΐ de sangue total foram incubados a .37 ^ftC com 1 pg/rnl/peptídeo de. pools de peptídeo» de 15mer superpostos de SiV ídescritos acima) ou DM5C isoladamente, e cs anticorpos eo-estimuladores anti-CD28 e anti-OMSd (BD Eiioscíences/Pharmingen San Diego CA) e Brefeldín A (xo pg/ml, Sigma) por 6 h. Anticorpos anti-CD3- PE, anti-CDéFITC e anti-CD8“PerCP (BD, clones SP34, M-T477 e SK1, respeccivamente} luxam adicionados pox' 30 minutos. As células sanguíneas vermelhas foram Usadas (solução de iise FACS, BD) e os leucõcitos restantes permeabilizados {Solução da Permeabilização FACS 2, BD) e incubados cora anticorpo anti-ΙΡΝ-γ-APC .humano (BD, clone B27), antes da fixação e aquisição íLSRII, BDj . Os dados da aquisição foram analisados usando Plowjo versão 5.3.2 (Tree Star,

Ashland, OR? . A percentagem de linfócitos antígeno··· específicos .retidos que expressam IFN-γ foi avaliada era subconjuntos de lixxfócitos CD3'CD4' e CD3*CD8^f. As respostas ao eortopo oe cexuia T CD8 xmunouommante para Gag d.e .'3.1'1 KP9 em animais Mane-Λ*10* foram avaliadas por um tetrâmero Mane.A*10/KP9, conto descrito Células T CD4 periféricas totais foram medidas certo uma proporção de linfocitos por citometria de fluxo em sangue fresco.

Ensaios de virologia

RNA de SXV no plasma foi quantificado por PC.R em tempo real em 140 μΐ de plasma na University of Melbourne {limite inferior de quantificação de 3,1 log-.g cópias/ml) em todos os pontos do tempo usando uma sonda Taqfrlarr*. como descrito previamente e, para validar esses resultados com um ensaio mais sensível, em visions peletirados de 1,0 ml de. plasma no National Cancer Institute -limite inferior de quantificação de 1,0 log-, cdpias/ml), como descrito previamente '^J. Para identificar' se ocorreu escape mutacional no epitopo KP9, realizamos clonagem por R.T-PCP. e seqúencíaraento do cDNA viral plasmatics extraído através de

K.PSs en; Gau como descrito previamente *

Pontos finais/anãlises estatísticas

O conto final orimário foi a redução no RNA do SIV no plasma em animais imunizado» com OPAL, comparados com controles por área sob a curva com ponderação temporal (TWAUC) por 10 semanas após a retirada da ART (ou seja, amostras da 12“ até a 2 0“ semana) . .Essa abordagem de resumo estatístico é recomendada para estudos cano aqueles que envolvem medidas seriais ^:i< Os inventores cosiparsram grupos de tratamento ativo (OPAL-Gag e OPAL-All) com controles separadamente e em conjunto. A análise primária foi restrita aos animais que controlaram a viremia na ART na 10⁴ semana. (VL < 3,1 logic cópías/ml), na medida em que o controle da VL é um previsor importante da habilidade dos animais para responderem às imunoterapias ^í:. Um ponto final viroldgico secundário pré~planejado foi o estudo de todos os animais vivos com ajuste tanto para a VL ao final da ART (10* semana) quanto ao estado de Mane-A*ií). As comparações de grupes usaram testes t de duas amostras para dados contínuos, e o teste exato de Fisher para dados binários. As análises de sobrevida utilizaram análises CoxX 6íÇí X' C 3 3 & O >

Cálculo da potência

Qs presentes inventares estimaram que o desvio-padrão do retorno da VL após interrupção do tratamento seria de 0,8 log:rt cópia de RNA do SIV/ral de plasma _ &esse estudo intensivo, foi estimado que 2 dos 12 macacos dentro de um grupo podem ter problemas confusos como, por exemplo, resposta incompleta à ART ou morte por infecção aguda por nIV. Uma oomparaçao de 10 animais de controies vs 10 animais com tratamento ativo gera 88% de potência (p 0,05? para detectar uma diferença de 1,0 log_:i<.· na TWAUC da VI.: ao lonoo das nrimeiras 10 semanas,· Uma comoaraçao ’ ill 9/1'3 9^: estimada de 10 animals de control® vs, todos cs 20 animais tratados ativamente {OPAL-Gag mais OPAL-All) gerou 80% de potência para detectar diferenças de 0,87 log·;.:; copia/ml de redução da Vi.

Realização do estudo

Esse estudo foi realizado de acordo com um protocolo escrito previamente usando Good Laboratory Practice

Standards da Australian Therapeutic Goods Administration como diretrizes. Os desvios do protocolo foram pouco significativos e não afetaram os resultados do estudo. A auditoria de dados parciais durante o estudo não despertaram preocupações sobre a realização do estudo.

A revelação de cada patente, pedido de patente e publicação aqui citados é aqui incorporada por referência 15 em sua totalidade.

A citação de qualquer referência aqui feita não deve sei considerada como uma admissão de que essa referência está disponível como “Técnica estabelecida''' em ralação ao presente pedido.

Ao longo de toda a especificação, o objetivo foi descrever as modalidades preferidas da invenção, sem limitação da invenção a qualquer modalidade ou conjunto específico de características. Aqueles habilitados na técnica, portanto, observarão que, à lus da presente 25 revelação, várias modificações e alterações podem ser feitas nas modalidades específicas exemplificadas, sem se afastar do escopo da presente invenção, Todas essas modificações e alterações devem ser incluídas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

TABELAS

TABELA 1

122/139

	PBPTÍDBG	IO	DE	SEQVÊHCIA
35	VQQIGGNYVHLPLS P	ID .	DE	SBQ.	Wli;	35
bill/™	QGNYVHD PLSPRTLM	ID.	DE	SEQ.	N’ :	36
.....	VHL.PLSPRTLHWVK	ID,	DE	SEQ.	N:.	111(............
33	LÒR I EE_:	ID,	DE	EEQ.	F :	38
3 9	TLNAWKLXEEKKFG	ID.	DE	SEQ.	IM :	39
4 0	WVKL1EEKKEGAEVV	ID.	DE	SEQ.	N⁹ :	40
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43	EVVPGFQALSEGCTP	ID.	DE	SEQ.	I'M :	4 3
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M	CTPYDIWQMLNCVGD	ID.	DE	eeq.	ir j	46
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4 9	VGDHQAAMQIIRD.il.	ID.	DE	SEQ.	ir^: :	(\|lil((
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5 2	QIIRDIINERAADWD	ID.	DE	SEQ.	N'⁹ :	51
52	DIINEEAADWDLQHP	ID.	DE	SEQ.	N⁹ :	52
83	EEAADWDLQHPQPAP	ID.	DE	SEQ.	N^:i :	53
84	DWDLQHPQPAPQQGQ	ID,	DE	SEQ-	N^a :	54
55	QHPQPAPQQGQLP.EP	ID.	DE	SEQ.	H^9< t	55
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	PEPTÍDB0	ID	DE	SEQÜÊNCIA
63	WMYRQQNPIPVGNIY	ID .	DE	SEQ.	N> :	63
64	QQNPXPVGNIYRRWI	ID,	DE	SEQ.	N^<: :	64
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68	DIYRRNIQLGLQKCV	ID,	DE	SEQ.	ΙΓ ;	66
67	RWIQEGLQKCVPMYD	ID,	DS	SEQ.	N^s> ;	67
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89	KCVRMYNPTNILDVK	ID.	DE	SEQ,	N^:J ;	6 9
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74	PFQSYVDRFYKSLRA	ID.	DE	SEQ.	N^if :	,il))l\|
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90	PGQKARLMAEALKEA	ID.	DE	SEQ.	)Í8j)	so

124/ 09

	PEPTIDES	ID DE SEQUÊNCIA
91	ARLMAEALKEALAPV	ID. DE	SEQ,	TO :	91
92	AEALKEALAPvPIPE	ID. DE	SEQ.	SC	92
93	KEALAPVPIPEAAAQ	ID. DE	SEQ.	N'· t	/11............\|:
94	APWIPFAAAQQRGP	ID. DE	SEQ.	N* :	94
95	IPFAAAQQRGPRKPI	ID. DE	SEQ.	IP ;	95
96	AAOORGPRKPXKCW	ID.. DE	SEQ/	N¹' ;	90
97	RGPRKP 1KCWNCGKE	1D. DE	SEQ.	N‘^: ;	97
98	KPIKCNNCGKEGHSA	ID, DE	SEQ,	r	98
	CWNCGKEGHSAR.QQR	ID . DE	SEQ.	?r ·.	99
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ιοί	HSARQCRAFRRQGCW	ID. DE		O j	1H........:
102	QCRAPRRQGCWKCGK.	ID. DE	SEQ.	N^!> :	102
103	PRRQGCWKCG KMDHV	ID. DE	SEQ.	K’ :	103
104	GCWKCGKMDHVMAKC	ID, DE	SEQ.	N ;	104
105	CGKMDHVMAKCPDRQ	ID. DE	SEQ.	·? X	105
/\|®i/	DHVMAK.C PDRQAGFL»	ID. DE	SEQ.	N^B ;	106
107	AKGPDRQAGF.LGÜGP	IDDE	SEQ.	N° ;	107
108	DRQAGFLGI.GPWGKK	ID, DE	SEQ.	N ;
109	GFLGLGPWGKKPWF	ID. DE	SEQ.	ir :	109
liiil	LGPWGKKPRNFPMAQ	ID, DE	SEQ.		lio
111	GKKPRNEPMAQVHQG	ID. DE	Eq .	N * ;	111
: 112 ϊ	RNFPMAQVHQGLMPT	ID. DE	SEQ.	O:	112
113	MAQvHQGLMPTAPPE	ID. DE	SEQ.		113
114	HQGLMPTAPPEDPAV	ID. DE	SEQ.	N* :	1 14
115	MPTAPPBDPAVDLLK	ID. DE	SEQ.	N* t	115
ilill	PPEDPAVDLLKNYMQ	ID. DE	SEQ.	Ν’ :
117	PAVDLLKNYMQEGKQ	ID. DE	SEQ.	N^e :	117
118	LLKNYMQLGKQQREK	ID. DE	SEQ.	N^í: :	113

	PEPTÍDEO	ID DE SEQÜÊHCIA
^; 119	YMQLGKQQREKQRES	ID.	DE	SEQ.	ID ' :	1.19
120	GKQQE.EKQREEREKE	ID.	DE	seq.	ISM :	120
121	REKQRESREKPYKEV	Γ........iDl)	DE	SEQ.	t	/ills™
122	RESREKPYKEVTEDL	... IÚ,	DE	SEQ.	Ipll	122
123	EKPYKEVTEDLLHD14	ID.	DE	SEQ.	XM ;	12 3
124	K.EVTEDLLHLNSLFG	ID.	DE	SEQ.	S” :	124
12 S	EDLLHLNSLFGGDQ	ID.	DE	EEQ.	SM :	llQEs........;

TABSLA 3

Uma modal .idade de?? ttrna sequência da ccnssnso do pool de

peptideo Gag de	hiv-ι ciado	b.	Cada peptIdeo	tern	15
aminoácidos	de	comprimento e	a a	sobrepõe	ao	peptideo
precedente	per	11 a minodcidoa	. 0	peptideo		tern	12
am i noáo ides	de	comprimento.	A	S ui i i Q 1<	de	Gag	de
comprimento	total	[IQ. DE SEQ.	5M ;	2511 estâ	modificada	cm
relação à base de	dados de sequência	do HIV.

	PEPTÍDEO	ID DE	SEQÚÊHCIA
t„	MGARASVLSGGELDR	ID.	DE	SEQ.		126
	ASVDSGGEDDkWEKI	ID.	DE	SEQ.	N^i: :	127
3	SGGELDRWEK1RLRP	ID.	DE	SEQ,	tr :	128
4	LDRWEKIRLRPGGKK	ID.	DE	SEQ.	1Γ ;	129
£.· 7	EKIP.LRPGGKKK'.VKI:	ID.	DE	SEQ.	W* '	139
β	LRPGGRKKYKLKHIV	ID.	DE	SEQ.	14;	131
7	GKKKYKLKHIVWASP.	ID.	w	SEQ .	R^c :	132
•\|tt·	YKLKHIVWASRELER	ID.	DE	SEQ.	D^<: :	tililt........
........ It'	HIVWASRELERFAVN	ID.	DE	SEQ .	IP ;	134
10	ASRELERFAVNPGLL	ID.	DE	SEQ .	IT j	135
		ID.	.DE	SEQ.		135
12	i FAVHPGLLETSEGCR	ID.	DE	SEQ.	N^:' :	137

	PEPTfDEG	ID DE SEQÜÊNCIA
13	PGL· .islS i xl ύ-ϊί.. RQ λ xjG·	ID.	DE	SEQ.	)14g-s	138
14	E'rSEGCRQILGQLQP	ID.	DE	ΕΕζ).	N* :	139
15	GCRQILGQDQPSLQT	ID.	d.e	DEQ.	S' ;	14 0
16	ILGQLQPSLQTGS EE	IE.	DE	S EQ.	M :	141
/............'ll)	LQDSLQTGSEEDRSE	IS.	DE	SEQ.	?Γ ;	142
18	LQTGSEELESDYNTV	ID.	DE	SEQ.	dlsSs	14:3-
	SEEIRSDWWATH	ID.	DE	SEQ.		144
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)........Il:........\|	MWW W^W	ID.	DE	ESQ.	:	145
χί	TLYCVHQRIEVKDTK	ID.	DE	SEQ.	M^:- :	14 7
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28	DTK.EALEKIEEEQNK	Ip.	DE	SEQ.	,tr;	150
) li)........	AEEKIEEEQMKSKKK	ID.	DE	SEQ.	E^;> :	151
27	XEEEQNKEKKKAQQA	ID.	DE	SEQ.	:	IE 2
38	QNKSKKKAQQAAADT	ID.	DE	SEQ.	N* r	153
2 9	KKKAQQAAADTGDSS	ID .	DE	SEQ.	N’ <	154
30	QQAAADTGDSEQVSQ	ID.	DE	EEQ.	E^:? c	155
31	ADTGNSSQVSQNYPI	ID.	DE	SEQ.	K^a ;	155
s :11	NSSQVSQNYPIVQNL	ID.	DE	ESQ.	N^c :	IE?
, 1131 ::\|	VSQNYPIVQNLQGQ^	ID.	DE	S EQ .	>r ;	158
3 4	YPIVQDLQGQMVHQA	ID.	DE	SEQ.	N- ;	159
35	QNLQGQMVHQAISPR	ID.	DE	8 EQ.	S’ ;	ISO
35	GQMTOQAIS HALDA	ID.	DE	SEQ.	N^ft :	151
	HQAISPRTDNAWVKV	ID.	DE	; O i ; mi ; mi	E^:: :	'III........
38	S PR1A.NAWVKVVEEK	XD.	DE	SEQ.	M :	163
3 9	LNAWVKVVEEKAFSP	ID.	DE	SEQ.	í	164
40	VKWEEKAFSPEVIP	/.................... Ill;	DE	SEQ.	IP :	155

127/1 39

1 PEPTÍDEO	ID DE SEQÜÊNCIA
41	EEKAFSPEVXPMFSA	ID.	DE	SEQ.	IP ;	166
42	FSPEVIPMESALSEG	ID,	DE	SEQ.	IP ;	167
43		ID.	ílií	seq.	>P j
44	FSALSEGATPQDLNT	ID.	DE	SEQ.	IP :	169
45	S EGATPQDWTMLNT	ID.	DE	SEQ .	IP ;	170
4 6	T PQDLNTMLNTVGGH	ID.	DE	SEQ.	N^<: :	171
	LXrrpn^NTVGGKQAAM	ID.	DE	SEQ.	IP :	172
48	LETVGGEQAANQMLK	ID.	DE	SEQ.	5P í	173
1	GGHQ.AAI4QMLKETIN	ID.	DE	SEQ .	N ’ :	174
........ígllsl	AAMQMLKETXNEEAA	ID.	DE	SEQ.	EP ;	sgggl..... /5
Í;\|l\|l\|ll	QMDKETINEEAAEWD	ID .	DE	SEQ.	N^v :	176
illillll	ETINEEAAEWDRLHP	1Ι5Ι\|\|\|·\|	XB	V; rç · & ; : V ; .........!	N^<: :	illlláill
53	EEAAEWDRLHPVEAG	ID.	DE	SEQ.	ll'-fQ	178
54	EWDRLHPVHAGPXAP		DE	SEQ.		179
55	LHP V.H AGPIA PGQMR	ID.	DE	SEQ.	IP :	ISO
55	MtGPXAPGQWSPRG	ID,	DE	SEQ.	PP :	181
8?	IAPGQMREPRGSDXA	ID.	DE	SEQ,	Ν' :	182
w	:QÍ4gÍPkWPIAGTTE·	ID.	DE	SEQ.	>P :	183
59	PRGSDIAGTTSTLQE	ID,	DE	SEQ.	N ;	184
60	DIAGTTSTLQEQIGW	ID.	DE	SEQ .	N’ :	185
61	TTSTLQEQIGWMTNN	XD.	DE	SEQ.	IKI	llggilllll
M	LQEQIGWMTNNPPIP	ID.	DE	10 ^:>.................	N^<: :	187
63	IGWMTNNPPIPVGE1	ID.	DE	SEQ.	£P í
64	1WPPIPVGEIYKRW	ID.	DE	SEQ.	IP ϊ	189
65	P1PVGEXYRRWX1LG	QllllIXDl	DE	SEQ.	iigpSs
66	QEI1O.WXXWWK:X....................................	ID.	DE	EEQ.	M :	ligllllllJ
6 /	KRWIILGLNKIVRMY	ID.	DE	SEQ,	IP :	19 a
68	ILGLNKXVP.MYSPTS	I'D,	DE	SEQ-	IP :	1573

	FEPTXDEQ	XI	DE SEQÜÊNCIA
EB	NK1VRMYSPTSXLDI	XD.	DS	SEQ.	N * :	194
_:: 11 )	RM YS PTSI L.D IRQGP	ID,	DE	SEQ.	;	195
)71) _s	PTSILDIRQGFKEPF	ID.	DS	SEQ.	E^:: ;	196
	wxooow	ID.	DE	SEQ.	N^<: ’.	197
73	QGPKEPFRDYVDRFY	XL.	DE	SEQ.	N* i	198
74	E FERDE VDRFYKTL<R	ID.	DS	SEQ.	N * :	199
75	DYVDRFYKTLRAEQA	ID.	DS	SEQ.	ID :	280
	R.FYKTLRAEQASQEV	ID.	DE	SEQ.	N” ;	2G1
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ll jll; jj	)ETÍlWhO>DC'Ol_:	ID.	DE	SEQ.	IV :	206
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96	lAAlLE^OlACQlW	ID.	DS	)\|1\|ι·	FT ;	21 1
87	I.EEMMTACQGVGGPG	ID.	DE	SEQ.	;	212
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89	QGVGGPGHKARVLAE	ID.	DE	SEQ.	;C ;	214
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91	KARt⁷LAFAMSQVTNS	1) 11\|:<	DE	SEQ.	E^;> ;	2X0
92	LAEAMSQVTNSATIM	ID.	DE	SEQ.	ID· :	217
	MSQVTNSATIMMQRC	ID.	DE	SEQ,	Γ:	)111/ 111_:
94	TNEATIMMQRGNFRN	ID.	DE	SEQ.	/17sj)	219
95	TI tfOW W wgl KT	ID.	DE	SEQ.		220
95	QRGNFRNQRKTVKCF	ID.	DE	SEQ .	Nⁿ :	221

	PEPTÍDEO	ID D® SEQÜÊNCIA
97	FRNQRKTVKCFNCGK	ID.	DE	EEQ,		222
98	.RKTVKCFDCGKEGH1	ID.	DE	EEQ.	tr :	223
99	vkcwcqKê^siao	ID .	DE	S£Q<	tT :	224
10G	NCGKEGH.I AKNCRAP	ID.	DE	SEQ,	N * :	225
101 :	RGHIAKNCRÃPRKKG	ID.	DE	SEQ.	ST ;	220
1G2	AKNGRAPRKKGCWKC	ID.	DE	SEQ.	tr ;	227
	RAPEERDCT&QGREG	ID.	DE	EEQ.	tr ;	228
.104	KKGCVí KCGKSGHQMK	ID.	DE	SEQ.	N* ϊ	22 9
	WKCGKEGHQMKDCTE	ID.	DE	SEQ.	.N ’ :	2 3 0
106	KFGHQMKDGTERQAN	IF.	DE	SEQ.	ID ?
107	QMKDGTERQANFLGK	XD.		SEQ.	tT ;	232
108	GTBRQAMFLGA1»PG	ID.	ΠΕ	Illi	b :	293
109	QANFLGKIWPSHKGR	ID.	DE	SEQ ,	tr :	2-M
1X0	DGKIWPSHKGRPGNF	ID.	DE	SEQ.	tr ;	\|\|3il<< s<
111	WPSMKGP.PGNFLQSR	ID.	DE	SEQ.	Ν» :	236
112	rgrpgnflqsrpept	ID.	DE	SEQ.	E'^; .'	237
no	GNFLQSRPEPTAPPE	ID.	DE	SEQ,	tr :	238
114		ID.	DE	SEQ.	tr;	239
115	EPTAPPEESFRFGEE	XD.	DE	SEQ.	tr :	24 0
xie	PPEESFRFGEETTTP	ID.	DE	SEQ,	N * ;	241
117	SFRFGEETTTDSQEQ		DE	SEQ.	IT :	242
llllijl	GEETTTPSQKQEPID	ID.	DD	SEQ.	tr ;	243
119	TTTPSQKQEPIDKEL	ID.	DE	il\|l	Ν' :	244
120	SQKQEPIDKELYPLA	ID.	DE	SEQ.	tr í	245
121	EPIDKELYPLAELRS	XD.	DE	SEQ.	tr i	i2;4Í<\|l........
122	...................................	ID.	DE	SEQ,	ir:	<<<<<<<
r :íw.......	PLASDRSII’GNDPSS	ID.	DE	SEQ.
124	LRSuFGNDPSSQ	io.	DE	SEQ.	tr ;	249

130/139

TABELA 4

UMA MODALIDADE DE UMA SEQÜÊNCIA DE GAG DE SIV DE

COMPRIMENTO TOTAL

TABELA S

UMA MODALIDADE DE UMA SEQÜÊNCIA DE GAO DE HIV-1 DE

COMPRIMENTO TOTAL b4GARASVLSGGELDRWEK.XR.LRP<^3KKKYKI>KHIVWASRELERF | ID. DF» SEQ. ÍAVNPGLLETSEGCRQI.LGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATDYCV | N * : 2 51 ^QRIEVKDTKEALEKIEEEQNKxSKKKAQQAAADTGNSSQVSQNY | jpIVQNLQGQMVHQAISPRTxxMAWVKWEEKAFSPEVIPEEKAFS í |pr/IPMFxSALSEGATPQDIJSTMLOTVGGHQAAMQMLOTINgEA } ^EWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNN | ipp I i-^;VG.E 1YKRsí λ jlãjGLNKI VRMà'SPTS χηΟΙΝοΟΡΚΕλΈΡΟΥ v i ^RFYKTLRAEQASQEVKNWITETLLVQNANPDETLLVQISANPDC ( piILOLGR/B7X®MTACQGYGGRGHOW^S^ |tIMMQRGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIzAKNCkAPRKKGCV/KCGK I ÍEGHQMKDCTERQANFX.GKIW PS H KGRPGNFLQSRPEPTAPP EES |

13.3/139

N- (N~ (.2,2-dif en.ilet.il ) L-N-meti. Ihomof enilalanina aarbatni Imet 11} gl icina )

------------------------_---------------------------.....................................................§·.................................................................................................

l-carbcxi-l- (2,2-difenil·· | N- (M- (3 _f :3--;iifen.-.lp.j:'opil·etil-amino)ciclopropano ( earbamilmetil)gliaina

TABELA 7

ANÁLISE ESTATÍSTICA SOBRE VL E SOBREVIDA

Teste t

Redução da VL 1

Teste t

Sobrevída ano sem hi«andado hioaudado

ART ano (valor p)

ART** (valor p) (valor p)

0,028

0,

0,080

0,013

0,066

0,069

ados com controles. Os valores mostrados

Reduções dos valores da VL são log_;._;; oôpias/ml compa refletem AUG VL oom ponderação temporal entre animais v e redução media absoluta ao final do período entre pare animais raorreran» após a 41* semana; a média das ; estimar diferenças na VL até a 64 * semana.

* Valor p da sobrevida reflete análise Cox-regressão.

'** Nenhum doe 8 animais vacinados oom OPAL-A11 que tin 10 controles - essa comparação não permitiu uma estimat .cinados e controles após retirada da ART, teses.

últimas observações da VL foi usada para am VL indetectável nm ART morre·,; vs va da slgníficânoia dessa comparação.

137/132 following a novel peptide immunotherapy, J, Virol. 79, 3.748-3.757 (200S).

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0 .3:3. Lori, F. e cols. ''Control of SIV rebound through

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para o tratamento ou a prevenção de uma infecção por lentivírus em um indivíduo, o método caracterizado por compreender o aumento do número de

5 células apresentadoras de antígeno Gag-específicas ou de precursores da célula apresentadora de antígeno Gagespecífica no indivíduo, cue apresentara em sua superfície gelo menos um peptídeo que compreende urna seqüência de aminoácidos que corresponde a uras porção de ura polipeptídeo 10 Gag, em que as células apresentadoras de antígeno Gagespecíficas ou os precursores da célula apresentadora de anrígeno Gag-específica são produzidos por contato das células apresentadoras de antígeno ou de precursores da célula apresentadora de antígeno com uma composição que 15 consiste basicamente em diversos peptídeos por um período e sob condições suficientes para que os peptídeos, ou formas processadas dos peptídeos, sejam apresentados pelas células apresentadoras de antígeno ou pelos precursores em sua superfície, era que os peptídeos individuais da composição tu compreendem porções diferentes de uma .seqüência de aminoácidos que correspondem a um polipeptídeo Gag e, opcionalmeute, exibem identidade ou similaridade de seqüência parcial para pelo menos outro peptídeo dos d i ve r s o s pep11decs.

25 2. Método, de acorde com a reivindicação 1, c ara c te r izado pelo fato de que o indivíduo recebe a administração das células apresentadoras de antígeno Gagespecíficas ou dos precursores da célula apresentadora de antígeno Gag-específica.

3 0 3, Método, de acordo cem a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ixxdivíduo recebe a administração da composição.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os pe.ptidees estão contidos

5 ou de algum outro modo associados a uma partícula.

5. Método, de acordo com a i-eivindicação 4, fato de que a partícula é selecionada da lipossomos, micelas, partículas lipxdicas, partículas cerâmicas/inorgânicas e partículas poliméricas.

0 6. Método, da acordo com a rei vindi cação 1, caracterizado pelo fato de que o mé t ado exc1ui a dm in i s t r a ção ao i nd i v í du o (X) de um peptideo que

compreende unia seqüência de aminoácidos que corresponde a uma porção de um polipeptídeo não-Gag de lentivírus, ou í2j IS de uma célula apresentadora de antígeno que foi colocada em contato com um pe.ptIdeo de acordo com íl? .

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígeno são selecionadas de células dendriticas,

20 macrôfagos e células de Langerhans.

«, Método, de acordo com a reivindicação 2 ou caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígeno ou composição são administradas com um veiculo e/ou diiuente farmaceuticamente aceitável.
2 5 9. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, car a c t e ri zado pele tate de que as células apresentadoras de antígeno ou composição são administradas com um adjuvante.

10. Método, de acordo com a reivindicação 3, cax'acterizado pelo fato de que a composição é administrada 30 com um composto que estabiliza os psptídeos.

11, Método, de acordo oom a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o lentivírus é selecionado do vírus da imunodeficíência humana (KIV) e vírusda imunodeficiência símia (SIV,,

5 12, Método, de acorda cam a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que a identidade ou similaridade de seqüência parcial estã contida em uma ou em. ambas as extremidades de um peptídeo individual.

13, Método, de acordo com a reivindicação 12,

10 caracterizado pelo fato de que pelo menos 4 resíduos de aminoácidos contíguos estão presentes em uma ou em ambas essas extremidades, cuja seqüência é idêntica ou similar a uma seqüência de aminoácidos contida dentro de pelo menos outra dos peptídeos.

15 14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o peptídeo possuí pelo menos 5 resíduos de aminoácidos de comprimento,

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, ca.racterizado pelo fato de true o peptídeo possui, no máximo,

20 cerca de 500 resíduas de aminoácidos de comprimento.

16, Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o comprimento dos peptídeos é selecionado para aumentar a produção de uma resposta de linfócitos T citoiíticos.

25 17, Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado p-elo tato de que os peptídeos possuem cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos de comprimento.

18. Método, de acordo cam a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o comprimento dos peptídeos 3 2 é selecionado parra aumentar a produção de uma. resposta de ♦

linfócitos T auxiliares,

19. Método, de acordo com a. reivindicação 18, caracterizado pele fato de que os peptídeo» possuem cerca de 12 a cerca de 20 aminoácidos de comprimento.

5 20. Método, de acordo com a reivindicação 12..

caracterirado pelo fato de que as seqüências peptídicas -são derivadas de pelo menos cerca de 30% da seqüência que corresponde ao polipeptídeo Gag.

21. Método, de acordo com a reivindicação 12, ¹⁰ caracterirado pelo fato de que os diverso» peptídeo» compreendem peptideos de dois ou mais polipeptídeos Gag difer entes.

22. Processo para a produção de células apresentadoras de antígeno para o tratamento ou st prevenção de uma

IS infecção por lent! vírus, o processe- caracterizado por compreender o contato de células apresentadoras de antígeno ou de precursores da célula apresentadora de antígeno com uma composição que consiste essencialmente em diversos peptídeo» por um período e sob condições suficientes para 20 que os peptídeo», ou as formas processadas doa peptídeo», sejam apresentado» pelas células apresentadoras de antígeno ou pelos precursores em sua. superfície, em que os peptídeo» individuais da composição compreendem porções diferente» de uma seqüência de aminoácidos que correspondem a um

29 pci ineptideo Gag e, opoionalmente, exibem identidade ou similaridade de seqüência parcial para pelo menos outro peptídeo dos diversos peptídeo».

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que os precursores são

30 cultivados por um período e sob condições suficientes para diferenciar as células apresentadoras de antígeno dos precursores,

24, Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterízado pele fate- de cue os peptídeos são colocados

5 em contato cam uma população substancialmente purificada de células apresentadoras de antígeno ou seus precursores.

25, Processo, de acordo com a reivindicação 22, c a ra e t e r .1 z a do pelo fato de que os peptídeos são colocados em contato com uma população heterogênea de células

10 apresentadoras da antígeno ou seus precursores,

26, Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a população heterogênea de células é selecionada de sangue e células mononucleares des sangue periférico.

15 2'7, Processo, de acorda com a reivindicação 22, car^tergzado fato de cue as células apresentadoras de antígeno ou seus precursores são selecionadas de monócitcs, macrófagos, células da linhagem mielõide, células ã, células dendríticas ou células de Langerhans.

20 25. Processo, de acordo com a reivindicação 22, car ac ter i z ado pelo fato de que os peptídeos sàc colocados em contato oco uma população não cultivada de células apresentadoras de antígeno ou seus precursores.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 2-8,

2 5 caracter! zado pelo fato de que a população é homogênea.

30. Processo, de acordo cosí a reivindicação 28, caracter! zado pelo fato de que a população é heterogênea. 31. Processo, de acordo com a .reivindicação 2 8, caracter! sedo pe1o fato de que a popu1ação é se1ee ionada de

30 sangue total, sangue fresco ou frações deste, células _x: WM aorionu ol eares do sangue periférico, frações de células braucas do sangue total,, concentrado de hemâcias, enrugue irradiado, células dendríticas, monócitos, macrófagos, neutrófilos, linfócitos, células natural killer· e células T 5 natural killer.

33. Processo, de .acordo com a reivindicação 28, A^c pelo fato de que a população não foi submetida as condições de ativação.

33. Método- para a produção de linfócitos.

10 sensibilizados por Gag, c ar a c t er i z ado pelo fato de que cs métodos compreendem o contato de uma população de linfócitos. ou de seus precursores, com uma célula apresentadora de antígeno Gag-específíca produzida pelo processo da reivindicação 22 por um período e sob condições

15 suficientes para sensibilizar os linfócitos para que respondam ao polipeptídeo; Gag.

34 . Método para o tratamento ou a prevenção de uma infecção? por lentivírus era um indivíduo,. o método caracterizado por compreender a administração ao indivíduo 20 de um modulador imune selecionado de? {1} células apresentadoras de antígeno ou precursores da célula apresentadora de antígeno, que foram colocadas em contato com uma composição que consiste basicamente, em diversos peptídeos por um período a sob condições suficientes para 25 que os peptídeos,. ou formas processadas dos peptídeos, sejam apresentados pelas células apresentadoras de antígeno ou pelos precursores era sua superfície, em que os peptídeos individuais da composição compreendem porçoes diferentes de uras seqüência de aminoácidos que correspondera a um 30 polipeptídeo Gag e, opcionalmente, exibem identidade ou a 7 / 14 similaridade de sequêxxcia parcial para pelo .menos outro peptídeo dos diversos peptídeos; e (2) uma composição que consiste basicamente em diversos peptídeos, em que os peptídeos individuais compreendem porções diferentes de uma 5 sequência de aminoácidos que correspondem a um polipeptídeo Gag e, opcíonalmenta, exibem identidade ou similaridade de seqüência parcial para pelo menos outro peptídeo dos diversos peptídeos; e (3) uma população de linfõcitos, ou seus precursores, que foi colocada em contato com células 10 apresentadoras de antígeno de acordo com (1) por um período e sob condições suficientes para sensibilizar os linfõeitos para que respondam a um polipeptídeo Gag, em que o modulador imune é administrado em uma quantidade que é eficaz para tratar ou evitar a infecção 15 por lentivírus.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o modulador imune é administrado sistemicamente.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34,

20 caracterizado pelo fato de que o modulador imune é administrado por injeção.
3v. Método para o tratamento ou a prevenção de uma doença de imunodeficiência adquirida em um indivíduo, o método caracter!zado por compreender a administração ao 25 indivíduo de um modulador imune selecionado de: {1} células apresentadoras de antígeno ou precursores da. célula apresentadora de antígeno, que foram colocadas em contato com. uma composição que consiste basicamente em diversos peptídeos por um período e sob condições suficientes para 30 que os peptídeos, ou as formas processadas dos peptídeos, sejam apresentados pelas células apresentadoras de antígeno ou pelos precursores em sua superfície, em que os peptideos individuais da composição compreendem porções diferentes de uma eeqQência de aminoácidos que correspondem a um 5 polipeptídeo Gag e, opcionalmente, exibem identidade ou similaridade de seqüência parcial para pelo menos outro peptldeo dos diversos pentideas? e í2j uma composição que consiste basicamente era diversos peptideos, em que os peptideos individuais compreendem porções diferentes de uma 10 seqüência de aminoácidos que correspondem a um polipeptídeo

Gag e, opcionalmente, exibem identidade ou similaridade de seqüência parcial para pelo menos outro peptíduo dos diversos peptideos; e (3) uma população de linfdeltas, ou seus precursores, que far colocada era contato cam células 15 apresentadoras de antígeno de acordo cam (1) por um parioda e sob condições suficientes para sensibilizar os linfócitos para que respondam a ura polipeptídeo Gag, em que o moduladoz imune é administrada em uma quantidade que ã eficaz para tratar ou evitar a doença.

20 38. tso de um modulador imune, caractericada por ser selecionado a partir de: ílj células apresentadoras de antígeno ou precursores da célula apresentadora de antígeno, que foram colocadas em cent atra com uma composição que consiste basicamente em diversos peptideos por um 25 período e sob condições suficientes para que os peptideos, ou as formas processadas dos peptideos, sejam apresentados pelas células apresentadoras de antí$jeno ou pelos precursores em sua superfície, em que os peptideos individuais da composição compreendem porções diferentes de 30 uma seqüência de aminoácidos que correspondem a ura _Λ S* / Λύά polipeptídeo Gag e.< opcionalmente, exibem identidade ou similaridade de seqüêneia parcial para pelo menos outro peptídeo dos diversos peptídeo»; e {2} uma composição que consiste basicamente em diversos peptidees, em que os 5 peptídeo» individuais -compreendem porções diferentes de uma seqüência de aminoácidos que correspondem a um polipeptídeo Gag &, opcionalmente, exibem identidade ou similaridade de seqüência parcial psra^ pelo menos outro peptídeo dos diversos peptídeo»; e (2) uma população de linfócitos, ou 10 seus precursores, que foi colocada em contate com. células apresentadoras de antígeno de acordo com (1) por um período e sob condições suficientes para sensibilizar os linfócitos para que respondam a um polipeptídeo Gag, para o tratamento ou a prevenção de uma condição selecionada de uma infecção 15 por len.tlvi.rus e uma doença de imunodeficiência adquirida, 3$, Composição caracterizada por consistir essencialmente em células apresentadoras de antígeno ou precursores da célula apresentadora de antígeno que foram colocadas em contato com uma composição que consiste 20 basicamente em diversos peptídeo» por um período e sob condições suficientes para que os peptídeo», ou as formas processadas dos peptídeo», sejam apresentados pelas células apresentadoras de antígeno ou pelos precursores em sua superfície, em que os peptídeo» individuais da composição 25 compreendem porções diferentes de uma seqüência de aminoácidos que correspondem a. um polipeptídeo Gag e, opcionalmente. exibem identidade ou similaridade de sequência parcial para pelo menos outro peptídeo dos di verso» peptídecs.

3 0 40, Composição, de acordo com a. reivindicação 39, caracterizada pelo fate de qua as células apresentadoras de antfgeno ou precursores da célula apresentadora de antxgeno estão na forma de uma população substancialmente purificada de células apresentadoras de antfgeno ou precursores.
4'1. Composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que as células apresentadoras de antfgeno ou precursores da célula apresentadora de antfgeno estão na forma de uma população heterogênea de células apresentadoras de antlge.no ou precursores.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41, caracter!cada pelo fato de que a população heterogêxxea de células apresentadoras de antfgeno ou sets precursores é selecionada de sangue e células mononucleates do sangue periférico.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 39.· caracterizada pelo fato de que as células apresentadoras de antfgeno ou seus precursores são selecionadas de monócitos, macrófagos, células da linhagem mielóide, células E$_. células dendrfticas ou células de Langerhans.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que as células apresentadoras de antfgeno ou seus precursores estão na forma de uma população não cultivada de. células apresentadoras de antfgeno ou seus precursores.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44.

P^it; fato da que a população é homogênea.

46. Composição, de acordo curt a reivindicação 44,. caracterizada pelo fato de que a população é heterogênea,

47. Composição, de acorde com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a população é selecionada de

11/14 sangue total, sangue fresca ou frações deste, células manonucleares do sangue periférico, frações de células (trancas do sangue total, concentrado de hemácias, sangue irradiado, células dendriticas, monôcitos, macrófagos, neutrófilos, linfócitos, células natural killer e células T na t ura 1 kí: 11 er.

48. Composição, de acordo com a reivindicação 44, car ac ter is ada pele· fato de que a população não foi submetida às condições de ativação,

49. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por sxc'iuir céxu-xas apresentaooras ce antígeno que apresentam em sua superfície peptídeos que compreendem sequências de aminoácidos que correspondem às porções de: polipeptídeos: não- Gag:.

50. Composição ca ra c teri z a da pelo fato de que consiste basicamente em diversos peptídeos., em que os peptídeos individuais compreendem porções diferences de uma sequência de aminaãcidos que correspondem a. um polipeptídeo Gag e, opclonaImente, exibem identidade ou similaridade de sequência parcial para pelo menos outro peptídeo dos \X 1V — T G Ή fc 1 S

51. Composição, de acordo com a reivindicação 50, caracterinada pelo fato de que os peptídeos estão contidas ou de algum outro modo associados a uma partícula.

52. Composição, de acordo cora a reivindicação 51,· caracterizada pelo fato de true a partícula é selecionada de 11possomos, mi ce1a s, partí cu 1 a s lí pidi ca s, par tí cu1as csrâmicas/ínorgànicas e partículas poliméricas,

53. Composição, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada por compreender ainda células apresentadoras de antígeno ou precursores da célula apzesentadora de anti'gano.

54. Composição, de acordo com a reivindicação S3, caracterizada pelo fato de que as células apresentadoras de S antígeno ou precursores da célula apresentadora de antígeno estão na forma de uma população substanciaImente purificada de células apresentadoras de antígeno ou precursores.

ES. Composição, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que as células apresentadoras de 10 antígeno ou precursores da c éiui a apresentadora de antígeno estão na forma de uma população heterogênea de células apresentadoras de antígeno ou seus precursores.

56. Composição, de acorde com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de cue a população heterogênea de

15 células apresentadoras de antígeno ou precursores é selecionada de sangue e células mononucleares do sangue per1férico.

57. Composição, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que as células apresentadoras de

20 antígeno ou seus precursores são selecionadas de monócitos, macrôfagos, células da linhagem mielóide, células B, células dendríticas ou células de Langerhans.

58. Composição, de acordo oom a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que as células apresentadoras de

25 antígeno ou seus precursores estão na forma de uma população não cultivada de células apresentadoras de antígeno ou seus precursores.

53. Composição, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a população é homogênea.

30 »0. Composição, de. acordo com a reivindicação 58, caracte.ri saca pelo fat. o de que a população é heterogênea.

61. Composição, de acordo oom a reivindicação 60, ca ra c t e r ,i z a da pelo fato de que a população ê selecionada de sangue total, sangue frasco ou frações daste,, células
5 mononucleares do sangue periférica, frações de células brancas do sangue total, concentrado de hemácias, sangue Ί .{'.'radiado, células dendríticas, monócitos, macros agos .< neutrôfilos.,. linfócitos, células .natural killer e células T natura1 xx1x ex,

10 62. Composição, de acordo com a reivindicação 58, o a r ac t e r 1 z a da pelo fato de que a população não foi submetida às condições de ativação.
6 3 . Composição, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada por excluir células apresentadoras de

15 antígeno que apresentam um sus superfície peptideos que compreendem sequências de 'aminoácidos que correspondem às porções de po.l. ipept ídecs não · Gag..

64. Composição, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada por excluir um pentideo que compreende ume

20 sequências da aminoácidos que corresponde a uma porção de um Ç'íU.&. rt^..'.1.'..V... iic.í.-λ.u Λ. 1 .i ^.. t?...

65. Uso de uma Composição da reivindicação 39 ou reivindicação 50 caracter! zado pelo fato de ser para o tratamento ou a prevenção de uma condição selecionada de

25 uma infecção por lentivírus e uma doença de imunodef i.c i ênc i.a adqui rida,

66. Uso de uma Composição da rei vindicação 3 9 ou reivindicação 50 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamente para o tratamento ou a

30 nrevencâo de uma condicão selecionada de uma infecção uor

14/14 lentivírus e uma doença de imunodeficiência adquirida.